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The heat shock protein response and physiological stress in aquatic organisms Mazur, Carl François 1996

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T H E HEAT SHOCK PROTEIN RESPONSE AND PHYSIOLOGICAL STRESS IN AQUATIC ORGANISMS. by CARL FRANCOIS MAZUR B.Sc, McGill University, 1986 M.Sc, The University of British Columbia, 1991 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY in THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES (Department of Animal Science) I accept this thesis as conforming /ro the required standard THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA JULY, 1996 © Carl Frangois Mazur, 1 9 9 6 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholariy purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of fl N/rf/?l The University of British Columbia Vancouver, Canada Date /M&XfT Z 7. /f94 DE-6 (2/88) 11 A b s t r a c t T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d in this t h e s i s were p e r f o r m e d to e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n h e a t - s h o c k p r o t e i n s ( h s p ) a n d t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e in a q u a t i c a n i m a l s . C e l l l i n e s w e r e first e x p o s e d to s e l e c t e d s t r e s s o r s to d e t e r m i n e w h i c h h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e i n d u c e d b y e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . T h e h s p 7 0 a n d h s p 3 0 r e s p o n s e s w e r e t h e n m e a s u r e d in t h e t i s s u e s of l ive f i s h p r e - e x p o s e d to a 4 5 s handling s t r e s s , i n t r a p e r i t o n e a l Cortisol implants o r h e a t shock to test t h e ef fec t physiological s t r e s s a n d Cortisol o n t h e h e a t shock p r o t e i n r e s p o n s e . H e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s w e r e q u a n t i f i e d b y d e n s i t o m e t r i c s c a n n i n g of W e s t e r n b l o t s p r o b e d wi th s a l m o n i d - s p e c i f i c r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s t r e s s o r s u s e d for t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e 1 0 a n d 1 5 ° C h e a t s h o c k s , p H 4 . 5 to p H 10, 10 m M L - a z e t i d i n e , a n d 4 5 s p h y s i c a l h a n d l i n g . A u t o r a d i o g r a p h s of o n e a n d t w o d i m e n s i o n a l S D S - P A G E g e l s s h o w e d , wi th few e x c e p t i o n s , that n e w 7 0 a n d 3 0 k D a p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d b y c e l l l i n e s e x p o s e d to t h e s e l e c t e d s t r e s s o r s . A f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f r a d i o l a b e l e d proteins in Chinook salmon embryonic ( C H S E ) cell line e x p o s e d to a wide p H r a n g e , f r o m p H 4 . 5 to p H 10, s h o w e d a p r o m i n e n t 7 0 k D a p r o t e i n in r e s p o n s e to e i t h e r l o w o r h i g h p H . A n o v e l 8 0 k D a p r o t e i n w a s o b s e r v e d 1 h a n d 3 h af ter e x p o s u r e of t h e c e l l s to p H 10.0 , a n d a 3 2 k D a p r o t e i n b a n d w a s o b s e r v e d in c e l l s e x p o s e d to p H 5.5 . T h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e w a s i n d u c e d in l ive f i s h b y p h y s i c a l h a n d l i n g . C i r c u l a t i n g p l a s m a C o r t i s o l l e v e l s w e r e i n c r e a s e d a l o n e b y i n t r a p e r i t o n e a l s l o w - r e l e a s i n g Cortisol i m p l a n t s . H a n d l i n g a n d Cortisol i m p l a n t s resulted i n e l e v a t e d p l a s m a Cortisol a n d glucose levels. P l a s m a sodium, c h l o r i d e a n d p o t a s s i u m i o n l e v e l s w e r e e s s e n t i a l l y unaffected b y a n y o f t h e t r e a t m e n t s . G i l l , a n t e r i o r k i d n e y , l iver a n d s k e l e t a l m u s c l e samples w e r e t a k e n at r e g u l a r i n t e r v a l s h e a t s h o c k t r e a t m e n t s a n d s h o w e d e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s in U l the gill, liver, and kidney t issues 1 h after a 2 -h 10°C step change heat shock. T h e four t issues, including skeletal muscle, had elevated hsp70 concentrat ions 48 h after heat shock. Only the gill t issues had elevated hsp30 levels 1 h after heat shock and no t issues had elevated hsp30 levels 48 h after the heat shock. H s p 7 0 levels were e levated in gil ls t i ssues for three w e e k s after the f ish were exposed to a 2 -h 15°C step change heat shock and returned to ambient temperature. Phys ica l handl ing did not induce increased levels of hsp70 in gill, liver or kidney t issues. Handl ing the f ish prior to heat shock s u p p r e s s e d the typical hsp70 level increase observed in the gills of heat - shocked f ish, however, e levated p lasma Cortisol concentrations a lone did not attenuate the gill hsp70 increase c a u s e d by heat shock. Gi l l t i ssues from f ish which were hand led or cortisol - injected prior to heat shock showed no increase in hsp30 concentrat ion either 1 or 48 h after the heat shock. Pr imary cultures of trout hepatocytes were exposed to physio logical (10"7) and pharmacological (10"5) concentrat ions of adrenal ine to test for its effect on heat shock protein levels in vitro. Propranolol w a s used to test the effect of b locking U-receptors during exposure of hepatocytes to adrenal ine. T h e s e hepatocyte exposures showed that cel ls exposed to physio logical or pharmacological concentrat ions of adrenal ine had e levated levels of hsp70. Ce l l s exposed to equimolar pharmacological (10"5) concentrat ions of both adrenal ine and the p-b locker propranolol had the same hsp70 concentrat ions as those found in control cel ls . T h e blocking effect of propranolol on the f i -receptors may therefore block the intracellular a lka los is known to be c a u s e d by adrenal ine, and wh ich may have induced the hsp70 in adrenal ine e x p o s e d primary hepatocytes. T A B L E O F C O N T E N T S A b s t r a c t ii T a b l e of C o n t e n t s iv Lis t o f T a b l e s vii L is t o f F i g u r e s viii A c k n o w l e d g m e n t s ( s p e c i f i c a c k n o w l e d g m e n t s f o r e a c h c h a p t e r a r e g i v e n in t h o s e c h a p t e r s ) xi C h a p t e r 1 G e n e r a l I n t r o d u c t i o n 1 G e n e r a l t h e s i s o b j e c t i v e 1 T h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e 1 R e g u l a t i o n o f t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e 3 T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f h s p 7 0 g e n e e x p r e s s i o n 3 H e a t s h o c k f a c t o r s t r u c t u r e a n d r e g u l a t i o n 4 D N A r e c o g n i t i o n 8 T r a n s l a t i o n a l c o n t r o l o f t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e 8 F u n c t i o n s o f t h e h e a t s h o c k p r o t e i n s 1 0 C h a p e r o n i n g 1 0 H s p 6 0 . . . . 11 H s p 7 0 11 H s p 9 0 1 3 S m a l l h s p s 1 3 P r o t e i n f o l d i n g 14 C h a p e r o n i n 14 H s p 7 0 14 M e m b r a n e t r a n s p o r t 1 5 P h y s i o l o g i c a l s t r e s s in f i s h 17 C o m m o n f i s h s t r e s s o r s 18 T h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e in f i s h 19 P r i m a r y r e s p o n s e 19 S e c o n d a r y r e s p o n s e 2 0 T e r t i a r y r e s p o n s e 2 0 D e t e c t i o n o f s t r e s s e d s t a t e s 21 O b j e c t i v e s o f t h e t h e s i s 2 2 C h a p t e r 2 G e n e r a l M a t e r i a l s a n d m e t h o d s 3 4 F i s h h o l d i n g t a n k s , w a t e r q u a l i t y a n d r e a r i n g c o n d i t i o n s . . . . 3 4 F i s h a n e s t h e s i a 3 4 B l o o d s a m p l i n g 3 4 P l a s m a Cortisol d e t e r m i n a t i o n 3 5 C e l l l i n e s 3 6 R a d i o l a b e l i n g 3 6 R a d i o l a b e l e d c e l l s a m p l e p r e p a r a t i o n 3 7 T i s s u e s a m p l e p r e p a r a t i o n 3 7 B i c i n c h o n i n i c a c i d p r o t e i n a s s a y 3 8 S D S - P A G E o n e d i m e n s i o n a l g e l s 3 9 T w o d i m e n s i o n a l g e l s 4 0 C o o m a s s i e s t a i n i n g 4 0 A u t o r a d i o g r a p h y a n d F l u o r o g r a p h y (full s i z e g e l s ) 41 A u t o r a d i o g r a p h y ( m i n i g e l s ) 41 T r a n s f e r r i n g p r o t e i n s f r o m m i n i g e l s to m e m b r a n e s 41 P r i m a r y a n t i b o d i e s 4 2 W e s t e r n blot t ing 4 3 D e n s i t o m e t r y 4 4 C h a p t e r 3 E n h a n c e d p r o t e i n s i n f i s h c e l l l i n e s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s 4 6 I n t r o d u c t i o n • 4 6 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 4 6 R e s u l t s 4 7 D i s c u s s i o n 4 9 C o n c l u s i o n 51 A c k n o w l e d g m e n t 51 C h a p t e r 4 p H c h a n g e i n d u c e s i n c r e a s e d l e v e l s of n o v e l p r o t e i n s o f 80 , 7 0 a n d 3 2 k D a i n c h i n o o k s a l m o n e m b r y o n i c c e l l s 5 9 I n t r o d u c t i o n 5 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 6 0 R e s u l t s 61 D i s c u s s i o n 61 A c k n o w l e d g m e n t 6 4 C h a p t e r 5 T i m e c o u r s e a n d l e v e l s o f h e a t s h o c k p r o t e i n s in t h e t i s s u e s o f h e a t s h o c k e d c u t t h r o a t trout 7 3 I n t r o d u c t i o n 7 3 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 7 5 R e s u l t s 7 8 D i s c u s s i o n 8 0 A c k n o w l e d g m e n t 8 3 C h a p t e r 6 T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n h e a t s h o c k p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d s t r e s s h o r m o n e s in f i s h c e l l s 1 0 0 I n t r o d u c t i o n 1 0 0 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 101 R e s u l t s 1 1 2 D i s c u s s i o n 1 1 4 A c k n o w l e d g m e n t 1 1 7 C h a p t e r 7 G e n e r a l d i s c u s s i o n a n d C o n c l u s i o n s 1 4 8 L i t e r a t u r e C i t e d 1 5 5 A p p e n d i x 1 E x p o s u r e o f W i n t e r F l o u n d e r , S c u l p i n s , M u s s e l s a n d O y s t e r s to c r u d e oil a n d a c r u d e oil a n t i - a d h e s i v e 1 6 9 I n t r o d u c t i o n 1 6 9 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 1 7 0 R e s u l t s : 1 7 2 D i s c u s s i o n 1 7 2 A c k n o w l e d g m e n t 1 7 4 vii L i s t of t a b l e s T a b l e 1.1 W a t e r q u a l i t y s t a n d a r d s n e c e s s a r y f o r r e a r i n g u n s t r e s s e d s a l m o n i d s 2 6 T a b l e 1.2 C o m m o n p h y s i o l o g i c a l v a r i a b l e s m e a s u r e d to d e t e r m i n e s t r e s s l e v e l s in s a l m o n i d s 2 7 T a b l e 3.1 T r e a t m e n t s u s e d to i n d u c e t h e s y n t h e s i s of n o v e l p r o t e i n s in f o u r f i s h c e l l l i n e s 5 2 T a b l e 4.1 E x p e r i m e n t a l m e d i a a d j u s t e d to p H 4 . 5 to p H 1 0 . 0 6 5 T a b l e 4 . 2 N o v e l p r o t e i n s i n d u c e d i n C H S E c e l l s e x p o s e d to a b r o a d p H r a n g e a n d l a b e l e d e i t h e r d u r i n g e x p o s u r e , 1 h o r 3 h af ter r e t u r n to c o n t r o l m e d i u m ( p H 7.5) 6 6 viii Lis t o f F i g u r e s F i g u r e 1.1 T h e c e l l u l a r s t r e s s r e s p o n s e a n d its i n d u c e r s 2 9 F i g u r e 1.2 T h e h e a t s h o c k f a c t o r c y c l e 31 F i g u r e 1.3 M o d e l o f i m p o r t a n d s o r t i n g o f B C S 1 p r o t e i n 3 3 F i g u r e 3.1 H s p 7 0 s y n t h e s i s in t w o f i s h c e l l l i n e s , R T G - 2 a n d C H S E -2 1 4 , e x p o s e d to a n 8 ° C h e a t s h o c k 5 3 F i g u r e 3 .2 T w o - d i m e n s i o n a l S D S - P A G E o f f i s h c e l l l i n e s s h o w i n g s y n t h e s i s o f n o v e l p r o t e i n s in r e s p o n s e t o h e a t s h o c k a n d L - a z e t i d i n e 5 5 F i g u r e 3 .3 p H c h a n g e c a u s e s s y n t h e s i s o f n o v e l 2 5 a n d 6 8 k D a p r o t e i n s in t h r e e f i s h c e l l l i n e s 5 7 F i g u r e 4.1 N o v e l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d in C H S E c e l l s e x p o s e d to p H c h a n g e s 6 8 F i g u r e 4 . 2 N o v e l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d in C H S E c e l l s e x p o s e d t o p H 4 . 5 a n d p H 5 .5 7 0 F i g u r e 4 . 3 C H S E c e l l s s y n t h e s i z e n o v e l 7 0 a n d 8 0 k D a p r o t e i n s w h e n e x p o s e d to p H 10 .0 7 2 F i g u r e 5.1 S t a n d a r d s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t 8 5 F i g u r e 5 .2 T h r e e s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t s u s e d to d e t e r m i n e t h e d u r a t i o n o f t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e 8 7 F i g u r e 5 .3 C o r e t e m p e r a t u r e s o f h e a t s h o c k e d cut throat trout 8 9 F i g u r e 5 .4 G i l l t i s s u e h s p 7 0 l e v e l s 12 m i n af ter a 1 2 m i n 1 0 . 9 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k 91 F i g u r e 5 .5 T i s s u e h s p 7 0 l e v e l s af ter a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k 9 3 F i g u r e 5 .6 T i s s u e h s p 3 0 l e v e l s af ter a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k 9 5 F i g u r e 5 . 7 R e d b l o o d c e l l h s p 7 0 l e v e l s af ter a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k 9 7 F i g u r e 5 .8 G i l l h s p 7 0 l e v e l s s h o w i n g t h e d u r a t i o n o f t h e h e a t F i g u r e 5 .8 G i l l h s p 7 0 l e v e l s s h o w i n g t h e d u r a t i o n of t h e h e a t . s h o c k response 9 9 F i g u r e 6.1 P l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout exposed to a 4 5 s handling s t r e s s 1 1 9 F i g u r e 6 .2 P l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout exposed to a 4 5 s h a n d l i n g s t r e s s 121 F i g u r e 6 .3 T i s s u e h s p 7 0 l e v e l s 1 h f o l l o w i n g a 4 5 s h a n d l i n g s t r e s s 1 2 3 F i g u r e 6 . 4 T i m e c o u r s e of gill h s p 7 0 e l e v a t i o n f o l l o w i n g a 4 5 s h a n d l i n g s t r e s s 1 2 5 F i g u r e 6 . 5 P l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e l e v e l s i n h a n d l e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 2 7 F i g u r e 6 . 6 P l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n s i n h a n d l e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 2 9 F i g u r e 6 .7 E x a m p l e of W e s t e r n b l o t s o f gill t i s s u e p r o t e i n s p r o b e d w i t h s a l m o n i d - s p e c i f i c a n t i - h s p 7 0 a n d a n t i - h s p 3 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s 131 F i g u r e 6 .8 G i l l h s p 7 0 l e v e l s i n Cortisol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d rainbow trout 1 3 3 F i g u r e 6 .9 G i l l h s p 3 0 l e v e l s in C o r t i s o l i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 3 5 F i g u r e 6 . 1 0 P l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e l e v e l s in Cortisol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 3 7 F i g u r e 6.11 P l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n s in Cortisol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 3 9 F i g u r e 6 . 1 2 G i l l h s p 7 0 l e v e l s in Cortisol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 141 F i g u r e 6 . 1 3 G i l l h s p 3 0 l e v e l s in Cortisol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout 1 4 3 F i g u r e 6 . 1 4 H s p 7 0 l e v e l s in r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s exposed to p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f e p i n e p h r i n e in vitro 1 4 5 X F i g u r e 6 . 1 5 H s p 7 0 l e v e l s in r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s e x p o s e d to a p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n of e p i n e p h r i n e a n d p r o p r a n o l o l 1 4 7 F i g u r e A p p e n d i x .1 D i a g r a m of a p r o t e c t e d m a r i n e m e s o c o s m s 1 7 5 xi A c k n o w l e d g m e n t F i n a n c i a l s u p p o r t p r o v i d e d b y t h e C a n a d i a n B a c t e r i a l D i s e a s e s N e t w o r k ( C B D N ) a n d t h e s u p p o r t o f D r . G . K . I w a m a with h i s i d e a s a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h e p r e p a r a t i o n of this t h e s i s a r e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h e c o l l a b o r a t i o n o f D r . E P M C a n d i d o , w h o s u p p l i e d t h e f i s h - s p e c i f i c p r i m a r y a n t i b o d i e s u s e d f o r W e s t e r n blot t ing, a n d S a n d y B a b i c h f o r h e r t e c h n i c a l e x p e r t i s e in p r e p a r i n g t h e s e a n t i b o d i e s is g r e a t l y a p p r e c i a t e d . T h e c o l l a b o r a t i o n of D r . P . T h o m a s a n d t h e d a i l y l a b o r a t o r y a s s i s t a n c e o f R . F o r s y t h , P a i g e A c k e r m a n , G r a c e C h o , J o h n M o r g a n a n d o t h e r s t u d e n t s in t h e l a b , in t h e a r e a s of l a b o r a t o r y t e c h n i q u e s a n d a n a l y s i s w a s i n v a l u a b l e . L a s t l y , I w a n t to t h a n k m y wife , C a r o l , w h o f r e q u e n t l y s h o w e d g r e a t p a t i e n c e t h r o u g h o u t t h e l e n g t h y p r e p a r a t i o n of this t h e s i s , s h a r e d h e r h u m o r a n d h a d t h e w i s d o m to b r i n g o u r w o n d e r f u l s o n I s a a c into o u r w o r l d . 1 C h a p t e r 1: G e n e r a l i n t r o d u c t i o n G e n e r a l t h e s i s o b j e c t i v e T h e p u r p o s e o f this s t u d y is to e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e a n d t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e in a q u a t i c a n i m a l s a n d c e l l l i n e s . D e s p i t e a l a r g e b o d y of l i terature o n t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e a n d t h e e x t e n s i v e w o r k d o n e to d a t e o n t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e of s a l m o n i d s , little is k n o w n a b o u t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e two a d a p t i v e r e s p o n s e s to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s . T h i s g e n e r a l i n t r o d u c t i o n is wri t ten w i t h t h r e e s p e c i f i c o b j e c t i v e s . T h e first is to d i s c u s s t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e in g e n e r a l t e r m s , g i v i n g i n f o r m a t i o n a n d a br ief r e v i e w of t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d in t h e r e g u l a t i o n a n d s y n t h e s i s of h e a t s h o c k p r o t e i n s . T h e r o l e t h e y p l a y a s c h a p e r o n e s , in p r o t e i n f o l d i n g a n d t r a n s m e m b r a n e t r a n s p o r t is a l s o d i s c u s s e d . T h e s e c o n d g o a l is to d e s c r i b e t h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e of f i s h , w i t h e m p h a s i s o n t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e w h i c h o c c u r s w h e n o r g a n i s m s a r e f a c e d wi th s u b o p t i m a l e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e third s e g m e n t of th is c h a p t e r o u t l i n e s t h e s t u d i e s a n d t h e o r g a n i z a t i o n of t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d in this t h e s i s . T h e heat s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e H e a t s h o c k p r o t e i n s ( h s p ) a r e s y n t h e s i z e d in t h e c e l l s o f m o s t o r g a n i s m s , in r e s p o n s e to v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l a n d p a t h o p h y s i o l o g i c a l s t r e s s o r s . T h e h e a t s h o c k r e s p o n s e w a s first o b s e r v e d a s p u f f i n g " in t h e p o l y t e n e c h r o m o s o m e s o f Drosophila s a l i v a r y g l a n d s e x p o s e d to h e a t s h o c k ( R i t o s s a 1 9 6 2 ) . T h e p r o d u c t s f o r m e d w e r e later n a m e d h e a t s h o c k p r o t e i n s ( T i s s i e r e s et a l . , 1 9 7 4 ) . A l t h o u g h s o m e of t h e s e p r o t e i n s h a v e a l s o b e e n c a l l e d s t r e s s p r o t e i n s ( S P ) , t h e t r a d i t i o n a l h s p n o m e n c l a t u r e will b e u s e d t h r o u g h o u t this t h e s i s . 2 S o m e h s p s h a v e b e e n f o u n d to i n c r e a s e in c o n c e n t r a t i o n w h e n o r g a n i s m s a r e e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s s u c h a s ul t ravio le t light, h e a v y m e t a l s , x e n o b i o t i c s , e t h a n o l , a n o x i a , a m i n o a c i d a n a l o g u e s , v i r a l i n f e c t i o n s a n d p H c h a n g e ( H i g h t o w e r 1 9 8 0 ; K o t h a r y a n d C a n d i d o 1 9 8 2 ; M i s r a et a l . 1 9 8 9 ; S a n c h e z et a l . 1 9 9 2 ; W e l c h 1993 ; ) a n d p r o v i d e a m e a s u r e of p r o t e c t i o n a g a i n s t s t r e s s insult . O t h e r h s p s fac i l i ta te t h e d e g r a d a t i o n of d e n a t u r e d p r o t e i n s . M a n y h e a t s h o c k p r o t e i n s a l s o p a r t i c i p a t e in a n u m b e r of e s s e n t i a l m e t a b o l i c p a t h w a y s in n o r m a l c e l l s , s u c h a s t h e s y n t h e s i s , a s s e m b l y a n d t r a n s p o r t o f c e l l u l a r p r o t e i n s , a s w e l l a s r e g u l a t i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s t e r o i d h o r m o n e s a n d t h e i r r e c e p t o r s ( s e e N o v e r , 1 9 8 4 ; L i n d q u i s t , 1 9 8 6 ; L i n d q u i s t a n d C r a i g , 1 9 8 8 ; N a g a o et a l . , 1 9 9 0 ; W e l c h et a l . , 1 9 9 1 ; W e l c h , 1993) . T h e h s p r e s p o n s e a l l o w s o r g a n i s m s to s u r v i v e s t r e s s o r s that m i g h t o t h e r w i s e r e s u l t in c e l l d a m a g e or d e a t h ( H i g h t o w e r 1980) . C e l l s e x p o s e d to d i f f e r e n t c h e m i c a l , p h y s i c a l o r p h y s i o l o g i c a l s t r e s s o r s r e s p o n d b y e x p r e s s i n g t h e s e e v o l u t i o n a r i l y c o n s e r v e d p r o t e i n s ( S c h l e s i n g e r et a l . , 1982) , w h i c h h a v e b e e n f o u n d in o r g a n i s m s a s d i v e r s e a s b a c t e r i a , y e a s t , m o l l u s k s , f i s h a n d h u m a n s ( M a r g u l i s et a l . 1 9 8 9 ; S c h l e s i n g e r 1 9 8 6 ; Z a f a r u l l a h et a l . 1 9 9 2 ) . H s p 7 0 is a m o n g t h e m o s t h i g h l y c o n s e r v e d p r o t e i n s k n o w n a n d is f o u n d in n e a r l y all o r g a n i s m s ( G u p t a a n d G o l d i n g 1 9 9 3 ) ; o n l y Hydra oligactis h a s b e e n f o u n d n o t to s y n t h e s i z e this p r o t e i n u p o n t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n ( B o s c h et a l . 1 9 8 8 ) . T h e g e n e s f o r h s p 7 0 a r e m o r e t h a n 5 0 p e r c e n t s i m i l a r b e t w e e n b a c t e r i a , y e a s t a n d Drosophila ( C r a i g et a l . 1979) . S u c h c o n s e r v a t i o n s u g g e s t s that h s p s m a y p l a y a r o l e in t h e g e n e r a l i z e d s t r e s s r e s p o n s e o f w h o l e a n i m a l s d e s c r i b e d b y S e l y e (1950) . A c q u i r e d t o l e r a n c e , o r t h e abi l i ty to s u r v i v e s u b s e q u e n t a n d m o r e s e r i o u s e n v i r o n m e n t a l s t r e s s , c o r r e l a t e s wi th t h e a c c u m u l a t i o n o f h s p s ( S u b j e c k e t a l . , 1 9 8 2 ; L i n d q u i s t 1 9 8 6 ) . 3 T h e e x p r e s s i o n of h e a t s h o c k g e n e s , w h i c h a r e c o m m o n a m o n g n e a r l y a l l o r g a n i s m s , is i n v o l v e d in t h e s u r v i v a l of c e l l s e x p o s e d to h a r s h e n v i r o n m e n t s ( M o r i m o t o et a l . , 1993) . F i g u r e 1.1 s h o w s t h e m a i n f a c t o r s w h i c h s t i m u l a t e t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e , a l s o r e f e r r e d to a s t h e c e l l u l a r s t r e s s r e s p o n s e . A s F i g u r e 1.1 o u t l i n e s , this r e s p o n s e is i n v o l v e d in p r o t e c t i n g o r g a n i s m s f r o m d a m a g e w h i c h m a y b e c a u s e d b y e n v i r o n m e n t a l or, p a t h o p h y s i o l o g i c a l s t r e s s o r s a n d in n o n - s t r e s s f u l c o n d i t i o n s s u c h a s d e v e l o p m e n t a n d d i f f e r e n t i a t i o n ( M o r i m o t o , 1 9 9 2 ) . H s p s h a v e b e e n g r o u p e d into f o u r f a m i l i e s a c c o r d i n g to s i m i l a r i t i e s in t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t s a n d p r i m a r y s t r u c t u r e s . T h e f o u r m a j o r f a m i l i e s a r e : (1) 9 0 k D a , (2) 7 0 k D a , (3) 6 0 k D a a n d (4) t h e 1 6 - 3 0 k D a f a m i l i e s . T h e s e a r e u s u a l l y r e f e r r e d to a s h s p 9 0 , h s p 7 0 , h s p 6 0 a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( L M W ) h s p s , r e s p e c t i v e l y ( S c h l e s i n g e r et a l . , 1982) . T h e h s p f a m i l y m o s t c o m m o n l y i n d u c e d i n o r g a n i s m s e x p o s e d to s u b o p t i m a l p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s is c o m p o s e d o f p r o t e i n s o f r e l a t i v e m o l e c u l a r m a s s a b o u t 7 0 , 0 0 0 ( h s p 7 0 ) . T h i s f a m i l y o f h s p s is s y n t h e s i z e d b y b o t h p r o k a r y o t i c a n d e u k a r y o t i c c e l l s . Regulation of the h e a t shock response Transcriptional regulation ofhso70 gene expression: T h e h s p 7 0 g e n e h a s b e e n w e l l s t u d i e d a s a c l a s s i c a l h e a t s h o c k -r e s p o n s i v e g e n e . C e r t a i n g r o w t h h o r m o n e s , m i t o g e n s , s e r u m s t i m u l a t i o n , a n d v i r a l i n f e c t i o n s l e a d to t h e e x p r e s s i o n o f t h e h u m a n h s p 7 0 g e n e at t h e G 1 / S b o u n d a r y o f t h e c e l l c y c l e . T h e p r o m o t e r o f t h e h u m a n h s p 7 0 g e n e c o n t a i n s m u l t i p l e h e a t s h o c k e l e m e n t s ( H S E ) , w h i c h a r e i n v e r t e d r e p e a t s o f t h e p e n t a m e r i c s e q u e n c e n G A A n . T h e s e c o n f e r s t r e s s i n d u c i b i l i t y a n d h a v e a b a s a l p r o m o t e r r e g i o n c o m p r i s e d of a c o m p l e x a r r a y of c i s - b i n d i n g s i t e s ( S p 1 , C C A A T , 4 A T F ) , w h i c h a r e m u l t i p l e c i s - r e g u a l t o r y e l e m e n t s . T h e s e e l e m e n t s c o n f e r a r a n g e of c o n s t i t u t i v e a n d i n d u c i b l e t r a n s c r i p t i o n a l r e s p o n s e s to t h e h s p 7 0 g e n e . S i m i l a r e l e m e n t s a r e a l s o c o m m o n to t h e p r o m o t e r s of o t h e r h e a t s h o c k g e n e s ( M o r i m o t o et a l . , 1992) . I n d u c t i o n of h e a t s h o c k g e n e s in h i g h e r e u k a r y o t e s is m e d i a t e d b y t h e a c t i v a t i o n of a p r e - e x i s t i n g h e a t s h o c k f a c t o r ( H S F ) that b i n d s to a H S E , w h i c h is a target g e n e s e q u e n c e l o c a t e d in t h e p r o m o t e r s o f h e a t -i n d u c i b l e g e n e s ( P e l h a m 1 9 8 2 ; W u et a l . , 1990) . Heat shock factor structure and regulation: T w o a d j a c e n t r e g i o n s n e a r t h e a m i n o t e r m i n u s of H S F p r o t e i n s a r e r e q u i r e d f o r h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g of this p r o t e i n to t h e H S E . D e l e t i o n of a r e g i o n b e a r i n g c o n s e r v e d l e u c i n e z i p p e r m o t i f s a b o l i s h e s t h e m u l t i m e r i c a s s o c i a t i o n a n d h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g to t h e H S E ( W e s t w o o d et a l . , 1991) . T h e n a t i v e m o l e c u l a r m a s s o f a c t i v e a n d i n a c t i v e f o r m s of H S F h a s b e e n d e t e r m i n e d u s i n g w e s t e r n blot t ing af ter p o r e e x c l u s i o n limit e l e c t r o p h o r e s i s o n n o n d e n a t u r i n g g e l s . A n a l y s i s o f u n s h o c k e d Drosophila t i s s u e c u l t u r e c e l l s r e v e a l e d a s i n g l e c o m p l e x m i g r a t i n g at a n a t i v e r e l a t i v e m o l e c u l a r m a s s of a b o u t 2 2 0 , 0 0 0 . T h i s c o m p l e x r e a c t s wi th p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s r a i s e d to b a c t e r i a l l y p r o d u c e d H S F p r o t e i n ( a - H S F ) . H e a t i n g th is c o m p l e x in vitro r e s u l t s in a par t ia l d e p l e t i o n of t h e 2 2 0 K s p e c i e s a n d t h e a p p e a r a n c e of a 6 9 0 K H S F s p e c i e s , i n a d d i t i o n to a s m a l l a m o u n t o f h i g h e r M r m a t e r i a l . A n a l y s i s o f b o t h s m a l l a n d l a r g e H S F c o m p l e x e s f o r D N A - b i n d i n g ac t iv i ty ( b y m o b i l i t y shift t e c h n i q u e u s i n g p o r e e x c l u s i o n limit e l e c t r o p h o r e s i s ) r e v e a l e d that t h e 6 9 0 K s p e c i e s , but n o t t h e 2 2 0 K s p e c i e s , s h o w e d s p e c i f i c b i n d i n g to 3 2 P - l a b e l e d H S E . T h e 2 2 0 K H S F s p e c i e s t h e r e f o r e r e p r e s e n t s t h e i n a c t i v e f o r m o f H S F , a n d h e a t t r e a t m e n t c o n v e r t s it to t h e a c t i v e 6 9 0 K s p e c i e s ( W e s t w o o d et a l . , 1991) . F i g u r e 1.2 is a m o d e l o f H S F r e g u l a t i o n w h i c h h a s b e e n p r o p o s e d b y M o r i m o t o ( 1 9 9 3 ) but h a s y e t to b e p r o v e n . 5 M o n o m e r i c H S F is t h o u g h t to b e p r e s e n t in b o t h t h e c y t o p l a s m a n d n u c l e u s of u n s t r e s s e d c e l l s a n d h a s n o D N A b i n d i n g act ivi ty . U p o n o l i g o m e r i z a t i o n , t h e H S F s a r e r e d i s t r i b u t e d to Drosophila c h r o m o s o m a l puff s i t e s . T h e H S F a l s o b i n d to a s m a n y a s 1 5 0 o t h e r c h r o m o s o m a l s i t e s , s u c h a s d e v e l o p m e n t a l l o c i , w h i c h a r e r e p r e s s e d d u r i n g h e a t s h o c k . T h i s b i n d i n g s u g g e s t s a r e p r e s s o r r o l e of n o r m a l g e n e act ivi ty f o r H S F d u r i n g h e a t s t r e s s ( W e s t w o o d et a l . , 1991) . H S F a s s e m b l e s into a t r imer a n d a c c u m u l a t e s w i t h i n t h e n u c l e u s i n r e s p o n s e to h e a t s h o c k a n d o t h e r p h y s i o l o g i c a l s t r e s s o r s . H S F t r i m e r s b i n d to t h e H S E s , l o c a t e d in t h e 5 ' - f l a n k i n g s e q u e n c e s o n h e a t s h o c k r e s p o n s i v e g e n e s . T h e s e g e n e s a r e a c t i v a t e d w i t h i n m i n u t e s o f t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n . H S F - D N A b i n d i n g activity, h o w e v e r , d o e s n o t a l w a y s c o r r e l a t e w i t h t r a n s c r i p t i o n a l activity. T h i s s u g g e s t s that t h e r e a r e m u l t i p l e s t e p s in t h e a c t i v a t i o n p r o c e s s . H S F e x h i b i t s a s t r e s s - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n w h i c h m i g h t a f f e c t its t r a n s c r i p t i o n a l act ivity . T h e h e a t s h o c k - a c t i v a t e d t r a n s c r i p t i o n a l r e s p o n s e is a t t e n u a t e d if t h e c e l l s a r e e x p o s e d to p r o l o n g e d i n t e r m e d i a t e h e a t s h o c k . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e t r i m e r i c f o r m o f t h e H S F is t h o u g h t to b e c o n v e r t e d b a c k to t h e D N A n o n - b i n d i n g m o n o m e r i c f o r m a n d t h e d i s t r i b u t i o n r e t u r n s to t h e n o r m a l s u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s . U n d e r p r o l o n g e d h e a t s h o c k , h o w e v e r , s u s t a i n e d h e a t s h o c k g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d H S F D N A b i n d i n g act ivi ty is o b s e r v e d ( M o r i m o t o , 1 9 9 3 ) . H e a t s h o c k p r o t e i n s t h e m s e l v e s m a y r e g u l a t e h e a t s h o c k g e n e e x p r e s s i o n v i a a n a u t o r e g u l a t o r y l o o p ( M o r i m o t o , 1 9 9 3 ) . O n e p r o p o s e d h y p o t h e s i s is that a s t h e i n c r e a s e d l e v e l s o f m i s f o l d e d p r o t e i n s i n d u c e d d u r i n g h e a t s h o c k o r o t h e r f o r m s o f s t r e s s b i n d to H s p 7 0 , H S F b e c o m e s a c t i v a t e d a s it is r e l e a s e d f r o m H s p 7 0 . M o r i m o t o et a l . ( 1992 ) s h o w e d that H S F a s s o c i a t e s wi th h s p 7 0 a n d that t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e t w o i n c r e a s e s a s t h e h s p 7 0 l e v e l s i n c r e a s e in c e l l s e x p o s e d to h e a t . T h i s H S F - h s p 7 0 c o m p l e x is d i s r u p t e d u p o n a d d i t i o n of A T P o r o t h e r h y d r o l y z a b l e n u c l e o t i d e s w h i l e t h e 6 a d d i t i o n of n o n - h y d r o l y z a b l e n u c l e o t i d e a n a l o g u e s d o n o t d i s r u p t t h e c o m p l e x . N e g a t i v e r e g u l a t i o n of H S F b y h s p 7 0 is s u g g e s t e d , a s e x o g e n o u s r e c o m b i n a n t w i l d - t y p e h s p 7 0 c a n a s s o c i a t e with a c t i v a t e d H S F a n d d i s r u p t its D N A - b i n d i n g abil i ty . A m i n o - t e r m i n a l o r c a r b o x y - t e r m i n a l d e l e t i o n m u t a n t h s p 7 0 c a n n o t b i n d to H S F a n d b l o c k b i n d i n g to D N A . T h e i n h i b i t o r y ef fec t o f h s p 7 0 o n H S F - D N A c o m p l e x b i n d i n g is a b o l i s h e d b y A T P . T h e o l i g o m e r i c n a t u r e of t h e h e a t s h o c k f a c t o r p r o t e i n af ter e x p o s u r e of c e l l s to s t r e s s m a y e x p l a i n h o w t h e s e f a c t o r s c a n b i n d to t h e s t r u c t u r a l l y d is t inc t 5 b p u n i t s a n d to h e a t s h o c k e l e m e n t s w i t h m o r e t h a n 5 b p unit . B o t h a r r a n g e m e n t s of t h e 5 b p unit, h e a d - t o - h e a d a n d tai l - to- tai l , h a v e t h e s a m e affinity f o r H S F . T h e l e n g t h of t h e H S F footpr int i n c r e a s e s wi th t h e a d d i t i o n o f o t h e r 5 b p u n i t s to f o r m l o n g e r a r r a y s . T h e e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y of H S F - D N A c o m p l e x e s d e c r e a s e s m a r k e d l y with t h e a d d i t i o n of t h r e e 5 b p uni ts , s u g g e s t i n g that b i n d i n g o f t h e H S F t r i m e r s to D N A s u b u n i t s is d e t e r m i n e d b y t h e n u m b e r of 5 b p r e c o g n i t i o n s i te u n i t s that a r e c o r r e c t l y p o s i t i o n e d w i t h t h e a r r a y ( P e r i s i c e t a l . , 1 9 8 9 ) . S o r g e r a n d N e l s o n (1989) a l s o s u g g e s t e d that t h e o l i g o m e r i z a t i o n o f t h e y e a s t H S F f r o m Saccharomyces cervisiae l e a d s to t h e f o r m a t i o n of t r i m e r s in s o l u t i o n a n d b o u n d to D N A . T h e t r i m e r i z a t i o n o f H S F is p r o p o s e d to b e m e d i a t e d b y t h e o c c u r r e n c e of h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s at e v e r y 7 r e s i d u e s , l ike t h e l e u c i n e z i p p e r . T h i s m u l t i m e r i z a t i o n of H S F is t h o u g h t to b e e s s e n t i a l f o r affinity b i n d i n g of H S F to D N A . A m a r k e d d i f f e r e n c e e x i s t s b e t w e e n t h e H S F of y e a s t c e l l s a n d H S F of h u m a n c e l l s . Y e a s t c e l l H S F b i n d s to D N A at al l t e m p e r a t u r e s a n d t h e o l i g o m e r i z a t i o n s ta te o f t h e s e H S F a p p e a r s n o t to c h a n g e . In h u m a n ( H e L a ) a n d Drosophila c e l l s , h o w e v e r , H S F b i n d s to D N A o n l y af ter h e a t s h o c k . It is a s s u m e d that a t r a n s i t i o n b e t w e e n t h e m o n o m e r a n d t r i m e r s ta te of t h e s e H S F i n c r e a s e s t h e i r abi l i ty to b i n d D N A . 7 D e s p i t e w i d e s p r e a d c o n s e r v a t i o n of h e a t - s h o c k p r o t e i n s a n d t h e H S E s e q u e n c e in e u k a r y o t e s , t h e p r e d i c t e d a m i n o - a c i d s e q u e n c e s o f t h e c l o n e d H S F s a r e h i g h l y d i v e r g e n t , e x c e p t f o r t h e D N A - b i n d i n g d o m a i n a n d s e v e r a l h e p t a d r e p e a t s of h y d r o p h o b i c r e s i d u e s , o r l e u c i n e - z i p p e r m o t i f s . F o r Drosophila a n d S . cervisiae H S F s , d e l e t i o n o f a r e g i o n b e a r i n g c o n s e r v e d l e u c i n e z i p p e r m o t i f s a b o l i s h e s t h e m u l t i m e r i c a s s o c i a t i o n a n d h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g to H S E ( S o r g e r a n d N e l s o n , 1989) . T h e r e g u l a t o r y i n v o l v e m e n t of h e a t s h o c k f a c t o r s is d i f f e r e n t f o r e u k a r y o t e s a n d p r o k a r y o t e s . In h i g h e r e u k a r y o t e s , H S F is m a i n t a i n e d in a n o n -D N A b i n d i n g s t a t e in u n s t r e s s e d c e l l s a n d in r e s p o n s e to h e a t s h o c k a c q u i r e s a n o l i g o m e r i c s ta te a n d b i n d s to t h e H S E in t h e p r o m o t e r s o f h e a t s h o c k - r e s p o n s i v e g e n e s . In S . cervisiae, H S F c o n s t i t u t i v e l y b i n d s D N A a n d u n d e r g o e s h e a t -i n d u c e d p h o s p h o r y l a t i o n w i t h a n i n c r e a s e i n t r a n s c r i p t i o n a l ac t ivi ty . P h o s p h o r y l a t i o n of H S F is not e s s e n t i a l f o r o l i g o m e r i z a t i o n , a c q u i s i t i o n of D N A b i n d i n g activity, o r t r a n s l o c a t i o n o f H S F into t h e n u c l e u s . H o w e v e r , p h o s p h o r y l a t i o n m a y b e i m p o r t a n t f o r a t t a i n i n g m a x i m a l i n d u c i b l e t r a n s c r i p t i o n a l ac t iv i ty o r f o r a t t e n u a t i o n of t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . H S F s h a v e t w o h i g h l y c o n s e r v e d s e g m e n t s ; t h e a m i n o - t e r m i n a l l o c a l i z e d D N A b i n d i n g d o m a i n , w h i c h is a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 a m i n o a c i d s l o n g , a n d a motif of h y d r o p h o b i c h e p t a d r e p e a t s , w h i c h m e d i a t e s t h e o l i g o m e r i z a t i o n of H S F ( M o r i m o t o et a l . , 1 9 9 2 ) . A b r a v a y a et a l . ( 1 9 9 2 ) p e r f o r m e d g e l m o b i l i t y - s h i f t a s s a y s wi th a n o l i g o n u c l e o t i d e c o n t a i n i n g t h e H S E s e q u e n c e f r o m t h e h u m a n h s p 7 0 p r o m o t e r a n d w h o l e - c e l l e x t r a c t s f r o m h u m a n K 5 6 2 c e l l s p r e i n c u b a t e d with t h e a n t i - h s p 7 0 m o n o c l o n a l a n t i b o d y C 9 2 to d e t e r m i n e if h s p 7 0 a s s o c i a t e s with H S F . T h e y s h o w e d that t h e a d d i t i o n o f this a n t i - h s p 7 0 a n t i b o d y to e x t r a c t s f r o m c e l l s h e a t - s h o c k e d f o r 3 h r e s u l t s in t h e a p p e a r a n c e of s u p e r s h i f t e d c o m p l e x e s w h i l e t h e a d d i t i o n o f e q u i v a l e n t a m o u n t s of a n t i - m o u s e I g G h a d n o ef fec t o n t h e m o b i l i t y o f t h e H S F - H S E c o m p l e x . T h i s 8 s u g g e s t s that in c e l l s h e a t - s h o c k e d for 3 h , s o m e of t h e a c t i v a t e d H S F is c o m p l e x e d wi th h s p 7 0 . H s p 7 0 t h e r e f o r e p r e v e n t s t h e a c t i v a t i o n of H S F b y i n h i b i t i n g its t r a n s f o r m a t i o n f r o m t h e n o n - D N A - b i n d i n g s ta te to t h e D N A - b i n d i n g f o r m ; A T P a b o l i s h e d this i n h i b i t o r y effect . DNA recognition: E u k a r y o t i c h e a t s h o c k g e n e i n d u c t i o n in r e s p o n s e to a t e m p e r a t u r e u p s h i f t is m e d i a t e d b y t h e b i n d i n g of h e a t s h o c k f a c t o r (a t r a n s c r i p t i o n a l ac t iva tor ) to a h i g h l y c o n s e r v e d s h o r t D N A s e q u e n c e k n o w n a s h e a t s h o c k e l e m e n t . T h e s e a r e b e s t d e s c r i b e d a s c o n t i g u o u s a r r a y s of v a r i a b l e n u m b e r s of t h e 5 b p s e q u e n c e n G A A n a r r a n g e d in a l t e r n a t i n g o r i e n t a t i o n (n d e n o t e s l e s s s t r o n g l y c o n s e r v e d n u c l e o t i d e s that n e v e r t h e l e s s m a y b e i n v o l v e d in i m p o r t a n t D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s ) . T w o o r m o r e n G A A n u n i t s a r e r e q u i r e d f o r h i g h affinity b i n d i n g of h e a t s h o c k f a c t o r in vitro. T h e o r i e n t a t i o n of t h e s e uni ts c a n b e e i t h e r h e a d - t o - h e a d ( n G A A n n T T C n ) o r tail - to-tai l ( n T T C n n G A A n ) S o r g e r (1991) . In a d d i t i o n , a r e g i o n n e c e s s a r y f o r e f f i c ient t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n of t h e Drosophila h e a t - s h o c k g e n e f o r h s p 2 2 h a s b e e n i d e n t i f i e d d o w n s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n start s i te . T h e e x p r e s s i o n o f P - f a c t o r - m e d i a t e d m u t a n t g e n e i n s e r t i o n s s h o w that d e l e t i o n s w i t h i n t h e first 2 6 n u c l e o t i d e s b l o c k s t h e p r e f e r e n t i a l t r a n s l a t i o n of h s p 2 2 m R N A at h i g h t e m p e r a t u r e s . If this r e g i o n is intact , u p to 8 6 % of t h e l e a d e r c a n b e d e l e t e d w i t h o u t a f f e c t i n g t r a n s c r i p t i o n o r t r a n s l a t i o n ( H u l t m a r k et. a l . , 1986) . Translational control of the heat shock response: L e s s is k n o w n a b o u t t h e t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l of t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e c o m p a r e d to t h e t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l of t h e r e s p o n s e . O n e o f t h e b e s t e x a m p l e s of t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e i s s e e n in D . melanogaster c e l l s . T r a n s l a t i o n of p r e - e x i s t i n g m R N A s is r e p r e s s e d b y m o r e t h a n 9 5 % w i t h i n 1 0 m i n w h e n c e l l s f r o m this o r g a n i s m a r e s h i f t e d f r o m 2 5 ° to 9 3 7 ° C . W h e n n e w l y t r a n s c r i b e d m R N A s f o r h s p s a p p e a r in t h e c y t o p l a s m t h e 5' e n d o f their u n t r a n s l a t e d l e a d e r s e q u e n c e m e d i a t e s their p r e f e r e n t i a l t r a n s l a t i o n , to t h e vi r tual e x c l u s i o n of o t h e r p r o t e i n s a s l o n g a s t h e c e l l s a r e m a i n t a i n e d at e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s ( P e t e r s e n a n d L i n d q u i s t , 1 9 8 8 ) . C e l l s r e t u r n e d to 2 5 ° C c o n t i n u e to s y n t h e s i z e h s p s f o r a t i m e that is p r o p o r t i o n a t e to t h e s e v e r i t y o f t h e p r e c e d i n g s t r e s s o r . H s p 7 0 s y n t h e s i s is i n v a r i a b l y r e p r e s s e d w h e n t h e t r a n s l a t i o n of p r e - e x i s t i n g m R N A s is r e s t o r e d ( D i D o m e n i c o et a l . , 1 9 8 2 ) . U n u s u a l l y l o n g A - r i c h l e a d e r s e q u e n c e s a r e f o u n d in al l Drosophila h e a t - s h o c k g e n e s i n d u c e d in r e s p o n s e to e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s . I n d u c t i o n o f h e a t - s h o c k -p r o t e i n s y n t h e s i s is d u e b o t h to a n i n d u c e d t r a n s c r i p t i o n of t h e h e a t - s h o c k g e n e s a n d to t h e s e l e c t i v e t r a n s l a t i o n of t h e s e t r a n s c r i p t s ( H u l t m a r k et a l . , 1 9 8 6 ) . T h e p r o t e i n s y n t h e t i c m a c h i n e r y of h e a t - s h o c k e d c e l l s is m o d i f i e d s u c h that h e a t -s h o c k m e s s e n g e r s a r e p r e f e r e n t i a l l y t r a n s l a t e d ( S c o t t a n d P a r d u e , 1 9 8 1 ; K r u g e r a n d B e n e c k e , 1 9 8 2 ) . T h e r e p r e s s i o n of n o r m a l m e s s a g e t r a n s l a t i o n is d u e to t h e i n a c t i v a t i o n or m o d i f i c a t i o n of a f a c t o r that is r e q u i r e d f o r t h e t r a n s l a t i o n of n o r m a l c e l l u l a r m R N A s , p o s s i b l y t h e c a p - b i n d i n g f a c t o r . M a r o t o a n d S i e r r a ( 1988 ) s h o w e d wi th l y s a t e s f r o m h e a t - s h o c k e d Drosophila e m b r y o s that t r a n s l a t i o n o f h e a t - s h o c k m R N A is b a s i c a l l y u n a f f e c t e d b y t h e a d d i t i o n o f c a p a n a l o g u e s , w h i l e t h e r e s i d u a l s y n t h e s i s f r o m n o r m a l c e l l u l a r m R N A s is r e p r e s s e d . A n a n t i b o d y a g a i n s t t h e Drosophila c a p - b i n d i n g p r o t e i n b l o c k s t h e t r a n s l a t i o n o f t h e b u l k of n o r m a l c e l l u l a r m R N A s , but n o t t h e t r a n s l a t i o n o f h s p 7 0 m R N A ( L i n d q u i s t a n d P e t e r s e n , 1990) . H s p 7 0 is a s s o c i a t e d wi th t r a n s l a t i n g r i b o s o m e s a n d this a s s o c i a t i o n c a n b e d i s r u p t e d b y t h e d r u g p u r o m y c i n , w h i c h c a u s e s t h e r e l e a s e o f n a s c e n t p o l y p e p t i d e s f r o m t h e r i b o s o m e . H s p 7 0 m a y t h e r e f o r e a i d in t h e p a s s a g e of n a s c e n t p o l y p e p t i d e s t h r o u g h t h e r i b o s o m e c h a n n e l to t h e c y t o s o l ( N e l s o n et a l . , 1992) . 10 Functions of heat shock proteins H e a t s h o c k p r o t e i n s a r e not o n l y p r e s e n t w h e n o r g a n i s m s a r e e x p o s e d to s t r e s s f u l e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s , but a r e a l s o s y n t h e s i z e d b y c e l l s u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s ( C r a i g et a l . , 1983) . T h e c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d h e a t s h o c k p r o t e i n s , o f t e n r e f e r r e d to a s c o g n a t e s ( h s c ) a p p e a r to b e i m p o r t a n t f o r t h e r e g u l a t i o n of p r o t e i n h o m e o s t a s i s . M o l e c u l a r c h a p e r o n e s a r e a u b i q u i t o u s g r o u p of h s p s w h i c h i n c l u d e t h e h s p 9 0 , h s p 7 0 a n d h s p 6 0 , a l s o r e f e r r e d to a s c h a p e r o n i n . T h i s g r o u p of p r o t e i n s d i r e c t s t h e f o l d i n g a n d a s s e m b l y of o t h e r c e l l u l a r p r o t e i n s , a n d is a l s o i n v o l v e d in r e g u l a t i n g t h e k i n e t i c p a r t i t i o n i n g b e t w e e n p r o t e i n f o l d i n g , t r a n s l o c a t i o n r e a c t i o n s a n d p r o t e i n a g g r e g a t i o n ( S a n d e r s et a l . , 1 9 9 2 ) . P r o t e i n d e n a t u r a t i o n r e s u l t i n g in m i s f o l d i n g a n d a g g r e g a t i o n is c a u s e d b y t h e w e a k e n i n g o f p o l a r b o n d s a n d e x p o s u r e o f h y d r o p h o b i c g r o u p s , o f t e n t h e resul t of e x p o s u r e o f p r o t e i n s to a d v e r s e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c o n d i t i o n s ( W e d l e r , 1987) . T h e t e r m p r o t e o t o x i c i t y w a s c o i n e d b y H i g h t o w e r (1991 ) to u n d e r s c o r e this i m p o r t a n t t a rge t f o r s t r e s s o r - i n d u c e d d a m a g e . M e m b e r s of t h e h s p 7 0 a n d h s p 9 0 f a m i l i e s a r e i n v o l v e d in t h e a s s e m b l y a n d d i s a s s e m b l y of p r o t e i n s a n d p r o t e i n - c o n t a i n i n g s t r u c t u r e s ( P e l h a m , 1 9 8 6 ) . Chaperoning: M o l e c u l a r c h a p e r o n e s h a v e r e c e n t l y b e e n d e f i n e d a s a f a m i l y of u n r e l a t e d c l a s s e s of p r o t e i n s that m e d i a t e t h e c o r r e c t a s s e m b l y of o t h e r p o l y p e p t i d e s but that a r e not c o m p o n e n t s o f t h e f u n c t i o n a l a s s e m b l e d s t r u c t u r e s . T h e m o l e c u l a r c h a p e r o n e c o n c e p t s u g g e s t s that s e l f - a s s e m b l y is n o t t h e p r e d o m i n a n t p r o c e s s o f p r o t e i n a s s e m b l y in vivo; o b s e r v a t i o n s h a v e s h o w n that s o m e p r o t e i n s will n o t a s s e m b l e c o r r e c t l y u n l e s s a s s i s t e d b y o t h e r p r o t e i n s . T h e c h a p e r o n e f u n c t i o n a p p e a r s to b e r e q u i r e d b e c a u s e m a n y c e l l u l a r p r o c e s s e s that i n v o l v e p r o t e i n a s s e m b l y c a r r y a n i n h e r e n t r i s k o f m a l f u n c t i o n d u e to t h e 11 n u m b e r , v a r i e t y a n d flexibil i ty of t h e w e a k i n t e r a c t i o n s that h o l d p r o t e i n s in their f u n c t i o n a l c o n f o r m a t i o n s . It a p p e a r s to b e t h e r o l e o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s to c o m b a t t h e p r o b l e m of i n c o r r e c t i n t e r a c t i o n s w h i c h g e n e r a t e n o n f u n c t i o n a l s t r u c t u r e s ( E l l i s a n d v a n d e r V i e s , 1991) . hsp 60: T h e 6 0 K h s p f a m i l y o f ' c h a p e r o n i n s ' i n c l u d e s m i t o c h o n d r i a l h s p 6 0 , c h l o r o p l a s t R u b i s c o - s u b u n i t b i n d i n g p r o t e i n a n d G r o E L in Escherichia coli. T r a n s p o r t i n t e r m e d i a t e s of p r e c u r s o r p r o t e i n s h a v e b e e n u s e d to s h o w that h s p 6 0 i n t e r a c t s with i m p o r t e d p r o t e i n s in a n A T P - d e p e n d e n t r e a c t i o n , a n d p r o m o t e s t h e ( r e ) f o l d i n g a n d a s s e m b l y of p r o t e i n s . T h i s is a n i n d i c a t i o n that h s p 6 0 h a s t h e f u n c t i o n of a ' f o l d a s e ' ( K a n g et a l . , 1990) . U n l i k e h s p 7 0 , b i n d i n g o f c h a p e r o n i n s e e m s to i n v o l v e s i d e - c h a i n h y d r o p h o b i c i t y ( F l y n n et a l . , 1991) . F u r t h e r m o r e , c h a p e r o n i n ( c p n 6 0 ) f o r m s a n o l i g o m e r i c c o m p l e x that is a r r a n g e d a s a s i n g l e t o r o i d a l r i n g of s e v e n 6 0 - k D a s u b u n i t s ( V i i t a m i n et a l . , 1 9 9 2 ) . S e v e n i d e n t i c a l b i n d i n g s i t e s a r e c r e a t e d b y this " d o n u t " s t r u c t u r e . T h i s c o m p l e x b i n d s i n c o m p l e t e l y f o l d e d p r o t e i n s a n d d i r e c t s t h e f o l d i n g p e p t i d e to t h e c o r r e c t c o n f o r m a t i o n , in a n A T P - d e p e n d e n t f a s h i o n ( B u c h n e r et a l . , 1 9 9 1 ) . T h e c o m p l e x a l s o p r e v e n t s a g g r e g a t i o n of i n c o m p l e t e l y f o l d e d p r o t e i n s until t h e y a r e c o m p e t e n t f o r o l i g o m e r a s s e m b l y ( C h e n g et a l . , 1 9 8 9 ; M a r t i n et a l . , 1 9 9 1 ) . C h a p e r o n i n s y n t h e s i s i n c r e a s e s u n d e r a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s w h i c h c a u s e p r o t e i n d e n a t u r a t i o n . U n l i k e h s p 7 0 , h o w e v e r , c h a p e r o n i n is u n a b l e to b r e a k u p e x i s t i n g p r o t e i n a g g r e g a t e s ( C a l t a b i a n o et a l . , 1 9 8 8 ) . T h e s e d i f f e r e n c e s i n c o n f o r m a t i o n a l b i n d i n g s u g g e s t that c h a p e r o n i n a n d h s p 7 0 p e r f o r m d i f f e r e n t f o l d i n g f u n c t i o n s . hsp 70: H s p 7 0 is a u b i q u i t o u s a n d h i g h l y c o n s e r v e d f a m i l y o f s t r e s s p r o t e i n s . A t l e a s t 21 p r o t e i n s b e l o n g i n g to this m u l t i g e n e f a m i l y h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d . H s p 7 0 D N A a n d R N A f r o m m a m m a l s , f i s h , n e m a t o d e s a n d m o l l u s k s c r o s s -h y b r i d i z e , i n d i c a t i n g a h i g h d e g r e e o f s i m i l a r i t y in n u c l e o t i d e s e q u e n c e f r o m 12 t h e s e d i v e r s e p h y l a ( N o v e r a n d S c h a r f , 1991) . A n t i g e n i c a n d A T P - b i n d i n g d o m a i n s o n h s p 7 0 f r o m o r g a n i s m s a s d i v e r g e n t a s m o l l u s k s a n d h u m a n s a r e s i m i l a r , f u r t h e r i n d i c a t i n g t h e s imilar i ty of h s p 7 0 f r o m t h e s e d i v e r g e n t o r g a n i s m s ( M a r g u l i s et a l . , 1989) . H s p 7 0 s y n t h e s i s i n c r e a s e s d u r i n g a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s , a n d p r o t e c t s t h e c e l l s f r o m p r o t e o t o x i c i t y . C y t o p l a s m i c h s p 7 0 m i g r a t e s to t h e n u c l e u s , b i n d s to p r e - r i b o s o m e s a n d o t h e r p r o t e i n c o m p l e x e s to h e l p p r e v e n t their d e n a t u r a t i o n ( L i n d q u i s t 1 9 8 6 ; G e t h i n g a n d S a m b r o o k 1992) . T h e r e is a l s o e v i d e n c e that h s p 7 0 c a n p r e v e n t t h e f o r m a t i o n of i n s o l u b l e a g g r e g a t e s a n d b r e a k u p e x i s t i n g a g g r e g a t e s that c a n b e d a m a g i n g to t h e c e l l . T h e s e f u n c t i o n s m a y a l l o w d a m a g e d p r o t e i n s to r e f o l d a n d r e s u m e their n o r m a l b i o l o g i c a l act ivi ty ( E l l i s 1 9 9 0 ; G a i t a n a r i s et a l . 1 9 9 0 ; S k o w y r a et a l . , 1990) . D a m a g e d p r o t e i n s a r e a l s o v e c t o r e d to l y s o s o m e s f o r d e g r a d a t i o n b y h s p 7 0 ( C h i a n g et a l . , 1989) . H s p 7 0 is a l s o a m o l e c u l a r c h a p e r o n e , if it i s a s s u m e d that t h e p r i m a r y ef fec t of s t r e s s is to c a u s e t h e a p p e a r a n c e of i n t e r a c t i v e s u r f a c e s that a r e r e c o g n i z e d b y c h a p e r o n e s . T h e h s p 7 0 p r o t e i n s a r e p r o d u c e d b y p r o k a r y o t e s ( D n a K i n E. coli) a n d s e v e r a l c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s i n e u k a r y o t e s ( c y t o s o l i c c l a t h r i n - u n c o a t i n g A T P a s e a n d B i P in t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ) . N o n f u n c t i o n a l s t r u c t u r e s a p p e a r to b e p r e v e n t e d f r o m f o r m i n g w h e n p o l y p e p t i d e s i n t e r a c t w i t h h s p 7 0 d u r i n g t h e a s s e m b l y p r o c e s s . E x a m p l e s of t h e s e i n t e r a c t i o n s a r e : (1) t h e a s s o c i a t i o n of B i P p r o t e i n w i t h n a s c e n t u n f o l d e d p o l y p e p t i d e s a s t h e y e m e r g e in t h e l u m e n of e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m d u r i n g c o t r a n s l a t i o n a l p r o t e i n t r a n s p o r t , (2) t h e a s s o c i a t i o n o f h s p 7 0 , e n c o d e d b y t h e S S A 1 a n d S S A 2 g e n e s of y e a s t , wi th p r e c u r s o r p o l y p e p t i d e s d e s t i n e d to e n t e r t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m or m i t o c h o n d r i o n , w h i c h m a i n t a i n s t h e p o l y p e p t i d e s in a t r a n s l o c a t i o n - c o m p e t e n t c o n f o r m a t i o n . A n h s p 7 0 m e m b e r is a l s o r e q u i r e d in t h e m i t o c h o n d r i a l matr ix f o r p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a n d c o r r e c t f o l d i n g . H s p 7 0 a l s o 13 p r o m o t e s t h e d i s a s s e m b l y of p r o t e i n s w h i c h h a v e b e e n d a m a g e d a s a r e s u l t o f s t r e s s . H e a t - s h o c k p r o t e i n s a s s o c i a t e wi th t h e i n t e r a c t i v e s u r f a c e s o f d a m a g e d p r o t e i n s , a n d t h e A T P - m e d i a t e d r e l e a s e of t h e d e n a t u r e d p r o t e i n s a p p e a r s to f a v o r c o r r e c t r e a s s e m b l y o f t h e p r o t e i n s s t r u c t u r e s . D n a K f r o m E. coli c a u s e s t h e r e a p p e a r a n c e of R N A p o l y m e r a s e act ivi ty w h e n i n c u b a t e d wi th h e a t d e n a t u r e d i n a c t i v e p o l y m e r a s e a n d M g A T P a s e ( E l l i s a n d v a n d e r V i e s , 1 9 9 1 ) . hsp90: M e m b e r s o f t h e h s p 9 0 f a m i l y o f p r o t e i n s a r e m o l e c u l a r c h a p e r o n e s i n v o l v e d in s i g n a l t r a n s d u c t i o n b y s t e r o i d r e c e p t o r s . T h e s t e r o i d r e c e p t o r is b o u n d to h s p 9 0 in t h e a b s e n c e of s t e r o i d h o r m o n e s , a n d is u n a b l e to a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n of s t e r o i d - c o n t r o l l e d g e n e s . S t e r o i d h o r m o n e s d i s p l a c e t h e b o u n d h s p 9 0 , w h i c h r e s u l t s in a s t e r o i d - r e c e p t o r c o m p l e x c a p a b l e o f a c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o n . Y e a s t s t u d i e s s u g g e s t that this e f fec t is n o t o n e o f s t e r i c h i n d r a n c e o f t h e D N A b i n d i n g s i te b y h s p 9 0 . R e c e p t o r s c a n b e a c t i v a t e d b y t h e h o r m o n e o n l y if t h e y a r e initially b o u n d to h s p 9 0 , w h i c h a p p e a r s to b i n d to t h e r e c e p t o r a n d m a i n t a i n it in a n a c t i v a t a b l e c o n f o r m a t i o n ( E l l i s a n d v a n d e r V i e s , 1 9 9 1 ) . W i e c h et a l . ( 1992 ) h a v e s h o w n that H s p 9 0 s u p p r e s s e s t h e f o r m a t i o n o f p r o t e i n a g g r e g a t e s b y b i n d i n g to t h e target p r o t e i n s at a s t o i c h i o m e t r y o f o n e H s p 9 0 d i m e r to o n e o r two s u b s t r a t e m o l e c u l e ( s ) . It m a y b e that H s p 9 0 u s e s a n o v e l m o l e c u l a r m e c h a n i s m to a s s i s t p r o t e i n f o l d i n g in vivo a s this a c t i o n o f H s p 9 0 is n o t d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e of n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e . Small hsps: T h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t s t r e s s p r o t e i n s ( L M W ) a r e a d i v e r s e g r o u p of h e a t - i n d u c i b l e p r o t e i n s in t h e 2 0 - k D a r a n g e . T h e s e p r o t e i n s a r e m o r e s p e c i e s - s p e c i f i c a n d a r e l e s s c o n s e r v e d t h a n t h e o t h e r m a j o r s t r e s s p r o t e i n f a m i l i e s . T h e s e p r o t e i n s a r e , h o w e v e r , a l l h o m o l o g o u s to ct-crystallin a n d h a v e t h e abi l i ty to f o r m h i g h e r o r d e r s t r u c t u r e s o f a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 , 0 0 0 k D a . T h e y a r e n o t s y n t h e s i z e d u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , a s h s p 9 0 , h s p 7 0 a n d t h e c h a p e r o n i n s a r e . T h e s y n t h e s i s o f t h e s e p r o t e i n s is d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d 14 a n d is i n d u c e d b y a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( S a n d e r s , 1 9 9 3 ) . A l t h o u g h little is k n o w n of t h e m e c h a n i s m s in their t h e r m o t o l e r a n c e ro le , p r e s e n c e o f L M W h e a t s h o c k p r o t e i n s c o r r e l a t e s with a c q u i r e d t h e r m a l t o l e r a n c e in Drosophila a n d r o d e n t c e l l s ( B e r g e r a n d W o o d w a r d , 1 9 8 3 ; L a n d r y et a l . , 1989) . Protein folding Chaperonin: A s w a s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , h s p 6 0 i n t e r a c t s wi th i m p o r t e d p r o t e i n s in a n A T P - d e p e n d e n t r e a c t i o n , a n d p r o m o t e s t h e ( r e ) f o l d i n g a n d a s s e m b l y of p r o t e i n s ( K a n g et a l . , 1990) . B i n d i n g o f h s p 6 0 to p r o t e i n s a p p e a r s to i n v o l v e s i d e - c h a i n h y d r o p h o b i c i t y ( F l y n n e t a l . , 1 9 9 1 ) . C h a p e r o n i n ( c p n 6 0 ) f o r m s a n o l i g o m e r i c c o m p l e x that is a r r a n g e d a s a s i n g l e t o r o i d a l r i n g o f s e v e n 6 0 - k D a s u b u n i t s ( V i i t a n e n et a l . , 1992) . T h e r i n g r e s u l t s in s e v e n i d e n t i c a l b i n d i n g s i t e s c r e a t e d b y t h e " d o n u t " s t r u c t u r e . T h e c o m p l e x b i n d s i n c o m p l e t e l y f o l d e d p r o t e i n s a n d d i r e c t s t h e f o l d i n g p e p t i d e to t h e c o r r e c t c o n f o r m a t i o n , in a n A T P - d e p e n d e n t f a s h i o n ( B u c h n e r et a l . , 1991) . Hsp70: H s p 7 0 is p r e s e n t in t h e m i t o c h o n d r i a l matr ix a n d is i n v o l v e d in t h e ( r e ) f o l d i n g of p r o t e i n s w h i c h a r e u n f o l d e d d u r i n g t h e i r t r a n s l o c a t i o n f r o m t h e c y t o s o l t h r o u g h t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e to t h e m i t o c h o n d r i a l matrix . C y t o s o l i c h s p 7 0 , c a l l e d S s a 1 - 4 p in y e a s t , c o n f e r s t r a n s p o r t - c o m p e t e n c e to p r o t e i n p r e c u r s o r s , a s t h e y s t i m u l a t e t r a n s l o c a t i o n i n m i t o c h o n d r i a a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( K a n g et a l . , 1990) . H s p 7 0 is f o u n d in s e v e r a l s u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s a n d b i n d s p r i m a r i l y to a l i p h a t i c r e s i d u e s ( p r o b a b l y t h r o u g h h y d r o g e n b o n d i n g with t h e p e p t i d e b a c k b o n e , h y d r o p h o b i c c o n t a c t s , a n d sal t b r i d g e s wi th s i d e c h a i n s ) o n target p r o t e i n s ( F l y n n et a l . , 1 9 9 1 ; L a n d r y et a l , , 1 9 9 2 ) to m o d u l a t e p r o t e i n f o l d i n g , t r a n s p o r t a n d r e p a i r . C o g n a t e h s c 7 0 f a c i l i t a t e s t h e f o l d i n g of n e w p e p t i d e s b y s t a b i l i z i n g t h e p e p t i d e c h a i n s in a l o o s e l y f o l d e d s ta te until s y n t h e s i s h a s b e e n c o m p l e t e d , a n d t h e n p r e v e n t s i n c o r r e c t f o l d i n g of t h e p e p t i d e ( B e c k m a n n et a l . , 1 9 9 0 ; G e t h i n g a n d S a m b r o o k , 15 1992) . A T P h y d r o l y s i s a p p e a r s to b e n e c e s s a r y f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f h s p 7 0 f r o m t h e p r o t e i n d u r i n g t h e f o l d i n g p r o c e s s . S s d p ( m i t o c h o n d r i a l h s p 7 0 ) h a s b e e n s h o w n to b e r e q u i r e d in t h e m i t o c h o n d r i a l matr ix of y e a s t ( S . cervisiae) f o r t r a n s l o c a t i o n a n d ( r e ) f o l d i n g of p r o t e i n s w i t h i n t h e matr ix ( K o l l et a l . , 1992) . P r o t e i n s that r e m a i n in t h e matr ix af ter t r a n s l o c a t i o n a r e t r a n s f e r r e d f r o m h s p 7 0 to t h e c h a p e r o n i n h s p 6 0 , w h i c h is i n v o l v e d i n t h e i r A T P - d e p e n d e n t f o l d i n g a n d a s s e m b l y ( C h e n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . Membrane transport C o m p e l l i n g g e n e t i c a n d b i o c h e m i c a l e v i d e n c e s u g g e s t s that h s p 7 0 p r o t e i n s a i d in p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n . P r o t e i n s t r a n s l o c a t i n g into t h e m i t o c h o n d r i a m u s t u n f o l d o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e a n d t h e n r e f o l d o n t h e matr ix s i d e (this p r o c e s s is p r o m o t e d b y t h e h s p 6 0 p r o t e i n ) . U n f o l d i n g of t h e m i t o c h o n d r i a l p r e c u r s o r p r o t e i n s to r e a c h t r a n s l o c a t i n g - c o m p e t e n t c o n f o r m a t i o n r e q u i r e s e x t r a -m i t o c h o n d r i a l A T P ( R o t h m a n 1 9 8 9 ) . F i g u r e 1.3 is a m o d e l o f p r o t e i n i m p o r t a n d s o r t i n g p r o p o s e d b y F o l s c h et a l . (1996) . C y t o p l a s m i c h s c 7 0 s t i m u l a t e s t h e i m p o r t of p r o t e i n s into t h e m i t o c h o n d r i a a n d m a y e x p l a i n t h e d e p e n d e n c e o n A T P for t h e i m p o r t of p r o t e i n s ( M u r a k a m i et a l . , 1 9 8 8 ) . C y t o s o l i c h s p 7 0 , c a l l e d S s a 1 - 4 p in y e a s t s t i m u l a t e s t r a n s l o c a t i o n o f p r e c u r s o r p r o t e i n s into m i t o c h o n d r i a l a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( E R ) , s u g g e s t i n g that t h e s e h s p 7 0 s a r e i n v o l v e d in c o n f e r r i n g t r a n s p o r t c o m p e t e n c e to p r e c u r s o r s ( K a n g e t a l . , 1 9 9 0 ) . H s p 7 0 h a s b e e n s h o w n to h o l d s o m e p r o t e i n s i n a n u n f o l d e d c o n f i g u r a t i o n , w h i c h is n e c e s s a r y f o r t a r g e t i n g a n d t r a n s l o c a t i o n to c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s s u c h a s m i t o c h o n d r i a , c h l o r o p l a s t s a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( S a n d e r s et a l . , 1992) . S o m e p a t h w a y s of p r o t e i n s o r t i n g b e t w e e n t h e f o u r m i t o c h o n d r i a l s u b c o m p a r t m e n t s : (1) t h e o u t e r m e m b r a n e , (2) t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e , (3) t h e i n n e r m e m b r a n e , a n d (4) t h e matrix , h a v e b e e n c o n s e r v e d t h r o u g h o u t e v o l u t i o n (Hart l a n d N e u p e r t , 1 9 9 0 ) . K o l l et a l . ( 1 9 9 2 ) 16 u s e d t h e t r a n s l o c a t i o n of c y t o c h r o m e b 2 a c r o s s t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e to e l u c i d a t e t h e a n t i f o l d i n g r o l e of h s p 6 0 . T h e i r r e s u l t s s h o w that c y t o c h r o m e b 2 r e a c h e s t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e of m i t o c h o n d r i a af ter b e i n g t r a n s p o r t e d into t h e matr ix a n d t h e n e x p o r t e d a c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e p r i o r to a r r i v i n g at t h e i n n e r m e m b r a n e s p a c e . H s p 6 0 p r e v e n t s t h e f o l d i n g o f c y t o c h r o m e b 2 w h i l e t h e p r o t e i n is in t h e matrix . T h i s a l l o w s t h e p r o t e i n to b e e x p o r t e d to t h e i n n e r m e m b r a n e s p a c e w h i l e still in t h e u n f o l d e d s ta te . T h e e x p o r t s e q u e n c e in p r e -c y t o c h r o m e b 2 f u n c t i o n s b y i n h i b i t i n g t h e A T P - d e p e n d e n t r e l e a s e o f t h e p r o t e i n f r o m h s p 6 0 . In a d d i t i o n to A T P , t h e r e l e a s e f o r e x p o r t a p p a r e n t l y r e q u i r e s t h e i n t e r a c t i o n of t h e s i g n a l s e q u e n c e wi th a c o m p o n e n t o f t h e e x p o r t m a c h i n e r y in t h e i n n e r m e m b r a n e . If a cr i t ical l e n g t h of t h e p o l y p e p t i d e c h a i n h a s b e e n t r a n s l o c a t e d into t h e matrix, e x p o r t of t h e p o l y p e p t i d e c a n b e g i n , e v e n t h o u g h i m p o r t into t h e matr ix is not c o m p l e t e d . H s p 6 0 is t h e r e f o r e i n v o l v e d in t w o a c t i v i t i e s : (1) c a t a l y z i n g t h e f o l d i n g o f p r o t e i n s d e s t i n e d f o r t h e matrix , a n d (2) f a c i l i t a t i n g t h e c h a n n e l i n g of p r o t e i n s b e t w e e n t h e m a c h i n e r i e s f o r i m p o r t a n d e x p o r t a c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e . T h i s is a c c o m p l i s h e d b y m a i n t a i n i n g t h e p r o t e i n s in a n u n f o l d e d s tate . H y d r o p h o b i c e x p o r t s e q u e n c e s in c y t o c h r o m e b 2 m a y a c t a s a n t i f o l d i n g s i g n a l s to s w i t c h h s p 6 0 f r o m o n e f u n c t i o n to t h e o t h e r . T h e h e a t - s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e h a s b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y r e c e n t l y , a n d m u c h is k n o w n a b o u t t h e r o l e s of h s p s in r e g u l a t i n g t h e h s p r e s p o n s e , p r o t e i n f o l d i n g a n d t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n t r a n s p o r t . N e w i n s i g h t s into g e n e f u n c t i o n a n d r e g u l a t i o n in t h e f a c e of e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s , s u c h a s h e a t s h o c k , a r e b e g i n n i n g to e m e r g e wi th n u m e r o u s l a b o r a t o r i e s n o w i n v e s t i g a t i n g t h e m o l e c u l a r b i o l o g y of this r e s p o n s e . A n a r e a of i n v e s t i g a t i o n that h a s , h o w e v e r , r e c e i v e d little a t t e n t i o n h a s b e e n t h e ef fec t o f t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e o n h s p a b u n d a n c e in s t r e s s e d c e l l s o r w h o l e o r g a n i s m s . 17 P h y s i o l o g i c a l s t r e s s in f i s h T h e c o n c e p t o f s t r e s s is o n e that is n o t u n f a m i l i a r . O r g a n i s m s c a n b e c o m e s t r e s s e d w h e n p h y s i o l o g i c a l o r p s y c h o l o g i c a l c o n d i t i o n s a n d p a t t e r n s a r e e x t e n d e d b e y o n d their n o r m a l r a n g e . F i s h a r e n o e x c e p t i o n ; t h e y a r e e x p o s e d to s t r e s s o r s b o t h in their n a t u r a l e n v i r o n m e n t a n d in a q u a c u l t u r e f a c i l i t i e s ' o p e r a t i o n s . T h e intensi ty a n d t h e d u r a t i o n of e x p o s u r e to t h e s t r e s s o r m a y , to a l a r g e extent , d e t e r m i n e if t h e a n i m a l is c a p a b l e o f c o p i n g w i t h t h e s t r e s s ; m a n y n e g a t i v e i m p a c t s , e s p e c i a l l y o n h e a l t h , c a n a p p e a r w h e n f i s h a r e s u b j e c t e d to l o n g - t e r m s t r e s s . T h e r e a r e m a n y d e f i n i t i o n s of s t r e s s in f i s h ( s e e B a r t o n a n d I w a m a 1991) . H o w e v e r , t h e d e f i n i t i o n p r o p o s e d b y Brett (1958) , w h i c h s t a t e s that s t r e s s is " a s ta te p r o d u c e d b y a n e n v i r o n m e n t a l or o t h e r f a c t o r w h i c h e x t e n d s t h e a d a p t i v e r e s p o n s e s of a n a n i m a l b e y o n d t h e n o r m a l r a n g e o r w h i c h d i s t u r b s t h e n o r m a l f u n c t i o n i n g to s u c h a n e x t e n t that in e i t h e r c a s e , t h e c h a n c e s o f s u r v i v a l a r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d " will b e u s e d a s a c o n c e p t u a l f r a m e w o r k h e r e . W h i l e th is d e f i n i t i o n e x c l u d e s a n y a d a p t i v e a s p e c t s of s t r e s s , it d o e s p r o v i d e t h e r e s e a r c h e r wi th s o m e f i r m cr i ter ia b y w h i c h s t r e s s e d s t a t e s c a n b e d e f i n e d . In this r e g a r d it s t a n d s out a s a v e r y f u n c t i o n a l d e f i n i t i o n , c o m p a r e d to o t h e r s w h i c h a r e s o m e w h a t v a g u e b y t r y i n g to e n c o m p a s s al l c o n s i d e r a t i o n s . T h e f o l l o w i n g is a br ief o v e r v i e w o f t h e g e n e r a l i z e d s t r e s s r e s p o n s e in f i s h . T h e d a t a a r e h e a v i l y d o m i n a t e d b y s a l m o n i d s , a s m a n y s t u d i e s r e g a r d i n g s t r e s s p h y s i o l o g y in f i s h h a v e b e e n c o n d u c t e d in t e m p e r a t e a r e a s of t h e w o r l d w h e r e th is f a m i l y of f i s h e s h a s p r e v a i l e d a s t h e m o s t c o m m o n l y c o n s u m e d a s w e l l a s s t u d i e d s p e c i e s . T h i s o v e r v i e w c o n s i s t s of (1) a s u m m a r y of s o m e o f t h e c o m m o n f a c t o r s that c a n c a u s e s t r e s s in f i s h , (2) s o m e o f t h e c o m m o n l y s t u d i e d p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f f i s h to s t r e s s , (3) s o m e o f t h e i n d i c a t o r s o f s t r e s s e d s t a t e s in t h e f i e l d , a n d (4) t h e a p p l i c a t i o n s of s u c h k n o w l e d g e . S o m e i m p o r t a n t , 18 but little s t u d i e d a r e a s , s u c h a s t h e b e h a v i o r a l a s p e c t s a s s o c i a t e d wi th s t r e s s in f i s h a r e o n l y m e n t i o n e d a n d not d i s c u s s e d . M o s t p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s c a r r i e d o u t wi th f i s h s u b j e c t t h e a n i m a l to a c e r t a i n d e g r e e o f s t r e s s . In r e a d i n g this o v e r v i e w t h e r e a d e r s h o u l d b e c o m e a w a r e of t h e s t r e s s e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h u s e d f o r t h e s t u d i e s p r e s e n t e d in this t h e s i s . Common fish stressors T h e s e l e c t i o n of t h e s t r e s s o r s d i s c u s s e d h e r e is b y n o m e a n s m e a n t to e x c l u d e o t h e r p o s s i b l e s t r e s s o r s u n i q u e to c e r t a i n s p e c i e s o r g e o g r a p h i c a r e a s . W h i l e t h e c a t e g o r i e s of e n v i r o n m e n t a l , p h y s i c a l , a n d b i o l o g i c a l s t r e s s o r s a r e r a t h e r a rbi t rary t e r m s , t h e y h e l p to g r o u p t h e d i v e r s e p o s s i b l e s t r e s s o r s into a f e w t h e m e s . T h e s u s c e p t i b i l i t y of f i s h to d i f ferent s t r e s s o r s a l s o i n v o l v e s g e n e t i c c o m p o n e n t s . T h e r e a r e d i f f e r e n c e s in t h e s t r e s s r e s p o n s e s a m o n g s p e c i e s ( s e e B a r t o n a n d I w a m a , 1 9 9 1 ; V i j a y a n a n d M o o n , 1994) , a n d d i f f e r e n c e s a m o n g s t o c k s of t h e s a m e s p e c i e s in t o l e r a n c e to a p p l i e d s t r e s s o r s . It is n o t t h e i n t e n t i o n of this r e v i e w to d i s c u s s in a n y d e t a i l t h e e x t e n s i v e list o f k n o w n s t r e s s o r s to f i s h . T h e di f ferent t y p e s of p o t e n t i a l s t r e s s o r s that m a y a f f e c t f i s h h a v e s i m p l y b e e n s u m m a r i z e d . E n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s a r e m a i n l y a s s o c i a t e d wi th a d v e r s e c h e m i c a l c o n d i t i o n s of t h e w a t e r . A l t h o u g h p o l l u t a n t s a r e c o m m o n e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s , e x t r e m e c o n d i t i o n s o r c h a n g e s in w a t e r q u a l i t y p a r a m e t e r s s u c h a s d i s s o l v e d o x y g e n , a m m o n i a , h a r d n e s s , p H , g a s c o n t e n t a n d par t ia l p r e s s u r e s , a n d t e m p e r a t u r e c a n s t r e s s t h e f i s h . T a b l e 1.1 lists w a t e r q u a l i t y v a r i a b l e s f o u n d in p r i s t i n e w a t e r s , w h i c h a r e s u i t a b l e f o r r e a r i n g o f s a l m o n i d s s u c h a s trout a n d s a l m o n in a h e a l t h y a n d u n s t r e s s e d s ta te ( I w a m a et a l . 1996) . M e t a l s s u c h a s c o p p e r , c a d m i u m , z i n c , a n d i r o n c a n c a u s e s t r e s s a n d d e a t h in f i s h . C o n t a m i n a n t s s u c h a s a r s e n i c , c h l o r i n e , c y a n i d e , v a r i o u s p h e n o l s , a n d p o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l s a r e p o t e n t s t r e s s o r s f o r all s a l m o n i d s . O t h e r 19 p o t e n t i a l e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s i n c l u d e i n s e c t i c i d e s , h e r b i c i d e s , f u n g i c i d e s , a n d d e f o l i a n t s . Industr ia l , d o m e s t i c , a n d a g r i c u l t u r a l a c t i v i t i e s c e r t a i n l y a d d s u c h c o n t a m i n a n t s to t h e e n v i r o n m e n t , w h i c h m a y affec t f i s h at all life s t a g e s ( H e a t h , 1995) . P h y s i c a l s t r e s s o r s i n c l u d e t h o s e that a r e i n v o l v e d in h a n d l i n g , c r o w d i n g , c o n f i n e m e n t , t r a n s p o r t , o r o t h e r f o r m s of p h y s i c a l d i s t u r b a n c e . C h a s i n g f i s h to e x h a u s t i o n h a s b e e n a c o m m o n p r o t o c o l in s o m e p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s . A n g l i n g a l s o s t r e s s e s f i s h in this w a y . B i o l o g i c a l s t r e s s o r s c a n b e m a n i f e s t in d o m i n a n c e h i e r a r c h i e s w h i c h d e v e l o p b e t w e e n i n d i v i d u a l s w i t h i n c o n f i n e s s u c h a s e x p e r i m e n t a l t a n k s o r p o s s i b l y in n a t u r a l e n v i r o n m e n t s . D i s e a s e p a t h o g e n s c a n a l s o b e c o n s i d e r e d a s b i o l o g i c a l s t r e s s o r s . T h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e o f f i s h In r e s p o n s e to a s t r e s s o r s u c h a s h a n d l i n g o r c r o w d i n g , a f i s h will u n d e r g o a s e r i e s o f b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s in a n a t t e m p t to c o m p e n s a t e f o r t h e c h a l l e n g e i m p o s e d u p o n it, a n d t h e r e b y c o p e wi th t h e s t r e s s . T h e s t r e s s r e s p o n s e in f i s h h a s b e e n b r o a d l y c a t e g o r i z e d into t h e p r i m a r y , s e c o n d a r y a n d tert iary r e s p o n s e s ( M a z e a u d et a l . 1 9 7 7 ; W e d e m e y e r et a l . 1 9 9 0 ) In a d d i t i o n to t h e w h o l e a n i m a l c h a n g e s that h a v e b e e n w i d e l y s t u d i e d , r e c e n t r e p o r t s i n d i c a t e c e l l u l a r a d j u s t m e n t s in r e s p o n s e to di f ferent s t r e s s o r s w h i c h are c h a r a c t e r i z e d b y t h e e x p r e s s i o n of s t r e s s p r o t e i n s ( W e l c h , 1 9 9 3 ) . Primary response. T h i s initial r e s p o n s e r e p r e s e n t s t h e p e r c e p t i o n o f an a l t e r e d s t a t e a n d ini t iates a n e u r o e n d o c r i n e r e s p o n s e that f o r m s par t of t h e g e n e r a l i z e d s t r e s s r e s p o n s e in f i s h ( G a m p e r l et a l . 1994) . T h i s r e s p o n s e i n c l u d e s t h e r a p i d r e l e a s e of s t r e s s h o r m o n e s , c a t e c h o l a m i n e s a n d Cortisol, into t h e c i r c u l a t i o n . C a t e c h o l a m i n e s ( C A T S ) a r e r e l e a s e d f r o m t h e c h r o m a f f i n t i s s u e s i t u a t e d in t h e 20 h e a d k i d n e y of t e l e o s t s , a n d a l s o f r o m t h e e n d i n g s o f a d r e n e r g i c n e r v e s ( s e e R a n d a l l a n d P e r r y , 1 9 9 2 ) . C o r t i s o l is r e l e a s e d f r o m t h e i n t e r r e n a l t i s s u e , l o c a t e d in t h e h e a d k i d n e y , in r e s p o n s e to s e v e r a l pi tui tary h o r m o n e s , but m o s t p o t e n t l y to a d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e ( A C T H ) ( s e e B a l m et a l . 1994) . A r e c e n t s t u d y s h o w e d that A C T H m a y a l s o s t i m u l a t e e p i n e p h r i n e r e l e a s e , a n d that c h r o n i c Cortisol t r e a t m e n t m a y affect catecholamine s t o r a g e a n d r e l e a s e i n trout ( R e i d et a l . 1 9 9 6 ) . A s b o t h t h e chromaffin t i s s u e a n d t h e i n t e r r e n a l t i s s u e lie in c l o s e p r o x i m i t y in f i s h , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t to t h e p o s s i b i l i t y that a paracrine control for s t r e s s h o r m o n e r e g u l a t i o n e x i s t s in f i s h ( R e i d et a l . 1 9 9 6 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n s of b o t h h o r m o n e s a r e d e p e n d e n t o n a p p r o p r i a t e r e c e p t o r s o n ta rge t t i s s u e s . Secondary response: T h i s r e s p o n s e c o n s i s t s of t h e v a r i o u s b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s a s s o c i a t e d wi th s t r e s s , a n d m a y b e m e d i a t e d to a l a r g e e x t e n t b y t h e a b o v e s t r e s s h o r m o n e s . T h e s t r e s s h o r m o n e s a c t i v a t e a n u m b e r o f m e t a b o l i c p a t h w a y s s u c h a s t h e g l y c o l y t i c a n d g l u c o n e o g e n i c p a t h w a y s , w h i c h r e s u l t in a l t e r a t i o n s in b l o o d c h e m i s t r y a n d h e m a t o l o g y ( s e e M a u l e et a l . 1 9 8 9 ; B a r t o n a n d I w a m a , 1 9 9 1 ; R a n d a l l a n d P e r r y , 1 9 9 2 ; V i j a y a n et a l . , 1 9 9 4 b ) . Tertiary response: T h i s r e s p o n s e r e p r e s e n t s w h o l e a n i m a l a n d p o p u l a t i o n l e v e l c h a n g e s a s s o c i a t e d wi th s t r e s s ( W e d e m e y e r et a l . , 1990) . If t h e f i s h is u n a b l e to a c c l i m a t e o r a d a p t to t h e s t r e s s , w h o l e a n i m a l c h a n g e s m a y o c c u r a s a r e s u l t o f e n e r g y - r e p a r t i t i o n i n g b y d i v e r t i n g e n e r g y s u b s t r a t e s to c o p e w i t h t h e i n c r e a s e d e n e r g y d e m a n d a s s o c i a t e d wi th s t r e s s a n d a w a y f r o m a n a b o l i c ac t iv i ty s u c h a s g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n . T h u s , c h r o n i c e x p o s u r e to s t r e s s o r , a g a i n d e p e n d i n g o n t h e i n t e n s i t y a n d d u r a t i o n of t h e s t r e s s o r , c a n l e a d to d e c r e a s e s in g r o w t h , d i s e a s e r e s i s t a n c e , r e p r o d u c t i v e s u c c e s s , s m o l t i n g a n d s w i m m i n g p e r f o r m a n c e . 21 A t a p o p u l a t i o n l e v e l , d e c r e a s e d r e c r u i t m e n t a n d p r o d u c t i v i t y m a y a l ter c o m m u n i t y s p e c i e s a b u n d a n c e a n d d i v e r s i t y . Detection of Stressed States T h e d e t e c t i o n of s t r e s s e d s t a t e s in f i s h d e p e n d s u p o n t h e m e a s u r e m e n t o f t h e r e s p o n s e s d e s c r i b e d a b o v e . T h e r e a r e a n u m b e r o f m e t h o d s a v a i l a b l e f o r e v a l u a t i n g t h e e f f e c t s o f s t r e s s o n f i s h ( A d a m s 1 9 9 0 ; W e d e m e y e r e t a l . 1990) , but m a n y of t h e s e t e c h n i q u e s a r e o n l y a p p r o p r i a t e f o r r e s e a r c h o r c l i n i c a l l a b o r a t o r i e s , b e c a u s e t h e y i n v o l v e r e l a t i v e l y s o p h i s t i c a t e d p r o c e d u r e s a n d r e q u i r e e x p e n s i v e e q u i p m e n t to p e r f o r m . P l a s m a a d r e n a l i n e c o n c e n t r a t i o n s c a n b e m e a s u r e d b y H P L C ( s e e W o o d w a r d 1982) , a n d Cortisol c o n c e n t r a t i o n s c a n b e m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y ( e . g . K i t s - C l i n i c a l A s s a y , M a s s a c h u s e t t s ) o r b y E L I S A ( B a r r y et a l . 1993) . T a b l e 1.2 g i v e s e s t i m a t e s of a d r e n a l i n e , Cortisol a n d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s in t h e p l a s m a o f r e s t i n g a n d s t r e s s e d s a l m o n i d s . T h e s e v a l u e s s h o u l d s e r v e a s g e n e r a l g u i d e l i n e s a s i n d i v i d u a l c o n d i t i o n s of s p e c i e s , i n c l u d i n g pr ior r e a r i n g h i s t o r y a n d l o c a l e n v i r o n m e n t a n d s ta te of d e v e l o p m e n t will m o d i f y t h e p l a s m a v a l u e s f o r c o n t r o l a n d s t r e s s e d s t a t e s ( B a r t o n a n d I w a m a , 1991) . A s w e l l a s t h e m e a s u r e m e n t o f t h e s e s t r e s s h o r m o n e s , t h e m e a s u r e m e n t o f p l a s m a g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n h a s b e e n u s e d a s a n i n d i c a t o r o f s t r e s s e d s t a t e s i n f i s h . It is p r o b a b l y t h e m o s t c o m m o n l y m e a s u r e d s e c o n d a r y c h a n g e that o c c u r s d u r i n g t h e s t r e s s r e s p o n s e in f i s h ( W e d e m e y e r et a l . 1 9 9 0 ) . In a d d i t i o n to t h e m e a s u r e m e n t of t h e s t r e s s h o r m o n e s a n d g l u c o s e , t h e d e f i n i t i o n of t h e s t r e s s e d s ta te in f i s h u s e d h e r e i m p l i e s that m o n i t o r i n g of a n y p h y s i o l o g i c a l o r b e h a v i o r a l v a r i a b l e c o u l d b e u s e d a s a n i n d i c a t o r o f s t r e s s . T h i s is c e r t a i n l y t rue p r o v i d e d that g o o d c o n t r o l , o r r e s t i n g , v a l u e s d a t a a r e a v a i l a b l e f o r c o m p a r i s o n . H e m a t o l o g i c a l v a r i a b l e s s u c h a s h e m a t o c r i t , 22 h e m o g l o b i n c o n c e n t r a t i o n , r e d a n d w h i t e c e l l n u m b e r , a n d c lo t t ing t i m e c a n b e u s e d f o r s u c h p u r p o s e s . P l a s m a c o n c e n t r a t i o n s of i o n s a n d p r o t e i n c a n a l s o b e u s e f u l i n d i c a t o r s of p h y s i o l o g i c a l s t a t u s . A s e m i - q u a n t i t a t i v e p r o t o c o l f o r a s s e s s i n g t h e p h y s i c a l c o n d i t i o n o f f i s h h a s b e e n d e v e l o p e d a n d u s e d s u c c e s s f u l l y b y f i s h e r y b i o l o g i s t s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n a n d m o n i t o r i n g o f f i s h h e a l t h a n d q u a l i t y ( s e e G o e d e a n d B a r t o n 1990) . T e m p o r a l c h a n g e s in a n y of t h e s e v a r i a b l e s a r e vital in s u c h a s s e s s m e n t s . A r o u t i n e m o n i t o r i n g p r o g r a m that i n c o r p o r a t e s s e v e r a l o f t h e s e v a r i a b l e s c a n b e u s e d to s t u d y f i s h p o p u l a t i o n s , r a t h e r t h a n r e l y i n g o n a s i n g l e i n d i c a t o r r e f l e c t i n g o n l y o n e l e v e l of b i o l o g i c a l o r g a n i z a t i o n ( A d a m s , 1 9 9 0 ) . C l i n i c a l a s w e l l a s f i e l d m e t h o d s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n of o t h e r p h y s i o l o g i c a l v a r i a b l e s that m a y b e u s e f u l in s u c h a s s e s s m e n t s h a v e b e e n d e s c r i b e d ( s e e I w a m a et a l . 1995) . O b j e c t i v e o f the t h e s i s : T h e m a i n o b j e c t i v e of this t h e s i s w a s to e s t a b l i s h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e h s p a n d h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e s , a s n o s t u d i e s to d a t e h a v e i n v e s t i g a t e d h o w t h e two s t r e s s r e s p o n s e s interac t in s a l m o n i d s o r f i s h c e l l s e x p o s e d to s t r e s s f u l e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e p r i m a r y o b j e c t i v e w a s t h e n to e x a m i n e t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e w i t h i n t h e c o n t e x t of t h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e in f i s h . T h e f o l l o w i n g b a s i c q u e s t i o n s w e r e i n v e s t i g a t e d : (1) w h i c h h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e i n d u c e d w h e n w h o l e a q u a t i c o r g a n i s m s , o r t h e c e l l s of a q u a t i c o r g a n i s m s , a r e e x p o s e d to v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s , a n d (2) w h a t e f f e c t s d o t h e h o r m o n a l c h a n g e s a s s o c i a t e d wi th t h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e h a v e o n t h e h e a t s h o c k - p r o t e i n r e s p o n s e i n w h o l e a n i m a l t i s s u e s o r f i s h c e l l s c u l t u r e d in vitro ? 23 T h e s t u d i e s p r e s e n t e d in this t h e s i s w e r e c o n d u c t e d to test two h y p o t h e s e s , t h e first b e i n g that a g e n e r a l i z e d h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e w o u l d b e o b s e r v e d in f i s h or f i s h c e l l l i n e s e x p o s e d to v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . T h e s e c o n d h y p o t h e s i s w a s that t h e h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e , o b s e r v e d in p h y s i c a l l y s t r e s s e d f i s h , w o u l d affect t h e l e v e l s of h e a t s h o c k p r o t e i n s f o u n d in h e a t s h o c k e d f i s h . T h e s e two h y p o t h e s e s w e r e t e s t e d in t h e s t u d i e s d e s c r i b e d in C h a p t e r s 3 to 7. In C h a p t e r 3, n o v e l p r o t e i n s i n d u c e d in f o u r f i s h c e l l l i n e s e x p o s e d to h e a t s h o c k , p H c h a n g e , L - a z e t i d i n e a n d b l e a c h Kraft p u l p mill e f f l u e n t w e r e i d e n t i f i e d b y o n e a n d two d i m e n s i o n a l S D S - P A G E of r a d i o l a b e l e d p r o t e i n s . T h e e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d f o r th is c h a p t e r s h o w e d that n o v e l p r o t e i n s of 7 0 a n d 3 0 k D a w e r e , wi th f e w e x c e p t i o n s , c o n s i s t e n t l y s y n t h e s i z e d in r e s p o n s e to t h e v a r i o u s s t r e s s o r s t e s t e d . T h e e x p e r i m e n t d e s c r i b e d in c h a p t e r 4 f u r t h e r i n v e s t i g a t e d t h e h s p r e s p o n s e of t h e Chinook s a l m o n (Oncorhynchus tshawytscha) e m b r y o n i c c e l l l ine e x p o s e d to a w i d e p H r a n g e . T h i s c e l l l i n e w a s c h o s e n f o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n b e c a u s e it h a d b e e n f o u n d to exhibi t a s t r o n g h s p r e s p o n s e in p r e v i o u s h e a t s h o c k tr ials . R e s u l t s f r o m this c h a p t e r s h o w e d that a 7 0 k D a p r o t e i n w a s s y n t h e s i z e d in C H S E c e l l s e x p o s e d to l o w a n d h i g h p H , wi th a s t r o n g r e s p o n s e i n d u c e d w h e n c e l l s w e r e e x p o s e d to d e c r e a s e in p H , f r o m p H 7.5 to p H 7.0. E x p e r i m e n t s in C h a p t e r 5 d e s c r i b e d t h e t i m e c o u r s e a n d t i s s u e - s p e c i f i c h s p r e s p o n s e of s a l m o n i d s e x p o s e d to h e a t s h o c k . R e s u l t s f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s s h o w e d that h s p 7 0 a n d h s p 3 0 l e v e l s a r e c o n s i s t e n t l y e l e v a t e d in t h e f i s h t i s s u e s of f i s h e x p o s e d to h e a t s h o c k . T h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e w a s d e t e c t a b l e 1 h af ter h e a t s h o c k e d f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e a n d w e r e e l e v a t e d f o r a s l o n g a s t h r e e w e e k s af ter t h e h e a t s h o c k t r e a t m e n t . 24 F i s h gi l ls , l iver, a n t e r i o r k i d n e y , m u s c l e a n d r e d blood c e l l s f r o m h e a t s h o c k e d w h o l e f i s h all r e s p o n d e d with e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s . S k e l e t a l m u s c l e s s h o w e d a d e l a y e d o n s e t of h s p 7 0 e l e v a t i o n c o m p a r e d to t h e o t h e r t i s s u e s . A l t h o u g h h s p 3 0 l e v e l s d i d i n c r e a s e in r e s p o n s e to h e a t s h o c k , t h e r e s p o n s e w a s n o t a s p r o n o u n c e d a s that of h s p 7 0 . T h e s e c o n d h y p o t h e s i s t e s t e d w a s that i n t e r a c t i o n o c c u r s b e t w e e n t h e h o r m o n a l - s t r e s s a n d t h e h s p r e s p o n s e s of s a l m o n i d s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . E x p e r i m e n t s in C h a p t e r 6 d e s c r i b e d the e f f e c t s of h a n d l i n g a n d art i f ic ial e l e v a t i o n o f p l a s m a Cortisol ( b y i n t r a p e r i t o n e a l Cortisol i m p l a n t s ) o n the h e a t s h o c k protein l e v e l s of cut throat trout ( O . clarki) e x p o s e d to h e a t s h o c k . T h e p l a s m a Cortisol, g l u c o s e and ion concentrations, a s well a s the h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s , in t i s s u e s f r o m h a n d l e d o r c o r t i s o l - i n j e c t e d f i s h were m e a s u r e d to d e t e r m i n e if t h e s e t r e a t m e n t s w o u l d af fec t the h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e . A s e p a r a t e e x p e r i m e n t was p e r f o r m e d to d e t e r m i n e if p h y s i o l o g i c a l o r p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s of e p i n e p h r i n e e l i c i t e d a hsp r e s p o n s e in i s o l a t e d r a i n b o w trout ( O . mykiss) h e p a t o c y t e s m a i n t a i n e d in p r i m a r y c u l t u r e . R e s u l t s f r o m the experiments s h o w that a h a n d l i n g s t r e s s p r i o r to h e a t s h o c k e x p o s u r e c a u s e s h s p 7 0 a n d h s p 3 0 l e v e l s in t h e gill tissues o f c u t t h r o a t trout to b e s u p p r e s s e d r e l a t i v e to the l e v e l s observed i n gill tissues o f f i s h w h i c h w e r e o n l y h e a t s h o c k e d . E l e v a t e d p l a s m a Cortisol l e v e l s , c a u s e d b y intraperitoneal Cortisol implants, s u p p r e s s e d h s p 3 0 but not h s p 7 0 l e v e l s in t h e gill tissues o f c u t t h r o a t trout e x p o s e d to h e a t s h o c k . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t that t h e h s p 3 0 r e s p o n s e is d o w n r e g u l a t e d b y c o r t i c o s t e r o i d s w h i l e h s p 7 0 is d o w n r e g u l a t e d b y o t h e r f a c t o r s w h i c h are par t o f the h a n d l i n g s t r e s s r e s p o n s e s u c h a s t h e a d r e n a l i n e r e s p o n s e . R e s u l t s f r o m the h e p a t o c y t e e p i n e p h r i n e e x p o s u r e experiment s h o w e d that h s p 7 0 l e v e l s i n c r e a s e w h e n t h e s e c e l l s are e x p o s e d to p h y s i o l o g i c a l or p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s o f e p i n e p h r i n e in vitro. 25 E x p e r i m e n t s in d e s c r i b e d in A p p e n d i x 1 e x a m i n e d t h e ef fec t of c r u d e oi l o n t h e h s p r e s p o n s e o f two b e n t h i c f i s h s p e c i e s a n d two s h e l l f i s h s p e c i e s c h r o n i c a l l y e x p o s e d to a c o n t r o l l e d m a r i n e e n v i r o n m e n t c o n t a m i n a t e d wi th " F o r t i s " c r u d e oil a n d a n e w c r u d e oil a n t i - a d h e s i v e c o m p o u n d d e v e l o p e d f o r c r u d e o i l s p i l l r e m e d i a t i o n in a r c t i c e n v i r o n m e n t s . T i s s u e s f r o m e a c h o f t h e t w o f i s h a n d t h e two s h e l l f i s h s p e c i e s w e r e e x a m i n e d for t h e p r e s e n c e o f h e a t s h o c k p r o t e i n s b y W e s t e r n blot, u s i n g f i s h - s p e c i f i c , a n t i - h s p 7 0 a n d a n t i - h s p 3 0 p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . N o c h a n g e in h s p c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d in f i s h o r s h e l l f i s h t i s s u e s s a m p l e d f r o m c r u d e oil or a n t i - a d h e s i v e e x p o s e d a n i m a l s . 26 T a b l e 1.1 W a t e r q u a l i t y s t a n d a r d s n e c e s s a r y f o r r e a r i n g u n s t r e s s e d s a l m o n i d s ( f rom I w a m a et a l . , 1996) . V a r i a b l e T e m p e r a t u r e T o t a l G a s P r e s s u r e D i s s o l v e d O2 A m m o n i a P H C 0 2 S u s p e n d e d S o l i d s H 2 S ( h y d r o g e n s u l f i d e ) R a n g e 4 - 1 5 ° C < 1 0 3 % s a t u r a t i o n 6 .0 m g / L < 1 0 . 0 u g / L a s N H 3 6 . 5 - 8 . 5 < 2 0 . 0 m g / L < 3 .0 m g / L < 2 5 . 0 m g / L < 2 . 0 u g / L C o m m e n t s at t h e o u t f l o w N Q 2 - (ni t r i te)0 .015 @ [CI-] < 2 . 0 m g / L f o r i n c u b a t i o n of e g g s f o r g e n e r a l r e a r i n g a s u n d i s s o c i a t e d f o r m toxici ty a f f e c t e d b y [CI-] 27 T a b l e 1.2 C o m m o n p h y s i o l o g i c a l v a r i a b l e s m e a s u r e d to d e t e r m i n e s t r e s s l e v e l s in s a l m o n i d s ( I w a m a et a l . , 1996) . R e s t i n g S t r e s s e d A d r e n a l i n e ( n m o l e s / L ) < 3 2 0 - 7 0 C o r t i s o l ( n g / m L ) < 10 4 0 - 2 0 0 G l u c o s e ( m m o l / L ) <4 > 5 28 F i g u r e 1.1 T h e c e l l u l a r s t r e s s r e s p o n s e a n d its i n d u c e r s . E l e v a t e d l e v e l s o f s t r e s s p r o t e i n s a r e k n o w n to resul t f r o m e x p o s u r e o f c e l l s to t h r e e g e n e r a l c l a s s e s of s t r e s s o r s : 1. e n v i r o n m e n t a l a n d p h y s i o l o g i c a l s t r e s s o r s , 2. p a t h o p h y s i o l o g i c a l s t a t e s i n c l u d i n g d i s e a s e a n d 3. n o n - s t r e s s f u l c o n d i t i o n s s u c h a s c e l l g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t . S o m e of t h e s e s t r e s s o r s c a u s e h e a t s h o c k f a c t o r s ( H S F ) to b e c o m e a c t i v a t e d , e n t e r t h e n u c l e u s a n d b i n d to h e a t s h o c k e l e m e n t s ( H S E ) . H S E is t h e p r o m o t e r of h e a t s h o c k g e n e e x p r e s s i o n . A d a p t e d f r o m M o r i m o t o et a l . (1992) . 29 AMINO ACID ANALOGUES P. NON-STRESSFUL CONDITIONS CELL CYCLE GROWTH FACTORS DEVELOPMENT AND DIFFERENTIATION . PATHOPHYSIOLOGICAL STATE FEVER AND INFLAMATION HYPERTROPHY OXIDANT INJURY ISCHEMIA ANTI-NEOPLASTIC CHEMICALS VIRAL AND BACTERIAL INFECTION NEURONAL INJURY AGING ONCOGENES AND PROTO-ONCOGENES T h e c e l l u l a r s t r e s s r e s p o n s e a n d its i n d u c e r s . ( A d a p t e d f r o m M o r i m o t o et a l . , 1992). 30 F i g u r e 1.2 P r o p o s e d m o d e l of t h e h e a t s h o c k f a c t o r c y c l e . W h e n c e l l s a r e not s t r e s s e d , h e a t s h o c k f a c t o r ( H S F ) is t h o u g h t to m a i n t a i n e d in m o n o m e r i c , n o n -D N A b i n d i n g f o r m b y its i n t e r a c t i o n with h s p 7 0 (1). A s h e a t s h o c k , o r o t h e r s t r e s s o r a r e a p p l i e d , H S F m o n o m e r s t r i m e r i z e (2). T h i s t r i m e r t h e n b i n d s to s p e c i f i c s e q u e n c e e l e m e n t s in h e a t s h o c k g e n e p r o m o t e r s (3), a n d b e c o m e s p h o s p h o r y l a t e d (4). I n c r e a s e d l e v e l s of h s p 7 0 , r e s u l t i n g f r o m t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h e h e a t s h o c k g e n e s , l e a d s to t h e f o r m a t i o n of H S F - h s p 7 0 c o m p l e x e s (5). H S F t h e n d i s s o c i a t e s f r o m t h e D N A a n d is c o n v e r t e d to n o n -D N A b i n d i n g m o n o m e r s (6) ( h y p o t h e t i c a l m o d e l f r o m M o r i m o t o , 1 9 9 3 ) . 32 F i g u r e 1.3 P r o p o s e d m o d e l of i m p o r t a n d s o r t i n g of t h e B C S 1 p r o t e i n . A p o s i t i v e l y c h a r g e d s e g m e n t of a m i n o a c i d s w h i c h is l o c a t e d i m m e d i a t e l y C-t e r m i n a l to t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a c t s a s a n i n t e r n a l t a r g e t i n g s i g n a l . In o r d e r to f u n c t i o n , this s e q u e n c e is p o s t u l a t e d to c o o p e r a t e with t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n to f o r m a tight h a i r p i n l o o p s t r u c t u r e . T h i s l o o p is t r a n s l o c a t e d a c r o s s t h e i n n e r m e m b r a n e v i a t h e M I M / m t - H s p 7 0 m a c h i n e r y in a m e m b r a n e p o t e n t i a l - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e n o v e l m e c h a n i s m o f i m p o r t a n d s o r t i n g of t h e B C S 1 p r o t e i n is p r o p o s e d to r e p r e s e n t a m o r e g e n e r a l m e c h a n i s m u s e d b y a n u m b e r o f i n n e r m e m b r a n e p r o t e i n s . IM, i n n e r m e m b r a n e ; I M S , i n t e r m e m b r a n e s p a c e ; M I M , m i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e i m p o r t m a c h i n e r y ; 7 0 , m t / H s p 7 0 ; t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n ( a m i n o a c i d s 4 5 0 6 8 ) i s i n d i c a t e d b y a b l a c k b o x ; t h e i n t e r n a l t a r g e t i n g s e q u e n c e ( a m i n o a c i d s r e s i d u e s 6 9 - 8 3 ) is r e p r e s e n t e d b y a z i g z a g l ine with p o s i t i v e c h a r g e s ( f rom F o l s c h et a l . , 1 9 9 6 ) . 33 34 C h a p t e r 2 G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s This chapter is included as guide to the materials and methods which were common to chapters 5 and 6 as well a s the experiments descr ibed in appendix 1. Fish holding tanks, water quality and rearing conditions T h e holding tanks for all f ish were suppl ied with dechlor inated V a n c o u v e r city tap water (6.2-14.1 °C, pH 6.1, total hardness 4.2 mg/L; 0 2 10 mg/L). T h e f ish were held in 800- , 2 0 0 - or 5 0 - L tanks at a stocking density of ranging from 16.5 to 19.5 18 g/L and were fed to satiation once daily. F o o d w a s withheld for 48 h prior to all sampl ing periods. Fish anesthesia Al l f ish used for these studies were anesthet ized by gently dipnetting the them from their holding tank and transferring them to a bath containing 100 mg/L of tricaine methanesulfonate (TMS) buffered with an equal weight of sodium bicarbonate ( N a H C 0 3 ) . T h e anesthet ic bath w a s buffered to avo id the stressful effects of low pH which occur when T M S is added to soft f reshwater (Summerfelt and Smith, 1990) Blood sampling Blood sampl ing w a s performed on anesthet ized f ish or f ish which w e r e sacr i f iced with a b low to the head. Length and weight measurements w e r e taken on all f ish and then 0.5 mL of blood w a s drawn into hepar in ized tuberculin syr inges fitted with 2 0 G needles. The needles were inserted at a 45° angle, at the ventral midline, just posterior to the anal fin (see Houston, 1990). T h e 35 n e e d l e s w e r e i n s e r t e d until t h e y r e s t e d a g a i n s t t h e b a c k b o n e , at w h i c h p o i n t t h e y p e n e t r a t e t h e c a u d a l v e s s e l s w h i c h lie b e t w e e n a d j a c e n t hemal a r c h e s . A l l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d w i t h i n 2 m i n of r e m o v i n g t h e f i s h f r o m t h e w a t e r . E a c h b l o o d s a m p l e w a s t h e n t r a n s f e r r e d to 1 . 5 - m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s a n d c e n t r i f u g e d f o r 2 m i n at 1 1 , 6 0 0 g in a M i c r o - C e n t a u r C e n t r i f u g e ( M S E S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , S u s s e x , E n g l a n d ) . T h e p l a s m a f r a c t i o n w a s t h e n a s p i r a t e d f r o m t h e r e d b l o o d c e l l p e l l e t s , t h e p e l l e t s w e r e f r o z e n o n d r y i c e a n d t h e n s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e p r o c e s s e d for B C A p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n a n d S D S - P A G E . P l a s m a f r a c t i o n s w e r e s i m i l a r l y f r o z e n a n d s t o r e d until p l a s m a Cortisol, g l u c o s e a n d i o n d e t e r m i n a t i o n s . Plasma Cortisol determination P l a s m a Cortisol c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a s o l i d - p h a s e c o a t -A - C o u n t ® 1 2 5 l - r a d i o i m m u n o a s s a y ( D i a g n o s t i c P r o d u c t s C o r p o r a t i o n , L o a A n g e l e s , C A ) . In this p r o c e d u r e , 1 2 5 l - l a b e l e d Cortisol c o m p e t e s f o r a f i x e d t i m e wi th Cortisol in t h e s a m p l e , for a n t i b o d y s i t e s w h i c h a r e i m m o b i l i z e d o n t h e w a l l of a p o l y p r o p y l e n e t u b e . D e c a n t i n g t h e s u p e r n a t a n t is s u f f i c i e n t to t e r m i n a t e t h e c o m p e t i t i o n a n d to i s o l a t e t h e a n t i b o d y - b o u n d f r a c t i o n of t h e r a d i o l a b e l e d Cortisol. C o u n t i n g t h e t u b e in a g a m m a c o u n t e r t h e n y i e l d s a n u m b e r w h i c h c a n b e c o n v e r t e d , b y w a y of a c a l i b r a t i o n c u r v e , to a v a l u e f o r t h e Cortisol c o n c e n t r a t i o n in t h e s a m p l e . T h i s p r o c e d u r e w a s m o d i f i e d f r o m F o s t e r a n d D u n n ( 1 9 7 4 ) a n d v a l i d a t e d f o r u s e w i t h f i s h p l a s m a b y R e d d i n g et al. ( 1 9 8 4 ) w h o s h o w e d that c r o s s r e a c t i v i t y wi th c o r t i s o n e , t h e o t h e r m a j o r c o r t i c o s t e r o i d in t e l e o s t e a n f i s h e s , is 7 .0%. . A l l f r o z e n p l a s m a s a m p l e s in h e p a r i n i z e d m i c r o c a p i l l a r y t u b e s w e r e t h a w e d a n d 10 pl of p l a s m a w a s t r a n s f e r r e d into e a c h a n t i b o d y - c o a t e d p o l y p r o p y l e n e t u b e direc t ly , w i t h o u t s a m p l e p r e p a r a t i o n . 1 .0 m L o f 1 2 5 l Cortisol 36 w a s a d d e d to e v e r y t u b e w h i c h w a s t h e n m i x e d a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 4 5 m i n . E a c h t u b e w a s t h e n d e c a n t e d t h o r o u g h l y to s t o p t h e r e a c t i o n a n d c o u n t e d for 1 m i n in a 1 2 8 2 C o m p u g a m m a C S u n i v e r s a l g a m m a c o u n t e r ( L K B W a l l a c e , T u r k u , F i n d l a n d ) . Cell lines T h e f o u r f i s h c e l l l i n e s u s e d in C h a p t e r s 3 a n d 4 e x p e r i m e n t s w e r e : 1) r a i n b o w trout g o n a d a l c e l l s ( R T G - 2 ; A T C C , C R L 5 5 ) , 2) r a i n b o w trout h e p a t o m a c e l l s ( R T H - 1 4 9 ; A T C C . C R L 1 7 1 0 ) , 3) c h i n o o k s a l m o n e m b r y o n i c c e l l s ( C H S E -2 1 4 ; A T C C . C R L 1 6 8 1 ) a n d 4) c a r p (Cyprinus carpio) e p i t h e l i a l c e l l s ( E P C ; F i j a n et a l . , 1983) . T h e c e l l l i n e s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e P a c i f i c B i o l o g i c a l S t a t i o n , D e p a r t m e n t of F i s h e r i e s a n d O c e a n s , N a n a i m o , B . C . , C a n a d a . T h e y w e r e m a i n t a i n e d in M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u m ( M E M ) w i t h E a r l e ' s s a l t s , s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l c a l f s e r u m , 1 5 m M H E P E S ( G I B C O ) a n d 2 . 2 m g / m L N a H C 0 3 in a i r at 2 0 ° C . T h e c e l l s w e r e c u l t u r e d in 7 5 cm2 t i s s u e c u l t u r e f l a s k s ( N a l g e n e ) . T h e y w e r e s u b c u l t u r e d a s t h e y a p p r o a c h e d c o n f l u e n c e a n d w e r e u s e d in t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s a s t h e y b e c a m e c o n f l u e n t . Rao7o/abe//A7a/ A l l c e l l s w e r e r a d i o l a b e l e d b y r e m o v i n g t h e g r o w t h m e d i u m f r o m t h e c u l t u r e f l a s k s a n d a d d i n g 3 m L of m e t h i o n i n e - f r e e m e d i u m c o n t a i n i n g 5 0 o r 1 0 0 u C i o f [35S]-methionine p e r m L ( N e w E n g l a n d N u c l e a r ) p e r m L o f m e d i u m . F o l l o w i n g e a c h e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t ( T a b l e 1) a n d r a d i o l a b e l i n g , t h e [35S]-m e t h i o n i n e m e d i u m w a s r e m o v e d f r o m e a c h f l a s k a n d t h e c e l l s w e r e g e n t l y w a s h e d t w i c e f o r 5 m i n wi th c o m p l e t e m e d i u m . T h e w a s h e s w e r e d i s c a r d e d a n d 3 m L o f f r e s h c o m p l e t e m e d i u m w a s a d d e d to e a c h f l a s k . T h e c e l l s w e r e t h e n s c r a p e d off of t h e b o t t o m o f t h e f l a s k s u s i n g a c e l l s c r a p e r a n d t h e s u s p e n s i o n 37 w a s t r a n s f e r r e d to a s ter i le c u l t u r e t u b e . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s m i x e d a n d a l i q u o t e d into 1 . 5 - m L E p p e n d o r f t u b e s . T h e s a m p l e s w e r e f r o z e n a n d s t o r e d at - 8 0 ° C until t h e y w e r e r u n o n S D S - P A G E g e l s . Radiolabeled cell sample preparation T h e l a b e l e d c e l l s w e r e t h a w e d a n d b o i l e d f o r 5 m i n w i t h a n e q u a l v o l u m e of L a e m m l i s a m p l e b u f f e r (60 m M T r i s - H C l , 1 0 % g l y c e r o l , 2 % S D S , 1 % Q>-m e r c a p t o e t h a n o l a n d 0 . 0 0 1 % b r o m o p h e n o l b l u e ; p H 6.8) . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c o o l e d to r o o m t e m p e r a t u r e , a n d , if v i s c o u s , w a s e x t r u d e d t h r e e of f o u r t i m e s t h r o u g h a 2 7 G n e e d l e fi t ted to a 1 - m L s y r i n g e . T h e s u s p e n s i o n w a s t h e n c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n for 1 m i n at 1 5 , 0 0 0 g . Tissue sample preparation A l l f i s h a n d s h e l l f i s h t i s s u e s w e r e p r e p a r e d f o r t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) a s s a y a n d S D S - P A G E a s f o l l o w s . T h e 1 -g t i s s u e s a m p l e s w e r e t h a w e d o n i ce , f r o m - 2 0 ° C at w h i c h t h e y w e r e s t o r e d , a n d r i n s e d in 1 0 m L of 5 0 0 - m M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7.5). A 0 . 5 - g s a m p l e of t i s s u e w a s a d d e d to 1.0 m L o f h y p o t o n i c s o l u t i o n ( 1 0 0 m M T r i s - H C l ( p H 7.5); 0 . 1 % S D S ; 0.1 m M P M S F ) a n d 2 5 0 u L of a 5 X p r o t e a s e i n h i b i t o r c o c k t a i l ( 5 . 0 m M P M S F ; 7 . 5 m M E D T A ; 5 u M p e p s t a t i n A ; 5 p M l e u p e p t i n ; 1.5 u M a p r o t i n i n in 1 0 m M T r i s - H C l ( p H 7 . 5 ) ) . E a c h s a m p l e w a s h o m o g e n i z e d o n i c e f o r 3 0 s u s i n g a t e f l o n t i p p e d h o m o g e n i z e r ( T R I - R I n s t r u m e n t s , J a m a i c a , N Y ) m o u n t e d i n a 1 0 - m m T y p e 6 h a n d h e l d e l e c t r i c drill ( B l a c k & D e c k e r , B r o c k v i l l e , O n t . ) r e v o l v i n g at 1 0 0 - 1 2 5 r p m with s p e e d r e g u l a t e d b y a n A D J U S T - A - V O L T v o l t a g e r e g u l a t o r ( S t a n d a r d E l e c t r i c P r o d u c t C o . , D a y t o n O H . ) . T h e h o m o g e n i z e d t i s s u e s w e r e t r a n s f e r r e d to 1.5 m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s a n d c e n t r i f u g e d at 1 7 , 0 0 0 g f o r 4 5 m i n at 4 ° C . T h e s u p e r n a t a n t w a s s e p a r a t e d into two f r a c t i o n s ; 1 5 0 pl w a s u s e d d i r e c t l y f o r t h e 38 B C A p r o t e i n a s s a y a n d a 6 5 0 - u l f r a c t i o n w a s m i x e d 1:1 w i t h 2 X L a e m m l i s a m p l e b u f f e r ( 1 2 0 m M T r i s - H C l , 2 0 % g l y c e r o l , 4 % S D S , 2 % 1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 0 . 0 0 2 % b r o m o p h e n o l b l u e ; p H 6.8), b o i l e d for 3 m i n u t e s a n d s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e r u n o n S D S - P A G E g e l s . Bicinchoninic acid protein assay T h e b i c i n c h o n i n i c a c i d p r o t e i n a s s a y c o m b i n e s t h e r e d u c t i o n of C u + 2 b y p r o t e i n to C u + 1 , in a n a l k a l i n e m e d i u m , with t h e c u p r o u s ( C u + 1 ) i o n d e t e c t i n g p r o p e r t y of B C A ( S m i t h et a l . , 1985) . T h e p u r p l e - c o l o r e d p r o d u c t o f this a s s a y is f o r m e d b y t h e i n t e r a c t i o n of two m o l e c u l e s of B C A with o n e c u p r o u s i o n . T h e s t r u c t u r e of t h e p r o t e i n , t h e p r e s e n c e of f o u r a m i n o a c i d s ( c y s t e i n e , c y s t i n e , t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e ) a n d t h e n u m b e r of p e p t i d e b o n d s a r e r e s p o n s i b l e f o r c o l o r f o r m a t i o n in p r o t e i n s a m p l e s . T h e C u + 1 - B C A c o m p l e x is w a t e r s o l u b l e a n d e x h i b i t s a s t r o n g a b s o r b a n c e at 5 6 2 n m . T h i s B C A a s s a y w a s u s e d i n a 9 6 - w e l l m i c r o p l a t e f o r m a t , w h i c h a l l o w e d t h e u s e of o n l y 10 pi o f s a m p l e s u p e r n a t a n t p e r q u a n t i t a t i o n . T h e w o r k i n g s o l u t i o n of B C A / c o p p e r s u l f a t e (50 :1) w a s p r e p a r e d f r e s h d a i l y b y m i x i n g 5 0 p a r t s of b i c i n c h o n i n i c a c i d s o l u t i o n ( S i g m a , M i s s i s s a u g a , O n t . ) wi th o n e part of 4 % w / v c o p p e r s u l f a t e ( C u 2 S 0 4 - 5 H 2 0 ) . P r o t e i n s t a n d a r d s w e r e p r e p a r e d f r o m s t a n d a r d b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) ( S i g m a , M i s s i s s a u g a , O n t . ) . T e n m i c r o l i t e r s of e a c h s t a n d a r d w e r e a d d e d to t h e first t h r e e c o l u m n s o n t h e p l a t e a n d s t a n d a r d s w e r e all d o n e in t r ipl icate . S e r i a l d i l u t i o n s of t h e s a m p l e s u p e r n a t a n t w e r e q u a n t i f i e d to e n s u r e that o n e d i l u t i o n l e v e l w o u l d lie w i t h i n t h e 5 0 - to 4 0 0 - u g / m L r a n g e of t h e s t a n d a r d s . T h e t o p o f e a c h w e l l w a s s e a l e d wi th 6 - c m w i d e T u c k T a p e © t r a n s p a r e n t p a c k i n g t a p e ( C a n a d i a n T e c h n i c a l T a p e L t d . , M o n t r e a l , Q u e . ) a n d t h e p l a t e s w e r e f l o a t e d in a 6 0 ° C w a t e r b a t h f o r 1 5 m i n . T h e a b s o r b a n c e at e a c h w e l l w a s r e a d at 5 6 2 n m with a m o d e l 3 5 5 0 m i c r o p l a t e r e a d e r ( B i o - R a d , L a b o r a t o r i e s , C A ) . 39 A b s o r b a n c e v a l u e s f r o m t h e s t a n d a r d s , m e a s u r e d at 5 7 0 n m , w e r e u s e d to g e n e r a t e a r e g r e s s i o n e q u a t i o n f o r s t a n d a r d p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . SDS-PAGE (one dimensional gels) T h e l a b e l e d c e l l s w e r e t h a w e d a n d b o i l e d f o r 5 m i n wi th a n e q u a l v o l u m e of L a e m m l i s a m p l e b u f f e r (30 m M T r i s - H C l ( p H 6.8), 1 0 0 m M g l y c e r o l , 7 0 m M S D S , 0 .7 M f i - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 2 0 u M b r o m o p h e n o l b l u e ) . T h e s o l u t i o n w a s c o o l e d to r o o m t e m p e r a t u r e , a n d w a s e x t r u d e d t h r e e or f o u r t i m e s t h r o u g h a 2 7 G n e e d l e fi t ted to a s y r i n g e if t h e s o l u t i o n w a s v i s c o u s . T h e s o l u t i o n w a s t h e n c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 m i n at 1 5 , 0 0 0 g . O n e d i m e n s i o n a l S D S - P A G E w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g to t h e d i s c o n t i n u o u s s y s t e m of L a e m m l i (1970 ) u s i n g a M i n i - P r o t e a n II D u a l S l a b C e l l ( B i o - R a d ) with a 4 % s t a c k i n g g e l a n d a 1 2 . 5 % r e s o l v i n g g e l . B r o m o p h e n o l B l u e (0 .001%) w a s a d d e d to t h e s t a c k i n g g e l p r e p a r a t i o n to h e l p v i s u a l i z e t h e w e l l s e p t a w h i l e l o a d i n g t h e s a m p l e s . A l a n e o n e a c h g e l w a s l o a d e d with 2 0 - 3 0 u g of p r e s t a i n e d m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ( G i b c o - B R L Inc., B u r l i n g t o n , O n t ) , w h i c h w e r e u s e d to e s t i m a t e t h e m o l e c u l a r m a s s o f e a c h p r o t e i n b a n d s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s . N o t e that t h e m o l e c u l a r w e i g h t s of u n k n o w n p r o t e i n s a r e o n l y e s t i m a t e s a s t h e i r p o s i t i o n r e l a t i v e to t h e k n o w n m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s w a s e s t i m a t e d . E a c h w e l l r e c e i v e d 5 0 u g of p r o t e i n , a s d e t e r m i n e d b y t h e B i c h i n c o n i n i c a c i d p r o t e i n a s s a y . C l a r i f i e d s a m p l e s u p e r n a t a n t s w e r e t h a w e d f r o m - 2 0 ° C a n d w e r e l o a d e d d i r e c t l y to t h e s t a c k i n g w e l l s af ter t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s o f al l w e r e a d j u s t e d to t h e s a m e l e v e l b y d i l u t i n g t h e c o n c e n t r a t e d s a m p l e s wi th L e a m m l i ' s s a m p l e buffer . T h i s p r a c t i c e e n a b l e d l o a d i n g t h e s a m e v o l u m e into e a c h w e l l a n d h e l p e d p r e v e n t b a n d d i s t o r t i o n s w h i c h c a n resul t f r o m u n e v e n i o n i c c o n t e n t c a u s i n g e l e c t r i c f i e l d d i s t o r t i o n s w i t h i n t h e g e l . E l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d at 2 0 0 V until t h e d y e front r e a c h e d t h e b o t t o m of t h e r e s o l v i n g g e l . 40 Two dimensional gels T w o d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s u s i n g i s o e l e c t r i c f o c u s i n g f o l l o w e d b y S D S - P A G E w a s d o n e a c c o r d i n g to t h e O ' F a r r e l l ( 1975 ) m e t h o d , a s d e s c r i b e d b y W e l c h a n d F e r a m i s c o (1985) . C l a r i f i e d s a m p l e s u p e r n a t a n t s w e r e i n c u b a t e d with a n e q u a l v o l u m e of i s o e l e c t r i c s a m p l e b u f f e r (10 M u r e a , 1.6 % N P - 4 0 , 5 . 0 % a m p h o l y t e ( p H 5-7), 1 0 0 m M dithiothrei tol ) at 3 7 ° C f o r 15 m i n , m i x e d , a n d c e n t r i f u g e d f o r 3 0 s at 1 5 , 0 0 0 g p r ior to l o a d i n g o n t o t h e t u b e g e l s . T h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n a p p l i e d to t h e t o p of t h e t u b e g e l s wi th c a r e , to a v o i d m i x i n g t h e s a m p l e with t h e u p p e r t a n k buffer . T h e s a m p l e s w e r e r u n s e q u e n t i a l l y at 4 0 0 V f o r 3 h, 6 0 0 V f o r 2 h, 8 0 0 V f o r 15 h a n d 1 0 0 0 V f o r 5 h . A f t e r a r u n w a s c o m p l e t e d , t h e t u b e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e a p p a r a t u s a n d t h e g e l s w e r e c a r e f u l l y e x t r u d e d o n t o t h e s t a c k i n g p o r t i o n of t h e s l a b g e l s ( 5 % s t a c k i n g g e l , 1 2 . 5 % r e s o l v i n g ge l ) . T h e t u b e g e l s w e r e s e c u r e d b y s e a l i n g t h e m into p o s i t i o n o n t o t h e s t a c k i n g g e l with 0 . 5 % a g a r o s e d i s s o l v e d in L a e m m l i s a m p l e b u f f e r . E l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d at 8 0 V until t h e d y e f ront r e a c h e d t h e s t a c k i n g / r e s o l v i n g g e l i n t e r f a c e a n d t h e n at 1 8 0 V unti l t h e d y e f ront r e a c h e d t h e b o t t o m of t h e r e s o l v i n g g e l . Coomassie staining E a c h t i s s u e s a m p l e s u p e r n a t a n t w a s l o a d e d o n t o at l e a s t t w o i d e n t i c a l g e l s to a l l o w f o r o n e g e l to b e s t a i n e d wi th C o o m a s s i e B l u e R - 2 5 0 to v i s u a l l y v e r i f y that t h e p r o t e i n l o a d i n g w a s e q u a l a m o n g all w e l l s . C o o m a s s i e s t a i n i n g w a s p e r f o r m e d b y s o a k i n g t h e g e l s in t h e s t a i n i n g s o l u t i o n ( 0 . 1 % c o o m a s s i e b l u e R - 2 5 0 , 1 0 % a c e t i c a c i d , 4 0 % m e t h a n o l 5 0 % H 2 0 ) o n a n o r b i t a l s h a k e r f o r 3 0 m i n , d e s t a i n i n g t h e g e l s in d e s t a i n s o l u t i o n ( 1 0 % a c e t i c a c i d , 4 0 % m e t h a n o l 5 0 % H 2 0 ) a n d t h e n d r y i n g t h e m b e t w e e n two s h e e t s of h y d r a t e d c e l l o p h a n e p a p e r . 41 Autoradiography & Fluorography (full size gels) A u t o r a d i o g r a p h y of t h e o n e - d i m e n s i o n a l S D S - P A G E m i n i - g e l s w a s d o n e b y d r y i n g t h e g e l s u s i n g a B i o - R a d g e l d r y e r a n d a p p l y i n g t h e d r i e d g e l s to A G F A C U R I X X - R a y f i lm for a 5 - to 8 - d a y e x p o s u r e at - 8 0 ° C . F l u o r o g r a p h y w a s d o n e o n l a r g e s l a b g e l s a s f o l l o w s : t h e g e l s w e r e s u b m e r g e d f o r 2 0 - 3 0 m i n in t h r e e c h a n g e s of f r e s h d i m e t h y l s u l f o x i d e ( D M S O ) . T h e g e l s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d to a 1 5 % d i p h e n y l o x a z o l e ( P P O ) / D M S O s o l u t i o n a n d s o a k e d f o r 1 h o n a rotary s h a k e r . T h e P P O in t h e g e l w a s p r e c i p i t a t e d b y s o a k i n g t h e g e l s in d i s t i l l e d w a t e r , with t h r e e c h a n g e s of w a t e r o v e r a 1 -h p e r i o d . T h e g e l s w e r e t h e n d r i e d a n d a p p l i e d to f i lm f o r 2 4 h at - 8 0 ° C . Autoradiography (minigels) T h e m i n i - g e l s ( o n e - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ) w e r e d r i e d u s i n g a B i o -R a d g e l d r y e r a n d a p p l i e d to A G F A C U R I X X - R a y f i l m . T h e f i l m w a s e x p o s e d a t - 8 0 ° C f o r 5 to 8 d a y s a n d t h e n d e v e l o p e d . Transferring proteins from minigels to membranes A l l p r o t e i n s w e r e t r a n s f e r r e d f r o m t h e g e l s to n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C A ) for W e s t e r n b lo t t ing . T h e s e m i - d r y b l o t t i n g m e t h o d , first r e p o r t e d b y K y h s e - A n d e r s o n (1984) , w a s u s e d to t r a n s f e r p r o t e i n s f r o m a l l a c r y l a m i d e g e l s to n i t r o c e l l u l o s e . T h e s e t r a n s f e r s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e T r a n s - B l o t ® S D S e m i - D r y E l e c t r o p h o r e t i c T r a n s f e r C e l l ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C A ) . P r i o r to t r a n s f e r r i n g t h e p r o t e i n s to n i t r o c e l l u l o s e , t h e e l e c t r o p h o r i z e d g e l s w e r e e q u i l i b r a t e d f o r 15 m i n in B j e r r u m a n d S c h a f e r - N i e l s e n (1986) t r a n s f e r b u f f e r (48 m M T r i s ; 3 9 m M g l y c i n e , 2 0 % m e t h a n o l ( p H 9.2)). E q u i l i b r a t i o n f a c i l i t a t e s t h e r e m o v a l o f e l e c t r o p h o r e s i s b u f f e r s a l t s a n d d e t e r g e n t s , a n d r e d u c e s t h e a m o u n t o f h e a t g e n e r a t e d d u r i n g t h e 42 t r a n s f e r . It a l s o a l l o w s t h e g e l to s h r i n k to its f i n a l s i z e p r i o r to e l e c t r o p h o r e t i c t r a n s f e r . T h e n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s w e r e s o a k e d in t r a n s f e r b u f f e r f o r 1 5 - 3 0 m i n p r i o r to t r a n s f e r to e n s u r e p r o p e r b i n d i n g of t h e a c r y l a m i d e g e l to t h e m e m b r a n e , c a r e w a s t a k e n not to e n t r a p a i r b u b b l e s d u r i n g t h e w e t t i n g p r o c e s s a s t h e s e c a n b l o c k t r a n s f e r of m o l e c u l e s . T h e g e l a n d n i t r o c e l l u l o s e w e r e s a n d w i c h e d b e t w e e n two 0 . 3 3 - m m t h i c k s h e e t s of W h a t m a n c h r o m a t o g r a p h y p a p e r ( B a l s t o n L t d . , E n g l a n d ) p r e s o a k e d in t r a n s f e r buffer . A i r b u b b l e s w e r e r o l l e d o u t at e a c h s t e p of a p p l y i n g t h e b o t t o m filter p a p e r a n d g e l / m e m b r a n e s a n d w i c h a n d t o p filter p a p e r o n t o t h e b o t t o m p l a t i n u m a n o d e . T h e c a t h o d e w a s t h e n a d d e d o n t o t h e s t a c k a n d t h e c u r r e n t a p p l i e d . A l l g e l s w e r e t r a n s f e r r e d f o r 15 m i n wi th 15 vol ts , s u p p l i e d b y t h e m o d e l 2 0 0 / 2 . 0 p o w e r s u p p l y ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C A ) . T r a n s f e r e f f i c i e n c y w a s v e r i f i e d f o r e a c h g e l b y u s i n g p r e - s t a i n e d m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ( B R L ) a n d n o t i n g f o r t h e i r p r e s e n c e o n t h e n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e f o l l o w i n g t ransfer , a n d a l s o b y s t a i n i n g t h e g e l w i t h C o o m a s s i e b l u e R - 2 5 0 p r o t e i n s t a i n after t h e t r a n s f e r w a s c o m p l e t e d . Primary antibodies R a b b i t p o l y c l o n a l a n t i - h s p 7 0 a n d a n t i - h s p 3 0 a n t i b o d i e s u s e d in t h e s t u d y w e r e p r o d u c e d in D r . E . P . M C a n d i d o ' s l a b o r a t o r y in t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y of B r i t i s h C o l u m b i a . F o r p r o d u c t i o n o f h s p 7 0 , r a i n b o w trout R T G - 2 c e l l s w e r e c u l t u r e d in ro l ler bot t les in E a g l e ' s M E M with 1 0 % fe ta l b o v i n e s e r u m . B e f o r e r e a c h i n g c o n f l u e n c e , c e l l s w e r e i n d u c e d wi th 5 0 m M s o d i u m a r s e n i t e for 1 5 - 2 4 h , a l l o w e d to r e c o v e r in f r e s h m e d i u m f o r 2 -3 h , h a r v e s t e d b y t r y p s i n i z a t i o n , w a s h e d in P B S a n d s t o r e d at - 7 0 ° C . F o r p r e p a r a t i o n of r a i n b o w trout h s p 7 0 , f r o z e n R T G - 2 c e l l p e l l e t s w e r e h o m o g e n i z e d with a s t a i n l e s s s t e e l D o u n c e h o m o g e n i z e r in a l y s i s b u f f e r c o n s i s t i n g of 10 m M T r i s - a c e t a t e p H 7.5, 10 m M N a C l a n d 0.1 m M E D T A to 43 w h i c h w a s a d d e d P M S F to 1 2 0 m M i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e . T h e l y s a t e w a s c e n t r i f u g e d at 1 2 , 0 0 0 g f o r 15 m i n at 4 ° C , a n d t h e h s p 7 0 w a s p u r i f i e d f r o m t h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t b y A T P - a g a r o s e affinity c h r o m a t o g r a p h y , e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b y W e l c h a n d F e r a m i s c o (1985) . N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s w e r e initially i m m u n i z e d with p u r i f i e d h s p 7 0 e m u l s i f i e d in C o m p l e t e F r e u n d ' s A d j u v a n t , a n d b o o s t e d wi th t h e a n t i g e n in F r e u n d ' s I n c o m p l e t e A d j u v a n t . A n t i s e r u m w a s p r e c i p i t a t e d w i t h 5 0 % s a t u r a t e d a m m o n i u m s u l f a t e , d i a l y z e d a g a i n s t P B S a n d s t o r e d at - 2 0 C in 0 .02 % s o d i u m a z i d e . R a b b i t p o l y c l o n a l a n t i - h s p 3 0 a n t i b o d i e s w e r e m a d e a g a i n s t r e c o m b i n a n t Chinook s a l m o n h s p 3 0 p r o d u c e d i n E. coli f r o m a c D N A c l o n e p r o v i d e d b y D r . L . W e b e r , U n i v e r s i t y of R e n o , R e n o N e v a d a . Western blotting N i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s with t r a n s f e r r e d p r o t e i n s w e r e p r o b e d f o r h s p 7 0 , h s p 6 0 a n d h s p 3 0 . T h e m e m b r a n e s w e r e first b l o c k e d at r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h o r u n d e r r e f r i g e r a t i o n wi th b l o c k i n g s o l u t i o n of 2 % s k i m m i l k a n d 0 . 1 % N a N 3 in T T B S , w h i c h is m a d e with 0 . 0 5 % T w e e n - 2 0 in T B S ( 5 0 m M t r i s - b a s e , 2 0 0 m M N a C l , p H 7.5). T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d f o r 5 m i n in T T B S a n d t h e n i n c u b a t e d for 1 h in p r i m a r y a n t i b o d y s o l u t i o n d i l u t e d 1 : 5 0 0 wi th b l o c k i n g s o l u t i o n to w h i c h w a s a d d e d 0 . 5 7 m M p h e n o l m e t h y l s u l p h o n o f l o u r i d e ( P M S F ) , 5 p M l e u p e p t i n a n d 0 . 3 p M A p r o t i n i n a n d 1 % N o n i d e t . P r i m a r y a n t i b o d i e s s p e c i f i c to r a i n b o w trout h s p 7 0 a n d c h i n o o k s a l m o n h s p 3 0 w e r e d e v e l o p e d in t h e l a b o r a t o r y of D r . E . P . M . C a n d i d o a n d w e r e m a d e a v a i l a b l e t h r o u g h a c o o p e r a t i v e a g r e e m e n t wi th S t r e s s g e n Inc. ( V i c t o r i a , B C ) . H s p 6 0 w a s p r o b e d f o r u s i n g a n t i - h s p 6 0 a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t e i t h e r H. virescens (moth) h s p 6 0 or P C C 7 9 4 2 ( c y a n o b a c t e r i a ) . T h e m e m b r a n e s w e r e t h e n w a s h e d t w i c e f o r 5 m i n wi th T T B S a n d i n c u b a t e d in c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y ( g o a t a n t i -44 rabbi t o r a n t i - m o u s e with c o n j u g a t e d p h o s p h a t a s e ( G i b c o - B R L Inc., B u r l i n g t o n , O n t . ) d i l u t e d to r e c o m m e n d e d c o n c e n t r a t i o n w i t h T T B S ) f o r 2 h w i t h g e n t l e a g i t a t i o n . T h e m e m b r a n e s w e r e t h e n w a s h e d t w i c e f o r 5 m i n wi th T T B S a n d o n c e f o r 5 m i n wi th T B S to r e m o v e r e s i d u a l T w e e n - 2 0 . C o l o r d e v e l o p m e n t w a s p e r f o r m e d b y d e c a n t i n g t h e T B S a n d e q u i l i b r a t i n g t h e m e m b r a n e s wi th s u b s t r a t e b u f f e r ( 1 0 0 m M t r i s - b a s e , 1 0 0 m M N a C l , 5 0 m M M g C I 2 ) f o r 1 0 m i n b e f o r e d e v e l o p m e n t . T h e m e m b r a n e s w e r e t h e n d e v e l o p e d in a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d e v e l o p e r [100 pi of N B T r e a g e n t (Nitro b l u e t e t r a z o l i u m : 5 0 m g / m L d i s s o l v e d in 7 0 % D M F ( d i m e t h y l f o r m a m i d e ) , 8 % m e t h a n o l a n d 2 2 % d d H 2 0 ) a n d 1 0 0 u l of B C I P r e a g e n t ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l p h o s p h a t e ; in 1 0 0 % D M F ) in 15 m L of t h e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e s u b s t r a t e buffer ] . T h e m e m b r a n e s w e r e i m m e r s e d in t h e c o l o r d e v e l o p m e n t s o l u t i o n f o r 1-5 m i n , d e p e n d i n g o n t h e c o l o r d e v e l o p m e n t rate . T h e d e v e l o p m e n t w a s s t o p p e d b y d e c a n t i n g t h e d i s h a n d f l o o d i n g t h e m e m b r a n e wi th d i s t i l l e d w a t e r . T h e m e m b r a n e s w e r e t h e n d r i e d o n filter p a p e r a n d s t o r e d b e t w e e n p o l y e s t e r s h e e t s to m i n i m i z e f a d i n g . Densitometry measurements A l l W e s t e r n blot b a n d i n t e n s i t i e s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g t h e S i g m a G e l d e n s i t o m e t r y s o f t w a r e p r o g r a m ( J a n d e l C o r p o r a t i o n . , S a n R a f a e l , C A ) . T h e G a u s s i a n m o d e l ( s p e c i f i e d p e r c e n t of t h e h e i g h t o f t h e p e a k u s e d to i n t e g r a t e t h e a r e a u n d e r t h e c u r v e c r e a t e d b y t h e i n t e n s i t y o f t h e s c a n n e d b a n d ) , t h e t h r e s h o l d l e v e l (pixel intensi ty) a n d t h r e s h o l d p e r c e n t ( u s e r d e f i n e d p e r c e n t a g e o f a l l p i x e l s u s e d to i n t e g r a t e t h e a r e a u n d e r t h e c u r v e ) w e r e a l l s e t a t t h e s a m e l e v e l s w h e n d a t a s e t s w e r e c r e a t e d to c o m p a r e t h e t i s s u e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e to d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t s . A l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l o g of a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e a r e a u n d e r t h e p e a k s p r o d u c e d b y 45 densitometry has been reported (Blake et al . 1984). The concentrat ion vs. band intensity relationship observed in our trials agreed with this relationship. 46 C h a p t e r 3 E n h a n c e d p r o t e i n s in f i s h c e l l l i n e s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . I n t roduct ion T h e o b j e c t i v e of this s t u d y w a s to d e t e r m i n e if a n y p r o t e i n s c o m m o n l y i n c r e a s e d in c o n c e n t r a t i o n w h e n di f ferent f i s h c e l l l i n e s w e r e e x p o s e d to f o u r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . S e v e r a l s t u d i e s d o c u m e n t t h e e x p r e s s i o n of s t r e s s p r o t e i n s in a q u a t i c o r g a n i s m s , f o c u s i n g o n t h e e f f e c t s of h e a t s h o c k o n w h o l e a n i m a l s o r i n c e l l l i n e s ( M i s r a et a l . , 1 9 8 9 ; P a r s e d e t a l . , 1 9 9 3 ; S a n d e r s a n d M a r t i n , 1 9 9 3 ; F l a n a g a n et a l . , 1995) . W h i l e n o v e l p r o t e i n s h a v e a p p e a r e d wi th a r a n g e of s t r e s s o r s , t h e r e h a s b e e n a l a c k of c o m p r e h e n s i v e s t u d i e s w h e r e f i s h o r f i s h c e l l l i n e s a r e e x p o s e d to a v a r i e t y o f s t r e s s o r s in a n a t t e m p t to d e s c r i b e a g e n e r a l i z e d r e s p o n s e . S t u d i e s o n t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e , a s it r e l a t e s to t h e w h o l e s t r e s s r e s p o n s e in g e n e r a l a n d t h e s t r e s s h o r m o n e r e s p o n s e in p a r t i c u l a r , a r e n e e d e d to bet ter u n d e r s t a n d t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e v a r i o u s f a c e t s o f t h e s e a d a p t i v e s t r e s s r e s p o n s e s . F o u r f i s h c e l l l i n e s w e r e e x p o s e d to f o u r d i f f e r e n t s t r e s s o r s , a n d w e r e a n a l y z e d f o r t h e e x p r e s s i o n of h e a t s h o c k p r o t e i n s b y o n e a n d t w o d i m e n s i o n a l S D S - P A G E a n d a u t o r a d i o g r a p h y o r f l u o r o g r a p h y . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s M a t e r i a l s a n d m e t h o d s d e s c r i b i n g t h e c e l l l i n e s , r a d i o l a b e l i n g , r a d i o l a b e l e d c e l l s a m p l e p r e p a r a t i o n a s w e l l a s o n e a n d two d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s u s e d f o r t h e e x p e r i m e n t s in this c h a p t e r a r e p r e s e n t e d in t h e G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n ( C h a p t e r 2). 47 Stressors T h e s t r e s s o r s u s e d f o r this s e r i e s o f e x p e r i m e n t s a r e s u m m a r i z e d in T a b l e 2 .1 . H e a t s h o c k , p H c h a n g e , e x p o s u r e to L - a z e t i d i n e , a n d e x p o s u r e to b l e a c h e d K r a f t mill e f f l u e n t ( B K M E ) w e r e a p p l i e d to a l l c e l l l i n e s . T h e h e a t s h o c k w a s a p p l i e d b y t r a n s f e r r i n g t h e f l a s k s f r o m r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 0 ° C ) to a 2 8 ° C w a t e r b a t h . C o n t r o l c e l l s w e r e m a i n t a i n e d at 2 0 ° C . p H c h a n g e a n d L -a z e t i d i n e w a s p e r f o r m e d b y a s p i r a t i n g t h e n o r m a l g r o w t h m e d i u m ( p H 7.5) f r o m e a c h f l a s k a n d r e p l a c i n g it with m e d i u m a d j u s t e d to p H 5.7 , 6 .7 , 8 .7 o r 9 .7 , o r m e d i u m c o n t a i n i n g 1 0 m M L - a z e t i d i n e . T i s s u e c u l t u r e m e d i u m f o r t h e B K M E e x p o s u r e trials w e r e p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g p o w d e r e d , m e t h i o n i n e - f r e e M E M with E a r l ' s sa l t s , 1 0 % F B S , 15 m M H E P E S a n d 2 .2 m g / m L N a H C 0 3 in o n e q u a r t e r , o n e ha l f a n d full s t r e n g t h B K M E eff luent , w h i c h c o r r e s p o n d e d to o r g a n o c h l o r i n e c o n c e n t r a t i o n s s h o w n in T a b l e 3 .1 , r e s p e c t i v e l y . C o n t r o l c e l l s f o r e a c h o f t h e s e e x p e r i m e n t s h a d a c o n c u r r e n t n o r m a l g r o w t h m e d i u m c h a n g e to c o n t r o l f o r h a n d l i n g e f f e c t s . Results Heat Shock O n e - d i m e n s i o n a l S D S - P A G E g e l s s h o w e d a p r o m i n e n t b a n d o f a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s 7 0 k D a in h e a t s h o c k e d R T G - 2 a n d C H S E - 2 1 4 c e l l s . T h e c o n t r o l s of t h e s e c e l l l i n e s h a d o n l y a fa int b a n d at th is l o c u s ( F i g u r e 3.1) . O n l y a faint b a n d at 7 0 k D a w a s s e e n in t h e h e a t s h o c k e d R T H - 1 4 9 c e l l s . N o d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d b e t w e e n t h e b a n d i n g p a t t e r n s o f h e a t - s h o c k e d a n d c o n t r o l c a r p e p i t h e l i a l c e l l s ( E P C ) ( d a t a not s h o w n ) . In two d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s , h e a t - s h o c k e d R T G - 2 c e l l s r e v e a l e d e n h a n c e d e x p r e s s i o n of two i s o f o r m s of p r o t e i n s of a p p r o x i m a t e l y 7 0 k D a . In 48 a d d i t i o n , 2 0 0 k D a a n d 3 0 k D a p r o t e i n s s h o w e d e n h a n c e d e x p r e s s i o n in t h e h e a t s h o c k e d s a m p l e s , c o m p a r e d to c o n t r o l s ( F i g u r e 3 .2 : 1 a & 1b) . H e a t - s h o c k e d R T H - 1 4 9 c e l l s s h o w e d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n of t h r e e p r o t e i n s wi th a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s e s of 80 , 7 0 a n d 3 0 k D a c o m p a r e d to c o n t r o l s ( F i g u r e 3 .2 : 2 a & 2 b ) . H e a t - s h o c k e d C H S E - 2 1 4 c e l l s s h o w e d m a s s i v e d i f f u s e d s p o t s at a p p r o x i m a t e l y 9 0 a n d 7 0 k D a i n d i c a t i v e of l a r g e s c a l e p r o t e i n p r o d u c t i o n . I n d i v i d u a l p r o t e i n s (i .e . , n u m b e r a n d i s o f o r m s ) of t h e s e t w o p r o t e i n g r o u p s c o u l d n o t b e d i f f e r e n t i a t e d d u e to t h e l a r g e a u t o r a d i o g r a p h a r e a e x p o s e d b y t h e s e p r o t e i n s . T h e h e a t s h o c k e d C H S E c e l l l ine a l s o s h o w e d i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s of t h r e e p r o t e i n s with a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s e s o f 50 , 2 8 a n d 2 5 k D a , w h i c h w e r e not e v i d e n t in t h e c o n t r o l c e l l s . T w o p r o t e i n s o f a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s e s of 3 0 a n d 2 8 k D a , s h o w e d e n h a n c e d e x p r e s s i o n in h e a t s h o c k e d c e l l s c o m p a r e d to c o n t r o l s ( F i g u r e 3 .2 : 3 a & 3 b ) . E P C , u p o n h e a t s h o c k , s y n t h e s i z e d 1 3 n e w p r o t e i n s , f o u r o f t h e s e (28, 2 7 , 2 0 a n d 1 5 k D a ) w e r e in t h e u s u a l s l ight ly a c i d i c to n e a r - n e u t r a l p H r a n g e o f h e a t s h o c k p r o t e i n s . T e n o t h e r p r o t e i n s i n d u c e d b y h e a t s h o c k in t h e E P C c e l l s w e r e in t h e h i g h l y a l k a l i n e r a n g e a n d h a d a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 6 0 , 50 , 4 7 , 44 , 4 2 , 2 6 , 2 5 , 2 3 a n d 2 2 k D a ( F i g u r e s 3 .2 : 4 a & 4 b ) . L-Azetidine A p r o t e i n wi th a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s of 7 0 k D a w a s h i g h l y i n d u c e d in L - a z e t i d i n e - t r e a t e d R T G - 2 c e l l s a n d w a s p r e s e n t at a l o w l e v e l in t h e c o n t r o l c e l l s . T h e R T G - 2 f l u o r o g r a p h s u g g e s t s a g e n e r a l i z e d r e d u c t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s a s a r e s u l t of L - a z e t i d i n e e x p o s u r e ( F i g u r e 3 .2 : 1c) . L - a z e t i d i n e -t r e a t e d R T H - 1 4 9 a l s o s h o w e d a g e n e r a l i z e d a t t e n u a t i o n of p r o t e i n s y n t h e s i s ( F i g u r e 3 .2 : 2 c ) . A p r o t e i n with a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s o f 5 0 k D a , a b s e n t in t h e c o n t r o l , w a s e x p r e s s e d in C H S E - 2 1 4 in r e s p o n s e to this a m i n o a c i d 49 a n a l o g u e ( F i g u r e 3.2 : 3c ) . L - a z e t i d i n e t r e a t m e n t of E P C i n d u c e d t h e s y n t h e s i s of two p r o t e i n s with a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s e s of 8 0 a n d 7 0 k D a a s w e l l a s a n e w p r o t e i n wi th a n a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r m a s s o f 4 0 k D a in t h e h i g h l y a l k a l i n e r a n g e ( F i g u r e 3.2 : 4 c ) . pH change N o d i f f e r e n c e w a s o b s e r v e d b e t w e e n t h e p r o t e i n p r o f i l e s o f R T G - 2 c o n t r o l c e l l s a n d c e l l s e x p o s e d to p H s of 5 .7 to 9.7 . ( d a t a not s h o w n ) . R T H - 1 4 9 c e l l s r e v e a l e d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n of a p r o t e i n of a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t of 6 8 k D a in c e l l s e x p o s e d to p H 9 .7 r e l a t i v e to c o n t r o l s c e l l s . C H S E s h o w e d a n e n h a n c e d p r o d u c t i o n of a 3 0 k D a p r o t e i n in all o f t h e e x p e r i m e n t a l p H r e g i m e s . In E P C , t h e f o l l o w i n g b a n d s w e r e m o r e p r o n o u n c e d in t h e e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t s , c o m p a r e d to c o n t r o l s : >200, 100 , 90 , 65 , 60 , 44 , 4 3 , 4 0 , 30 , 2 5 , a n d 2 3 k D a , w i t h t h e m o s t p r o m i n e n t b a n d a p p e a r i n g at a p p r o x i m a t e l y 6 5 k D a i n t h e c e l l s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l p H s of 8 .7 a n d 9 .7 ( F i g u r e 3 . 3 ) . Bleached Kraft pulp mill effluent D e s p i t e t e c h n i c a l p r o b l e m s c a u s i n g s t r e a k i n g of t h e p r o t e i n s d u r i n g e l e c t r o p h o r e s i s of t h e S D S - P A G E g e l s , R T G - 2 , R T H - 1 4 9 a n d C H S E e x p o s e d to t h e B K M E a p p e a r e d to s h o w i n d u c t i o n of n o v e l p r o t e i n s o f a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 0 0 k D a , 7 0 k D a a n d a 5 0 k D a , w h i l e e f f l u e n t - t r e a t e d E P C c e l l s d i d n o t s h o w i n d u c t i o n of a n y n e w p r o t e i n s . D a t a a r e n o t s h o w n d u e to q u a l i t y o f t h e a u t o r a d i o g r a p h s . D i s c u s s i o n T h e s m a l l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y h e a t s h o c k e d C H S E a n d E P C c e l l s a r e s i m i l a r in s i z e to t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( L M W ) h e a t s h o c k p r o t e i n s i m p l i c a t e d 50 in t h e r m o t o l e r a n c e ( L a n d r y et a l . , 1 9 8 9 ; S u b j e c k et a l . , 1982) . T h e s e L M W h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e k n o w n to b e m o r e s p e c i e s s p e c i f i c a n d l e s s c o n s e r v e d t h a n t h e 7 0 k D a a n d 9 0 k D a f a m i l i e s of h s p s ( S a n d e r s , 1 9 9 3 ) . T h r e e s a l m o n i d c e l l l i n e s c o n s i s t e n t l y e x p r e s s e d p r o t e i n s o f 7 0 a n d 3 0 k D a in r e s p o n s e to h e a t s h o c k . T h e f a d i n g in i n t e n s i t i e s o f b a n d s o t h e r t h a n t h e n e w l y i n d u c e d p r o t e i n s o n t h e o n e d i m e n s i o n a l g e l s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e k n o w l e d g e that d u r i n g h e a t s h o c k t h e r e is a r e d u c t i o n in t h e s y n t h e s i s o f m o s t p r o t e i n s o t h e r t h a n h e a t s h o c k p r o t e i n s ( s e e L i n d q u i s t , 1986) . T h e i n d u c t i o n o f a 7 0 k D a a n d a 3 0 k D a h e a t s h o c k p r o t e i n h a s b e e n r e p o r t e d f o r h e a t - s h o c k e d R T G - 2 ( K o t h a r y a n d C a n d i d o , 1982) . M i s r a et a l . ( 1989 ) r e p o r t e d t h e i n c r e a s e of a p r o m i n e n t 7 0 k D a p r o t e i n in h e a t - s h o c k e d R T H - 1 4 9 a n d C H S E - 2 1 4 in a d d i t i o n to p r o t e i n s of 95 , 84 , 7 4 a n d 2 8 k D a . A l t h o u g h t h e n u m b e r a n d m o l e c u l a r m a s s e s of t h e p r o t e i n s i n d u c e d in t h e p r e s e n t s t u d y v a r i e d f r o m t h o s e of t h e a b o v e w o r k e r s , t h e r e s u l t s a r e in g e n e r a l a g r e e m e n t w i t h t h e i r f i n d i n g s . H e a t s h o c k e d E P C c e l l l ine s h o w e d i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s of a n u m b e r of h i g h l y a l k a l i n e p r o t e i n s . H i g h l y a l k a l i n e h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e r a r e ; o n e is a h e a t - i n d u c e d 4 7 - k D a p r o t e i n in c h i c k e n f i b r o b l a s t s wi th a p l o f a p p r o x i m a t e l y 9 .0 ( N a g a o et a l . , 1986) . T h e o c c u r r e n c e o f s u c h a l a r g e n u m b e r of p r o t e i n s wi th h i g h l y a l k a l i n e p l in t h e c y p r i n i d c e l l l ine c a l l s f o r f u r t h e r s t u d y . A m i n o a c i d a n a l o g u e s s u c h a s c a n a v a n i n e , e t h i o n i n e a n d L - a z e t i d i n e h a v e b e e n s h o w n to i n d u c e h e a t s h o c k p r o t e i n s in Tetrahymena a n d H e L a c e l l s ( W i l h e l m et a l . , 1 9 8 2 ; H i g h t o w e r , 1 9 8 0 ; T h o m a s a n d M a t h e w s , 1 9 8 2 ) . T h e g e n e r a l i z e d r e d u c t i o n of p r o t e i n s y n t h e s i s o b s e r v e d in t h e f i s h c e l l l i n e s u s e d in this s t u d y w a s p e r h a p s d u e to t h e u s e of a n e x c e s s i v e c o n c e n t r a t i o n o f L -a z e t i d i n e . A l t h o u g h w h o l e f i s h s h o w a s t r e s s r e s p o n s e (i .e . , e l e v a t e d p l a s m a c o n c e n t r a t i o n of Cortisol a n d g l u c o s e ; s e e B a r t o n a n d I w a m a , 1 9 9 1 ) w h e n t h e y 51 a r e e x p o s e d to b l o o d p H c h a n g e s of f r a c t i o n s of a p H unit, R T G - 2 c e l l s d i d not s h o w a n i n c r e a s e d h e a t s h o c k p r o t e i n i n d u c t i o n w h e n e x p o s e d to p H c h a n g e s of 1 o r 2 uni ts a b o v e or b e l o w n o r m a l g r o w t h m e d i u m p H . C e l l l i n e s c u l t u r e d f o r m a n y g e n e r a t i o n s a r e k n o w n to l o s e s u r f a c e r e c e p t o r s a n d t h e r e f o r e r e s p o n d d i f f e r e n t l y t h a n n o r m a l c e l l s to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . T h e s e c e l l u l a r c h a n g e s l e a d u s to s t u d i e s e x a m i n i n g t i s s u e s f r o m w h o l e a n i m a l s in c h a p t e r s f o u r to six . Conclusion T h e p r e s e n t s t u d y s h o w e d that v a r i o u s n o v e l p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d in t h r e e s a l m o n i d a n d o n e c y p r i n i d c e l l l ine e x p o s e d to f o u r s t r e s s o r s . A l t h o u g h o n l y a f e w s t r e s s o r s w e r e i n v e s t i g a t e d , n o v e l p r o t e i n s of a p p r o x i m a t e l y 7 0 a n d 3 0 k D a a p p e a r e d to b e g e n e r a l l y i n d u c e d , w h i l e a 1 0 0 k D a p r o t e i n m a y b e a s p e c i f i c i n d i c a t o r of B K M E e x p o s u r e in s a l m o n i d s . Acknowledgments T h e c o l l a b o r a t i o n of D r . R o b e r t D e v l i n , W e s t V a n c o u v e r L a b o r a t o r y , D e p a r t m e n t of F i s h e r i e s a n d O c e a n s , B . C . , C a n a d a , in p r o v i d i n g t h e c e l l l i n e s , e q u i p m e n t a n d s p a c e to d o p r e l i m i n a r y w o r k o n h s p r e s p o n s e is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . 52 T a b l e 3.1 T r e a t m e n t s u s e d to i n d u c e t h e s y n t h e s i s o f n o v e l p r o t e i n s in t h e f o u r f i s h c e l l l i n e s . S t r e s s o r T r e a t m e n t ( d u r a t i o n ) R a d i o l a b e l i n g ( p o s t -s t r e s s ) h e a t s h o c k 2 0 - » 2 8 ° C 1 h p H c h a n g e p H 6.7 , p H 8 .7 (1 h) 4 h L - a z e t i d i n e 1 0 m M ( 1 h ) 4 h B K M E 3 .75 , 7.5, 15.0. m g / m L 4 h 53 F i g u r e 3.1 H s p 7 0 s y n t h e s i s in two f i s h c e l l l i n e s ; R T G - 2 a n d C H S E - 2 1 4 e x p o s e d to a t e m p e r a t u r e i n c r e a s e of 8 ° C . C o n t r o l s a m p l e s ( C ) w e r e g r o w n at 2 0 ° C w h i l e e x p e r i m e n t a l s a m p l e s (E) w e r e e x p o s e d to 2 8 ° C f o r 1 h , a n d r e t u r n e d to 2 0 ° C f o r r a d i o l a b e l i n g with 1 0 0 u C i p e r m L [35S]-methionine. S a m p l e s w e r e r u n o n 1 2 . 5 % a c r y l a m i d e S D S - P A G E g e l s . A r r o w h e a d s i n d i c a t e b a n d s of p r o t e i n that w e r e i n d u c e d b y t h e h e a t s h o c k t r e a t m e n t . 54 MW (kDa) 70 > CHSE-214 C C E E 55 F i g u r e 3 .2 T w o - d i m e n s i o n a l S D S - P A G E o f f i s h c e l l l i n e s s h o w i n g s y n t h e s i s of n o v e l p r o t e i n s in r e s p o n s e to h e a t s h o c k a n d L - a z e t i d i n e . F l u o r o g r a p h s l a b e l e d 1 ,2 ,3 a n d 4 a r e ; R T G - 2 , R T H - 1 4 9 , C H S E - 2 1 4 a n d E P C , r e s p e c t i v e l y . T h e s u b s c r i p t s a , b, a n d c d e n o t e c o n t r o l , h e a t s h o c k e d (20 to 2 8 ° C ) a n d L - a z e t i d i n e (10 m M ) e x p o s u r e r e s p e c t i v e l y . C o n t r o l c e l l s w e r e g r o w n at 2 0 ° C . H e a t s h o c k e d c e l l s w e r e e x p o s e d to 2 8 ° C f o r a 1 h p e r i o d . T h e L - a z e t i d i n e t r e a t m e n t w a s a 4 - h e x p o s u r e to 1 0 m M L - a z e t i d i n e . C e l l s w e r e l a b e l e d f o r 1 h wi th 1 0 0 u C i [35S]-methionine. S a m p l e s w e r e l o a d e d with e q u a l c o u n t s a n d r u n o n 1 2 . 5 % a c r y l a m i d e S D S - P A G E g e l s . A r r o w h e a d s i n d i c a t e p r o t e i n s p o t s w h i c h w e r e e n h a n c e d r e l a t i v e to t h o s e o b s e r v e d in c o n t r o l c e l l s . 56 Heat Controls shock MW (kDa) acid . alkaline L-azetidine R T G - 2 R T H -149 » 7 > • 57 F i g u r e 3 .3 p H c h a n g e c a u s e s s y n t h e s i s of n o v e l 2 5 a n d 6 9 k D a p r o t e i n s in t h r e e f i s h c e l l l i n e s . R T H - 1 4 9 , C H S E - 2 1 4 a n d E P C c e l l s l a b e l e d wi th [ 3 5 S ] -m e t h i o n i n e (1 h w i t h 1 0 0 u C i / m L ) a n d r u n o n 1 2 . 5 % a c r y l a m i d e g e l s . R T H -1 4 9 e x p o s e d to p H 9 .7 s y n t h e s i z e d e n h a n c e d l e v e l s of a 6 8 k D a p r o t e i n . C H S E - 2 1 4 s h o w i n c r e a s e d p r o d u c t i o n of a l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n o f a p p r o x i m a t e l y 2 5 k D a . E P C c e l l s e x p o s e d to p H s of 8 .7 a n d 9 .7 s h o w e d i n c r e a s e d s y n t h e s i s of a 6 8 k D a p r o t e i n c o m p a r e d to c e l l s m a i n t a i n e d at p H 7.7. A r r o w h e a d s i n d i c a t e b a n d s w h i c h w e r e e n h a n c e d r e l a t i v e to c o n t r o l s . cd x O • o cd c> O Q o LO 1^ i a ^  i— CO c> ^ 0 A O O CM A A A o CO CM ** 59 Chapter 4 pH change induces increased levels of novel proteins of 80, 70 and 32 kDa in chinook salmon embryonic (CHSE) cells I n t r o d u c t i o n I n f o r m a t i o n o n t h e e f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l p H o n m a n y f o r m s o f a q u a t i c life is a c c u m u l a t i n g a n d s h o w s a v a r i e t y of c e l l u l a r r e s p o n s e s in o r g a n i s m s o r c e l l s e x p o s e d to p H c h a n g e ( M o r r i s et a l . , 1989) . In c h i c k e n e m b r y o c e l l s , l o w e x t r a c e l l u l a r p H i n d u c e s t h e s y n t h e s i s of g l u c o s e r e g u l a t e d p r o t e i n s w h i l e h i g h e x t r a c e l l u l a r p H i n d u c e s h e a t s h o c k p r o t e i n s ( W h e l a n a n d H i g h t o w e r 1 9 8 5 ) . Histoplasma capsulatum, a n i n t r a c e l l u l a r p a t h o g e n i c f u n g u s , w h i c h m u l t i p l i e s i n s i d e m a c r o p h a g e s a n d r e s i s t s m a c r o p h a g e m i c r o b i o c i d a l m e c h a n i s m s , s u r v i v e s e x p o s u r e to p H 4 . 0 a n d i n c r e a s e s t h e s y n t h e s i s o f e i g h t c o n s t i t u t i v e p r o t e i n s s o m e of w h i c h m a y b e h e a t - s h o c k p r o t e i n s ( K a m e i et a l . 1 9 9 2 ) . A t l e a s t s i x t e e n p o l y p e p t i d e s a r e i n d u c e d in E. coli af ter a n e x t e r n a l p H shift d o w n f r o m p H 6 .9 to p H 4 .3 ; f o u r of t h e s e p o l y p e p t i d e s c o r r e s p o n d to t h e w e l l k n o w n h s p s G r o E L , D n a K , H t p G a n d H t p M ( H e y d e a n d P o r t a l i e r , 1 9 9 0 ) . K h a n d j i a n (1990) s h o w e d that p r i m a r y m o u s e k i d n e y c e l l c u l t u r e s e x p o s e d to a c i d i c m e d i u m ( p H 5.5) s y n t h e s i z e d a 7 0 k D a p r o t e i n , p o s s i b l y h s p 7 0 . C h a n g e s in w a t e r p H a r e p o t e n t s t r e s s o r s o f f i s h ( s e e B a r t o n a n d I w a m a , 1991) . T h e e x p e r i m e n t s p r e s e n t e d h e r e w e r e p e r f o r m e d to i n v e s t i g a t e t h e s t r e s s r e s p o n s e o f a c h i n o o k s a l m o n c e l l l ine ( C H S E - 2 1 4 ; A T C C C R L 1 6 8 1 ) e x p e r i m e n t a l l y e x p o s e d to a w i d e p H r a n g e . T h e h y p o t h e s i s t e s t e d w a s that s a l m o n e m b r y o n i c c e l l s e x p o s e d to a shift in p H w o u l d s y n t h e s i z e n o v e l p r o t e i n s a n d that d i f f e r e n t p r o t e i n s m i g h t b e i n d u c e d at t h e a c i d i c a n d t h e b a s i c e n d s o f t h e t e s t e d p H r a n g e . I n v e s t i g a t i n g w h i c h p r o t e i n s a r e i n d u c e d b y t h e s e p H shif ts 6 0 m a y h e l p to e l a b o r a t e t h e effec t that e x t e r n a l p H c h a n g e h a s o n c e l l u l a r m e t a b o l i s m a n d o n t h e s t r e s s r e s p o n s e at t h e o r g a n i s m a l l e v e l . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s Cell line T h e Chinook s a l m o n e m b r y o n i c ( C H S E - 2 1 4 ) c e l l l i n e ( A T C C C R L 1 6 8 1 ) w a s u s e d f o r this e x p e r i m e n t . T h e m e d i a a n d c o n d i t i o n s u s e d f o r n o r m a l c e l l m a i n t e n a n c e a r e d e s c r i b e d in t h e G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ( C h a p t e r 2) . T h e r a d i o l a b e l i n g , S D S - P A G E m i n i g e l a n d a u t o r a d i o g r a p h y p r o t o c o l s a r e a l s o d e s c r i b e d in C h a p t e r 2. Stressors T h e c e l l s w e r e e x p o s e d to e x p e r i m e n t a l m e d i u m a d j u s t e d f r o m 4 . 5 to 10.0 , in 0 . 5 - p H i n c r e m e n t s . T h e c e l l s w e r e g r o w n to c o n f l u e n c e at p H 7 .5 in c o n t r o l g r o w t h m e d i u m p r i o r to all trials a n d w e r e s t r e s s e d w i t h t h e e x p e r i m e n t a l m e d i u m f o r a p e r i o d of 1 h . E a c h e x p e r i m e n t a l m e d i u m w a s b u f f e r e d w i t h 2 0 m M of t h e b u f f e r s ( S i g m a , St . L o u i s , M O ) a s o u t l i n e d in T a b l e 3 .1 . C o n t r o l c e l l s w e r e m a i n t a i n e d in m e d i u m a d j u s t e d to p H 7.5 a n d b u f f e r e d w i t h 15 m M H E P E S . T h e m e d i u m of t h e c o n t r o l c e l l s w a s c h a n g e d c o n c u r r e n t l y w i t h t h e o t h e r e x p e r i m e n t a l m e d i u m to c o n t r o l f o r h a n d l i n g e f f e c t s . T h e p H of all m e d i a w e r e m e a s u r e d u s i n g a s t a n d a r d p H m e t e r , ( B e c k m a n , F u l l e r t o n , C A ) c a l i b r a t e d wi th r e f e r e n c e b u f f e r s o l u t i o n s ( S i g m a , St . L o u i s , M O ) . T h e p H o f e a c h m e d i u m r e m a i n e d c o n s t a n t d u r i n g t h e c e l l e x p o s u r e t r ia ls ; v a r i a t i o n s i n p H (0 .01 -0 .05 ) w e r e w i t h i n t h e m e a s u r e m e n t e r r o r of t h e i n s t r u m e n t . 61 R e s u l t s D e c r e a s i n g t h e p H of t h e g r o w t h m e d i u m f r o m t h e c o n t r o l p H of 7 .5 to p H 4 .5 , o r i n c r e a s i n g it to p H 1 0 . 0 f o r a p e r i o d of 1 h r e s u l t e d in t h e i n d u c t i o n o f a s e t o f n o v e l p r o t e i n s w i t h r e l a t i v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 8 0 , 7 0 a n d 3 2 k D a ( T a b l e 4 .2) . C e l l s e x p o s e d to p H 7.0 m e d i u m f o r 1 h e x p r e s s e d e l e v a t e d l e v e l s of a n o v e l 7 0 k D a p r o t e i n 1 h a n d 3 h af ter t h e s t r e s s , c o m p a r e d w i t h c o n t r o l c e l l s m a i n t a i n e d at p H 7.5. C e l l s l a b e l e d d u r i n g t h e 1 -h p H - 7 . 0 e x p o s u r e d i d n o t s h o w e l e v a t e d s t r e s s p r o t e i n e x p r e s s i o n ( F i g u r e 4 .1) . C e l l s e x p o s e d to p H 4 . 5 s h o w e d t h e s a m e p a t t e r n a n d t i m e c o u r s e of e l e v a t e d 7 0 k D a p r o t e i n e x p r e s s i o n ( F i g u r e 4 .2) w h i l e t h e c e l l s e x p o s e d to p H 5 .5 s h o w e d e n h a n c e d s y n t h e s i s o f 7 0 a n d 3 2 k D a p r o t e i n s 1 h a n d 3 h af ter e x p o s u r e to t h e s t r e s s o r m e d i u m ( F i g u r e 4 .3) . C e l l s l a b e l e d d u r i n g t h e 1 - h a c i d i c p H e x p o s u r e s d i d n o t s h o w e l e v a t e d s t r e s s p r o t e i n s y n t h e s i s . C e l l s e x p o s e d to t h e p H 1 0 . 0 m e d i u m s y n t h e s i z e d a 7 0 a n d 8 0 k D a p r o t e i n 1 h af ter re turn to t h e c o n t r o l g r o w t h m e d i u m . S y n t h e s i s of t h e 8 0 k D a p r o t e i n r e m a i n e d e l e v a t e d 3 h af ter t h e c e l l s w e r e r e t u r n e d to t h e c o n t r o l m e d i u m , w h e r e a s e x p r e s s i o n o f t h e 7 0 k D a p r o t e i n r e t u r n e d to c o n t r o l l e v e l s in that p e r i o d . C e l l s l a b e l e d d u r i n g t h e 1-h a l k a l i n e p H e x p o s u r e d i d n o t s h o w e l e v a t e d s t r e s s p r o t e i n s y n t h e s i s ( F i g u r e 4 .4) . D i s c u s s i o n T h i s s t u d y s h o w s that C H S E c e l l s e x p o s e d to a c i d i c o r a l k a l i n e g r o w t h m e d i u m s y n t h e s i z e d e l e v a t e d l e v e l s of n o v e l p r o t e i n s . E n h a n c e d s y n t h e s i s o f 8 0 , 7 0 a n d 3 2 k D a p r o t e i n s w e r e o b s e r v e d i n c e l l s e x p o s e d t o a w i d e p H r a n g e . I n c r e a s e d s y n t h e s i s o f t h e m o s t p r o m i n e n t p r o t e i n , wi th a n a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t of 7 0 k D a , w a s o b s e r v e d 1 a n d 3 h af ter t h e c e l l s w e r e e x p o s e d to e i t h e r a c i d i c a n d a l k a l i n e p H , but n o t d u r i n g t h e 1 -h p H c h a l l e n g e . 62 T h i s h i g h l e v e l of a n o v e l 7 0 k D a p r o t e i n 1 h after t h e p H s t r e s s e x p o s u r e is s i m i l a r to t h e h i g h l e v e l of h s p 7 0 s e e n 1 h after Drosophila are e x p o s e d to h e a t s h o c k ( F e d e r et a l . 1995) . C r a i g a n d G r o s s (1991 ) a n d L i n d q u i s t (1993) , h a v e r e p o r t e d that, in Drosophila, R N A p o l y m e r a s e is c o n s t i t u t i v e l y b o u n d to t h e h s p 7 0 p r o m o t e r , a n d that t h e h s p 7 0 m R N A c o n t a i n s n o i n t r o n s a n d c a n t h e r e f o r e b e t r a n s c r i b e d , p r o c e s s e d a n d e x p o r t e d to t h e n u c l e u s v e r y r a p i d l y ( a s it r e q u i r e s n o s p l i c i n g , w h i c h is t i m e c o n s u m i n g ) . A s s u m i n g that t h e n o v e l 7 0 -k D a p r o t e i n s that w e r e o b s e r v e d a r e h s p 7 0 , t h e m e c h a n i s m s d e s c r i b e d b y t h o s e a u t h o r s m a y e x p l a i n t h e r a p i d i n c r e a s e o f t h e n o v e l 7 0 - k D a p r o t e i n . A t p r e s e n t , o n e c a n o n l y s p e c u l a t e o n t h e m e c h a n i s m s o f s t r e s s p r o t e i n i n d u c t i o n b y p H c h a n g e in t h e m e d i u m . E r y t h r o c y t e s of f i s h a n d s o m e o t h e r v e r t e b r a t e s r e s e m b l e s o m a t i c c e l l s in that t h e y p o s s e s s n u c l e i , m i t o c h o n d r i a , e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a n d v a r i o u s o t h e r o r g a n e l l e s ( S c h w e i g e r 1 9 6 2 ; W e b e r 1 9 8 2 ) . In situ r e g u l a t i o n of r a i n b o w trout e r y t h r o c y t e i n t r a c e l l u l a r p H d u r i n g e x t r a c e l l u l a r a c i d o s i s o c c u r s u p o n a d r e n e r g i c s t i m u l a t i o n . T h e a d r e n e r g i c s t i m u l a t i o n c a u s e s a r i s e in c y c l i c A M P , w h i c h a c t i v a t e s t h e N a + - H + e x c h a n g e r l e a d i n g to i n t r a c e l l u l a r a l k a l i n i z a t i o n ( B o u t i l i e r a n d F e r g u s o n , 1 9 8 9 ) . L a c k o f a d r e n e r g i c s t i m u l a t i o n in t h e c u l t u r e d c e l l s m a y h a v e r e n d e r e d t h e C H S E c e l l s in t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t u n a b l e to a d j u s t thei r i n t r a c e l l u l a r p H w h e n e x p o s e d to a c i d i c g r o w t h m e d i a . A d e c r e a s e in i n t r a c e l l u l a r p H m a y h a v e c a u s e d t h e s y n t h e s i s o f t h e o b s e r v e d n o v e l p r o t e i n s . U d e l s m a n e t a l . ( 1 9 9 3 ) p o s t u l a t e s tha t h s p s y n t h e s i s is c o n t r o l l e d b y g l u c o c o r t i c o i d - c a t e c h o l a m i n e i n t e r a c t i o n s a n d that a - j - a d r e n e r g i c r e c e p t o r s interac t with g l u c o c o r t i c o i d s to m a i n t a i n h o m e o s t a s i s . If C H S E c e l l s b e h a v e s i m i l a r l y to c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l s , in w h i c h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n t e r n a l a n d e x t e r n a l p H h a s b e e n i n v e s t i g a t e d ( G i l l i e s et a l . 1982) , it is l ikely that r e d u c i n g t h e e x t r a c e l l u l a r p H r e s u l t e d in a d e c r e a s e in i n t r a c e l l u l a r p H o f at l e a s t s e v e r a l - t e n t h s of a p H unit . 63 A l k a l i n i z a t i o n ( p H 10.0) of t h e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m i n d u c e d t h e s y n t h e s i s o f n e w 80- , 7 0 - a n d 3 2 - k D a p r o t e i n s . H a m m o n d et a l . ( 1982 ) s h o w e d that t h e i n t r a c e l l u l a r p H of m a m m a l i a n c e l l s e x p o s e d to a l k a l i n e m e d i u m m a y h a v e a p p r o a c h e d t h e e x t r a c e l l u l a r p H of 8 .7 . T h e C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 1 0 . 0 in t h e p r e s e n t s t u d y m a y a l s o h a v e e x p e r i e n c e d s i g n i f i c a n t i n t r a c e l l u l a r p H i n c r e a s e s . A s i m p o r t a n t p H - i n d u c e d s t r u c t u r a l t r a n s i t i o n s o c c u r , e v e n w i t h i n t h e b i o l o g i c a l p H r a n g e ( H o c h a c h k a a n d S o m e r o , 1984) , a n d i m p r o p e r p r o t e i n f o l d i n g , l e a d i n g to p r o t e i n a g g r e g a t i o n , is t h o u g h t to initiate a h e a t s h o c k - l i k e r e s p o n s e ( G e o r g o p o u l o s a n d W e l c h , 1993) , t h e o b s e r v e d h s p 7 0 i n c r e a s e s e e n in C H S E e x p o s e d to p H c h a n g e s w a s e x p e c t e d . O n e m a y c o n c l u d e that p H c h a n g e h a s a d r a m a t i c e f fec t o n p r o t e i n s y n t h e s i s in C H S E c e l l s g r o w n in c u l t u r e a n d that t h e s e c e l l s s h o w e n h a n c e d s y n t h e s i s of n e w p r o t e i n s w h e n t h e y a r e e x p o s e d to p H s a b o v e o r b e l o w n o r m a l p h y s i o l o g i c a l p H . It is t h e r e f o r e i m p e r a t i v e that i n v e s t i g a t o r s w h o w o r k with C H S E c e l l s b u f f e r t h e g r o w t h m e d i u m to e n s u r e that t h e p H d o e s not drift, a s this c h a n g e in c u l t u r e c o n d i t i o n will elicit t h e s y n t h e s i s of n o v e l p r o t e i n s that c o u l d c o n f o u n d e x p e r i m e n t a l r e s u l t s . R e s u l t s f r o m C h a p t e r s 2 a n d 3 s h o w e d that n o v e l p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d w h e n f i s h c e l l s a r e e x p o s e d to s t r e s s f u l g r o w t h m e d i u m c o n d i t i o n s . T h e s e n e w p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d b y r a d i o l a b e l i n g , f o l l o w e d b y o n e o r t w o d i m e n s i o n a l S D S - P A G E a n d t h e n a u t o r a d i o g r a p h y , w h i c h s e p a r a t e d t h e p r o t e i n s b y m o l e c u l a r w e i g h t o r i s o e l e c t r i c point . T h e s e m e t h o d s w e r e u s e f u l f o r s h o w i n g t h e v a r i e t y of n o v e l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d in c u l t u r e d c e l l s e x p o s e d to v a r i o u s c h a n g e s in vitro. T h e next l ine of i n v e s t i g a t i o n w a s to e x a m i n e t h e r e s p o n s e o f w h o l e a q u a t i c a n i m a l s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l c h a n g e s a n d to e s t a b l i s h if p r o t e i n s 64 i n d u c e d in t h e t i s s u e s of w h o l e a n i m a l s m i g h t b e t h e s a m e o r s i m i l a r to t h o s e o b s e r v e d i n t h e s t r e s s e d f i s h c e l l l i n e s . T h e t e c h n i q u e that w a s u s e d to p u r s u e this l ine of i n q u i r y w a s to u s e p r i m a r y a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e p r o t e i n s of in teres t that h a d b e e n o b s e r v e d to d a t e . P o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t 7 0 - a n d 3 0 - k D a s a l m o n i d p r o t e i n s w e r e d e v e l o p e d f o r W e s t e r n blot t ing p r o t e i n s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m t h e t i s s u e s of w h o l e a n i m a l s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . A c k n o w l e d g m e n t s T h e c o l l a b o r a t i o n of D r . R . D e v l i n , D e p a r t m e n t o f F i s h e r i e s a n d O c e a n s , C a n a d a , w h o f o r p r o v i d e d t h e c e l l l i n e s , e q u i p m e n t a n d s p a c e to d o p r e l i m i n a r y w o r k o n t h e h s p r e s p o n s e is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h e l a b o r a t o r y a s s i s t a n c e of M r . R . F o r s y t h a n d t h e c o l l a b o r a t i o n o f D r . B . F i n l a y is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . 65 T A B L E 4 . 1 . E x p e r i m e n t a l m e d i a a d j u s t e d to p H 4 . 5 to 10 .0 . p H G r o w t h m e d i u m b u f f e r s 4 . 5 2 0 m M 2 - [ - M o r p h o l i n o ] e t h a n e s u l f o n i c a c i d ( M E S ) 5 .0 2 0 m M M E S 5 .5 2 0 m M M E S 6 .0 2 0 m M M E S 6 .5 10 m M M E S a n d 10 m M 2 - [ b i s ( 2 H y d r o x y e t h y l ) a m i n o ] e t h a n e s u l f o n i c a c i d ( B E S ) 7 .0 1 0 m M B E S a n d 1 0 m M ( N - [ 2 - H y d r o x y e t h y l ] p i p e r a z i n e -N'-[2 e t h a n e s u l f o n i c a c i d ] ( H E P E S ) 7 .5 15 m M H E P E S 8 .0 10 m M H E P E S a n d 10 m M t r i s [ H y d r o x y m e t h y l ] a m i n o m e t h a n e ( T r i z m a ® ) 8 .5 10 m M T r i z m a ® a n d 10 m M 3 - [ ( 1 , 1 - D i m e t h y l - 2 - h y d r o x y e t h y l ) a m i n o ] - 2 - h y d r o x y p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ( A M P S O ) 9 .0 2 0 m M A M P S O 9.5 10 m M A M P S O a n d 10 m M 3 - [ C y c l o h e x y l a m i n o ] - 1 - p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ( C A P S ) 1 0 . 0 2 0 m M C A P S 66 T a b l e 4 .2 . N o v e l p r o t e i n s i n d u c e d in C H S E c e l l s e x p o s e d to a b r o a d p H r a n g e a n d l a b e l e d e i t h e r d u r i n g e x p o s u r e , 1 h , o r 3 h af ter r e t u r n to c o n t r o l m e d i u m ( P H 7.5). P r o t e i n s ( k D a ) at e l e v a t e d l e v e l s p H D u r i n g e x p o s u r e 1 h after e x p o s u r e 3 h af ter e x p o s u r e 4 . 5 n o n e 7 0 7 0 5 . 0 n o n e 7 0 7 0 , 3 2 5 .5 n o n e 7 0 , 3 2 7 0 , 3 2 6 . 0 n o n e 7 0 7 0 6 .5 n o n e 7 0 7 0 7 .0 n o n e 7 0 7 0 7 .5 (control ) n o n e n o n e n o n e 8 .0 n o n e 7 0 7 0 8 .5 n o n e 7 0 7 0 9 .0 n o n e 7 0 8 0 9 .5 n o n e 7 0 8 0 1 0 . 0 _ n o n e 7 0 , 8 0 8 0 67 F i g u r e 4.1. N o v e l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d in C H S E c e l l s e x p o s e d to p H c h a n g e s . C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 7.0 (a) o r m a i n t a i n e d in c o n t r o l m e d i u m ( p H 7.5) (b). T h e c e l l s w e r e l a b e l e d with [ 3 5 S ] - m e t h i o n i n e f o r 1 h e i t h e r d u r i n g t h e p H c h a n g e o r 1 h a n d 3 h af ter r e t u r n to c o n t r o l p H . C e l l s e x p o s e d to p H 7.0 s y n t h e s i z e d e l e v a t e d l e v e l s o f a 704vDa p r o t e i n 1 h a n d 3 h af ter r e t u r n to t h e c o n t r o l m e d i u m . C o n t r o l c e l l s at p H 7.5 s h o w e d n o e l e v a t e d p r o t e i n s y n t h e s i s . 69 F i g u r e 4 .2 . N o v e l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d in C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 4 . 5 a n d p H 5.5 . T h e first l a n e m a r k e d 0 h r e f e r s to c e l l s w h i c h w e r e r a d i o l a b e l e d d u r i n g t h e p H c h a l l e n g e . C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 4 . 5 (a) s y n t h e s i z e d e l e v a t e d l e v e l s o f a 7 0 k D a p r o t e i n 1 h a n d 3 h af ter r e t u r n to t h e c o n t r o l m e d i u m ( p H 7.5) . C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 5 .5 (b a n d c) e x p r e s s e d e l e v a t e d l e v e l s of 7 0 a n d 3 2 k D a p r o t e i n s at 1 h a n d 3 h after r e t u r n to t h e c o n t r o l m e d i u m ( p H 7.5) . 70 MW (kDa) A 69 > pH 4.5 . * pH 5.5 pH 5.5 Oh 1 h 3 h 71 F i g u r e 4 . 3 . C H S E c e l l s s y n t h e s i z e n o v e l 7 0 - a n d 8 0 - k D a p r o t e i n s w h e n e x p o s e d to p H 10 .0 . C H S E c e l l s e x p o s e d to p H 1 0 . 0 s y n t h e s i z e d e l e v a t e d l e v e l s of a 7 0 k D a p r o t e i n 1 h af ter r e t u r n to c o n t r o l m e d i u m ( p H 7.5) . A n e w l y f o r m e d 8 0 - k D a p r o t e i n w a s o b s e r v e d 1 h a n d 3 h af ter t h e c e l l s w e r e r e t u r n e d to c o n t r o l m e d i u m . 72 pH 10 MW (kDa) Oh 1 h 3h 73 C h a p t e r 5 Time course and levels of heat shock proteins in the tissues of heat shocked cutthroat trout I n t r o d u c t i o n T h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s that e n a b l e o r g a n i s m s to t o l e r a t e t e m p e r a t u r e c h a n g e s e n c o u n t e r e d in their e n v i r o n m e n t d e m o n s t r a t e that t h e h i g h e r t h e l e v e l of b i o l o g i c a l o r g a n i z a t i o n , t h e m o r e t h e r m a l l y s e n s i t i v e a r e t h e p r o c e s s e s i n v o l v e d ( L a g e r s p e t z , 1987) . A l t h o u g h h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e u b i q u i t o u s c o m p o n e n t s of all l iv ing s y s t e m s ( N o v e r a n d S c h a r f , 1991) , thei r p h y s i o l o g i c a l r o l e s a s part of t h e o r g a n i s m a l s t r e s s r e s p o n s e a r e o n l y n o w b e c o m i n g c l e a r e r . A t t h e c e l l u l a r l e v e l , all o r g a n i s m s r e s p o n d to a h y p e r t h e r m i c s t r e s s b y s y n t h e s i z i n g a h i g h l y c o n s e r v e d se t of p r o t e i n s k n o w n a s h e a t s h o c k p r o t e i n s . D e p e n d i n g o n t h e o r g a n i s m s or c e l l t y p e , t h e h e a t - s h o c k , o r c e l l u l a r s t r e s s r e s p o n s e , c a n b e e x p r e s s e d w i t h i n m i n u t e s of e x p o s u r e to a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( s e e L i n d q u i s t , 1986) . It is g e n e r a l l y a g r e e d that t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e is a n i m m e d i a t e a n d t r a n s i e n t r e s p o n s e to h e a t a s w e l l a s o t h e r t y p e s of c e l l u l a r injury ( S k i d m o r e et a l . , 1 9 9 5 ; F l a n a g a n et a l . , 1 9 9 5 ) . A m o n g t h e di f ferent h s p s i n d u c e d w h e n c e l l s a r e s t r e s s e d , t h e 70 k D a h s p h a s t h e h i g h e s t c o r r e l a t i o n to t h e m a g n i t u d e a n d d u r a t i o n o f a t h e r m a l s t r e s s ( M i z z e n a n d W e l c h , 1988) . A s u b l e t h a l h e a t s h o c k h a s p l e i o t r o p i c e f f e c t s o n c e l l s : T h e r e is a n i n a c t i v a t i o n of t h e " n o r m a l " p a t t e r n of g e n e t i c e x p r e s s i o n at d i f f e r e n t l e v e l s ( t r a n s c r i p t i o n , s p l i c i n g , a n d t r a n s l a t i o n of m R N A s into p r o t e i n s ) a s w e l l a s a l t e r a t i o n s in c e l l u l a r m o r p h o l o g y ( N g u y e n et a l . , 1989) . S y n t h e s i s o f h s p s is c l o s e l y c o r r e l a t e d with t h e p h e n o m e n o n o f t e m p e r i n g " t h e c e l l s or t h e r m o t o l e r a n c e ; a c o n d i t i o n i n g h e a t s h o c k c o n f e r s t h e abi l i ty to s u r v i v e a s u b s e q u e n t , m o r e s e v e r e h e a t s h o c k that o t h e r w i s e w o u l d be l e t h a l to t h e 74 o r g a n i s m ( G e d a m u et a l . 1 9 8 3 ; M o s s e r et a l . , 1987) . D i f f e r e n c e s in s u r v i v a l b e t w e e n n a i v e a n d c o n d i t i o n e d o r g a n i s m s a r e o f t e n in t h e r a n g e o f 1 0 0 - to 1 0 0 0 - f o l d . C o n d i t i o n i n g h e a t t r e a t m e n t s a l s o p r o v i d e t o l e r a n c e to m a n y o t h e r t y p e s of s t r e s s , s u c h a s e x p o s u r e to e t h a n o l a n d s o d i u m a r s e n i t e . C o n v e r s e l y , e x p o s u r e to m o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n s of e t h a n o l a n d s o d i u m a r s e n i t e i n d u c e t o l e r a n c e to b o t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s of e t h a n o l a n d s o d i u m a r s e n i t e , a s w e l l a s to h i g h t e m p e r a t u r e s ( L i n d q u i s t , 1 9 8 6 ; N o v e r a n d S c h a r f , 1 9 9 1 ) . A s t h e s e s t r e s s o r s a l s o i n d u c e t h e s y n t h e s i s of h s p s , it h a s l o n g b e e n p o s t u l a t e d that h s p s a r e r e s p o n s i b l e , at l e a s t in part , f o r i n d u c e d t o l e r a n c e ( s e e L i n d q u i s t , 1986) . T h e s y n t h e s i s of h e a t s h o c k p r o t e i n s in a q u a t i c o r g a n i s m s m a y b e u s e f u l a s a n i n d i c a t i o n of a q u a t i c e n v i r o n m e n t d e g r a d a t i o n . A p r i m a r y m e c h a n i s m of toxici ty i n v o l v e s p r o t e i n d e n a t u r a t i o n w h i c h r e s u l t s in p r o t e i n a g g r e g a t i o n a n d m i s f o l d i n g ( H i g h t o w e r , 1 9 9 1 ) a n d t h e s y n t h e s i s o f h e a t s h o c k p r o t e i n s . H e a t s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s o c c u r s a s i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n d e n a t u r a t i o n c a u s e s h s p 7 0 p r o t e i n s to r e l e a s e m o n o m e r i c h e a t s h o c k f a c t o r ( H S F ) p r o t e i n s , w h i c h t h e n t r i m e r i z e a n d b i n d to g e n e p r o m o t e r , r e s u l t i n g in t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e h e a t s h o c k p r o t e i n g e n e s . H e a t s h o c k p r o t e i n s t h e n fac i l i ta te t h e " r e p a i r " o f t h e d e n a t u r e d p r o t e i n s . A s t h e d e n a t u r e d p r o t e i n s a r e r e p a i r e d , r e l e a s e o f t h e H S F d e c l i n e s , s l o w i n g t h e h s p i n d u c t i o n p r o c e s s , t h e r e b y c o m p l e t i n g t h e a u t o r e g u l a t o r y f e e d b a c k l o o p ( M o r i m o t o et a l . , 1 9 9 4 a ; W e l c h , 1 9 9 3 ) . T h e h s p r e s p o n s e of s a l m o n i d s e x p o s e d to h e a t s h o c k w a s f u r t h e r i n v e s t i g a t e d b y m e a s u r i n g t h e d u r a t i o n a n d l e v e l s of h s p 7 0 f o u n d in d i f f e r e n t c u t t h r o a t trout t i s s u e s af ter t h e f i s h w e r e e x p o s e d to s t e p c h a n g e h e a t s h o c k a n d r e t u r n e d to n o r m a l e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . F i v e d i f f e r e n t t i s s u e s w e r e e x c i s e d a n d a n a l y z e d to d e t e r m i n e t i s s u e - s p e c i f i c h s p 7 0 a n d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s d u r i n g r e c o v e r y f r o m t h e h e a t s h o c k t r e a t m e n t s . 75 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s Fish: C u t t h r o a t trout w e r e u s e d for all h e a t s h o c k e x p e r i m e n t s . C u t t h r o a t trout of b o t h s e x e s , w e i g h i n g 5 4 . 3 + 11 .5 g ( M e a n ± 1 S D ) w e r e r a i s e d f r o m e g g s at t h e U n i v e r s i t y of B r i t i s h C o l u m b i a a q u a c u l t u r e fac i l i ty a n d w e r e h e l d in 2 0 0 - L o v a l f i b e r g l a s s t a n k s . T h e h o l d i n g t a n k s f o r t h e f i s h w e r e s u p p l i e d wi th d e c h l o r i n a t e d V a n c o u v e r city t a p w a t e r (6 .4-14.1 ° C , p H 6 .1 , total h a r d n e s s 4 .2 m g / L ; O 2 10 m g / L ) . Core Temperature measurements: T o a s s e s s t h e a c t u a l t e m p e r a t u r e o f c u t t h r o a t trout d u r i n g e x p o s u r e to a r a p i d w a t e r t e m p e r a t u r e c h a n g e , t h e f i s h w e r e fitted with a c o r e t e m p e r a t u r e p r o b e a s f o l l o w s . T h e f i s h w e r e a n e s t h e t i z e d b y g e n t l y d i p n e t t i n g t h e m f r o m t h e t a n k a n d t r a n s f e r r i n g t h e m to a b a t h c o n t a i n i n g 1 0 0 m g / L of t r i c a i n e m e t h a n e s u l f o n a t e ( T M S ) , b u f f e r e d wi th a n e q u a l w e i g h t of s o d i u m b i c a r b o n a t e ( N a H C 0 3 ) to a v o i d t h e s t r e s s f u l e f f e c t s o f l o w p H ( S u m m e r f e l t a n d S m i t h , 1990) , a n d fitted with t h e r e m o t e p r o b e of a s m a r t a ™ L C D i n d o o r / o u t d o o r digi ta l t h e r m o m e t e r ( I n t e r T A N , B a r r i e , O n t . ; t e m p e r a t u r e r e s o l u t i o n of 0.1 ° C ) . T h e p r o b e w a s i n s e r t e d t h r o u g h t h e e s o p h a g u s , l o d g e d in t h e s t o m a c h a n d h e l d in p l a c e b y s u t u r i n g t h e s i g n a l w i r e to t h e l o w e r j a w u s i n g s i z e 0 n o n - a b s o r b a b l e s i lk s u r g i c a l s u t u r e ( E t h i c o n Inc.) T h e f i s h w e r e a l l o w e d to r e c o v e r f r o m this p r o c e d u r e f o r 1 h in a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r a n d w e r e t h e n t r a n s f e r r e d to a s e p a r a t e t a n k wi th w a t e r h e a t e d to 1 7 . 5 ° C . C o r e t e m p e r a t u r e s of t h e f i s h w e r e m e a s u r e d b e f o r e , a n d e v e r y 2 m i n af ter t h e f i s h w e r e t r a n s f e r r e d f r o m a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( 6 . 6 ° C ) to t h e h e a t e d w a t e r , m a i n t a i n e d at 1 7 . 5 ° C b y two t h e r m a l s t a n d a r d A - 7 5 8 i m m e r s i o n a q u a r i u m h e a t e r s ( H a g e n Inc., T o r o n t o , O n t . ) . C o r e t e m p e r a t u r e s w e r e a g a i n r e c o r d e d at t h e s a m e i n t e r v a l s w h e n t h e f i s h w e r e t r a n s f e r r e d b a c k to a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r . T h e a m b i e n t a n d h e a t e d w a t e r w e r e m o n i t o r e d f o r t e m p e r a t u r e a n d 76 o x y g e n c o n t e n t u s i n g a h a n d y m k l l p o r t a b l e t e m p e r a t u r e a n d d i s s o l v e d o x y g e n m e t e r ( O x y G u a r d , B i r k e r o d , D e n . ) . D i s s o l v e d o x y g e n l e v e l w a s m a i n t a i n e d a b o v e 8 0 % of s a t u r a t i o n t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t b y a e r a t i n g e a c h t a n k wi th a f i n e b u b b l e a e r a t i o n d i f f u s e r . F o u r gill a r c h e s w e r e e x c i s e d f r o m all f i s h w h e n t h e c o r e t e m p e r a t u r e s r e -e q u i l i b r a t e d with t h e a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e (24 m i n af ter t h e ini t iat ion o f s t e p c h a n g e h e a t s h o c k ) to d e t e r m i n e if t h e gill t i s s u e s h a d e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s af ter 12 m i n of r e c o v e r y at a m b i e n t t e m p e r a t u r e . C o n t r o l f i s h w e r e t r a n s f e r r e d f r o m a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e to a d i f f e r e n t t a n k m a i n t a i n e d at t h e s a m e t e m p e r a t u r e to c o n t r o l f o r h a n d l i n g e f f e c t s . A s e c o n d g r o u p o f c o n t r o l f i s h w e r e t r e a t e d wi th a n e s t h e s i a o n l y , to c o n t r o l f o r t h e ef fec t o f a n e s t h e s i a in t h e f i s h fi t ted wi th a c o r e t e m p e r a t u r e p r o b e . T h e s e f i s h w e r e a n e s t h e t i z e d wi th b u f f e r e d T M S a n d k e p t o u t of w a t e r f o r 3 m i n , t h e t i m e r e q u i r e d to p e r f o r m t h e p r o b e i n s e r t i o n a n d s u t u r i n g , w e r e t h e n r e t u r n e d to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e a n d s a m p l e d af ter 2 4 m i n of r e c o v e r y . T h e gill a r c h e s f r o m al l f i s h w e r e f r o z e n o n d r y i c e i m m e d i a t e l y af ter e x c i s i o n a n d w e r e s t o r e d at - 2 0 ° C unti l t h e y w e r e p r o c e s s e d b y S D S - P A G E a n d W e s t e r n blot a n a l y s i s f o r h s p l e v e l d e t e r m i n a t i o n . T o d e t e r m i n e w h i c h t i s s u e s s h o w a h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e to a r a p i d t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n , cut throat trout w h e r e e x p o s e d to a r a p i d 1 0 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n (13 .2 to 2 3 . 2 ° C ) , m a i n t a i n e d at this e l e v a t e d t e m p e r a t u r e f o r 2 h a n d t h e n r e t u r n e d to a m b i e n t 1 3 . 2 ° C w a t e r ( F i g u r e 5 .1) . G i l l , l iver , a n t e r i o r k i d n e y , a n d s k e l e t a l m u s c l e s a m p l e s w e r e e x c i s e d f r o m t h e s e f i s h 1 h a n d 4 8 h af ter t h e y w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . In a s e p a r a t e e x p e r i m e n t , cut throat trout w e r e e x p o s e d to a r a p i d 1 6 . 2 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n ( f rom 6.2 to 2 2 . 4 ° C ) to m e a s u r e h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s in t h e c i r c u l a t i n g r e d b l o o d c e l l s . T h e s e f i s h w e r e k e p t at 2 2 . 4 ° C f o r 2 h a n d 77 t h e n r e t u r n e d to a m b i e n t 6 . 2 ° C w a t e r . B l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n 1 h a n d 5 d a y s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . T o d e t e r m i n e t h e d u r a t i o n of t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e , c u t t h r o a t trout w e r e s u b j e c t e d to t h e f o l l o w i n g t h r e e e x p e r i m e n t a l t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n p r o t o c o l s : (1) a s t e p c h a n g e 1 0 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n , a c c o m p l i s h e d b y t r a n s f e r r i n g t h e f i s h f r o m a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e ( 7 . 4 ° C ) to 1 7 . 4 ° C w a t e r , l e a v i n g t h e f i s h at this e l e v a t e d t e m p e r a t u r e f o r 2 h a n d t h e n r e t u r n i n g t h e f i s h to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e ; (2) a s t e p c h a n g e 1 5 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n ( 7 . 4 ° C to 2 2 . 4 ° C water ) , a g a i n l e a v i n g t h e f i s h at this e l e v a t e d t e m p e r a t u r e f o r 2 h a n d r e t u r n i n g t h e m to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e ; o r (3) a s t e p c h a n g e 1 0 ° C ( 7 . 4 ° C to 1 7 . 4 ° C ) t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n , m a i n t a i n e d f o r 2 h , f o l l o w e d b y a 1 h r e c o v e r y p e r i o d at a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( 7 . 4 ° C ) , a 2 h 1 5 ° C s t e p c h a n g e t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n ( 7 . 4 ° C to 2 2 . 4 ° C ) a n d t h e n r e t u r n i n g t h e f i s h to a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 5.2) . F o u r gill a r c h e s w e r e e x c i s e d f r o m al l t r e a t m e n t g r o u p s at 1 h , 9 6 h , a n d t h e n at 1, 2, 3 a n d 4 w e e k s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . C o n t r o l f i s h w e r e t r a n s f e r r e d f r o m a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r to a s e p a r a t e t a n k wi th w a t e r at t h e s a m e t e m p e r a t u r e . A l l gill a r c h e s w e r e i m m e d i a t e l y f r o z e n o n d r y i c e a n d s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e a n a l y z e d f o r h s p c o n t e n t b y S D S - P A G E a n d W e s t e r n blot . Tissue excisions: G i l l a r c h e s , a n t e r i o r k i d n e y , l iver a n d s k e l e t a l m u s c l e w e r e e x c i s e d b y r e m o v i n g t h e f i s h f r o m t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r tank , q u i c k l y p u l l i n g t h e t e m p e r a t u r e p r o b e out t h r o u g h t h e e s o p h a g u s ( c o r e t e m p e r a t u r e trial f i s h ) a n d a d m i n i s t e r i n g a b l o w to t h e h e a d w i t h a p l a s t i c b a t o n to kill t h e f i s h . T h e f i s h w e r e m e a s u r e d a n d w e i g h e d a n d t h e n f o u r gill a r c h e s , t h e a n t e r i o r k i d n e y , 1 g o f l iver a n d 1 g of s k e l e t a l m u s c l e w e r e e x c i s e d w i t h s u r g i c a l s c i s s o r s a n d f o r c e p s . T h e t i s s u e s w e r e i m m e d i a t e l y p l a c e d i n s e r t e d into 1 .5 m L c o n i c a l 78 E p p e n d o r f t u b e s a n d f r o z e n o n d r y i c e . T h e e n t i r e e x c i s i o n p r o c e d u r e w a s n o r m a l l y p e r f o r m e d in l e s s t h a n 2 m i n . T h e t i s s u e s w e r e s t o r e d at -20°C until t h e y w e r e p r o c e s s e d f o r B C A p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n , S D S - P A G E a n d W e s t e r n blot t ing . R e f e r to t h e G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ( C h a p t e r 2) f o r t h e s t a n d a r d p r o t o c o l s u s e d f o r b l o o d s a m p l i n g , p l a s m a C o r t i s o l d e t e r m i n a t i o n , t i s s u e s a m p l e p r e p a r a t i o n , t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d p r o t e i n a s s a y , S D S - P A G E , c o o m a s s i e s t a i n i n g , t r a n s f e r r i n g p r o t e i n s f r o m g e l s to n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s , W e s t e r n blot t ing a n d d e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s . Statistical analysis D a t a w e r e s ta t is t ica l ly a n a l y z e d e i t h e r b y f-test o r o n e - w a y a n a l y s i s of v a r i a n c e ( A N O V A ) , S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s o r D u n n ' s M u l t i p l e R a n g e T e s t w h e r e a p p r o p r i a t e . In c a s e s w h e r e t h e d a t a s e t f a i l e d t h e n o r m a l i t y t e s t r e q u i r e d to r u n t h e M e s t , a M a n n - W h i t n e y r a n k s u m test w a s u s e d a s a n o n p a r a m e t r i c a l t e r n a t i v e . If a d a t a se t f a i l e d to p a s s t h e n o r m a l i t y test p r i o r t h e p e r f o r m i n g a m u l t i p l e c o m p a r i s o n s test, a K r u s k a l l - W a l l i s A N O V A o n r a n k s w a s p e r f o r m e d , r a t h e r t h a n a s t a n d a r d o n e w a y A N O V A . S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e e s t a b l i s h e d at t h e p=0.05 l e v e l f o r all tes ts . R e s u l t s T h e p r e l i m i n a r y s t u d y d o c u m e n t e d t h e c o r e b o d y t e m p e r a t u r e d u r i n g e x p o s u r e to a r a p i d t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n . S u r p r i s i n g l y f e w d a t a a r e a v a i l a b l e o n t h e rate of i n t e r n a l b o d y t e m p e r a t u r e c h a n g e in f i s h e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e c h a n g e s . F i g u r e 5.3 s h o w s h o w t h e i n t e r n a l b o d y t e m p e r a t u r e of t h e s e f i s h e q u i l i b r a t e d to t h e e l e v a t e d w a t e r t e m p e r a t u r e in a p p r o x i m a t e l y 10 m i n . W h e n t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t 6 .6 ° C w a t e r , t h e i r c o r e t e m p e r a t u r e a g a i n e q u i l i b r a t e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e in a p p r o x i m a t e l y 10 m i n . 79 G i l l s a m p l e s t a k e n f r o m t h e s e f i s h a s their b o d y t e m p e r a t u r e r e - e q u i l i b r a t e d to a m b i e n t 6 . 6 ° C , i .e . , 12 m i n after thei r re turn to 6 . 6 ° C w a t e r , s h o w e d n o i n c r e a s e in h s p 7 0 l e v e l s , c o m p a r e d with c o n t r o l f i s h that h a d b e e n t r a n s f e r r e d f r o m 6 . 6 ° C to a s e p a r a t e t a n k at 6 . 6 ° C a n d s a m p l e d 2 4 m i n af ter t h e t r a n s f e r . A n e s t h e s i a c o n t r o l f i s h , w h i c h w e r e a n e s t h e t i z e d a n d k e p t o u t of w a t e r f o r 3 m i n , a l s o s h o w e d n o d i f f e r e n c e in h s p 7 0 l e v e l s w h e n s a m p l e d 2 4 m i n af ter a n e s t h e s i a , c o m p a r e d to c o n t r o l f i s h . T h e s e r e s u l t s s h o w that t h e h s p 7 0 r e s p o n s e h a d n o t o c c u r r e d 2 4 m i n af ter t h e o n s e t of a s t e p c h a n g e 1 0 . 9 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n ( f r o m 6 .6 to 1 7 . 5 ° C ) a n d 12 m i n after t h e f i s h h a d b e e n r e t u r n e d to a m b i e n t 6 . 6 ° C w a t e r ( F i g u r e 5.4) . T i s s u e s a m p l e s f r o m a s e p a r a t e e x p e r i m e n t , w h e r e f i s h w e r e e x p o s e d to a 2 - h s t e p c h a n g e 1 0 ° C h e a t s h o c k ( f r o m 1 2 . 4 to 2 2 . 4 ° C ) s h o w that a l l t i s s u e s , e x c e p t f o r t h e s k e l e t a l m u s c l e , h a d e l e v a t e d h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . A l l t i s s u e s , i n c l u d i n g t h e s k e l e t a l m u s c l e s , h a d e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 5.5) . T h e t i s s u e s a m p l e s w e r e a l s o p r o b e d f o r h s p 3 0 a n d s h o w e d that o n l y gill t i s s u e s a m p l e d 1 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e h a d e l e v a t e d h s p 3 0 l e v e l s . T i s s u e l e v e l s o f h s p 3 0 w e r e e i t h e r n o n -d e t e c t a b l e o r u n c h a n g e d 4 8 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 5.6) . In a s e p a r a t e trial , cut throat trout w e r e e x p o s e d to a 2 - h s t e p c h a n g e 1 6 . 2 ° C h e a t s h o c k ( f rom 6.2 to 2 2 . 4 ° C ) . B l o o d s a m p l e s s h o w e d h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s in t h e r e d b l o o d c e l l s w e r e u n c h a n g e d 1 h af ter r e t u r n to a m b i e n t t e m p e r a t u r e a n d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r 5 d a y s af ter t h e h e a t s h o c k ( F i g u r e 5.7) . 80 T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d h e r e t h e r e f o r e s h o w that h e a t s h o c k p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d in a t i s s u e s e l e c t i v e - m a n n e r in s a l m o n i d s e x p o s e d to e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s . R e s u l t s f r o m t h e t h r e e d i f ferent h e a t s h o c k t r e a t m e n t s o n gill t i s s u e h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s , d u r i n g a o n e m o n t h r e c o v e r y p e r i o d , s h o w e d that a 1 5 ° C - 2 h s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t (7.4 to 2 2 . 4 ° C ) c a u s e d h s p 7 0 l e v e l s to b e e l e v a t e d a b o v e c o n t r o l l e v e l s f o r t h r e e w e e k s ( F i g u r e 5.8) . F i s h that r e c e i v e d a 1 0 ° C h e a t s h o c k h a d e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s f o r o n e w e e k f o l l o w i n g t h e t r e a t m e n t w h i l e f i s h e x p o s e d to a 1 0 ° C h e a t s h o c k f o l l o w e d b y a 1 5 ° C h e a t s h o c k h a d e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s f o r two w e e k s after r e t u r n to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . D i s c u s s i o n T h e r e s u l t s s h o w e d that t h e in situ b o d y t e m p e r a t u r e o f 5 5 - g c u t t h r o a t trout e q u i l i b r a t e d to t h e e n v i r o n m e n t a l w a t e r t e m p e r a t u r e w i t h i n 12 m i n af ter r e t u r n i n g to a m b i e n t t e m p e r a t u r e w e r e h i g h l y r e p e a t a b l e . T h e ra te of in situ t e m p e r a t u r e c h a n g e w a s r a p i d , a s w o u l d b e p r e d i c t e d f o r p o i k i l o t h e r m s , w h i c h a r e e n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e c o n f o r m e r s . T h e r a p i d e q u i l i b r a t i o n d e m o n s t r a t e s t h e l o w h e a t r e t e n t i o n of t h e s e f i s h . T h e i r n o r m a l c a l m b e h a v i o r o b s e r v e d d u r i n g t h e r a p i d t e m p e r a t u r e t r a n s i t i o n s u g g e s t s that a r a p i d t e m p e r a t u r e c h a n g e , w i t h i n t h e u p p e r a n d l o w e r le thal t e m p e r a t u r e limits f o r this s p e c i e s , d o e s n o t c a u s e b e h a v i o r a l d i s t r e s s , a n d that t h e f i s h d o n o t p e r c e i v e t h i s r a p i d t e m p e r a t u r e c h a n g e a s life t h r e a t e n i n g . R e s u l t s s h o w i n g that h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s in t h e gill t i s s u e s a m p l e s w e r e not e l e v a t e d 2 4 m i n after t h e o n s e t of a s u d d e n 1 0 . 9 ° C t e m p e r a t u r e e l e v a t i o n s u g g e s t that t h e h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e i n t h e s e f i s h o c c u r s a t a s l o w e r rate t h a n t h e " i m m e d i a t e " r e s p o n s e s e e n b y r e s e a r c h e r s i n v e s t i g a t i n g t h e ef fec t of h e a t s h o c k o n m a m m a l i a n c e l l s ( C a i r o et a l . , 1 9 8 3 ; L i et a l . , 1 9 8 3 ; R y a n 81 et a l . , 1991) . T h e fact that t h e f i s h in t h e s e tr ials h a d l o w b o d y t e m p e r a t u r e s , c o m p a r e d to h o m e o t h e r m s , p r o b a b l y e x p l a i n s t h e s l o w e r r e s p o n s e t i m e a n d l o n g e r d u r a t i o n of t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e o b s e r v e d in t h e s e f i s h . D e c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s l o w s t h e ra te at w h i c h c h e m i c a l t r a n s f o r m a t i o n s o c c u r , a n d s m a l l t e m p e r a t u r e c h a n g e s h a v e a l a r g e ef fec t o n r e a c t i o n r a t e s ( H o c h a c h k a a n d S o m e r o , 1984) . T h e p r e s e n t s t u d y r e v e a l s that a c c u m u l a t i o n of h s p 7 0 is g e n e r a l l y u n i f o r m a c r o s s t h e t i s s u e s s a m p l e d ; h o w e v e r , s k e l e t a l m u s c l e s h o w e d a s l o w e r r e s p o n s e t i m e t h a n t h e o t h e r t i s s u e s s a m p l e d . T h i s o b s e r v a t i o n is c o n s i s t e n t wi th t h e f i n d i n g s of F l a n a g a n et a l . (1995) , w h o f o u n d that t h e q u a d r i c e p m u s c l e s of m a l e S p r a g u e - D a w l e y rats ( 2 5 0 - 3 0 0 g ) r e q u i r e d g r e a t e r t h e r m a l s t r e s s t h a n that n e c e s s a r y to i n d u c e h s p 7 0 s y n t h e s i s in t h e rat liver, s m a l l i n t e s t i n e o r k i d n e y t i s s u e s . It is n o t e w o r t h y that t h e o t h e r t i s s u e s s a m p l e d , a n d that h a d e l e v a t e d h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e , w e r e p e r f u s e d with b l o o d w h e n s a m p l e d . A l t h o u g h r e d b l o o d c e l l s a m p l e s t a k e n 1 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e h a d v a r i a b l e h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s c o m p a r e d to t h e l e v e l s f o u n d in c o n t r o l f i s h r e d b l o o d c e l l s , it is p o s s i b l e that t h e e l e v a t e d h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d in t h e liver, a n t e r i o r k i d n e y s a n d gill t i s s u e s w e r e c a u s e d b y e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s in t h e r e d b l o o d c e l l s in t h o s e t i s s u e s . T h e r e s u l t s of t h e t i m e c o u r s e e x p e r i m e n t , p e r f o r m e d to d e t e r m i n e t h e d u r a t i o n of a h e a t s h o c k r e s p o n s e , in f i s h e x p o s e d to a 2 h 1 5 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k , s h o w e d that h s p 7 0 p r o t e i n s c a n r e m a i n e l e v a t e d f o r u p to t h r e e w e e k s af ter t h e f i s h a r e r e t u r n e d to a m b i e n t 7 . 4 ° C w a t e r . A l t h o u g h a p a t t e r n o f e l e v a t e d h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n in Mytillus gill t i s s u e f o r u p to 8 w e e k s ( S a n d e r s et a l . , 1992) , that p a t t e r n of e l e v a t e d h s p 7 0 w a s o b s e r v e d in m u s s e l s m a i n t a i n e d at a h i g h ( 2 7 ° C ) t e m p e r a t u r e f o r t h e d u r a t i o n o f 82 t h e s a m p l i n g p e r i o d . T h e p r e s e n t f i n d i n g s d e m o n s t r a t e that h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s c a n r e m a i n e l e v a t e d f o r a p r o l o n g e d p e r i o d af ter f i s h a r e r e t u r n e d to c o l d e r a m b i e n t t e m p e r a t u r e . A s t e m p e r a t u r e h a s s h a r p e f f e c t s o n t h e r e a c t i o n v e l o c i t y c o n s t a n t s of c h e m i c a l r e a c t i o n s , c h a n g e s in t e m p e r a t u r e f r e q u e n t l y h a v e s u b s t a n t i a l e f f e c t s o n t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s of b i o c h e m i c a l r e a c t i o n s . It w a s S v a n t e A r r h e n i u s w h o , in t h e 1 8 8 0 s , d e v e l o p e d a n e q u a t i o n to d e t e r m i n e t h e e f f e c t of t e m p e r a t u r e o n t h e f r a c t i o n of a p o p u l a t i o n o f m o l e c u l e s that is r e a c t i v e at a n y g i v e n t e m p e r a t u r e . H i s e q u a t i o n r e v e a l s that o n l y a s m a l l f r a c t i o n of t h e total p o p u l a t i o n of m o l e c u l e s p o s s e s s e n o u g h e n e r g y to r e a c t at a c e r t a i n t e m p e r a t u r e , a n d that c h a n g e s in t e m p e r a t u r e l e a d to m a r k e d i n c r e a s e s or d e c r e a s e s in t h e s i z e of this r e a c t i v e p o p u l a t i o n ( H o c h a c h k a a n d S o m e r o , 1 9 8 4 ) . V a r i a t i o n s in b o d y t e m p e r a t u r e i m p a c t f i s h p h y s i o l o g y in t w o p r i m a r y w a y s : (1) T e m p e r a t u r e d e t e r m i n e s t h e ra te of c h e m i c a l r e a c t i o n s , a n d e v e n m o d e s t r e d u c t i o n s i n t e m p e r a t u r e ( e . g . 1 0 ° C w i t h i n t h e b i o l o g i c a l t e m p e r a t u r e r a n g e , c o r r e s p o n d i n g to a c h a n g e of o n l y 3 % in a v e r a g e k i n e t i c e n e r g y ) m a r k e d l y d e p r e s s r e a c t i o n r a t e s ( typica l ly 2 - to 3 - f o l d ) ; (2) t e m p e r a t u r e d i c t a t e s t h e p o i n t of e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e f o r m a t i o n a n d d i s r u p t i o n o f t h e n o n c o v a l e n t f o r c e s w h i c h s t a b i l i z e b o t h m a c r o m o l e c u l a r ( e . g . b i o l o g i c a l m e m b r a n e s a n d s u b u n i t i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p r o t e i n s ) a n d m o l e c u l a r ( e . g . p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s ) s t r u c t u r e s of p h y s i o l o g i c a l i m p o r t a n c e , a n d t h e b i n d i n g o f l i g a n d s to p r o t e i n s ( e . g . h o r m o n e - r e c e p t o r a n d e n z y m e s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n s ) . H o u l i h a n et a l , ( 1995 ) s t a t e s that t h e m a x i m u m v a l u e f o r w h o l e f i s h f r a c t i o n a l r a t e s o f p r o t e i n t u r n o v e r , w h i c h i s e q u a l to t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s a n d p r o t e i n d e g r a d a t i o n u n d e r m a i n t e n a n c e c o n d i t i o n s , is a p p r o x i m a t e l y 4 - 5 % p e r d a y in r a i n b o w trout l e s s t h a n 2 0 0 g . A v e r a g e r a t e s h a v e b e e n m e a s u r e d at 2 - 4 % p e r d a y , d e p e n d i n g o n t h e e x p e r i m e n t a l m e t h o d s u s e d . S u c h d e g r a d a t i o n r a t e s a r e c o n s i s t e n t wi th t h e t h r e e w e e k e l e v a t i o n o f 83 h s p 7 0 o b s e r v e d in t h e gill t i s s u e s o f h e a t s h o c k e d c u t t h r o a t trout in t h e s e tr ials . T h e d u r a t i o n o f t h e o b s e r v e d h s p e l e v a t i o n is t h e r e f o r e in t h e c o r r e c t t i m e r a n g e a n d is c o n s i s t e n t wi th t h e p r o t e i n t u r n o v e r r a t e s r e p o r t e d b y H o u l i h a n et a l . (1995) . A c k n o w l e d g m e n t s T h e c o l l a b o r a t i o n of S t r e s s g e n B i o t e c h n o l o g y C o r p . a n d D r . P . C a n d i d o in p r o v i d i n g t h e m o n o c l o n a l a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s u s e d f o r this w o r k is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h e l a b o r a t o r y a s s i s t a n c e of R . F o r s y t h , G . C h o , J . M o r g a n , S . B a b y i s h a n d E . T e n g is s i n c e r e l y a p p r e c i a t e d . T h e g e n e r o s i t y o f D r . B . F i n l a y in a l l o w i n g t h e u s e h i s l a b o r a t o r y a n d e q u i p m e n t is a l s o g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . 84 F i g u r e 5.1 S t a n d a r d s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t . W a t e r t e m p e r a t u r e d u r i n g a n d af ter t h e 2 - h s t e p c h a n g e 1 0 ° C h e a t s h o c k ( f rom 1 2 . 4 to 2 2 . 4 ° C ) t r e a t m e n t u s e d to d e t e r m i n e t h e l e v e l s of h s p 7 0 a n d h s p 3 0 in t h e gi l l , h e a d k i d n e y , l iver a n d s k e l e t a l m u s c l e t i s s u e s of c u t t h r o a t trout. T h e f i s h w e r e s a m p l e d at 1 h a n d 4 8 h af ter t h e y w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t ( 1 2 . 4 ° C ) w a t e r . 85 ( Q 0 ) ejnjBjeduje; jeievw 86 F i g u r e 5 .2 T h r e e s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t s u s e to d e t e r m i n e t h e d u r a t i o n of t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . T h e s e a r e t h e t h r e e s t e p c h a n g e h e a t s h o c k t r e a t m e n t s u s e d to e s t a b l i s h t h e d u r a t i o n of t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e in t h e gill t i s s u e s of c u t t h r o a t trout. T h e f i s h w e r e e x p o s e d to t h e d i f f e r e n t w a t e r t e m p e r a t u r e s b y g e n t l y t r a n s f e r r i n g t h e m f r o m t h e c o n t r o l t a n k m a i n t a i n e d at a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( 7 . 4 ° C ) to t a n k s h e a t e d to e i t h e r 1 7 . 4 ° C o r 2 2 . 4 ° C a s s h o w n in g r a p h s A , B a n d C . A l l t r e a t m e n t g r o u p s w e r e s a m p l e d at 1 h , 4 8 h , 1, 2, 3 , a n d 4 w e e k s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e . 87 2 5 2 0 A 1 5 1 0 5 10°C heat shock o o 0 D 5 o C L £ 0 +J 2 5 2 0 1 5 1 0 5 2 5 2 0 1 5 1 0 5 15°C heat shock 10 and 15 °C heat shock 1(h) 4 14 21 28 Sampling time (days) after return to ambient temperatu 88 F i g u r e 5 .3 C o r e t e m p e r a t u r e s of h e a t s h o c k e d c u t t h r o a t trout. C o r e t e m p e r a t u r e of c u t t h r o a t trout e x p o s e d to a 1 2 - m i n s t e p c h a n g e 1 0 . 9 ° C h e a t s h o c k a n d t h e n r e t u r n e d to a m b i e n t ( 6 . 6 ° C ) w a t e r . T e m p e r a t u r e m e a s u r e m e n t s w e r e t a k e n e v e r y 2 m i n w h i l e t h e f i s h w e r e a c c l i m a t i n g to t h e n e w t e m p e r a t u r e w a t e r , (p < 0 .05 , N=4 , m e a n ± 1 S E ) . ( D o ) e-injejeduia} 9 J O Q 90 Figure 5.4 Gi l l t issue hsp70 levels 12 min after a 12-min 1 0 . 9 X step change heat shock. Densitometry measurements of Weste rn blots of cutthroat trout gill samples probed with anti-trout hsp70 rabbit polyclonal antibodies. Control , T M S anesthet ized f ish and f ish exposed to a 12 min step change 10.9°C heat shock, were all sampled 24 min after the start of the treatments. (p< 0.05, N=4, mean ± SE ) . 1 1 1— 1 i —r~ —r~ 1 —r~ —r o o o o o o o o o o o m o IO o IO o IO o IO IO Tf CO CO CM CM (sjmn Ajejjiqje) Aiisueiin pueq ozdsH 92 F i g u r e 5 .5 T i s s u e h s p 7 0 l e v e l s af ter a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k . D e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s of W e s t e r n b l o t s of c u t t h r o a t t rout gi l l , l iver , a n t e r i o r k i d n e y a n d s k e l e t a l m u s c l e s a m p l e s p r o b e d with anti - t rout h s p 7 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s 1 h a n d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e . A s t e r i s k s d e n o t e s t r e a t m e n t s w i t h s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t h s p 7 0 b a n d i n t e n s i t i e s (p< 0 .05 , N=4 , m e a n ± S E ) . 1 Time after 48 heat shock (h) 94 F i g u r e 5 .6 T i s s u e h s p 3 0 l e v e l s after a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k . D e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s of W e s t e r n b l o t s of c u t t h r o a t trout gil l , l iver , a n t e r i o r k i d n e y a n d s k e l e t a l m u s c l e s a m p l e s p r o b e d wi th anti - t rout h s p 3 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s 1 h a n d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e . A s t e r i s k s d e n o t e s t r e a t m e n t s wi th s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t h s p 3 0 b a n d i n t e n s i t i e s (p < 0 .05 , N=4 , m e a n ± S E ) . 95 Time after heat shock (h) 96 F i g u r e 5 .7 R e d b l o o d c e l l h s p 7 0 l e v e l s af ter a s t e p c h a n g e h e a t s h o c k . D e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s of W e s t e r n b l o t s of c u t t h r o a t trout r e d b l o o d c e l l s a m p l e s p r o b e d wi th anti - t rout h s p 7 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s 1 h a n d 5 d a y s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e . A s t e r i s k s d e n o t e s t r e a t m e n t s wi th s i g n i f i c a n t l y d i f ferent h s p 7 0 b a n d i n t e n s i t i e s (p < 0 .05 , N =4, m e a n ± S E ) . 97 (sjmn AjBJJiqje) Ajisueju! pueq QZ^sq 98 F i g u r e 5 .8 G i l l h s p 7 0 l e v e l s s h o w i n g t h e d u r a t i o n of t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . D e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s of W e s t e r n b l o t s o f c u t t h r o a t trout gill s a m p l e s p r o b e d w i t h anti - t rout h s p 7 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s 1 h , 9 6 h , a n d 1, 2, 3 a n d 4 w e e k s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=4 , m e a n ± S E ) . Note: A s t e r i s k o n 1 0 ° C h e a t s h o c k d a t a in 2 w e e k s a m p l e s d e n o t e s that t h e d a t a a r e s h o w n f o r i l lustra t ion o n l y a n d a r e not i n c l u d e d in t h e s ta t i s t i ca l a n a l y s i s d u e to t h e l a r g e v a r i a t i o n w i t h i n this g r o u p . 99 O o </> 4-1 G) o o If) O o </> (0 0) o o If) 0 c o CO hi 0) 0) I I I I I I I o o o o o o o o O O O O O O O TT CM O 00 CO T j CN CO . Q CO O CD O) I I I I I I I O O O O O O O O O O O O O O O T t CN O CO CO T t CN 3 o o o o o o o o o O O O O O O O rt CN O CO CO T t CN O O O O O O O O O O O O O O O CN O CO CO CN I I I I I I I o o o o o o o o O O O O O O O T t CN O CO CO T t CN o o o o o o o o O O O O O O O T t CN O CO CO T t CN (simn Ajejiiqje) Aijsueiui pueq dsH 100 Chapter 6 The relationship between heat shock protein levels and stress hormones. Introduction Phys ica l stressors offish such as handl ing (Barton et a l . , 1980), crowding and conf inement (P icker ing and Pottinger, 1989) c a u s e increases in p lasma Cortisol concentration, which have been shown to result in both lymphocytopenia (Pickering, 1984) and susceptibi l ity of salmonids to var ious d i s e a s e s and infections (Picker ing and Duston, 1983). The importance of environmental stressors and the associat ion of hsps with steroid receptors, and hsp 90 overexpress ion in steroid responsive mal ignancies has generated considerable interest (Parsons, 1993; Jamee l et al . , 1993) and prompted further investigation into the assoc iat ion between environmental stress and the heat shock protein response in this thesis. A n interesting observat ion on the activation of heat shock genes in whole animals w a s made by Blake et al . (1991). T h e s e investigators demonstrated that the stress imposed by phys ica l restraint of the rat w a s sufficient to induce the express ion of select heat shock genes in the adrenals and vascu lar t issues. More recent ev idence (Holbrook and Ude lsman 1994) now indicate that restraint stress induces H S F 1 (the s a m e transcription factor that is induced by heat shock) and that the stress response w a s endocr ine- regulated by adrenocort icotropic hormone (ACTH) . Hypophysectomized rats did not exhibit this restraint-related heat shock gene induction, whereas the acute treatment of hypophysectomized rats with A C T H showed induction of hsp70 express ion in the adrenal g lands (Blake et al . 1991). T h e s e observat ions point to a link between the neuroendocr ine pathways and 101 t h e models proposed f o r H S F a c t i v a t i o n by t h e p r e s e n c e of u n f o l d e d o r m i s f o l d e d p r o t e i n s . If t h e h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e in a q u a t i c o r g a n i s m s is to b e u s e d a s a r e l i a b l e i n d i c a t o r of p h y s i o l o g i c a l l y s t r e s s e d s t a t e s , it is n e c e s s a r y to e s t a b l i s h w h a t , if a n y , e f fec t t h e h a n d l i n g a n d s a m p l i n g p r o c e d u r e s h a v e o n h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s in t h e t i s s u e s o f o r g a n i s m s w h i c h h a v e b e e n e x p o s e d to s t r e s s f u l e n v i r o n m e n t s . T o i n v e s t i g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s t r e s s h o r m o n e s a n d h s p c o n c e n t r a t i o n in t h e t i s s u e s of r a i n b o w trout a n d cut throat trout, b o t h r e s p o n s e s w e r e m e a s u r e d in f i s h s t r e s s e d wi th h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a d r e n a l i n e a n d h s p s w a s i n v e s t i g a t e d wi th e x p e r i m e n t s u s i n g trout h e p a t o c y t e s in p r i m a r y c u l t u r e . C e l l s w e r e e x p o s e d to h e a t a n d p h y s i o l o g i c a l o r p h a r m a c o l o g i c a l l e v e l s of a d r e n a l i n e in vitro. T h e h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s in t h e s e c e l l s w e r e m e a s u r e d a n d c o m p a r e d to c o n t r o l c e l l s in n o r m a l g r o w t h m e d i u m . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s Fish: R a i n b o w trout a n d cut throat trout w e r e u s e d f o r t h e s e e x p e r i m e n t s . R a i n b o w trout of b o t h s e x e s , w e i g h i n g 51.1 ± 11.1 ( m e a n ± S D ) w e r e o b t a i n e d f r o m t h e W e s t C r e e k trout f a r m , A l d e r g r o v e , B r i t i s h C o l u m b i a , a n d a c c l i m a t e d in 2 0 0 - L o v a l fiberglass t a n k s for 2 w e e k s b e f o r e t h e h a n d l i n g , Cortisol injection a n d h e a t s h o c k e x p e r i m e n t s . C u t t h r o a t t rout of b o t h s e x e s , w e i g h i n g 5 4 . 5 ± 11.11 ( M e a n ± S D ) w e r e a l s o u s e d f o r s e p a r a t e h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k e x p e r i m e n t s . O n e l a r g e r a i n b o w trout w e i g h i n g a p p r o x i m a t e l y 2 0 0 g w a s u s e d to i s o l a t e h e p a t o c y t e s f o r p r i m a r y c u l t u r e . T h e l a r g e r r a i n b o w trout w a s m a i n t a i n e d in a 8 0 0 - L o v a l f i b e r g l a s s t a n k p r i o r to t h e h e p a t o c y t e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e p r o c e d u r e . 102 Handling and heat shock T o d e t e r m i n e t h e effec t of h a n d l i n g , h e a t s h o c k a n d t h e c o m b i n a t i o n of h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k o n p l a s m a Cor t i so l a n d h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s in r a i n b o w trout gill t i s s u e s , f i s h w e r e e x p o s e d to t h e t h r e e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t s : (1) a 4 5 - s a e r i a l e x p o s u r e ; (2) a 1 0 ° C h e a t s h o c k ( f r o m 1 2 . 4 to 2 2 . 4 ° C ) wi th t h e f i s h m a i n t a i n e d at this e l e v a t e d t e m p e r a t u r e f o r 2 h ; o r (3) a 4 5 -s a e r i a l e x p o s u r e f o l l o w e d b y t h e s a m e h e a t s h o c k r e g i m e . A l l f i s h w e r e s a m p l e d at 1 a n d 4 8 h after t h e y w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t 1 2 . 4 ° C . C o n t r o l f i s h f o r t h e s e t r e a t m e n t s w e r e m a i n t a i n e d at a m b i e n t 1 2 . 4 ° C a n d s a m p l e d c o n c u r r e n t l y with t h e t r e a t e d f i s h . P l a s m a Cortisol, g l u c o s e , s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d to d e t e r m i n e t h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s of e a c h treatment. Cortisol injections T o d e t e r m i n e t h e ef fec t of e l e v a t e d Cor t i so l l e v e l s a n d h e a t s h o c k o n h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s in c u t t h r o a t trout gill t i s s u e s , f i s h w e r e e x p o s e d to t h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t s : (1) Cor t i so l i m p l a n t s ; (2) a 1 0 ° C h e a t s h o c k ( f r o m 12 .4 to 2 2 . 4 ° C ) wi th t h e f i s h m a i n t a i n e d at this e l e v a t e d t e m p e r a t u r e f o r 2 h , o r (3) C o r t i s o l i m p l a n t s f o l l o w e d b y t h e s a m e h e a t s h o c k r e g i m e . A l l f i s h w e r e s a m p l e d at 1 a n d 4 8 h after t h e y w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t 1 2 . 4 ° C . C o n t r o l f i s h f o r t h e s e t r e a t m e n t s w e r e m a i n t a i n e d at a m b i e n t 1 2 . 4 ° C a n d s a m p l e d c o n c u r r e n t l y w i t h t h e t r e a t e d f i s h . Epinephrine exposure T o d e t e r m i n e t h e ef fec t of e p i n e p h r i n e o n c u l t u r e d l iver c e l l s , h e p a t o c y t e s f r o m a 2 0 0 - g r a i n b o w trout w e r e c u l t u r e d a n d e x p o s e d to p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s of e p i n e p h r i n e wi th a n d w i t h o u t a p r i o r 2 - h s t e p 103 c h a n g e 1 5 ° C h e a t s h o c k ( f rom 15 to 30°C). T h e c e l l s w e r e a l l o w e d to r e c o v e r f r o m t h e h e a t s h o c k a n d / o r e p i n e p h r i n e e x p o s u r e f o r 1 h a n d w e r e t h e n h a r v e s t e d , w a s h e d , f r o z e n o n d r y i c e a n d s t o r e d at - 7 0 ° C until S D S - P A G E a n d W e s t e r n b l o t t i n g . A s e c o n d e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d to tes t t h e e f f e c t of b l o c k i n g B - receptors d u r i n g e x p o s u r e to e p i n e p h r i n e o n h s p 7 0 l e v e l s in trout h e p a t o c y t e s . C u l t u r e d h e p a t o c y t e s w e r e e x p o s e d to a p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 - 5 M ) of e p i n e p h r i n e e i t h e r wi th a n d w i t h o u t t h e p - b l o c k e r p r o p r a n o l o l . T h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d in t h e s e m e d i a f o r 3 h a n d t h e n h a r v e s t e d f o r S D S - P A G E a n d W e s t e r n b l o t t i n g p r o b e d w i t h t h e t rout s p e c i f i c a n t i - h s p 7 0 rabbi t p r i m a r y a n t i b o d y . Primary hepatocyte isolation and culture: P r i m a r y h e p a t o c y t e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e w a s p e r f o r m e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b y M o m m s e n et a l . ( 1994) . T h e f i s h w e r e first a n e s t h e t i z e d w i t h a le thal d o s e of T M S (0 .5 g T M S a n d 1 g N a H C 0 3 / L ) . A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d u n d e r a s e p t i c c o n d i t i o n s . T h e f i s h s k i n w a s s w a b b e d wi th a l c o h o l , a l l s u r g i c a l i n s t r u m e n t s , n y l o n fil ters a n d s o l u t i o n s w e r e s t e r i l i z e d . T h e a n e s t h e t i z e d f i s h w a s t h e n cut f r o m t h e v e n t to t h e p e r i t o n e u m a l o n g t h e v e n t r a l m i d l i n e wi th c a r e , to a v o i d n i c k i n g t h e l iver . T h e p o s t e r i o r i n t e s t i n a l v e i n w a s t e a s e d f r e e f r o m t h e s u r r o u n d i n g fat a b o u t 8 c m f r o m t h e l iver a n d t w o l o o p s of 3 -0 s u r g i c a l t h r e a d w e r e t i e d a r o u n d t h e gut a n d v e s s e l . S c i s s o r s w e r e u s e d to n i c k t h e v e s s e l a n d a P E - 9 0 c a n n u l a w a s s l i p p e d into t h e v e s s e l w i t h s l ight r o l l i n g until a s l ight r e s i s t a n c e w a s felt, i n d i c a t i n g that t h e tip o f t h e c a n n u l a w a s a b o u t 5 m m f r o m t h e l iver . T h e c a n n u l a w a s t h e n f i x e d in p o s i t i o n b y t i g h t e n i n g t h e s u r g i c a l t h r e a d s a n d s e c u r i n g t h e m wi th a d o u b l e knot . A m u l t i c h a n n e l p e r i s t a l t i c p u m p w a s s e t to m i n i m u m f l o w rate to i n f u s e m o d i f i e d H a n k ' s m e d i u m [ 1 3 6 . 9 m M N a C l , 5 .4 m M K C I , 0 .81 m M M g S 0 4 , 0 . 4 4 m M K H 2 P O 4 , 0 . 3 3 m M 104 N a 2 H P 0 4 , 5 .0 m M N a H C 0 3 , 10 m M H E P E S , ( p H 7 . 6 3 at r o o m t e m p e r a t u r e ) ] d u r i n g c a n n u l a t i o n . T h e f l o w ra te w a s i n c r e a s e d g r a d u a l l y to a b o u t 2 m L / m i n ( a b o u t 0 .5 to 1.0 m L p e r g l iver p e r min) after s u c c e s s f u l c a n n u l a t i o n w h i l e t h e l iver b l a n c h e d . T h e h e a r t w a s e x p o s e d a n d r e m o v e d d u r i n g t h e b l a n c h i n g p e r i o d to a l l o w f r e e d r a i n a g e o f t h e p e r f u s a t e a n d to p r e v e n t p r e s s u r e b u i l d - u p in t h e l iver . T h e l iver w a s m a s s a g e d lightly f o r 5 to 8 m i n to a s s i s t in c l e a r i n g al l of t h e b l o o d f r o m t h e l iver . W h e n all o f t h e b l o o d h a d c l e a r e d , t h e p e r f u s a t e w a s s w i t c h e d to c o l l a g e n a s e , [17.5 m g c o l l a g e n a s e ( S i g m a t y p e IV), a total o f 7 5 , 0 0 0 u n i t s w a s d i s s o l v e d in m o d i f i e d H a n k ' s m e d i u m , m a d e f r e s h just b e f o r e u s e ] t a k i n g c a r e n o t to i n t r o d u c e a n y a i r into t h e p e r f u s i o n l ine . T h e l iver w a s a g a i n m a s s a g e d l ightly f o r a b o u t 5 m i n af ter t h e s w i t c h to c o l l a g e n a s e to i n c r e a s e c e l l y i e l d . T h e l iver w a s p e r f u s e d in situ wi th c o l l a g e n a s e at r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 to 2 5 m i n , at w h i c h t i m e t h e l iver h a d s o m e f l u i d f l o w i n g f r e e l y f r o m a r e a s o n t h e s u r f a c e . T h e l iver w a s t h e n c a r e f u l l y r e m o v e d f r o m t h e c a v i t y , t a k i n g c a r e n o t to p u n c t u r e t h e g a l l b l a d d e r o r to d r a i n b i l e into t h e l iver . T h e vena cava a n d p e r i t o n e a l l i n i n g w e r e cut a n d t h e l iver w a s lifted b y s l i p p i n g t w o f i n g e r s u n d e r n e a t h b o t h s i d e s of t h e o r g a n . T h e g a l l b l a d d e r w a s cut off w h i l e t h e l iver w a s s u p p o r t e d b e t w e e n t h e f i n g e r s a n d t h e l iver w a s t r a n s f e r r e d to a s m a l l g l a s s petr i d i s h o n i c e c o n t a i n i n g 2 m L of m o d i f i e d H a n k ' s m e d i u m . T h e l iver w a s t h e n c h o p p e d f i n e l y wi th a r a z o r b l a d e a n d t h e t i s s u e s u s p e n s i o n w a s p o u r e d into c o a r s e 2 5 3 - u m p l a n k t o n n e t t i n g f u s e d u n d e r h e a t into t h e b o t t o m o f a 2 0 0 -m L p l a s t i c b e a k e r . T h e s u s p e n s i o n of c e l l s f l o w e d f r o m t h e c o a r s e filter o n t o a f i n e r 5 2 - o r 7 3 - u m p l a n k t o n n e t w h i c h w a s h e a t s e a l e d o n t o t h e b o t t o m o f a s e c o n d p l a s t i c 2 0 0 - m L b e a k e r a n d f i n a l l y into a b e a k e r s i t t ing o n i c e . C e l l s p l u s d e b r i s w e r e g e n t l y m a s s a g e d t h r o u g h t h e c o a r s e filter but a l l o w e d to d r a i n f r e e l y t h r o u g h t h e s e c o n d filter. T h e c e l l s w e r e f l u s h e d t h r o u g h t h e s c r e e n s u s i n g a b o u t 5 0 m L o f i c e - c o l d , C a 2 + - f r e e m o d i f i e d H a n k ' s s o l u t i o n . T h e c e l l s w e r e 105 t h e n c e n t r i f u g e d at s l o w s p e e d (60 g) f o r 3 to 4 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d , t h e r e s u l t i n g p e l l e t w a s g e n t l y s w i r l e d to b r e a k u p t h e c e l l c l u s t e r s a n d t h e n t a k e n u p in w a s h i n g a n d i n c u b a t i o n m e d i u m [2% d e f a t t e d b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) p l u s 1 . 5 m M CaCl2 m a d e u p in m o d i f i e d H a n k ' s m e d i u m ] , total v o l u m e a b o u t 5 t i m e s t h e w e i g h t of t h e l iver . T h e r e s u l t i n g s u s p e n s i o n w a s m i x e d g e n t l y b y s w i r l i n g a n d r e - c e n t r i f u g e d . T h i s w a s h i n g p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d f o u r o r f i v e t i m e s . T h e f i n a l c e l l p e l l e t w a s t a k e n u p in c u l t u r e m e d i u m . T h e c e l l s w e r e c u l t u r e d in L - 1 5 , d i l u t e d to a c o n c e n t r a t i o n of 1.0 X 1 0 6 c e l l s / m L a n d p l a t e d at a d e n s i t y of a b o u t 0 .3 X 1 0 6 c e l l s / c m 2 in P r i m a r i a flat b o t t o m s i x - w e l l p l a t e s ( B e c t o n D i c k s o n L a b w a r e , F r a n k l i n L k e s , N e w J e r s e y ) . T h e c e l l s s e t t l e d to t h e b o t t o m of t h e w e l l s a n d s t a r t e d a d h e r i n g i m m e d i a t e l y . T h e c e l l s w e r e c u l t u r e d in a m b i e n t a i r at 1 5 ° C a n d t h e c u l t u r e m e d i u m w a s c h a n g e d e v e r y 2 d a y s . T h e c e l l s f o r m e d a c o n f l u e n t m o n o l a y e r w i t h i n 2 4 to 4 8 h a n d w e r e u s e d f o r t h e tr ials t h r e e d a y s af ter t h e y w e r e i s o l a t e d . Epinephrine and heat shock exposures T h e c u l t u r e d h e p a t o c y t e s w e r e e x p o s e d to p h y s i o l o g i c a l (10~ 7 M ) a n d p h a r m a c o l o g i c a l ( 1 0 - 5 M ) ( G a m p e r l et a l . , 1994 ) c o n c e n t r a t i o n s o f e p i n e p h r i n e ( S i g m a , M i s s i s s a u g a , O n t . ) . T h e e p i n e p h r i n e c o n c e n t r a t i o n s w e r e e s t a b l i s h e d b y a d d i n g t h e a p p r o p r i a t e v o l u m e of a s t o c k ( 1 0 - 3 M ) s o l u t i o n o f e p i n e p h r i n e d i s s o l v e d in w a t e r . T h e e p i n e p h r i n e w a s a d d e d to t h e c e l l c u l t u r e a n d t h e c e l l s w e r e t h e n e i t h e r i n c u b a t e d f o r 2 h at a m b i e n t 1 5 ° C o r t r a n s f e r r e d t o a 3 0 ° C i n c u b a t o r f o r 2 h . T h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e c e l l s w e r e h a r v e s t e d 3 h af ter t h e a d d i t i o n o f e p i n e p h r i n e to t h e g r o w t h m e d i u m a n d t h e h e a t s h o c k e d ( 3 0 ° C ) c e l l s w e r e a l l o w e d to r e c o v e r at a m b i e n t t e m p e r a t u r e f o r 1 h p r i o r to h a r v e s t i n g , r e s u l t i n g in e q u a l e p i n e p h r i n e e x p o s u r e t i m e f o r t h e two t r e a t m e n t g r o u p s . 106 Hepatocyte harvesting from 6 well plates T h e L - 1 5 m e d i u m f r o m e a c h w e l l o f t h e s i x - w e l l c u l t u r e p l a t e s w a s r e m o v e d f r o m e a c h w e l l . T h e c e l l s w e r e t h e n w a s h e d o n c e wi th a b o u t 1 m L of 0 . 0 5 M T r i s b u f f e r ( p H 7.5) b e i n g c a r e f u l n o t to d i s t u r b t h e c e l l s (i .e . p o u r t h e T r i s b u f f e r d o w n t h e s i d e w a l l o f t h e w e l l r a t h e r t h a n d i r e c t l y o n t o t h e c e l l s to a v o i d d i s l o d g i n g t h e c e l l s f r o m t h e b o t t o m o f t h e w e l l ) . T h e p l a t e s w e r e s w i r l e d g e n t l y to w a s h t h e c e l l s a n d t h e T r i s w a s t h e n a s p i r a t e d off a n d d i s c a r d e d . 7 5 0 pi of f r e s h b u f f e r w a s a d d e d to e a c h w e l l a n d t h e c e l l s w e r e s c r a p e d off t h e b o t t o m of t h e w e l l s with a r u b b e r p o l i c e m a n . T h e c e l l s u s p e n s i o n s w e r e h a r v e s t e d wi th a P a s t e u r p i p e t t e a n d t r a n s f e r r e d to a s e t o f l a b e l e d 1 . 5 - m L t u b e s . T h e t u b e s w e r e s p u n at l o w s p e e d ( 1 , 1 0 0 g) f o r 2 m i n , t h e s u p e r n a t a n t w a s a s p i r a t e d a n d d i s c a r d e d a n d t h e p e l l e t s w e r e f r o z e n o n d r y i c e a n d s t o r e d at - 7 0 ° C unti l S D S - P A G E a n d W e s t e r n blo t t ing . 3-blocking of epinephrine receptors T h e (3-receptors of c u l t u r e d trout h e p a t o c y t e s w e r e 0 - b l o c k e d b y a d d i n g p r o p r a n o l o l ( 1 0 - 3 M ) to t h e c u l t u r e m e d i u m at t h e s a m e t i m e a s a p h a r m a c o l o g i c a l d o s e of e p i n e p h r i n e ( 1 0 - 5 M ) w a s a d d e d . C o n t r o l c e l l s h a d e p i n e p h r i n e a d d e d to t h e c u l t u r e m e d i u m o n l y . T h e e x p o s u r e t i m e f o r b o t h g r o u p s o f c e l l s w a s 3 h . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d at t h e e n d o f t h e 3 h e x p o s u r e p e r i o d , f r o z e n o n d r y i c e a n d s t o r e d at - 7 0 ° C until S D S - P A G E a n d W e s t e r n b l o t t i n g . Hepatocyte sonication 1 . 5 - m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s c o n t a i n i n g f r o z e n h e p a t o c y t e p e l l e t s r e c e i v e d 1 5 0 pi of T r i s b u f f e r (0 .05 M ; p H 7.5). T h e c e l l s w e r e m i x e d a n d s o n i c a t e d o n i c e f o r 3 0 s wi th a V i b r a c e l l s o n i c a t o r ( S o n i c s a n d M a t e r i a l s Inc., 107 C T . , U S A ) . 10 ul of t h e s o n i c a t e d c e l l s u s p e n s i o n w a s a d d e d to 9 0 pl of T r i s b u f f e r (0 .05 M , p H 7 .5) in a 1.5 m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e a n d u s e d to d e t e r m i n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n b y B C A a s s a y . 7 5 pl of s o n i c a t e d c e l l s u s p e n s i o n w a s a d d e d to a s e c o n d t u b e c o n t a i n i n g 7 5 pl of 2X L a e m m l i ' s s a m p l e buffer , b o i l e d f o r 3 m i n a n d t h e n f r o z e n at - 2 0 ° C until S D S - P A G E a n d W e s t e r n b lo t t ing . Cortisol injections S l o w - r e l e a s i n g i n t r a p e r i t o n e a l Cortisol i m p l a n t s w e r e i n j e c t e d into t h e r a i n b o w trout u s i n g t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y S p e c k e r et a l . ( 1994) . T h e Cortisol ( h y d r o c o r t i s o n e ; S i g m a , St . L o u i s M O ) w a s d i s s o l v e d in a 1:1 m i x t u r e (w/w) of c o c o n u t oi l ( S i g m a , St . L o u i s , M O ) a n d c a n o l a oi l ( P r o c t o r a n d G a m b l e , Inc., T o r o n t o , O n t . ) h e a t e d to l i q u e f a c t i o n ( 4 2 ° C ) , at a c o n c e n t r a t i o n o f 1 5 m g Cortisol / m L o f o i l . T h e i n j e c t i o n s w e r e d o n e w h i l e t h e m i x t u r e w a s still f l u i d ( 2 5 ° C ) a n d t h e i m p l a n t s o l i d i f i e d in t h e c o l d e r trout. T h e i n j e c t i o n s w e r e m a d e u s i n g a 1 - m L p l a s t i c s y r i n g e a t t a c h e d to a 21 G , 2 . 5 - c m n e e d l e . T h e i n s e r t i o n p o i n t into t h e p e r i t o n e a l c a v i t y w a s o n t h e v e n t r a l b o d y s u r f a c e , m i d w a y b e t w e e n t h e p e l v i c a n d p e c t o r a l f i n s . T o a c h i e v e p l a s m a Cortisol c o n c e n t r a t i o n s s i m i l a r to t h o s e s e e n in s t r e s s e d f i s h , t h e f i s h w e r e i m p l a n t e d with a d o s e of 7 5 pg Cortisol / g b o d y w e i g h t . T h e f i s h w e r e l ightly a n e s t h e t i z e d p r i o r to i n j e c t i o n a n d w e i g h e d t o d e t e r m i n e t h e i n j e c t i o n v o l u m e (5 pl p e r g of f i s h ) . Blood sampling B l o o d s a m p l i n g w a s c a r r i e d o u t b y s e v e r i n g t h e c a u d a l p e d u n c l e wi th a s c a l p e l a n d d r a w i n g a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 pl o f b l o o d into t w o s e p a r a t e h e p a r i n i z e d m i c r o h e m a t o c r i t c a p i l l a r y t u b e s . T h e h e m a t o c r i t t u b e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d in 108 a n I E C M o d e l M B m i c r o h e m a t o c r i t c e n t r i f u g e ( Internat ional E q u i p m e n t C o . , N e e d h a m H t s . , M A ) . T h e r e d blood c e l l f r a c t i o n of t h e b l o o d w a s s e p a r a t e d f r o m t h e p l a s m a f r a c t i o n b y c u t t i n g t h e t u b e s wi th a d i a m o n d s c r i b e . T h e p l a s m a f r a c t i o n w a s s e a l e d in t h e t u b e with C R I T O S E A L a n d s t o r e d at - 2 0 ° C until u s e d f o r Cortisol, g l u c o s e a n d i o n determinations. Plasma glucose determination P l a s m a g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g t h e a m o d i f i e d T r i n d e r ( 1 9 6 9 ) e n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n m e t h o d a v a i l a b l e in kit f o r m ( S i g m a , M i s s i s s a u g a , O n t . ) . In this a s s a y , g l u c o s e is o x i d i z e d to g l u c o n i c a c i d a n d h y d r o g e n p e r o x i d e , in t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d b y g l u c o s e o x i d a s e . T h e h y d r o g e n p e r o x i d e f o r m e d r e a c t s in t h e p r e s e n c e of p e r o x i d a s e wi th 4 - a m i n o a n t i p y r i n e a n d p - h y d r o x y b e n z e n e s u l f o n a t e to f o r m a q u i n o n e a m i n e d y e , w i t h a n a b s o r b a n c e m a x i m u m at 5 0 5 n m . T h e i n t e n s i t y o f t h e c o l o r p r o d u c e d is d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l to t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n in t h e s a m p l e . T h e g l u c o s e ( T r i n d e r ) r e a g e n t (0 .5 m M 4 - a m i n o a n t i p y r i n e ; 2 0 m M p - h y d r o x y b e n z e n e ; 1 5 , 0 0 0 U / L g l u c o s e o x i d a s e {Aspergillus niger); 1 0 , 0 0 0 U / L p e r o x i d a s e ( h o r s e r a d i s h ) at p H 7.0) w a s u s e d in a 9 6 - w e l l microt i ter p l a t e f o r m a t . A s t a n d a r d c u r v e w a s g e n e r a t e d f o r e a c h a s s a y b y a d d i n g 2 .5 pi of s t a n d a r d s o f k n o w n g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n to 2 5 0 pi of T r i n d e r r e a g e n t at r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e r e a c t i o n a l l o w e d to p r o c e e d f o r 18 m i n . T h e a b s o r b a n c e at 5 0 5 n m w a s r e a d wi th a T h e r m o m a x m i c r o p l a t e r e a d e r ( M o l e c u l a r D e v i c e s , M e n l o P a r k , C A ) . G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s in u n k n o w n s a m p l e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n d e r i v e d f r o m a b s o r b a n c e v a l u e s v s . k n o w n s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n s . Plasma ion determinations 109 P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d u s i n g a H a a k e B u c h l e r digi ta l c h l o r i d o m e t e r ( H a a k e B u c h l e r I n s t r u m e n t s , Inc., S a d d l e b r o o k , N . J . ) w h i c h is a c o u l o m e t r i c titrator d e s i g n e d to d e t e r m i n e t h e c h l o r i d e i o n c o n c e n t r a t i o n o f s o l u t i o n s s u c h a s s e r u m , u r i n e a n d o t h e r a q u e o u s s o l u t i o n s . T h e p r i n c i p l e o f o p e r a t i o n is t h e q u a n t i f i a b l e r e a c t i o n w h i c h r e s u l t s w h e n s i l v e r a n d c h l o r i d e i o n s c o m b i n e to f o r m i n s o l u b l e p r e c i p i t a t e s of s i l v e r c h l o r i d e ( A g C I ) . T h i s r e a c t i o n is c a r r i e d o u t at a c o n s t a n t rate b y p a s s i n g a f i x e d d i r e c t c u r r e n t b e t w e e n a p a i r o f s i l v e r e l e c t r o d e s i m m e r s e d in a n a c i d s o l u t i o n ( 0 . 6 4 % nitric a c i d a n d 1 0 % g l a c i a l a c e t i c a c i d in d i s t i l l e d w a t e r ) . T h e a n o d e , w h i c h is c o n s u m e d in this r e a c t i o n is a c o n t i n u o u s s p o o l of s i l v e r w i r e . A s t h e e q u i v a l e n c e p o i n t o f t h e r e a c t i o n is r e a c h e d , t h e c u r r e n t f l o w i n g b e t w e e n a p a i r of s e p a r a t e i n d i c a t o r e l e c t r o d e s i n c r e a s e s a n d is d e t e c t e d b y t h e s e n s e c i rcui t ry . A t a p r e s e t i n d i c a t o r c u r r e n t , t h e i n s t r u m e n t a u t o m a t i c a l l y s t o p s t h e i n c r e m e n t a l c o u n t e r . S i n c e t h e g e n e r a t o r c u r r e n t is c o n s t a n t , t h e total t i tration t i m e is d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l to t h e n u m b e r o f c h l o r i d e i o n s p r e s e n t in t h e s a m p l e v i a l . T h e i n s t r u m e n t d i s p l a y s t h e i r r e l a t i v e t i m e in u n i t s o f m i l l i e q u i v a l e n t s c h l o r i d e p e r liter. T h e r e p r o d u c i b i l i t y a n d a c c u r a c y o f t h e i n s t r u m e n t a r e b o t h ± 0 . 5 % a n d t h e r e s o l u t i o n is 1 m E q / L . C h l o r i d e c o n t e n t o f e a c h p l a s m a s a m p l e w a s m e a s u r e d b y a d d i n g 1 0 pl o f p l a s m a to 4 m L o f a c i d s o l u t i o n . T h e titration t i m e f o r e a c h s a m p l e w a s a b o u t 2 0 s. E a c h s a m p l e w a s a n a l y z e d in d u p l i c a t e . P l a s m a s o d i u m a n d p o t a s s i u m m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a n i o n c h r o m a t o g r a p h . T h e s a m p l e s w e r e p r o c e s s e d b y a d d i n g 5 p l o f p l a s m a a n d 5 pl of a c e t o n i t r i l e (a p r o t e i n prec ipi ta tor ) to 1 8 0 pl o f d i s t i l l e d a n d d e i o n i z e d w a t e r N A N O p u r e U l t r a p u r e w a t e r s y s t e m ( B a r n s t e a d , D u b u r q u e , lo.) a n d t h e n c e n t r i f u g i n g f o r 2 - 3 m i n at 1 1 , 6 0 0 g i n a M i c r o - C e n t a u r c e n t r i f u g e ( M S E S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , S u s s e x , E n g l a n d ) . 1 0 0 pl of t h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n p i p e t t e d d i r e c t l y into a n a u t o s a m p l e r v i a l f i t ted wi th a 2 0 0 - p l p o l y p r o p y l e n e 110 insert . T h e s a m p l e s w e r e i n j e c t e d into t h e d e t e c t o r wi th a S I L - 9 A a u t o injector a n d p u m p e d t h r o u g h t h e s y s t e m u s i n g a n L P - 6 A p u m p . T h e c o n d u c t i v i t y o f e a c h s a m p l e w a s d e t e c t e d b y a C D D - 6 A c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r w h i c h w a s t e m p e r a t u r e s t a b i l i z e d u s i n g a C T O - 6 A S c o l u m n o v e n . T h e o u t p u t s i g n a l f r o m e a c h s a m p l e , a s it p a s s e d t h r o u g h t h e d e t e c t o r , w a s a n a l y z e d b y a C R - 5 0 1 i n t e g r a t o r (all c o m p o n e n t s b y S h i m a d z u S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , Inc., C o l u m b i a , M d ) . Gill excision G i l l a r c h e s w e r e e x c i s e d af ter r e m o v i n g t h e f i s h f r o m t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r t a n k , a n d q u i c k l y p u l l i n g t h e t e m p e r a t u r e p r o b e o u t t h r o u g h t h e e s o p h a g u s (in t h e c a s e of f i s h w h i c h h a d b e e n f i t ted w i t h a t e m p e r a t u r e p r o b e ) a d m i n i s t e r i n g a b l o w to t h e h e a d with a p l a s t i c b a t o n , a n d m e a s u r i n g a n d w e i g h i n g e a c h f i s h . F o u r gill a r c h e s , t h e w h o l e a n t e r i o r k i d n e y , 1.0 g o f l iver a n d 1.0 g o f s k e l e t a l m u s c l e w e r e e x c i s e d with s u r g i c a l f o r c e p s a n d s c i s s o r s , i m m e d i a t e l y p l a c e d in 1.5 m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s a n d f r o z e n o n d r y i c e . T h e e n t i r e e x c i s i o n p r o c e d u r e w a s n o r m a l l y p e r f o r m e d in l e s s t h a n 2 m i n . T h e t i s s u e s w e r e s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e p r o c e s s e d f o r B C A p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n a n d S D S - P A G E . Gill sample preparation A l l f i s h gi l ls w e r e p r e p a r e d f o r t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) a s s a y , to d e t e r m i n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , a n d S D S - P A G E a s f o l l o w s . T h e g i l l s w e r e t h a w e d o n i c e , f r o m - 2 0 ° C at w h i c h t h e y w e r e s t o r e d , a n d r i n s e d in 1 0 m L o f 5 0 0 m M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7.5). A 0 . 5 - g s a m p l e o f t i s s u e w a s a d d e d to 1.0 m L of h y p o t o n i c s o l u t i o n [100 m M T r i s - H C l ( p H 7.5) ; 0 . 1 % S D S ; 0.1 m M P M S F ) a n d 2 5 0 pi of a 5 X p r o t e a s e inhibi tor c o c k t a i l ( 5 . 0 m M P M S F ; 7 .5 m M E D T A ; 5 u M p e p s t a t i n A ; 5 u M l e u p e p t i n ; 1 .5 u M a p r o t i n i n in 1 0 m M T r i s -Ill H C I ( p H 7 . 5 ) ] a n d h o m o g e n i z e d o n i c e for 3 0 s u s i n g a T e f l o n t i p p e d h o m o g e n i z e r ( T R I - R I n s t r u m e n t s , J a m a i c a , N Y . ) m o u n t e d in a 1 0 - m m T y p e 6 h a n d l e h e l d e l e c t r i c drill ( B l a c k & D e c k e r , B r o c k v i l l e , O n t . ) r e v o l v i n g at 1 0 0 - 1 2 5 r p m wi th s p e e d r e g u l a t e d b y a n A D J U S T - A - V O L T v o l t a g e r e g u l a t o r ( S t a n d a r d E l e c t r i c P r o d u c t C o . , D a y t o n O H . ) . T h e h o m o g e n i z e d t i s s u e s w e r e t r a n s f e r r e d to 1 . 5 - m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s a n d c e n t r i f u g e d at 1 7 , 0 0 0 g for 4 5 m i n a t 4 ° C . T h e s u p e r n a t a n t w a s s e p a r a t e d into two f r a c t i o n s ; 1 5 0 pl w a s u s e d d i r e c t l y f o r t h e B C A p r o t e i n a s s a y a n d a 650 -pl f r a c t i o n w a s m i x e d 1:1 wi th 2 X L a e m m l i s a m p l e b u f f e r ( 1 2 0 m M T r i s - H C l , 2 0 % g l y c e r o l , 4 % S D S , 2 % f i - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 0 . 0 0 2 % b r o m o p h e n o l b l u e ; p H 6.8), b o i l e d f o r 3 m i n a n d s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e r u n o n S D S - P A G E g e l s . S t a n d a r d p r o t o c o l s f o r p l a s m a Cortisol d e t e r m i n a t i o n , t h e b i c i n c h o n i n i c ac id- p r o t e i n a s s a y , S D S - P A G E , c o o m a s s i e s t a i n i n g , t r a n s f e r r i n g p r o t e i n s f r o m g e l s to n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s , W e s t e r n blot t ing , a n d d e n s i t o m e t r y m e a s u r e m e n t s c a n b e f o u n d in t h e G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n ( C h a p t e r 2). Statistical analysis D a t a w e r e e i t h e r s ta t is t ica l ly a n a l y z e d b y M e s t o r o n e - w a y a n a l y s i s of v a r i a n c e ( A N O V A ) f o l l o w e d o r S t u d e n t - N e w m a n - K e u l s o r D u n n ' s M u l t i p l e R a n g e T e s t w h e r e a p p r o p r i a t e . In c a s e s w h e r e t h e d a t a s e t f a i l e d t h e n o r m a l i t y tes t r e q u i r e d to r u n t h e M e s t , a M a n n - W h i t n e y r a n k s u m test w a s u s e d a s a n o n p a r a m e t r i c a l t e r n a t i v e . If a d a t a se t f a i l e d to p a s s t h e n o r m a l i t y test p r i o r t h e p e r f o r m i n g a m u l t i p l e c o m p a r i s o n s test, a K r u s k a l l - W a l l i s A N O V A o n r a n k s w a s p e r f o r m e d , r a t h e r t h a n a s t a n d a r d o n e w a y A N O V A . S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e e s t a b l i s h e d at t h e p = 0 . 0 5 l e v e l f o r all tes ts . 112 R e s u l t s T h e h a n d l i n g protocol w a s effective in elevating p l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e l e v e l s . P l a s m a Cortisol concentrations p e a k e d at 1 1 6 ± 11 .2 n g / m L ( m e a n ± S E ) 1 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e h o l d i n g t a n k s . T h e g l u c o s e v a l u e s p e a k e d at 2 2 4 ± 6 .4 m g / d L ( m e a n ± S E ) 3 h af ter t h e s t r e s s f u l h a n d l i n g e v e n t ( F i g u r e 6.1) . P l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e v a l u e s w e r e u n c h a n g e d af ter t h e 4 5 s h a n d l i n g s t r e s s ( F i g u r e 6.2) G i l l , l iver a n d k i d n e y c o n c e n t r a t i o n s of h s p 7 0 m e a s u r e d in t i s s u e s a m p l e s t a k e n 1 h af ter t h e 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s s h o w e d n o differences between s t r e s s e d f i s h a n d c o n t r o l f i s h ( F i g u r e 6.3) . A t i m e c o u r s e trial p e r f o r m e d to m e a s u r e gill h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s d u r i n g a 4 8 - h r e c o v e r y p e r i o d after a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s a l s o s h o w e d n o d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e h a n d l e d f i s h a n d t h e u n d i s t u r b e d c o n t r o l f i s h ( F i g u r e 6 .4) . A 4 5 - s h a n d l i n g stress t h e r e f o r e d i d not i n d u c e t h e e x p r e s s i o n of h s p 7 0 in a n y of t h e t i s s u e s that w e r e s u r v e y e d d u r i n g t h e 4 8 - h p e r i o d f o l l o w i n g e x p o s u r e to that s t r e s s o r . P l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e measurements from f i s h e x p o s e d to a 1 0 ° C h e a t s h o c k with a n d w i t h o u t a prior 4 5 - s h a n d l i n g stress s h o w e d that t h e f i s h s a m p l e d 1 h af ter t h e s i n g l e o r d o u b l e s t r e s s o r e x p o s u r e s h a d e l e v a t e d p l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e l e v e l s , w h i c h returned to c o n t r o l l e v e l s 4 8 h after e x p o s u r e to t h e s t r e s s o r s ( F i g u r e 6.5) P l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e m e a s u r e m e n t s t a k e n 1 a n d 4 8 h after t h e f i s h w e r e e x p o s e d to h a n d l i n g , h e a t s h o c k o r b o t h g e n e r a l l y s h o w e d n o ef fec t o f e i t h e r h a n d l i n g o r h e a t s h o c k o n t h e s e v a r i a b l e s 1 h after t h e f i s h h a d been e x p o s e d to t h e s t r e s s o r s . T h e o n l y o b s e r v e d d i f f e r e n c e s w e r e b e t w e e n t h e p l a s m a s o d i u m l e v e l s o f f i s h 4 8 h af ter o n e g r o u p h a d b e e n b o t h h e a t s h o c k e d a n d h a n d l e d c o m p a r e d to f i s h that h a d b e e n h a n d l e d o n l y ( F i g u r e 6.6) . F i g u r e 6 .7 s h o w s t y p i c a l W e s t e r n b l o t s o f f i s h p r o t e i n s t r a n s f e r r e d to n t i r o c e l l u l o s e a n d p r o b e d wi th t h e s a l m o n i d - s p e c i f i c 113 h s p 7 0 a n d h s p 3 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s a m p l e s h o w n is of r a i n b o w trout gil l t i s s u e p r o t e i n s from c o n t r o l a n d h e a t - s h o c k e d f i s h . G i l l t i s s u e h s p 7 0 a n d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s m e a s u r e d in t i s s u e s a m p l e s t a k e n 1 h af ter t h e f i s h w e r e e i t h e r h a n d l e d , o r b o t h h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k s h o w e d that h s p 7 0 a n d h s p 3 0 l e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r in f i s h h a n d l e d b e f o r e b e i n g e x p o s e d to a 1 0 ° C h e a t s h o c k p r o t o c o l ( F i g u r e s 6 .8 a n d 6.9) . R e s u l t s f r o m t h e Cortisol i n j e c t e d a n d h e a t s h o c k e d f i s h w e r e s i m i l a r to t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m f i s h that h a d b e e n h a n d l e d a n d h e a t s h o c k e d , e x c e p t f o r o n e o b s e r v a t i o n . H s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s in gill t i s s u e s f o l l o w i n g a 1 0 ° C h e a t s h o c k w e r e u n a f f e c t e d b y h i g h c i r c u l a t i n g Cortisol c o n c e n t r a t i o n s . F i s h tha t r e c e i v e d t h e Cortisol i m p l a n t s h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e c o m p a r e d to c o n t r o l f i s h that r e c e i v e d s h a m i m p l a n t s wi th Cortisol c a r r i e r o n l y . T h e e l e v a t e d Cortisol a n d g l u c o s e l e v e l s w e r e o b s e r v e d at b o t h 1 h a n d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 6 .10) . P l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s a g a i n r e m a i n e d u n c h a n g e d af ter t h e Cortisol in jec t ion o r h e a t s h o c k t r e a t m e n t s . T h e o n l y p l a s m a i o n d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d 4 8 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to a m b i e n t t e m p e r a t u r e w a t e r . P l a s m a s o d i u m l e v e l s at t h i s t i m e w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r i n f i s h that h a d r e c e i v e d a Cortisol i m p l a n t a n d h a d b e e n h e a t s h o c k e d , c o m p a r e d wi th c o n t r o l f i s h , o r f i s h that h a d o n l y b e e n h e a t s h o c k e d . S i m i l a r l y , f i s h that h a d r e c e i v e d a Cortisol i m p l a n t a n d w e r e h e a t s h o c k e d h a d l o w e r p l a s m a c h l o r i d e l e v e l s t h a n t h e c o n t r o l f i s h a n d f i s h o n l y Cortisol i n j e c t e d o r h e a t s h o c k e d ( F i g u r e 6 .11) . T h e m o s t s t r i k i n g r e s u l t s f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s a r e t h o s e s h o w n in f i g u r e s 6 . 1 2 a n d 6 .13 . F i g u r e 6 . 1 2 s h o w s that gill t i s s u e h s p 7 0 l e v e l s w e r e u n a f f e c t e d b y h i g h c i r c u l a t i n g p l a s m a Cortisol c o n c e n t r a t i o n s . C o r t i s o l - i m p l a n t e d a n d s h a m - i m p l a n t e d f i s h s u b j e c t e d to a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k h a d t h e s a m e h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n 1 h after t h e h e a t s h o c k t r e a t m e n t s . F i g u r e 6 . 1 3 114 s h o w s that gill t i s s u e h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r in f i s h that had intraperitoneal Cortisol i m p l a n t s c o m p a r e d with f i s h s h a m i m p l a n t e d with t h e Cortisol carrier o n l y . T h e results s h o w e d that f i s h with e l e v a t e d p l a s m a Cortisol concentrations d u e to h a n d l i n g stress o r Cortisol i m p l a n t h a v e t h e s a m e o r l o w e r gill h s p 7 0 a n d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s in r e s p o n s e to a h e a t s h o c k . W h e n p l a s m a Cortisol concentration w a s artificially e l e v a t e d (by s l o w -r e l e a s i n g intraperitoneal Cortisol implants) t h e f i s h gill tissues d i d n o t h a v e t h e n o r m a l i n c r e a s e d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n but d i d s h o w a n o r m a l i n c r e a s e o f h s p 7 0 , a f te r a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k . R e s u l t s f r o m t h e p r i m a r y h e p a t o c y t e c u l t u r e s e x p o s e d to e p i n e p h r i n e s h o w e d that w h e n t h e c e l l s a r e m a i n t a i n e d at 1 5 ° C , a 2-h e x p o s u r e to e i t h e r a p h y s i o l o g i c a l ( 1 0 - 7 M ) o r a p h a r m a c o l o g i c a l ( 1 0 - 5 M ) d o s e o f e p i n e p h r i n e c a u s e d a s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n in h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 1 4 a ) W h e n t h e s a m e e x p e r i m e n t a l c o n c e n t r a t i o n s of e p i n e p h r i n e w e r e a p p l i e d to c e l l s b e f o r e a 1 5 ° C h e a t s h o c k ( f rom 1 5 ° C to 3 0 ° C ) , all c e l l s , i n c l u d i n g t h e c o n t r o l c e l l s n o t e x p o s e d to e p i n e p h r i n e , h a d t h e s a m e e l e v a t i o n in h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 6 . 1 4 b ) . W h e n p r i m a r y h e p a t o c y t e c e l l s w e r e e x p o s e d to t h e p - b l o c k e r p r o p r a n o l o l t o g e t h e r w i t h a p h a r m a c o l o g i c a l d o s e of e p i n e p h r i n e ( 1 0 - 5 M ) , t h e e l e v a t i o n o f h s p 7 0 p r e v i o u s l y o b s e r v e d did not o c c u r ( F i g u r e 6 .15) . D i s c u s s i o n A l t h o u g h m u c h is k n o w n a b o u t t h e r o l e o f h e a t s h o c k p r o t e i n s in r e g u l a t i n g t h e f u n c t i o n , f o l d i n g a n d t r a f f i c k i n g o f g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s (Pratt , 1993) , little s t u d y h a s b e e n m a d e of t h e e f f e c t s o f c i r c u l a t i n g l e v e l s of c o r t i c o s t e r o i d s o n h e a t s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s . T h e p r e s e n t r e s u l t s s h o w that t h e p l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e concentrations o f cutthroat t rout e x p o s e d to a 45 -s h a n d l i n g s t r e s s w e r e e l e v a t e d to l e v e l s s i m i l a r to p r e v i o u s l y r e p o r t e d v a l u e s 115 in s a l m o n i d s m e a s u r e d af ter h a n d l i n g o r c o n f i n e m e n t s t r e s s ( B a r t o n et a l . 1 9 8 0 ; B a r t o n et a l . 1 9 8 5 ; B a r t o n et a l . , 1 9 8 6 ; B a r t o n a n d I w a m a , 1991) . T h e d a t a f r o m t h e p r e s e n t s t u d i e s s u g g e s t that t h e s t r e s s e x p e r i e n c e d b y t h e s e f i s h w a s a n o r m a l h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e to p h y s i c a l h a n d l i n g . T h e f i s h w e r e a n d m e a s u r e d 0 .5 , 1, 2, 3, a n d 4 8 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e i r h o l d i n g t a n k s , w e r e n o r m a l l y e l e v a t e d a n d t y p i c a l o f f i s h a d a p t i n g to a n a c u t e h a n d l i n g s t r e s s . T h e u n a f f e c t e d p l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e l e v e l s m e a s u r e d in t h e s e f i s h d e m o n s t r a t e d that t h e f i s h w e r e a b l e to a d j u s t to t h e h a n d l i n g s t r e s s a n d d i d not s u f f e r f r o m i o n o r e g u l a t o r y i m p a i r m e n t . T h e n o r m a l gi l l , l iver a n d a n t e r i o r k i d n e y h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s in t h e s e f i s h , 1 h after t h e h a n d l i n g s t r e s s , s h o w e d that a s t a n d a r d 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s d i d not i n d u c e t h e s y n t h e s i s of h s p 7 0 in a n y of t h e s e t i s s u e s . T h e h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s w e r e u n a f f e c t e d in t h e gill t i s s u e s of t h e s e f i s h f o r 4 8 h after t h e h a n d l i n g s t r e s s a n d t h e s e c o n s i s t e n t l e v e l s s u g g e s t that t h e l a c k of a m e a s u r e d r e s p o n s e to e l e v a t e d p l a s m a C o r t i s o l is u n l i k e l y d u e to i n a p p r o p r i a t e s a m p l i n g s c h e d u l e . T h e s e f i n d i n g s a r e i n t e r e s t i n g , a s a h s p 7 0 e l e v a t i o n h a s c l e a r l y b e e n d e m o n s t r a t e d in s o m e t i s s u e s in rats e x p o s e d to a restraint s t r e s s ( B l a k e et a l . 1991) . T h e l o w e r h s p 7 0 a n d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s in t h e gill t i s s u e s o f c u t t h r o a t trout e x p o s e d to a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s i m m e d i a t e l y b e f o r e a 2 - h h e a t s h o c k , c o m p a r e d with f i s h not e x p o s e d to a h a n d l i n g s t r e s s p r i o r to h e a t s h o c k , h a s not p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d . P l a s m a Cor t i so l , g l u c o s e a n d i o n l e v e l s m e a s u r e d in t h e s e f i s h i n d i c a t e that t h e f i s h w e r e e x p e r i e n c i n g a t y p i c a l h o r m o n a l s t r e s s r e s p o n s e to t h e h a n d l i n g s t r e s s ( s e e B a r t o n a n d I w a m a , 1 9 9 1 ) . P l a s m a Cortisol a n d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s in f i s h w i t h s l o w r e l e a s i n g C o r t i s o l i m p l a n t s w e r e a s e x p e c t e d wi th h i g h c i r c u l a t i n g p l a s m a Cortisol c o n c e n t r a t i o n s in t h e Cortisol i m p l a n t e d f i s h . T h e d a t a o b t a i n e d f r o m Cor t i so l i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d f i s h s u g g e s t that h i g h c i r c u l a t i n g p l a s m a C o r t i s o l 116 l e v e l s d o n o t af fec t t h e s y n t h e s i s o f h s p 7 0 but m a y s u p p r e s s t h e s y n t h e s i s o f h s p 3 0 in t h e gill t i s s u e s of l ive f i s h e x p o s e d to h e a t s h o c k . A d i r e c t l ink b e t w e e n s t e r o i d h o r m o n e s a n d h e a t s h o c k p r o t e i n s h a s b e e n k n o w n f o r s o m e t i m e . It is w e l l d o c u m e n t e d that a n a s s o c i a t i o n e x i s t s b e t w e e n h s p s a n d t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s (Pratt , 1993) . T h e s t e r o i d r e c e p t o r s a r e d i r e c t s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m s in w h i c h t h e r e c e p t o r r e q u i r e s h e a t s h o c k p r o t e i n s to f o r m a s t e r o i d - c o m p a t i b l e h e t e r o c o m p l e x o f s t e r o i d r e c e p t o r a n d f o u r o r m o r e k n o w n h e a t s h o c k p r o t e i n s . T h i s c o m p l e x b i n d s s t e r o i d h o r m o n e s , t r a n s l o c a t e s to t h e n u c l e u s , b i n d s to e n h a n c e r s e q u e n c e s in t h e g e n o m e a n d a l t e r s t h e t r a n s c r i p t i o n r a t e s of s p e c i f i c g e n e s ( Y a m a m o t o , 1 9 8 5 ) . S e p a r a t e d o m a i n s o f t h e r e c e p t o r s a r e r e s p o n s i b l e f o r s i g n a l r e c e p t i o n a n d s u b s e q u e n t D N A b i n d i n g . D e l e t i o n of t h e h o r m o n e b i n d i n g d o m a i n ( H B D ) in t h e C O O H t e r m i n u s y i e l d s r e c e p t o r s that a r e c o n s t i t u t i v e a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n ( E v a n s , 1 9 8 8 ) . It is k n o w n that s t e r o i d b i n d i n g i n d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w i t h i n t h e r e c e p t o r p r o t e i n a n d that this a l t e r a t i o n r e n d e r s a f r a g m e n t of t h e h u m a n m i n e r a l o c o r t i c o i d r e c e p t o r (MR) r e s i s t a n t to p r o t e o l y s i s ( T r a p p a n d H o l s b o e r , 1 9 9 5 ) . A l t h o u g h h s p 7 0 is k n o w n to b e r e q u i r e d f o r t h e a s s e m b l y o f t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r into a h e t e r o c o m p l e x wi th h s p 9 0 ( H u t c h i s o n et a l . , (1994) , little i n f o r m a t i o n a b o u t t h e e f f e c t s of g l u c o c o r t i c o i d s o n h e a t s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s is a v a i l a b l e . T w o s t u d i e s , H o l b r o o k a n d U d e l s m a n ( 1 9 9 4 ) a n d B r u n t e t a l . ( 1 9 9 0 ) s h o w h e a t s h o c k p r o t e i n e x p r e s s i o n in r e s p o n s e to p h y s i o l o g i c a l s t r e s s a n d s t e r o i d h o r m o n e s , r e s p e c t i v e l y . A l t h o u g h t h e s e two s t u d i e s s h o w e d a n i n d u c t i o n of h s p s in r e s p o n s e to s t r e s s o r s o r e x p o s u r e to s t e r o i d h o r m o n e s , t h e y w e r e p e r f o r m e d o n rats a n d a f u n g u s r e s p e c t i v e l y a n d m a y n o t a c c o r d i n g l y b e r e l e v a n t to t h e p r e s e n t f i n d i n g s . 117 A c k n o w l e d g m e n t T h e c o l l a b o r a t i o n of S t r e s s g e n B i o t e c h n o l o g y C o r p . a n d D r . P . C a n d i d o in p r o v i d i n g t h e m o n o c l o n a l a n d p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s u s e d f o r th is w o r k is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h e l a b o r a t o r y a s s i s t a n c e of R . F o r s y t h , G . C h o , J . M o r g a n , S . B a b i c h a n d E . T e n g is s i n c e r e l y a p p r e c i a t e d . T h e l i b e r a l u s e of D r . B . F i n l a y ' s l a b o r a t o r y e q u i p m e n t t h r o u g h o u t this s t u d y w a s g r e a t l y a p p r e c i a t e d . 118 F i g u r e 6.1 P l a s m a Cort isol (A) a n d g l u c o s e (B) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s . A s t e r i s k s d e n o t e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e h a n d l e d (fi l led c i rc le ) a n d c o n t r o l ( o p e n c i r c l e ) f i s h s a m p l e d at t h e i n d i c a t e d t i m e s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e i r r e c o v e r y t a n k s , (p < 0 .05 , N=8, m e a n ± S E ) . 119 120 F i g u r e 6 .2 P l a s m a s o d i u m (A) , p o t a s s i u m (B) a n d c h l o r i d e (c) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s . N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d b e t w e e n t h e h a n d l e d f i s h (fi l led c i rc le ) a n d t h e c o n t r o l f i s h ( o p e n c i rc le ) , at a n y of t h e s a m p l i n g t i m e s af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e i r r e c o v e r y t a n k s , (p < 0 . 0 5 , N = 8 , m e a n ± S E ) . 121 Time after handling (h) 122 F i g u r e 6 .3 T i s s u e h s p 7 0 l e v e l s 1 h f o l l o w i n g a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s . D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a of W e s t e r n blots of c u t t h r o a t trout gi l l , l iver a n d a n t e r i o r k i d n e y s a m p l e s p r o b e d with anti - t rout h s p 7 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . S a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to their r e s p e c t i v e r e c o v e r y t a n k s . B a r s s h a r i n g a letter a r e not s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p< 0 .05 , N=4, m e a n ± S E ) . 123 i t control 45s handling CO • mmm C 3 (0 (0 to c 0) c • M i C3 o Q_ to - > o c 73 • • • I 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 JL X a 124 F i g u r e 6 .4 T i m e c o u r s e of gill h s p 7 0 e l e v a t i o n f o l l o w i n g a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s . D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a o f W e s t e r n b l o t s o f c u t t h r o a t t rout gil l p r o b e d w i t h anti - t rout h s p 7 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . S a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1, 3, a n d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to their r e s p e c t i v e r e c o v e r y t a n k s . B a r s w i t h i n a s a m p l i n g p e r i o d s h a r i n g a letter a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p< 0 . 0 5 , N=4, m e a n ± S E ) . 125 (lojjuoo jo %) uouBJ^ueouoo QZdsH 126 F i g u r e 6 .5 P l a s m a Cort isol ( A a n d B) a n d g l u c o s e ( C a n d D ) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k ( s o l i d b a r s ) , a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s ( h o r i z o n t a l l i n e s ) o r b o t h h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k (ver t ical l i n e s ) . C o n t r o l s a r e b l a n k b a r s . D a t a s h o w n in g r a p h s A a n d C a r e f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . G r a p h s B a n d D s h o w d a t a f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . B a r s not s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=8 , m e a n ± S E ) . 127 (ira/§u) lospjoo (lP/§ui) 3sooni§ 128 F i g u r e 6 .6 P l a s m a s o d i u m ( A a n d B) , p o t a s s i u m ( C a n d D ) a n d c h l o r i d e ( E a n d F ) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k ( s o l i d b a r s ) , a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s ( h o r i z o n t a l l i n e s ) o r b o t h h a n d l i n g a n d h e a t s h o c k (ver t ical l i n e s ) . C o n t r o l s a r e b l a n k b a r s . D a t a s h o w n in g r a p h s A , C a n d E a r e f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . G r a p h s B , D a n d F s h o w d a t a f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=8, m e a n ± 1 S E ) . 129 cd cd cd H cd cd - a o •a cd o o 00 - l - i cd •a cd 1 cd ^3 cd , 0 cd cd ^  H o o cd O <D » r cd H cd cd o o o o o o i n o <n ^ I I I I I O O O V O ' t M O o o o o o <N '—1 ' — i cd \ cd H cd cd H cd cd cd cd cd H cd H cd cd o o o o o o in o <o c<) i - H i - < o o o v o - ^ r < i o o o o o o cd i n c G 43 O c S3 (=1 cd 43 1/3 i n 6X) a cd 43 o oo o o 4=1 wo ctf <D CD umipos inmssejod QpUOJip (TAJTJLI) uopejjusouco UOI BUISBIJ 130 F i g u r e 6 .7 E x a m p l e o f W e s t e r n b l o t s of gill t i s s u e p r o t e i n s p r o b e d with s a l m o n i d - s p e c i f i c a n t i - h s p 7 0 a n d a n t i - h s p 3 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e f o u r c o n t r o l s a m p l e s w e r e s h a m i n j e c t e d wi th t h e Cor t i so l c a r r i e r a n d t h e h e a t s h o c k e d s a m p l e s w e r e i n j e c t e d with t h e s a m e c a r r i e r t h e n e x p o s e d to a 2 h -1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k a n d s a m p l e d af ter 1 h of r e c o v e r y f r o m t h e h e a t s h o c k . 131 MW (kDa) Controls Heat shocked 70 > 132 F i g u r e 6 .8 G i l l h s p 7 0 l e v e l s i n h a n d l e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout. D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a of W e s t e r n b l o t s of gill t i s s u e s a m p l e s p r o b e d wi th anti - t rout h s p 7 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1 h af ter t h e s h a m i m p l a n t e d t h e n h e a t s h o c k e d (sol id) o r t h e h a n d l e d t h e n h e a t s h o c k e d ( c r o s s h a t c h e d ) f i s h w e r e r e t u r n e d to their r e c o v e r y t a n k s . B a r s not s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p < 0 .05 , N=4, m e a n ± S E ) . 133 134 F i g u r e 6 .9 G i l l h s p 3 0 l e v e l s in h a n d l e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout. D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a of W e s t e r n blots of gill t i s s u e s a m p l e s p r o b e d with anti - t rout h s p 3 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1 h af ter t h e s h a m i m p l a n t e d t h e n h e a t s h o c k e d (sol id) o r t h e h a n d l e d t h e n h e a t s h o c k e d ( c r o s s h a t c h e d ) f i s h w e r e r e t u r n e d to their r e c o v e r y t a n k s . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y di f ferent (p < 0 .05 , N=4, m e a n ± S E ) . 135 heat shock Ui • ••• c ro .Q ro 10 c 0) n o C O QL (0 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 handling and heat shock 136 F i g u r e 6 . 1 0 P l a s m a Cortisol ( A a n d B) a n d g l u c o s e ( C a n d D ) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k ( s o l i d bars), Cortisol i m p l a n t s , ( h o r i z o n t a l l i n e s ) o r both Cortisol i m p l a n t s a n d h e a t s h o c k (ver t ical l i n e s ) . C o n t r o l s a r e blank bars. D a t a s h o w n in g r a p h s A a n d C a r e from p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 1 h after t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . G r a p h s B a n d D s h o w d a t a f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 4 8 h after t h e f i s h were r e t u r n e d to the r e c o v e r y t a n k s . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p < 0 .05 , N=8 , m e a n ± S E ) . 137 c/3 PH on •a cd a * t>0 ^ o 0 1 o o O O <L> O 43 i — r T T T © o © o o o © © © © © iri © in © ir> H H H © © © © © © © © © TT rq I H i — i — i — i — r © © © © © © © © © © © V> © V) © *n N N H H (|UI/§U) [OSIJJOD o •PH O C A • PN I N o © •PN c j 43 C A a o o C A • PN -N o cj a JO cj cu C A 0 0 T f CJ O P C 5/5 P-l T © © © © © © © © © rf m rq I H ([p/§Ul) 9S0DI1|§ UOI;BJ;U3DUOD B U I S B U 138 F i g u r e 6.11 P l a s m a s o d i u m ( A a n d B) , p o t a s s i u m ( C a n d D ) a n d c h l o r i d e ( E a n d F ) c o n c e n t r a t i o n s in r a i n b o w trout e x p o s e d to a 1 0 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k ( s o l i d b a r s ) , Cortisol i m p l a n t s , ( h o r i z o n t a l l ines ) or b o t h Cortisol i m p l a n t s a n d h e a t s h o c k (ver t ica l l i n e s ) . C o n t r o l s a r e b l a n k b a r s . D a t a s h o w n in g r a p h s A , C a n d E a r e from p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 1 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . G r a p h s B, D a n d F s h o w d a t a f r o m p l a s m a s a m p l e s c o l l e c t e d 4 8 h af ter t h e f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e r e c o v e r y t a n k s . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=8 , m e a n ± S E ) . 139 Vi cs a +4 rt c a % 3* 'o .89 .S3 • r t » . f . O o in I — o © ^ S 43 0 1 C S 4 3 hi a I I I I O O O O O IT) O V ) N H rt a I I I I I I O 00 VO T t fN o es hi 03 C8 J, I I I I 08 I I I I I O O O O O o M ^ O T f N O N H H ^ 00 a I I I I O O O O O o «o o >o CN r - H 03 cs I I I I O O O O O O V ) O V ) f N rt i H rampos ramssBjod apuojip (jATUl) U0pBJ}U33U0D UOI BUISBIJ o 1/3 rt CD In OJ 140 F i g u r e 6 . 1 2 G i l l h s p 7 0 l e v e l s in Cor t i so l i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout. D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a o f W e s t e r n b l o t s o f gil l t i s s u e s a m p l e s p r o b e d wi th anti - t rout h s p 7 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1 h af ter t h e s h a m i m p l a n t e d t h e n h e a t s h o c k e d (sol id) o r t h e Cor t i so l i m p l a n t e d t h e n h e a t s h o c k e d ( c r o s s h a t c h e d ) f i s h w e r e r e t u r n e d t o t h e i r r e c o v e r y t a n k s . B a r s not s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=4 , m e a n ± S E ) . 141 142 F i g u r e 6 . 1 3 G i l l h s p 3 0 l e v e l s in Cort isol i m p l a n t e d a n d h e a t s h o c k e d r a i n b o w trout. D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a o f W e s t e r n b l o t s o f gil l t i s s u e s a m p l e s p r o b e d wi th anti - t rout h s p 3 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . T h e s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d 1 h after t h e s h a m implanted t h e n h e a t s h o c k e d (sol id) o r t h e Cortisol i m p l a n t e d t h e n h e a t s h o c k e d ( c r o s s h a t c h e d ) f i s h w e r e r e t u r n e d to t h e i r r e c o v e r y t a n k s . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p < 0 .05 , N=4 , m e a n ± S E ) . 143 144 F i g u r e 6 . 1 4 H s p 7 0 l e v e l s in r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s e x p o s e d to p h y s i o l o g i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s of e p i n e p h r i n e in vitro. D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a o f W e s t e r n b l o t s of r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s p r o b e d wi th a n t i -trout h s p 7 0 rabbi t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . In (A) , t h e c e l l s w e r e m a i n t a i n e d at a m b i e n t 1 5 ° C . C o n t r o l c e l l s w e r e g r o w n in n o r m a l L - 1 5 m e d i u m ( b l a n k ) , a s e p a r a t e t r e a t m e n t g r o u p of c e l l s w e r e e x p o s e d to a p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n (10" 7 M ) o f e p i n e p h r i n e ( h a t c h e d ) a n d a thi rd g r o u p w a s e x p o s e d to a p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n (10" 5 M ) o f e p i n e p h r i n e ( so l id ) . In (B) , T h e c e l l s w e r e e x p o s e d to t h e s a m e e p i n e p h r i n e c o n c e n t r a t i o n s a s in (A) , but w e r e e x p o s e d to a 1 5 ° C s t e p c h a n g e h e a t s h o c k b e f o r e t h e e p i n e p h r i n e w a s a d d e d to t h e m e d i u m . B a r s n o t s h a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p < 0 .05 , N=3 , m e a n ± S E ) . 146 F i g u r e 6 . 1 5 H s p 7 0 l e v e l s in r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s e x p o s e d to a p h a r m a c o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n of e p i n e p h r i n e a n d p r o p r a n o l o l . D e n s i t o m e t r y a n a l y s i s d a t a of W e s t e r n b l o t s of r a i n b o w trout h e p a t o c y t e s p r o b e d w i t h a n t i -trout h s p 7 0 r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s . C o n t r o l c e l l s w e r e g r o w n in n o r m a l L -1 5 m e d i u m ( b l a n k ) , a g r o u p of c e l l s w e r e e x p o s e d to 10" 5 M p r o p r a n o l o l ( C r o s s h a t c h ) a n d t h e third g r o u p w a s e x p o s e d to a p h a r m a c o l o g i c a l (10~ 5 M ) c o n c e n t r a t i o n of e p i n e p h r i n e a n d 10" 5 M p r o p r a n o l o l ( sol id) . B a r s n o t s n a r i n g a letter a r e s i g n i f i c a n t l y d i f ferent (p < 0 .05 , N=3 , m e a n ± S E ) . (sjnm ^jBJ^iqjB) A*}isiia}in pireq 0Z,dsH 148 C h a p t e r 7 G e n e r a l d i s c u s s i o n a n d C o n c l u s i o n s Most of our knowledge concern ing the homeostat ic role of heat shock proteins has come from studies using cultured cel ls . A l though much less is known about their express ion in situ, heat shock proteins are induced acutely in intact animals in response to local ized t issue injury, as wel l as systemical ly fol lowing heat stress (Vas et al . 1988; Gower et al . 1989; B lake et a l . 1990; Morimoto et al . 1990). T h e sa lmonid stress hormone response observed in f ish exposed to var ious environmental stressors (see W e d e m e y e r et a l . , 1990; Barton and Iwama, 1991; Iwama et al . , 1996) and the heat shock protein response, studied extensively in gene regulation experiments (see W e l c h , 1993; Georgopou los and W e l c h , 1993; Morimoto et a l . , 1994) have both been wel l documented. F e w investigators (Ude lsman et a l . , 1993; Holbrook and Ude lsman , 1994; Pratt, 1993), however, have examined the interaction between the two r e s p o n s e s and none of these studies had been performed on fish. T h e exper iments descr ibed in this thesis investigated the heat shock protein response, within the context of the physio logical stress response, in intact sa lmonids and f ish cel l l ines. The experiments focused on two major stress hormones (epinephrine and Cortisol) and the effect they have on hsp70 and hsp30 concentrat ions measured in f ish cel l l ines and the t issues of whole salmonids. T h e genera l experimental approach w a s to induce one or both responses , by expos ing the organisms to known stressors which induce the responses i.e. handl ing stress for the hormonal response and heat shock for the hsp response , and then measure both responses in the st ressed organisms. 149 My results clearly show that the hsp response c a n be detected in sa lmonid t issues, both in situ and in vitro. T h e s e results are consistent with the results of G e d a m u et a l . (1983), Kothary and Cand ido (1982) and Dyer et a l . (1991) who showed that f ish cel ls and t issues isolated from whole organisms have a detectable heat shock protein response when e x p o s e d to heat s h o c k or other environmental toxicants. T h e hsp response is thought to be induced by the denaturation of endogenous proteins, wh ich re lease hsfs that are normally bound to hsp70. Th is triggers a c a s c a d e of events that c a u s e s the synthesis of addit ional hsp70, which can bind and inactivate free hsf thus completing the feedback loop and terminating the synthesis of more hsp70 (Morimoto et a l . , 1994). Resu l ts from the present show that, depending on the severity of the treatment, e levated hsp70 levels can be detected for up to three w e e k s after the f ish are returned to ambient temperature in the gill t i ssues of f ish e x p o s e d to a brief heat shock treatment. The temperatures necessary to induce a hsp response in var ious f ish t issues had previously been reported (Dyer et a l . , 1991; Dietz and Somero, 1993) and the results shown here demonstrate, for the first time, the long duration of the response. A function of protein turnover under normal c i rcumstances is to el iminate abnormal and potentially 'toxic' polypeptides that result from n o n s e n s e or m issense mutations, errors in gene express ion or post -synthet ic damage (see Hawkins, 1991). In both animal and bacterial cel ls , s u c h proteins are select ively hydro lyzed in a form of 'cel lular sanitation system', wh ich mainly involves ubiquit in-dependent pathways (Goldberg et a l . , 1987; Goff, Voe l lmy and Goldberg , 1988). The duration of e levated hsp70 reported here suggests that hsp70 present in the gill t issues of salmonids is not perce ived as 'toxic' by these t issues. T h e observat ion that the heat shock treatment which resulted in the 150 l o n g e s t l a s t i n g h s p 7 0 e l e v a t i o n w a s t h e t r e a t m e n t that b r o u g h t t h e f i s h c l o s e s t to their n o r m a l m a x i m a l e n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e is c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c e p t that p r o t e i n d e n a t u r a t i o n a n d l o s s i n c r e a s e s wi th i n c r e a s e d t e m p e r a t u r e ( s e e S o m e r o , 1 9 9 5 ) . T h e d u r a t i o n o f t h e r e s p o n s e is c o n s i s t e n t w i t h t h e p r o t e i n t u r n o v e r t i m e s r e p o r t e d f o r s a l m o n i d s r e a r e d at t e m p e r a t e t e m p e r a t u r e ( H o u l i h a n e t a l . , 1995) . T h e results s h o w n h e r e a r e t h e first to demonstrate t h e e f f e c t o f Cortisol o n h s p c o n c e n t r a t i o n in t h e t i s s u e s of intact s a l m o n i d s . M y results s h o w that e l e v a t e d p l a s m a Cortisol c o n c e n t r a t i o n , c a u s e d b y p h y s i c a l h a n d l i n g , d o n o t af fec t h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n in t h e gill , a n t e r i o r k i d n e y o r l iver o f c u t t h r o a t trout. T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t with rat e x p e r i m e n t s w h i c h s h o w that res t ra int s t r e s s d o e s n o t i n d u c e h s p 7 0 g e n e e x p r e s s i o n in 12 o f 14 t i s s u e s t e s t e d ( U d e l s m a n et a l . 1993) . T h e i n n e r c o r t i c a l a d r e n a l t i s s u e a n d t h o r a c i c a o r t a t i s s u e s f r o m t h o s e rat trials w e r e t h e o n l y t i s s u e s to s h o w a n h s p 7 0 g e n e e x p r e s s i o n f o l l o w e d b y e l e v a t e d h s p 7 0 p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , w i t h m a x i m u m e x p r e s s i o n o c c u r r i n g 3 a n d 6 h after restraint . T h e p r e s e n t r e s u l t s s h o w e d n o h s p 7 0 i n d u c t i o n in e i t h e r t h e l iver o r a n t e r i o r k i d n e y t i s s u e 1 h af ter h a n d l i n g , o r in t h e gill t i s s u e s s a m p l e d 1, 3 or 4 8 h af ter t h e h a n d l i n g s t r e s s . T h e s t e r o i d r e s p o n s e is k n o w n to affec t e n e r g y m e t a b o l i s m in s t r e s s e d o r g a n i s m s a n d to c a u s e c i r c u l a t i n g g l u c o s e l e v e l s to i n c r e a s e . C e l l s a r e k n o w n to p o s s e s s e x t r e m e l y h i g h i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s in all c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s ( 1 0 0 - 1 5 0 m g / m L ) a n d f i s h a r e k n o w n to ut i l ize p r o t e i n s a s a n e n e r g y s o u r c e f o r t h e p r o d u c t i o n of g l u c o s e v i a t h e g l u c o n e o g e n i c p a t h w a y ( s e e G a m p e r l et a l , 1 9 9 4 ) . T h e a t t e n u a t i o n o f s o m e p r o t e i n s y n t h e s i s in t h e f a c e of i n c r e a s e d c i r c u l a t i n g s t e r o i d m a y t h e r e f o r e h a v e b e e n c a u s e d b y t h e a l l o c a t i o n o f r e s o u r c e s to e n e r g y m o b i l i z a t i o n r a t h e r t h a n n o r m a l p r o t e i n s y n t h e s i s . 151 T h e Cortisol a n d g l u c o s e m e a s u r e m e n t s t a k e n af ter t h e c u t t h r o a t trout w e r e e x p o s e d to a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s i n d i c a t e that t h e s e f i s h e x p e r i e n c e d a n o r m a l p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d in s i m i l a r l y h a n d l e d f i s h ( B a r t o n et a l . 1 9 8 0 ; B a r t o n et a l . 1 9 8 5 ; B a r t o n et a l . , 1 9 8 6 ; B a r t o n a n d I w a m a , 1991) . T h e m e a s u r e d p l a s m a s o d i u m , p o t a s s i u m a n d c h l o r i d e i o n s w e r e n o t a f f e c t e d b y a n y of t h e t r e a t m e n t g r o u p s a n d s h o w e d that t h e f i s h w e r e n o t s u f f e r i n g f r o m i o n o r e g u l a t o r y i m p a i r m e n t . T h e l o w e r h s p 7 0 a n d h s p 3 0 c o n c e n t r a t i o n s in t h e gill t i s s u e s o f c u t t h r o a t trout e x p o s e d to a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s i m m e d i a t e l y b e f o r e a 2 - h h e a t s h o c k , c o m p a r e d wi th f i s h that w e r e not e x p o s e d to a h a n d l i n g s t r e s s p r i o r to h e a t s h o c k , h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d . R e s u l t s f r o m t h e p r e s e n t s t u d y d e m o n s t r a t e that s a l m o n i d l iver a n d k i d n e y t i s s u e s d o n o t s h o w a n i n c r e a s e in h s p 7 0 in r e s p o n s e to h a n d l i n g s t r e s s . T h i s is s i m i l a r to r e s u l t s o b t a i n e d f r o m l iver a n d k i d n e y t i s s u e s o f r e s t r a i n e d ra ts ( U d e l s m a n et a l . , 1993) . T h e i n c r e a s e in t h o r a c i c a o r t a a n d a d r e n a l h s p 7 0 c o n c e n t r a t i o n s o b s e r v e d in t h e r e s t r a i n e d rat w e r e l i n k e d to a c t i v a t i o n of b o t h t h e h y p o t h a l a m i c - p i t u i t a r y - a d r e n a l a x i s a n d t h e s y m p a t h e t i c n e r v o u s s y s t e m . F i s h v a s c u l a r t i s s u e s m a y a l s o h a v e e l e v a t e d h s p 7 0 l e v e l s c a u s e d b y a d r e n e r g i c s t i m u l a t i o n but t h e s e t i s s u e s w e r e n o t s a m p l e d in t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t . A d i r e c t l ink b e t w e e n s t e r o i d h o r m o n e s a n d h e a t s h o c k p r o t e i n s h a s b e e n k n o w n f o r s o m e t i m e . A n a s s o c i a t i o n b e t w e e n h s p s a n d g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s is w e l l d o c u m e n t e d (Pratt, 1993) . T h e s t e r o i d r e c e p t o r s a r e d i r e c t s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m s in w h i c h t h e r e c e p t o r , w h i c h r e q u i r e s h e a t s h o c k p r o t e i n s to f o r m a s t e r o i d - c o m p a t i b l e h e t e r o c o m p l e x of s t e r o i d r e c e p t o r a n d f o u r o r m o r e k n o w n h e a t s h o c k p r o t e i n s , b i n d s s t e r o i d h o r m o n e s , t r a n s l o c a t e s to t h e n u c l e u s , b i n d s to e n h a n c e r s e q u e n c e s in t h e g e n o m e a n d a l t e r s t h e t r a n s c r i p t i o n r a t e s of 152 s p e c i f i c g e n e s ( Y a m a m o t o , 1985) . S e p a r a t e d o m a i n s of t h e r e c e p t o r s a r e r e s p o n s i b l e f o r s i g n a l r e c e p t i o n a n d s u b s e q u e n t D N A b i n d i n g . D e l e t i o n o f t h e h o r m o n e b i n d i n g d o m a i n ( H B D ) in t h e C O O H t e r m i n u s y i e l d s r e c e p t o r s that a r e c o n s t i t u t i v e a c t i v a t o r s of t r a n s c r i p t i o n ( E v a n s , 1988) . It is k n o w n that s t e r o i d b i n d i n g i n d u c e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e w i t h i n t h e r e c e p t o r p r o t e i n a n d that this a l t e r a t i o n r e n d e r s a f r a g m e n t of t h e h u m a n m i n e r a l o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( M R ) r e s i s t a n t to p r o t e o l y s i s ( T r a p p a n d H o l s b o e r , 1995) . A l t h o u g h h s p 7 0 is k n o w n to b e r e q u i r e d f o r t h e a s s e m b l y of t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r into a h e t e r o c o m p l e x wi th h s p 9 0 ( H u t c h i s o n et a l . , 1994) , little i n f o r m a t i o n a b o u t t h e e f f e c t s o f g l u c o c o r t i c o i d s o n t h e h e a t s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s is a v a i l a b l e . T w o s t u d i e s , H o l b r o o k a n d U d e l s m a n ( 1 9 9 4 ) a n d B r u n t et a l . ( 1 9 9 0 ) s h o w h e a t s h o c k p r o t e i n e x p r e s s i o n in r e s p o n s e to p h y s i o l o g i c a l s t r e s s a n d s t e r o i d h o r m o n e s , r e s p e c t i v e l y . T h e p r e s e n t r e s u l t s s h o w that c u l t u r e d h e p a t o c y t e s r e s p o n d to e p i n e p h r i n e in a p - r e c e p t o r d e p e n d e n t m a n n e r s u g g e s t that t h e h y p o t h a l a m i c -p i t u i t a r y - i n t e r r e n a l a x i s m e d i a t e s t h e h s p 7 0 r e s p o n s e in s o m e f i s h t i s s u e s a s it d o e s in s o m e rat t i s s u e s , with t h e d i s t i n c t i o n that t h e f i s h t i s s u e m a y b e p -r e c e p t o r m e d i a t e d a s o p p o s e d to t h e a i - r e c e p t o r m e d i a t i o n r e p o r t e d f o r rat a o r t a t i s s u e ( H o l b r o o k a n d U d e l s m a n , 1994) . T h e first two s e t s of e x p e r i m e n t s , d i s c u s s e d in c h a p t e r s 3 a n d 4, s h o w e d that h s p 7 0 a n d h s p 3 0 w e r e t h e h s p s m o s t c o m m o n l y s y n t h e s i z e d in c e l l l i n e s e x p o s e d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . T h e s e r e s u l t s s h o w that, a s h a d p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d in t h e h s p l i terature o n n o n - f i s h s p e c i e s , h s p 7 0 is t h e m o s t c o m m o n l y r e p r e s e n t e d h s p f a m i l y s y n t h e s i z e d w h e n c e l l s o r w h o l e o r g a n i s m s a r e e x p o s e d to v a r i o u s a d v e r s e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e p r e s e n t r e s u l t s t h e r e f o r e c o n f i r m that s a l m o n i d s a n d s a l m o n i d c e l l l i n e s g e n e r a l l y r e s p o n d to e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s a s d o n o n - s a l m o n i d s p e c i e s . T h e s e f i n d i n g s a r e 153 c o n s i s t e n t wi th t h e c o n s e r v e d n a t u r e of h s p 7 0 g e n e s a n d t h e w i d e d i v e r s i t y of o r g a n i s m s p r e v i o u s l y s h o w n to s y n t h e s i z e th is f a m i l y o f p r o t e i n s i n r e s p o n s e to h e a t s h o c k a n d o t h e r i n d u c e r s of t h e h s p r e s p o n s e . T h e f i n d i n g that t h e n o r m a l h s p 7 0 a n d h s p 3 0 e l e v a t i o n s e e n in t h e gill t i s s u e s of h e a t s h o c k e d f i s h is a t t e n u a t e d b y a 4 5 - s h a n d l i n g s t r e s s p r i o r to t h e h e a t s h o c k d e m o n s t r a t e s that t h e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e h a s a n i n f l u e n c e o n t h e h s p r e s p o n s e of s a l m o n i d t i s s u e s . T h e o b s e r v a t i o n that t h e n o r m a l h s p 3 0 r e s p o n s e is a t t e n u a t e d b y art if icial ly e l e v a t e d c i r c u l a t i n g Cortisol l e v e l s ( b y i n t r a p e r i t o n e a l Cortisol i m p l a n t s ) w h i l e t h e h s p 7 0 r e s p o n s e f o l l o w i n g h e a t s h o c k is u n a f f e c t e d b y t h e s a m e t r e a t m e n t s u g g e s t s that t h e s e t w o h s p s a r e r e g u l a t e d b y di f ferent m e c h a n i s m s . F u r t h e r s t u d i e s o n t h e i n d u c t i o n of t h e r e s p o n s e in v a r i o u s f i s h t i s s u e s e x p o s e d to b o t h e l e v a t e d Cortisol a n d a d r e n a l i n e in vitro m a y h e l p to e l u c i d a t e s o m e o f t h e s e m e c h a n i s m s . F u r t h e r w o r k o n t h e e x p r e s s i o n o f h s p s in situ with m o r e t i s s u e s e x a m i n e d , a n d with t h e b l o o d c o m p o n e n t of t h e t i s s u e s s e p a r a t e d f r o m t h e s t ruc tura l c e l l s p r i o r to t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n will s u r e l y a l s o l e a d to i n t e r e s t i n g n e w i n s i g h t s o n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e h o r m o n a l a n d h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e in s a l m o n i d s . General conclusion T h e g e n e r a l c o n c l u s i o n s w h i c h c a n b e d r a w n f r o m the e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d h e r e a r e that h s p 7 0 a n d h s p 3 0 m a y b e u s e d a s r e l i a b l e i n d i c a t o r s o f e n v i r o n m e n t a l s t r e s s . P h y s i c a l h a n d l i n g , w h i c h r e s u l t s in e l e v a t e d p l a s m a c o r t i c o s t e r o i d l e v e l s , d o e s not i n c r e a s e h s p 7 0 o r h s p 3 0 l e v e l s in f i s h t i s s u e s and was f o u n d to suppress t h e i n d u c t i o n o f h s p 7 0 in t h e gill t i s s u e s of h e a t s h o c k e d c u t t h r o a t trout. 154 A r t i f i c i a l l y e l e v a t e d Cortisol l e v e l s , f r o m intraperitoneal i m p l a n t s , d i d not af fec t t h e n o r m a l e l e v a t i o n of h s p 7 0 o b s e r v e d in t h e gill t i s s u e s of h e a t s h o c k e d cut throat trout but it d i d s u p p r e s s t h e i n d u c t i o n o f h s p 3 0 in t h e s e s a m e gill t i s s u e s . T h e h a n d l i n g p r o c e d u r e s n e c e s s a r y f o r s a m p l i n g f i s h f r o m t h e e n v i r o n m e n t s h o u l d not, t h e r e f o r e , b y t h e m s e l v e s , r e s u l t in e l e v a t e d h e a t s h o c k p r o t e i n s in s a l m o n i d liver, g i l l , k i d n e y or s k e l e t a l m u s c l e t i s s u e s . F u r t h e r s t u d i e s o n t h e i n t e r a c t i o n of t h e h o r m o n a l a n d h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e s o f s a l m o n i d t i s s u e s a n d c e l l s l i n e s , a n d t h e c e l l s p e c i f i c h s p r e s p o n s e s o f s a l m o n i d t i s s u e s n e e d to b e p e r f o r m e d . T h e u s e of s a l m o n i d - s p e c i f i c a n t i - h s p a n t i b o d i e s in i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y will s u r e l y y i e l d n e w i n s i g h t s into t h e s e i n t e r a c t i o n s . 155 Literature Cited A b r a v a y a , K . , M y e r s , M . P . , M u r p h y , S . P . a n d R.I . M o r i m o t o . 1 9 9 2 . T h e h u m a n h e a t s h o c k p r o t e i n h s p 7 0 i n t e r a c t s with H S F , t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r that r e g u l a t e s h e a t s h o c k g e n e e x p r e s s i o n . G e n e s D e v e l o p . , 6 : 1 1 5 3 . A d a m s , S . M . (ed . ) 1 9 9 0 . B i o l o g i c a l i n d i c a t o r s o f s t r e s s i n f i s h . A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y S y m p o s i u m 8, A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y , B e t h e s d a , M a r y l a n d . 191 p p . A n a n t h a n , J . , G o l d b e r g , A . L . a n d R . V o e l l m y , 1 9 8 6 . A b n o r m a l p r o t e i n s s e r v e a s e u k a r y o t i c s t r e s s s i g n a l s a n d t r igger t h e a c t i v a t i o n o f h e a t s h o c k g e n e s . S c i e n c e , 2 3 2 : 5 2 2 - 5 2 4 . B a l m , P . H . M . , P . P e p e l s , S . H e l f r i c h , M . L . M . H o v e n s a n d S . E . W e n d e l a a r B o n g a . 1 9 9 4 . A d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e in r e l a t i o n to i n t e r r e n a l f u n c t i o n d u r i n g s t r e s s in t i l a p i a {Oreochromis mossambicus). G e n . C o m p . E n d o c r i n o l . 96 , 3 4 7 - 3 6 0 . B a r r y , T . P . , A . F . L a p p , T . B . K a y e s a n d J . A . M a l i s o n . 1 9 9 3 . V a l i d a t i o n o f a microtitre p l a t e E L I S A f o r measuring Cortisol in f i s h a n d comparison o f stress r e s p o n s e s o f r a i n b o w trout (Oncorhynchus mykiss) a n d l a k e trout {Salvelinus namaycush). A q u a c u l t u r e 117 , 3 5 1 - 3 6 3 . B a r t o n , B . A . a n d I w a m a , G . K . 1 9 9 1 . P h y s i o l o g i c a l c h a n g e s in f i s h f r o m s t r e s s in a q u a c u l t u r e wi th e m p h a s i s o n t h e r e s p o n s e a n d e f f e c t s of c o r t i c o s t e r o i d s . A n n . R e v . F i s h D i s . , 1: 3 -26 . B a r t o n , B . A . , P e t e r , R . E . , a n d C . R . P a u l e n c u . 1 9 8 0 . P l a s m a C o r t i s o l l e v e l s of f i n g e r l i n g r a i n b o w trout [Salmo gairdneri) at rest , a n d s u b j e c t e d to h a n d l i n g , c o n f i n e m e n t , t r a n s p o r t , a n d s t o c k i n g . C a n . J . F i s h . A q u a . S c i . , 3 7 : 8 0 5 - 8 1 1 . B a r t o n , B . A . , S c h r e c k , C . B . , a n d L A . S i g i m o n d i . 1 9 8 6 . M u l t i p l e a c u t e d i s t u r b a n c e s e v o k e c u m u l a t i v e p h y s i o l o g i c a l s t r e s s r e s p o n s e s in j u v e n i l e c h i n o o k s a l m o n . T r a n s . A m . F i s h . S o c , 1 1 5 : 2 4 5 - 2 5 1 . B a r t o n , B . A . , S c h r e c k , C . B . , E w i n g , R . D . H e m i n g s e n , R . D . a n d R . P a t i n o . 1 9 8 5 . C h a n g e s in p l a s m a Cor t i so l d u r i n g s t r e s s a n d s m o l t i f i c a t i o n in c o h o s a l m o n , Oncorhynchus kisutch. G e n . C o m p . E n d o c r i n o l . , 5 9 : 4 6 8 - 4 7 1 . B e c k m a n n , R . B . , M i z z e n , L . A . a n d W . J . W e l c h . 1 9 9 0 . I n t e r a c t i o n s o f h s p 7 0 w i t h n e w l y s y n t h e s i z e d p r o t e i n s : i m p l i c a t i o n s f o r p r o t e i n f o l d i n g a n d a s s e m b l y . S c i e n c e , 2 4 8 : 8 5 0 . 156 B e r g e r , H . M . a n d M . P . W o o d w a r d . 1 9 8 3 . S m a l l h e a t s h o c k p r o t e i n s in Drosophila m a y c o n f e r t h e r m a l t o l e r a n c e . E x p . C e l l R e s . 1 4 7 : 4 3 7 . B j e r r u m , O . J . a n d C . S c h a f e r - N i e l s e n . 1 9 8 6 . A n a l y t i c a l E l e c t r o p h o r e s i s , M . J . D u n n , e d . , p . 3 1 5 ; V e r l a g C h e m i e , W e i n h e i m . B l a k e , M . S . , J o h n s t o n , K . H . , R u s s e l l - J o n e s , G . J . , a n d E . C . G o t s c h l i c h . 1 9 9 1 . A r a p i d , s e n s i t i v e m e t h o d f o r d e t e c t i o n of a l k a l i n e p h o s p h a t a s e - c o n j u g a t e d a n t i -a n t i b o d y o n W e s t e r n b l o t s . A n a l . B i o c h e m . , 1 3 6 : 1 7 5 - 1 7 9 . B l a k e , M . J . , R . U d e l s m a n , G . J . F e u l n e r , D . D . N o r t o n , a n d N . J . H o l b r o o k . 1 9 9 1 . S t r e s s - i n d u c e d h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 e x p r e s s i o n in a d r e n a l c o r t e x : A n a d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e - s e n s i t i v e , a g e - d e p e n d e n t r e s p o n s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 8 8 : 9 8 7 3 - 9 8 7 7 . B l a k e , M . J . , G e r s h o n , D . , F a r g n o l i , J . a n d N . J . H o l b r o o k . 1 9 9 0 . D i s c o r d a n t e x p r e s s i o n of h e a t s h o c k p r o t e i n m R N A s in t i s s u e s of h e a t - s t r e s s e d rats . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 : 1 5 2 7 5 - 1 5 2 7 9 . B o s c h , T . C . , K r y l o w , S . M . , B o d e , H . R . a n d R . E . S t e e l e . 1 9 8 8 . T h e r m o t o l e r a n c e a n d s y n t h e s i s o f h e a t s h o c k p r o t e i n s : t h e s e r e s p o n s e s a r e p r e s e n t in Hydra attenuatabe a b s e n t in Hydra oligactis. P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 5 : 7 9 2 7 - 3 4 . B o u t i l i e r , R . G . , a n d R . A . F e r g u s o n . 1 9 8 9 . N u c l e a t e d r e d c e l l f u n c t i o n : m e t a b o l i s m a n d p H r e g u l a t i o n . C a n . J . Z o o l . 6 7 : 2 9 8 6 - 2 9 9 3 . Brett , J . R . 1 9 5 8 . I m p l i c a t i o n s of a s s e s s m e n t of e n v i r o n m e n t a l s t r e s s . In: L a r k i n , P . A . (ed . ) T h e i n v e s t i g a t i o n o f f i s h - p o w e r p r o b l e m s . H . R . M a c M i l l a n L e c t u r e s in F i s h e r i e s , U n i v e r s i t y of B r i t i s h C o l u m b i a , V a n c o u v e r , C a n a d a , p p 6 9 - 8 3 . B r u n t , S . A . , R i e h l , R . , a n d J . C . S i l v e r . 1 9 9 0 . S t e r o i d h o r m o n e r e g u l a t i o n o f t h e Achlya ambisexualis 8 5 - k D a h e a t s h o c k p r o t e i n , a c o m p o n e n t o f t h e Achlya s t e r o i d r e c e p t o r c o m p l e x . M o l . C e l l . B i o l . , 1 0 : 2 7 3 - 2 8 1 . B u c h n e r , J . , S c h m i d t , M . , F u c h s , M . , J a e n i c k e , R . , R u d o l p h e , R . , S c h m i d , F . X . a n d T . K i e f h a b e r . 1 9 9 1 . G r o E f a c i l i t a t e s r e f o l d i n g of c i t ra te s y n t h a s e b y s u p p r e s s i n g a g g r e g a t i o n , B i o c h e m . , 3 0 : 1 5 8 6 . C a i r o , G . , B a r d e l l a , L , S c h i a f f o n a t i , L . a n d A . B e r n e l l i - Z a z z e r a . (1983) . S y n t h e s i s of h e a t s h o c k p r o t e i n s in rat l iver af ter i s c h e m i a a n d h y p e r t h e r m i a . H e p a t o l o g y . , 5 : 3 5 7 - 3 6 1 . C a l t a b i a n o , M . M . , K o e s t l e r , T . P . , P o s t e , G . a n d R . G . G r e i g . 1 9 8 8 . I n d u c t i o n o f 3 2 a n d 3 4 k D a s t r e s s p r o t e i n s b y s o d i u m a r s e n i t e , h e a v y m e t a l s a n d t h i o l -r e a c t i v e a g e n t s . J . B i o l . C h e m . , 2 6 1 : 1 3 3 8 1 . 157 C h e n g , M . Y . , H a r t l , F . - U . , M a r t i n , J . , P o l l o c k , R . A . , K a l o u s e k , F . , N e u p e r t , W . , H a l l b e r g , E . M . , H a l l b e r g , R . L , a n d A . L . H o r w i c h , 1 9 8 9 . M i t o c h o n d r i a l h e a t -s h o c k p r o t e i n h s p 6 0 is e s s e n t i a l f o r a s s e m b l y of p r o t e i n s i m p o r t e d into y e a s t m i t o c h o n d r i a . N a t u r e , 3 3 7 , 6 2 0 . C h i a n g , H . - L , T e r l e c k y , S . R . , P l a n t , C P . a n d J . F . D i c e . 1 9 8 9 . A r o l e f o r a 7 0 -k i l o d a l t o n h e a t s h o c k p r o t e i n in l y s o s o m a l d e g r a d a t i o n of i n t e r c e l l u l a r p r o t e i n s . S c i e n c e , 2 4 6 : 3 8 2 . C r a i g , E . A . , a n d C A . G r o s s . 1 9 9 1 . Is h s p 7 0 t h e c e l l u l a r t h e r m o m e t e r ? T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 6 : 1 3 5 - 1 4 3 . C r a i g , E . A . , Ingol ia , T . D . a n d L . J . M a n s e a u . 1 9 8 3 . E x p r e s s i o n of D r o s o p h i l a h e a t - s h o c k c o g n a t e g e n e s d u r i n g h e a t - s h o c k a n d d e v e l o p m e n t . D e v . B i o l . , 9 9 : 4 1 8 . C r a i g , E . A . M c C a r t h y , B . J . a n d S . C W a d s w o r t h . 1 9 7 9 . S e q u e n c e o r g a n i z a t i o n of two r e c o m b i n a n t p l a s m i d s c o n t a i n i n g g e n e s f o r t h e m a j o r h e a t s h o c k - i n d u c e d p r o t e i n of D. melanogaster. C e l l , 1 6 ( 3 ) : 5 7 5 - 5 8 8 . D i D o m e n i c o , B . J . , B u g a i s k y , G . E . , a n d S . L i n d q u i s t . 1 9 8 2 . H e a t s h o c k a n d r e c o v e r y a r e m e d i a t e d b y di f ferent t r a n s l a t i o n a l m e c h a n i s m s P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 9 : 6 1 8 1 . D i e t z , T . J . , a n d G . N . S o m e r o . 1 9 9 3 . I n t e r s p e c i f i c a n d i n t e r t i s s u e d i f f e r e n c e s in h e a t s h o c k p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h r e s h o l d i n d u c t i o n t e m p e r a t u r e s . P h y s i o l . Z o o l . , 6 6 : 8 6 3 - 8 8 0 . D y e r , S . D . , D i c k s o n , K . L . , Z i m m e r m a n , E . G . a n d B . M . S a n d e r s . 1 9 9 1 . T i s s u e -s p e c i f i c p a t t e r n s of s y n t h e s i s of h e a t - s h o c k p r o t e i n s a n d t h e r m a l t o l e r a n c e o f t h e f a t h e a d m i n n o w (Pimphales promales). C a n . J . Z o o l . , 6 9 : 2 0 2 1 - 2 0 2 7 . E l l i s , R . J . 1 9 9 0 . T h e m o l e c u l a r c h a p e r o n c o n c e p t . S e m i n . C e l l . B i o l . , 1 :1 . E l l i s , R . J . a n d S . M v a n d e r V i e s . 1 9 9 1 . M o l e c u l a r c h a p e r o n e s . A n n u . R e v . B i o c h e m . , 6 0 : 3 2 1 . E v a n s , R . M . 1 9 8 8 . T h e s t e r o i d a n d t h y r o i d r e c e p t o r s u p e r f a m i l y . S c i e n c e , 2 4 0 ( 4 8 5 4 ) : 8 8 9 - 8 9 5 . F e d e r , M . E . , P a r s e l l , D . A . a n d S . L . L i n d q u i s t . 1 9 9 5 . T h e s t r e s s r e s p o n s e a n d s t r e s s p r o t e i n s In: C e l l B i o l o g y o f T r a u m a , e d . J . J . L e m a s t e r s a n d C . O l i v e r . C R C P r e s s . B o c a R a t o n , F L p p . 1 7 7 - 1 9 1 . 158 F l a n a g a n , S . W . , R y a n , A.J . , G i s o l f i , C V . a n d P . L . M o s e l e y . 1 9 9 5 . T i s s u e -s p e c i f i c H S P 7 0 r e s p o n s e in a n i m a l s u n d e r g o i n g h e a t s t r e s s . A m . J. P h y s i o l . , 2 6 8 ( R e g u l a t o r y Intergrat ive C o m p . P h y s i o l . 3 7 ) : R 2 8 - R 3 2 . F l y n n , G . C . , P o h l , J., F l o c c o , M . T . a n d J.E. R o t h m a n . 1 9 9 1 . P e p t i d e - b i n d i n g s p e c i f i c i t y o f t h e m o l e c u l a r c h a p e r o n e B i P , N a t u r e , 3 5 3 : 7 2 6 . F o l s c h , H . , G u i a r d , B . , N e u p e r t , W . a n d R . A . S tuar t . 1 9 9 6 . Internal t a r g e t i n g s i g n a l of t h e B C S 1 p r o t e i n : a n o v e l m e c h a n i s m of i m p o r t into m i t o c h o n d r i a . E M B O J . , 15(3) : 4 7 9 - 4 8 7 . F o s t e r , L . B . , a n d R . T . D u n n . 1 9 7 4 . S i n g l e - a n t i b o d y t e c h n i q u e f o r r a d i o i m m u n o a s s a y of Cortisol in u n e x t r a c t e d s e r u m o r p l a s m a . C l i n . C h e m . 2 0 : 3 6 5 - 3 6 8 . G a i t a n a r i s , G . A . , P a p a v a s s i l i o u , A . G . , R u b o c k , P . , S i l v e r s t e i n , S . J . a n d M . E . G o t t e s m a n . 1 9 9 0 . R e n a t u r a t i o n of d e n a t u r e d r e p r e s s o r r e q u i r e s h e a t s h o c k p r o t e i n s . C e l l , 6 1 : 1 0 1 3 . G a m p e r l , A . K . , M . M . V i j a y a n a n d R . G . Bout i l ie r . 1 9 9 4 . E x p e r i m e n t a l c o n t r o l of s t r e s s h o r m o n e l e v e l s in f i s h e s : t e c h n i q u e s a n d a p p l i c a t i o n s . R e v . F i s h B i o l . F i s h . 4, 2 1 5 - 2 5 5 . G e d a m u , L . , C u l h a m , B . a n d H e i k k i l a , J . J . 1 9 8 3 . A n a l y s i s o f t h e t e m p e r a t u r e -d e p e n d e n t t e m p o r a l p a t t e r n of h e a t - s h o c k - p r o t e i n s y n t h e s i s in f i s h c e l l s . B i o s c i . R e p . , 3 : 6 4 7 - 6 5 8 . G e o r g o p o u l o s , C , a n d W . J . W e l c h . 1 9 9 3 . R o l e of t h e m a j o r h e a t s h o c k p r o t e i n s a s m o l e c u l a r c h a p e r o n e s . A n n u . R e v . C e l l . B i o l . , 9 : 6 0 1 - 6 3 4 . G e t h i n g , M - J . , a n d J . S a m b r o o k . 1 9 9 2 . P r o t e i n f o l d i n g in t h e c e l l . N a t u r e , 3 5 5 : 3 3 . G i l l i e s , R . J . , O g i n o , T . , S h u l m a n , R . G . , a n d D . C . W a r d . 1 9 8 2 . 3 2 P n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e e v i d e n c e f o r t h e r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H b y E h r l i c h a s c i t e s t u m o r c e l l s . J . C e l l B i o l . , 9 5 : 2 4 - 2 8 . G o e d e , R . W . a n d B . A . B a r t o n . 1 9 9 0 . O r g a n i s m i c i n d i c e s a n d a n a u t o p s y - b a s e d a s s e s s m e n t a s i n d i c a t o r s of h e a l t h a n d c o n d i t i o n of f i s h . A m . F i s h . S o c . S y m p . 8., 9 3 - 1 0 8 . G o f f , S . A . , V o e l l m y , R . a n d A . L . G o l d b e r g . 1 9 8 8 . P r o t e i n b r e a k d o w n a n d t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e . In Ubiquitin ( e d . M . R e c h s t e i n e r ) , p p . 2 0 7 - 2 3 8 . P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k . 159 G o l d b e r g , A . L . M e n o n , A . S . , G o f f , S . A . a n d D . T . C h i n . 1 9 8 7 . M o l e c u l a r d e t e r m i n a n t s of d e g r a d a t i o n of p r o t e i n s . B i o c h e m . S o c . T r a n s . , 1 5 : 8 0 9 - 8 1 1 . G o w e r , D . J . , H o l l m a n , C , L e e , K . S . , a n d M . T . T y t e l l . 1 9 8 9 . S p i n a l c o r d injury a n d t h e s t r e s s p r o t e i n r e s p o n s e . J . N e u r o s u r g . , 7 0 : 6 0 5 - 6 1 1 . G u p t a , , R . S . a n d G . B . G o l d i n g . 1 9 9 3 . E v o l u t i o n o f H S P 7 0 a n d its i m p l i c a t i o n s r e g a r d i n g r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n a r c h a e b a c t e r i a , e u b a c t e r i a a n d e u k a r y o t e s . J . M o l . E v o l . , 3 7 : 5 7 3 - 5 8 2 . H a m m o n d , G . L . , L a i , Y . - K . , a n d C . L . M a r k e d . 1 9 8 2 . D i v e r s e f o r m s of s t r e s s l e a d to n e w p a t t e r n s o f g e n e e x p r e s s i o n t h r o u g h a c o m m o n a n d e s s e n t i a l m e t a b o l i c p a t h w a y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , U S A . , 7 9 : 3 4 8 5 - 3 4 8 8 . H a r t l , F . - U . , a n d W . N e u p e r t . 1 9 9 0 . P r o t e i n s o r t i n g to m i t o c h o n d r i a : e v o l u t i o n a r y c o n s e r v a t i o n of f o l d i n g a n d a s s e m b l y . S c i e n c e , 2 4 7 : 9 3 0 . H e y d e , M . a n d R . P o r t a l i e r . 1 9 9 0 . A c i d s h o c k p r o t e i n s o f Escherichia coli. F E M S M i c r o b i o l . Lett . , 6 9 : 1 9 - 2 6 . H a w k i n s , A . J . S . , 1 9 9 1 . P r o t e i n t u r n o v e r : a f u n c t i o n a l a p p r a i s a l . F u n c . E c o l . , 5 : 2 2 2 - 2 3 3 . H e a t h , A . G . 1 9 9 5 . W a t e r p o l l u t i o n a n d f i s h p h y s i o l o g y . C R C P r e s s , L e w i s p u b l i s h e r s , N e w Y o r k . H i g h t o w e r , L . E . 1 9 8 0 . C u l t u r e d a n i m a l c e l l s e x p o s e d to a m i n o a c i d a n a l o g u e s a n d p u r o m y c i n r a p i d l y s y n t h e s i z e s e v e r a l p o l y p e p t i d e s . J . C e l l . P h y s i o l . , 1 0 3 : 4 0 7 - 4 2 7 . H i g h t o w e r , L . E . 1 9 9 1 . H e a t s h o c k , s t r e s s p r o t e i n s , c h a p e r o n e s , a n d p r o t e o t o x i c i t y ( M e e t i n g r e v i e w ) , C e l l , 6 6 : 1 . H o c h a c h k a P . W . a n d G . N . S o m e r o . 1984 . T e m p e r a t u r e a d a p t a t i o n In: Biochemical Adaptation. P r i n c e t o n U n i v e r s i t y P r e s s , P r i n c e t o n , N e w J e r s e y . H o l b r o o k , N . J . a n d R . U d e l s m a n . 1 9 9 4 . H e a t s h o c k p r o t e i n g e n e e x p r e s s i o n in r e s p o n s e t o p h y s i o l o g i c s t r e s s a n d a g i n g . In: The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. ( e d s . ) R.I . M o r i m o t o , A . T i s s i e r e s a n d C . G e o r g o p o u l o s . ( C o l d S p r i n g H a r b o r m o n o g r a p h s e r i e s ; 26 ) . C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , P l a i n v i e w , N e w Y o r k . H o u l i h a n , D . F . , C a r t e r , C G . a n d I.D. M c C a r t h y . 1 9 9 5 . P r o t e i n s y n t h e s i s in f i s h . In: Metabolic Biochemistry, ( e d s . ) , P . W . H o c h a c h k a a n d T . P . M o o n . E l s e v i e r , N e w Y o r k . 160 H o u s t o n , A . H . 1 9 9 0 . B l o o d a n d c i r c u l a t i o n . In: M e t h o d s f o r F i s h B i o l o g y . ( E d s . , S c h r e c k , C . B . a n d P . B . M o y l e ) . A m . F i s h . S o c , B e t h e s d a , M a r y l a n d , U S A . H u t c h i n s o n , K . A . , Di t tmar , K . D . , C z a r , M . J . , a n d W . B . Pratt . 1 9 9 4 . P r o o f that h s p 7 0 is r e q u i r e d f o r a s s e m b l y of t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r into a h e t e r o c o m p l e x wi th h s p 9 0 . J . B i o l . C h e m . 2 6 9 : 5 0 4 3 - 5 0 4 9 . H u l t m a r k , D . , K l e m e n z , R . a n d W . J . G e h r i n g , 1 9 8 6 . T r a n s l a t i o n a l a n d t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l e l e m e n t s in t h e u n t r a n s l a t e d l e a d e r o f t h e h e a t - s h o c k g e n e h s p 2 2 . C e l l , 4 4 : 4 2 9 . I w a m a , G . K . , V i j a y a n , M . M . , a n d J . D . M o r g a n . 1 9 9 6 . T h e s t r e s s r e s p o n s e in F i s h . (In press). I w a m a , G . K . , J . D . M o r g a n a n d B . A . B a r t o n . 1 9 9 5 . S i m p l e f i e l d m e t h o d s f o r m o n i t o r i n g s t r e s s a n d g e n e r a l c o n d i t i o n o f f i s h . A q u a . R e s . , 2 6 : 2 7 3 - 2 8 2 . J a m e e l , A . , L a w , M . , C o o m b e s , R . C . a n d Y . A . L u q m a n i . 1 9 9 3 . S i g n i f i c a n c e of h e a t s h o c k p r o t e i n 9 0 a s a p r o g n o s t i c i n d i c a t o r in b r e a s t c a n c e r . Int. J . O n c o l . , 2 : 1 0 7 5 - 1 0 8 0 . K a m e i , K . , B r u m m e r , E . , d e m o n s , K . V . , a n d D . A . S t e v e n s . 1 9 9 2 . I n d u c t i o n o f s t r e s s p r o t e i n s y n t h e s i s in Histoplasma capsulatum b y h e a t , l o w p H a n d h y d r o g e n p e r o x i d e . J . M e d . V e t . M y c o l . , 3 0 : 3 8 5 - 3 9 3 . K a n g , P . - J . , O s t e r m a n , J . , S h i l l i n g , J . , N e u p e r t , W . , C r a i g , E . A . a n d N. P f a n n e r . 1 9 9 0 . R e q u i r e m e n t o f H s p 7 0 in t h e m i t o c h o n d r i a l matr ix f o r t r a n s l o c a t i o n a n d f o l d i n g of p r e c u r s o r p r o t e i n s . N a t u r e , 3 4 8 : 1 3 7 . K h a n d j i a n , E . W . 1 9 9 0 . A c i d i c e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t i n d u c e s o n a s u b s e t o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s in p r i m a r y m o u s e k i d n e y c e l l c u l t u r e s . B i o c h e m . C e l l B i o l . , 6 8 ( 4 ) : 8 0 4 - 8 0 7 . K o l l , H . , G u i a r d , B . , R a s s o w , J . , O s t e r m a n , J . , H o r w i c h , A . L . , N e u p e r t , W . , a n d F . - U . H a r t l . 1 9 9 2 . A n t i f o l d i n g act ivi ty o f h s p 6 0 c o u p l e s p r o t e i n i m p o r t into t h e m i t o c h o n d r i a l matr ix wi th e x p o r t to t h e i n t e r m e m b r a n e s p a c e . C e l l , 6 8 : 1 1 6 3 -1 1 7 5 . K o t h a r y , R . K . a n d C a n d i d o , E . P . M . ( 1982 ) I n d u c t i o n o f a n o v e l s e t of p o l y p e p t i d e s b y h e a t s h o c k o r s o d i u m a r s e n i t e in c u l t u r e d c e l l s o f r a i n b o w trout, Salmo gairdneri. C a n . J . B i o c h e m . , 6 0 : 3 4 7 - 5 5 . K r u g e r , C , a n d B . - J . B e n e c k e . 1 9 8 2 . T r a n s l a t i o n a n d t u r n o v e r o f Drosophila h e a t - s h o c k a n d n o n h e a t - s h o c k m R N A s . in H e a t S h o c k f r o m B a c t e r i a to M a n , 161 M . J . S c h l e s i n g e r , M . A s h b u m e r , a n d A . T i s s i e r e s , e d s . ( C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k : C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ) , p p . 1 9 1 . L a e m m l i , U . K . (1970) C l e a v a g e of s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d of b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e , 2 2 7 : 6 8 0 - 8 5 . L a g e r s p e t z , K . Y . H . 1 9 8 7 . T e m p e r a t u r e e f f e c t s o n d i f f e r e n t o r g a n i z a t i o n l e v e l s in a n i m a l s . In T e m p e r a t u r e a n d a n i m a l c e l l . E d i t e d b y K . B o w l e r a n d B . J . F u l l e r . C o m p a n y o f B i o l o g i s t s L t d . , C a m b r i d g e , U . K . p p . 4 2 9 - 4 4 9 . L a n d r y , J . , C h r e t i e n , P . , L a m b e r t , H . , H i c k e y , E . a n d L A . W e b e r . 1 9 8 9 . H e a t s h o c k r e s i s t a n c e c o n f e r r e d b y e x p r e s s i o n of t h e h u m a n H S P 2 7 g e n e in r o d e n t c e l l s . J . C e l l B i o l . , 1 0 9 : 7 . L a n d r y , S . J . , J o r d a n , R . , M c M a c k e n , R . , a n d L . M . G i e r a s c h . 1 9 9 2 . D i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s f o r t h e s a m e p o l y p e p t i d e b o u n d to c h a p e r o n e s D n a K a n d G r o E L , N a t u r e , 3 5 5 : 4 5 5 . L i , G . C . , M e y e r , J . L . , M a k , J . Y . a n d G . M . H a h n . 1 9 8 3 . H e a t - i n d u c e d p r o t e c t i o n o f m i c e a g a i n s t t h e r m a l d e a t h . C a n c e r R e s . , 4 3 : 5 7 5 8 - 5 7 6 0 . L i n d q u i s t , S . 1 9 8 6 . T h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . A n n . R e v . B i o c h e m . , 5 5 : 1 1 5 1 - 9 1 . L i n d q u i s t , S . 1 9 9 3 . A u t o r e g u l a t i o n o f t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e , In: T r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n of g e n e e x p r e s s i o n 2, H a n , J . , E d . , P l e n u m P r e s s . N e w Y o r k . L i n d q u i s t , S . a n d C r a i g , E . A . 1 9 8 8 . T h e h e a t s h o c k p r o t e i n s . A n n . R e v . G e n e . , 2 2 : 6 3 1 - 7 7 . L i n d q u i s t , S . a n d R . P e t e r s e n . 1 9 9 0 . S e l e c t i v e t r a n s l a t i o n a n d d e g r a d a t i o n of h e a t - s h o c k m e s s e n g e r R N A s in Drosophila. E n z y m e , 4 4 : 1 4 7 . M a r g u l i s , B . A . , A n t r o p o v a , O . Y . a n d A . D . K h a r a z o v a . 1 9 8 9 . 7 0 k D a h e a t s h o c k p r o t e i n s f r o m m o l l u s k a n d h u m a n c e l l s h a v e c o m m o n s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d o m a i n s . C o m p . B i o c h e m . P h y s i o l . , 9 4 ( b ) : 6 2 1 - 6 2 8 M a r o t o , F . G . a n d J . M . S i e r r a . 1 9 8 8 . T r a n s l a t i o n a l c o n t r o l in h e a t - s h o c k e d Drosophila e m b r y o s . E v i d e n c e f o r t h e i n a c t i v a t i o n o f ini t iat ion f a c t o r ( s ) i n v o l v e d in t h e r e c o g n i t i o n o f m R N A c a p s t r u c t u r e . J . B i o l . C h e m . , 2 6 3 : 1 5 7 2 0 . M a r t i n , J . , L a n g e r , T . , B o t e v a , R . , S c h r a m e l , A . , H o r w i c h , A . L . a n d F . - U . H a r t l . 1 9 9 1 . C h a p e r o n i n - m e d i a t e d p r o t e i n f o l d i n g at t h e s u r f a c e o f g r o E L t h r o u g h a ' m o l t e n g l o b u l e ' - l i k e i n t e r m e d i a t e . N a t u r e , 3 5 2 : 3 6 . 162 M a u l e , A . G . , R . A . T r i p p , S . L . Kat tar i a n d C . B . S c h r e c k . 1 9 8 9 . S t r e s s a l t e r s i m m u n e f u n c t i o n a n d d i s e a s e r e s i s t a n c e in c h i n o o k s a l m o n (Oncorhynchus tshawytscha). J . E n d o c r i n o l . , 1 2 0 : 1 3 5 - 1 4 2 . M a z e a u d , M . M . , F . M a z e a u d a n d E . M . D o n a l d s o n . 1 9 7 7 . P r i m a r y a n d s e c o n d a r y e f f e c t s o f s t r e s s in f i s h : s o m e n e w d a t a with a g e n e r a l r e v i e w . T r a n s . A m . F i s h . S o c , 1 0 6 : 2 0 1 - 2 1 2 . M i s r a , S . , Z a f a r u l l a h , M . , P r i c e - H a u g h e y , J . a n d G e d a m u , L . 1 9 8 9 . A n a l y s i s of s t r e s s - i n d u c e d g e n e e x p r e s s i o n in f i s h c e l l l i n e s e x p o s e d to h e a v y m e t a l s a n d h e a t s h o c k . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a , 1 0 0 7 : 3 2 5 - 3 3 . M i z z e n , L . A . , a n d W . J . W e l c h . 1 9 8 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n of t h e t h e r m o t o l e r a n t c e l l . I. E f f e c t s o n p r o t e i n s y n t h e s i s act ivity a n d t h e r e g u l a t i o n o f h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 e x p r e s s i o n . J . C e l l B i o l . , 1 0 6 : 1 1 0 5 - 1 1 1 6 . M o m m s e n , T . P . , M o o n , T . M . a n d P . J . W a l s h . 1 9 9 4 . H e p a t o c y t e s : i s o l a t i o n , m a i n t e n a n c e a n d u t i l i z a t i o n . In: H o c h a c h k a a n d M o n m m s e n ( e d s . ) B i o c h e m i s t r y a n d m o l e c u l a r b i o l o g y of f i s h e s , v o l . 3. E l s e v i e r S c i e n c e B . V . , N e w Y o r k . M o r i m o t o , R . I . , T i s s i e r e s , A . , a n d C . G e o r g o p o u l o s 1 9 9 4 . The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. ( C o l d S p r i n g H a r b o r M o n o g r a p h s e r i e s ; 2 6 ) , C o l d s p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s . P l a i n v i e w , N e w Y o r k . M o r i m o t o , R . I . , J u r i v i c h , D . A . , K r o e g e r , P . E . , M a t h u r , S . K . , M u r p h y , S . P . , N a k a i , A . , S a r g e , K . , A b r a v a y a , K . a n d L . T . S i s t o n e n . 1 9 9 4 . R e g u l a t i o n o f h e a t s h o c k g e n e t r a n s c r i p t i o n b y a f a m i l y of h e a t s h o c k f a c t o r s . In: 777e biology of heat shock proteins and molecular chaperones. ( e d s . ) R.I . M o r i m o t o , A . T i s s i e r e s a n d C . G e o r g o p o u l o s . ( C o l d S p r i n g H a r b o r m o n o g r a p h s e r i e s ; 26 ) . C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , P l a i n v i e w , N e w Y o r k . M o r i m o t o , R.I . , 1 9 9 3 . C e l l s in s t r e s s : T r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f h e a t s h o c k g e n e s . S c i e n c e , 2 5 9 : 1 4 0 9 . M o r i m o t o , R.I . , S a r g o , K . D . a n d K . A b r a v a y a . 1 9 9 2 . T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n of h e a t s h o c k g e n e s . J . B i o l . C h e m . , 2 6 7 ( 3 1 ) : 2 1 9 8 7 . M o r i m o t o , R . I . , T i s s i e r e s , A . a n d C . G e o r g o p o u l o s . 1 9 9 0 . Stress proteins in Biology and Medicine. C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s . C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . M o r r i s , R . , T a y l o r , E . , B r o w n , D . a n d D . B r o w n . , E d s . 1 9 8 9 . A c i d T o x i c i t y a n d A q u a t i c a n i m a l s , C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k . 163 M o s s e r , D . D . , V a n O o s t o m , J. a n d N . C . B o l s . 1 9 8 7 . I n d u c t i o n a n d d e c a y of t h e r m o t o l e r a n c e in r a i n b o w trout f i b r o b l a s t s . J. C e l l . P h y s i o l . , 1 3 2 : 1 5 5 - 1 6 0 . M u r a k a m i , H . , P a i n , D . , a n d G . B l o b e l , 1 9 8 8 . 7 0 - k D a h e a t s h o c k - r e l a t e d p r o t e i n is o n e of at l e a s t two dis t inc t c y t o s o l i c f a c t o r s s t i m u l a t i n g p r o t e i n i m p o r t into m i t o c h o n d r i a . J. C e l l B i o l . , 1 0 7 : 2 0 5 1 . N a g a o , K . , S a g a , S . a n d Y a m a d a , K . M . 1 9 8 6 . A m a j o r c o l l a g e n - b i n d i n g p r o t e i n of c h i c k e m b r y o f i b r o b l a s t s is a n o v e l h e a t s h o c k p r o t e i n . J. C e l l B i o l . 1 0 3 : 2 2 3 -2 2 9 . N a g a o , R . T . , K i m p e l , J.A. a n d K e y , J . L 1 9 9 0 . M o l e c u l a r a n d c e l l u l a r b i o l o g y of t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e . A d v . G e n e . , 2 8 : 2 3 5 - 7 4 . N e l s o n , R . J . , Z i e g e l h o f f e r , T . , N i c o l e t , C , W e r n e r - W a s h b u r n e , M . a n d E . A . C r a i g . 1 9 9 2 . T h e t r a n s l a t i o n M a c h i n e r y a n d 7 0 k D a h e a t s h o c k p r o t e i n c o o p e r a t e in p r o t e i n s y n t h e s i s . C e l l , 7 1 : 9 7 . N g u y e n , V . T . , M o r a n g e , M . a n d O . B e n s a u d e . 1 9 8 9 . P r o t e i n d e n a t u r a t i o n d u r i n g h e a t s h o c k a n d r e l a t e d s t r e s s . J . B i o l . C h e m . , 2 6 4 ( 1 8 ) : 1 0 4 8 7 - 1 0 4 9 2 . N o v e r , L . a n d K . - D . S c h a r f . 1 9 9 1 . H e a t s h o c k p r o t e i n s . In: N o v e r L . e d i t o r . H e a t s h o c k r e s p o n s e . N e w Y o r k : C R C P r e s s , p p . 3 7 3 - 4 0 8 . N o v e r , L . 1 9 8 4 . Heat Shock Response of Eukaryotic Cells. S p r i n g e r - V e r l a g . 8 2 PP-O ' F a r r e l l , P . H . 1 9 7 5 . H i g h r e s o l u t i o n t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s of p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . , 2 5 0 ( 1 0 ) : 4 0 0 7 - 4 0 2 1 . P a r s o n s , P . A . 1 9 9 3 . T h e i m p o r t a n c e a n d c o n s e q u e n c e s o f s t r e s s in l i v i n g a n d f o s s i l p o p u l a t i o n s : f r o m l i f e - h i s t o r y v a r i a t i o n to e v o l u t i o n a r y c h a n g e . A m N a t . 1 4 2 : S 5 - S 2 0 . P a r s e l l , D . A . , J . T a u l i e n , a n d S . L i n d q u i s t . 1 9 9 3 . T h e r o l e o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s in t h e r m o t o l e r a n c e . P h i l o s . T r a n s . R . S o c . L o n d . B 3 3 9 : 2 7 9 - 2 8 5 . P e l h a m , H . R . B . , 1 9 8 2 . A r e g u l a t o r y u p s t r e a m p r o m o t e r e l e m e n t in t h e Drosophila h s p 7 0 h e a t - s h o c k g e n e . C e l l 3 0 : 2 7 3 . P e l h a m , H . R . B . , 1 9 8 6 . S p e c u l a t i o n s o n t h e f u n c t i o n s of t h e m a j o r h e a t s h o c k a n d g l u c o s e r e g u l a t e d p r o t e i n s . C e l l , 4 6 : 9 5 9 . 164 P e r i s i c 0 . X i a o , H . a n d J . T . L i s . 1 9 8 9 . S t a b l e b i n d i n g o f Drosophila h e a t s h o c k f a c t o r to h e a t - t o - h e a d a n d tail - to-tail r e p e a t s of a c o n s e r v e d 5 b p r e c o g n i t i o n unit . C e l l , 59 (5) : 7 9 7 - 8 0 6 . P e t e r s e n , R . a n d S . L i n d q u i s t . 1 9 8 8 . T h e Drosophila hsp70 m e s s a g e is r a p i d l y d e g r a d e d at n o r m a l t e m p e r a t u r e s a n d s t a b i l i z e d b y h e a t s h o c k . G e n e , 7 2 : 1 6 1 . P i c k e r i n g , A . D . 1 9 8 4 . C o r t i s o l - i n d u c e d l y m p h o c y t o p e n i a in b r o w n trout, Salmo Trutta L . G e n . C o m p . E n d o c r i n o l . , 5 3 : 2 5 2 - 2 5 9 . P i c k e r i n g , A . D . a n d J . D u s t o n . 1 9 8 3 . A d m i n i s t r a t i o n of C o r t i s o l to b r o w n trout, Salmo Trutta L . a n d its e f f e c t s o n t h e s u s c e p t i b i l i t y to saprolegna i n f e c t i o n a n d f u r u n c u l o s i s . J . F i s h B i o l . , 2 3 : 1 6 3 - 1 7 5 . P i c k e r i n g , A . D . a n d T . G . P o t t i n g e r . 1 9 8 9 . S t r e s s r e s p o n s e s a n d d i s e a s e r e s i s t a n c e i n s a l m o n i d f i s h : E f f e c t s o f c h r o n i c e l e v a t i o n o f p l a s m a C o r t i s o l . F i s h P h y s i o l . B i o c h e m . , 7 : 2 5 3 - 2 5 8 . Pratt , W . B . 1 9 9 3 . T h e r o l e o f h e a t s h o c k p r o t e i n s in r e g u l a t i n g t h e f u n c t i o n , f o l d i n g a n d t r a f f i c k i n g o f t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r . J . B i o l . C h e m . , 2 6 8 ( 2 9 ) : 2 1 4 5 5 - 2 1 4 5 8 . R a n d a l l , D . J . a n d S . F . P e r r y . 1 9 9 2 . C a t e c h o l a m i n e . In F i s h P h y s i o l o g y , V o l . X l l B ( E d i t e d b y W . S . H o a r , D . J . R a n d a l l a n d T . P . F a r r e l l ) , p p . 2 5 5 - 3 0 0 . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . R e d d i n g , J . M . , S c h r e c k , C . B . , B i r k s , E . K . a n d R . D . E w i n g . 1 9 9 4 . C o r t i s o l a n d its e f f e c t s o n p l a s m a t h y r o i d h o r m o n e a n d e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n s in f r e s h w a t e r a d u r i n g s e a w a t e r a c c l i m a t i o n i n y e a r l i n g c o h o s a l m o n , O n c o r h y n c h u s k i s u t c h . G e n . C o m p . E n d o c r i n o l . , 5 6 : 1 4 6 - 1 5 5 . R e i d , S . G . , M . M . V i j a y a n a n d S . F . P e r r y . 1 9 9 6 . M o d u l a t i o n o f c a t e c h o l a m i n e s t o r a g e a n d r e l e a s e b y t h e p i t u i t a r y - i n t e r r e n a l a x i s i n t h e r a i n b o w trout (Oncorhynchus mykiss). J . C o m p . P h y s i o l . B . , 1 6 5 : 6 6 5 - 6 7 6 . R i t o s s a , F . , 1 9 6 2 . A n e w p u f f i n g p a t t e r n i n d u c e d b y h e a t s h o c k a n d D N P in Drosophila, E x p e r i e n t i a , 1 8 : 5 7 1 . R o t h m a n , J . E . 1 9 8 9 . P o l y p e p t i d e c h a i n b i n d i n g p r o t e i n s : c a t a l y s t s o f p r o t e i n f o l d i n g a n d r e l a t e d p r o c e s s e s in t h e c e l l . C e l l , 5 9 : 5 9 1 . R y a n , A . J . , G i s o l f i , C V . a n d P . L . M o s e l e y . 1 9 9 1 . S y n t h e s i s o f 7 0 K s t r e s s p r o t e i n b y h u m a n l e u k o c y t e s : e f f e c t s of e x e r c i s e in t h e h e a t . J . A p p l . P h y s i o l . , 7 0 : 4 4 6 -4 7 1 . 165 S a n c h e z , Y . , J . T a u l i e n , K . A . , B o r k o v i c h , a n d S . L i n d q u i s t . 1 9 9 2 . H s p 1 0 4 is r e q u i r e d for t o l e r a n c e to m a n y f o r m s o f s t r e s s . E M B O J., 1 1 : 2 3 5 7 - 2 3 6 4 . S a n d e r s , B . M . 1 9 9 3 . S t r e s s p r o t e i n s in a q u a t i c o r g a n i s m s : a n e n v i r o n m e n t a l p e r s p e c t i v e . Cr i t . R e v . T o x i c o l . , 2 3 ( 1 ) : 4 9 - 7 5 . S a n d e r s , B . M . a n d L . S . M a r t i n . 1 9 9 3 . S t r e s s p r o t e i n s a s b i o m a r k e r s o f c o n t a m i n a n t e x p o s u r e in a r c h i v e d e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s . S c i . T o t . E n v i r o n . , 1 3 9 / 1 4 0 : 4 5 9 - 4 7 0 . S a n d e r s , S . L . , W h i t e f e i l d , K . M . , V o g e l , J . P . , R o s e , M . D . a n d R . W . S c h e k m a n . 1 9 9 2 . S e c 6 1 p a n d B i P d i r e c t l y fac i l i ta te p o l y p e p t i d e t r a n s l o c a t i o n in t h e E R . C e l l , 6 9 : 3 5 3 . S c h l e s i n g e r , M . J . 1 9 8 6 . H e a t s h o c k p r o t e i n s : t h e s e a r c h f o r f u n c t i o n s . J . C e l l B i o l . 1 0 3 : 3 2 1 - 3 2 5 . S c h l e s i n g e r , M . J . , A s h b u r n e r , M . a n d A . T i s s i e r e s . 1 9 8 2 . H e a t s h o c k : f r o m B a c t e r i a to M a n , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y . S c h l e s i n g e r , M . J . , A s h b u r n e r , M . a n d T i s s i e r e s , A . ( e d s . ) C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . p p . 3 0 9 - 1 4 . S c h w e i g e r , H . G . 1 9 6 2 . P a t h w a y s of m e t a b o l i s m in n u c l e a t e a n d a n u c l e a t e e r y t h r o c y t e s . Int. R e v . C y t o l . 1 3 : 1 3 5 - 2 0 1 . S c o t t , M . P . , a n d M . L . P a r d u e . 1 9 8 1 . T r a n s l a t i o n a l c o n t r o l in l y s a t e s of Drosophila melanogaster c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 : 3 3 5 3 . S e l y e , H . 1 9 5 0 . S t r e s s a n d t h e g e n e r a l a d a p t a t i o n s y n d r o m e . Brit . M e d . J . 1 3 8 3 - 1 3 9 2 . S k i d m o r e , R . , G u t i e r e s , J . A . , G u e r r i e o , V . a n d K . C . K r e g e l . 1 9 9 5 . H S P 7 0 i n d u c t i o n d u r i n g e x e r c i s e a n d h e a t s t r e s s in rats : r o l e o f i n t e r n a l t e m p e r a t u r e . A m . J . P h y s i o l . 2 6 8 ( R e g . Intergr. C o m p . P h y s i o l . 3 7 ) : R 9 2 - R 9 7 . S k o w y r a , D . , G e o r g o p o u l o s , C . a n d W . Z y l i c z . 1 9 9 0 . T h e E.coli D n a K g e n e p r o d u c t , t h e h s p 7 0 h o m o l o g , c a n r e a c t i v a t e h e a t - i n a c t i v a t e d R N A p o l y m e r a s e in a n A T P h y d r o l y s i s - d e p e n d e n t m a n n e r . C e l l , 6 2 : 9 3 9 . S o m e r o , G . N . 1 9 9 5 . P r o t e i n s a n d T e m p e r a t u r e . A n n u . R e v . P h y s i o l . , 5 7 : 4 3 - 6 8 . S o r g e r , P . K . a n d H . C . N e l s o n , 1 9 8 9 . T r i m e r i z a t i o n o f a y e a s t t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o r v i a a c o i l e d - c o i l motif. C e l l , 5 9 : 8 0 7 . 166 S o r g e r , P . K . , 1 9 9 1 . H e a t s h o c k f a c t o r a n d t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . C e l l , 6 5 : 3 6 3 . S p e c k e r , J . L , Portesi, D . M . , C o r n e l l , S . C . a n d P . A . V e i l l e t t e . 1 9 9 4 . M e t h o d o l o g y f o r implanting Cortisol in A t l a n t i c s a l m o n a n d e f f e c t s o f c h r o n i c a l l y e l e v a t e d Cortisol o n osmoregulatory p h y s i o l o g y . A q u a c u l t u r e , 1 2 1 : 1 8 1 - 1 9 3 . S p r y , D . J . , W o o d , C . M . , a n d P . V . H o d s o n . 1 9 9 4 T h e e f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l a c i d o n f r e s h w a t e r f i s h wi th p a r t i c u l a r r e f e r e n c e to t h e s o f t w a t e r l a k e s in O n t a r i o a n d t h e m o d i f y i n g e f f e c t s of h e a v y m e t a l s : a l i terature r e v i e w . C a n a d a G r e a t l a k e s B i o l i m n o l o g y L a b o r a t o r y , 1. B u r l i n g t o n , C a n a d a . S u b j e c k , J . R . , S c i a n d r a , J . , a n d R . J . J o h n s o n . 1 9 8 2 . H e a t s h o c k p r o t e i n s a n d t h e r m o t o l e r a n c e : c o m p a r i s o n of i n d u c t i o n k i n e t i c s . Br . J . R a d i o l . 5 5 : 5 7 9 - 5 8 4 . S u m m e r f e l t , R . C , a n d L . S . S m i t h . 1 9 9 0 . A n e s t h e s i a , s u r g e r y , a n d r e l a t e d t e c h n i q u e s , p p . 2 1 3 - 2 7 2 . In C . B . S c h r e c k a n d P . B . M o y l e (edi tors ) . M e t h o d s f o r f i s h b i o l o g y . A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y , B e t h e s d a , M a r y l a n d . T h o m a s , G . P . a n d M . B . M a t h e w s . 1 9 8 2 . C o n t r o l of p o l y p e p t i d e c h a i n e l o n g a t i o n in t h e s t r e s s r e s p o n s e : a n o v e l t r a n s l a t i o n c o n t r o l . ]n: Heat Shock: From Bacteria to Man. S c h l e s i n g e r , M . J . , A s h b u r n e r , M . a n d T i s s i e r e s , A . ( e d s . ) C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k . p p . 2 0 7 - 1 3 . T i s s i e r e s , A . , H . K . M i t c h e l l , a n d V . M . T r a c e y . 1974 . P r o t e i n s y n t h e s i s in s a l i v a r y g l a n d s o f Drosophila melanogaster. R e l a t i o n to c h r o m o s o m e p u f f s . J . M o l . B i o l . 8 4 : 3 8 9 - 3 9 8 . T r a p p , T . a n d F . H o l s b o e r . 1 9 9 5 . L i g a n d - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s in t h e m i n e r a l o c o r t i c o i d r e c e p t o r a n a l y z e d b y p r o t e a s e m a p p i n g . B i o c h e m B i o p h y s . R e s . C o m m . 2 1 5 ( 1 ) : 2 8 6 - 2 9 1 . T r i n d e r , P . 1 9 6 9 . D e t e r m i n a t i o n of g l u c o s e in b l o o d u s i n g g l u c o s e o x i d a s e wi th a n a l t e r n a t i v e o x y g e n a c c e p t o r . A n n . C l i n . B i o c h e m . 6 : 2 4 - 2 8 . U d e l s m a n , R . , B l a k e , M . J . , S t a g g , C A . a n d N . J . H o l b r o o k . 1 9 9 3 . E n d o c r i n e c o n t r o l o f s t r e s s - i n d u c e d h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 e x p r e s s i o n in vivo. S u r g e r y , 1 1 5 ( 5 ) : 6 1 1 - 6 1 6 . V a s s , K . , W e l c h , W . J . a n d T . S . N o w a k . 1 9 8 8 . L o c a l i z a t i o n o f t h e 7 0 - K s t r e s s p r o t e i n i n d u c t i o n i n g e r b i l b r a i n af ter i s c h e m i a . A c t a N e u r o p a t h o l . 7 7 : 1 2 8 - 1 3 5 . V i i t a n e n , P . V . , L o r i m e r , G . H . , S e e t h e r a m , R . , G u p t a , R . S . , O p p e n h e i m , J . , T h o m a s , J . O . a n d N . J . C o w a n . 1 9 9 2 . M a m m a l i a n m i t o c h o n d r i a l c h a p e r o n i n 6 0 f u n c t i o n s a s a s i n g l e t o r o i d a l r i n g . J . B i o l . C h e m . , 2 6 7 : 6 9 5 . 167 V i j a y a n , M . M . a n d T . W . M o o n . 1 9 9 4 . T h e s t r e s s r e s p o n s e a n d t h e p l a s m a d i s a p p e a r a n c e of c o r t i c o s t e r o i d a n d g l u c o s e in a m a r i n e te leos t , t h e s e a r a v e n . C a n . J . Z o o l . 72 , 3 7 9 - 3 8 6 . V i j a y a n , M . M . , P . K . R e d d y , J . F . L e a t h e r l a n d a n d T . W . M o o n . 1 9 9 4 b . T h e e f f e c t s of Cortisol o n h e p a t o c y t e m e t a b o l i s m i n r a i n b o w trout: a s t u d y u s i n g t h e s t e r o i d a n a l o g u e R U 4 8 6 . G e n . C o m p . E n d o c r i n o l . 96 , 7 5 - 8 4 . W e b e r , R . E . 1 9 8 2 . I n t r a s p e c i f i c a d a p t a t i o n of h e m o g l o b i n f u n c t i o n in f i s h to o x y g e n a v a i l a b i l i t y . In: E x o g e n o u s a n d e n d o g e n o u s i n f l u e n c e s o n m e t a b o l i c a n d n e u r a l c o n t r o l . E d i t e d b y A . D . F . A d d i n k a n d N . S p r o n k . P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d , p p . 8 7 - 1 0 2 . W e d e m e y e r , G . A . , B . A . B a r t o n a n d D . J . M c L e a y . 1 9 9 0 . S t r e s s a n d a c c l i m a t i o n , p p . 4 5 1 - 4 8 9 , In: M e t h o d s f o r f i s h b i o l o g y , C . B . S c h r e c k a n d P . B . M o y l e , e d s : A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y , B e t h e s d a , M a r y l a n d . W e d l e r , F . C . 1 9 8 7 . D e t e r m i n a n t s o f m o l e c u l a r h e a t s tabi l i ty . In: Thermotolerance, V o l . II, M e c h a n i s m s o f h e a t r e s i s t a n c e , H e n l e , K . J . , E d . , C R C P r e s s , B o c a R a t o n , F L . W e l c h , W . J . 1 9 9 3 . H o w c e l l s r e s p o n d to s t r e s s . S c i . A m . 2 6 9 , 5 6 - 6 4 . W e l c h , W . J . a n d J . R . F e r a m i s c o . 1 9 8 5 . R a p i d p u r i f i c a t i o n o f m a m m a l i a n 7 0 , 0 0 0 - d a l t o n s t r e s s p r o t e i n s : affinity of t h e p r o t e i n s for n u c l e o t i d e s . M o l . C e l l . B i o l . 5 : 1 2 2 9 - 1 2 3 7 . W e l c h , W . J . , K a n g , H . S . , B e c k m a n n , R . P . , a n d L A . M i z z e n . 1 9 9 1 . R e s p o n s e o f m a m m a l i a n c e l l s to m e t a b o l i c s t r e s s : c h a n g e s i n c e l l p h y s i o l o g y a n d s t r u c t u r e / f u n c t i o n of s t r e s s p r o t e i n s . C u r r . T o p i c s M i c r o b i o l . I m m u n o l . 1 6 7 : 3 1 - 5 5 . W e s t w o o d , J . T . , C l o s , J . a n d C . W u , 1 9 9 1 . S t r e s s - i n d u c e d o l i g o m e r i z a t i o n a n d c h r o m o s o m a l r e l o c a l i z a t i o n of h e a t - s h o c k fac tor . N a t u r e , 3 5 3 : 8 2 2 . W h e l a n , S . A . a n d L . E . H i g h t o w e r . 1 9 8 5 . D i f f e r e n t i a l i n d u c t i o n o f g l u c o s e -r e g u l a t e d a n d h e a t s h o c k p r o t e i n s : E f f e c t o f p H a n d s u l f h y d r y l - r e d u c i n g a g e n t s o n c h i c k e n e m b r y o c e l l s . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 5 : 2 5 1 - 2 5 8 . W i e c h , H . , J . B u c h n e r , R . Z i m m e r m a n , a n d U . J a k o b . 1 9 9 2 . H s p 9 0 c h a p e r o n e p r o t e i n f o l d i n g in vitro. N a t u r e , 3 5 8 : 1 6 9 - 1 7 0 . W i l h e l m , J . M . , S p e a r , P . a n d S a x , C . 1 9 8 2 . H e a t - s h o c k p r o t e i n s in t h e p r o t o z o a n Tetrahymena: i n d u c t i o n b y p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t i o n a n d p o s s i b l e r o l e in c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m . ]n: Heat Shock: From Bacteria to Man. M . J . 168 S c h l e s i n g e r , M . A s h b u r n e r a n d A . T i s s i e r e s . E d s . ( C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y . : C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ) . W o o d w a r d , J . J . 1 9 8 2 . P l a s m a c a t e c h o l a m i n e s in r e s t i n g trout, Salmo gairdneri R i c h a r d s o n , b y h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . F i s h B i o l . 2 1 , 4 2 9 - 4 3 2 . W u , C , Z i m a r r i n o , V . , T s a i , C , W a l k e r , B . , a n d S . W i l s o n . 1 9 9 0 . T r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n of h e a t s h o c k g e n e s , In: S t r e s s P r o t e i n s i n B i o l o g y a n d M e d i c i n e , R .I . M o r i m o t o A . T i s s i e r e s , a n d C . G e o r g o p o u l o s , e d s . ( C o l d S p r i n g H a r b o r , N e w Y o r k : C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ) , p p . 4 2 9 . Y a m a m o t o , K . R . 1 9 8 5 . S t e r o i d r e c e p t o r r e g u l a t e d t r a n s c r i p t i o n of s p e c i f i c g e n e s a n d g e n e n e t w o r k s . A n n u . R e v . G e n e t . 1 9 : 2 0 9 - 2 5 2 . Z a f a r u l l a h , M . , W i s i e w s k i , J . , S h w o r a k , N . W . , S c h i e m a n , S . , M i s r a , S . , a n d L . G e d a m u . 1 9 9 2 . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of a c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d h e a t s h o c k c o g n a t e H S C 7 1 g e n e f r o m r a i n b o w trout. E u r . J . B i o c h e m . , 2 0 4 : 8 9 3 - 8 9 8 . 169 A p p e n d i x 1 E x p o s u r e o f W i n t e r F l o u n d e r , S c u l p i n s , M u s s e l s a n d O y s t e r s to c r u d e o i l a n d a c r u d e o i l a n t i - a d h e s i v e I n t r o d u c t i o n H y d r o c a r b o n s a r e u b i q u i t o u s e n v i r o n m e n t a l c o n t a m i n a n t s that o r i g i n a t e f r o m i n d u s t r i a l e f f l u e n t s a n d t h e d i v e r s e b y - p r o d u c t s o f p e t r o l e u m e x p l o i t a t i o n . T h e c o m p o s i t i o n o f c r u d e oil is c o m p l e x a n d v a r i e s f r o m r e g i o n to r e g i o n . T h e m a j o r c o m p o n e n t s a r e a l i p h a t i c h y d r o c a r b o n s , c y c l i c p a r a f f i n h y d r o c a r b o n s , a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s , n a p h t h a - a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s , r e s i n s , a s p h a l t e n e s , h e t e r o a t o m i c c o m p o u n d s , a n d m e t a l l i c c o m p o u n d s . T h e a r o m a t i c a n d n a p h t h a n o - a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s a r e c o n s i d e r e d to b e t h e m o s t t o x i c c o m p o n e n t s in oil ( H e a t h , 1995) . T h e p r e v a l e n c e a n d p e r s i s t e n c e o f t h e s e c o m p o u n d s in t h e e n v i r o n m e n t is of m a j o r g l o b a l c o n c e r n f o r t h e e n v i r o n m e n t . T h e h s p r e s p o n s e is i n v o l v e d in p r o t e c t i n g o r g a n i s m s f r o m d a m a g e d u e to e x p o s u r e to a w i d e v a r i e t y of s t r e s s o r s . T h i s s t r e s s r e s p o n s e e n t a i l s t h e r a p i d s y n t h e s i s of a s e t p r o t e i n s k n o w n a s h e a t s h o c k p r o t e i n s n a m e d a s s u c h b e c a u s e t h e y a r e h e a t - i n d u c i b l e . A c q u i r e d t o l e r a n c e to e n v i r o n m e n t a l c h a n g e c o r r e l a t e s wi th t h e a c c u m u l a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s , a s e x p o s u r e to a m i l d s t r e s s r e g i m e c o n f e r s t h e abil i ty to s u r v i v e a s u b s e q u e n t a n d m o r e s e v e r e s t r e s s w h i c h w o u l d o t h e r w i s e b e le thal to t h e o r g a n i s m ( s e e L i n d q u i s t , 1 9 8 6 ) . P r o t e c t i o n b y h e a t s h o c k p r o t e i n s a l s o a p p e a r s to i n v o l v e c o m m o n t a r g e t s of e n v i r o n m e n t a l l y i n d u c e d d a m a g e , a s t o l e r a n c e is e n h a n c e d a s l o n g a s s t r e s s p r o t e i n s a r e e l e v a t e d a n d is i n d e p e n d e n t o f t h e s p e c i f i c c h e m i c a l o r p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s t r e s s o r ( S a n d e r s , 1993) . T h i s s t u d y i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f c r u d e oi l a n d a c r u d e oi l a n t i - a d h e s i v e c o m p o u n d d e v e l o p e d to n e u t r a l i z e c r u d e oi l s p i l l e d in a r c t i c m a r i n e e n v i r o n m e n t s o n t h e l e v e l s of h e a t s h o c k p r o t e i n s f o u n d in t h e 170 t i s s u e s of t w o b e n t h i c f i s h s p e c i e s a n d two s h e l l f i s h s p e c i e s s a m p l e d f r o m p r o t e c t e d m e s o c o s m s . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A n i m a l s T h e two f i s h s p e c i e s u s e d f o r t h e s e trials w e r e : (1) o n e y e a r o l d w i n t e r f l o u n d e r (Pseudopleuronectes americanus) a n d (2) o n e - y e a r - o l d s c u l p i n s (Myoxocephalus aenaeus). T h e s e f i s h w e r e c h o s e n b e c a u s e t h e y a r e n o n -m i g r a t o r y a n d t h e r e f o r e w o u l d b e c o t i n u o u s l y e x p o s e d to t o x i c a n t s in t h e v i c i n i t y of p o l l u t i o n s o u r c e s . T h e two m o l l u s k s in t h e s e tr ials w e r e : (1) t h e l o n g n e c k c l a m (Mya arenaria) a n d (2) t h e b l u e m u s s e l (Mytilus edulis). T h e s e o r g a n i s m s a r e e n d o g e n o u s to P o i n t - a u - P e r e , Q u e b e c , a n d w e r e r e a d i l y o b t a i n e d f r o m l o c a l f i s h e r s . M e s o c o s m s T h e p r o t e c t e d m e s o c o s m s u s e d for t h e s e tr ials a r e t h o s e d e s c r i b e d b y S i r o n et a l . ( 1993) . T h e s e h a b i t a t s a r e a g r o u p of f i v e d o u b l e - w a l l e d s t a i n l e s s s t e e l t a n k s ( in ternal d i m e n s i o n : h e i g h t = 3 m ; d i a m e t e r = 1.4 m ; v o l u m e = 3 .5 m 3 ) s h o w n in F i g u r e 4 . 1 . T h e r m o r e g u l a t e d c o o l a n t w a s c i r c u l a t e d b e t w e e n t h e two w a l l s of e a c h tank, a l l o w i n g c o n t r o l of w a t e r t e m p e r a t u r e s f o r e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d at n e a r - n a t u r a l c o n d i t i o n s . A m b i e n t a i r w a s b l o w n o v e r t h e s e a w a t e r s u r f a c e of e a c h tank, to s i m u l a t e w e a t h e r i n g p r o c e s s e s a n d c o n d i t i o n s s i m i l a r to t h o s e f o u n d in a n a t u r a l s u b a r c t i c e n v i r o n m e n t . S a m p l i n g a n d t e m p e r a t u r e m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d b y m e a n s o f t w o s a m p l i n g p o r t s l o c a t e d o n t h e s i d e w a l l o f e a c h t a n k , at 1 m a n d 2 m d e p t h s . T h e s e e x t e r i o r t a n k s w e r e e x p o s e d to n a t u r a l p h o t o p e r i o d . A e r a t i o n of t h e w a t e r c o l u m n w a s p r o v i d e d b y a c o n t i n u o u s s t r e a m of air b u b b l e s e n t e r i n g t h r o u g h t h e 2 - m s a m p l i n g p o r t o f e a c h t a n k . T h e b u b b l i n g i n d u c e d a t u r b u l e n t m i x i n g s u f f i c i e n t to h o m o g e n i z e t h e 171 e n t i r e w a t e r c o l u m n . S e a w a t e r s u p p l i e d to t h e t a n k s w a s d r a w n f r o m t h e e s t u a r y at P o i n t e - a u - P e r e , at a d e p t h of 5 m . T h i s s e a w a t e r w a s f i l t e r e d t h r o u g h a g r a v e l b e d a s it w a s p u m p e d to t h e t a n k s . S a l i n i t y o f t h e s e a w a t e r v a r i e d b e t w e e n 2 6 . 5 a n d 27 .1 %o a n d t h e t e m p e r a t u r e v a r i e d f r o m 6.1 to 8 .9 6 C . E a c h of t h e f o u r m e s o c o s m s h o u s e d f r e e - s w i m m i n g w i n t e r f l o u n d e r a n d s c u l p i n s , 3 0 of e a c h s p e c i e s . R e c t a n g u l a r p o l y p r o p y l e n e b a s k e t s , m e a s u r i n g 4 0 c m b y 5 0 c m a n d 2 0 c m d e e p c o n t a i n i n g s e d i m e n t c o l l e c t e d f r o m t h e inter t idal a r e a a d j a c e n t to t h e r e s e a r c h s t a t i o n at P o i n t e - a u x - P e r e , w e r e s e e d e d w i t h 2 0 m u s s e l s a n d 2 0 c l a m s a n d s u s p e n d e d 1 m f r o m t h e b o t t o m o f e a c h m e s o c o s m . T h e s e b a s k e t s w e r e p u l l e d u p to t h e s u r f a c e to s a m p l e t h e m u s s e l a n d c l a m s . T o d e t e r m i n e if t h e t i s s u e s of w i n t e r f l o u n d e r , s c u l p i n s , m u s s e l s o r c l a m s h a d a h e a t s h o c k p r o t e i n r e s p o n s e w h e n c h r o n i c a l l y e x p o s e d to c r u d e o i l , c r u d e oil a n t i - a d h e s i v e o r t h e c o m b i n a t i o n of b o t h c r u d e oi l a n d a n t i - a d h e s i v e , t h e f i s h a n d m o l l u s k s w e r e h e l d i n f o u r s e p a r a t e m e s o c o s m s r e c e i v i n g e s t u a r i n e s e a w a t e r a n d e x p o s e d to f o u r d i f ferent t r e a t m e n t s . O n e m e s o c o s m r e c e i v e d 5 0 0 p p m of c r u d e oil " F o r t i s " , a t y p e of c r u d e oi l that is r e g u l a r l y t r a n s p o r t e d b y t a n k e r a l o n g t h e St . L a u r e n c e S e a w a y a n d that p e r i o d i c a l l y r e a c h e s t h e r o c k y s h o r e s of t h e s e a w a y d u e to s p i l l s o r t a n k e r b i l g e d i s c h a r g e . T h e s e c o n d m e s o c o s m r e c e i v e d 5 0 0 p p m of t h e c r u d e oi l a n t i - a d h e s i v e c o m p o u n d , w h i c h w a s d e v e l o p e d to n e u t r a l i z e c r u d e oil f l o a t i n g in a r c t i c m a r i n e e n v i r o n m e n t s . T h e t h i r d m e s o c o s m r e c e i v e d 5 0 0 p p m o f c r u d e oi l a n d 5 0 0 p p m o f t h e a n t i -a d h e s i v e c o m p o u n d . T h e f o u r t h m e s o c o s m w a s t h e c o n t r o l a n d r e c e i v e d a m b i e n t s e a w a t e r f r o m t h e e s t u a r y . T i s s u e s a m p l i n g A l l f i s h w e r e p i t h e d pr ior to e x c i s i n g t h e t i s s u e s . G i l l a r c h e s , l iver , a n d s k e l e t a l m u s c l e s a m p l e s w e r e e x c i s e d f r o m 1 0 f i s h that h a d b e e n h e l d in t h e 172 m e s o c o s m s f o r 3 m o n t h s . E a c h f i s h w a s m e a s u r e d f o r l e n g t h a n d w e i g h t a n d t h e n f o u r gill a r c h e s , a p p r o x i m a t e l y 1 g of l iver a n d 1 g o f s k e l e t a l m u s c l e w e r e e x c i s e d f r o m e a c h f i s h . G i l l a n d m a n t l e t i s s u e s w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e m o l l u s k s b y s e p a r a t i n g t h e v a l v e s a n d e x c i s i n g t h e two t i s s u e s t o g e t h e r , t a k i n g c a r e not to c o n t a m i n a t e s a m p l e s wi th d e b r i s o r a d d u c t o r m u s c l e t i s s u e . A l l t i s s u e s w e r e i m m e d i a t e l y p l a c e d in 1 . 5 - m L c o n i c a l E p p e n d o r f t u b e s a n d w e r e f r o z e n o n d r y i c e . T h e e n t i r e e x c i s i o n p r o c e d u r e w a s n o r m a l l y p e r f o r m e d in l e s s t h a n 2 m i n . T h e t i s s u e s w e r e s t o r e d at - 2 0 ° C until t h e y w e r e p r o c e s s e d f o r S D S - P A G E a n d W e s t e r n blot . T h e p r o t o c o l s f o r t i s s u e s a m p l e p r e p a r a t i o n , t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d p r o t e i n a s s a y , S D S - P A G E , C o o m a s s i e s t a i n i n g , t r a n s f e r r i n g p r o t e i n s to m e m b r a n e s a n d W e s t e r n blot t ing a r e d e s c r i b e d in t h e G e n e r a l M a t e r i a l s a n d M e t h o d s s e c t i o n ( C h a p t e r 2) . R e s u l t s T h e r e s u l t s f r o m t h e s e tr ials s h o w e d that n o n e o f t h e t h r e e t r e a t m e n t s h a d s i g n i f i c a n t e f f e c t s o n a n y h e a t s h o c k p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s f o u n d in t i s s u e s of t h e f i s h o r s h e l l f i s h s a m p l e d d u r i n g t h e s e tr ials ( s e l e c t e d d a t a s h o w i n g l a c k o f d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t g r o u p s a r e o m i t t e d a n d will b e i n c l u d e d in f i n a l t h e s i s draft) . D i s c u s s i o n T h e l a c k o f d i f f e r e n c e in h e a t s h o c k p r o t e i n l e v e l s f o u n d in t h e t i s s u e s of f i s h a n d s h e l l f i s h e x p o s e d to t h e d i f ferent t r e a t m e n t s s u g g e s t s that t h e o r g a n i s m s e x p o s e d to t h e s e di f ferent t r e a t m e n t s d i d n o t e x p e r i e n c e s u f f i c i e n t s t r e s s to i n d u c e t h e p r o t e i n d e n a t u r a t i o n , p r o p o s e d a s t h e t r i g g e r f o r a c t i v a t i o n of h e a t s h o c k g e n e s ( H i g h t o w e r , 1 9 8 0 ; A n a t h a n et a l . , 1 9 8 6 ) . 173 Acknowledgments T h e c o l l a b o r a t i o n o f D r s . C . A u d e t a n d J . P e l l e r i n - M a s s i c o t t e . o f t h e Institut n a t i o n a l d e l a r e s e a r c h s c i e n t i f i q u e , R i m o u s k i , Q u e . , w h o p r o v i d e d t h e f i s h a n d s h e l l f i s h t i s s u e s a m p l e s , u s e d f o r this s t u d y is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h e l a b o r a t o r y a s s i s t a n c e o f P . A c k e r m a n a n d R . F o r s y t h a s w e l l a s t h e c o l l a b o r a t i o n of D r . B . F i n l a y is g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . Literature cited A n a n t h a n , J . , G o l d b e r g , A . L . a n d R . V o e l l m y , 1 9 8 6 . A b n o r m a l p r o t e i n s s e r v e a s e u k a r y o t i c s t r e s s s i g n a l s a n d t r i g g e r t h e a c t i v a t i o n o f h e a t s h o c k g e n e s . S c i e n c e , 2 3 2 : 5 2 2 - 5 2 4 . H e a t h , A . G . 1 9 9 5 . W a t e r p o l l u t i o n a n d f i s h p h y s i o l o g y . C R C P r e s s , L e w i s p u b l i s h e r s , N e w Y o r k . H i g h t o w e r , L . E . 1 9 8 0 . C u l t u r e d a n i m a l c e l l s e x p o s e d to a m i n o a c i d a n a l o g u e s a n d p u r o m y c i n r a p i d l y s y n t h e s i z e s e v e r a l p o l y p e p t i d e s . J . C e l l . P h y s i o l . , 1 0 3 : 4 0 7 - 4 2 7 . L i n d q u i s t , S . 1 9 8 6 . T h e h e a t s h o c k r e s p o n s e . A n n . R e v . B i o c h e m . , 5 5 : 1 1 5 1 - 9 1 . S a n d e r s , B . M . a n d L . S . M a r t i n . 1 9 9 3 . S t r e s s p r o t e i n s a s b i o m a r k e r s o f c o n t a m i n a n t e x p o s u r e in a r c h i v e d e n v i r o n m e n t a l s a m p l e s . S c i . T o t . E n v i r o n . , 1 3 9 / 1 4 0 : 4 5 9 - 4 7 0 . S i r o n , R . , P e l e t i e r , E . , D e l i l l e , D . a n d S . R o y . 1 9 9 3 . F a t e a n d e f f e c t s o f d i s p o e r s e d c r u d e o i l u n d e r i c y c o n d i t i o n s s i m u l a t e d in m e s o c o s m s . M a r . E n v i r o n . R e s . , 3 5 : 2 7 3 - 3 0 2 . 174 F i g u r e A p p . 1 D i a g r a m s o f a s i n g l e a n d a b a n k o f f i v e p r o t e c t e d m a r i n e m e s o c o s m s . P r o t e c t e d e x p e r i m e n t a l m e s o c o s m s at t h e Institut N a t i o n a l d e la R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e ( I N R S ) w e t l a b o r a t o r y a r e l o c a t e d a l o n g t h e St . L a u r e n c e E s t u a r y at R i m o u s k i , Q u e b e c . S e a w a t e r d r a w n f r o m a d e p t h o f 5 m h a d t y p i c a l e s t u a r i n e c h a r a c t e r i s t i c s wi th s a l i n i t y a n d t e m p e r a t u r e r a n g i n g f r o m 2 6 - 2 7 %o a n d 8 - 9 ° C , r e s p e c t i v e l y . 175 1 OUTDOOR DECK 2 SAMPLING PORTS AND PROBES 3 SEDIMENT TRAP 4 BENTHOS GRID 5 SURFACF VENTILATION 6 THERMOSTATEO DOUBLE-WAl. 7 INDOOR SAMPLING ROOM 

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