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CA²⁺-activated potassium channels in smooth muscle cell from cerebral artery of adult rat 1992

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1.0086586.ris

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CA2+ACTIVATED POTASSIUM CHANNELS IN SMOOTH MUSCLE CELL FROM CEREBRAL ARTERY OF ADULT RAT By YIHONG WANG M. D., Beijing Second Medical College, 1983 M. Sc., Peking Union Medical College, 1985 A THESIS SUBMIT thD IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY in THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES FACULTY OF MEDICINE DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY We accept this thesis as conforming the required standard THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA April 1992 © Yihong Wang, 1992 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of ph f(( 7 The University of British Columbia Vancouver, Canada Date __________________ DE-6 (2/88) A b s t r a c t P a t c h c l a m p m e t h o d s w e r e u s e d t o s t u d y t h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f C a2 + - a c t i v a t e d p o t a s s i u m ( K C a ) c h a n n e l s i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( C V S M C s ) d e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a l a r t e r i e s o f a d u l t r a t s . P r o c e d u r e s w e r e d e v e l o p e d f o r t h e e n z y m a t i c d i s s o c i a t i o n o f C V S M C s f r o m c e r e b r a l a r t e r i e s . D i s s o c i a t e d c e l l s w e r e m a i n t a i n e d a t 4 ° C o r c u l t u r e d a t 3 7 ° C f o r 1 - 3 d a y s p r i o r t o u s e . C V S M C s w e r e i d e n t i f i e d u s i n g a m o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t h m u s c l e a - a c t i n . T h e c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2 w a s e m p l o y e d t o m e a s u r e t h t r e s t i n g a n d s e r o t o n i n ( 5 - H T ) s t i m u l a t e d l e v e l s o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , [ C a2 + ] i n t h e s e c e l l s . A r e s t i n g [ C a2 + ] i l e v e l o f 4 1 j 5 . 6 n M w a s o b t a i n e d f r o m a t o t a l o f 1 1 0 C V S M C s i n c u l t u r e . S e r o t o n i n ( 5 - H T , 1 0 n M t o 1 0 0 M ) i n d u c e d a t r a n s i e n t i n c r e a s e o f [ C a2+ J i a b o v e r e s t i n g l e v e l s . T h e e f f e c t s o f t h r e e k n o w n b l o c k e r s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2 + c h a n n e l s , n i f e d i p i n e , L a 3 + a n d C o2 + w e r e t e s t e d b y c o a p p l i c a t i o n w i t h 5 - H T . I t w a s f o u n d t h e n e i t h e r 1 0 m M L a C 1 3 n o r 1 0 m M C 0 C 1 2 r e d u c e d t h e r i s e i n [ C a2 + f t e v o k e d b y a p p l i c a t i o n o f 1 p . . M 5 - H T . N i f e d i p i n e ( 1 0 M ) a l s o f a i l e d t o s i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h e r i s e i n [ C a2 + ] i a c t i v a t e d b y 1 M 5 - H T . T h e e f f e c t s o f t h e p a r t i a l l y s e l e c t i v e 5 - H T 2 r e c e p t o r a n t a g o n i s t , k e t a n s e r i n ( 5 n M ) r e v e r s i b l y a t t e n u a t e d t h e 5 - H T r e s p o n s e i n a l l c e l l s t e s t e d . T h e e f f e c t o f 5 - H T o n [ C a2 + J i w a s c l e a r l y d o s e - d e p e n d e n t a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f 5 - H T p r o d u c i n g a h a l f - m a x i m a l i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i w a s f o u n d t o b e 1 0 n M . D u r i n g c e l l - a t t a c h e d p a t c h c l a m p r e c o r d i n g s f r o m C V S M C s k e p t a t 4 ° C u n t i l u s e , 5 - H T ( 1 - 1 0 p . M ) i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f i n w a r d l y d i r e c t e d , 8 - 1 0 p A s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s s t u d i e d a t a p i p e t t e p o t e n t i a l o f 0 m V . 5 - H T ( 1 0 - 1 0 0 p . M ) a l s o i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f b r i e f b i p h a s i c c u r r e n t s p i k e s w i t h p e a k - t o - p e a k a m p l i t u d e o f 1 0 p A . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t i s o l a t e d C V S M C s r e t a i n e d U e l e c t r o - r e s p o n s i v e n e s s t o 5 - H T a f t e r 2 - 3 d a y s i n v i t r o . D u r i n g w h o l e - c e l l , c u r r e n t c l a m p r e c o r d i n g s f r o m t h e s e c e l l s , t h e r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l o f C V S M C s w a s f o u n d t o b e - 4 1 ± 1 1 . 7 m V . A p p l i c a t i o n o f s t r o n g d e p o l a r i z i n g s t i m u l i e v o k e d o n l y s m a l l ( 1 0 - 1 5 m V ) r e g e n e r a t i v e r e s p o n s e s a n d a c t i o n p o t e n t i a l s w e r e n o t o b s e r v e d . W h e n m e a s u r e d a t z e r o a p p l i e d c u r r e n t , t h e s l o p e m e m b r a n e r e s i s t a n c e , R m o f C V S M C s w a s 3 . 2 ± 0 . 4 8 G o . T h e a v e r a g e m e m b r a n e t i m e c o n s t a n t , r m w a s 7 8 ± 2 6 m s a n d c e l l c a p a c i t a n c e , C m w a s 2 4 ± 2 . 3 p F . I s o l a t e d , i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m C V S M C s d i s p l a y e d t w o c l a s s e s o f K C a c h a n n e l . T h e f i r s t c l a s s o f c h a n n e l s , d e s i g n a t e d a s K ( C a ) L c h a n n e l s , h a d a m e a n c o n d u c t a n c e o f 2 0 7 ± 1 0 p S i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K C 1 s o l u t i o n s . T h e p e r m e a b i l i t y o f t h e o p e n c h a n n e l t o p o t a s s i u m w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e G o l d m a n - H o d g k i n - K a t z c o n s t a n t f i e l d e q u a t i o n a t P K = 3 . 9 x 1 0 - 1 3 c m/ s . T h e s e c h a n n e l s s h o w e d a h i g h d e g r e e o f s e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s ( P N a / P K < 0 . 0 5 ) a n d f o r p o t a s s i u m o v e r c e s i u m i o n s ( P C s / P K < 0 . 0 5 ) . C s + c a u s e d a v o l t a g e - d e p e n d e n t f l i c k e r i n g b l o c k o f o p e n K ( C a ) L c h a n n e l s . T h e e f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] i o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y a n d o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s o f K ( C a ) L c h a n n e l s w a s s t u d i e d . T h e t h r e s h o l d l e v e l o f [ C a2 + ] j a t w h i c h c h a n n e l o p e n i n g s w e r e j u s t d e t e c t a b l e w a s a b o u t 0 . 0 1 j I M . T h e m e a n v a l u e o f [ C a2 + ] j a t w h i c h s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e o p e n h a l f o f t h e t i m e , P o ( o . 5 ) w a s 2 3 M w h e n t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( V ) w a s + 4 0 m V . O v e r t h e r a n g e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l s ( - 8 0 t o + 8 0 m V ) a n d [ C a2 + J i l e v e l s ( 0 . 0 1 M t o 1 m M ) s t u d i e d , o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s f o r K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e w e l l f i t t e d b y t h e s u m o f t w o e x p o n e n t i a l s , i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a t l e a s t t w o k i n e t i c a l l y d i s t i n g u i s h 4 b l e o p e n s t a t e s f o r t h i s c h a n n e l . R a i s i n g [ C a2 + ] i i n c r e a s e d t h e t i m e c o n s t a n t o f t h e s l o w c o m p o n e n t , w h i l e h a v i n g n o e f f e c t o n t h a t o f t h e f a s t c o m p o n e n t . T h e e f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y a n d o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n w e r e a l s o s t u d i e d . A t l o w [ C a2 + I i ( < 5 0 M ) , a 1 4 m V 1 1 1 d e p o l a r i z a t i o n i n d u c e d a n e - f o l d i n c r e a s e i n P o . A t [ C a2 + ] j > 5 0 M , P o a p p r o a c h e d u n i t y a n d s h o w e d l i t t l e f u r t h e r i n c r e a s e o n m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n . A t [ C a2+ ] j = 1 0 P M , t h e v a l u e o f t h e s l o w t i m e c o n s t a n t d e r i v e d f r o m o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d a t p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s , w h i l e t h a t o f t h e f a s t t i m e c o n s t a n t w a s u n a f f e c t e d . T h e e f f e c t o f t e t r a e t h y l a m m o n i u m i o n s ( T E A ) o n c u r r e n t f l o w i n K ( C a ) L c h a n n e l s w a s s t u d i e d . T E A c a u s e d a d o s e - d e p e n d e n t , r e v e r s i b l e r e d u c t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f c u r r e n t i n t h e K ( C a ) L c h a n n e l s , w h e n a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c f a c e o f t h e m e m b r a n e . T h i s e f f e c t w a s c h a r a c t e r i z e d b y a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t , K d o f 0 . 8 3 ± 0 . 0 9 m M a t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f + 4 0 m V , a n d w i t h [ C a2 + = 1 0 0 , L M . T E A h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s a d o p t i n g t h e o p e n s t a t e . T h e s e c o n d c l a s s o f K C a c h a n n e l s , d e s i g n a t e d a s K ( C a ) I c h a n n e l s , w a s d e t e c t e d o n a m i n o r i t y o f p a t c h e s s t u d i e d . K ( C a ) I c h a n n e l s s h o w e d a c o n d u c t a n c e o f 9 2 ± 2 . 6 p S i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K C 1 s o l u t i o n s . T h e p o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y o f t h e o p e n c h a n n e l w a s 1 . 7 5 . ± 0 . 1 2 x 1 0 - 1 3 c m / s . K ( C a ) I c h a n n e l s a r e h i g h l y s e l e c t i v e f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s ( P N a / P K < 0 . 0 5 ) a n d f o r p o t a s s i u m o v e r c e s i u m ( P C s / P K < 0 . 0 5 ) . T h e o p e n p r o b a b i l i t y , P o o f K ( C a ) J c h a n n e l s i n c r e a s e d a s [ C a2 + ] j w a s e l e v a t e d o v e r t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e 0 . 1 M t o 1 0 0 M . P o a l s o i n c r e a s e d o n d e p o l a r i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p a t c h . T E A c a u s e d a r e v e r s i b l e , d o s e - d e p e n d e n t r e d u c t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f c u r r e n t i n t h e K ( C a ) I c h a n n e l , w h e n a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e ( K d = 0 . 3 1 m M ± 0 . 0 3 ) . T h e p r e s e n t p r e p a r a t i o n r e p r e s e n t s a u s e f u l m o d e l w i t h w h i c h t o s t u d y t h e i o n i c c o n d u c t a n c e s p r e s e n t i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . T h i s p r e p a r a t i o n c a n a l s o b e e m p l o y e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f v a s o c o n s t r i c t o r s a n d v a s o d i l a t o r s o n c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e c e r e b r a l v a s c u l a t u r e . l v Table of Contents Abstract ii List of Figures ix List of Tables xiii List of Abbreviations xiv Acknowledgements xvi CHAPTER 1: INTRODUCIION 1 1.1.The role of vascular smooth muscle cells (VSMCS) in the control of blood flow 1 1.1.1.Contractile mechanisms in VSMCs 2 1.1.2.Factors influencing [Ca2+]i in VSMCs 3 1.1.3.Hormonal and neural regulation of contraction in VSMCs 5 1.1.4.Vasoconstrictor action of serotonin on VSMCs 7 1.2.Electrophysiological properties of VSMCs 8 1.3.Potassium currents in the membrane of VSMCs 10 1.3.1.The delayed (outward) rectifier K-current 11 1.3.2.The transient outward current (A-current) 11 1.3.3.Inwardly rectifying K-currents 12 1.3.4.ATP-sensitive K-current 14 1.3.5.ça-activated potassium channels 14 1.4.Calcium-activated K-channels 15 1.4.1.Large conductance calcium-activated potassium channels 15 1.4.2.Intermediate conductance calcium-activated potassium channels 18 1.4.3.Small conductance calcium-activated potassium channels 19 1.4.4.Modulation of ionic currents through KCa channels 20 1.5.Rationale 21 V C H A P T h R 2 : E X P E R I M E N T A L P R O C E D U R E S . 2 4 2 . 1 . D i s p e r s a l o f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s 2 4 2 . 1 . 1 . C o v e r s l i p p r e p a r a t i o n 2 7 2 . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f i s o l a t e d C V S M C s 2 8 2 . 2 . 1 . M a s s o n t r i c h r o m e t e s t 2 8 2 . 2 . 2 . I m m u n o f l o u r e s c e n t a n d i n i m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g o f C V S M C s 2 8 2 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n i s o l a t e d C V S M C s 3 0 2 . 3 . 1 . L o a d i n g o f t h e f u r a - 2 - A M i n d i c a t o r i n t o C V S M C s 3 0 2 . 3 . 2 . C e l l c h a m b e r a n d p e r f u s i o n s y s t e m f o r f u r a - 2 m e a s u r e m e n t s 3 1 2 . 3 . 3 . M e a s u r e m e n t o f [ C a2+ ] j i n C V S M C s 3 2 2 . 3 . 4 . C a l c u l a t i o n o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n C V S M C s 3 8 2 . 3 . 5 . C a l i b r a t i o n o f t h e f u r a - 2 s y s t e m f o r d e t e r m i n a t i o n o f [ C a2+ ] j i n C V S M C s 3 9 2 . 4 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o n i s o l a t e d C V S M C s 3 9 2 . 4 . 1 . P r e p a r a t i o n o f p a t c h e l e c t r o d e s 4 0 2 . 4 . 2 . G r a v i t y p e r f u s i o n s y s t e m f o r a p p l i c a t i o n o f e x p e r i m e n t a l s o l u t i o n s 4 3 2 . 4 . 3 . E x p e r i m e n t a l s o l u t i o n s 4 4 2 . 4 . 4 . A n a l y s i s o f p a t c h c l a m p d a t a 4 5 C A H P T E R 3 : R E S U L T S 5 0 3 . 1 . M o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f C V S M C s i n v i t r o 5 0 3 . 2 . I n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m o f C V S M C s i n c u l t u r e 5 3 3 . 2 . 1 . R e s t i n g [ C a2+ ] i o f C V S M C s i n c u l t u r e 5 3 v i 3 . 2 . 2 . E f f e c t o f s e r o t o n i n o n [Ca2 + ] j o f C V S M C s i n c u l t u r e. 5 3 3 . 3 . E l e c t r i c a l properties o f i s o l a t e d C V S M C s 7 8 3 . 3 . 1 . B a s i c e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l properties o f i s o l a t e d C V S M C s s t u d i e d w i t h c e l l - a t t a c h e d a n d w h o l e - c e l l , c u r r e n t c l a m p r e c o r d i n g s 7 8 3 . 4 . K C a c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t membrane p a t c h e s e x c i s e d f r o m C V S M C s 9 4 3 . 4 . 1 . C o n d u c t a n c e a n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K(Ca)L c h a n n e l 9 7 3 . 4 . 2 . E f f e c t o f K+ replacement b y C s + o n c u r r e n t f l o w t h r o u g h K(Ca)L c h a n n e l s 1 0 9 3 . 4 . 3 . E f f e c t o f v a i y i n g [Ca2+]i o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f K(Ca)L c h a n n e l s 1 1 5 3 . 4 . 4 . E f f e c t o f v a r y i n g [Ca2+]j o n t h e o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n o f K(Ca)L c h a n n e l s 1 1 8 3 . 4 . 5 . E f f e c t o f m e m b r a n e potential o n t h e open p r o b a b i l i t y o f K(Ca)L c h a n n e l s 1 2 8 3 . 4 . 6 . E f f e c t o f membrane potential o n t h e o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n o f K(Ca)L c h a n n e l s 1 3 1 3 . 4 . 7 . 1 f f e c t o f i n t e r n a l l y a p p l i e d TEA o n K(Ca)L c h a n n e l s 1 3 4 3 . 5 . K ( C a ) I c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m i s o l a t e d C V S M C s 1 4 1 CHAPTER 4 : D I S C U S S I O N 1 6 2 4 . 1 . M o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f C V S M C s i n v i t r o 1 6 2 4 . 2 . I n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i n c u l t u r e d C V S M C s 1 6 4 4 . 2 . 1 . M o d u l a t i o n o f [Ca2+]i b y s e r o t o n i n i n C V S M C s 1 6 5 4 . 3 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l properties o f i s o l a t e d C V S M C s 1 6 7 4.4.Ca2+ - a c t i v a t e d K c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s 1 7 0 4 . 4 . 1 . P r o p e r t i e s o f K ( C a ) L c h a n n e l s 1 7 1 v u 4 . 4 . 1 . 1 . I o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l . 1 7 1 4 . 4 . 1 . 2 . C a2+ d e p e n d e n c e o f K ( C a ) L c h a n n e l o p e n i n g 1 7 4 4 . 4 . 1 . 3 . V o l t a g e d e p e n d e n c e o f o p e n i n g o f K ( C a ) L c h a n n e l s 1 7 8 4 . 4 . 1 . 4 . B l o c k a d e o f K ( C a ) L c h a n n e l s b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A 1 7 9 4 . 4 . 2 . P r e p e r t i e s o f K ( C a ) I c h a n n e l s 1 8 1 4 . 4 . 3 . T h e p o s s i b l e r o l e o f K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s 1 8 2 4 . 5 . C o n c l u s i o n s a n d s i g n i f i c a n c e 1 8 4 R E F E R E N C E S 1 8 7 y i n L i s t o f F i g u r e s F i g u r e 1 . V e n t r a l a s p e c t o f t h e a d u l t r a t b r a i n s h o w i n g p o s i t i o n s o f t h e b a s i l a r , p o s t e r i o r c o m m u n i c a t i n g , p o s t e r i o r a n d m i d d l e c e r e b r a l a r t e r i e s u s e d i n t h i s s t u d y 2 5 F i g u r e 2 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e s y s t e m f o r m e a s u r i n g [ C a2 + I i u s i n g t h e f l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2 3 4 F i g u r e 3 . E x c i t a t i o n s p e c t r a o f 1 m M f u r a - 2 3 6 F i g u r e 4 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e p r o c e d u r e s u s e d t o m a k e t h e w h o l e - c e l l a n d i n s i d e - o u t p a t c h r e c o r d i n g s r e p o r t e d i n t h i s s t u d y 4 1 F i g u r e 5 . . . B l o c k d i a g r a m o f t h e p a t c h c l a m p r e c o r d i n g s y s t e m 4 6 F i g u r e 6 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d r a t c e r e b r a l a r t e r y s m o o t h m u s c l e c e l l s i n v i t r o , t r e a t e d w i t h t h e M a s s o n t r i c h r o m e s t a i n 5 1 F i g u r e 7 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l e a - a c t i n a n d v i s u a l i z e d u s i n g a f l o u r e s c e n t m a r k e r 5 4 F i g u r e 8 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l e a - a c t i n a n d v i s u a l i z e d u s i n g a p e r o x i d a s e m a r k e r 5 6 F i g u r e 9 . T h e i n c r e a s e i n [ C a2+ ] i t r i g g e r e d b y a p p l i c a t i o n o f 5 - H T t o a C V S M C 5 9 F i g u r e 1 0 . A v e r a g e t i m e c o u r s e o f t h e i n c r e a s e i n [ C a2+ ] i t r i g g e r e d b y a p p l i c a t i o n o f 5 - H T t o a n i s o l a t e d C V S M C s 6 1 F i g u r e 1 1 . I n c r e a s e i n [ C a2 + ] i t r i g g e r e d b y a p p l i c a t i o n o f K + t o a C V S M C F i g u r e 1 2 . E f f e c t o f L a 3 + a n d C o 2 + o n s e r o t o n i n - i n d u c e d c h a n g e s i n [ C a 2 + ] j o f a C V S M C 6 5 F i g u r e 1 3 . E f f e c t o f n i f e d i p i n e o n t h e r i s e i n [ C a2+ ] i t r i g g e r e d b y 5 - H T i n a C V S M C 6 7 l x F i g u r e 1 4 . E f f e c t o f k e t a n s e r i n o n t h e r i s e i n [ C a2 + J i e v o k e d b y 5 - H T i n a C V S M C a f t e r 2 d a y s i n v i t r o 7 1 F i g u r e 1 5 . D e c r e a s i n g r e s p o n s i v e n e s s o f a C V S M C t o r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s o f 5 - H T 7 3 F i g u r e 1 6 . L o g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h o w i n g t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i t r i g g e r e d b y v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f 5 - H T 7 5 F i g u r e 1 7 . S p o n t a n e o u s , s m a l l a m p l i t u d e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s r e c o r d e d i n c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s 7 8 F i g u r e 1 8 . L a r g e a m p l i t u d e , i n w a r d l y d i r e c t e d s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s e v o k e d i n a c e l l - a t t a c h e d p a t c h d u r i n g a p p l i c a t i o n o f 5 - H T 8 0 F i g u r e 1 9 . B i p h a s i c c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m a C V S M C u s i n g t h e c e l l - a t t a c h e d c o n f i g u r a t i o n 8 2 F i g u r e 2 0 . R e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l s r e c o r d e d f r o m C V S M C s 8 5 F i g u r e 2 1 . V o l t a g e c h a n g e s i n d u c e d b y a p p l i c a t i o n o f c o n s t a n t c u r r e n t p u l s e s i n a C V S M C s t u d i e d u s i n g t h e w h o l e - c e l l , c u r r e n t c l a m p t e c h n i q u e 8 7 F i g u r e 2 2 . C u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s h i p s o b t a i n e d i n t h e w h o l e - c e l l , c u r r e n t c l a m p r e c o r d i n g m o d e 8 9 F i g u r e 2 3 . S e m i - l o g a r i t h m i c p l o t o f t h e d e c a y p h a s e o f a h y p e r p o l a r i z i n g e l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l e v o k e d i n a C V S M C u n d e r w h o l e c e l l , c u r r e n t - c l a m p c o n d i t i o n s 9 1 F i g u r e 2 4 . P l o t o f c u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p s o f s i n g l e K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l c u r r e n t s f r o m p a t c h e s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l p o t a s s i u m s o l u t i o n s 9 4 F i g u r e 2 5 . S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s f l o w i n g t h r o u g h a s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l i n a n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h v o l t a g e - c l a m p e d a t v a r i o u s p o t e n t i a l s 9 7 x F i g u r e 2 6 . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s f o r K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s o b t a i n e d f r o m a n i n s i d e - o u t p a t c h 9 9 f i g u r e 2 7 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u m s o l u t i o n s 1 0 1 F i g u r e 2 8 . E f f e c t s o f N a + o r C s + r e p l a c e m e n t o f K + o n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s i n K ( C a ) L c h a n n e l s 1 0 4 F i g u r e 2 9 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s w h e n 8 0 m M K C 1 a t c y t o p l a s m i c o r e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e w a s r e p l a c e d b y N a C l 1 0 6 F i g u r e 3 0 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s w h e n 8 0 m M K C 1 a t c y t o p l a s m i c o r e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e w a s r e p l a c e d b y C s C 1 1 1 0 F i g u r e 3 1 . S i n g l e - c h a n n e l K ( C a ) L c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m a n i n s i d e - o u t p a t c h a t d i f f e r e n t f i l t e r b a n d w i d t h s 1 1 2 F i g u r e 3 2 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] i o n t h e o p e n i n g o f K ( C a ) L c h a n n e l s 1 1 6 F i g u r e 3 3 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] i o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l 1 1 8 F i g u r e 3 4 . D i s t r i b u t i o n o f o p e n t i m e s f o r t h e K ( C a ) L c h a n n e l s t u d i e d i n a n i s o l a t e d p a t c h c o n t a i n i n g o n e a c t i v e c h a n n e l 1 2 1 F i g u r e 3 5 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] i o n t h e t i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n g o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s o f K ( C a ) L c h a n n e l s 1 2 4 F i g u r e 3 6 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] i o n r e l a t i v e n e m b e r o f o p e n i n g s o f K ( C a ) L c h a n n e l s g o v e r n e d b y t h e t i m e c o n s t a n t s r f a n d r s 1 2 6 F i g u r e 3 7 . D e p e n d e n c e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s o n m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d [ C a2 + I i 1 2 9 F i g u r e 3 8 . E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e t i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n g t h e o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s o f K ( C a ) L c h a n n e l s 1 3 2 x l F i g u r e 3 9 . B l o c k i n g e f f e c t o f i n t e r n a l T E A o n t h e K ( C a ) L c h a n n e l 1 3 4 F i g u r e 4 0 . D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e b l o c k o f c u r r e n t f l o w i n t h e K ( C a ) L c h a n n e l b y T E A 1 3 7 F i g u r e 4 1 . E f f e c t o f i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l 1 3 9 F i g u r e 4 2 . S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s f l o w i n g i n K ( C a ) I c h a n n e l s a t v a r i o u s m e m b r a n e p o t e n t i a l s 1 4 1 F i g u r e 4 3 . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d f o r K ( C a ) I c h a n n e l c u r r e n t s 1 4 4 F i g u r e 4 4 . C o n d u c t a n c e a n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l 1 4 6 F i g u r e 4 5 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] i o n t h e a c t i v i t y o f K ( C a ) I c h a n n e l s . . . 1 4 9 F i g u r e 4 6 . E f f e c t o f [ C a2 + ] j o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l 1 5 1 F i g u r e 4 7 . D e p e n d e n c e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) I c h a n n e l s o n m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d [ C a2 + ] i 1 5 3 F i g u r e 4 8 . B l o c k i n g e f f e c t o f T E A o n c u r r e n t f l o w i n t h e K ( C a ) I c h a n n e l 1 5 5 F i g u r e 4 9 . D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r b l o c k o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A 1 5 7 F i g u r e 5 0 . E f f e c t o f T E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l 1 5 9 x l i L i s t o f T a b l e s T a b l e I : T h e i n f l u e n c e o f C o2 + , L a 3 + , a n d n i f e d i p i n e o n t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i i n d u c e d b y 5 - H T i n c u l t u r e d r a t C V S M C s 6 9 T a b l e I I : C h a r a c t e r i s t i c s o f B K c h a n n e l s i n v a r i o u s p r e p a r a t i o n s 1 7 4 X I I ’ L i s t o f A b b r e v i a t i o n s [ C a2 + ] j : C o n c e n t r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m 4 - A P : 4 - a m i n o p y r i d i n e 5 - H T : 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e , s e r o t o n i n A C H : A c e t y i c h o l i n e A D P : A d e n o s i n e d i p h o s p h a t e A N O V A : A n a l y s i s o f v a r i a n c e A N P : A t r i a l n a t r i u r e t i c p e p t i d e A P : A c t i o n p o t e n t i a l A T P : A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e A T P a s e s : E n z y m e s t h a t c a t a l y z e t h e h y d r o l y s i s o f A T P c A M P : C y c l i c a d e n o s i n e - 3 ’ , 5 ’ - m o n o p h o s p h a t e c G M P : C y c l i c g u a n o s i n e - 3 ’ , 5 ’ - m o n o p h o s p h a t e C V S M C : C e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l C V S M C s C e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s D A B : 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e D A G : D i a c y i g l y c e r o l D M S O : D i m e t h y l s u l f o x i d e E B S S : E a r l ’ s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n E D R F : E n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r E G T A : E t h y l e n e g l y c o l - b i s Q 3 - a m i n o e t h y l e t h e r ) N , N , N ’ , N ’ - t e t r a a c e t i c a c i d F I T C : F l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e G - p r o t e i n : G u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n . G I P : G a s t r i c i n h i b i t o r y p e p t i d e H B S S : H a n k ’ s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n H E P E S : N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ’ - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d x i v 1 P 3 : I n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e K C a c h a n n e l : C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l K C a c u r r e n t : C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c u r r e n t K ( C a ) I c h a n n e l : I n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l K ( C a ) L c h a n n e l : L a r g e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l K G s o l u t i o n : P o t a s s i u m g l u t a m a t e s o l u t i o n M L C K : M y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s e M W : M o l e c u l a r w e i g h t P B S : P h o s p h a t e b u f f e r s a l i n e P I P 2 : L - - p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l d i p h o s p h a t e P K C : P r o t e i n k i n a s e C P L C : P h o s p h o l i p a s e C P o : O p e n p r o b a b i l i t y S E M : S t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n S M C : S m o o t h m u s c l e c e l l S M C s : S m o o t h m u s c l e c e l l s S R : S a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m T E A : T e t r a e t h y l a m m o n i u m T T X : . T e t r o d o t o x i n V S M C : V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l V S M C s : V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s x v Acknowledgements I wish to express my deepest gratitude to my supervisor, Dr. David A.Mathers, for his encouragement, knowledgeable direction, patience, and supportthroughout the course of research in his laboratory and during the preparation ofthis thesis. The confidence that Dr. Mathers showed in my abilities allowed meto continue this study at a time when my own confidence was waning, and enabled me to complete the work. I would like to thank other members of my thesis committee, Dr. RalphKeeler, Dr. Steve Kehi, and Dr. David Quastel for their valuable suggestions andconstructive comments which made this project interesting and relevant. I would like to express my sincere thanks to Dr. Kenneth G. Baimbridgefor providing me with laboratory equipment and chemicals for intracellular free calcium measurements. I thank Dr. Morley Sutter for his valuable advice and encouragement. Also thanks are due to those in the Department of Physiology for theirhelp and friendship. They are Dr. Alison Buchan, Dr. Tony Pearson, Dr. PeterVaughan, Mr. John Sariker, Mr. Joe Tay, Miss Stella Atmadja, and MissNarinder Dhatt. I especially thank Veronica Corvalan-Grossling for her many hours ofgraphic work on the computer. People working in the department administration, workshop and animal room were always very kind and helpful and I thank them very much. xvi T h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o m y p a r e n t s Z e n g g a o W a n g a n d Z h e n g z h u a n g Y a o , m y h u s b a n d P i n g a n d m y d a u g h t e r D i a n a f o r t h e i r e m o t i o n a l s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t . C h a p t e r 1 I n t r o d u c t i o n A l t e r e d c o n t r a c t i l i t y o f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( C V S M C s ) i s b e l i e v e d t o p l a y a r o l e i n s e v e r a l c e r e b r o v a s c u l a r d i s e a s e s o f c l i n i c a l i m p o r t a n c e ( M i c h e l . e t a l . 1 9 9 0 ) . T h e c o n t r a c t i l e s t a t e o f C V S M C s i s i n t u r n r e g u l a t e d b y t h e l e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m ( [ C a2+ ] i ) a n d b y t h e f l o w o f i o n i c c u r r e n t i n s e v e r a l t y p e s o f m e m b r a n e c h a n n e l s ( J o h n s e t a l . 1 9 8 7 ; T o m i t a 1 9 8 8 ; H a t h a w a y e t a l . 1 9 9 1 ) . A m o n g t h e s e a r e t h e s o - c a l l e d c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s ( K C a c h a n n e l s ) , w h i c h a r e p r o b a b l y i m p o r t a n t i n t h e m o d u l a t i o n o f c e l l r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d c e l l m e m b r a n e r e p o l a r i z a t i o n a f t e r e x c i t a t i o n ( T o m i t a 1 9 8 8 ; L a t o r r e e t a l . 1 9 8 9 ; E d w a r d s a n d W e s t o n 1 9 9 0 ; K o i b 1 9 9 0 ) . T o d a t e , h o w e v e r , m o s t d e t a i l e d s t u d i e s o n f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m a n d c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s h a v e b e e n p e r f o r m e d o n c e l l s i s o l a t e d f r o m p e r i p h e r a l v e s s e l s o r f r o m n o n v a s c u l a r t i s s u e s . T h e g o a l o f t h i s s t u d y , t h e r e f o r e w a s t o i n v e s t i g a t e u s i n g p a t c h c l a m p t e c h n i q u e s ( H a m i l l e t a l . 1 9 8 1 ) t h e p r o p e r t i e s o f K C a c h a n n e l s i n C V S M C s d e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a l v a s c u l a t u r e o f a d u l t r a t s : T h e c a l c i u m s e n s i t i v e d y e f u r a - 2 w a s a l s o u s e d t o s t u d y t h e l e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n t h e s e c e l l s . 1 . 1 . T h e r o l e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( V S M C s ) i n t h e c o n t r o l o f b l o o d f l o w . V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( V S M C s ) p l a y a p r e d o m i n a n t r o l e i n r e g u l a t i n g t h e b l o o d f l o w o f t h e b r a i n a n d o t h e r o r g a n s . T h e c o n t r a c t i o n a n d r e l a x a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l s i n t h e b l o o d v e s s e l w a l l c o n t r i b u t e t o t h e 1 m a i n t e n a n c e o f n o r m a l v a s c u l a r f u n c t i o n . T h e f o l l o w i n g p a r a g r a p h s s u m m a r i z e c u r r e n t k n o w l e d g e o f t h e b a s i c c o n t r a c t i l e m e c h a n i s m s f o u n d i n V S M C s . 1 . 1 . 1 . C o n t r a c t i l e m e c h a n i s m s i n V S M C s T h e c o n t r a c t i l i t y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i s d e p e n d e n t o n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t w o m a j o r t y p e s o f c o n t r a c t i l e p r o t e i n s , a c t i n a n d m y o s i n . M o s t i n v e s t i g a t o r s e n v i s a g e s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n i n t e r m s o f t h e s l i d i n g - f i l a m e n t m o d e l o r i g i n a l l y p r o p o s e d f o r s t r i a t e d m u s c l e ( H u x l e y 1 9 9 0 ) . I n t h i s m o d e l , t h e h e a d s o f m y o s i n m o l e c u l e s , w h i c h a r e b u n d l e d t o g e t h e r i n t o t h i c k ( m y o s i n ) f i l a m e n t s , u n d e r g o a c y c l e o f h i g h - a n d l o w - a f f i n i t y b i n d i n g t o t h i n f i l a m e n t s ( a c t i n , t r o p o m y o s i n a n d o t h e r p r o t e i n s ) i n a r e a c t i o n d r i v e n b y a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) h y d r o l y s i s . T e n s i o n g e n e r a t i o n o c c u r s a s a r e s u l t o f r o t a t i o n o f t h e h e a d s o f m y o s i n , w h i c h a r e b o u n d i n c r o s s - b r i d g e s t r u c t u r e s t o a c t i n m o l e c u l e s , f r o m a n a n g l e o f 9 0 0 t o 4 5 0 w i t h r e s p e c t t o t h e l o n g a x i s o f a c t i n - a n d m y o s i n - c o n t a i n i n g f i l a m e n t s . T h e d i r e c t i o n o f f o r c e g e n e r a t i o n i s p a r a l l e l e d t o t h e o r i e n t a t i o n o f t h e s e f i l a m e n t s . I n V S M C s , c o n t r a c t i o n m e d i a t e d b y m y o s i n a n d a c t i n f i l a m e n t s i s r e g u l a t e d b y C a2+ t h r o u g h a n u m b e r o f d i f f e r e n t m e c h a n i s m s ( B o l t o n 1 9 7 9 ; J o h n s e t a ! . 1 9 8 7 ; H a t h a w a y e t a l . 1 9 9 1 ) . T h e m o s t i m p o r t a n t o f t h e s e i n v o l v e s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f m y o s i n m o l e c u l e s ( A d e i s t e i n a n d S e l l e r s 1 9 8 7 ) . I n t h i s m e c h a n i s m , C a2 + b i n d s t o c a l m o d u l i n a n d t h e r e s u l t i n g c o m p l e x a c t i v a t e s t h e e n z y m e m y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s e ( M L C K ) , w h i c h i n t u r n c a t a l y z e s m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d i n i t i a t e s r a p i d s h o r t e n i n g . A f t e r d e p h o s p h o r y l a t i o n , t h e a c t o m y o s i n p a s s e s t h r o u g h a “ l a t c h ” s t a t e b a c k t o r e s t ( H a i a n d M u r p h y 1 9 8 9 ) . V a s c u l a r m y o s i n i s c o m p o s e d o f t w o h e a v y c h a i n s ( M W , 2 0 0 , 0 0 0 a n d 2 0 4 , 0 0 0 ) 2 and two sets of light-chain subunits [regulatory, or 20,000 Da, light chains (i.e., LC2O) and alkali, or 17,000 Da, light chains]. The serine-19 residue of LC2O is the site of phosphorylation by MLCK. Investigations with the fluorescent Ca2+ indicator fura-2 or the photoprotein aequorin have demonstrated that the level of free intracellular Ca2+ closely regulates the extent of LC2O phosphorylation (Rembold et al. 1988; Taylor et al. 1989). Phosphorylation of LC2O activates the ATPase activity actomyosin (Sellers 1985) initiating the cycling of cross- bridge formation and, hence, of contraction. The state of phosphorylation in smooth muscle myosin is also regulated by the opposing action of myosin phosphatase and by the modulation of MLCK activity. In vitro, MLCK can be phosphorylated by several protein kinases, including cyclic adenosine 3’,5’- monophosphate (cAMP)-dependent protein kinase (Payne et a!. 1986), cyclic guanosine 3’,5’-monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (Nishikawa et a!. 1984; Hathaway et a!. 1985), Ca2/calmodulin-dependent protein kinase II (Ikebe and Reardon 1990), and protein kinase C (Nishikawa et al. 1985). In vascular smooth muscle, tension can be maintained while LC2O dephosphorylation and [Ca2+] levels decrease. This mechanical state of tension maintenance with slowly cycling cross-bridges has been called the “latch state” by Hai and Murphy (1989). The latch state is energy efficient because tension is maintained at reduced ATP consumption. The molecular mechanisms that produce the latch state are unknown. Hai and Murphy (1989) hypothesized that dephosphorylation of LC2O while in a high-affinity binding conformation might alter the kinetics of cross-bridge detachment. Slowing of cross-bridge detachment would prolong high-affinity binding and tension. 1.1.2. Factors influencing [Ca2+]i in VSMCs 3 T h e g e n e r a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f t e n s i o n i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e a r e d e p e n d e n t o n p r o c e s s e s t h a t m o d u l a t e i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o f f r e e C a2 + . C a l c i u m m a y e n t e r t h e c y t o p l a s m i c c o m p a r t m e n t o f V S M C s i n a n u m b e r o f w a y s , i n c l u d i n g t r a n s - s a r c o l e m m a l e n t r y t h o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2 + c h a n n e l s , N a + - C a2+ e x c h a n g e , a n d r e c e p t o r - o p e r a t e d C a2+ c h a n n e l s . T h e d e p o l a r i z a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l s b y e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n , i n c r e a s e d e x t e r n a l p o t a s s i u m , o r v a r i o u s n e u r o t r a n s m i t t e r s e v o k e s a n i n w a r d c u r r e n t c a r r i e d b y C a2 + i o n s t h r o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2 + c h a n n e l s w h i c h s h a r e c e r t a i n f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s w i t h L - t y p e C a2+ c h a n n e l s o f s t r i a t e d m u s c l e ( N e l s o n e t a l . 1 9 8 8 ) . C a l c i u m m a y a l s o b e r e l e a s e d f r o m i n t e r n a l s t o r e s v i a r y a n o d i n e r e c e p t o r - l i k e C a2+ c h a n n e l s o f t h e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m ( S R ) ( A s h i d a 1 9 8 8 ) a n d r e l e a s e d f r o m o t h e r i n t e r n a l s i t e s v i a a n i n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e ( 1 P 3 ) - a c t i v a t e d c h a n n e l ( N e l s o n e t a l . 1 9 9 0 ) . S e v e r a l t y p e s o f K + c h a n n e l s h a v e b e e n d e t e c t e d i n v a s c u l a r m u s c l e c e l l s , i n c l u d i n g C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s , d e l a y e d r e c t i f i e r K + c h a n n e l s , a n d A T P - s e n s i t i v e K + c h a n n e l s . I n c r e a s e s i n K + c o n d u c t a n c e a s a r e s u l t o f a c t i v a t i o n o f a n y o f t h e s e c h a n n e l s l e a d s t o m e m b r a n e h y p e r p o l a r i z a t i o n w i t h s u b s e q u e n t c l o s u r e o f v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2 + c h a n n e l s ( S t a n d e n e t a l . 1 9 8 9 ) a n d e n h a n c e d C a2+ e x t r u s i o n v i a N a + - C a2+ e x c h a n g e ( L a u g e r 1 9 8 7 ) . I n a l l c a s e s , t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e i s a r e d u c t i o n i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e . V a r i o u s h o r m o n e s a c t i n g t h r o u g h m e m b r a n e - b o u n d g u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n s ( G - p r o t e i n s ) ( F r e i s s m u t h e t a ! . 1 9 8 9 ) a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C ( P L C ) , w h i c h c o n v e r t s L - a - p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l d i p h o s p h a t e ( P I P 2 ) t o d i a c y i g l y c e r o l ( D A G ) a n d i n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e ( 1 P 3 ) . 1 P 3 i n t u r n 4 s t i m u l a t e s r e l e a s e o f C a2+ f r o m t h e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m v i a a n d 1 P 3 - r e c e p t o r p r o t e i n , w h i c h i s a t y p e o f C a2+ c h a n n e l ( H a s h i m o t o e t a l . 1 9 8 6 ; B e r r i d g e 1 9 8 9 ) . D A G a c t i v a t e s t h e e n z y m e p r o t e i n k i n a s e C i n t h e s a r c o l e n i m a w h i c h i n t u r n p h o s p h o r y l a t e s m a n y o t h e r m e m b r a n e p r o t e i n s , s u c h a s r e c e p t o r s a n d t h e N a + - K + e x c h a n g e r ( N i s h i z u k a 1 9 8 8 ) . O t h e r s e c o n d m e s s e n g e r s , s u c h a s c A M P a n d c G M P r e g u l a t e i n t r a c e l l u l a r C a2 + a n d / o r c h a n g e t h e C a2 + - s e n s i t i v i t y o f c o n t r a c t i l e p r o t e i n s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s ( K a m m a n d S t u l l 1 9 8 9 ) . c A M P i s t h o u g h t m a i n l y t o s t i m u l a t e C a2+ u p t a k e i n t o t h e S R , w h e r e a s c G M P i s t h o u g h t t o a c t p r i n c i p a l l y b y s t i m u l a t i n g s a r c o l e m m a l A T P a s e s ( L i n d e m a n n e t a . 1 9 8 3 ; V r o l i x e t a l . 1 9 8 8 ) . 1 . 1 . 3 . H o r m o n a l a n d n e u r a l r e g u l a t i o n o f c o n t r a c t i o n i n V S M C s T h e c o n t r a c t i l e a c t i v i t y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s i s r e g u l a t e d b y a v a r i e t y o f l o c a l a n d s y s t e m i c m e c h a n i s m s . S y m p a t h e t i c a n d p a r a s y m p a t h e t i c n e r v e s p l a y a m a j o r r o l e i n t h e s y s t e m i c c o n t r o l o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e , w h i l e a n u m b e r o f o t h e r a g e n t s m o d u l a t e t h e r e s p o n s i v e n e s s o f V S M C s a t a l o c a l l e v e l . K n o w l e d g e c o n c e r n i n g t h e s e l o c a l r e g u l a t i n g m e c h a n i s m s h a s p r o g r e s s e d r a p i d l y i n r e c e n t y e a r s . L o c a l r e g u l a t i o n i s b r o u g h t a b o u t b y t h e i n t r i n s i c c o n t r a c t i l r e s p o n s e o f s m o o t h m u s c l e t o s t r e t c h , a n d b y t h e a c t i o n s o f v a s o d i l a t o r y m e t a b o l i t e s a n d l o c a l v a s o c o n s t r i c t o r s . S i n c e F u r c h g o t t a n d Z a w a d s k i ( 1 9 8 0 ) f i r s t r e p o r t e d t h a t t h e v a s o d i l a t o r y r e s p o n s e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o a c e t y i c h o l i n e r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f a n i n t a c t e n d o t h e l i u m , t h e r o l e o f t h e e n d o t h e l i u m i n t h e r e g u l a t i o n o f v a s c u l a r t o n e h a s a t t r a c t e d 5 c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t . A c t i v a t i o n o f e n d o t h e l i a l r e c e p t o r s b y a n u m b e r o f v a s o a c t i v e s u b s t a n c e s s t o r e d a n d r e l e a s e d b y p l a t e l e t s , e n d o t h e l i u m , o r s u r r o u n d i n g t i s s u e s s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g o r c o n s t r i c t i n g f a c t o r s ( V a n h o u t t e 1 9 8 1 ; D e C l e r c k a n d D a v i d 1 9 8 1 ; B u r n s t o c k 1 9 9 0 ) . T h e s e s u b s e q u e n t l y m o d i f y v a s c u l a r t o n e b y c o n t r a c t i n g o r r e l a x i n g t h e v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e ( B u r n s t o c k 1 9 9 0 ) . T h e e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F ) h a s n o w b e e n i d e n t i f i e d a s n i t r i c o x i d e ( I g n a r r o e t a l . 1 9 8 6 , P a l m e r e t a l . 1 9 8 7 ) . I n a d d i t i o n t o a c e t y i c h o l i n e , e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t v a s o d i l a t i o n h a s a l s o b e e n s h o w n t o o c c u r i n r e s p o n s e t o o t h e r v a s o a c t i v e s u b s t a n c e s , i n c l u d i n g A T P , a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e ( A D P ) , a r a c h i d o n i c a c i d , s u b s t a n c e P , n e u r o k i n i n A , 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 5 - H T ) , b r a d y k i n i n , h i s t a m i n e , n e u r o t e n s i n , v a s o p r e s s i n , a n g i o t e n s i n I I a n d t h r o m b i n ( M i o n e e t a l . 1 9 9 0 ) . S o m e o f t h e v a s o a c t i v e s u b s t a n c e s w h i c h r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f e n d o t h e l i u m t o p r o d u c e v a s o d i l a t i o n a l s o a c t a s v a s o c o n s t r i c t o r s w h e n r e l e a s e d f r o m p e r i v a s c u l a r n e r v e s . T h e r e a p p e a r s , t h e r e f o r e , t o b e a r e s t i n g d y n a m i c b a l a n c e b e t w e e n e n d o t h e l i u m d e r i v e d v a s o d i l a t o r y t o n e a n d s y m p a t h e t i c v a s o c o n s t r i c t o r t o n e , w h i c h i s a l t e r e d u n d e r d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o p h y s i o l o g i c a l c i r c u m s t a n c e s . A l t h o u g h t h e n a t u r e o f t h e e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t c o n t r a c t i n g f a c t o r i s s t i l l u n c l e a r , a t l e a s t t h r e e d i f f e r e n t c l a s s e s o f e n d o t h e l i a l v a s o c o n s t r i c t o r s u b s t a n c e s h a v e b e e n r e c o g n i z e d ( L u s c h e r 1 9 8 8 ) . T h e s e c o n s i s t o f m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d , p o l y p e p t i d e - l i k e f a c t o r s , s u c h a s e n d o t h e l i n , a 2 1 - r e s i d u e p e p t i d e i s o l a t e d f r o m p o r c i n e a o r t i c e n d o t h e l i a l c e l l s ( Y a n a g i s a w a , 1 9 8 8 ) a n d a n u n i d e n t i f i e d d i f f u s i b l e f a c t o r r e l e a s e d f r o m a n o x i c / h y p o x i c e n d o t h e l i u m c e l l s . 6 S y s t e m i c r e g u l a t i o n o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e i s b r o u g h t a b o u t b y c i r c u l a t i n g s u b s t a n c e s a n d b y t h e a c t i o n o f v a s o m o t o r n e r v e s . C i r c u l a t i n g v a s o d i l a t o r y a g e n t s i n c l u d e k i n i n s a n d a t r i a l n a t r i u r e t i c p e p t i d e ( A N P ) . C i r c u l a t i n g v a s o c o n s t r i c t o r s i n c l u d e v a s o p r e s s i n , n o r e p i n e p h r i n e , e p i n e p h r i n e , a n d a n g i o t e n s i n I I . I n t h e n e u r a l r e g u l a t i o n o f V S M C c o n t r a c t i o n , s y m p a t h e t i c n e r v e s p l a y a d o m i n a n t r o l e . W i t h v e r y f e w e x c e p t i o n s , n o r e p i n e p h r i n e r e l e a s e d f r o m a d r e n e r g i c n e r v e t e r m i n a l s a c t i v a t e s a i p h a - a d r e n o c e p t o r s a t t h e m e m b r a n e o f V S M C s ( p o s t j u n c t i o n a l a l p h a - a d r e n o c e p t o r s ) ( B u r n s t o c k 1 9 8 6 ; 1 9 9 0 ) . 1 . 1 . 4 . V a s o c o n s t r i c t o r a c t i o n o f s e r o t o n i n o n V S M C s S e r o t o n i n i s o n e o f t h e m o s t p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r a g e n t s i n t h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o n o f m a m m a l s ( E d v i n s s o n e t a l . 1 9 8 4 ; Y o u n g e t a l . 1 9 8 6 a , 1 9 8 6 b ; C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . I t w a s f i r s t i s o l a t e d a n d c r y s t a l l i z e d b y R a p p o r t , G r e e n a n d P a g e ( 1 9 4 8 ) a n d w a s s y n t h e s i z e d b y H a m l o n a n d F i s h e r ( 1 9 5 1 ) . S e r o t o n i n m a y p l a y a r o l e i n t h e e t i o l o g y o f s e v e r a l i m p o r t a n t d i s o r d e r s o f t h e v a s c u l a r s y s t e m , i n c l u d i n g m i g r a i n e , h y p e r t e n s i o n , v a s o s p a s m a s s o c i a t e d w i t h s u b a r a c h n o i d h a e m o r r h a g e a n d i s c h e m i a ( B o h r a n d W e b b 1 9 8 8 ; M i c h e l e t a l . 1 9 9 0 ; L a n c e 1 9 8 2 ; V a n h o u t t e 1 9 8 5 ; W i l k i n s 1 9 8 0 ) . N e r v e f i b e r s c o n t a i n i n g 5 - H T h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y a r o u n d t h e p i a l a r t e r i e s o f m a n y s p e c i e s ( C h a n g , O w m a n a n d S t e i n b u s c h 1 9 8 8 ) . S e r o t o n i n r e c e p t o r s u b t y p e s c a n b e c a t e g o r i z e d i n t o t h r e e m a j o r f a m i l i e s , 5 - H T 1 , 5 - H T 2 a n d 5 - H T 3 r e c e p t o r s , a n d e a c h f a m i l y c o n s i s t s o f m u l t i p l e r e c e p t o r s u b t y p e s t h a t s h a r e s i m i l a r i t i e s i n t h e i r m o l e c u l a r b i o l o g i c a l , p h a r m a c o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l , a n d / o r p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s ( S c h m i d t a n d P e r o u t k a 1 9 8 9 ) . 7 I n t h e p e r i p h e r a l v a s c u l a t u r e , i t i s w e l l e s t a b l i s h e d t h a t 5 - H T i n d u c e d c o n t r a c t i o n o f t e n i n v o l v e s t h e b i n d i n g o f s e r o t o n i n t o 5 - H T 2 r e c e p t o r s o n t h e m e m b r a n e o f V S M C s . I n t h e s e v e s s e l s , 5 - H T 2 r e c e p t o r o c c u p a t i o n t r i g g e r s p h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s , y i e l d i n g t h e s e c o n d m e s s e n g e r 1 P 3 . 1 P 3 t h e n i n i t i a t e s c o n t r a c t i o n b y r e l e a s i n g C a2+ f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s ( P e r o u t k a a n d S n y d e r 1 9 7 9 ; C o n n a n d S a u n d e r s - B u s h 1 9 8 7 ; P e r o u t k a 1 9 8 7 ) . I n t h e c a s e o f c e r e b r o v a s c u l a r v e s s e l s , h o w e v e r , t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h s e r o t o n i n p r o d u c e s c o n t r a c t i o n i n s m o o t h m u s c l e a r e l e s s w e l l u n d e r s t o o d . I n c o n d u c t i n g c e r e b r a l a r t e r i e s o f t h e r a t , s e r o t o n i n - i n d u c e d c o n t r a c t i o n s a r e b l o c k e d b y n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e 5 - H T 2 r e c e p t o r a n t a g o n i s t k e t a n s e r i n , s u g g e s t i n g t h e i n v o l v e m e n t o f 5 - H T 2 r e c e p t o r s i n t h i s t i s s u e ( C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , i n s i m i l a r s t u d i e s c o n d u c t e d o n c a n i n e b a s i l a r a r t e r i e s , s e r o t o n i n e f f e c t s h a v e b e e n a s c r i b e d t o a c t i v a t i o n o f 5 - H T 1 r e c e p t o r s ( P e r o u t k a a n d K u h a r 1 9 8 4 ) , 5 - H T 2 r e c e p t o r s ( M u l l e r S c h w e i n i t z e r a n d E n g e l 1 9 8 3 ) , o r t o a n a s y e t u n c l a s s i f i e d r e c e p t o r t y p e ( C o h e n a n d C o l b e r t 1 9 8 6 ) . C o n t r a c t i l e r e s p o n s e s t o 5 - H T w h i c h c a n n o t b e r e a d i l y a s c r i b e d t o t h e a c t i v a t i o n o f 5 - H T 2 r e c e p t o r s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n c e r e b r a l a r t e r i e s f r o m t h e c a t ( Y o u n g e t a l . 1 9 8 6 b ) a n d t h e r a b b i t ( B r a d l e y e t a l . 1 9 8 6 ) . F a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e 5 - H T 2 r e c e p t o r m e d i a t e d c h a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m h a v e b e e n s t u d i e d i n s e v e r a l t y p e s o f V S M C f r o m p e r i p h e r a l v e s s e l s u s i n g c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t d y e s ( N a b i k a e t a l . 1 9 8 5 ; C a p p o n i e t a l . 1 9 8 7 ; T a k a t a e t a l . 1 9 8 8 ) . T h e r e h a v e a s y e t b e e n n o d i r e c t m e a s u r e m e n t s o n t h e i n f l u e n c e o f s e r o t o n i n o n f r e e i n t r a c e l l u l a r C a2+ i n 8 c e r e b r o v a s c u l a r V S M C s t o p e r m i t c o m p a r i s o n w i t h t h e d a t a o b t a i n e d f r o m p e r i p h e r a l t i s s u e s . 1 . 2 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f V S M C s V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s f r o m d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s e x h i b i t w i d e v a r i a t i o n s i n t h e i r p a s s i v e a n d a c t i v e p r o p e r t i e s . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s f r o m C V S M C s s h o w r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l s w i t h i n t h e r a n g e o f - 4 0 m V a n d - 7 0 m V i n i n t a c t g u i n e a - p i g c e r e b r a l a r t e r y ( K a r a s h i m a a n d K u r i y a m a 1 9 8 1 ; Y a m a m o t o a n d H o t t a 1 9 8 6 ) , d o g c e r e b r a l a r t e r y ( S u z u k i a n d F u j i w a r a 1 9 8 2 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 2 ) , a n d c a t m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y ( H a r d e r 1 9 8 0 ; H a r d e r e t a l . 1 9 8 1 ) . I n i n t a c t g u i n e a - p i g c e r e b r a l a r t e r y , t h e m e m b r a n e o f C V S M C s w a s f o u n d t o b e e l e c t r i c a l l y q u i e s c e n t , a n d n e i t h e r s p o n t a n e o u s a c t i o n p o t e n t i a l s n o r m i n i a t u r e e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l s w e r e o b s e r v e d . A s i n g l e , b r i e f s t i m u l u s i n d u c e d a s p i k e p o t e n t i a l f o l l o w e d b y a d e p o l a r i z i n g s l o w - p o t e n t i a l , a n d t h e s e e v e n t s w e r e a s s o c i a t e d w i t h m u s c l e c o n t r a c t i o n . E x t e r n a l a p p l i c a t i o n o f t e t r a e t h y l a m m o n i u m ( T E A ) , a K + c h a n n e l b l o c k e r , e n h a n c e d t h e a m p l i t u d e o f t h e s p i k e p o t e n t i a l ( K a r a s h i m a a n d K u r i y a m a 1 9 8 1 ; Y a m a m o t o a n d H o t t a 1 9 8 6 ) . I n t h e i n t a c t d o g c e r e b r a l a r t e r y , C V S M C s o n l y g e n e r a t e d s p i k e s i n r e s p o n s e t o o u t w a r d c u r r e n t p u l s e s u n d e r c o n d i t i o n s o f p r e t r e a t m e n t w i t h 1 0 m M T E A . I n C V S M C s o f i n t a c t r a b b i t b a s i l a r a r t e r y , t h e m e a n r e s t i n g p o t e n t i a l w a s - 6 1 m V , m e m b r a n e i n p u t r e s i s t a n c e a n d t i m e c o n s t a n t w e r e 5 - 4 0 M f 2 a n d 5 - 3 0 m s , r e s p e c t i v e l y . A c t i o n p o t e n t i a l s w e r e r e a d i l y e v o k e d b y d e p o l a r i z i n g c u r r e n t s , e v e n i n t h e a b s e n c e o f T E A ( S u r p r e n a n t e t a l . 1 9 8 7 ) . 9 W h o l e - c e l l , p a t c h c l a m p r e c o r d i n g s h a v e b e e n m a d e i n V S M C s i s o l a t e d f r o m m e s e n t e r i c a r t e r y ( B o l t o n e t a l . 1 9 8 5 ) , a o r t a ( T o r o e t a ! . 1 9 8 6 ) , a n d r a t c e r e b r a l a r t e r y S t e e l e e t a l 1 9 9 1 ; Z h a n g e t a l . 1 9 9 1 ) . S i n g l e a o r t a V S M C s w e r e f o u n d t o e x h i b i t i n p u t r e s i s t a n c e s i n t h e 3 G ( ] r a n g e , m u c h h i g h e r t h a n f o u n d u s i n g c o n v e n t i o n a l i n t r a c e l l u l a r m i c r o e l e c t r o d e s . T h e s e c e l l s h a d a m e a n c a p a c i t a n c e o f 1 7 p F a i i d i n m a n y c a s e s c o u l d g e n e r a t e C a2 + - d e p e n d e n t a c t i o n p o t e n t i a l S o n d e p o l a r i z a t i o n ( T o r o e t a ! . 1 9 8 6 ) . C V S M C s i s o l a t e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s e x h i b i t e d i n p u t r e s i s t a n c e s i n t h e r a n g e 4 - 9 G o , a g a i n m u c h h i g h e r t h a n t y p i c a l o f c e r e b r a l a r t e r i e s s t u d i e d w i t h i n t r a c e l l u l a r m i c r o e l e c t r o d e s ( S t e e l e e t a l . 1 9 9 1 ) . I n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , t h e d e p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l h a s b e e n r e g a r d e d m a i n l y a s t h e r e s u l t o f i n w a r d f l o w o f C a2+ t h r o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n t C a c h a n n e l s ( B o l t o n 1 9 7 9 ; T o m i t a 1 9 8 2 ) . I n w a r d m e m b r a n e c u r r e n t s g e n e r a t i n g t h e a c t i o n p o t e n t i a l a r e l i t t l e e f f e c t e d b y c o m p l e t e r e p l a c e m e n t o f N a w i t h T E A o r T r i s + . T e t r o d o t o x i n , a s e l e c t i v e b l o c k e r o f v o l t a g e - s e n s d v e N a c h a n n e l s i s a l s o i n e f f e c t i v e . I n c o n t r a s t , t h e s e i n w a r d c u r r e n t s a r e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e e x t e r n a l c o n c e n t r a t i o n o f C a2 + o r B a2 + ( T o m i t a 1 9 8 8 ) . T w o d i s t i n c t c l a s s e s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s e x i s t i n r a t v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . O n e o f t h e s e c h a n n e l s h a s a l o w t h r e s h o l d a n d a f a s t i n a c t i v a t i o n r a t e ( “ f a s t c h a n n e l ” ) , w h i l e t h e o t h e r d i s p l a y s a h i g h t h r e s h o l d a n d a s l o w i n a c t i v a t i o n r a t e ( “ s l o w c h a n n e l ” ) ( L o i r a n d e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e s e “ f a s t ” a n d “ s l o w ” C a c h a n n e l s s e e m t o c o r r e s p o n d t o t h e “ T ( t r a n s i e n t ) - t y p e ” a n d “ L ( l o n g - l a s t i n g ) - t y p e ” C a c h a n n e l s s e e n i n o t h e r t i s s u e s ( M c C l e s k e y e t a l . 1 9 8 6 ) . A s t u d y o n g u i n e a - p i g t h o r a c i c a o r t a s m o o t h m u s c l e c e l l s , h o w e v e r , o n l y s h o w e d t h e e x i s t e n c e o f t h e s l o w c h a n n e l t y p e ( C a f f r e y e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e i n a b i l i t y o f s o m e V S M C s t o g e n e r a t e a c t i o n p o t e n t i a l s o n 1 0 m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n b y i n j e c t e d c u r r e n t p r o b a b l y r e f l e c t s t h e i r m a r k e d o u t w a r d r e c t i f i c a t i o n d u e t o e n h a n c e d K c o n d u c t a n c e , r a t h e r t h a n a l a c k o f C a c h a n n e l s ( M e k a t a 1 9 7 6 ) . 1 . 3 . P o t a s s i u m c u r r e n t s i n t h e m e m b r a n e o f V S M C s T h e g e n e r a l r o l e o f p o t a s s i u m ( K ) c u r r e n t s i n t h e m o d u l a t i o n o f v a s c u l a r e x c i t a b i l i t y i s n o w w e l l r e c o g n i z e d . I n s m o o t h m u s c l e c e l l s , p o t a s s i u m c u r r e n t s p l a y a c r u c i a l r o l e i n t h e v a s c u l a r r e s p o n s e t o e n d o g e n o u s a n d p h a r m a c o l o g i c a l v a s o d i l a t o r s b y d e t e r m i n i n g t h e r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l , a n d t h e t i m e c o u r s e , a m p l i t u d e a n d p o l a r i t y o f e l e c t r i c a l c h a n g e s ( B r a y d e n e t a l . 1 9 9 1 ) . I n g e n e r a l , a n i n c r e a s e i n K c o n d u c t a n c e r a i s e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( h y p e r p o l a r i z a t i o n ) a n d d e p r e s s e s e l e c t r i c a l e x c i t a b i l i t y ( B u l b r i n g a n d T o m i t a 1 9 8 7 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e i s r e l a x a t i o n o r r e d u c t i o n o f v a s c u l a r t o n e . K - c u r r e n t s m a y b e c l a s s i f i e d i n t o v a r i o u s c a t e g o r i e s u s i n g t h e c r i t e r i a o f c h a n n e l g a t i n g p r o p e r t i e s , c o n d u c t a n c e a n d p h a r m a c o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . B a s e d o n t h e s e c r i t e r i a , K - c u r r e n t s c a n b e d i v i d e d i n t o t h e f o l l o w i n g c l a s s e s . 1 . 3 . 1 . T h e d e l a y e d ( o u t w a r d ) r e c t i f i e r K - c u r r e n t T h i s c u r r e n t c o n t r i b u t e s t o t h e m a c r o s c o p i c o u t w a r d K - c u r r e n t w h i c h i s m a i n l y r e s p o n s i b l e f o r t h e r e p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l i n m a n y c e l l t y p e s . I t w a s f i r s t d e s c r i b e d i n t h e s q u i d g i a n t a x o n ( H o d g k i n a n d H u x l e y 1 9 5 2 ) . S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s c o n d u c t e d i n n e u r o n e s ( C o n t i a n d N e h e r 1 9 8 0 ) a n d i n s k e l e t a l m u s c l e ( S t a n d e n e t a l . 1 9 8 5 ) , h a v e s h o w n a n e l e m e n t a r y 1 1 c o n d u c t a n c e o f 1 5 - 2 0 p S . W h o l e - c e l l c u r r e n t f l o w i n g i n t h e s e c h a n n e l s i n c r e a s e s s i g m o i d a l l y o n m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n . U n d e r a c o n s t a n t d e p o l a r i z i n g s t i m u l u s , a s l o w , e x p o n e n t i a l i n a c t i v a t i o n o c c u r s , r e q u i r i n g u p t o s e v e r a l s e c o n d s f o r c o m p l e t i o n . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e v o l t a g e d e p e n d e n c e o f a c t i v a t i o n a n d i n a c t i v a t i o n c a n b e m o d u l a t e d b y p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n ( B e z a n i l l a e t a l . 1 9 8 5 ) . N o s e l e c t i v e p h a r m a c o l o g i c a l a g o n i s t s a r e k n o w n f o r t h i s c u r r e n t . L i k e m o s t K c u r r e n t s , t h e d e l a y e d r e c t i f i e r c a n b e b l o c k e d b y C s + , B a 2 + ( W a g o n e r a n d O x f o r d 1 9 8 7 ) , i n t r a c e l l u l a r T E A ( A r m s t r o n g 1 9 7 1 ) , a n d e x t e r n a l T E A ( H i l l e 1 9 9 2 ) . I n s m o o t h m u s c l e c e l l s , d e l a y e d r e c t i f i e r c h a n n e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n p u l m o n a r y a r t e r y ( O k a b e e t a l . 1 9 8 7 ) , r a b b i t j e j u n u m ( B e n h a m a n d B o l t o n 1 9 8 3 ; B e n h a m e t a l . 1 % 7 ) , b l a d d e r ( K i o c k n e r a n d I s e n b e r g 1 9 8 5 ) a n d i n i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e ( O h y a e t a l . 1 9 8 6 ) . I n t h e s e t i s s u e s , t h e d e l a y e d r e c t i f i e r c h a n n e l s m a y o p e n d u r i n g t h e r e p o l a r i z a t i o n p h a s e o f s l o w e l e c t r i c a l w a v e s . 1 . 3 . 2 . T h e t r a n s i e n t o u t w a r d c u r r e n t ( A - c u r r e n t ) T h e t r a n s i e n t o u t w a r d c u r r e n t , a l s o k n o w n a s “ t h e A - c u r r e n t ” ( I A ) w a s f i r s t d e s c r i b e d i n m o l l u s c a n n e u r o n s ( C o n n o r a n d S t e v e n s 1 9 7 1 ) . P a t c h c l a m p s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h i s c u r r e n t i s m e d i a t e d b y s i n g l e c h a n n e l s o f c o n d u c t a n c e 1 5 - 2 0 p 5 w h i c h c a n b e b l o c k e d b y e x t e r n a l a p p l i c a t i o n o f 4 - a m i n o p y r i d i n e ( 4 - A P , T a y l o r 1 9 8 7 ) . A - c u r r e n t c h a n n e l s a c t i v a t e a n d i n a c t i v a t e v e r y r a p i d l y d u r i n g m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n s . A - c u r r e n t c h a n n e l s a r e o p e n i n t h e s u b t h r e s h o l d r e g i o n o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l , a n d c a n t h e r e f o r e p l a y a r o l e i n d e t e r m i n i n g c e l l f i r i n g f r e q u e n c y . I n n e u r o n e s , t h i s c u r r e n t p a r t i c i p a t e s 1 2 i n t h e c o n t r o l o f n e u r o n a l f i r i n g r a t e , s p i k e l a t e n c y a n d a c t i o n p o t e n t i a l r e p o l a r i z a t i o n ( H i l l e 1 9 8 4 ) . I n s m o o t h m u s c l e c e l l s , a c u r r e n t w i t h p r o p e r t i e s s i m i l a r t o n e u r o n a l A - c u r r e n t s h a s b e e n d e s c r i b e d i n p u l m o n a r y a r t e r y ( O h y a e t a ! . 1 9 8 6 ) . T h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s c u r r e n t i n V S M C s r e m a i n s , h o w e v e r , u n c l e a r . 1 . 3 . 3 . I n w a r d r e c t i f y i n g K - c u r r e n t s T h e e x i s t e n c e o f p o t a s s i u m c u r r e n t s w h i c h a r e a c t i v a t e d b y m e m b r a n e h y p e r p o l a r i z a t i o n h a s b e e n r e p o r t e d i n v a r i o u s t i s s u e s . I n g e n e r a l , t h e s e c u r r e n t s f a l l i n t o t w o b r o a d c a t e g o r i e s . T h e f i r s t t y p e o f c u r r e n t i s c h a r a c t e r i z e d b y a h i g h s e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s . T h e v o l t a g e r a n g e o v e r w h i c h t h i s c u r r e n t i s a c t i v a t e d s h i f t s m a r k e d l y w h e n t h e e x t e r n a l c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m i s a l t e r e d . T h i s c u r r e n t i s b l o c k e d b y l o w ( 1 m M ) c o n c e n t r a t i o n s o f B a2 + o r C s + . C u r r e n t s o f t h i s t y p e h a v e b e e n c l a s s i c a l l y d e s c r i b e d i n t h e m e m b r a n e o f s t a r f i s h e g g s ( H a g i w a r a e t a l . 1 9 7 6 , 1 9 7 8 , 1 9 7 9 ) , s k e l e t a l m u s c l e ( A d r i a n 1 9 6 9 ) a n d c a r d i a c m u s c l e ( N o b l e 1 9 8 4 ) . S i n g l e c h a n n e l s t u d i e s u s i n g t h e p a t c h c l a m p t e c h n i q u e s h o w t h a t m e m b r a n e c h a n n e l s c a r r y i n g t h i s t y p e o f i n w a r d r e c t i f i e r c u r r e n t h a v e a m o d e s t c o n d u c t a n c e ( 2 0 - 3 0 p S ) w h e n m e a s u r e d i n p h y s i o l o g i c a l l y a p p r o p r i a t e p o t a s s i u m s o l u t i o n s ( B r i s m a r e t a l . 1 9 8 9 ; B u r t o n a n d H u t t e r 1 9 9 0 ; C l a r k e e t a l . 1 9 9 0 ) . A s e c o n d c l a s s o f i n w a r d r e c t i f i e r c u r r e n t h a s b e e n f o u n d i n m a n y t y p e s o f n e u r o n e ( H a l l i w e l l a n d A d a m s 1 9 8 2 ; M a y e r a n d W e s t b r o o k 1 9 8 3 ; C r e p e l e t a l . 1 9 8 6 ) a s w e l l a s i n g u t s m o o t h m u s c l e f i b r e s ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 7 ) . T h i s c l a s s o f i o n i c c o n d u c t a n c e s h o w s a p p r e c i a b l e p e r m e a b i l i t y t o s o d i u m i o n s a s w e l l a s t o K + . T h e v o l t a g e r a n g e f o r a c t i v a t i o n o f t h i s c o n d u c t a n c e i s i n s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f 1 3 e x t r a c e l l u l a r p o t a s s i u m . B a r i u m i o n s a r e r e l a t i v e l y i n e f f e c t i v e i n b l o c k i n g t h i s c u r r e n t . T o d a t e , t h e r e h a v e b e e n r e l a t i v e l y f e w d e t a i l e d s t u d i e s c o n d u c t e d o n t h e i n w a r d r e c t i f i e r c h a n n e l s f o u n d i n s m o o t h m u s c l e c e l l s . H o w e v e r , i n m a n y t y p e s o f S M C , e l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l s i n d u c e d b y l a r g e h y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t s r e a c h a p e a k a n d t h e n d e c a y w i t h t i m e . T h i s i n w a r d r e c t i f i c a t i o n h a s b e e n o b s e r v e d i n S M C s i s o l a t e d f r o m g u i n e a - p i g t a e n i a c a e c i ( T o m i t a 1 9 6 6 ) , t o a d s t o m a c h ( S i m s e t a ! . 1 9 8 5 ) a n d r a b b i t j e j u n u m ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 7 ) . T h e i n w a r d r & c t i f i e r c u r r e n t p r e s e n t i n r a b b i t j e j u n u m S M C s h a s b e e n a n a l y z e d u s i n g t h e w h o l e - c e l l p a t c h c l a m p t e c h n i q u e ( H a m i l l e t a l . 1 9 8 1 ) . T h i s c u r r e n t b e l o n g s t o t h e s e c o n d c l a s s d e s c r i b e d a b o v e . A n i n w a r d l y r e c t i f y i n g c h a n n e l p e r m e a b l e t o K + , N a + a n d C a2+ h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d i n S M C s i s o l a t e d f r o m t h e s t o m a c h o f t h e t o a d ( H i s a d a e t a l . 1 9 9 1 ) . T h i s c h a n n e l h a s a c o n d u c t a n c e o f 6 4 p S i n p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s a n d i s a c t i v a t e d b y m e m b r a n e h y p e r p o l a r i z a t i o n . I n c o n t r a s t t o t h e s e f i n d i n g s i n g u t s m o o t h m u s c l e , e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t i n w a r d r e c t i f i e r s o f t h e f i r s t c l a s s a r e p r e s e n t i n C V S M C s t h e p r o x i m a l s e g m e n t o f r a t c e r e b r a l a r t e r i o l e s ( E d w a r d s e t a l . 1 9 8 8 ) a n d i n C V S M C s i n s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m ( E d w a r d s a n d H i r s t 1 9 8 8 ) . T h e s e c u r r e n t s d r e u n a f f e c t e d b y r e m o v a l o f e x t e r n a l N a + b u t a r e b l o c k e d h y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f B a 2 + . 1 . 3 . 4 . A T P - s e n s i t i v e K - c u r r e n t . A n A T P - s e n s i t i v e K - c u r r e n t ( K A T p ) w a s f i r s t i d e n t i f i e d i n c a r d i a c m u s c l e ( N o m a 1 9 8 3 ) . T h i s c u r r e n t w a s f i r s t d e m o n s t r a t e d a t t h e s i n g l e c h a n n e l l e v e l i n V S M C s b y S t a n d e n e t a l . ( 1 9 8 9 ) . A p r i m a r y c h a r a c t e r i s t i c o f t h i s 1 4 c u r r e n t i s i t s a c t i v a t i o n b y t h e h y p e r p o l a r i z i n g v a s o d i l a t o r c r o m a k a l i m a n d i t s i r i h i b i t i o n . b y c y t o p l a s m i c A T P , a s w e l l a s b y s u l f o n y l u r e a c o m p o u n d s , s u c h a s g l i b e n c l a m i d e a n d b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f B a2+ . M o s t K A T P c h a n n e l s d e s c r i b e d s h o w n o a p p a r e n t i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m d e p e n d e n c y a n d o n l y s l i g h t v o l t a g e s e n s i t i v i t y . S o m e r e c e n t r e p o r t s , h o w e v e r , h a v e d e m o n s t r a t e d a l a r g e c o n d u c t a n c e v o l t a g e a n d C a2 + - s e n s i t i v e c h a n n e l i n V S M C s f r o m p o r c i n e c o r o n a r y a r t e r y ( S i l b e r b e r g a n d B r e e m e n 1 9 9 0 ) a n d r a b b i t a o r t a , r a b b i t t r a c h e a a n d p i g c o r o n a r y a r t e r y ( G e l b a n d e t a l . 1 9 9 0 ) w h i c h i s a l s o s e n s i t i v e t o c y t o p l a s m i c A T P a n d t o c r o m a k a l i m . T h i s c h a n n e l h a s b e e n i s d e s i g n a t e d a s t h e B K A T p c h a n n e l . K A T P c h a n n e l s i n v a r i o u s t y p e s o f S M C s m a y p l a y a r o l e i n p r o t e c t i o n a g a i n s t i s c h e m i c a n d a n o x i c i n s u l t s ( G e l b a n d e t a l . 1 9 9 0 ; S i l b e r b e r g a n d B r e e m e n 1 9 9 0 ) . 1 . 3 . 5 . C a - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s A t p r e s e n t t h r e e g r o u p s o f c a l c i u m - d e p e n d e n t K - c h a n n e l s , K C a h a v e b e e n d e s c r i b e d i n m a n y t i s s u e s , b a s e d o n t h e i r s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e , c a l c i u m s e n s i t i v i t y , v o l t a g e d e p e n d e n c e , a n d p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s . T h e s e t h r e e g r o u p s o f K C a c h a n n e l s a r e d e s i g n a t e d a s l a r g e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d c h a n n e l s ( B K ) , i n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d c h a n n e l s ( 1 K ) , a n d s m a l l c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d c h a n n e l s ( S K ) . A n u m b e r o f r e v i e w s a b o u t t h e s e c h a n n e l s h a v e b e e n p u b l i s h e d ( T o m i t a 1 9 8 8 ; L a t o r r e e t a l . 1 9 8 9 ; E d w a r d s a n d W e s t o n 1 9 9 0 ; K o I b 1 9 9 0 ) . P r o p e r t i e s o f t h e s e c h a n n e l t y p e s a r e d i s c u s s e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . 1 . 4 . C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s 1 5 1 . 4 . 1 . L a r g e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s , B K B K o r m a x i - K c h a n n e l s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d i n m a n y c e l l t y p e s . E l e m e n t a r y c u r r e n t s f l o w i n g i n B K c h a n n e l s w e r e f i r s t o b s e r v e d i n b o v i n e a d r e n a l c c i r o m a f f i n c e l l s ( M a r t y , 1 9 8 1 ) a n d l a t e r i n c e l l s f r o m s k e l e t a l m u s c l e ( M e t h f e s s e l a n d B o h e i m 1 9 8 2 ; L a t o r r e e t a l . 1 9 8 2 ; V e r g a r a a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ; V e r g a r a e t a l . 1 9 8 4 ; B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 , 1 9 8 6 ; M o c z y d l o w s k i 1 9 8 3 , 1 9 8 5 ) , c a r d i a c m u s c l e ( C a l l e w a e r t e t a l . 1 9 8 6 ) , e n d o c r i n e c e l l s ( W o n g e t a l . 1 9 8 2 ; M a r t y 1 9 8 3 ; Y e l l e n 1 9 8 4 ; W o n g a n d A d l e r 1 9 8 6 ) , e x o c r i n e c e l l s ( M a r u y a m a e t a l . 1 9 8 3 ; C o o k e t a l . 1 9 8 4 ; F i n d l a y e t a l . 1 9 8 5 ; G i t t e r e t a l . 1 9 8 7 ; G r a y e t a l . 1 9 9 0 ) , e p i t h e l i a l c e l l s ( C h r i s t e n s e n a n d Z e u t h e n 1 9 8 7 ) a n d i m m u n e c e l l s ( G a l l i n 1 9 8 4 ) . B K c h a n n e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n S M C s d e r i v e d f r o m t h e i n t e s t i n e ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ; C e c c h i e t a l . 1 9 8 6 ; M a y e r e t a ! . 1 9 9 0 ) , s t o m a c h ( B e r g e r e t a l . 1 9 8 4 ; C a r l e t a l . 1 9 9 0 ) , p e r i p h e r a l a r t e r i e s ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ; B o l t o n e t a l . 1 9 8 5 ; I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ) , a i r w a y ( M c C a n n a n d W e l s h , 1 9 8 6 ) , u r e t e r ( S h u b a 1 9 8 1 ) a n d t a e n i a c a e c i ( I n o m a t a a n d K a o 1 9 7 9 ) . B K c h a n n e l s e x h i b i t t h e f o l l o w i n g p r o p e r t i e s : ( 1 ) l a r g e s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e i n t h e r a n g e o f 1 5 0 - 3 0 0 p S a t a s y m m e t r i c a l , h i g h K c o n c e n t r a t i o n s ; ( 2 ) h i g h s e l e c t i v i t y f o r K + o v e r o t h e r m o n o v a l e n t c a t i o n s ; ( 3 ) a c t i v a t i o n b y i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m ( 1 - 1 0 M ) a n d m e m b r a n e v o l t a g e ( e - f o l d i n c r e a s e i n c u r r e n t f o r 9 - 1 5 m V d e p o l a r i z a t i o n ) ; ( 4 ) b l o c k a d e b y e x t e r n a l l y a p p l i e d T E A ( K d < 1 m M ) , q u i n i n e , B a2 + a n d , i n m o s t c a s e s b y t h e s c o r p i o n t o x i n c h a r y b d o t o x i n . B K c h a n n e l s a r e h i g h l y s e l e c t i v e f o r K ± o v e r N a + ( P N a / K < 0 . 0 5 ) . I n g e n e r a l , t h e p e r m e a b i f l t y s e q u e n c e f o r t h e m o n o v a l e n t c a t i o n s i n t h e s e c h a n n e l s 1 6 a p p e a r s t o b e s u b s t a n t i a l l y i n d e p e n d e n t o f t h e c e l l t y p e ( T o n i l i n s e t a l . 1 9 8 4 ; B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ; A k b a r a k i e t a l . 1 9 8 9 ; E m e r a n e t a l . 1 9 9 0 ) . T h i s s e q u e n c e i s T I + > K + > R b + > N H 4 + > > C s + > N a + > L j + . T h e s e n s i t i v i t y o f B K c h a n n e l s t o [ C a2 + ] i v a r i e s s i g n i f i c a n t l y a m o n g d i f f e r e n t c e l l t y p e s . F o r e x a m p l e , i n r a b b i t j e j u n u m a n d g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y S M C , 1 0 - 9 M [ C a2+ ] j i s s u f f i c i e n t t o a c t i v a t e B K c h a n n e l s ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , i n c a n i n e a i r w a y S M C , B K c h a n n e l s r e q u i r e [ C a2+ J j > 1 0 - 7 M f o r a c t i v a t i o n ( M c C a n n a n d W e l s h 1 9 8 6 ) . B K c h a n n e l o p e n p r o b a b i l i t y i s a l s o s e n s i t i v e t o m e m b r a n e p o t e n t i a l . A g a i n , h o w e v e r , t h e v o l t a g e d e p e n d e n c y o f c h a n n e l o p e n i n g v a r i e s a m o n g d i f f e r e n t c e l l t y p e s . T h i s v o l t a g e d e p e n d e n c e s e e m s t o r e s u l t f r o m t h e p o t e n t i a l d e p e n d e n t b i n d i n g o f C a2+ t o t h e c h a n n e l , r a t h e r t h a n f r o m a n i n t r i n s i c c h a n n e l d i p o l e ( K o l b 1 9 9 0 ) . T h e g a t i n g k i n e t i c s o f B K c h a n n e l s c a n b e v e r y c o m p l e x . B K c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t m u s c l e s h o w f o u r d i s t i n c t m o d e s o f g a t i n g , d e f i n e d a s n o r m a l , i n t e r m e d i a t e o p e n , b r i e f o p e n a n d b u z z ( M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . T h e n o r m a l g a t i n g m o d e ( 9 6 % o f a l l t r a n s i t i o n s ) i t s e l f d i s p l a y s a t l e a s t t h r e e t o f o u r o p e n s t a t e s a n d s i x t o e i g h t s h u t s t a t e s o f t h e c h a n n e l , a s i n d i c a t e d b y t h e m u l t i - e x p o n e n t i a l n a t u r e o f d w e l l t i m e d i s t r i b u t i o n s . I n c o n t r a s t , B K c h a n n e l s i n V S M C s i s o l a t e d f r o m m e s e n t e r i c a r t e r y d i s p l a y a p p a r e n t l y s i m p l e r k i n e t i c s ( t w o o p e n s t a t e s a n d t h r e e c l o s e d s t a t e s , B e n h a m e t a ! . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , i t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h i s s i m p l i c i t y r e f l e c t s t h e u s e o f s h o r t e r l e n g t h s o f d a t a f o r a n a l y s i s , w h i c h w o u l d e l i m i n a t e i n f r e q u e n t l y o c c u r r i n g o p e n s t a t e s a n d l o n g d u r a t i o n c l o s e d s t a t e s ( M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . 1 7 E x p e r i m e n t s w i t h B K c h a n n e l s r e c o n s t i t u t e d i n t o l i p i d b i l a y e r s s t r o n g l y i n d i c a t e t h a t C a2+ a c t s a s a s i m p l e l i g a n d t o p r o m o t e c h a n n e l o p e n i n g , r a t h e r t h a n a c t i v a t i n g a c a l c i u m - d e p e n d e n t r e a c t i o n p a t h w a y , s u c h a s C a2 + - c a l m o d u l i n o r p r o t e i n k i n a s e C - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n ( L a t o r r e e t a l . 1 9 8 5 ) . C o m p l e x s t a t e d i a g r a m s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r t h e B K c h a n n e l i n w h i c h 1 - 3 c a l c i u m i o n s b i n d s e q u e n t i a l l y t o t h e c h a n n e l , s t a b i l i z i n g o n e o f a n u m b e r o f o p e n o r c l o s e d s t a t e s . U n i l i g a n d e d c h a n n e l s a r e p r e s u m e d t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e m a j o r i t y o f s h o r t d u r a t i o n c h a n n e l o p e n i n g s , w h i l e t h e b i n d i n g o f t h e s e c o n d a n d t h i r d c a l c i u m i o n s s t a b i l i z e s t h e l o n g e r - l i v e d o p e n s t a t e s ( B a r r e t t e t a l . 1 9 8 2 ; M o c z y d l o w s k i a n d L a t o r r e 1 9 8 3 : M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . I n B K c h a n n e l s o f s k e l e t a l m u s c l e f i b e r s , i n t r a c e l l u l a r m a g n e s i u m i o n s c a n p r o m o t e c h a n n e l o p e n i n g a t p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f t h i s c a t i o n ( 0 . 4 - 3 m M ) ( S q u i r e a n d P e t e r s e n 1 9 8 7 ) . T h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s p h e n o m e n o n i s a s y e t u n c l e a r . B K c h a n n e l s i n m o s t , b u t n o t a l l p r e p a r a t i o n s a r e b l o c k e d b y n a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s c o r p i o n t o x i n c h a r y b d o t o x i n a p p l i e d t o t h e e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e ( M i l l e r e t a l . 1 9 8 5 ) . T h i s t o x i n a p p e a r s t o a c t a s a n o p e n c h a n n e l b l o c k e r . I n m o s t p r e p a r a t i o n s , l o w c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 1 - 1 m M ) o f T E A a p p l i e d t o t h e e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e r e v e r s i b l y b l o c k c u r r e n t f l o w i n B K c h a n n e l s i n a m a n n e r o n i y w e a k l y d e p e n d e n t o n m e m b r a n e v o l t a g e . T h i s i n t e r a c t i o n m a y b e d e s c r i b e d a s a m o n o m o l e c u l a r r e a c t i o n w i t h a n a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t , K d = 0 . 3 m M ( Y e l l e n 1 9 8 4 a , 1 9 8 4 b ; V e r g a r a a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ; B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 ) . T E A a l s o b l o c k s c u r r e n t f l o w i n B K c h a n n e l s w h e n a p p l i e d t o t h e i n t e r n a l m e m b r a n e f a c e . I n c u l t u r e d m y o t u b e s ( B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 ) , 1 8 c h r o m a f f i n c e l l s ( Y e l l e n 1 9 8 4 a , 1 9 8 4 b ) , a n d i n m e s e n t e r i c a r t e r y V S M C s ( B e n h a m e t a L . 1 9 8 5 ) , t h e K d f o r b l o c k b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A i s 1 2 m M o r h i g h e r . I n m a r k e d c o n t r a s t , B K c h a n n e l s i n c l o n a l p i t u i t a r y c e l l s ( W o n g a n d A d l e r 1 9 8 6 ) a n d i n b r & n s y n a p t o s o m a l m e m b r a n e s ( F a r l e y a n d R u d y 1 9 8 8 ) d i s p l a y a m u c h h i g h e r s e n s i t i v i t y t o i n t e r n a l T E A , w i t h a K d i n t h e 0 . 1 m M r a n g e . B K c h a n n e l s a r e a l s o b l o c k e d b y C s + a p p l i e d t o e i t h e r m e m b r a n e f a c e . T h i s b l o c k i s i n t e n s i f i e d a t m e m b r a n e v o l t a g e s w h i c h d r i v e C s i o n s i n t o t h e o p e n c h a n n e l . T y p i c a l l y , t h e b l o c k i s t o o f a s t t o b e k i n e t i c a l l y r e s o l v e d , a n d r e s u l t s i n a n a p p a r e n t r e d u c t i o n i n m e a n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t ( Y e l l e n 1 9 8 4 a , 1 9 8 4 b ) . I n n e u r o n e s , c u r r e n t f l o w i n B K c h a n n e l s s e r v e s t o r e p o l a r i z e t h e m e m b r a n e t o w a r d s E K , t e r m i n a t i n g v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u m e n t r y a n d r e s t o r i n g f i r i n g f r e q u e n c y t o r e s t i n g l e v e l s . B K c h a n n e l s a p p a r e n t l y m e d i a t e t h e m a c r o s c o p i c m e m b r a n e c u r r e n t d e s i g n a t e d a s I c i n m a n y t y p e s o f e x c i t a b l e c e l l . T h i s c u r r ç n t g e n e r a t e s t h e f a s t a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n s e e n d u r i n g a c t i o n p o t e n t i a l f i r i n g i n t h e s e c e l l s ( K a c z m a r e k a n d L e v i t a n 1 9 8 7 ) . I t h a s a l s o b e e n p r o p o s e d t h a t B K c h a n n e l s m a y p l a y a r o l e i n t h e a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n s e e n i n C V S M C s o f c e r e b r a l a r t e r i e s ( H i r s t e t a ! . 1 9 8 6 ; S t e e l e e t a l . 1 9 9 1 ) . 1 . 4 . 2 . I n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s , 1 K 1 K c h a n n e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n a g r e a t v a r i e t y o f t i s s u e s i n c l u d i n g n e u r o n e s ( E w a l d e t a l . 1 9 8 5 ) , r a t k i d n e y t u b u l e s ( F r i n d t a n d P a l m e r 1 9 8 7 ) a n d r a t b r a i n s y n a p t o s o m e s ( F a r l e y a n d R u d y 1 9 8 8 ) . T h e s e c h a n n e l s s o m e t i m e s c o e x i s t w i t h B K c h a n n e l s ( A k b a r a l i e t a ! . 1 9 9 0 ) . C h a n n e l c o n d u c t a n c e v a r i e s 1 9 f r o m 3 0 t o 1 2 0 p S . Q u i n i n e , q u i n i d i n e , T E A a n d c h a r y b d o t o x i n a c t a s b l o c k e r s o f 1 K c h a n n e l s ( K o i b 1 9 9 0 ; E d w a r d s a n d W e s t o n 1 9 9 0 ) . 1 K c h a n n e l s o f c o n d u c t a n c e a r o u n d 1 0 0 p S h a v e b e e n d e t e c t e d i n V S M C s i s o l a t e d f r o m r a b b i t p o r t a l v e i n ( I n o u e e t a l . 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ) a n d h u m a n c y s t i c a r t e r y ( A k a r a l i e t a l . 1 9 9 0 ) . T h e s e c h a n n e l s s h o w a n i n c r e a s e d o p e n p r o b a b i l i t y o n c e l l d e p o l a r i z a t i o n o r i n c r e a s i n g [ C a2+ I i , b u t t h e o p e n p r o b a b i l i t y i s q u i t e l o w a t n o r m a l r e s t i n g p o t e n t i a l s o f - 5 0 m V t o - 5 5 m V . T h e s e 1 K c h a n n e l s m a y t h e r e f o r e b e m o r e i m p o r t a n t i n r e p o l a r i z a t i o n a f t e r t h e a c t i o n p o t e n t i a l t h a n i n m a i n t a i n i n g t h e r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l ( I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ) . 1 . 4 . 3 . S m a l l c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d c h a n n e l s , S K . T h e S K c h a n n e l s e x h i b i t a c o n d u c t a n c e i n t h e r a n g e o f 1 0 - 1 4 p S a n d w e r e f i r s t d e s c r i b e d i n c u l t u r e d r a t s k e l e t a l m u s c l e c e l l s ( B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 6 ) a n d i n g u i n e a - p i g h e p a t o c y t e s ( C o o k a n d H a y l e t t 1 9 8 5 ) . S K c h a n n e l s e x h i b i t n o v o l t a g e s e n s i t i v i t y a n d i n g e n e r a l t h e s e c h a n n e l s a r e m o r e s e n s i t i v e t h a n B K c h a n n e l s t o [ C a2 + ] j . S K c h a n n e l s m e d i a t e t h e s l o w a f t e r h y p e p o I a r i z a t i o n ( A H P ) w h i c h f o l l o w s t h e a c t i o n p o t e n t i a l i n m a n y c e l l t y p e s ( P e n n e f a t h e r e t a l . 1 9 8 5 ) . T h e s l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n p l a y s a k e y r o l e i n s p i k e f r e q u e n c y a d a p t a t i o n i n n e u r o n e s ( B a r r e t t a n d B a r r e t t 1 9 7 6 ; B a r r e t t e t a l . 1 9 8 1 ; K a w a i a n d W a t a n a b e 1 9 8 6 ) . E x t e r n a l l y a p p l i e d T E A a t c o n c e n t r a t i o n s u p t o 2 5 m M h a s n o s i g n i f i c a n t b l o c k i n g e f f e c t o n S K c h a n n e l s i n s k e l e t a l m u s c l e c e l l s ( R o m e y a n d L a z d u n s k i 1 9 8 4 ; B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 6 ) o r i n t h e s y m p a t h e t i c n e u r o n e s 2 0 (Pennefather et al. 1986). SK channels are however blocked by nanomolar concentrations of the bee toxin apamin (Kolb 1990). Among smooth muscle cells, SK channels have yet to be studied at the single channel level of resolution. However, apamin is known to block neurotensin induced relaxation in rat ileum smooth muscle, suggesting that SK channels are indeed present in some SMCs (Kullack et a!. 1987) 1.4.4. Modulation of the ionic current through KCa channels Both single channel and whole-cell studies have suggested that the current through KCa cl’annels can be modulated by neurotransmitters or intracellular second messengers, and by putative K+ channel openers, such as cromakalim and penacidil. The relaxation of guinea-pig taenia coli mediated bya-adrenergic agonists involves activation of KCa channels, with subsequent membrane hyperpolarization (Buibring and Tomita 1987). As noted above, neurotensin induced relaxation of rat ileum smooth muscle can be blocked by apamin, suggesting the involvement of SK channels in this process (Kullack et al. 1987). cAMP has been shown to activate KCa channels in rat aorta VSMCs, suggesting that phosphorylation may play a role in the activation of these channels (Sadoshima et a!. 1988). In tracheal myocytes, protein kinase A activates KCa channels (Kume et al. 1989) while the muscarinic activation of canine colonic smooth muscle appears to involve suppression of KCa channel activity via a pertussis toxin sensitive G protein (Cole and Sanders 1989). In porcine coronary artery, the newly discovered vasoactive peptide endothelin has been found to enhance the probability of opening of BK channels, while higher doses 21 o f t h e p e p t i d e ( > 1 0 n M ) i r r e v e r s i b l y i n h i b i t e d t h i s c h a n n e l . T h e s e a c t i o n s c o u l d p l a y r o l e s i n t h e v a s o d i l a t o r a n d v a s o c o n s t r i c t o r e f f e c t s o f t h i s p e p t i d e ( H u e t a l . 1 9 9 1 ) . T h e p o t e n t v a s o d i l a t o r n i t r o p r u s s i d e a p p e a r s t o r e l a x a o r t i c V S M C s b y a c t i v a t i n g K C a c h a n n e l s ( W i l l i a m s e t a ! . 1 9 8 8 ) . T h e p o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r c r o m a k a l i m a c t i v a t e s B K c h a n n e l s i n h u m a n m e s e n t e r i c a r t e r y b y d e c r e a s i n g t h e m e a n s h u t t i m e o f t h e s e c h a n n e l s ( K i o c k n e r e t a l . 1 9 8 9 ) . 1 . 5 . R a t i o n a l e I t i s e v i d e n t f r o m t h i s r e v i e w t h a t K C a c h a n n e l s h a v e b e e n w e l l s t u d i e d i n V S M C s f r o m i s o l a t e d p e r i p h e r a l v e s s e l s , a s w e l l a s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s f r o m n o n - v a s c u l a r t i s s u e s ( T o m i t a 1 9 8 8 ; S p e r e l a k i s a n d O h y a 1 9 8 9 ; A l c b a r a k i e t a l . 1 9 9 0 ; E d w a r d s a n d W e s t o n 1 9 9 0 ) . I n c o n t r a s t , h o w e v e r , K C a c h a n n e l s h a v e b e e n l i t t l e s t u d i e d i n S M C s d e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o n o f m a m m a l s . T h e f e w p a p e r s w h i c h h a v e a p p e a r e d o n t h i s t o p i c h a v e c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f K C a c u r r e n t s i n C V S M C s i s o l a t e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s , b u t a s y e t f e w d e t a i l s o f t h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s e c h a n n e l s a r e a v a i l a b l e ( Z h a n g e t a ! . 1 9 9 1 ; S t e e l e e t a ! . 1 9 9 1 ) . T h i s a b s e n c e o f k n o w l e d g e i s r e g r e t t a b l e , i n v i e w o f t h e a p p a r e n t i m p o r t a n c e o f t h e s e c h a n n e l s i n r e g u l a t i n g t h e c o n t r a c t i l e s t a t e o f V S M C s . K C a c h a n n e l s m a y a l s o p l a y a i m p o r t a n t r o l e i n t h e e t i o l o g y o f t h e v a s o s p a s m t h a t o c c u r s i n m a n y p a t i e n t s f o l l o w i n g s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e ( M i c h e l e t a l . 1 9 9 0 ) . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t f r e e r a d i c a l s m a y m e d i a t e t h e v a s o c o n s t r i c t o r a c t i o n o f o x y h e m o g l o h i n o n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . O x y h e m o g l o b i n i n d u c e d c b n t r a c t i o n s a r e a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n K C a c u r r e n t s i n 2 2 CVSMCs, presumably as a result of an elevated level of free intracellular calcium (Steele et al. 1991). With these considerations in mind, it was decided to perform a study designed to elucidate the biophysical properties of KCa channels in CVSMCs derived from adult rats. Conventional intracellular recording techniques were not suitable for this preect, since these methods cannot resolve current flow in individua’ membrane channels. For this purpose it was necessary to employ the patch clamp method, devised by Neher and Sakmann (Hamill et al. 1981; Sakmann and Neher 1983). This decision in turn required the use of enzymatically dissociated CVSMCs, since the membrane of smooth muscle cells is invested by a tough connective tissue matrix in intact vessels (Ross and Reith 1985). The goals of this project may then be stated as follows: 1. To devise methods for the enzymatic dispersion of CVSMCs from the cerebral arteries of adult rats. Isolated cells were found to remain viable in Vitro for several days after isolation. Histological and immunocytochemical methods were employed to identify dispersed CVSMCS in these preparations. 2. To perform patch clamp recordings in the whole-cell, current clamp mode to determine the basic electrophysiological properties of dispersed CVSMCs. 23 3. To perform patch clamp recordings in the isolated, inside-out patch mode in order to investigate the biophysical properties of single KCa channels in the CVSMC membrane. These properties included single channel conductance, channel kinetics, modulation of channel gating by membrane voltage and intracellular free calcium, and the sensitivity of these channels to the potassium channel blockers TEA and Cs +. 4. Since the gating of KCa channels is critically dependent on the level of intracellular free calcium, it was also decided to estimate the value of this parameter in dispersed CVSMCs, using the calcium- sensitive probe fura-2. 5. As noted previously, there is some uncertainty as to the mode of action of the vasoconstrictor 5-HT on cerebrovascular smooth muscle. It was therefore decided to investigate this matter using the fura-2 assay of intracellular calcium. 24 Chapter 2 Experimental Procedures 2.1. Disprsal of cerebrovascular smooth muscle cells Experiments were performed on cerebrovascular smooth muscle cells (CVSMCs) isolated from the middle, basilar, posterior communicating and posterior cerebral arteries of adult Wistar rats (200-250 g, Charles River, Montreal). Rats were sacrificed by decapitation under sodium pentobarbital anaesthesia (30 mg/kg). The cerebral hemispheres and cerebellum were exposed by removing the parietal bone. The brain was carefully removed under aseptic conditions and placed in a 60 mm culture dish with brain dissecting buffer solution containing Ca2+ and Mg2+ free Hank’s Balanced Salt solution (HBSS, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) of the following composition, in mM: 138 NaC1, 5 KC1, 0.3 KH2PO4, 0.3 Na2HPO4.7H20, 18 Dextrose, 4 NaHCO3, 15.7 HEPES with penicillin 100 U/mi and streptomycin 100g/ml (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), pH 7.4. Under the low power of a dissecting light microscope, the basilar, middle, posterior communicating and posterior cerebral arteries and their first order and second order side branches (Fig 1) were removed (Fig 1) using iridectomy scissors and fine forceps and placed in a 65 mm culture dish filled with potassium glutamate (KG) buffer solution containing, in mM: 140 glutamic acid monopotassium, 16 NaHCO3, 0.5 NaH2PO4, 16.5 Dextrose and 25 HEPES, pH 7.4. After incubation in KG solution for 10 minutes at 370C, the vessels were minced with iridectomy scissors into 0.5 mm fragments. The fragments were then transferred into a 15 ml centrifuge tube containing 3 ml of 0.1% trypsin (Type C, Sigma, dissolved in KG solution) and incubated at 37oC for 10 minutes. The tissue suspension was then 25 F i g u r e 1 . V e t 4 r a l a s p e c t o f t h e a d u l t r a t b r a i n s h o w i n g p o s i t i o n s o f t h e b a s i l a r , p o s t e r i o r c o m m u n i c a t i n g , p o s t e r i o r a n d m i d d l e c e r e b r a l a r t e r i e s u s e d i n t h i s s t u d y . 2 6 - M i d d l e C e r e b r a l A r t e r y P o s t e r i o r C o m m u n i c a t i n g A r t e r y P o s t e r i o r C e r e b r a l A r t e r y B a s i l a r A r t e r y 2 7 c e n t r i f u g e d , a n d r e s u s p e n d e d i n a t u b e c o n t a i n i n g 3 m l o f 0 . 3 % c o l l a g e n a s e ( T y p e 1 A , S i g m a , d i s s o l v e d i n K G s o l u t i o n ) a n d 0 . 2 m l o f 0 . 5 % t r y p s i n i n h i b i t o r ( S i g m a , d i s s o l v e d i n K G s o l u t i o n ) . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C f o r 1 5 m i n u t e s , t h e c e l l s u s p e n s i o n w a s a l l o w e d t o s e d i m e n t f o r 3 m i n u t e s a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s r e m o v e d . C e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 3 m l o f h o r s e s e r u m ( h e a t - i n a c t i v a t e d , G i b c o ) a t 4 ° C i n o r d e r t o i n h i b i t t h e a c t i v i t y o f e n z y m e s . T h i s s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d . A 6 m l v o l u m e o f K G s o l u t i o n w a s p l a c e d i n t h e t u b e a n d c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d , w a s h e d a n d c e n t r i f u g e d . A f i n a l r e s u s p e n s i o n i n 1 m l o f K G s o l u t i o n w a s m a d e . A 0 . 2 m l o f t h i s c e l l s u s p e n s i o n w a s p i p e t t e d o n t o a p r e - c o a t e d g l a s s c o v e r s l i p ( s e e S e c t i o n 2 . 1 . 1 . ) a n d a l l o w e d t o s e t t l e f o r a t l e a s t 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 1 - 2 3 ° C ) . I f i n t e n d e d f o r u s e i n f u r a - 2 d e t e r m i n a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , t h e c o v e r s l i p w a s t r a n s f e r r e d i n t o a 3 5 m m c u l t u r e d i s h w i t h 2 m l o f M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u m ( M E M , G i b c o ) c o n t a i n i n g , i n m M : 4 L - g l u t a m i n e , 1 6 N a H C O 3 , 2 0 H E P E S , a n d 1 5 % h o r s e s e r u m ( G i b c o ) ( S t u r e k a n d H e r m s m e y e r 1 9 8 6 ) . T h e s e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n a 1 0 % C 0 2 i n c u b a t o r a t 3 7 ° C f o r 2 - 4 d a y s p r i o r t o u s e . I n t h e c a s e o f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s , c o v e r s l i p s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o 3 5 m m c u l t u r e d i s h e s w i t h 2 m l o f m a i n t e n a n c e s o l u t i o n c o n t a i n i n g , i n m M : 1 3 3 N a C 1 , 5 K C 1 , 0 . 8 C a C 1 2 , 1 . 3 M g C 1 2 , 5 G l u c o s e , 1 0 H E P E S w i t h p e n i c i l l i n ( 1 0 0 U / m i , S i g m a ) a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0 j . g / m 1 , S i g m a ) ( Z h a n g e t a l . 1 9 9 1 ) . C e l l s w e r e m a i n t a i n e d a t 4 o C i n a r e f r i g e r a t o r a n d u s e d w i t h i n 7 2 h o u r s o f p l a t i n g . 2 . 1 . 1 . C o v e r s l i p p r e p a r a t i o n 1 8 m m c i r c l e g l a s s c o v e r s l i p s ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o m p a n y , c a t . n o . 1 2 - 5 4 5 - 1 0 0 ) w e r e c l e a n e d i n c o n c e n t r a t e d n i t r i c a c i d a t 6 0 ° C f o r 3 0 m i n u t e s a n d t h e n 2 8 s t e r i l i z e d i n a n a u t o c l a v e f o r 4 0 m i n u t e s . A f t e r s o a k i n g o v e r n i g h t i n 1 0 g / m l p o l y - D - l y s i n e ( S i g m a ) d i s s o l v e d i n 0 . 1 5 M b o r a t e b u f f e r s o l u t i o n ( p H 8 . 4 ) , c o v e r s l i p s w e r e r i n s e d i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . 0 . 2 m l H B S S ( G i b c o ) c o n t a i n i n g 1 6 . 7 g l a m i n i n ( S i g m a ) w a s a d d e d t o e a c h c o v e r s l i p 2 - 3 h o u r s b e f o r e u s e . 2 . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f i s o l a t e d C V S M C s 2 . 2 . 1 . M a s s o n t r i c h r o m e t e s t S m o o t h m u s c l e c e l l s c a n b e i d e n t i f i e d b y t h e u s e o f t h e M a s s o n t r i c h r o m e s t a i n ( M a s s o n 1 9 2 9 ; S p a t z e t a l . 1 9 8 3 ) . I n t h i s m e t h o d , t h e c e l l s o n t h e c o v e r s l i p w e r e f i r s t f i x e d w i t h 2 . 5 % f o r m a l i n i n p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o n ( P B S ) c o n t a i n i n g , i n m M : 1 4 9 N a C l , 2 K H 2 P O 4 , 4 . 2 N a 2 H P O 4 , p H 7 . 4 f o r 1 0 m i n u t e s . N u c l e i w e r e s t a i n e d w i t h 5 0 % i r o n h e m a t o x y l i n ( 1 : 1 i n H 2 0 ) i n 5 m i n u t e s f o l l o w e d b y d i f f e r e n t i a t i o n w i t h 1 % a c i d a l c o h o l f o r 1 s e c o n d . A f t e r w a s h i n g w i t h d i s t i l l e d w a t e r , t h e c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h 2 % P o n c e a u a c i d s o l u t i o n ( d i s s o l v e d i n 1 % a c e t i c a c i d ) f o r 2 . 5 m i n u t e s . T h i s d y e s t a i n s t h e c y t o p l a s m o f s m o o t h m u s c l e c e l l s . T h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d f i n a l l y d i f f e r e n t i a t e d w i t h 1 % p h o s p h o t u n g s t i c a c i d f o r 5 m i n u t e s . S t a i n e d c e l l s w e r e d e h y d r a t e d b y s e q u e n t i a l a p p l i c a t i o n o f 7 0 % , 9 5 % , a n d 1 0 0 % e t h a n o l s o l u t i o n s , c l e a n e d i u x y l e n e a n d m o u n t e d o n p r e c l e a n e d g l a s s m i c r o s c o p e s l i d e s ( F i s h e r ) w i t h m o u n t i n g m e d i a ( C o v e r b o n d , S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G r a w P a r k , I l l i n o i s ) . T h e n u c l e i o f C V S M C s a n d b a c k g r o u n d c e l l s ( e n d o t h e l i a l c e l l s , f i b r o b l a s t s ) w e r e s t a i n e d b l a c k . T h e c y t o p l a s m o f C V S M C s w a s s t a i n e d r e d , w h i l e t h e c y t o p l a s m o f c e l l s o f c o n n e c t i v e t i s s u e o r i g i n w a s s t a i n e d b l u e . 2 9 2 . 2 . 2 . I m m u n o f l u o r e s c e n t a n d i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g o f C V S M C s S m o o t h m u s c l e c e l l s c a n a l s o b e i d e n t i f i e d b y a p p l i c a t i o n o f a m o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t h m u s c l e a - a c t i n ( F r a n k e e t a l . 1 9 8 0 ) . I n t h i s m e t h o d , c o v e r s l i p s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S , f i x e d i n 2 . 5 % f o r m a l i n ( d i s s o l v e d i n P B S ) f o r 5 m i n u t e s , a i r d r i e d , a n d w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S . A f t e r b l o c k i n g n o n s p e c i f i c b i n d i n g w i t h 5 0 % g o a t s e r u m ( G i b c o ) f o r 2 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , c o v e r s l i p s w e r e i n c u b a t e d w i t h t h e p r i m a r y a n t i b o d y , a m o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t h m u s c l e a - a c t i n ( C G A 7 , S i g m a , d i l u t e d 1 : 4 0 0 w i t h P B S ) o v e r n i g h t a t 4 ° C . C o v e r s l i p s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S a n d i n c u b a t e d w i t h a 1 : 5 0 0 0 d i l u t i o n i n P B S o f t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y , b i o t i n - A P a f f i n i p u r e g o a t a n t i - m o u s e I g G ( J a c k s o n I m m u n o r e s e a r c h L a b o r a t o r i e s I n c . , W e s t G r o v e , P A ) . F o r i m m u n o f l u o r e s c e n t s t u d i e s , t h e b i o t i n y l a t e d I g G w a s l o c a l i z e d b y i n c u b a t i o n w i t h a 1 : 5 0 0 0 d i l u t i o n o f f l u o r e s c e n t c o n j u g a t e d e g g - w h i t e a v i d i n ( J a c k s o n I m m u n o r e s e a r c h L a b . I n c . ) f o r t w o h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e . S t a i n e d c o v e r s l i p s w e r e g i v e n a f i n a l r i n s e i n P B S a n d m o u n t e d . o n g l a s s m i c r o s c o p e s l i d e s w i t h m o u n t i n g m e d i a ( C o v e r b o n d ) . T h e s e p r e p a r a t i o n s w e r e v i s u a l i s e d a n d p h o t o g r a p h e d u s i n g a f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e ( Z e i s s , W e s t G e r m a n y ) . F o r i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g , t h e b i o t i n y l a t e d I g G w a s l o c a l i z e d b y i n c u b a t i n g w i t h a p e r o x i d a s e c o n j u g a t e d e g g - w h i t e a v i d i n ( V e c t o r L a b ) f o r t w o h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e . C o v e r s l i p s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s i n P B S . T h e p e r o x i d a s e r e a c t i o n w a s d e v e l o p e d b y i n c u b a t i n g t h e c o v e r s l i p s w i t h t h e p e r o x i d a s e s u b s t r a t e 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e ( D A B , 1 0 m g / m i i n P B S ) f o r 1 0 3 0 m i n u t e s a n d 0 . 0 3 % h y d r o g e n p e r o x i d e ( H 2 0 2 ) f o r 3 0 m i n u t e s . T h e s e c o v e r s l i p s w e r e g i v e n a f i n a l r i n s e i n P B S . C e l l s w e r e d e h y d r a t e d i n g r a d e d e t h a n o l - w a t e r s o l u t i o n s , c l e a r e d i n x y l e n e a n d m o u n t e d o n t o m i c r o s c o p e s l i d e s w i t h m o u n t i n g m e d i a . I m m u n o p e r o x i d a s e p r e p a r a t i o n s w e r e v i s u a l i z e d a n d p h o t o g r a p h e d u n d e r l i g h t m i c r o s c o p y ( O l y m p u s C C K - 1 , x 3 0 0 m a g n i f i c a t o n ) . T h e f o l l o w i n g c o n t r o l s f o r s p e c i f i c i t y o f s t a i n i n g w e r e d o n e f o r b o t h t h e i m m u n o p e r o x i d a s e a n d i m m u n o f l u o r e s c e n t p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a b o v e : ( a ) r e p l a c e m e n t o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y , C G A 7 , b y a n i r r e l e v a n t a n t i b o d y s p e c i f i c f o r g a s t r i c i n h i b i t o r y p e p t i d e ( G I P , M R C p e p t i d e g r o u p , D e p t . P h y s i o l o g y , U B C ) , ( b ) o m i s s i o n o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y , ( c ) i n c u b a t i o n w i t h 5 0 % g o a t s e r u m ( G i b c o ) . 2 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n i s o l a t e d C V S M C s T h e f l u o r e s c e n t C a2 + i n d i c a t o r f u r a - 2 A M ( G r y n k i e w i c z e t a l , 1 9 8 5 ) w a s u s e d t o m e a s u r e t h e l e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m [ C a2 + I i p r e s e n t i n i s o l a t e d C V S M C s . T h i s m e t h o d w a s a l s o a p p l i e d t o d e t e r m i n e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e c e l l s t o t h e v a s o c o n t r i c t o r s e r o t o n i n ( 5 - H T ) ( C a p p o m e t a ! . 1 9 8 7 ) . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n 2 - 3 d a y o l d c u l t u r e s i n c u b a t e d a t 3 7 0 C , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . T h e s e c u l t u r e s w e r e u s e d , s i n c e t h e s p h e r i c a l C V S M C s b e c a m e m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t f r o m t h e f l a t b a c k g r o u n d c e l l s a f t e r 2 - 3 d a y s i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C , a s r e v e a l e d b y M a s s o n s t a i n i n g a n d i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t a i n i n g f o r s m o o t h m u s c l e a - a c t i n ( s e e R e s u l t s s e c t i o n ) . 3 1 2 . 3 . 1 . L o a d i n g o f t h e f u r a - 2 - A M i n d i c a t o r i n t o C V S M C s . F u r a - 2 A M ( M o l e c u l a r P r o b e s I n c . , E u g e n e , O R ) 1 m g w a s d i s s o l v e d i n 1 m l o f c h l o r o f o r m , a n d 5 0 1 a l i q u o t s o f t h i s s o l u t i o n w e r e p i p e t t e d i n t o 2 0 s m a l l p l a s t i c a m p u l e s . T h e s e a m p u l e s w e r e p l a c e d i n a d i s s i c a t o r , a n d v a c u u m - d r i e d f o r 3 h o u r s . T h e d r i e d a l i q u o t s w e r e s t o r e d a t - 7 0 0 C . F o r e a c h c o v e r s l i p u s e d , 5 g o f f u r a - 2 A M p e r p l a s t i c a m p u l e w a s d i s s o l v e d i n 5 0 1 o f d i m e t h y l s u l f o x i d e ( D M S O , S i g m a ) , p r o d u c i n g a n 1 m M s t o c k s o l u t i o n . 2 O j d o f t h i s s t o c k s o l u t i o n w e r e a d d e d t o 2 m l o f E a r l ’ s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( E B S S ) c o n t a i n i n g ( m M ) : 5 K C 1 , 0 . 8 M g C 1 2 , 1 . 8 C a C 1 2 , 1 1 7 N a C l , 2 6 N a H C O 3 , 1 N a H 2 P O 4 , 5 . 6 D e x t r o s e , a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 , t e m p e r a t u r e 3 7 0 C . 1 m l o f t h i s s o l u t i o n w a s i m m e d i a t e l y a d d e d t o a 3 5 m m c u l t u r e d i s h c o n t a i n i n g 1 m l E B S S . T h e c o v e r s l i p w i t h t h e s m o o t h m u s c l e c e l l s w a s p l a c e d f a c e - u p i n t h e d i s h . F u r a 2 A M i s h y d r o p h o b i c a n d t h e r e f o r e p e n e t r a t e s t h e p l a s m a m e m b r a n e w i t h o u t d i f f i c u l t y . C e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h f u r a - 2 A M f o r 1 . 5 h o u r s a t 3 7 ° C t o a l l o w t h e u p t a k e t o r e a c h e q u i l i b r i u m . O n c e i n s i d e t h e c e l l , c y t o s o l i c e s t e r a s e s c l e a v e t h e a c e t o x y m e t h y l g r o u p s f r o m t h e i n d i c a t o r t o r e l e a s e f r e e f u r a - 2 w h i c h i s m e m b r a n e i m p e r m e a n t a n d i s t h e r e f o r e t r a p p e d i n s i d e t h e c e l l s . A f t e r a r i n s e w i t h E B S S , a f u r t h e r i n c u b a t i o n o f 3 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C w a s c a r r i e d o u t i n 2 m l o f f r e s h E B S S t o w a s h o u t e x c e s s f u r a - 2 A M . T h e s e l o a d i n g c o n d i t i o n s w e r e c h o s e n t o m i n i m i z e t h e r i s k o f o v e r l o a d i n g t h e c e l l s w i t h d y e , a n d a l s o s e r v e d t o s u p p r e s s t h e f o r m a t i o n o f p a r t i a l l y h y d r o l y z e d f u r a - 2 d e r i v a t i v e s ( T s i e n 1 9 8 8 ) . 2 . 3 . 2 . C e l l c h a m b e r a n d p e r f u s i o n s y s t e m f o r f u r a - 2 m e a s u r e m e n t s . A f t e r l o a d i n g , c o v e r s l i p s w e r e m o u n t e d f a c e - d o w n i n t o a s p e c i a l l y d e s i g n e d l a m i n a r f l o w - t h r o u g h c h a m b e r ( v o l u m e 3 5 0 l ) f i l l e d w i t h H a n k ’ s 3 2 b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( H B S S ) . c o n s i s t i n g o f ( m M ) : 1 5 0 N a C 1 , 4 K C 1 , 1 C a C 1 2 , 1 M g C 1 2 a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . S i l i c o n e g r e a s e w a s u s e d t o c o m p l e t e a w a t e r t i g h t s e a l b e t w e e n t h e c o v e r s l i p a n d c h a m b e r . T h e c h a m b e r w a s i n s e r t e d i n t o a s t a i n l e s s s t e e l h o l d e r , a n d t h e n t h e e n t i r e a s s e m b l y w a s m o u n t e d o n t o t h e s t a g e o f a J e n a l u m a r Z e i s s f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e . C e l l s w e r e v i e w e d u n d e r o i l i m m e r s i o n a t l O O x m a g n i f i c a t i o n o n t h e m i c r o s c o p e . D u r i n g d e t e r m i n a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m , c e l l s w e r e c o n t i n u o u s l y p e r f u s e d w i t h H B S S a t 2 1 - 2 3 ° C u s i n g a f l o w r a t e o f 4 m I / m m . T h e H B S S c o n t a i n e d 1 m M C a2 + i n a l l e x p e r i m e n t s u t l i l i z i n g f u r a - 2 . T h i s c o n c e n t r a t i o n o f C a2+ w a s s e l e c t e d t o a l l o w c o m p a r i s o n o f r e s u l t s w i t h a p r e v i o u s s t u d y o f t h i s t y p e , c o n d u c t e d o n a o r t i c V S M C s ( N a b i k a e t a l . , 1 9 8 5 ) . K e t a n s e r i n ( J a n s s e n B i o t e c h , B e e r s e , B e l g i u m ) , l a n t h a n u m c h l o r i d e ( S i g m a ) , c o b a l t c h l o r i d e ( S i g m a ) a n d n i f e d i p i n e ( S i g m a ) w e r e d i s s o l v e d i n H B S S a n d p e r f u s e d o v e r t h e c e l l s i n p l a c e o f d r u g - f r e e H B S S . S e r o t o n i n ( 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e , 5 - H T , S i g m a ) w a s d i s s o l v e d i n 1 0 0 l H B S S a n d i n j e c t e d i n t o t h e i n l e t t u b e o f t h e p e r f u s i o n c h a m b e r . W h e n t h e e f f e c t s o f a n t a g o n i s t s w e r e b e i n g s t u d i e d , t h e s e a g e n t s w e r e a l s o p r e s e n t i n t h e 1 0 0 p . l v o l u m e c o n t a i n i n g 5 - H T , a t t h e s a m e d o s e a s a p p l i e d t o t h e c e l l c h a m b e r . A p p l i c a t i o n o f d r u g - f r e e H B S S i n t h i s w a y p r o d u c e d a t r a n s i e n t i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i i n m o s t c e l l s t e s t e d . T h e p e a k i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i s e e n d u r i n g t h e s e a r t i f a c t u a l r e s p o n s e s a v e r a g e d 2 3 ± 5 % o v e r b a s e l i n e l e v e l s o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m ( n = 3 9 c e l l s , m e a n ± S E M ) . F o r q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s , t h i s a r t i f a c t u a l i n c r e a s e w a s s u b t r a c t e d f r o m t h e s i g n a l i n d u c e d b y s e r o t o n i n a p p l i c a t i o n t o y i e l d a m o r e a c c u r a t e e s t i m a t e o f t h e e f f e c t o f 5 - H T o n [ C a2 + ] i . T o r e d u c e t h e i n f l u e n c e o f e r r o r s i n t r o d u c e d b y a r t i f a c t s u b t r a c t i o n , o n l y c o r r e c t e d i n c r e a s e s i n [ C a2 + ] i t h a t e x c e e d e d b a s e l i n e 3 3 l e v e l s b y a t o t a l o f 5 0 % o r m o r e w e r e c o n s i d e r e d d u r i n g q u a n t i t a t i v e a n a l y s e s o f 5 - H T r e s p o n s e s . . 2 . 3 . 3 . M e a s u r e m e n t o f [ C a2 + f t i n C V S M C s F r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m w a s d e t e r m i n e d i n i n d i v i d u a l C V S M C s b y u s i n g a Z e i s s J e n a l u m a r m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h a n e p i f l u o r e s c e n c e d e t e c t o r . T h e l i g h t s o u r c e w a s a 2 0 0 W m e r c u r y a r c l a m p p o w e r e d b y a D C p o w e r s u p p l y . T h e l i g h t w a s f i r s t p a s s e d t h r o u g h o n e o f t h r e e d i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c e f i l t e r s w h i c h s e l e c t i v e l y p a s s e d t h e f o l l o w i n g w a v e l e n g t h s : 3 5 0 ± 1 0 , 3 8 0 ± 1 0 o r 3 6 5 ± 1 0 u r n ( F i g . 2 ) . T h e s e f i l t e r s w e r e h e l d i n a t u r r e t w h i c h c o u l d b e r o t a t e d b y a c o m p u t e r - c o n t r o l l e d s t e p p i n g m o t o r . T h e l i g h t w a s t h e n p a s s e d t h r o u g h a 4 1 0 n m d i c h r o i c m i r r o r a n d a l O O x a p o c h r o m a t i c o i l i m m e r s i o n l e n s w i t h a n u m e r i c a l a p e r t u r e o f 1 . 4 a n d a n a d j u s t a b l e d i a p h r a g m t o r e d u c e t h e l i g h t i n t e n s i t y . A f i e l d d i a p h r a g m i n t h e l i g h t p a t h p r i o r t o t h e d i c h r o i c m i r r o r w a s u s e d t o r e d u c e t h e a r e a o f i l l u m i n a t i o n t o t h e s i z e o f a s i n g l e C V S M C . A l l f l u o r e s c e n t l i g h t p a s s e d b a c k t h r o u g h t h e d i c h r o i c m i r r o r a n d a 4 5 0 u r n b a n d p a s s f i l t e r t o r e d u c e b a c k g r o u n d f l u o r e s c e n c e . T h e 3 6 5 n m f i l t e r w a s e m p l o y e d d u r i n g c e l l s e l e c t i o n , s i n c e b o t h t h e C a2 + - b o u n d a n d u n b o u n d f u r a - 2 m o l e c u l e s e m i t a s i m i l a r i n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e a t t h i s e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h ( F i g . 3 ) ( G r y i i k i e w i c z e t a l . 1 9 8 5 ) . T h e e m i t t e d f l u o r e s c e n c e t a k e n a t 3 5 0 u r n ( i n d i c a t o r f l u o r e s c e n c e e n h a n c e d b y C a2+ b i n d i n g ) a n d 3 8 0 r i m ( d e c r e a s e d b y C a2+ b i n d i n g ) w a s e i t h e r o b s e r v e d b y d e f l e c t i n g t h e l i g h t t o t h e m i c r o s c o p e e y e p i e c e , o r q u a n t i f i e d b y d e f l e c t i n g t h e l i g h t t o a p h o t o m u l t i p l i e r t u b e p l a c e d i n t h e c a m e r a p o s i t i o n o f t h e m i c r o s c o p e . T h e p h o t o m u l t i p l i e r c o n v e r t e d t h e l i g h t s i g n a l i n t o a D C v o l t a g e ( F i g . 2 ) . T h i s v o l t a g e w a s t h e n c o n v e r t e d t o d i g i t a l f o r m b y a n a n a l o g u e t o d i g i t a l c o n v e r t e r b o a r d i n a n I B M c o m p a t i b l e c o m p u t e r , a n d s t o r e d o n t h e 3 4 F i g u r e 2 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e s y s t e m f o r m e a s u r i n g [ C a2 + I i u s i n g t h e f l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2 . 3 5 1 . M e r c u r y A r c L a m p w e i g h t b a l a n c e s ( n o f i l t e r s ) 9 . P h o t o m u l t i p l i c r T u b e 8 . i f w a v e l e n g t h o f l i g h t s > 4 1 0 n m 3 . D i c h . r o i c M i r r o r 5 . E x c i t a t i o n a t 3 5 0 o r 3 8 0 n m 1 0 . D A T A A N A L Y S I S D i g i t a l d a t a c o n v e r t e d t o ( C a2i I . I I I I C o m p u t e r c o n v e r t s f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y t o d i g i t a l f o r m 2 . F i l t e r t u r r e t j 7 . G 2 5 1 f i l t e r 3 6 5 n m 3 S O n s n — 4 . i f w a v e l e n g t h o f l i g h t i s < 4 1 0 n m 3 S O n m 6 . E m i s s i o n a t 5 0 0 n . m I I 3 6 F i g u r e 3 . E x c i t a t i o n s p e c t r a o f 1 m M f u r a - 2 . B o t h t h e C a2 + b o u n d a n d t h e u n b o u n d f u r a - 2 e m i t a s i m i l a r i n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e a t a n e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h o f 3 6 5 m n . 3 7 7. peak at 335 nm 6 — Ca2-BOUND FURA-2 — a-UNBOUND FURA-2 4. pcaka3ó2nm 00 LE1O (/JjV 1 equal intensity at 356 nm I I 300 320 340 360 380 400 EXCITATION WAVELENGTH (nm) EXCITATION SPECTRA OF 1 mM FURA—2. Adapted from Grynkicwicz et. al. 1985. 38 computer hard disk. Measurements of fluorescence ratios were obtained on a 5 second time base. Transient changes in [Ca2+ Ii occurring in less than 5 seconds could have gone undetected by this system. Fu.ra-2 measurements were made from a total of 110 cells in 40 cultures derived from 20 dissections. No significant trends were noted in the baseline or 5-HT stimulated calcium levels as a function of the number of days passed in vitro. This observation makes it unlikely that 5-HT sensitivity was being gradually down-regulated by the presence of serotonin in the culture medium. However, cultures derived from different dissections did show appreciable variability in the proportion of cells responsive to 5-HT, and in the degree of responsiveness the cells showed to serotonin. This variability could have resulted in part from the use of proteolytic enzymes, since it was very difficult to ensure that each dissection exposed the cells to the same degree of enzyme activity. However, the possibility that some of the variability noted is also present in vivo cannot be discounted. 2.3.4. Calculation of free intracellular calcium in CVSMCs. The concentration of free intracellular calcium [Ca2+ Ji in the cells studied was calculated using the following formula (Grynkiewicz et a!., 1985): [Ca2+ = Kd x x R - Rmin/Rmax - R where Kd = the equilibrium dissociation constant for the association of fura-2 with cytosolic free calcium: 224 M. = ratio of values: the fluorescence intensity at 380 nm with zero [Ca2+ ]/380 nm with infinite [Ca21 39 R= e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d r a t i o o f t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a t 3 5 0 n m / 3 8 0 n m . R m i n = r a t i o o f v a l u e s : t h e f l u o r e s c e n c e o f i n t e n s i t y a t 3 5 0 m n / 3 8 0 r i m w i t h z e r o [ C a2 1 . R m a x = r a t i o o f v a l u e s : t h e f l u o r e s c e n c e o f i n t e n s i t y a t 3 5 0 n m / 3 8 0 r i m w i t h i n f i n i t e [ C a2 + 1 . T h e v a l u e s o f i 3 , R m i n a n d R m a x w e r e d e t e r m i n e d b y c a l i b r a t i o n o f t h e s y s t e m , a s d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . F o r t h i s s t u d y , f 3 = 7 . 4 6 4 , R m j n = 0 . 5 8 4 , a n d R m a x = 5 . 5 4 9 . 2 . 3 . 5 . C a l i b r a t i o n o f t h e f u r a - 2 s y s t e m f o r d e t e r m i n a t i o n o f [ C a2 + ] j i n C V S M C s . C a l i b r a t i o n p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g 2 - 4 d a y o l d C V S M C c u l t u r e s l o a d e d w i t h f u r a - 2 A M i n t h e m a n n e r p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . A p a i r o f c u l t u r e s w a s f i r s t p l a c e d i n t h e m e a s u r i n g c h a m b e r f i l l e d w i t h H B S S , c o n t a i n i n g 1 . 0 m M C a2+ a n d 0 . 8 m M M g2+ . O n e c u l t u r e w a s t h e n e x p o s e d t o C a2+ f r e e H B S S c o n t a i n i n g 5 m M E G T A a n d 1 0 P M B r - A 2 3 1 8 7 , a n o n - f l u o r e s c e n t c a l c i u m i o n o p h o r e ( H S C R e s e a c h D e v e l o p m e n t C o r p o r a t i o n , T o r o n t o , C a n a d a ) . A f t e r 1 5 m i n u t e s , t h e r a t i o o f f l o u r e s c e n c e i n t e n s i t y a t 3 5 0 r i m a n d 3 8 0 r i m w a s m e a s u r e d i n 3 0 c e l l s , u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h [ C a2 + ] i w a s e f f e c t i v e l y 0 m M . T h i s r a t i o y i e l d e d t h e v a l u e o f R m i n . T h e s e c o n d c u l t u r e w a s n o w e x p o s e d t o s t a n d a r d H B S S c o n t a i n i n g 1 m M C a2 + a n d 1 0 J L M B r - A 2 3 1 8 7 . T h e r a t i o o f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e s a t 3 5 0 n m a n d 3 8 0 n m w a s m e a s u r e d i n 3 0 c e l l s , a s e x t r a c e l l u l a r C a2 + q u i c k l y e n t e r e d t h e c e l l a n d [ C a2 + J i b e c a m e e f f e c t i v e l y 1 m M . T h i s r a t i o y i e l d e d t h e v a l u e o f R m a x . T h e v a l u e o f 1 3 w a s c a l c u l a t e d b y 4 0 d i v i d i n g t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a t 3 8 0 n m o b t a i n e d f r o m t h e f i r s t c u l t u r e b y t h e v a l u e o b t a i n e d f r o m o f t h e s e c o n d c u l t u r e . T h i s e n t i r e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d i n t w o f u r t h e r c u l t u r e s p r e p a r e d f r o m a d i f f e r e n t d i s s e c t i o n . T h e v a l u e s o f R n i j n , R m a x a n d f 3 o b t a i n e d f r o m t h e s e c u l t u r e s d i d n o t d i f f e r f r o m t h e o r i g i n a l e s t i m a t e s b y m o r e t h a n 1 0 % . T h e a v e r a g e v a l u e s w e r e u s e d i n s u b s e q u e n t c a l c u l a t i o n s o f [ C a2 + ] j . 2 . 4 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o n i s o l a t e d C V S M C s . P a t c h c l a m p r e c o r d i n g s w e r e c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 1 - 2 3 o C ) . A t t h e t i m e o f r e c o r d i n g , o n e c u l t u r e d i s h c o n t a i n i n g c e l l s w a s t a k e n o u t o f t h e r e f r i g e r a t p r . T h e m a i n t e n a n c e s o l u t i o n w a s d r a w n o f f a n d r e p l a c e d w i t h 2 m l o f a b a t h i n g s o l u t i o n a p p r o p r i a t e t o t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n . T h e c u l t u r e d i s h w a s t h e n m o u n t e d o n t h e s t a g e o f a n i n v e r t e d , p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p e ( O l y m p u s C K , T o k y o , x 3 0 0 m a g n i f i c a t i o n ) . T h e m i c r o s c o p e , p a t c h c l a m p a m p l i f i e r h e a d - s t a g e a n d t h e p e r f u s i o n s y s t e m w e r e m o u n t e d o n a v i b r a t i o n d a m p i n g t a b l e ( K i n e t i c S y s t e m s I n c . , B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s ) a n d s h i e l d e d f r o m e l e c t r o m a g n e t i c r a d i a t i o n b y a F a r a d a y c a g e . R e c o r d i n g s w e r e m a d e u s i n g t h e c e l l - a t t a c h e d , w h o l e - c e l l ( c u r r e n t - c l a m p ) , i n s i d e - o u t p a t c h c o n f i g u r a t i o n s ( F i g . 4 ) o f t h e p a t c h c l a m p t e c h n i q u e . I n t h i s t e c h n i q u e , a l o w r e s i s t a n c e s e a l i s p r o d u c e d u p o n m e c h a n i c a l c o n t a c t b e t w e e n t h e e l e c t r o d e a n d t h e c e l l m e m b r a n e . W i t h g e n t l e s u c t i o n , t h e s e a l i n c r e a s e s i n r e s i s t a n c e b y 2 - 3 o r d e r s o f m a g n i t u d e , r e s u l t i n g i n a c e l l - a t t a c h e d g i g a o h m s e a l . B a c k g r o u n d n o i s e i s g r e a t l y r e d u c e d w i t h t h i s s e a l , l e a d i n g t o i m p r o v e d r e s o l u t i o n o f r e c o r d i n g s . A d d i t i o n a l s u c t i o n a p p l i e d t o t h e p a t c h c r e a t e d t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n f o r s t u d y o f b a s i c 4 1 F i g u r e 4 . S c b e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e p r o c e d u r e s u s e d t o m a k e t h e w h o l e - c e l l a n d i n s i d e - o u t p a t c h r e c o r d i n g s r e p o r t e d i n t h i s s t u d y . 4 2 L O W R E S I S T A N C E S E A L ( 5 0 M f l ) S U C T I O N J G I G A O H M S E A L C E L L A T T A C H E D P U L S E O F S U C T I O N , , / / \ P U L L / / v 1 7 A I R E X P O S U R E L W H O L E C E L L p I N S I D E - O U T R E C O R D I N G P A T C H 4 3 electrophysiological properties of the cells. To form an inside-out patch, the electrode was drawn away from the cell surface, creating a membrane vesicle at the electrode tip. The outer membrane of this vesicle was ruptured by brief passage through the solution/air interface (Hamill et al. 1981). 2.4.1. Preparation of patch electrodes Patch electrodes were pulled from capillary tubes of borosilicate glass (1.5 mm OD x 0.75 mm ID, Frederick Haer Corp, Brunswick, ME) in two successive steps on a modified David Kopf 700 vertical microelectrode puller. Electrode tip diameters ranged from 1-2 iL m. Electrodes were coated to within 50 m of their tips with 3140 RTV sealant (Dow Corning Corporation, Midland, Michigan) which reduced pipette-bath capacitance by forming a hydrophobic surface and increasing the wall thickness (Hamill et al. 1981). Patch clamp recordings of KCa channel activity were made from CVSMCs cultured for 2-3 days at 370C or alternatively from cells maintained at 40C, as described previously. It was evident that the latter procedure produced a higher probability of obtaining inside-out patches containing functional KCa channels. It was therefore decided to employ cells maintained at 4°C for all electrophysiological studies reported in this thesis. A disadvantage of using the cooled cell preparation was that both CVSMCsand other cell types retained a spherical morphology over the incubation period (see Results). For this reason, it was necessary to confirm the identity of each cell by means of the Masson trichrome test performed at the end of the recording session. Recordings were made from several cells in the same field. After completion of recording, the entire plate of cells was stained using 44 the Masson technique, without changing the field of cells visible in the microscope. Data from cells which failed to react positively to this test, or which dissociated from the cuture dish during staining were not used in this study. At the time of the experiment, the tip of each electrode was fire-polished to produce a clean and smooth tip rim. This facilitated the formation of a large resistance seal between the electrode and the cell membrane (Hamill et al. 1981). To carry out this step, the electrode was placed on the stage of a compound microscope (x480). The tip of electrode was brought to within 160 m of a platinum filament heated by the passage of DC current for about 1 second. After fire-polishing and filling with physiological saline, electrodes had resistances of 5-10 M2. 2.4.2. Gravity perfusion system for application of experimental solutions. A perfusion system was designed to apply experimental solutions to the cytoplasmic face of isolated membrane patches. The system comprised of eight 60 ml syringe barrels mounted above the stage of the microscope. Plastic taps were connected tightly to the end of each cylinder to allow for selection of the appropriate test solution. A short length of plastic tubing ran from this assembly to an L-shaped glass tube held in a micromanipulator. Following patch isolation, the orifice of this tube was moved to within 200 jm of the patch electrode tip. Tests performed using isolated inside-out patches containing KCa channels and solutions containing various concentrations of Ca2+ showed that membrane patches equilibrated with a new test solution within 25 seconds. 2.4.3. Experimental solutions 45 P r i o r t o r e c o r d i n g , t h e m e d i u m b a t h i n g t h e c e l l s w a s c h a n g e d t o a s t a n d a r d e x t r a c e l l u l a r s o l u t i o n c o n t a i n i n g ( i n m M ) : 1 4 0 N a C 1 ; 4 K C 1 ; 1 C a C 1 2 ; 1 M g C 1 2 ; 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . I n c e l l - a t t a c h e d a n d i n w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s , p a t c h p i p e t t e s w e r e f i l l e d w i t h a s o l u t i o n o f c o m p o s i t i o n ( m M ) : 1 4 0 K C 1 ; 3 N a C 1 ; 0 . 6 5 C a C 1 2 ; 3 E G T A ; 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . T h e f r e e C a2 + c o n c e n t r a t i o n i n t h i s s o l u t i o n w a s c a l c u l a t e d a t 1 0 - 8 M u s i n g p r o c e d u r e s d e v i s e d b y S t o c k b r i d g e ( 1 9 8 7 ) . T h e l e v e l o f f r e e C a2+ p r e s e n t a s a c o n t a m i n a n t i n o t h e r s a l t s w a s f o u n d t o b e b e l o w 1 0 - 5 M , a s m e a s u r e d b y a c a l c i u m - s e n s i t i v e e l e c t r o d e ( M o d e l 9 3 - 2 0 , O r i o n , M a s s a c h u s e t t s ) . T h i s v a l u e w a s s m a l l c o m p a r e d t o t h e t o t a l c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n n e e d e d i n a l l t h e E G T A b u f f e r e d s a l i n e s . A c o n t a m i n a t i o n l e v e l o f 8 x 1 0 - 6 M w a s a s s u m e d w h e n c a l c u l a t i n g t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f C a C l 2 r e q u i r e d i n e x p e r i m e n t a l s o l u t i o n s . D u r i n g r e c o r d i n g s f r o m i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s , p i p e t t e s u s u a l l y c o n t a i n e d a s o l u t i o n o f c o m p o s i t i o n ( i n m M ) : 1 4 0 K C 1 ; 1 0 H E P E S ; 3 E G T A ; 0 . 6 5 C a C 1 2 , p H 7 . 4 . T h e f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h i s s o l u t i o n w a s c a l c u l a t e d a t 1 0 n M ( S t o c k b r i d g e 1 9 8 7 ) . T h e c y t o p l a s m i c f a c e o f t h e i s o l a t e d m e m b r a n e p a t c h e s w a s n o r m a l l y e x p o s e d t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g ( i n m M ) : 1 4 0 K C 1 , 1 0 H E P E S , 3 E G T A , p H 7 . 4 , a n d t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t o t a l a n d f r e e C a2 + : 0 . 3 6 m M , 5 n M ; 0 . 6 5 m M , 1 0 n M ; 1 . 7 2 m M , 5 0 n M ; 2 . 1 9 n M , 0 . 1 M M ; 2 . 5 4 m M , 0 . 2 M M ; 2 . 7 9 m M , 0.51M; 2 . 7 m M , 1 M M ; 2 . 9 8 m M ,51L M ; 3 m M , 1 O J L M a n d 3 . 1 m M , 1 0 0 M M ( S t o c k b r i d g e 1 9 8 7 ) . T o d e t e r m i n e t h e p o t a s s i u m s e l e c t i v i t y o f K C a c h a n n e l s , 8 0 m M K C 1 w a s r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a C 1 o r C s C 1 , i n e i t h e r t h e p i p e t t e s o l u t i o n o r i n t h e s o l u t i o n b a t h i n g t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . R e p l a c e m e n t o f K + b y i o n s o f d i f f e r e n t m o b i l i t y i n s o l u t i o n l e a d t o t h e a p p e a r a n c e o f l i q u i d j u n c t i o n 4 6 p o t e n t i a l s . { H u b b a r d e t a l . 1 9 6 9 ) . T h e s e v o l t a g e s w e r e m e a s u r e d b y f l o w i n g e x p e r i m e n t a l s a l i n e s p a s t t h e t i p o f a p a t c h e l e c t r o d e f i l l e d w i t h s t a n d a r d e x t r a c e l l u l a r s o l u t i o n . L i q u i d j u n c t i o n p o t e n t i a l s w e r e i n d i c a t e d a s t h e c h a n g e i n z e r o - c u r r e n t p i p e t t e v o l t a g e m e a s u r e d b y t h e p a t c h c l a m p a m p l i f i e r . A p p r o p r i a t e c o r r e c t i o n s w e r e a p p l i e d t o t h e p a t c h p o t e n t i a l s m e a s u r e d d u r i n g e x p e r i m e n t a l s o l u t i o n c h a n g e s . C o r r e c t i o n f a c t o r s w e r e l e s s t h a n ± 5 m V . T h e e f f e c t o f t h e p o t a s s i u m c h a n n e l b l o c k e r t e t r a e t h y l a m m o n i u m ( T E A ) o n K C a c h a n n e l s w a s d e t e r m i n e d b y d i s s o l v i n g t h e c h l o r i d e s a l t o f t h e d r u g ( E a s t m a n K o d a k , R o c h e s t e r , N e w Y o r k ) i n t h e s o l u t i o n b a t h i n g t h e c y t o p l a s m i c f a c e o f i s o l a t e d m e m b r a n e p a L h e s . 2 . 4 . 4 . A n a l y s i s o f p a t c h c l a m p d a t a T h e g e n e r a l a r r a n g m e n t o f t h e a n a l y s i s s y s t e m i s s h o w n i n F i g u r e 5 . P a t c h e l e c t r o d e c u r r e n t s a n d v o l t a g e s w e r e r e c o r d e d u s i n g a L i s t E P C - 5 a m p l i f i e r ( M e d i c a l S y s t e m C o r p , N e w J e r s e y ) . S i g n a l s w e r e c a p t u r e d o n F M w i d e b a n d t a p e a t a b a n d w i d t h o f D C - 3 k H z ( - 3 d B , B e s s e l ) u s i n g a n i n s t r u m e n t a t i o n r e c o r d e r ( S t o r e 4 D S , R a c a l - D e c c a , E n g l a n d ) a n d d i s p l a y e d o n a r e c t i l i n e a r p e n r e c o r d e r ( D C - 1 0 0 H z , G o u l d , O h i o ) . D a t a a n a l y s i s p r o c e e d e d o f f - l i n e u s i n g a n A t a r i M e g a 4 c o m p u t e r ( A t a r i , S u n n y v a l e , C a l i f o r n i a ) a n d s o f t w a r e d e v i s e d b y I n s t r u t e c h C o r p o r a t i o n , N e w Y o r k . A f t e r a n a l o g u e - t o d i g i t a l ( A - D ) c o n v e r s i o n a t 8 k H z , c u r r e n t r e c o r d s 8 k B y t e s i n l e n g t h w e r e d i s p l a y e d o n a h i g h - r e s o l u t i o n m o n i t o r , a n d o b v i o u s a r t i f a c t s w e r e e d i t e d o u t . G a u s s i a n d i g i t a l f i l t e r i n g w a s a p p l i e d t o y i e l d a f i n a l c o r n e r f r e q u e n c y , f = 2 k H z ( - 3 d B ) u s i n g t h e r e l a t i o n 1 / f c2 = 1 / f 1 2 + 1 / f 2 2 w h e r e f i i s t h e G a u s s i a n f i l t e r c u t o f f a n d f 2 i s t h a t o f t h e t a p e r e c o r d e r o u t p u t f i l t e r ( C o i q u h o u n a n d S i g w o r t h , 1 9 8 3 ) . A t h r e s h o l d f o r e v e n t d e t e c t i o n w a s s e t a t 5 0 % o f t h e m e a n 4 7 F i g u r e 5 . B l o c k d i a g r a m o f t h e p a t c h c l a m p r e c o r d i n g s y s t e m . 4 8 [1 P a t C h C u r r e n t C e l l C u l t u r e D i s h D C - 3 K H z P i p e t t e V o l t a g e C ,0 , 0 0 c J o ’ - o S 0 4 9 single channel current for KCa channels encountered in the patch under study. Under-estimation of the durations of brief openings and closings barely crossing this threshold was addressed by applying a frequency correction factor. Open time distributions were valid down to the dead-time of the recording system, given as Td = 0.179/fc i.e. 90J.Ls (Colquhoun and Sigworth 1983). Frequency histograms of channel open times and amplitudes were constructed using bin widths 0.4 % of the total range of the parameter being plotted. Open time distributions were plotted on a logarithmic time axis. This transformed the exponential function y = A.e -t/r into a curve with peak amplitude at the time constant r and an area proportional to the number of events in that component (Sigworth and Sine 1987). Simplex maximization of likelihood was used to fit one, two or three exponential components to the observed open time distributions (Coiquhoun and Sigworth 1983). Curve fitting disregarded channel openings briefer than twice the system dead-time. Frequency distributions of current amplitudes were fitted by eye with computer- generated Gaussian functions. Currents and voltages were denoted with respect to the cytoplasmic face of the membrane in all recording configurations used. Reversal potentials for single channel currents were determined as the zero current intercepts of theoretical curves fitted to the data points by linear or non linear regression, as appropriate. The probability, Po of finding a single KCa channel in the open state during a recording of total duration, Ttt was calculated from the relation P0 = (Ti + T2 + ... + TN)/NTtot Here, N is the total number of functional KCa channels in the patch. Ti, T2, TN are the times when at least 1, 2 ... N channels were open (Mayer et al. 1990). 50 N t o o k v a l u e s i n t h e r a n g e 0 t o 4 , a s e s t i m a t e d b y d e p o l a r i z i n g e a c h p a t c h t o + 5 0 m V w i t h 1 m M C a2+ p r e s e n t a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . A c t i v e p a t c h e s g e n e r a l l y h a d 1 - 2 K C a c h a n n e l s p r e s e n t . A s n o t e d e a r l i e r C V S M C s w h i c h h a d b e e n c u l t u r e d a t 3 7 ° C t y p i c a l l y s h o w e d m o r e i n s i d e - o u t p a t c h e s d e v o i d o f K C a a c t i v i t y t h a n w a s t h e c a s e i n c e l l s m a i n t a i n e d a t 4 o C u n t i l u s e . F o r t h i s r e a s o n , t h e l a t t e r p r o c e d u r e w a s a d a p t e d i n a l l s i n g l e c h a n n e l s t u d i e s o n K C a c u r r e n t s p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s . R e s u l t s w e r e e x p r e s s e d a s m e a n ± S . E . M . T h e S t u d e n t ’ s t - t e s t o r A N O V A w a s u s e d t o e v a l u a t e d i f f e r e n c e s b e t w e e n e x p e r i m e n t a l g r o u p s . 5 1 Chapter 3 Results 3.1. Morphological characteristics of CVSMCs in vitro. Collagenase-trypsin treatment of isolated vessel fragments yielded a heterogeneous preparation consisting of various cell types and debris. These dispersed CVSMCs did not readily attach to the culture substrate, making it difficult to conduct fura-2 or electrophysiological studies on freshly isolated cells, However, after 2-3 days in vitro, many CVSMCs did become firmly attached to the substrate. The appearance of these preparations was dependent on the incubation protocol followed. After 2-3 days maintenance at 4°C, CVSMCs usually appeared as Masson positive cells of spherical shape with an average diameter of 12± O.6m (mean± SEM, n = 31). Occasionally, CVSMCs were slightly fusiform in shape on these plates. Small clusters of incompletely dissociated CVSMCs were also present in these preparations. These plates contained a number of Masson-negative cells , which were also of spherical shape (Fig. 6A). In preparations cultured for 2-3 days at 37°C, Masson positive CVSMCs retained the spherical morphology seen after low temperature incubation (Fig. 6B). However, the Masson negative cells in these cultures adopted flattened, extended morphologies characteristic of fibroblasts (Rose 1970) and polygonal endothelial cells maintained in vitro (Warren 1990). The cytoplasm of these background cells stained blue-grey under the Masson trichrome test (Fig. 6B). 52 F i g u r e 6 . P h o t o n i i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d r a t c e r e b r a l a r t e r y s m o o t h m u s c l e c e l l s i n v i t r o , t r e a t e d w i t h t h e M a s s o n t r i c h r o m e s t a i n . A , P r e p a r a t i o n i n c u b a t e d a t 4 0 C f o r 3 d a y s . M a s s o n p o s i t i v e C V S M C s a r e s t a i n e d r e d a n d a p p e a r a s s i n g l e c e l l s ( b l a c k a r r o w s ) o r a s s m a l l c l u s t e r s o f c e l l s ( o p e n a r r o w s ) . M a s s o n n e g a t i v e c e l l s ( w h i t e a r r o w s ) a n d d e b r i s a r e a l s o p r e s e n t . B , A s e c o n d p l a t e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 3 d a y s . T h e M a s s o n p o s i t i v e C V S M C s ( r e d ) h a v e r e t a i n e d a s p h e r i c a l s h a p e ( b l a c k a r r o w s ) . T h e M a s s o n n e g a t i v e b a c k g r o u n d c e l l s ( b l u e - g r e y ) h a v e d i f f e r e n t i a t e d i n t o f l a t t e n e d , e x t e n d e d s h a p e s ( w h i t e a r r o w s ) . 5 3 EDC0 I •0 ‘ “ p .,.,. S . I • “ S ED00 IP ‘ .90 , ;:, m C V S M C s i n c u b a t e d e i t h e r a t 4 ° C ( F i g . 7 A ) o r a t 3 7 ° C ( F i g . 7 B ) f o r 2 - 3 d a y s a l s o r e a c t e d p o s i t i v e l y o n i n c u b a t i o n w i t h a n t i - a - a c t i n a n t i b o d y , a n d w e r e r e a d i l y v i s u a l i z e d u s i n g t h e f l u o r e s c e n t F I T C m a r k e r . O m i s s i o n o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y f r o m t h i s p r o c e d u r e l e a d t o t h e l o s s o f s p e c i f i c l a b e l l i n g i n a l l p r e p a r a t i o n s t e s t e d ( F i g . 7 C ) . C V S M C s e x p o s e d t o t h e a n t i - a - a c t i n a n t i b o d y w e r e a l s o r e a d i l y v i s u a l i z e d u s i n g t h e p e r o x i d a s e m a r k e r ( F i g . 8 ) . T h e m o r p h o l o g y a n d s i z e o f a n t i b o d y - p o s i t i v e c e l l s a g r e e d w e l l w i t h r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g t h e M a s s o n t e s t . 3 . 2 . I n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m l e v e l o f C V S M C s i n c u l t u r e 3 . 2 . 1 . R e s t i n g [Ca2+]i o f C V S M C s i n c u l t u r e [Ca2+]i w a s d e t e r m i n e d u s i n g 2 - 3 d a y o l d c u l t u r e s o f C V S M C s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C , s i n c e t h e s m o o t h m u s c l e c e l l s i n t h e s e p l a t e s w e r e m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t f r o m b a c k g r o u n d c e l l s . M e a s u r e m e n t s o f f l u o r e s c e n c e r a t i o s f r o m a t o t a l o f 3 1 C V S M C s i n t h e s a m e c u l t u r e p l a t e s u s e d f o r c a l i b r a t i o n y i e l d e d a n a v e r a g e v a l u e o f r e s t i n g [Ca2+]i o f 3 9 . ± 3 . 6 n M . F l u o r e s c e n c e r a t i o s w e r e a l s o m e a s u r e d i n 1 1 0 a d d i t i o n a l c e l l s i n 2 8 o t h e r c u l t u r e s . [Ca2+]j w a s c a l c u l a t e d i n t h e s e c e l l s u s i n g t h e c a l i b r a t i o n f a c t o r s d e t e r m i n e d f r o m t h e f i r s t g r o u p o f p l a t e s . T h e s e c e l l s y i e l d e d a r e s t i n g [ C a2+ ] i l e v e l o f 4 1 ± 5 . 6 n M . T h i s v a l u e w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t d e t e r m i n e d i n t h e c a l i b r a t i o n p l a t e s ( P > 0 . 0 5 , S t u d e i t ’ s t - t e s t ) , i n d i c a t i n g t h a t f l u o r e s c e n c e r a t i o m e a s u r e m e n t s w e r e s t a b l e o v e r t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . 3 . 2 . 2 . E f f e c t o f s e r o t o n i n o n [ C a2 + ] j o f C V S M C S i n c u l t u r e 5 5 F i g u r e 7 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l e c r - a c t i n a n d v i s u a l i z e d u s i n g t h e f l u o r e s c e n t m a r k e r F I T C . A , A c u l t u r e i n c u b a t e d a t 4 ° C f o r 3 d a y s . A n t i b o d y p o s i t i v e C V S M C s a p p e a r b r i g h t g r e e n ( w h i t e a r r o w s ) . B . A c u l t u r e i n c u b a t e d f o r 3 d a y s a t 3 7 ° C . A n t i b o d y p o s i t i v e C V S M C s a g a i n a p p e a r b r i g h t g r e e n ( w h i t e a r r o w s ) . F a i n t l y s t a i n e d b a c k g r o u n d c e l l s e x h i b i t e d a d e g r e e o f a u t o - f l u o r e s c e n c e . C . A u t o - f l u o r e s c e n c e i s a l s o p r e s e n t i n a n e g a t i v e c o n t r o l c u l t u r e , i n c u b a t e d a t 3 7 o C f o r 3 d a y s a n d p r o c e s s e d i n t h e a b s e n c e o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y . C a l i b r a t i o n b a r i s 1 0 0 j m f o r a l l m i c r o g r a p h s . 5 6 Lc 3 S V wn001 F i g u r e 8 . P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t s m o o t h m u s c l e a - a c t i n a n d v i s u a l i z e d u s i n g t h e p e r o x i d a s e m a r k e r . A , A c u l t u r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 3 d a y s . A n t i b o d y p o s i t i v e C V S M C s a p p e a r d a r k b r o w n a n d a p p e a r e d a s s i n g l e c e l l s ( b l a c k a r r o w s ) o r s m a l l c l u s t e r s ( o p e n a r r o w s ) . A n t i b o d y n e g a t i v e b a c k g r o u n d c e l l s a r e a l s o p r e s e n t . B , A n e g a t i v e c o n t r o l c u l t u r e i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r 3 d a y s i n t h e a b s e n c e o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y . C a l i b r a t i o n b a r i s 1 0 0 c m f o r b o t h m i c r o g r a p h s . 5 8 4. w r j 1 C 0 C 3 S4 0 0 C 3 5 - H T ( 1 0 n M t o 1 0 0 1A M ) w a s a p p l i e d b y i n j e c t i n g 1 0 0 1 v o l u m e s o f t h e a g o n i s t i n t o t h e i n l e t p o r t o f t h e c e l l c h a m b e r . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , 5 - H T i n d u c e d a r a p i d , t r a n s i e n t i n c r e a s e o f [ C a2 + ] i a b o v e r e s t i n g l e v e l s f r o m 8 4 o u t o f 1 1 0 c e l l s t e s t e d . A t y p i c a l r e s p o n s e o f t h i s t y p e , i n d u c e d b y a p p l i c a t i o n o f 1 M 5 - H T , i s s h o w n i n F i g . 9 . T h e a v e r a g e t i m e c o u r s e o f t h e r e s p o n s e o f 1 3 c e l l s t o 1 M 5 - H T i s s h o w n i n F i g . 1 0 . N o e v i d e n c e w a s s e e n f o r o s c i l l a t o r y o r l o n g - l a s t i n g c h a n g e s o f f r e e C a2 + l e v e l s f o l l o w i n g t h e t r a n s i e n t a p p l i c a t i o n o f s e r o t o n i n t o C V S M C s . I t s e e m e d p o s s i b l e t h a t t h e 5 - H T i n d u c e d r i s e i n [ C a2 + I i s i m p l y r e f l e c t e d a n i n f l u x o f e x t r a c e l l u l a r C a2 + t h r o u g h v o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u m c h a n n e l s i n t h e s m o o t h m u s c l e c e l l m e m b r a n e . T h a t s u c h c h a n n e l s w e r e i n d e e d p r e s e n t o n C V S M C m e m b r a n e s w a s i n d i c a t e d b y t h e f a c t t h a t d e p o l a r i z a t i o n b y h i g h p o t a s s i u m s o l u t i o n s a l s o e v o k e d a i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m ( F i g . 1 1 ) . T o a d d r e s s t h i s p o s s i b i l i t y , t h e e f f e c t o f t h r e e k n o w n b l o c k e r s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2 + f l u x e s , n i f e d i p i n e , L a3 + a n d C o 2 + ( S u p r e n a n t e t a ! . 1 9 8 7 ) w e r e t e s t e d b y c o a p p l i c a t i o n w i t h 5 - H T . I t w a s f o u n d t h a t n e i t h e r 1 0 m M L a C 1 3 ( 4 o u t o f 4 c e l l s ) n o r 1 0 m M C 0 C 1 2 ( 4 o u t o f 4 c e l l s ) r e d u c e d t h e r i s e i n [ C a2+ I i e v o k e d b y a p p l i c a t i o n o f 1 M 5 - H T ( F i g . 1 2 , T a b l e I ) . N i f e d i p i n e ( 1 O J L M ) a l s o f a i l e d t o s i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h e r i s e i n [ C a2 + ] i a c t i v a t e d b y 1 M 5 - H T i n 4 o u t o f 4 c e l l s t e s t e d ( F i g . 1 3 , T a b l e I ) . I n c r e a s e s i n [ C a2 + ] i w e r e a l s o s e e n w h e n 5 - H T w a s a p p l i e d t o C V S M C s b a t h e d i n a c a l c i u m - f r e e m e d i u m ( 0 m M C a2± + 0 . 1 m M E G T A ) . H o w e v e r , u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s c e l l r e s p o n s i v e n e s s w a s t o o e r r a t i c f o r q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n s w i t h n o r m a l m e d i u m . T h e T r y p a n B l u e d y e e x c l u s i o n t e s t c o m f i r m e d t h a t t h e v i a b i l i t y o f C V S M C s c e l l s w a s g r e a t l y r e d u c e d o n e x p o s u r e t o C a2 + - f r e e m e d i u m . 6 0 F i g u r e 9 . T h e i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m , [ C a2+ I i , t r i g g e r e d b y a p p l i c a t i o n o f 5 - H T t o a s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l c u l t u r e d f o r 3 d a y s p r i o r t o u s e . A t t h e t i m e m a r k e d b y t h e a r r o w , 5 - H T w a s a p p l i e d b y r a p i d i n j e c t i o n o f a 1 0 0 j L 1 v o l u m e o f H B S S s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 M a g o n i s t i n t o t h e i n l e t t u b e o f t h e c e l l c h a m b e r . N o t e t h e e x p a n d e d t i m e s c a l e c o m p a r e d w i t h 5 - H T r e s p o n s e s s h o w n i n m o s t s u b s e q u e n t f i g u r e s . T h e l o n g l a t e n c y o f t h e r e s p o n s e i s l a r g e l y t h e r e s u l t o f p e r f u s i o n d e l a y s i n t h e d r u g d e l i v e r y s y s t e m . T e m p e r a t u r e 2 1 ° C . 6 1 2 0 0 1 , u M 5 — H T . 1 5 0 C . ‘ i o o L — J N A 0 • 0 0 . 4 0 . 8 1 . 2 1 . 6 2 . 0 T i m e ( m m ) 6 2 F i g u r e 1 0 . A v e r a g e t i m e c o u r s e o f t h e i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i t r i g g e r e d b y a p p l i c a t i o n o f l j M 5 - H T t o 1 3 C V S M C s i n 1 2 d i f f e r e n t c u l t u r e p l a t e s . T h e s e r e s p o n s e s h a v e b e e n n o r m a l i z e d b y p e a k a m p l i t u d e a n d a l i g n e d t e m p o r a l l y b y d e n o t i n g t h e t i m e a t o n s e t o f e a c h r e s p o n s e a s t = 0 . D a t a p o i n t s r e p r e s e n t t h e m e a n r e s p o n s e o f t h e 1 3 c e l l s m e a s u r e d a t a p a r t i c u l a r t i m e a f t e r r e s p o n s e o n s e t . 6 3 / \ 0 ( 1 ) I o 0 . 5 N I I I I . I 0 I z 0 . . . i . . — , - - 0 0 . 4 0 . 8 1 . 2 1 . 6 2 . 0 T i m e ( m m ) 6 4 Figure 11. Increase in [Ca2+Ji triggered by application of 100mM K+ saline to a cultured smooth muscle cell after 3 day in vitro. This solution was prepared by replacing sodium chloride isotonically with potassium chloride. A 100 .tl volume of this solution was injected into the inlet tube of the cell chamber at the time indicated by the arrow. 65 2 0 0 1 0 0 m M K + 1 5 0 C 1 0 0 + c \ J Q 0 L _ J I s 0 0 0 . 4 0 . 8 1 . 2 1 . 6 2 . 0 T i m e ( m m ) 6 6 F i g u r e 1 2 . E f f e c t o f L a3 + a n d C o 2 + o n s e r o t o n i n - i n d u c e d c h a n g e s i n [ C a2 + ] j o f a C V S M C c u l t u r e d f o r 3 d a y s p r i o r t o u s e . 5 - H T ( 1 M ) w a s a p p l i e d b y i n j e c t i o n o f 1 0 0 l v o l u m e s o f t h e a g e n t d i s s o l v e d i n H B S S i n t o t h e i n l e t t u b e o f t h e c e l l c h a m b e r . T h e t i m e s o f t h e s e i n j e c t i o n s a r e i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . A p p l i c a t i o n o f d r u g - f r e e H B S S s o l u t i o n i n t h i s m a n n e r ( c o n t r o l ) r e s u l t e d i n a s m a l l r i s e i n [ C a2 + ] i w h i c h w a s b e l o w t h e t h r e s h o l d l e v e l r e q u i r e d f o r a r e s p o n s e . D u r i n g t h e t i m e s i n d i c a t e d b y t h e h o r i z o n t a l b a r , L a3 + o r C o2 + w a s p e r f u s e d t h r o u g h t h e c e l l c h a m b e r a s 1 0 m M s o l u t i o n s o f t h e i r r e s p e c t i v e c h l o r i d e s a l t s . 6 7 200 LaCI3 CoCI2 (10mM) (10mM) 5—HT 5—HT 5—HT Control 5—HT 150 (1pM) 100 c ’ 1 0 ( 3 ‘‘ 50 A A A A 0 0 10 20 30 40 Time (mm) 6 8 Figure 13. Effect of nifedipine (10 M) on the rise in [Ca2+]i triggered by 1 M 5-HT in a CVSMC cultured for 3 days prior to use. Serotonin applications were made as shown by the arrows, using the procedure described for Fig. 12. Nifedipine was dissolved in HBSS and perfused over the cells, as indicated by the horizontal bar. 6 9 1 5 0 l O u M N i f e d i p i n e 1 2 0 l u M 5 — H T l u M 5 — H T . 1 C 1 ’ . / \ _ _ 6 0 ( _ ) L J 3 0 A A 0 ; 1 . T i m e ( m m ) 7 0 T a b l e I T h e i n f l u e n c e o f C o2+ , L a3+ , a n d n i f e d i p i n e o n t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n [ C a2j i n d u c e d b y 5 - H T i n c u l t u r e d r a t C V S M C s T r e a t m e n t % i n c r e a s e i n [ C a2j S t u d e n t ’ s t - t e s t o v e r b a s e l i n e l e v e l 5 - H T ( 1 M ) 1 1 5 ± 1 8 P < O . O 1 5 - H T + k e t a n s e r i n ( 5 n M ) 6 3 ± 9 ( n = 5 ) V 5 - H T ( 11L M ) 1 8 7 ± 3 8 P > O . 0 5 5 - H T + C o2( l O m M ) 1 9 0 ± 3 3 ( n = 4 ) 5 - H T ( 11M ) 1 6 2 ± 4 8 P > 0 . 0 5 5 - H T + L a3( 1 0 m M ) 1 6 5 ± 4 1 ( n = 4 ) 5 - H T ( 1 M ) 1 4 1 ± 1 6 P > 0 . 0 5 5 - H T + n i f e d i p i n e ( 1 0 M ) 1 3 8 ± 2 7 ( n = 4 ) 7 1 T h e e f f e c t s o f t h e p a r t i a l l y s e l e c t i v e 5 - H T 2 r e c e p t o r a n t a g o n i s t , k e t a n s e r i n , w e r e e x a m i n e d i n 1 0 c e l l s . K e t a n s e r i n ( 5 n M ) r e v e r s i b l y a t t e n u a t e d t h e 5 - H i ’ r e s p o n s e i n a l l 5 c e l l s t e s t e d ( F i g . 1 4 , T a b l e I ) . W h e n a p p l i e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 M , k e t a n s e r i n p r o d u c e d a c o m p l e t e b l o c k o f t h e r i s e i n [ C a2 h ] j t r i g g e r e d b y 1 j M 5 - H T i n S o u t o f 5 c e l l s t e s t e d . I n m a n y c a s e s , r e p e a t e d e x p o s u r e o f 5 - H T r e a c t i v e c e l l s t o a c o n s t a n t d o s e o f s e r o t o n i n l e a d t o a g r a d u a l l o s s o f r e s p o n s i v e n e s s t o t h e a g o n i s t . T h e l o s s o f r e s p o n s e s e e n d u r i n g r e p e a t e d a p p l i c a t i o n o f 5 - H T c o u l d o c c u r i n t h e a b s e n c e o f a n y i n c r e a s e i n t h e b a s e l i n e l e v e l o f f r e e c a l c i u m i n t h e c e l l ( F i g . 1 5 ) . T h i s d e c l i n e c o u l d n o t b e c o m p l e t e l y r e v e r s e d , e v e n b y w a s h i n g t h e c e l l u n d e r s t u d y i n s e r o t o n i n - f r e e s a l i n e f o r a p e r i o d o f 3 0 m i n u t e s . H o w e v e r , r o b u s t r e s p o n s e s t o 5 - H T c o u l d s t i l l b e d e t e c t e d i n o t h e r c e l l s i n t h e s a m e c u l t u r e , w h i c h h a d n o t p r e v i o u s l y b e e n e x p o s e d t o p h o t o e x c i t a t i o n . T h e e f f e c t o f 5 - H T o n [ C a2 + ] j w a s c l e a r l y d o s e - d e p e n d e n t , a s i s s h o w n i n F i g . 1 6 . T h i s l o g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n w a s o b t a i n e d f r o m 8 4 C V S M C s e x p o s e d t o a s i n g l e , t r a n s i e n t a p p l i c a t i o n o f 5 - H T , t o m i n i m i z e t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o f p h o t o e x c i t a n t w a v e l e n g t h s . Q u a n t i t a t i v e a s p e c t s o f t h i s l o g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h o u l d , h o w e v e r , b e i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n . T h e 1 0 0 1i l v o l u m e s o f a g o n i s t u s e d m a y h a v e b e e n s u b j e c t t o d i l u t i o n d u r i n g p a s s a g e t h r o u g h t h e c e l l c h a m b e r . I n a d d i t i o n , t h e a r t i f i c i a l i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i c a u s e d b y f l u i d i n j e c t i o n p r e c l u d e d a c c u r a t e m e a s u r e m e n t s f o r s e r o t o n i n d o s e s b e l o w 1 0 n M . U n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d , h o w e v e r , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e r e s p o n s e o f m o s t C V S M C s w a s a l r e a d y m a x i m a l a t a s e r o t o n i n d o s e o f 1 j L M . T h e c o n c e n t r a t i o n o f 5 - H T p r o d u c i n g a h a l f - m a x i m a l i n c r e a s e i n [ C a2 + ] i w a s 1 0 n M ( F i g . 1 6 ) . T h e 7 2 F i g u r e 1 4 . E f f e c t o f 5 n M k e t a n s e r i n o n t h e r i s e i n [ C a2 + ] i e v o k e d b y 1 M 5 - H T i n a C V S M C s t u d i e d a f t e r 2 d a y s i n v i t r o . 5 - H T w a s a p p l i e d b y i n j e c t i o n o f a 1 0 0 J L 1 v o l u m e o f d r u g , a s d e s c r i b e d i n p r e v i o u s f i g u r e s . D u r i n g t h e t i m e i n d i c a t e d b y t h e h o r i z o n t a l b a r , t h e c u l t u r e w a s p e r f u s e d w i t h H B S S s o l u t i o n c o n t a i n i n g 5 n M k e t a n s e r i n . T h e a n t a g o n i s t r e d u c e d , b u t d i d n o t a b o l i s h t h e r e s p o n s e o f t h i s c e l l t o 5 - H T . I n j e c t i o n o f d r u g - f r e e H B S S p r o d u c e d o n l y a s m a l l , a r t i f a c t u a l i n c r e a s e i n [ C a2+ J j ( c o n t r o l ) . 7 3 2 0 0 k e t a n s e r i n ( 5 n M ) c o n t r o l 5 — H T ( 1 M ) 5 — H T ( 1 , i M ) 5 — H T ( 1 i i M ) 1 6 0 . S 1 2 0 . r i + 0 1 8 0 o o L _ J 4 0 - A A A A 0 I I 0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 T i m e ( m m ) 7 4 F i g u r e 1 5 . D e c r e a s i n g r e s p o n s i v e n e s s o f a C V S M C c u l t u r e d f o r 3 d a y s t o r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s o f 0 . 1 j M 5 - H T . S e r o t o n i n w a s a p p l i e d b y i n j e c t i o n o f 1 0 0 1 v o l u m e s o f t h e a g e n t a t t h e t i m e s i n d i c a t e d b y t h e a r r o w s . 7 5 200 0.1 uM 5—HT 150 C + 100 \(“1 0 0 I J50 ____ •N _Y . A A A A 0 5 10 115W 20 25 Time (mm) 76 F i g u r e 1 6 . L o g - d o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h o w i n g t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n [ C a2j t r i g g e r e d b y v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f 5 - H T , t e s t e d i n a t o t a l o f 8 4 C V S M C s a f t e r 2 - 4 d a y s i n v i t r o . S y m b o l s s h o w t h e m e a n ± S E M v a l u e s f o r e a c h 5 - H T c o n c e n t r a t i o n u s e d . T h e s m o o t h c u r v e w a s d r a w n t o t h e e q u a t i o n : R e s p o n s e = 1 0 0 % I ( 1 + K / [ 5 - H T I ) w i t h K = 1 O n M . 7 7 1 0 0 - a ) c i : o 8 0 / 6 0 . — c i C , , 4 0 C ) — a ) C ) 2 0 0 i o i o8 i o i o6 1 o 1 o I o S e r o t o n i n ( M ) 7 8 m a x i m a l l e v e l o f [ C a2 + ] i a t t a i n e d d u r i n g s t i m u l a t i o n b y 5 - H T w a s a p p r o x i m a t e l y 1 7 0 n M . 3 . 3 . E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f i s o l a t e d C V S M C s T h e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s w e r e c o n d u c t e d o n C V S M C s m a i n t a i n e d f o r 2 - 3 d a y s a t 4 ° C p r i o r t o u s e . I t w a s f o u n d t h a t c e l l s t r e a t e d i n t h i s m a n n e r c o n s i s t e n t l y y i e l d e d a g r e a t e r p e r c e n t a g e o f m e m b r a n e p a t c h e s h a v i n g f u n c t i o n a l K C a c h a n n e l s t h a n w a s t h e c a s e f o r C V S M C s i n c u b a t e d a t 3 7 ° C . 3 . 3 . 1 . B a s i c e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f i s o l a t e d C V S M C s s t u d i e d w i t h c e l l - a t t a c h e d a n d w h o l e - c e l l , c u r r e n t c l a m p r e c o r d i n g s . D u r i n g p a t c h c l a m p r e c o r d i n g , p a t c h e l e c t r o d e s f o r m e d h i g h r e s i s t a n c e ( 1 0 - 5 0 G O ) s e a l s o n t h e m e m b r a n e o f C V S M C s i n a b o u t 7 0 % o f a t t e m p t s . P a t c h e l e c t r o d e s w e r e f i l l e d w i t h a s o l u t i o n o f c o m p o s i t i o n ( m M ) : 1 4 0 K C 1 , 3 N a C 1 , 0 . 6 5 C a C 1 2 , 3 E G T A a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . T h e p i p e t t e v o l t a g e w a s 0 m V . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , a b o u t 2 5 % o f t h e c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s h o w e d n o d i s c e r n a b l e s i n g l e c h a n n e l a c t i v i t y ( F i g . 1 7 A ) . I n t h e r e m a i n i n g 7 5 % o f t h e p a t c h e s , i n w a r d l y d i r e c t e d s m a l l a m p l i t u d e ( 1 - 2 p A ) s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e o b s e r v e d ( F i g . 1 7 B ) . S i n g l e c h a n n e l a c t i v i t y c o u l d b e m o d i f i e d i n c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s b y b a t h a p p l i c a t i o n o f 5 - H T i n t h e s t a n d a r d e x t e r n a l s a l i n e b a t h i n g t h e c e l l s . 5 - H T ( 1 - 1 0 M ) i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f i n w a r d l y d i r e c t e d , 8 - 1 0 p A s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s i n 6 / 1 0 c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e d a t a p i p e t t e p o t e n t i a l o f 0 m V ( F i g . 1 8 ) . T h e i d e n t i t y o f t h e s e c h a n n e l s w a s n o t i n v e s t i g a t e d 7 9 F i g u r e 1 7 . R e c o r d i n g s o b t a i n e d f r o m t w o c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e d i n t w o C V S M C s i n c u b a t e d a t 4 ° C f o r 3 d a y s p r i o r t o u s e . P a t c h e l e c t r o d e s w e r e f i l l e d w i t h a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 4 0 m M K C 1 . B a n d w i d t h D C - 2 k H z , p i p e t t e p o t e n t i a l 0 m V . A . N o d i s c e r n a b l e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e p r e s e n t i n t h i s p a t c h . B . S m a l l a m p l i t u d e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e p r e s e n t i n t h i s r e c o r d i n g . I n t h i s a n d i n a l l s u b s e q u e n t t r a c e s , i n w a r d m e m b r a n e c u r r e n t i s d e n o t e d b y d o w n w a r d d e f l e c t i o n f r o m b a s e l i n e . 8 0 18 SW0g ElV F i g u r e 1 8 . U p p e r p a n e l . L a r g e a m p l i t u d e , i n w a r d l y d i r e c t e d s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s e v o k e d i n a c e l l - a t t a c h e d p a t c h d u r i n g b a t h a p p l i c a t i o n ( b a r ) o f 1 0 0 M 5 - H T t o t h e e x p o s e d m e m b r a n e s u r f a c e o f a C V S M C . B a n d w i d t h D C - 2 0 0 H z . L o w e r p a n e l . P a r t o f t h e r e c o r d i n g s h o w n i n u p p e r p a n e l a t i n c r e a s e d t i m e r e s o l u t i o n ( D C - 2 k H z ) . P i p e t t e p o t e n t i a l 0 m V . T h e p a t c h e l e c t r o d e c o n t a i n e d 1 4 0 m M K C I . 8 2 SW VdOl S01 ydoi 0 JA.Jrl001LH5 f u r t h e r i n t h i s s t u d y . W h e n a p p l i e d a t a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n r a n g e ( 1 0 - 1 0 0 M M ) , 5 - H T a l s o i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f b r i e f , b i p h a s i c c u r r e n t s p i k e s i n 6 / 1 0 c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e d ( F i g . 1 9 ) . T h e s e e v e n t s w e r e a b o u t 1 0 p A i n p e a k - t o - p e a k a m p l i t u d e , w h e n m e a s u r e d a t a p i p e t t e p o t e n t i a l o f 0 m V . T h e s e c u r r e n t s w e r e s i m i l a r i n f o r m a n d a m p l i t u d e t o t h o s e a s s o c i a t e d w i t h a c t i o n p o t e n t i a l d i s c h a r g e i n h i g h i n p u t i m p e d a n c e c e l l s s t u d i e d u s i n g t h e c e l l - a t t a c h e d c o n f i g u r a t i o n ( F e n w i c k e t a l . 1 9 8 2 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t i s o l a t e d C V S M C s r e t a i n e d e l e c t r o - r e s p o n s i v e n e s s t o 5 - H i ’ a f t e r 2 - 3 d a y s i n v i t r o . T h e r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l o f a l a r g e s a m p l e o f C V S M C s w e r e m e a s u r e d u s i n g t h e w h o l e - c e l l , c u r r e n t - c l a m p r e c o r d i n g t e c h n i q u e . I n t h e s e s t u d i e s t h e p a t c h p i p e t t e s w e r e a g a i n f i l l e d w i t h a s a l i n e o f c o m p o s i t i o n ( m M ) : 1 4 0 K C 1 , 3 N a C 1 , 0 . 6 5 C a C 1 2 , 3 E G T A , 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . T h e r e s t i n g p o t e n t i a l s o f C V S M C s w e r e u n i m o d a l l y d i s t r i b u t e d w i t h a n a v e r a g e o f - 4 1 1 1 . 7 m V ( n = 6 9 ) , a n d r a n g e d f r o m - 1 8 m V t o - 6 9 m V ( F i g . 2 0 ) . T h e r e s i s t a n c e , c a p a c i t a n c e a n d t i m e c o n s t a n t o f t h e C V S M C m e m b r a n e w e r e e s t i m a t e d b y a p p l y i n g s m a l l d e p o l a r i z i n g a n d h y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t s t o t h e p a t c h e l e c t r o d e ( F i g . 2 1 ) . F l u c t u a t i o n s i n m e m b r a n e p o t e n t i a l w e r e n o t e d a t a l l m e m b r a n e v o l t a g e s , a n d t h e s e w e r e p a r t i c u l a r l y a p p a r e n t w h e n t h e m e m b r a n e w a s s t r o n g l y h y p e r p o l a r i z e d o r d e p o l a r i z e d . A p p l i c a t i o n o f s t r o n g d e p o l a r i z i n g s t i m u l i e v o k e d o n l y s m a l l ( 1 0 - 1 5 m V ) r e g e n e r a t i v e r e s p o n s e s a n d a c t i o n p o t e n t i a l s w e r e n o t o b s e r v e d . T h i s r e s u l t i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s c o n d u c t e d o n r a t C V S M C s i n i n t a c t v e s s e l s ( H i r s t e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s o f t w o t y p i c a l C V S M C s a r e s h o w n i n F i g . 2 2 . T h e r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l s o f t h e s e c e l l s w e r e - 3 1 m V a n d - 4 9 m V . I t c a n b e s e e n t h a t t h e m e a n s l o p e r e s i s t a n c e o f t h e s e c e l l s d e c r e a s e d m a r k e d l y a t 8 4 F i g u r e 1 9 . B i p h a s i c c u r r e n t s r e c o r d e d f o m a C V S M C a f t e r 2 d a y s i n v i t r o u s i n g t h e c e l l - a t t a c h e d c o n f i g u r a t i o n . T h e s o l u t i o n b a t h i n g t h e c e l l c o n t a i n e d 1 O O M 5 - H T . P i p e t t e p o t e n t i a l 0 m V . B a n d w i d t h D C - 2 k H z . T h e p i p e t t e s o l u t i o n c o n t a i n e d 1 4 0 m M K C 1 . 8 5 98 ‘Vd01 S JA.T11001in-c F i g u r e 2 0 . R e s t i n g membrane p o t e n t i a l s recorded f r o m 6 9 C V S M C s a f t e r 2 - 3 d a y s i n v i t r o a t 4 ° C . W h o l e - c e l l r e c o r d i n g m e t h o d s w e r e u s e d t o obtain t h e s e d a t a . P a t c h p i p e t t e s c o n t a i n e d 1 4 0 m M K C 1 a n d 3 m M N a C 1 . 8 7 1 4 1 2 ( I , c o 1 0 - 4 - , C a ) U ) - o ° 6 - d 4 . z 2 - — , — 0 — 1 0 — 2 0 — 3 0 — 4 0 — 5 0 — 6 0 — 7 0 — 8 0 — 1 0 0 R e s t i n g M e m b r a n e P o t e n t i a l ( m V ) 8 8 Figure 21. Voltage changes (lower traces) induced by application of constant current pulses (upper traces) in a CVSMC studied using the whole-cell, current clamp technique. Resting potential -31 mV, cell diameter 12.5 J L m. Pipette solution contained 140 mM KC1 and 3 mM NaCl. Bandwidth DC-200 Hz. 8 9 06 SI AWif doz Figure 22. Current-voltage relationships for two CVSMCs studied in the whole- cell, current clamp recording mode. The resting membrane potentials of these cells were -31 mV (closed circles) and -49 mV (open circles). The graph shows the change in. resting membrane potential, z V, evoked by application of constant current pulses of amplitude, I. Lines were fitted to data points by eye. Recording pitettes contained 140 mM KC1 and 3 mM NaCl. Temperature 21°C. 91 V ( m V ) 6 0 2 5 - 1 0 - y 3 I ( p A ) 1 7 - 6 0 - 8 0 I I — i 2 0 — 1 4 0 9 2 p o t e n t i a l s n e a r t o , a n d d e p o l a r i z e d f r o m t h e r e s t i n g m e m b r a n e v o l t a g e . T h e s l o p e o f t h e I - V r e l a t i o n s h i p a t t h e r e s t i n g p o t e n t i a l s i n d e c a t e d a m e m b r a n e r e s i s t a n c e , R o f 3 . 2 ± 0 . 4 8 G ) ( n = 2 0 ) . C e l l c a p a c i t a n c e a n d t i m e c o n s t a n t w e r e a s s e s s e d f r o m t h e d e c a y o f h y p e r p o l a r i z i n g e l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l s o f a b o u t 2 0 m V a m p l i t u d e i n 7 c e l l s . T h e s e d e c a y s w e r e w e l l f i t t e d b y a s i n g l e e x p o n e n t i a l t e r m , y i e l d i n g a n a v e r a g e m e m b r a n e t i m e c o n s t a n t o f m = 7 8 ± 2 6 m s ( n = 7 ) ( F i g . 2 3 ) . C e l l c a p a c i t a n c e w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e r e l a t i o n C m = T m / R m . A m e a n v a l u e o f 2 4 ± 2 . 3 p F w a s o b t a i n e d f r o m 7 c e l l s . T h i s v a l u e i s l a r g e r t h a n t h a t c a l c u l a t e d f o r l 2 j L m d i a m e t e r c e l l s , a s s u m i n g s p h e r i c a l s h a p e a n d a s p e c i f i c m e m b r a n e c o m p a c i t a n c e o f 1 j L F / c m2. 3 . 4 . K C a c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m C V S M C s I s o l a t e d i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m C V S M C s d i s p l a y e d a v a r i e t y o f s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w h e n e x p o s e d t o 1 4 0 m M K C 1 s o l u t i o n s a t b o t h m e m b r a n e f a c e s . I n s o m e c a s e s , s m a l l c u r r e n t s c o r r e s p o n d i n g t o s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e s i n t h e r a n g e 1 0 - 2 5 p S w e r e o b s e r v e d . T h e s e e v e n t s c o u l d r e a d i l y b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e a c t i v i t y o f K C a c h a n n e l s b y t h e i r s m a l l e r c o n d u c t a n c e a n d i n s e n s i t i v i t y t o c h a n g e s i n c a l c i u m i o n c o n c e n t r a t i o n a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . E v i d e n c e w a s o b t a i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f t w o c l a s s e s o f K C a c h a n n e l i n t h e s e p a t c h e s . T h e s e w e r e d i s t i n g u i s h e d o n t h e b a s i c o f a l a r g e d i f f e r e n c e i n s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e , a s m e a s u r e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s ( F i g . 2 4 ) . T h e f i r s t c l a s s o f c h a n n e l s , d e s i g n a t e d a s K ( C a ) L ( l a r g e c o n d u c t a n c e ) c h a n n e l s , w a s c h a r a c t e r i z e d b y a m e a n s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e o f 2 0 7 ± 1 0 p S ( n = 1 6 ) . T h e s e c o n d c a t e g o r y , d e s i g n a t e d a s K ( C a ) I ( i n t e r m e d i a t e 9 3 F i g u r e 2 3 . S e m i - l o g a r i t h m i c p l o t o f t h e d e c a y p h a s e o f a h y p e r p o l a r i z i n g e l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l e v o k e d i n a C V S M C m e m b r a n e u n d e r w h o l e c e l l , c u r r e n t - c l a m p c o n d i t i o n s . T h i s c e l l h a d a r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l o f - 3 9 m V . T h e g r a p h s h o w s t h e d e v i a t i o n , V o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l f r o m t h i s r e s t i n g l e v e l a s a f u n c t i o n o f t i m e s i n c e t h e t e r m i n a t i o n o f t h e s t i m u l a t i n g c u r r e n t p u l s e . D a t a p o i n t s w e r e f i t t e d b y a s t r a i g h t l i n e u s i n g l i n e a r r e g r e s s i o n . T h e a r r o w i n d i c a t e s t h e m e m b r a n e t i m e c o n s t a n t i - = 9 8 m s . 9 4 3 0 2 0 1 0 • e . . . . . 1 • 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 T i m e ( m s ) 9 5 F i g u r e 2 4 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p s o f s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l s ( c i r c l e s , n = 1 6 p a t c h e s ) a n d K ( C a ) I c h a n n e l s ( t r i a n g l e s , n = 1 0 p a t c h e s ) s t u d i e d i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s bathed i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u m s o l u t i o n s . T h e s t r a i g h t l i n e s w e r e f i t t e d t o t h e data b y l i n e a r r e g r e s s i o n , a n d represent t h e mean s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e f o r K ( C a ) L c h a n n e l s ( 2 0 7 ± 1 0 p S ) a n d f o r K ( C a ) I c h a n n e l s (92± 2 . 6 p S ) . 9 6 L6 91—. . (Aw)A 0909017 9— . . 17 0—017—09—09— 9 . 91(yd)I c o n d u c t a n c e c h a n n e l s ) d i s p l a y e d a s i g n i f i c a n t l y s m a l l e r c o n d u c t a n c e , 9 2 ± 2 . 6 p S ( n = 1 0 ) , P < 0 . 0 5 i n S t u d e n t ’ s t - t e s t w i t h K ( C a ) L c l a s s . A s s h o w n i n F i g . 2 4 , t h e r e w a s l i t t l e o v e r l a p i n t h e c o n d u c t a n c e r a n g e s c h a r a c t e r i z e d b y t h e s e m e a n v a l u e s , s u g g e s t i n g t h a t i n d e e d t w o d i s t i n c t c l a s s e s o f e v e n t s w e r e p r e s e n t . I t w a s a l s o n o t e d t h a t t h e m e a n K ( C a ) L c h a n n e l c o n d u c t a n c e w a s n o t s i m p l y a n i n t e g e r m u l t i p l e o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l c o n d u c t a n c e , i n d i c a t i n g t h a t t h e f o r m e r e v e n t s d i d n o t r e s u l t f r o m t h e s i m u l t a n e o u s o p e n i n g o f t w o o r m o r e K ( C a ) I c h a n n e l s . F o r t h e s e r e a s o n s , i t w a s d e c i d e d t o t r e a t K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c u r r e n t s a s t w o d i s t i n c t c l a s s e s o f e v e n t , a n d t o a s s e s s t h e i r p r o p e r t i e s w i t h r e g a r d t o i o n i c s e l e c t i v i t y , C a2 + a n d v o l t a g e d e p e n d e n c e a n d s e n s i t i v i t y t o t h e b l o c k i n g a c t i o n o f T E A . T h e p r o p e - t i e s o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l w i l l b e d e s c r i b e d f i r s t , s i n c e t h i s t y p e w a s e n c o u n t e r e d m o r e f r e q u e n t l y t h a n t h e s m a l l e r K ( C a ) I c h a n n e l . 3 . 4 . 1 . C o n d u c t a n c e a n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s a s c r i b e d t o t h e o p e n i n g o f K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e o b s e r v e d i n 1 6 / 2 0 i n s i d e - o u t p a t c h e s s t u d i e d . F i g . 2 5 s h o w s c u r r e n t s f l o w i n g t h r o u g h a s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l i n a n i n s i d e - o u t p a t c h v o l t a g e - c l a m p e d a t v a r i o u s m e m b r a n e p o t e n t i a l s . T h i s p a t c h w a s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K ± s o l u t i o n s a n d [ C a2+ ] i w a s 1 0 A M . F i g . 2 6 s h o w s t h e a m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d f o r K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m a p a t c h a t m e m b r a n e p o t e n t i a l s - 3 0 m V a n d + 3 0 m V . A t m e m b r a n e p o t e n t i a l s i n t h e r a n g e - 8 0 m V t o + 8 0 V , t h e s e d i s t r i b u t i o n s w e r e w e l l f i t t e d b y a s i n g l e G a u s s i a n t e r m i n a l l 1 6 p a t c h e s s t u d i e d . T h i s r e s u l t s h o w s t h a t t h e K ( C a ) L c h a n n e l d i d n o t e x h i b i t s i g n i f i c a n t s u b s t a t e c o n d u c t a n c e b e h a v i o r w h e n s t u d i e d i n e x c i s e d m e m b r a n e p a t c h e s . 9 8 Figure 25. Single-channel currents flowing through a K(Ca)L channel in an inside-out patch voltage-clamped at various membrane potentials, V. This patch was bathed in symmetrical 140 mM K+ solutions, [Ca2+]j and [Ca2+Jo were 10 J L M and 0.01 M respectively. 0 indicates channel closed and 1 indicates channel open. Bandwidth DC-200 Hz. 9 9 6 5 U ’1 4 5 rrTwrflr111 2 5 1Tt 1 P ’ I ’ f r r T T l I ‘ ‘ r r g w n 1 r ’ i 1 r L V ‘ j r v 1 T r ’ 1 T . 7 I q T r I 1 j ’ i r r n p ’ I f ’ T ‘ T I ’ 1 1 n q ’ 0 — 2 5 i i I l h l l L H H L L h L . L I 1 i i I . d L i I I L I l i i i L I L L l i L . i J1L L i i i L i l I t I l L J d I i i i i I I . l I . 1 1 1 1 1 1 1 I A . I - 4 5 - 6 5 . - — — - - — — — — - . - — — - - — - - . . - * 1 I a I I S 5 s l O p A V ( m V ) 0 1 0 0 1 0 0 F i g u r e 2 6 . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o f K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s o b t a i n e d f r o m a i n s i d e - o u t p a t c h v o l t a g e - c l a m p e d t o m e m b r a n e p o t e n t i a l s o f ( A ) + 3 0 m V , ( B ) - 3 0 m V . B o t h d i s t r i b u t i o n s w e r e w e l l f i t t e d b y s i n g l e G a u s s i a n t e r m s ( s m o o t h c u r v e s ) w i t h m o d a l v a l u e s a c c u r r i n g a t 6 . 2 7 p A i n ( A ) a n d a t - 6 . 4 8 p A i n ( B ) . P a t c h w a s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s a n d [Ca2+]i w a s 1 O M . [Ca2+Jo = 0 . O 1 , L M . 1 0 1 A1 2 0 - , , 1 0 0 - C 0 > L . . a ) C ’ ) - 0 4 0 - 2 : ] 1 ’ 2 1 ’ 6 0 A m p l i t u d e ( p A ) B 1 O o 0 8 0 0 6 0 0 L . c i ) 0 4 0 z2 0 0 — - j - - - - - O p A 5 1 0 A m p l i t u d e ( p A ) 1 0 2 In patches bathed in symmetrical 140 mM KC1 solutions, the I-V relationship of the K(Ca)L channel was linear over the voltage range -80 mV to + 80 mV, showed a reversal potential of 0 mV and a mean slope conductance of 207± 10 pS (n = 16, Fig. 27). The range of conductance values encountered in different patches was from 170 pS to 267 pS. The permeability of the open channel to potassium, PK was calculated from the I-V relation in symmetrical 140 mM K+, using the Goldman-Hodgkin- Katz constant-field equation (Goldman, 1943; Hodgkin & Katz, 1949): ‘K = PK.VF2/RT{[K + ]o-[K + Ji exp(VF/RT)}/ { 1-exp(VF/RT)} (1) When [K+]o = [K+Jj, Equation 1 simplifies to 1K = PK.VF2[K+]/(RT) (2) Here, 1K is the current through an open channel, V is membrane potential, [K+ ]o = [K+ Ji = 140 mM, F is Faraday’s constant, R is the gas constant, T is the absolute temperature and o and i indicate outside and inside (cytoplasmic) concentrations of ions respectively (Benham et al. 1986). Using Equation 2, a PK of 3.9 x 10-13 cm/s was calculated from the I-V plots averaged from sixteen patches (Fig. 27). When 80 mM KC1 in the solution bathing the external membrane face was replaced by an equimolar amount of NaCI, currents flowing in single K(Ca)L channels reversed at a potential around -21 mV (Fig. 28A). An average Vrev of 21.2 0.50 mV was obtained from 5 patches (see Fig. 29). This value 103 Figure 27. Current-voltage (I-V) relationship of single K(Ca)L channel currents averaged from 16 patches bathed in symmetrical 140 mM potassium solutions. It was found that the I-V relationship of the K(Ca)L channel was linear over the voltage range -80 mV to + 80 mV, showed a reversal potential at 0 mV, and a mean slope conductance of 207± 10 pS. Error bars are ±SEM. In this and in all subsequent figures showing standard errors, this parameter is omitted if its value is less than the size of the symbol. 104 1 6 i ( p A ) 1 2 O u t w a r d . 4 — 8 0 — 6 0 — 4 0 — 2 0 L I I I I I I I I I I I 1 I I I 2 0 4 0 6 0 8 0 V ( m V ) . 4 1 2 I n w a r d 1 6 1 0 5 F i g u r e 2 8 . E f f e c t s o f N a + o r C s + r e p l a c e m e n t o f K + o n t h e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s i n K ( C a ) L c h a n n e i s . S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s a t v a r i o u s m e m b r a n e p o t e n t i a l s , V ; w e r e o b t a i n e d f r o m a p a t c h w i t h o n e a c t i v e c h a n n e l w h e n 8 0 m M K C 1 i n t h e p i p e t t e w a s r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a C 1 i n A , a n d o f C s C 1 i n B . 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n . B a n d w i d t h D C - 2 k F I z . [ C a2 + J j , 1 0 0 M a n d [ C a2 1 o , 0 . 0 1 M . A a n d B w e r e o b t a i n e d f r o m d i f f e r e n t p a t c h e s . 1 0 6 SW001 yds :‘ W001 yd 11 ::z 0$, (wA LO I— I— I—— - I_—-.—.---—-‘--. :. 09- IZ LILLL V Figure 29. Current-voltage (I-V) relationship of single K(Ca)L channel currents when 80 mM KCI at the cytoplasmic (open squares) or external membrane face (filled diamonds) was replaced by NaC1. The symbols show mean currents calculated from 5 patches. Standard error bars were omitted if less than the symbol size. The thick solid lines show currents predicted from constant-field theory, assuming PK = 3.5 x 10-13 cm/s (external K+ replacement) or PlC 4.0 x 10-13 cm/s (cytoplasmic K+ replacement). All the currents observed fall within the range of values predicted from the constant-field equation, using the extreme values of PK seen in symmetrical 140 mM solutions (thin lines). [Ca2+]j = 100PM. [Ca2+]o 0.0lM. 108 1 6 i ( p A ) 1 2 O u t w a r d 1 0 - o - o 8 V ( m V ) 4 0 6 0 8 0 • 8 I n w a r d 1 2 1 6 1 0 9 i s v e r y c l o s e t o t h e r e v e r s a l p o t e n t i a l e x p e c t e d f o r a p o t a s s i u m s e l e c t i v e c h a n n e l u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ( V r e v = - 2 1 . 4 m V ) . W h e n 8 0 m M K C 1 i n t h e s o l u t i o n b a t h i n g t h e c y t o p l a s m i c f a c e w a s r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a C 1 , c u r r e n t s i n K ( C a ) L c h a n n e l r e v e r s e d a t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f + 2 1 . 2 ± 0 . 3 7 m V ( n = 5 , s e e F i g . 2 9 ) , a g a i n v e r y c l o s e t o t h e N e r n s t i a n r e v e r s a l p o t e n t i a l v a l u e f o r K + ( + 2 1 . 4 m V ) . T h e s e r e v e r s a l p o t e n t i a l s w e r e u s e d t o c a l c u l a t e t h e p e r m e a b i l i t y t a t i o P N a / P K , e m p l o y i n g t h e r e l a t i o n V r e v = ( R T / z F ) l n [ ( P N a [ N a ] o + P K [ K ] o ) / ( P N a [ N a ] j + P K [ K ] j ) ] ( 3 ) ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . H e r e V r e v i s t h e o b s e r v e d r e v e r s a l p o t e n t i a l , a n d z i s t h e v a l e n c e . A v a l u e o f P N a / P K < 0 . 0 5 w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n g a h i g h d e g r e e o f s e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s i n t h i s c h a n n e l . I t w a s a l s o n o t e d t h a t , s i n c e E Q w a s 0 m V t h r o u g h o u t t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e p e r m e a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l t o C l - m u s t b e v e r y l o w . T h e p o t a s s i u m s e l e c t i v e n a t u r e o f t h i s c h a n n e l w a s l a t e r c o n f i r m e d i n e x p e r i m e n t s w i t h t h e p o t a s s i u m c h a n n e l b l o c k e r s C s + a n d T E A , a s w i l l b e d e s c r i b e d i n a l a t e r s e c t i o n . U n d e r t h e a s s u m p t i o n o f n e g l i g i b l e p e r m e a b i l i t y t o N a + , t h e c o n s t a n t - f i e l d r e l a t i o n ( E q u a t i o n 1 ) w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e e x p e c t e d c u r r e n t t h r o u g h K ( C a ) L c h a n n e l s w h e n 8 0 m M K + w a s r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a + a t t h e c y t o p l a s m i c o r a t t h e e x t e r i a l m e m b r a n e f a c e . I n c a l c u l a t i n g t h e s e c u r r e n t s , t h e p a r a m e t e r P K w a s a l l o w e d t o v a r y b e t w e e n 3 . 3 x 1 0 - 1 3 c m / s a n d 4 . 9 x 1 0 - 1 3 c m / s , t h e e x t r e m e v a l u e s n o t e d f o r K ( C a ) L c h a n n e l s s t u d i e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . I t c a n b e s e e n t h a t t h e m e a n c u r r e n t s o b s e r v e d i n 5 p a t c h e s w e r e w e l l p r e d i c t e d b y c o n s t a n t - f i e l d t h e o r y w h e n P K = 3 . 5 x 1 0 - 1 3 c m / s ( r e p l a c e m e n t o f 8 0 m M e x t e r n a l K + b y N a + ) a n d P K = 4 . 0 x 1 0 - 1 3 c m / s ( r e p l a c e m e n t o f 8 0 m M i n t e r n a l K ± b y N a + ) ( F i g . 2 9 ) . F i g . 2 9 a l s o s h o w s ( a s t h i n s o l i d l i n e s ) t h e 1 1 0 c u r r e n t t h r o u g h t h e K ( C a ) L c h a n n e l c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x t r e m e v a l u e o f P K n o t e d e a r l i e r , n a m e l y 3 . 3 x 1 0 - 1 3 c m / s a n d 4 . 9 x l O - l3 c m / s . I t i s e v i d e n t t h a t a l l t h e c u r r e n t s o b s e r v e d d u r i n g N a + r e p l a c e m e n t o f K + f a l l w i t h i n t h e r a n g e o f v a l u e s p r e d i c t e d f r o m t h e c o n s t a n t - f i e l d e q u a t i o n . I t w a s t h e r e f o r e c o n c l u d e d t h a t N a + i o n s d o n o t i n t e r f e r e w i t h t h e p a s s a g e o f K + i o n s t h r o u g h t h e K ( C a ) L c h a n n e l , u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y . 3 . 4 . 2 . E f f e c t o f K + r e p l a c e m e n t b y C s + o n c u r r e n t f l o w t h r o u g h K ( C a ) L c h a n n e l s . T h e e f f e c t s o f r e p l a c i n g 8 0 m M K C 1 b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f C s C 1 i n e i t h e r t h e c y t o p l a s m i c o r t h e e x t e r n a l b a t h i n g s o l u t i o n w e r e e a c h s t u d i e d i n 5 p a t c h e s . W h e n C s + r e p l a c e d K + a t t h e e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e , t h e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s h a d a r e v e r s a l p o t e n t i a l c l o s e t o - 2 1 m V ( F i g . 2 8 B ) . A n a v e r a g e v a l u e o f V r e v = - 2 1 . 3 ± 0 . 4 6 m V w a s o b t a i n e d f r o m 5 p a t c h e s ( s e e F i g . 3 0 ) . R e p l a c e m e n t o f 8 0 m M K ± i n t h e c y t o p l a s m i c b a t h i n g s o l u t i o n b y e q u i m o l a r C s + r e s u l t e d i n a r e v e r s a l p o t e n t i a l o f + 2 1 . 2 ± 0 . 5 1 m V ( 5 p a t c h e s , s e e F i g . 3 0 ) . T h e s e r e v e r s a l p o t e n t i a l s w e r e u s e d t o c a l c u l a t e t h e p e r m e a b i l i t y r a t i o P C s / P K , e m p l o y i n g E q u a t i o n 3 . A v a l u e o f P C s / P K < 0 . 0 5 w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e K ( C a ) L c h a n n e l i s v e r y p o o r l y p e r m e a b l e t o C s + . I t w a s a l s o n o t e d t h a t c u r r e n t s i n s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l s r e c o r d e d i n t h e p r e s e n c e o f C s + e x h i b i t e d a g r e a t e r n o i s e v a r i a n c e , w h e n c o m p a r e d w i t h c u r r e n t s r e c o r d e d i n s y m m e t r i c a l K + g r a d i e n t s , o r d u r i n g r e p l a c e m e n t o f K + b y N a + ( s e e F i g s . 2 5 a n d 2 8 ) . T h i s o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h a f l i c k e r i n g b l o c k o f o p e n K ( C a ) L c h a n n e l s b y C s + , a s h a s p r e v i o u s l y b e e n o b s e r v e d i n o t h e r t y p e s 1 1 1 F i g u r e 3 0 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l c u r r e n t s w h e n 8 0 m M K C 1 a t t h e c y t o p l a s m i c ( f i l l e d t r i a n g l e s ) o r e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e ( o p e n t r i a n g l e s ) w a s r e p l a c e d b y C s C l . S y m b o l s s h o w m e a n c u r r e n t s o b t a i n e d f r o m 5 p a t c h e s . S t a n d a r d e r r o r b a r s w e r e o m i t t e d i f s m a l l e r t h a n s y m b o l . S o l i d l i n e s s h o w p r e d i c t e d c u r r e n t s a s s u m i n g c o n s t a n t - f i e l d b e h a v i o r , c a l c u l a t e d f o r t h e e x t r e m e v a l u e s o f P K s e e n i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . M e a n c u r r e n t s w e r e s m a l l e r t h a n p r e d i c t e d b y t h e c o n s t a n t - f i e l d e q u a t i o n , e s p e c i a l l y u n d e r c o n d i t i o n s p r o m o t i n g t h e e n t r y o f C s + i n t o t h e K ( C a ) L c h a n n e l ( i . e . a t n e g a t i v e p o t e n t i a l s w h e n C + w a s p r e s e n t i n t h e e x t e r n a l s o l u t i o n a n d a t t h e p o s i t i v e p o t e n t i a l s w h e n C s + w a s a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . [ C a2+ ] j = 1 0 0 P M . [ C a2± ] o = O . 0 l M . 1 1 2 1 6 i ( p A ) 1 2 O u t w a r d - 8 0 - 6 0 — 4 0 — 2 / , , , , , , V V 4 0 6 0 8 0 V ( m V ) 1 2 I n w a r d 1 6 1 1 3 o f K C a c h a n n e l ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . I n d i v i d u a l b l o c k i n g a n d u n b i o c k i n g e v e n t ; w e r e a t l e a s t p a r t i a l l y r e s o l v e d a t a 2 k H z b a n d w i d t h . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e r a t e c o n s t a n t s f o r c h a n n e l b l o c k a n d u n b l o c k w e r e n o t v e r y f a s t , s i n c e t h i s w o u l d r e s u l t i n a s m o o t h e d , t i m e - a v e r a g e d v a l u e o f c u r r e n t t h r o u g h t h e c h a n n e l ( Y e l l e n 1 9 8 4 a , b ) . T h e o c c u r r e n c e o f s i g n i f i c a n t n o i s e d u r i n g c u r r e n t f l o w i n t h e p r e s e n c e o f C s + m a d e i t d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e a n a p p r o p r i a t e m e a n c h a n n e l c u r r e n t f o r u s e i n I - V p l o t s . F o r t h i s r e a s o n , t h e s e c u r r e n t s w e r e s u b j e c t e d t o f u r t h e r d i g i t a l f i l t e r i n g t o r e d u c e t h e i r e f f e c t i v e b a n d w i d t h t o D C - 4 0 0 H z . A s s h o w n i n F i g . 3 1 , t h i s p r o c e d u r e r e s u l t e d i n a s m o o t h , t i m e - a v e r a g e d c u r r e n t s u i t a b l e f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f I - V p l o t s ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 6 ) . M e a n v a l u e s o f s u c h c u r r e n t s o b t a i n e d f r o m 5 p a t c h s t e s t e d w i t h c y t o p l a s m i c o r e x t e r n a l s u b s t i t u t i o n o f 8 0 m M K + b y C s + a r e s h o w n i n F i g . 3 0 . T h i s F i g u r e a l s o s h o w s t h e r a n g e o f e x p e c t e d c u r r e n t s t h r o u g h t h e K ( C a ) L c h a n n e l , u n d e r t h e a s s u m p t i o n t h a t C s + i s n o n - p e r m e a b l e b u t d o e s n o t b l o c k t h e p a s s a g e o f K + t h r o u g h t h e c h a n n e l . A s w a s t h e c a s e i n F i g . 2 9 , t h e s e t h e o r e t i c a l c u r r e n t s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e c o n s t a n t - f i e l d r e l a t i o n , u s i n g t h e e x t r e m e v a l u e s o f P K n o t e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . I t w a s n o t e d t h a t t h e o b s e r v e d c u r r e n t s w e r e s m a l l e r t h a n p r e d i c t e d b y c o n s t a n t - f i e l d t h e o r y , e s p e c i a l l y u n d e r c o n d i t i o n s p r o m o t i n g t h e e n t r y o f C s + i n t o t h e K ( C a ) L c h a n n e l , t h a t i s a t n e g a t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s w i t h C s + i n t h e e x t e r n a l s o l u t i o n , a n d a t p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s w i t h C s + a t t h e c y t o p l k s m i c m e m b r a n e f a c e ( F i g . 3 0 ) . A s s u m i n g t h a t t h e f l i c k e r b l o c k b y C s + i s n o t i n f l u e n c e d b y o t h e r i o n s , t h e n t h e t i m e - a v e r a g e d c u r r e n t t h r o u g h t h e b l o c k e d c h a n n e l i s g i v e n a s : 1 1 4 F i g u r e 3 1 . S i n g l e c h a n n e l K ( C a ) L c u r r e n t r e c o r d i n g s f r o m a n i n s i d e - o u t p a t c h b a t h e d i n 1 4 0 m M K ± s o l u t i o n w i t h 1 0 01L M [ C a2 + f t . T h e p a t c h e l e c t r o d e c o n t a i n e d 6 0 m M K + a n d 8 0 m M C s + 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n . T h e s a m e g r o u p o f s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s i s s e e n a t a f i l t e r b a n d w i d t h o f D C - 2 k H z ( u p p e r t r a c e ) , a n d a t a f i l t e r b a n d w i d t h o f D C 4 0 0 H z ( l o w e r t r a c e ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l + 6 0 m V . 1 1 5 9L1 SWOS -0 -I 0 —I ii III. IIIiliiiIi III!‘1’•i Ir’ir •T1J.I[.1 < i ( V ) > = i o ( V ) [ 1 + [ C s ] / K ( o ) e x p ( F Ô V / R T ) ] - 1 ( 4 ) w h e r e i o ( V ) i s t h e c u r r e n t t h r o u g h t h e u n b l o c k e d c h a n n e l , V i s p o t e n t i a l , K ( o ) i s t h e z e r o v o l t a g e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t a n d . 3 i s t h e f r a c t i o n o f t h e m e m b r a n e f i e l d f e l t b y C s + a t i t s b l o c k i n g s i t e , s o m e t i m e s r e f e r r e d t o a s t h e “ e f f e c t i v e v a l e n c e ” ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ; Y e l l e n 1 9 8 4 a ) . P l o t s o f l n ( i o / i - 1 ) v e r s u s V s h o u l d t h e r e f o r e y i e l d a s t r a i g h t l i n e o f s l o p e F . 3 / R T . T h e v a l u e o f . 3 p r o v i d e s a m e a s u r e o f t h e s t e e p n e s s o f v o l t a g e d e p e n d e n t b l o c k i n g . V a l u e s o f i0 w e r e o b t a i n e d f r o m t h e 5 p a t c h e s i n w h i c h N a + r e p l a c e d K + , s i n c e n o e v i d e n c e f o r N a + b l o c k o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l w a s s e e n . U s i n g t h e d a t a s h o w n i n F i g . 2 9 a n d F i g . 3 0 , p l o t s o f t h i s t y p e w e r e f o u n t ’ t o b e a p p r o x i m a t e l y l i n e a r o v e r t h e v o l t a g e r a n g e - 7 0 m V t o + 7 0 m y . W h e n C s + w a s p r e s e n t a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e , a v a l u e o f . 3 = 0 . 0 7 w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e c a t i o n d e t e c t s v e r y l i t t l e o f t h e m e m b r a n e f i e l d a t t h i s s i t e . I n c o n t r a s t , e x t e r n a l l y a p p l i e d C s + y i e l d e d a v a l u e o f 6 = - 0 . 6 6 , s u g g e s t i n g t h a t t h e i o n m u s t t r a n s v e r s e a n a p p r e c i a b l e f r a c t i o n o f t h e m e m b r a n e t o r e a c h i t s b i n d i n g s i t e , i f a p p l i e d e x t e r n a l l y . 3 . 4 . 3 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] i o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f [ C a2 + J i o n t h e p r o b a b i l i t y o f t h e s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l s b e i n g i n t h e o p e n s t a t e , r e c o r d i n g s w e r e m a d e f r o m i s o l a t e d i n s i d e - o u t p a t c h e s e x p o s e d t o s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . [ C a2+ I i w a s v a r i e d w h i l e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l o f t h e p a t c h w a s v o l t a g e - c l a m p e d t o + 4 0 m V . F i g . 3 2 s h o w s s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s o b t a i n e d f r o m a p a t c h c o n t a i n i n g a s i n g l e a c t i v e K ( C a ) L c h a n n e l . W h e n [ C a2 + ] i w a s 0 . 5 , L M , f e w c h a n n e l o p e n i n g s 1 1 7 F i g u r e 3 2 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + f t o n t h e o p e n i n g o f K ( C a ) L c h a n n e l s . S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t r e c o r d i n g s w e r e o b t a i n e d f r o m a n i s o l a t e d i n s i d e - o u t p a t c h c o n t a i n i n g o n e a c t i v e c h a n n e l a n d b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . T h e r e c o r d i n g p i p e t t e c o n t a i n e d 0 . 0 1 M C a2+ . M e m b r a n e p o t e n t i a l w a s + 4 0 m V . 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c h i s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n . B a n d w i d t h D C 2 0 0 H z . 1 1 8 ydSi S 61! r l$.I001 ‘I”3IPS0 0—--- I—— 0— 0--—- rimrannrm1,rr1rnrw01 ‘njif I——— w e r e s e e n ( P o = 0 . 0 0 4 5 ) a n d t h e m e a n c h a n n e l o p e n t i m e w a s c l e a r l y v e r y b r i e f . O n i n c r e a s i n g [ C a2 + ] i t o 1 , 1 0 a n d 1 0 0 M , P o i n c r e a s e d m a r k e d l y ( P o = 0 . 6 0 a t 1 0 0 M M [ C a2+ ] i ) . T h e m e a n s h u t t i m e o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l w a s g r e a t l y r e d u c e d a t [ C a2 + ] j = 1 0 0 M , w h i l e t h e m e a n o p e n t i m e a p p e a r e d g r e a t e r t h a n t h a t s e e n a t l o w c y t o p l a s m i c c a l c i u m . T h e e f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] i f r o m 0 . 0 1 M t o 1 m M o n P o v a l u e s m e a s u r e d i n 5 p a t c h e s a t V = + 4 0 m V i s s h o w n i n F i g . 3 3 A . T h e t h r e s h o l d l e v e l o f [ C a2+ ] i a t w h i c h c h a n n e l o p e n i n g s w e r e j u s t d e t e c t a b l e w a s a b o u t 0 . 0 1 M . T h e m e a n v a l u e o f [ C a2 + ] i a t w h i c h s i n g l e K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e o p e n h a l f o f t h e t i m e , P o ( 0 . 5 ) w a s 2 3 J L M . F i g . 3 3 B s h o w s t h e s e d a t a p r e s e n t e d a s a H i l l p l o t , i . e . l o g P o / ( 1 - P o ) v e r s u s l o g [ C a2 + ] j . A l i n e a r r e g r e s s i o n l i n e h a s b e e n f i t t e d t o t h e d a t a p o i n t s o b t a i n e d f o r [ C a2 + ] j v a l u e s b e t w e e n 0 . 0 5 L M a n d 1 j L M , t h e p r o b a b l e p h y s i o l o g i c a l r a n g e o f t h i s p a r a m e t e r i n s m o o t h m u s c l e c e l l s ( K i o c k n e r e t a l . 1 9 8 9 ) . O v e r t h i s r a n g e , t h i s l i n e h a d a m e a n s l o p e o f 2 . 0 0 T h i s r e s u l t s h o w s t h a t 2 c a l c i u m i o n s m u s t b i n d t o f u l l y s t a b i l i z e e a c h K ( C a ) L c h a n n e l i n t h e o p e n s t a t e ( B a r r e t t e t a l . 1 9 8 2 ) . A t v e r y l o w a n d v e r y h i g h [ C a2+ J i , t h e s l o p e f a c t o r w a s g r e a t l y r e d u c e d , a s h a s p r e v i o u s l y b e e n n o t e d i n K C a c h a n n e l s s t u d i e d i n r a t s k e l e t a l m u s c l e f i b r e s ( B a r r e t t e t a l . 1 9 8 2 ) . 3 . 4 . 4 . T h e e f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] i o n t h e o p e n t i m e o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l . O v e r t h e r a n g e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l s ( - 8 0 t o + 8 0 m V ) a n d [ C a2 + l e v e l s ( 0 . 0 1 M t o 1 m M ) u s e d i n t h i s s t u d y , o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s f o r K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e w e l l d e s c r i b e d b y t h e s u m o f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s , i n d i c a t i n g t h e 1 2 0 F i g u r e 3 3 . E f f e c t o f [Ca2 + Ii o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K(Ca)L c h a n n e l . ( A ) Mean open p r o b a b i l i t y P o i s plotted a s a f u n c t i o n o f [Ca2+]i o n s e m i l o g a r i t b m i c c o - o r d i n a t e s . T h e s m o o t h c u r v e w a s f i t t e d t o data p o i n t s u s i n g p o l y n o m i a l r e g r e s s i o n . ( B ) H i l l p l o t o f t h e s e d a t a , i . e . l o g Po/(1-Po) a g a i n s t l o g [Ca2 + Ii. O v e r r a n g e o f [Ca2 + Ji f r o m 0 . 0 51M t o 1 j I M , data w e r e w e l l f i t t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n l i n e ( s o l i d l i n e ) o f s l o p e n 2 . 0 0 . Data w e r e o b t a i n e d f r o m f i v e p a t c h e s . M e m b r a n e potential w a s + 4 0 m V d u r i n g t h e s e r e c o r d i n g s . [Ca2+]o = 0 . 0 1 1 2 1 AP0 0 . 3 0 . 6 - 0 . 4 I 0 . 2 1 0 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ C a2J1 ( j j 4 ) P ( 1 - P0) 1 0 / / / 0 . 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 0 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ C a2J1 ( J . L M ) 1 2 2 • q p r e s e n c e o f a t l e a s t t w o k i n e t i c a l l y d i s t i n g u i s h a b l e o p e n s t a t e s f o r t h i s c h a n n e l ( F i g . 3 4 ) . T h e s e d i s t r i b u t i o n s w e r e t h e r e f o r e w e l l f i t b y a n e q u a t i o n o f t h e f o r m y = N f . e - t / r f + N s . e t / r s ( 5 ) H e r e N f a n d N s a r e t h e z e r o t i m e a m p l i t u d e s o f t w o e x p o n e n t i a l f u n c t i o n s g o v e r n e d , r e s p e c t i v e l y , b y a f a s t t i m e c o n s t a n t r f a n d a s l o w t i m e c o n s t a n t r s . F r o m t h e s e p a r a m e t e r s , t h e t o t a l n u m b e r o f o p e n i n g s r e p r e s e n t e d b y e i t h e r c o m p o n e n t w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e r e l a t i o n s A f = N f . r f / B i n w i d t h ( 6 ) a n d A s = N s . r s / B i n w i d t h ( 7 ) H e r e , A f a n d A a r e t h e n u m b e r s o f o p e n i n g s i n t h e e x p o n e n t i a l t e r m s g o v e r n e d b y t h e f a s t t i m e c o n s t a n t , r f a n d t h e s l o w t i m e c o n s t a n t , T S r e s p e c t i v e l y . T h e v a l u e o f t h e b i n w i d t h p a r a m e t e r w a s o b t a i n e d d i r e c t l y f r o m t h e o p e n t i m e h i s t o g r a m s . T h e e f f e c t o f c h a n g i n g [ C a2 + ] i o n t h e o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s o f K ( C a ) L c h a n n e l s w a s i n v e s t i g a t e d i n 5 p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f + 4 0 m V ( F i g . 3 5 ) . I t w a s f o u n d t h a t i n c r e a s i n g [ C a2 + I i h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e m e a n v a l u e o f t h e f a s t t i m e c o n s t a n t r f i n t h e s e p a t c h e s ( F i g . 3 5 A ) . A t [ C a2+ ] i = O . O 1 M , a m e a n v a l u e o f r f = 0 . 5 8 ± 0 . 0 8 m s w a s o b t a i n e d w h i l e a t [ C a2 + I i = 1 0 M , T f = 0 . 5 2 0 . 1 5 m s w a s s e e n ( P > 0 . 0 5 , A N O V A ) . I n c o n t r a s t , r s w a s f o u n d t o i n c r e a s e o n e l e v a t i n g [ C a2+ ] i ( F i g . 3 5 B ) . A t [ C a2± ] i = 0 . 0 1 M M , a m e a n v a l u e o f r s = 5 . 9 ± 0 . 8 5 m s w a s o b t a i n e d , w h i l e a t [ C a2+ ] j = 1 0 A M , s = 1 4 . 6 ± 2 . 2 4 m s w a s o b s e r v e d ( P < 0 . 0 5 , A N O V A ) . 1 2 3 F i g u r e 3 4 . D i s t r i b u t i o n o f o p e n t i m e s f o r t h e K ( C a ) L c h a n n e l s t u d i e d i n o n e i s o l a t e d p a t c h c o n t a i n i n g a s i n g l e a c t i v e c h a n n e l . [Ca2+]i = 1 J . L M i n A a n d 1 m M i n B . B o t h d i s t r i b u t i o n s w e r e plotted o n a l o g a r i t h m i c t i m e a x i s a n d f i t t e d b y t h e s u m o f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s ( s m o o t h c u r v e s ) u s i n g t h e S i m p l e x a l g o r i t h m . In A , t h e f a s t f i t c o m p o n e n t h a d a t i m e c o n s t a n t rf = 0 . 4 1 m s , t h i s c o m p o n e n t m a d e u p 2 9 % o f t h e t o t a l o p e n i n g s . T h e s l o w f i t c o m p o n e n t w a s g o v e r n e d b y a t i m e c o n s t a n t rs = 1 1 . 4 m s , a n d m a d e u p t h e r e m a i n i n g 7 1 % o f o p e n i n g s . C o r r e s p o n d i n g v a l u e s f o r t h e d i s t r i b u t i o n s h o w n i n B w e r e rf = 0 . 3 8 m s ( 1 9 % o f o p e n i n g s ) a n d 7 s = 1 4 . 3 m s ( 8 1 % o f o p e n i n g s ) . M e m b r a n e potential w a s + 4 0 m V i n b o t h A a n d B . [Ca2+]o = 0 . 0 1 cM. 1 2 4 AU ) 1 0 0 0 c t i > L 8 0 a ) C ’ ) D o . 6 0 0 U ) D 4 0 E z 2 0 0 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 0 1 2 3 L o g o p e n t i m e ( s ) B 6 0 ( I ) C 0 • : ; 5 0 > ( 1 ) 4 0 ( I ) - o 0 3 0 0 2 0 S z 1 0 0 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 0 1 2 3 L o g o p e n t i m e ( s ) 1 2 5 F i g u r e 3 5 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] j o n t h e t i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n g o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n o f K ( C a ) L c h a n n e l s s t u d i e d i n S i n s i d e - o u t p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t + 4 0 m V . A , T h e f a s t t i m e c o n s t a n t ( i - f ) v e r s u s [ C a2 + I i . B , T h e s l o w t i m e c o n s t a n t ( r s ) v e r s u s [ C a2 + i i . [ C a2 + ] o = 0 . 0 1 1A M . 1 2 6 A0 . 0 0 I 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 I C a 2 + I i ( t M ) 2 0 r B 0 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 I 1 0 1 0 0 1 0 0 0 i C a 2 + I i ( J . L M ) 1 2 7 T h u s , i n c r e a s i n g [ C a2 + ] j i n c r e a s e d t h e t i m e c o n s t a n t o f t h e s l o w e x p o n e n t i a l c o m p o n e n t , w h i l e h a v i n g n o e f f e c t o n t h a t o f t h e f a s t e x p o n e n t i a l c o m p o n e n t . C h a n g i n g [ C a2+ J i a l s o h a d a n e f f e c t o n t h e r e l a t i v e n u m b e r s o f o p e n i n g s g o v e r n e d b y t h e t i m e c o n s t a n t s i - f a n d i - s . A s s h o w n i n F i g . 3 6 , i n c r e a s i n g [ C a2+ ] j f r o m 0 . 0 1 M t o 1 m M l e a d t o a m o n o t o n i c i n c r e a s e i n t h e v a l u e o f t h e r a t i o A5/ ( A f + A s ) ( F i g . 3 6 B ) , w i t h a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n t h e r a t i o A f / ( A f + A s ) ( F i g . 3 6 A ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s h o w t h a t i n c r e a s i n g [ C a2 + p r e f e r e n t i a l l y s t a b i l i z e d o p e n i n g s o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l g o v e r n e d b y t h e s l o w t i m e c o n s t a n t i - s . T h e m e a n o p e n t i m e , r m e a n o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e a b o v e d a t a u s i n g t h e r e l a t i o n r m e a n = A f / ( A f + A s ) . r f + A5/ ( A f + A s ) . r s ( 8 ) A t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f + 4 0 m V , i - m e a n i n c r e a s e d f r o m 2 . 7 0 . 2 3 m s ( n = 5 ) a t 0 . 0 1 M M [ C a2+ ] i t o 1 3 . 5 ± 0 . 3 5 m s a t 1 0 A M [ C a2+ ] j ( P < 0 . 0 5 , S t u d e n t s ’ t - t e s t ) . T h i s 5 f o l d r i s e i n i - m e a n w a s m u c h t o o s m a l l t o f u l l y a c c o u n t f o r t h e 4 2 5 f o l d i n c r e a s e s e e n i n o p e n p r o b a b i l i t y o n e l e v a t i n g [ C a2 + ] i f r o m 0 . 0 1 M t o 1 0 P M ( s e e F i g . 3 3 ) . I t w a s t h e r e f o r e c o n c l u d e d t h a t t h e m a j o r e f f e c t o f i n c r e a s i n g i n t e r n a l f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n w a s t o d e c r e a s e t h e m e a n s h u t t i m e o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l . 3 . 4 . 5 . E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l 1 2 8 F i g u r e 3 6 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + ] j o n t h e r e l a t i v e n u m b e r o f o p e n i n g s o f K ( C a ) L c h a n n e l s g o v e r n e d b y t h e t i m e c o n s t a n t s i - f a n d i - s . D a t a a r e m e a n ± S E M f r o m 3 - 5 i n s i d e - o u t p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t + 4 0 m V . I n A , t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r a t i o A f / ( A f + A s ) a n d [ C a2 + ] i i s i l l u s t r a t e d . I n B , t h e e f f e c t o f [ C a2+ ] j o n t h e r a t i o A5/ ( A f + A s ) i s s h o w n . [ C a2+ ] o O . 0 1 M . 1 2 9 AF ‘ H s . . H 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 I 1 0 1 0 0 1 0 0 0 l C a 2 + I i ( M ) B U i O . 6 0 . 0 0 I 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 l C a 2 + I i ( j i M ) 1 3 0 T h e p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s b e i n g i n t h e o p e n s t a t e w a s a l s o a f u n c t i o n o f t h e p o t e n t i a l a p p l i e d a c r o s s t h e m e m b r a n e p a t c h a s s h o w n i n F i g . 3 7 . W h e n [ C a2 + ] i w a s l e s s t h a n 5 0 M , t h e d e p e n d e n c e o f P o o n m e m b r a n e p o t e n t i a l w a s w e l l d e s c r i b e d b y t h e B o l t z m a n n r e l a t i o n ( K o i b 1 9 9 0 ) P o = [ 1 + e x p ( - K ( V - V o ) ) ] - l ( 9 ) w h e r e V o i s t h e p o t e n t i a l a t w h i c h P o = 0 . 5 ( F i g . 3 7 ) . I n 5 p a t c h e s e x p o s e d t o [ C a2 + ] i < 5 0 . M , t h e m e a n v a l u e o f t h e c o n s t a n t K w a s 0 . 0 4 5 + 0 . 0 0 6 m V - i . A t [ C a2 + J j l e v e l s b e t w e e n 0 . 0 1 M a n d 5 0 M , t h e p r i n c i p a l e f f e c t o f i n c r e a s i n g i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m w a s t o s h i f t t h e B o l t z m a n n r e l a t i o n t o t h e l e f t o n t h e v o l t a g e a x i s . I n 4 p a t c h e s s t u d i e d i n t h i s r a n g e o f [ C a2+ J i , t h e m e a n s h i f t o f t h e V o w a s 4 5 m V p e r d e c a d e c h a n g e i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m . A t [ C a2 + I i > 5 0 j I M , P o a p p r o a c h e d u n i t y a n d s h o w e d l i t t l e f u r t h e r i n c r e a s e o n m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n ( F i g . 3 7 ) . I n d e e d a t e n d e n c y w a s n o t e d t o w a r d r e d u c e d P o a t m e m b r a n e p o t e n t i a l s m o r e p o s i t i v e t h a n + 4 0 m V ( F i g . 3 7 ) . R e d u c e d P o a t p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s h a s p r e v i o u s l y b e e n n o t e d i n K C a c h a n n e l s s t u d i e d i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e g u i n e a - p i g ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) a n d i n K C a c h a n n e l s i n c o r p o r a t e d i n t o l i p i d b i l a y e r s ( V e r g a r a a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ) . 3 . 4 . 6 . E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n t i m e o f K C a c h a n n e l s . 1 3 1 F i g u r e 3 7 . D ç p e n d e n c e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y , P0 o f K ( C a ) L c h a n n e l s o n m e m b r a n e p o t e n t i a l ( V ) a n d [ C a2 + I i m e a s u r e d i n 4 i n s i d e - o u t p a t c h e s . W h e n [ C a2 + J j w a s 1 m M ( c i r c l e s ) a n d 1 0 0 J L M ( d i a m o n d s ) , f i t t i n g l i n e s w e r e d r a w n b y t h e p o l y n o m i a l r e g r e s s i o n . W h e n [ C a2 + J i w a s 5 0 M ( s q u a r e s ) a n d 0 . 5 M ( t r i a n g l e s ) , t h e f i t t i n g c u r v e s w e r e d r a w n t o t h e B o l t z m a n n e q u a t i o n P0 = [ 1 + e x p ( - K ( V - V0) ) ] - 1 w h e r e V o i s t h e p o t e n t i a l a t w h i c h P o = 0 . 5 . A t b o t h 5 0 M a n d 0 . 5 J L M f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , t h e c o n s t a n t K h a d t h e v a l u e 0 . 0 4 5 m V - i . A t 5 0 J L M f r e e c a l c i u m , V o = - 5 m V . a t 0 . 5 j M c a l c i u m , V o = + 8 8 m V . 1 3 2 (Aw)A 0809OtOt08 00Z V 09 0t °d The effect of varying membrane potential on the distribution of open times for K(Ca)L channels was studied inS patches exposed to [Ca2+]j = 10 ,iM. These distributions were well described by the sum of two exponential terms, as noted previously. It was found that changes in membrane potential did not significantly alter the value of the fast time constant, Tf in these patches (Fig. 38A). The mean value of if at V = -60 mV was 0.45± 0.06 ms, not significantly different from the value obtained at V = +60 mV (if = 0.38± 0.04 ms, P> 0.05, ANOVA). In contrast, the slow time constant, iS describing open time distributions was significantly altered by membrane potential in these patches (Fig. 38B). r8 was weakly voltage-dependent, increasing from 8.4 ± 0.55 ms at V = -60 mV to 16.6 ± 1.64 ms at V = +60 mV (P <0.05, ANOVA). It should however be noted that these value ofrf are close to the deadtime of the recording system. Small changes in if could therefore have gone undetected. 3.4.7. The effect of TEA applied to the cytoplasmic membrane face on current flow in the K(Ca)L channel. The effect of TEA on the K(Ca)L channel was studied in 6 inside-out membrane patches voltage-clamped at +40 mV with [Ca2+]i = 100PM. Fig. 39 shows single channel currents recording during an experiment of this kind in which TEA was applied by bath perfusion to the cytoplasmic membrane face. Under these conditions, TEA caused a dose-dependent, reversible reduction in the amplitude of current in the K(Ca)L channel. It was noted that the blocking action of TEA was not accompanied by a large increase in the variance of current noise in the open channel as observed at a bandwidth of DC-2-kHz (Fig. 39). TEA did not alter the reversal potential of the current through K(Ca)L channels, which was 0 mV in these experiments. 134 Figure 38. Effect of membrane potential on the time constants governing the open time distribution of K(Ca)L channels. A. Fast time constant (i-f) versus membrane potential. B. Slow time constant (rs) versus membrane potential. Data points are mean ±SEM from three to five patches. [Ca2+ Ji = 10 p. M and [Ca2±lo = 001p.MinbothAandB. 135 A‘ t f ( m s ) I I I I I I I — 8 0 — 6 0 — 4 0 — 2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 V ( m V ) B ( m s ) f - - - - -1 5 I I I I I — 8 0 — 6 0 — 4 0 — 2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 V ( m y ) . 1 3 6 F i g u r e 3 9 . B l o c k i n g e f f e c t o f i n t e r n a l T E A o n t h e K ( C a ) L c h a n n e l . S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e r e c o r d e d f r o m a n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u m s o l u t i o n s . T E A w a s a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c f a c e o f t h e m e m b r a n e a t t h e c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t e d . 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n . B a n d w i d t h D C - 2 k H z , m e m b r a n e p o t e n t i a l + 4 0 m V . [ C a2+ ] o = O . 0 1 $ M . 1 3 7 N O T E A 1 - - - - ‘ r l i 9 L d 0 . 5 m M T E A 1 - - - - 1 m M T E A : : : : 2 p A 5 0 m s 1 3 8 T h e p e r c e n t a g e r e d u c t i o n , R i i n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t c a u s e d b y v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f T E A a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s n i i c m e m b r a n e f a c e i s s h o w n i n F i g . 4 0 . I t w a s f o u n d t h a t t h e v a l u e o f R j w a s w e l l d e s c r i b e d b y t h e r e l a t i o n R j = 1 0 0 % / ( 1 + K d / [ T E A ] ) ( 1 0 ) w h e r e K d 0 . 8 3 ± 0 . 0 9 m M ( n = 5 p a t c h e s ) a t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f + 4 0 m V a n d [ C a2+]j = 100A M . T h e p r e s e n t d a t a o n T E A b l o c k w e r e t r a n s f o r m e d i n t o a H i l l p l o t b y r e p l o t t i n g a s l o g ( R i / i - R i ) v e r s u s l o g [ T E A ] , w h e r e R i s t h e r e d u c t i o n i n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s s e e n i n t h e p r e s e n c e o f t h e d r u g . T h i s p l o t y i e l d e d a s l o p e o f 0 . 8 2 , s u g g e s t i n g t h a t T E A i n t e r a c t s w i t h t h e c h a n n e l i n a o n e - t o - o n e f a s h i o n , p r e s u m a b l y b y t r a n s i e n t l y e n t e r i n g t h e c h a n n e l a n d b l o c k i n g m o v e m e n t o f K + . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , T E A h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s a d o p t i n g t h e o p e n s t a t e ( F i g . 4 1 ) . T h u s P o = 0 . 5 5 ± 0 . 1 5 ( n = 3 ) i n t h e a b s e n c e o f T E A , a n d P0 = 0 . 5 3 ± 0 . 1 7 ( n = 3 ) i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 m M T E A a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e ( P > 0 . 0 5 , A N O V A ) . 3 . 5 . K ( C a ) I c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m i s o l a t e d C V S M C s . 1 3 9 F i g u r e 4 0 . D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e b l o c k o f c u r r e n t f l o w i n t h e K ( C a ) L c h a n n e l b y i n t e r n a l T E A . T h e p e r c e n t a g e r e d u c t i o n i n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t i s p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f T E A a t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . T h e s o l i d l i n e p l o t s t h e r e l a t i o n R i = 1 0 0 % / ( 1 + K d / [ T E A ] ) w h e r e t h e a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t K d w a s 0 . 8 3 m M a n d [ T E A ] w a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f T E A . D a t a p o i n t s a r e m e a n ± S E M f r o m 3 - 5 p a t c h e s . T h e c a l c u l a t e d c u r v e w a s f i t t e d t o t h e d a t a p o i n t s b y n o n - l i n e a r r e g r e s s i o n . V = + 4 0 m V , [ C a2+ ] j = 1 O 0 M . [ C a2± ] o = 0 . 0 1 , L M . 1 4 0 H ru P er ce nt ag e re du ct io n o f si ng le c ha nn el c u rr e n t — C H - i F i g u r e 4 1 . E f f e c t o f T E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l . T h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e c h a n n e l i s p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f i n t e r n a l T E A . D a t a p o i n t s a r e m e a n ± S E M f r o m 3 - 5 p a t c h e s . N o s i g n i f i c a n c e b e t w e e n t h e m e a n v a l u e s o f P0 c a l c u l a t e d a t e a c h T E A c o n c e n t r a t i o n ( P > 0 . 0 5 A N O V A ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l + 4 0 m V , [ C a2+ ] j = 1 0 O M . [ C a2+ ] j = 0 . 0 1 j M . 1 4 2 1 . 0 - P0 0 . 8 - 0 . 6 - 0 . 4 - 0 . 2 - 0 C o n t r o l 0 . 1 1 1 0 1 0 0 T E A ( m M ) 1 4 3 K ( C a ) I c h a n n e l s w e r e d e t e c t e d i n a b o u t 2 5 % o f t h e i n s i d e - o u t p a t c h e s e x a m i n e d i n t h i s s t u d y . W h e n m e a s u r e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s , c u r r e n t s i n K ( C a ) L c h a n n e l s s h o w e d a r e v e r s a l p o t e n t i a l o f 0 m V ( F i g . 4 2 ) . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n o f t h i s c h a n n e l w a s l i n e a r w i t h a m e a n s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e o f 9 2 ± 2 . 6 p S ( n = 1 0 p a t c h e s ) . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o f c u r r e n t s f l o w i n g i n K ( C a ) I c h a n n e l s w e r e w e l l d e s c r i b e d b y s i n g l e G a u s s i a n t e r m s , i n d i c a t i n g t h a t t h i s c h a n n e l d i d n o t d i s p l a y a s i g n i f i c a n t s u b s t a t e o r s u p e r s t a t e c o n d u c t a n c e ( F i g . 4 3 ) . F r o m t h e s e d a t a , t h e p o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y o f t h e o p e n c h a n n e l w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e c o n s t a n t - f i e l d r e l a t i o n ( E q u a t i o n 2 ) . A m e a n v a l u e o f P K = 1 . 7 5 ± 0 . 1 2 x 1 0 - 1 3 c m / s w a s o b t a i n e d f r o m 1 0 p a t c h e s . T h e i n f r e q u e n t o c c u r r e n c e o f K ( C a ) I c h a n n e l s i n t h e s e p a t c h e s p r e c l u d e d a d e t a i l e d q u a n t i t a t i v e e x a m i n a t i o n o f t h e i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h i s c h a n n e l o r i t s s e n s i t i v i t y t o c h a n g e s i n [ C a2 + ] j a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l . H o w e v e r , i t w a s p o s s i b l e t o d e m o n s t r a t e q u a l i t a t i v e l y t h a t K ( C a ) I c h a n n e l s a r e i n d e e d s e l e c t i v e f o r p o t a s s i u m i o n s , a n d a r e m o d u l a t e d b y b o t h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d [ C a 2 h ] j . W h e n 8 0 m M K C 1 w a s r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a C 1 , c u r r e n t s t h r o u g h s i n g l e K ( C a ) I c h a n n e l s r e v e r s e d a t + 2 1 . 1 m V ( c y t o p l a s m i c f a c e K C 1 r e p l a c e m e n t ) a n d - 2 1 . 1 m V ( e x t e r n a l f a c e K C 1 r e p l a c e m e n t , F i g . 4 4 ) . T h e r a t i o P N a / P K w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e s e d a t a u s i n g E q u a t i o n 3 . A v a l u e o f P N a / P K < 0 . 0 5 w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n g t h a t K ( C a ) J c h a n n e l s a r e h i g h l y s e l e c t i v e f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s . I n s i m i l a r e x p e r i m e n t s w h e r e C s + r e p l a c e d K + , t h e r a t i o P C s / P K w a s a l s o f o u n d t o b e l e s s t h a n 0 . 0 5 . I n t h e p r e s e n c e o f C s + , c u r r e n t f l o w i n t h e K ( C a ) I c h a n n e l w a s l e s s t h a n p r e d i c t e d 1 4 4 F i g u r e 4 2 . S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t r e c o r d i n g s o f t h e a c t i v i t y o f K ( C a ) I c h a n n e l s a t v a r i o u s m e m b r a n e p o t e n t i a l s ( m V ) . A l l t r a c e s w e r e r e c o r d e d f r o m a s i n g l e i n s i d e - o u t p a t c h c o n t a i n i n g f o u r a c t i v e c h a n n e l s . T h i s p a t c h w a s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . 0 i n d i c a t e s a l l c h a n n e l s w e r e c l o s e d , w h i l e t h e n u m b e r s 1 , 2 , 3 a n d 4 i n d i c a t e c u r r e n t l e v e l s a s s o c i a t e d w i t h 1 , 2 , 3 a n d 4 c h a n n e l s o p e n , r e s p e c t i v e l y . B a n d w i d t h D C - 2 0 0 H z . C a l i b r a t i o n b a r s a p p l y t o a l l t r a c e s . T h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e w a s e x p o s e d t o [ C a2 + I i = 1 L M . T h e p i p e t t e c o n t a i n e d [ C a2+ ] o = 0 . 0 1 r i M . 1 4 5 09I Sc VdOZ kAlLfb4LL,4L.LL. z t--1r I j11•11I’IIIITII’ 0-OL r4iL4MJw 0 (Aw) Figure 43. Amplitude distributions obtained for K(Ca)I channel currents recorded from a single inside-out patch voltage-clamped at a membrane potential of + 30 mV in A and -30 mV in B. Both distributions were well fitted by single Gaussian terms (smooth curves) with modal values of 2.44 pA in A and -2.43 pA in B. The patch was bathed in symmetrical 140 mM K+ solutions. [Ca2+ ]j = 10 M, [Ca2+ ]o = 0.01 M. 147 A1 2 0 - C ’ , C 1 0 o ( ‘ I > 0 ) C , , I : Z 2 0 6 1 2 1 ‘ 6 2 ’ O A m p l i t u d e ( p A ) B 7 0 ( I ) C 6 0 c c l > 5 0 C I ) - D o 4 0 0 0 ) 6 1 ’ 2 1 ’ 6 A m p l i t u d e ( p A ) 1 4 8 F i g u r e 4 4 . C o n d u c t a n c e a n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l . C u r r e n t - v o l t a g e p l o t s o f s i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m f i v e i n s i d e - o u t p a t c h e s i n f i v e d i f f e r e n t i o n i c g r a d i e n t s : ( f i l l e d c i r c l e s ) s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K+ s o l u t i o n s ; ( o p e n s q u a r e s ) 8 0 m M internal K + r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f Na+; ( f i l l e d d i a m o n d s ) 8 0 m M e x t e r n a l K + r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f Na+; ( f i l l e d t r i a n g l e s ) 8 0 m M i n t e r n a l K + r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f Cs+; ( o p e n t r i a n g l e s ) 8 0 m M e x t e r n a l K + r e p l a c e d b y a n e q u i m o l a r a m o u n t o f Cs+. [Ca2+]o a n d [Ca2+]i w e r e O.01M a n d 1 0 0 P M r e s p e c t i v e l y . C o n t i n u o u s l i n e s a r e t h e o r e t i c a l c u r v e s f i t b y l i n e a r r e g r e s s i o n (data o b t a i n e d i n s y m m e t r i c a l p o t a s s i u m s o l u t i o n s ) o r n o n - l i n e a r r e g r e s s i o n t o t h e Goldman H o d g k i n - K a t z c o n s t a n t - f i e l d e q u a t i o n , u s i n g t h e d a t a p o i n t s o b t a i n e d d u r i n g replacement o f K+ b y Na+. 1 4 9 • 1 0 i ( p A ) 8 v . O u t w a r d 7 . A A A — 8 0 — 6 0 — 4 0 — 2 I I I 7 - ? o 4 0 6 0 8 0 V ( m V ) . 4 A • A D A I n w a r d - 1 0 1 5 0 from the constant-field relation. This effect was especially marked under conditions tending to drive Cs + into the open channel, i.e. at negative membrane potentials with Cs + present in the external solution, and at positive membrane potentials when Cs + was present at the cytoplasmic membrane face (Fig. 44). The open probability of K(Ca)I channels increased as [Ca2±]i was elevated over the coicentration range 0.1 M to 100MM (Fig. 45). Fig. 46A showsthe dependence of P0 on [Ca2+ ]i for one membrane patch voltage- clamped at V = + 4OmV. These data were replotted as a Hill plot, i.e. as log Po/(1-Po) against log [Ca2+Ji (Fig. 46B). It is evident that P0 was steeply dependent on [Ca2+Ji over the probable physiological range of this parameter (0.05-1 PM). In this range, the slope of the Hill plot was 2.17, suggesting that more than one calcium ion must bind to fully activate each K(Ca)I channel. The open probability of K(Ca)I channels also increased on depolarization of the membrane patch (Fig. 47). The dependance of Po on membrane potential was well described by the Boltzmann relation (Equation 9). The effect of increasing [Ca2+ ]i was to shift the Boltzmann relation to the left on the voltage axis, by about 40 mV per decade increase in free intracellular calcium (Fig. 47). The effect of TEA on the K(Ca)I channel was examined quantitatively in 6 inside-out patches voltage-clamped at V = + 40 mV with [Ca2+ ]j 100 M. TEA was applied by bath perfusion to the cytoplasmic membrane face. Under these conditions, TEA caused a reversible, dose-dependent reduction in the amplitude of current in the K(Ca)I channel (Fig. 48). TEA had no effect on the reversal potential of the current in K(Ca)I channels (0 mV). 1 5 1 F i g u r e 4 5 . E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2 + J i o n t h e a c t i v i t y o f K ( C a ) I c h a n n e l s . S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t r e c o r d i n g s w e r e o b t a i n e d f r o m a n i s o l a t e d i n s i d e - o u t p a t c h w i t h t w o a c t i v e c h a n n e l s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u m s o l u t i o n s . M e m b r a n e p o t e n t i a l w a s + 4 0 m V . 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d , w h i l e t h e n u m e r a l s l a n d 2 i n d i c a t e c u r r e n t l e v e l s a s s o c i a t e d w i t h 1 a n d 2 c h a n n e l s o p e n , r e s p e c t i v e l y . B a n d w i d t h D C - 2 0 0 H z . [Ca2+Jo = 0 . 0 1 M. 1 5 2 0 . 1 M Ca2 J iL Iii. fli1 - iLIL j 1 b L f ’ I 10M 1 0 0 lOpA 1 5 3 F i g u r e 4 6 . E f f e c t o f [Ca2+]i o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l . ( A ) O p e n p r o b a b i l i t y p l o t t e d a g a i n s t [ C a2 + ] i o n s e m i l o g a r i t h m i c c o - o r d i n a t e s . ( B ) F u l l p l o t o f t h e s e d a t a , i . e . l o g P o / ( 1 - P o ) a g a i n s t l o g [Ca2+]i. O v e r r a n g e o f [ C a2+ ] j f r o m 0 . 0 5 M t o 1 M , d a t a w e r e w e l l f i t t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n l i n e ( s o l i d l i n e ) o f s l o p e n = 2 . 1 7 . D a t a w e r e o b t a i n e d f r o m o n e i n s i d e - o u t p a t c h . V = + 4 0 m V , [Ca2+Jo 0 . 0 1 t M . 1 5 4 AP0 0 . 8 0 . 6 - 0 . 4 0 . 2 - 0 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ C a2] ( i i M ) B P0/ ( 1 - P) 0 . 0 1 - 0 . 0 0 1 . . 0 . 0 0 0 1 I I I 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 [ C a2] ( t M ) 1 5 5 F i g u r e 4 7 . D e p e n d e n c e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y , P o o f K ( C a ) I c h a n n e l s o n m e m b r a n e p o t e n t i a l V ( m Y ) a t d i f f e r e n t v a l u e s o f [ C a2+ I i . T h e d a t a w e r e o b t a i n e d f r o m 4 i n s i d e - o u t p a t c h e s e x p o s e d t o t h e f o l l o w i n g [ C a2+ ] j : 1 M ( o p e n s q u a r e s ) ; 1 O t M ( f i l l e d s q u a r e s ) ; 1 O O M ( f i l l e d t r i a n g l e s ) ; 1 m M ( f i l l e d d i a m o n d s ) . T h e f i t c u r v e s w e r e d r a w n t o t h e B o l t z m a n n e q u a t i o n P o = [ 1 + e x p ( - K ( V-V0))]-1 w h e r e V o i s t h e p o t e n t i a l a t w h i c h P o 0 . 5 . V o a t 1 M, 1 O M , 1 0 0 P M a n d 1 m M [Ca2+]i w e r e + 4 0 m V , + 1 8 m V , 0 m V a n d - 6 5 m V , r e s p e c t i v e l y . T h e c o n s t a n t K t o o k t h e f o l l o w i n g v a l u e s : 0 . 1 6 m V - i a t [Ca2+]i = 1 A M ; 0 . 0 9 6 m V - i a t [Ca2+]j = i0M; 0 . 0 3 5 m V - i a t [Ca2+]j = i 0 O M a n d 0 . 0 1 1 m V - i a t [Ca2+]j = 1 m M . [Ca2+]o = 0 . 0 1 M M . 1 5 6 P0 1 . 0 - 0 . 8 - A • 4 4 A A 0 . 4 A p a a I I I I I I - 8 0 - 6 0 - 4 0 - 2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 V ( m V ) 1 5 7 F i g u r e 4 8 . B l o c k i n g e f f e c t o f T E A o n c u r r e n t f l o w i n t h e K ( C a ) I c h a n n e l . S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t r e c o r d i n g s f r o m a n i n s i d e - o u t p a t c h w i t h o n e a c t i v e c h a n n e l . T E A w a s a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c f a c e o f t h e m e m b r a n e . 0 i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n . B a n d w i d t h D C - 2 k H z , V = + 4 0 m V . [Ca2+Jj 1 0 0 , L M , [Ca2+]o = O . O l M . T h e p a t c h w a s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K ± s o l u t i o n s . 1 5 8 N O T E A 0 . 5 m M T E A 1 m M T E A o j 5 p 4 l O O m s 1 5 9 The percentage reduction, Ri in single channel current caused by various concentrations of TEA applied to the cytoplasmic membrane face is shown in Fig. 49. The value of Ri was well predicted by the relation Rj = 100% / (1 + Kd / [TEA]), where the constant Kd had the value 0.31 mM under these conditions. These data were replotted as a Hill plot, log (Ri/i-Ri) versus log [TEA] where R is the reduction in mean single channel current caused by a given concentration of TEA. The slope of this plot was 0.70, suggesting that TEA blocks this channel in a one-to-one fashion, as seen for the K(Ca)L channel. TEA had no significant effect on the probability of K(Ca)I channels adopting an open state (Fig. 50). An ANOVA test was performed to compare these results with comparable data obtained for the K(Ca)L channel. It was found that no significant differences existed between these two data sets (P > 0.05). This result indicates that the K(Ca)L and the K(Ca)I channels have comparable sensitivities to internally applied TEA. 160 F i g u r e 4 9 . D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r b l o c k o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l b y T E A . T h e p e r c e n t a g e r e d u c t i o n o f s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t i s p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f T E A a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n ± S E M f r o m 3 - 5 p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t V = + 4 0 m V a n d e x p o s e d t o s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K + s o l u t i o n s . T h e s o l i d l i n e p l o t s t h e r e l a t i o n R i = 1 0 0 % / ( 1 + K d / [ T E A ] ) . T h e a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t K d w a s 0 . 3 1 m M . [ C a2+ ] j = 1 0 0 M M , [ C a2± ] o = 0 . 0 1 1 6 1 mPe rc en ta ge re du ct io n o f si ng le c ha nn el c u rr e n t 0 0 0 0 0% 0 00 0 0 p H H 0 F i g u r e 5 0 . E f f e c t o f TEA o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l . O p e n i n g p r o b a b i l i t y o f t h e c h a n n e l , P o i s plotted a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f internal TEA a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . [Ca2+ Ii 1 0 0 M , [Ca2+Jo = 0 . 0 1 M. P a t c h e s w e r e bathed i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K+ s o l u t i o n s . Data p o i n t s a r e mean± S E M f r o m 3 - 5 p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t + 4 0 m V . N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d b e t w e e n t h e s e m e a n s (P> 0 . 0 5 , A N O V A ) . 1 6 3 l . 0 C o n t r o l o . i 1 1 0 0 0 [ T E A ] ( m M ) 1 6 4 C h a p t e r 4 D i s c u s s i o n T h e p r e s e n t s t u d y h a s r e s u l t e d i n t h e d e v e l o p m e n t o f a n o v e l i n v i t r o p r e p a r a t i o n o f C V S M C s d e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a l a r t e r i e s o f a d u l t r a t s . T h e s e c e l l s w e r e , i d e n t i f i e d u s i n g t h e M a s s o n t r i c h r o m e t e s t a n d a n a n t i b o d y s p e c i f i c t o s m o o t h m u s c l e a - a c t i n . T h e c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2 w a s e m p l o y e d t o m e a s u r e t h e r e s t i n g l e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n C V S M C s a n d t o s t u d y t h e e f f e c t o f 5 - H T o n c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n t h e s e c e l l s . P a t c h c l a m p m e t h o d s w e r e u s e d t o m e a s u r e t h e b a s i c e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f C V S M C s i n v i t r o . T h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t w o t y p e s o f K C a c h a n n e l w e r e s t u d i e d i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m t h e s e c e l l s . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e r e s u l t s w i l l n o w b e d i s c u s s e d i n r e l a t i o n t o p r e v i o u s f i n d i n g s f r o m o t h e r l a b o r a t o r i e s . 4 . 1 . M o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f C V S M C s i n v i t r o S e v e r a l r e p o r t s h a v e a p p e a r e d d e s c r i b i n g t h e i n v i t r o g r o w t h o f C V S M C s f r o m c e r e b r a l r e s i s t a n c e v e s s e l s ( S p a t z e t a l . 1 9 8 3 ; D i g l i o e t a l . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , t h e p r e s e n t s t u d y i s a p p a r e n t l y t h e f i r s t t o d e s c r i b e s h o r t - t e r m c u l t u r e s o f C V S M C s d e r i v e d f r o m c o n d u c t i n g c e r e b r o v a s c u l a r a r t e r i e s o f t h e r a t . W h e n e x a m i n e d a f t e r 1 - 4 d a y s i n v i t r o , t h e c e l l s o b t a i n e d t y p i c a l l y d i s p l a y e d a s p h e r i c a l s h a p e . T h e s h a p e o f t h e s e c e l l s w a s t h e s a m e r e g a r d l e s s o f w h e t h e r p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 o C i n c u l t u r e m e d i u m o r k e p t a t 4 0 C i n a m a i n t e n a n c e s o l u t i o n . S i m i l a r m o r p h o l o g y h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n s h o r t - t e r m c u l t u r e s o f C V S M C s d e r i v e d f r o m p e n e t r a t i n g v e s s e l s s u p p l y i n g t h e r a t b r a i n , w h e r e m o r e t h a n f o u r 1 6 5 d a y s i n v i t r o w e r e r e q u i r e d f o r t h e c e l l s t o a d o p t a f u s i f o r m o r p o l y g o n a l s h a p e ( S p a t z e t a l . 1 9 8 3 ; D i g l i o e t a l . 1 9 8 6 ) . C e r e b r a l a r t e r i e s m a y b e c l a s s i f i e d a s t h e “ m u s c u l a r ” t y p e o f b l o o d v e s s e l , i n w h i c h t h e t u n i c a m e d i a c o n t a i n s o n l y a f e w e l a s t i c l a m i n a e a n d r e l a t i v e l y l i t t l e i n t e r c e l l u j a r s p a c e , w h e n c o m p a r e d t o “ e l a s t i c ” a r t e r i e s , s u c h a s t h e a o r t a . C V S M C s a r e s p i n d l e s h a p e d w h e n r e l a x e d , b u t l a c k t h e h i g h l y f u s i f o r m m o r p h o l o g y t y p i c a l o f g a s t r o i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e , t h e r a t i o o f m a x i m u m t o m i n i m u m a x e s b e i n g a b o u t 9 : 1 ( R h o d i n , 1 9 8 0 ) . S t e e l e e t a l . ( 1 9 9 1 ) h a v e d e s c r i b e d a p r o c e d u r e b y w h i c h C V S M C s a p p r o x i m a t i n g t h i s s h a p e c a n b e p r o d u c e d f o l l o w i n g e n z y m a t i c d i s s o c i a t i o n o f r a t b a s i l a r a r t e r i e s . T h e r e a s o n w h y t h i s r e s u l t w a s n o t o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d y r e m a i n s u n c l e a r . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e d i s s o c i a t i o n p r o c e d u r e s u s e d r e s u l t e d i n c y t o s k e l e t a l d a m a g e , a s r e p o r t e d f o r o t h e r C V S M C s f o l l o w i n g e n z y m a t i c t r e a t m e n t a n d p l a t i n g o n t o f o r e i g n s u b s t r a t e s ( S p a t z e t a l . 1 9 8 3 ; D i g l i o e t a l . 1 9 8 6 ) . I t i s a l s o k n o w n t h a t C V S M C s d i s s o c i a t e d f r o m r a t b a s i l a r a r t e r i e s a r e u n a b l e t o r e l a x f o l l o w i n g a b r i e f p e r i o d o f a c t i v e c o n t r a c t i o n , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f t h e a b s e n c e o f e l a s t i c e l e m e n t s i n t h e s e p r e p a r a t i o n s ( S t e e l e e t a l . 1 9 9 1 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e s t h a t t h e i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m l e v e l o f C V S M C s w a s a b o u t 4 0 n M , f a r b e l o w t h e m i c r o m o l a r l e v e l s r e q u i r e d t o a c t i v a t e m u s c l e c o n t r a c t i o n ( J o h n s e t a l . 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e , i t i s p r o b a b l e t h a t t h e s p h e r i c a l s h a p e o f t h e C V S M C s u s e d i n t h i s s t u d y w a s t h e r e s u l t o f f a i l u r e o f t h e c e l l s t o r e l a x p a s s i v e l y , r a t h e r t h a n o f a n a c t i v e l y m a i n t a i n e d c o n t r a c t i o n . T h e m a j o r i t y o f t h e s p h e r i c a l c e l l s p r e s e n t i n o u r s h o r t t e r m p r i m a r y c u l t u r e s w e r e f o u n d t o r e a c t p o s i t i v e l y t o b o t h M a s s o n ’ s t r i c h r o m e s t a i n a n d t o a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l e a - a c t i n . I n d i f f e r e n t i a t e d 1 6 6 S M C s , s m o o t h m u s c l e o e - a c t i n a n d ‘ y - a c t i n p r e d o m i n a t e o v e r o t h e r , n o n - S M C s p e c f f i c f o r m s o f t h e p r o t e i n . I n v a s c u l a r S M C s s t u d i e d t o d a t e , m o s t o f t h e a c t i n p r e s e n t i s i n t h e a - i s o a c t i n f o r m ( G a b b i a n i e t a l . 1 9 8 1 ; O w e n s e t a l . 1 9 8 6 ) . I n a d d i t i o n , t h e a - i s o a c t i n o f S M C s i s i m m u n o l o g i c a l l y d i s t i n c t f r o m t h a t f o u n d i n s k e l e t a l o r c a r d i a c m u s c l e c e l l s ( O w e n s e t a l . 1 9 8 6 ) . S M C a - a c t i n i s t h e r e f o r e c o n s i d e r e d t o b e a r e l i a b l e m a r k e r f o r s m o o t h m u s c l e t i s s u e s t u d i e d i n v i t r o ( M o o r e e t a l . 1 9 8 4 ; D i g l i o e t a l . 1 9 8 6 ) , a l t h o u g h c e r t a i n t u m o r s m a y a l s o e x p r e s s t h e a n t i g e n ( S k a l l e e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e s e c o n s i d e r a t i o n s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t t h e c e l l s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w e r e i n d e e d S M C s o f v a s c u l a r o r i g i n . 4 . 2 . I n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i n c u l t u r e d C V S M C s T h e r e s t i n g l e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n t h e C V S M C s c u l t u r e d a t 3 7 ° C w a s f o u n d t o b e a b o u t 4 0 n M . T h i s v a l u e i s c o m p a r a b l e w i t h t h e v a l u e o f 5 0 n M c y t o s o l i c f r e e [ C a2+ ] o b t a i n e d f r o m r e s t i n g a i r w a y s m o o t h m u s c l e c e l l s o b t a i n e d p s i n g f l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s ( R o d g e r a n d S m a l l , 1 9 9 1 ) . H o w e v e r , i t i s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t f o u n d i n V S M C s d i s p e r s e d f r o m a p e r i p h e r a l v e s s e l , t h e r a t a o r t a , i n w h i c h [ C a2+ ] j w a s f o u n d t o b e 1 2 6 n M , ( T a k a t a e t a l . 1 9 8 8 ) ; 1 5 3 n M , ( C a p p o n i e t a l . 1 9 8 7 ) ; a n d 1 1 4 n M , ( N a b i k a e t a l . 1 9 8 5 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , b a s e l i n e l e v e l s o f [ C a2+ ] i w e r e d e t e r m i n e d i n t h e s a m e c u l t u r e s u s e d t o c a l i b r a t e t h e m e a s u r e m e n t o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . I n a d d i t i o n , i n s i t u c a l i b r a t i o n u s i n g c e l l s i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e m o r e r e l i a b l e t h a n m e t h o d s e m p l o y i n g f l u o r e s c e n c e r a t i o s d e t e r m i n e d i n c e l l - f r e e s y s t e m s ( I s h i i e t a l . 1 9 8 9 ) . T h e m e a n r e s t i n g l e v e l o f [Ca2+]j w h i c h w a s o b t a i n e d s h o u l d t h e r e f o r e b e r e l i a b l e . 1 6 7 [ C a2+ ] j i s k n o w n t o d e c l i n e w h e n e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s l o w e r e d b e l o w a b o u t 2 m M , a t l e a s t i n t h e c a s e o f S M C s d e r i v e d f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t ( W i f f i a m s e t a l . 1 9 8 5 ; P r i t c h a r d a n d A s h l e y 1 9 8 6 ) . I n b o t h t h e p r e s e n t s t u d y , a n d i n o n e o f t h e s t u d i e s q u o t e d a b o v e , 1 m M C a2 + w a s e m p l o y e d i n t h e e x t e r n a l b a t h i n g s o l u t i o n ( N a b i k a e t a l . 1 9 8 5 ) . I t s e e m s u n l i k e l y t h e r e f o r e t h a t t h e s m a l l e r v a l u e o f [ C a 2 + ] j o b t a i n e d f r o m c u l t u r e d c e r e b r o v a s c u l a r S M C s w a s d u e e n t i r e l y t o t h e u s e o f a r e l a t i v e l y l o w c o n c e n t r a t i o n o f C a2 + i n t h e e x t e r n a l b a t h i n g s o l u t i o n . B i n d i n g o f t h e f r e e a c i d b y c e l l u l a r p r o t e i n s c a n l e a d t o a c h a n g e i n a f f i n i t y o f f u r a - 2 f o r c a l c i u m , a n d t o a n u n d e r e s t i m a t e o f [ C a2+ ] j ( K o n i s h i e t a l . 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , c o m p a r i s o n o f f u r a - 2 d a t a w i t h r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g c a l c i u m s e n s i t i v e m i c r o e l e c t r o d e s s u g g e s t s t h a t t h e u n d e r e s t i m a t e i n t r o d u c e d b y f u r a - 2 i s n o m o r e t h a n t w o - f o l d ( S o m l y o a n d H i m p e n s 1 9 8 9 ) . I n a d d i t i o n , t h i s e r r o r s h o u l d a p p l y t o a l l s t u d i e s i n w h i c h a c u v e t t e c a l i b r a t i o n o f f u r a - 2 c a l c i u m a f f i n i t y w a s e m p l o y e d . 4 . 2 . 1 . M o d u l a t i o n o f [ C a2 + ] i b y s e r o t o n i n i n C V S M C s T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n h e r e s h o w t h a t 5 - H T i n c r e a s e s f r e e i n t r a c e l l u l a r C a2 + l e v e l s i n C V S M C s d e r i v e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s . T h i s e f f e c t s h o w e d a n a p p a r e n t E C 5 O o f 1 0 n M , a v a l u e c l o s e t o t h a t s e e n i n s i m i l a r s t u d i e s c o n d u c t e d o n a n a o r t a S M C l i n e , E C 5 0 = 2 6 n M , ( D o y l e e t a l . 1 9 8 6 ) . I n a d d i t i o n , t h e e f f e c t o f 5 - l I T o n c a l c i u m m o b i l i z a t i o n w a s s h o w n t o b e m a x i m a l a t a s e r o t o n i n d o s e o f 1 u M i n a l l t h r e e o f t h e s e p r e p a r a t i o n s ( D o y l e e t a l . 1 9 8 6 ; C a p p o n i e t a l . 1 9 8 7 ) . 1 6 8 I n s t u d i e s c o n d u c t e d o n c u l t u r e d r a t a o r t a V S M C s , i t w a s f o u n d t h a t 5 - H T i n c r e a s e d [ C a2 + ] j t o a m a x i m a l l e v e l o f 1 8 7 n M , s i m i l a r t o t h a t s e e n i n t h e p r e s e n t s t u d y ( T a k a t a e t a l . 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , C a p p o n i e t a l . ( 1 9 8 8 ) , a l s o u s i n g r a t a o r t a V S M C s i n c u l t u r e , f o u n d t h a t 5 - H T a p p l i c a t i o n c o u l d e l e v a t e [ C a2+ ] i t o 4 0 0 n M i n t h e s e c e l l s . T h e r e a s o n f o r t h i s d i s c r e p a n c y i s n o t c l e a r , a l t h o u g h t h e s e s t u d i e s u s e d c e l l s a f t e r d i f f e r i n g n u m b e r s o f p a s s a g e i n c u l t u r e ( C a p p o n i e t a l . 1 9 8 8 ; T a k a t a e t a l . 1 9 8 8 ) . S i m u l t a n e o u s m e a s u r e m e n t s o f [ C a2+ ] a n d f o r c e d e v e l o p m e n t i n i n d i v i d u a l v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s s u g g e s t t h a t t h e t h r e s h o l d l e v e l o f [ C a2+ J i f o r t e n s i o n p r o d u c t i o n i s a r o u n d 1 2 5 n M a n d t h a t m a x i m a l f o r c e c a n b e p r o d u c e d a t a [Ca2+]i o f 5 0 0 - 6 0 0 n M ( Y a g i e t a l . 1 9 8 8 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e m a x i m a l l e v e l s o f [ C a2+ ] i r e a c h e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w o u l d b e s u f f i c i e n t f o r t e n s i o n d e v e l o p m e n t i n i s o l a t e d C V S M C s . I t s h o u l d a l s o b e n o t e d t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e c o n t r a c t i l e s y s t e m t o [ C a2+ I i h a s b e e n f o u n d t o v a r y w i t h t h e m a n n e r i n w h i c h v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s a r e s t i m u l a t e d . T h u s , a o r t a V S M C s s t i m u l a t e d w i t h n o r e p i n e p h r i n e e x h i b i t e d h a l f - m a x i m a l t e n s i o n a t a [ C a2 + I i o f o n l y 1 0 0 n M , w h i l e c e l l s s t i m u l a t e d b y t h e c a l c i u m i o n o p h o r e i o n o m y c i n r e q u i r e d 6 0 0 n M t o r e a c h a c o m p a r a b l e t e n s i o n ( B r u s c h i e t a l . 1 9 8 8 ) . I t i s k n o w n t h a t m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e c a n b e p h o s p h o r y l a t e d b y p r o t e i n k i n a s e C , a n e n z y m e a c t i v a t e d b y t h e d i a c y l g l y c e r o l l i b e r a t e d o n a c t i v a t i o n o f 5 - H T 2 r e c e p t o r s . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i s p h o s p h o r y l a t i o n p r o c e s s c o u l d r e d u c e t h e c a l c i u m r e q u i r e d f o r m a i n t a i n e d c o n t r a c t i o n ( B r u s c h i e t a l . 1 9 8 8 ) . T h e s e c o n s i d e r a t i o n s m a k e i t d i f f i c u l t t o a c c u r a t e l y a s s e s s t h e d e g r e e o f c o n t r a c t u r e w h i c h w o u l d b e p r o d u c e d b y a g i v e n r i s e i n [ C a2+ ] i , f o l l o w i n g a c t i v a t i o n o f t h e p r e s e n t c e l l s b y 5 - H T . 1 6 9 T h e 5 - H T i n d u c e d i n c r e a s e i n [ C a2 + I i w a s n o t p r e v e n t e d b y t h e p r e s e n c e o f o r g a n i c o r i n o r g a n i c C a2+ c h a n n e l b l o c k e r s . I n c o n t r a s t , i t i s k n o w n t h a t a c t i o n p o t e n t i a l g e n e r a t i o n i n r a t b a s i l a r a r t e r y C V S M C s i s p o w e r f u l l y b l o c k e d b y b o t h C o2+ a n d n i f e d i p i n e ( S u p r e n a n t e t a l . 1 9 8 7 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e r i s e i n [ C a2 + ] i e v o k e d b y 5 - H T d i d n o t d e p e n d o n t h e e n t r y o f C a 2 + t h r o u g h v o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u m c h a n n e l s , d u r i n g a c t i o n p o t e n t i a l f i r i n g . A s i m i l a r c o n c l u s i o n w a s r e a c h e d i n t h e c a s e o f s e r o t o n i n i n d u c e d c a l c i u m r e l e a s e o c c u r r i n g i n V S M C s d i s s o c i a t e d f r o m t h e r a t a o r t a ( C a p p o n i e t a l . 1 9 8 7 ) . A t d o s e s o f 1 - 5 O M , 5 - H T t r i g g e r s a s m a l l d e p o l a r i z a t i o n a n d a b r i e f b u r s t o f G a2+ s p i k e s i n c e r e b r o v a s c u l a r S M C s ( S u p r e n a n t e t a ! . 1 9 8 7 ) . C a l c i u m e n t r y t h r o u g h v o l t a g e - g a t e d C a c h a n n e l s a c t i v a t e d i n t h i s w a y m i g h t h a v e b e e n e x p e c t e d t o g i v e r i s e t o a n e n h a n c e d f u r a - 2 s i g n a l a t 5 - H T d o s e s o f 1 M o r g r e a t e r . T h i s s i g n a l s h o u l d b e s e n s i t i v e t o c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s . N o e v i d e n c e f o r t h i s e f f e c t w a s s e e n i n t h e p r e s e n t r e s u l t s . T h i s s u g g e s t s t h a t C a2+ e n t r y t h r o u g h m e m b r a n e c h a n n e l s w a s r e l a t i v e l y m i n o r , i n c o m p a r i s o n t o C a2 + r e l e a s e d f r o m i n t e r n a l s t o r e s . I t r e m a i n s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t c a l c i u m c h a n n e l b l o c k a d e w o u l d b e m o r e e f f e c t i v e i n r e d u c i n g t h e r e s p o n s e t o 5 - H T c o n c e n t r a t i o n s a b o v e t h e 1 M d o s e u s e d i n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e e f f e c t o f 5 - H T o n [ C a2+ I i w a s r e d u c e d b y a b o u t 5 0 % i n t h e p r e s e n c e o f 5 n M k e t a n s e r i n . T h i s c o n c e n t r a t i o n i s s i m i l a r t o t h e a f f i n i t y o f k e t a n s e r i n m e a s u r e d a t a g o n i s t l a b e l l e d 5 - H T 2 r e c e p t o r s i t e s i n r a t b r a i n c o r t e x , w h i c h s h o w a K d = 1 . 4 n M , ( L y o n e t a l . 1 9 8 7 ) . 1 n M k e t a n s e r i n a l s o s u p p r e s s e s w h a t a p p e a r t o b e 5 - H T 2 r e c e p t o r m e d i a t e d c a l c i u m f l u x e s i n t h e A 7 r 5 s m o o t h m u s c l e c e l l l i n e b y a b o u t 5 0 % ( D o y l e e t a l . 1 9 8 6 ) . K e t a n s e r i n 1 7 0 i s k n o w n t o b l o c k r e s p o n s e s m e d i a t e d b y t h e 5 - H T 1 C r e c e p t o r , b u t t h e a f f i n i t y o f t h i s s i t e i s a p p a r e n t l y t w o o r d e r s o f m a g n i t u d e t o o l o w t o r e a d i l y a c c o u n t f o r t h e p r e s e n t r e s u l t s ( C o n n a n d S a n d e r s - B u s h 1 9 8 7 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e o b s e r v e d i n s e n s i t i v i t y o f 5 - H T a c t i o n t o c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s , a n d t h e h i g h s e n s i t i v i t y t o b l o c k a d e b y k e t a n s e r i n a r e c o m p a t i b l e w i t h a m e c h a n i s m i n w h i c h 5 - H T 2 r e c e p t o r a c t i v a t i o n r e s u l t s i n t h e m o b i l i z a t i o n o f c a l c i u m f r o m i n t e r n a l s t o r e s . S e r o t o n i n i n d u c e d c o n t r a c t i o n s i n i n t a c t r a t c e r e b r a l a r t e r i e s a r e s u p p r e s s e d b y n a n o m o l a r l e v e l s o f k e t a n s e r i n ( C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e s e c o n t r a c t i o n s a r e a l s o s t r o n g l y i n h i b i t e d b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s ( C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . I t s e e m s l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t f u l l a c t i v a t i o n o f t h e c o n t r a c t i l e m e c h a n i s m i n c e r e b r o v a s c u l a r S M C s r e q u i r e s C a2 + - d e p e n d e n t p r o c e s s e s o v e r a n d a b o v e t h e r e l e a s e o f c a l c i u m f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s . T h e e f f e c t s o f 5 - H T o n m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d o n c a l c i u m r e l e a s e f r o m i n t e r n a l s t o r e s h a v e b e e n s t u d i e d i n d e t a i l i n r a t m e s a n g i a l c e l l s , a c o n t r a c t i l e , s m o o t h m u s c l e - l i k e c e l l f r o m t h e k i d n e y g l o m e r u l u s ( M e n e e t a l . 1 9 9 1 ) . I t w a s f o u n d t h a t 5 - H T a c t i v a t e d a 5 - H T 2 r e c e p t o r , w h i c h t r i g g e r e d i m m e d i a t e d d i s c h a r g e o f c a l c i u m f r o m i n t e r n a l s t o r e s . T h e e l e v a t i o n o f [ C a2 + J i a c t i v a t e d a c a l c i u m - d e p e n d e n t c h l o r i d e c o n d u c t a n c e , p r o d u c i n g a s m a l l , m a i n t a i n e d d e p o l a r i z a t i o n o f t h e c e l l w h i c h w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n t i n u e d o c c u p a t i o n o f 5 - H T 2 r e c e p t o r s b y t h e a g o n i s t . T h i s d e p o l a r i z a t i o n i n t u r n a c t i v a t e d v o l t a g e s e n s i t i v e C a c h a n n e l s , l e a d i n g t o t o n i c e n t r y o f c a l c i u m i n t o t h e c e l l ( M e n e e t a l . 1 9 9 1 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a t o n i c i n f l u x o f C a2+ t h r o u g h v o l t a g e s e n s i t i v e c h a n n e l s m a y a l s o o c c u r i n 5 - H T s t i m u l a t e d V S M C s , a n d t h a t t h i s 1 7 1 i n f l u x m a y b e n e c e s s a r y t o m a i n t a i n t h e c o n t r a c t i l e s t a t e , p o s s i b l y b y f a c i l i t a t i n g t h e r e c y c l i n g o f i n t e r n a l c a l c i u m ( S u t t e r 1 9 9 0 ) . I n s o m e c e l l s i n v e s t i g a t e d i n t h i s s t u d y , a m a r k e d l o s s o f 5 - H T r e s p o n s i v e n e s s w a s s e e n o n r e p e a t e d a p p l i c a t i o n o f t h e a g o n i s t . T h i s p h e n o m e n o n h a s a l s o b e e n r e p o r t e d i n s t u d i e s o f 5 - H T i n d u c e d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n S M C s f r o m t h e p e r i p h e r a l v a s c u l a t u r e ( C a p p o n i e t a l . 1 9 8 7 ; T a k a t a e t a l . 1 9 8 8 ) . T h e p r o g r e s s i v e d e c l i n e i n r e s p o n s e t o 5 - H T w a s m o s t m a r k e d i n t h e c e l l b e i n g e x p o s e d t o t h e p h o t o e x c i t a n t w a v e l e n g t h s . I t s e e m s l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t t h i s p h e n o m e n o n i n v o l v e d a d e g r e e o f p h o t o d y n a m i c d a m a g e , a s h a s b e e n n o t e d i n p r e v i o u s s t u d i e s u s i n g f u r a - 2 ( T s i e n 1 9 8 8 ) . I n t h e c e l l b e i n g i l l u m i n a t e d , p h o t o d y n a m i c d a m a g e m a y a l s o h a v e e n h a n c e d t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t o f e l e v a t e d [ C a2 + ] i , w h i c h i s k n o w n t o a c t i v a t e C a2 + - d e p e n d e n t p r o t e a s e s i n m a n y t i s s u e s ( B o n d , 1 9 8 8 ) . T h e d e c r e a s e d r e s p o n s e t o 5 - H T s e e n o n r e p e a t e d a g o n i s t a p p l i c a t i o n o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f e l e v a t i n g b a s e l i n e l e v e l s o f f r e e c a l c i u m , s u g g e s t i n g t h a t m e m b r a n e i n t e g r i t y w a s n o t g r e a t l y c o m p r o m i s e d d u r i n g t h i s p h e n o m e n o n . I t s e e m s u n l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t g r o s s d a m a g e t o t h e c e l l m e m b r a n e w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e d e c l i n i n g r e s p o n s i v e n e s s t o 5 - H T . I n s u m m a r y , t h e p r e s e n t r e s u l t s s h o w t h a t C V S M C s c u l t u r e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s p r o v i d e a n u s e f u l p r e p a r a t i o n i n w h i c h t o s t u d y C a2 + m o b i l i z a t i o n b y s e r o t o n i n a n d o t h e r a g e n t s a c t i v e i n t h e c e r e b r o v a s c u l a r c i r c u l a t i o n o f m a m m a l s . 4 . 3 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f i s o l a t e d C V S M C s 1 7 2 I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e m e a n r e s t i n g p o t e n t i a l o f i s o l a t e d C V S M C s f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s w a s f o u n d t o b e a b o u t - 4 0 m V . T h e s e c e l l s s h o w e d a n i n p u t r e s i s t a n c e o f a b o u t 3 G O a t t h e r e s t i n g p o t e n t i a l a n d a t o t a l m e m b r a n e c a p a c i t a n c e o f 2 4 p F . S i m i l a r v a l u e s o f i n p u t r e s i s t a n c e h a v e b e e n r e p o r t e d i n a p r e v i o u s p a t c h c l a m p s t u d y o f i s o l a t e d C V S M C s d e r i v e d f r o m r a t b a s i l a r a r t e r y ( S t e e l e e t a l . 1 9 9 1 ) . A s s u m i n g a s p e c i f i c m e m b r a n e c a p a c i t a n c e o f 1 p F / c m2, a s h a s b e e n s u g g e s t e d f o r V S M C s ( T o r o e t a l . 1 9 8 6 ) , a 2 4 p F c e l l s h o u l d p o s s e s s a s u r f a c e a r e a o f 2 4 0 0 m2. T h i s i s g r e a t l y i n e x c e s s o f t h e s u r f a c e a r e a c a l c u l a t e d f o r 1 2 j L m d i a m e t e r c e l l s o f p u r e l y s p h e r i c a l s h a p e ( 4 5 2 m2). T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e m e m b r a n e s u r f a c e o f t h e p r e s e n t c e l l s i s h i g h l y i n v o l u t e d , p r e s u m a b l y a s a c o n s e q u e n c e o f c e l l c o n t r a c t i o n a n d o f t h e p r e s e n c e o f n u m e r o u s c a v e o l a e i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( M u l v a n y 1 9 8 6 ) . H i r s t e t a l . ( 1 9 8 6 ) s t u d i e d t h e e l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f a r t e r i o l a r s e g m e n t s o f r a t m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y u s i n g i n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g t e c h n i q u e s . T h e y o b t a i n e d a m e a n r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l o f - 6 3 m V . S i m i l a r e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d o n i n t a c t c a t b a s i l a r a r t e r i e s ( H a r d e r e t a l . 1 9 8 1 ) a n d o n g u i n e a - p i g b a s i l a r a r t e r y ( F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 2 ) y i e l d e d m e a n r e s t i n g p o t e n t i a l s o f - 5 5 m V a n d - 5 0 m V r e s p e c t i v e l y . T h e s l i g h t l y l o w e r v a l u e s o f r e s t i n g p o t e n t i a l o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y c o u l d b e t h e r e s u l t o f s e v e r a l f a c t o r s . F o l l o w i n g f o r m a t i o n o f t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n , d i a l y s i s o f t h e c e l l u l a r c o n t e n t s o c c u r s , l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a n e w e q u i l i b r i u m b e t w e e n t h e b a t h i n g s o l u t i o n a n d t h e s o l u t i o n f i l l i n g t h e p a t c h p i p e t t e ( S a k m a n n a n d N e h e r 1 9 8 3 ) . T h e l a t t e r s o l u t i o n m u s t t h e r e f o r e a c c u r a t e l y r e f l e c t t h e i o n i c c o m p o s i t i o n o f t h e s a r c o p l a s m i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , i f r e l i a b l e v a l u e s o f r e s t i n g p o t e n t i a l a r e t o b e o b t a i n e d . 1 7 3 T h e m e m b r a n e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s s h o w s s i g n i f i c a n t r e s t i n g p e r m e a b i l i t y t o N a + a n d C l - , a s w e l l a s t o K + ( S u t t e r 1 9 9 0 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 2 ; J o h a n s s o n a n d S o m l y o 1 9 8 0 ) . E l e c t r o n p r o b e a n a l y s i s s t u d i e s c o n d u c t e d o n m e s e n t e r i c p o r t a l v e i n s h a v e i n d i c a t e d t h e f o l l o w i n g v a l u e s f o r i n t r a c e l l u l a r i o n i c c o n c e n t r a t i o n s , i n m m o l e / k g d r y w e i g h t : N a + 1 6 7 ; K + 6 1 1 ; C l - 2 7 8 ; M g2+ 3 6 a n d C a2+ 1 . 9 ( S o m l y o e t a ! . 1 9 7 9 ) . T h e s e v a l u e s i n d i c a t e t h a t , i n i n t a c t C V S M C s , [ K + J i / [ N a + ] j m a y b e a p p r e c i a b l y s m a l l e r t h a n t h e v a l u e w h i c h p e r t a i n e d d u r i n g w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s r e p o r t e d i n t h i s s t u d y ( 4 7 : 1 ) . W a h i s t r o m ( 1 9 7 1 ) e s t i m a t e d t h a t t h e N e r n s t p o t e n t i a l f o r N a + i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i s p r o b a b l y n o m o r e p o s i t i v e t h a n 2 1 m V , w h i l e E K w a s - 8 6 m V . T h e u s e o f l o w i n t e r n a l N a + i n w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s c o u l d t h e r e f o r e h a v e r e s u l t e d i n a n u n d e r e s t i m a t e o f t h e t r u e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n i s o l a t e d C V S M C s . I n a d d i t i o n , a o u a b a i n s e n s i t i v e N a + / K + p u m p i s k n o w n t o r e g u l a t e i o n i c c o n c e n t r a t i o n s i n V S M C s a n d t o e l e c t r o g e n i c a l l y c o n t r i b u t e s e v e r a l m i l l i v o l t s t o t h e r e s t i n g p o t e n t i a l o f t h e s e c e l l s i n v i v o ( S u t t e r 1 9 9 0 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 2 ) . T h i s p u m p w a s p r e s u m a b l y i n h i b i t e d d u r i n g m a i n t e n a n c e o f t h e c e l l s a t 4 ° C a n d d e p r e s s e d d u r i n g w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s , s i n c e e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d a t 2 1 0 C a n d t h e p i p e t t e s o l u t i o n d i d n o t c o n t a i n A T P . T h e i n p u t r e s i s t a n c e o f t h e i s o l a t e d C V S M C s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w a s f o u n d t o a v e r a g e 3 G O , a v a l u e c o m p a r a b l e t o r e s u l t s o b t a i n e d i n p a t c h c l a m p s t u d i e s o n S M C s i s o l a t e d f r o m r a t c a u d a l v e i n , 1 . 4 G O ( T o r o e t a l . 1 9 8 6 ) , r a b b i t j e j u n u m , 2 G O ( B o l t o n e t a l . 1 9 8 5 ) , a n d r a t b a s i l a r a r t e r y , 4 G O ( S t e e l e e t a ! . 1 9 9 1 ) . T h e m e a s u r e d v a l u e i n c l u d e s t h e l e a k a g e r e s i s t a n c e b e t w e e n t h e p i p e t t e a n d t h e m e m b r a n e , w h i c h w a s t y p i c a l l y a b o u t 1 0 G O . H e n c e t h e 1 7 4 m e a s u r e d i n p u t r e s i s t a n c e s s l i g h t l y u n d e r e s t i m a t e d t h e t r u e v a l u e o f t h i s p a r a m e t e r . T h e s e r e s i s t a n c e s i n t h e g i g a o h m r a n g e g r e a t l y e x c e e d v a l u e s d e t e r m i n e d i n i s o l a t e d V S M C s u s i n g i n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g m e t h o d s , w h i c h a r e t y p i c a l l y i n t h e r a n g e 0 . 4 5 - 0 . 5 9 G O ( T o r o e t a l . 1 9 8 6 ) . T h i s d i f f e r e n c e p r o b a b l y r e f l e c t s t h e p r e s e n c e o f a p p r e c i a b l e l e a k a g e c u r r e n t s a r o u n d t h e m i c r o e l e c t r o d e i n s e r t i o n ( S a k m a n n a n d N e h e r 1 9 8 3 ) . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s f r o m V S M C s i n i n t a c t b l o o d v e s s e l s y i e l d y e t l o w e r e s t i m a t e s o f m e m b r a n e r e s i s t a n c e , i n t h e o r d e r o f 1 0 - 1 0 0 M O . T h i s p r o b a b l y r e f l e c t s t h e s y n c y t i a l n a t u r e o f s m o o t h m u s c l e p r e p a r a t i o n s i n i n t a c t v e s s e l s ( H i r s t e t a l . 1 9 8 6 ; H e r m s m e y e r 1 9 7 6 ; S o m l y o 1 9 8 0 ; S u p r e n a n t e t a ! . 1 9 8 7 ) . C V S M C s i s o l a t e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s s h o w e d a m a r k e d f a l l i n i n p u t r e s i s t a n c e o n m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n , a n d o n l y s m a l l r e g e n e r a t i v e r e s p o n s e s c o u l d b e e v o k e d b y d i r e c t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n . T h e s e p r o p e r t i e s w e r e a l s o s e e n i n C V S M C s s t u d i e d w i t h i n t r a c e l l u l a r m i c r o e l e c t r o d e s i n i n t a c t c e r e b r a l a r t e r i e s o f t h e r a t ( H i r s t e t a l . 1 9 8 6 ) a n d g u i n e a - p i g ( F u g i w a r a a n d K u r i y a m a 1 9 8 3 ) . I n c o n t r a s t , C V S M C s i n i n t a c t r a b b i t b a s i l a r a r t e r y d o g e n e r a t e l a r g e a c t i o n p o t e n t i a l s o n d e p o l a r i z a t i o n i n n o r m a l b a t h i n g m e d i a ( S u p r e n a n t e t a ! . 1 9 8 7 ) . I n C V S M C s s t u d i e d i n i n t a c t r a t b a s i l a r a r t e r i e s , l a r g e a c t i o n p o t e n t i a l s w e r e e v o k e d o n d i r e c t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n , f o l l o w i n g s u p p r e s s i o n o f o u t w a r d p o t a s s i u m c u r r e n t b y T E A . I n w a r d c u r r e n t d u r i n g t h e s e a c t i o n p o t e n t i a l w a s c a r r i e d b y c a l c i u m i o n s ( H i r s t e t a ! . 1 9 8 6 ) . T h e e n h a n c e d l e v e l o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m s e e n i n t h e p r e s e n t c e l l s o n d e p o l a r i z a t i o n b y h i g h p o t a s s i u m s o l u t i o n s s u g g e s t s t h a t v o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u m c h a n n e l s w e r e a l s o p r e s e n t i n t h i s p r e p a r a t i o n . I t s e e m s l i k e l y , h o w e v e r , t h a t t h e i n w a r d c u r r e n t 1 7 5 f l o w i n g i n t h e s e c h a n n e l s w a s i n s u f f i c i e n t t o o v e r c o m e t h e d a m p i n g e f f e c t o f r e c t i f i e r c u r r e n t s , d u r i n g d i r e c t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n . D u r i n g a p p l i c a t i o n o f s e r o t o n i n t o t h e p r e s e n t c e l l s , b i p h a s i c c u r r e n t s w e r e o b s e r v e d i n c e l l - a t t a c h e d m e m b r a n e p a t c h e s . T h e s e c u r r e n t s s t r o n g l y r e s e m b l e d t h e c a p a c i t a n c e c u r r e n t s r e c o r d e d i n c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s d u r i n g a c t i o n p o t e n t i a l a c t i v i t y i n o t h e r t y p e s o f h i g h i m p e d a n c e c e l l ( F e n w i c k e t a l . 1 9 8 2 ) . S e r o t o n i n ( 1 - 5 O M ) i s k n o w n t o c a u s e a s m a l l d e p o l a r i z a t i o n i n c e r e b r a l a r t e r y V S M C s , a n d t o i n i t i a t e a b u r s t o f a c t i o n p o t e n t i a l s i n t h e s e c e l l s ( S u p r e n a n t e t a l . 1 9 8 7 ) . C a l c i u m e n t r y d u r i n g t h e s e a c t i o n p o t e n t i a l s m i g h t b e e x p e c t e d t o a c t i v a t e K C a c h a n n e l s i n t h e p r e s e n t c e l l s . L a r g e a m p l i t u d e s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e i n d e e d o b s e r v e d i n c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s d u r i n g e x p o s u r e o f C V S M C s t o s e r o t o n i n . F u r t h e r w o r k i s n e e d e d , h o w e v e r , t o i d e n t i f y t h e s e c u r r e n t s d e f i n i t i v e l y . 4 . 4 . Ca2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s I n t h i s s t u d y , e v i d e n c e w a s o b t a i n e d f o r t w o t y p e s o f v o l t a g e a n d C a - d e p e n d e n t K - c h a n n e l s i n C V S M C s d i s p e r s e d f r o m r a t c e r e b r a l a r t e r i e s . O n t h e b a s i s o f a l a r g e d i f f e r e n c e i n m e a n s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e , t h e s e w e r e d e s i g n a t e d a s K ( c D a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s . 4 . 4 . 1 . P r o p e r t i e s o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l T h e K ( C a ) L c h a n n e l s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r s h o w e d a c o n d u c t a n c e o f 2 0 7 ± 1 0 p A i n s y m m e t r i c a l h i g h p o t a s s i u m s o l u t i o n s , s i m i l a r t o t h a t o f B K 1 7 6 c h a n n e l s s t u d i e d i n V S M C s f r o m m e s e n t e r i c a r t e r y , a n d a v a r i e t y o f o t h e r s m o o t h m u s c l e p r e p a r a t i o n s ( S e e T a b l e I I ) . M e a s u r e d c o n d u c t a n c e v a l u e s o f K ( C a ) L c h a n n e l s v a r i e d f r o m 1 7 0 p S t o 2 6 7 p S w h e n m e a s u r e d u n d e r c o n s t a n t i o n i c c o n d i t i o n s . S i m i l a r v a r i a t i o n h a s b e e n s e e n i n t h e c o n d u c t a n c e o f B K c h a n n e l s i n c h r o m a f f i n c e l l s , 1 9 0 - 3 3 0 p S ( M a r t y 1 9 8 1 ) a n d i n r a t s k e l e t a l m u s c l e , 1 5 0 - 2 4 0 p S ( B a r r e t t e t a ! . 1 9 8 2 ) . T h e m e a n i n g o f t h e s e v a r i a t i o n s i n t e r m s o f c h a n n e l s t r u c t u r e r e m a i n s , h o w e v e r , u n c l e a r . A m o r e d e f i n i t i v e a s s i g n m e n t o f t h e p r e s e n t c h a n n e l t o t h e B K c a t e g o r y a w a i t s d e t e r m i n a t i o n o f c h a n n e l s e n s i t i v i t y t o c h a r y b d o t o x i n , a s e l e c t i v e b l o c k e r o f B K c h a n n e l s i n m a n y t i s s u e s ( L a n g a n d R i t c h i e 1 9 9 0 ; M a c K i n n o n a n d M i l l e r 1 9 8 8 ) . 4 . 4 . 1 . 1 . I o n i c s e l e c t i v i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e h i g h l y s e l e c t i v e f o r K + o v e r N a + ( P N a / P K < 0 . 0 5 ) , a s h a s b e e n o b s e r v e d f o r B K c h a n n e l s i n o t h e r s m o o t h m u s c l e c e l l s ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 6 ; I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ; G r e e n e t a l . 1 9 9 1 ; M a y e r e t a l . 1 9 9 0 ) . N a + d i d n o t s i g n i f i c a n t l y i n t e r f e r e w i t h t h e p a s s a g e o f K + t h r o u g h o p e n K ( C a ) L c h a n n e l s , e v e n w h e n p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 8 0 m M . S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d f o r t h e B K c h a n n e l f o u n d i n g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , c u r r e n t f l o w i n t h e B K c h a n n e l s o f b o v i n e c h r o m a f f i n c e l l s i s s u b j e c t t o a f a s t f l i c k e r b l o c k b y 5 m M i n t e r n a l N a + , p r o v i d i n g * K + i s a b s e n t f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ) . U n d e r t h e i o n i c c o n d i t i o n s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , a f l i c k e r b l o c k o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l b y i n t e r n a l N a + m a y h a v e b e e n r e l i e v e d b y t h e p r e s e n c e o f 1 4 0 m M K + i n t h e e x t e r n a l s o l u t i o n , a n d c o u l d t h e r e f o r e h a v e g o n e u n d e t e c t e d ( Y e l l e n 1 9 8 4 b ) . 1 7 7 Table II Characteristics of BK channels in various preparations Voltage Calcium TEA Tonic Conductance dependence dependence block(c) Preparation conditionsa (pS) Selectivity (a) (b) Kd(0)i Kd(0)0 Reference Bovine 160 K + 265 K>Rb>Na,Cs 12-15 mV lOnM 27mM 0.2mM Marty 1981, 1983, chromaffin Yellen 1984a cell Rat myotubes 140 K + 240 TI>K>Rb>NH4>> 11-16 mV 4OmV/10-fold 60mM 0.3mM Barret et aT. 1982, Na,Li,Cs V0(l sM)=40rnV Blatz and Magleby 1984,1986 Rabbit lOOK + 260 Ti>K>Rb>NH4>> 11-13 mV 4OmV/10-fold 45mM 0.29mM Latorreetal. 1982, Ttubulesb Na>Li>Cs V0(1 M)=40mV Moczydlowski et al.1983,1985, Vergara 1983 et al.1984 Rat anterior 140 K + 200 - 9 mV 6OmV/10-fold 0.08mM 52.2mM Wong and Adler 1986, pituitary cells V0(1 iM)=-30mV Wong et al. 1982 (AtT2O/D16-16) Rat anterior 150 K + 250-300 K>>Na 8 mV V0(1 M)=50mV Kd(60)02mMLang and Ritchie 1988 pituitary (GH3) Mouse parotid 145 K + 250 K>>Na 12 mV 1 nM - Ma ruyama et al 1983 acini Rat panceatic 140 K + 244 K>>Na 15 mV llOmV/10-fold - Cook et al.l984, B-cell , V0(1 M)=0mV Findlay et aL1985 Rabbit 140 K + 180 K>>Na 17 mV 100 nM - Gitter et al. 1987 collecting duct cells Rat pancreatic 150 K + 200 - yes 60-7OmV/1 00-fold - Gray et al. 1990 duct cells V(3jiM)=-4mV Rabbit 100K + 230 K>Rb>Na,Li,Cs 15 mV 3OmV/10-fold - Cecchi et al. 1986 intestinal SMCb V0(2jM)60mV Toad 130K + 250 K>>Na 9 mV 8OmV/l0-fold - Sin ger and Walsh 1987 stomach SMC V0(1 JLM)=lOmV Frog and toad 120 K + 200 K>>Na yes 10 nM 20mM for Bergeret al. 1984 stomach SMC total block externally Rabbit 126 K + 200 K>>Na yes 10 nM 12mM - B enham et al. 1985 intestinal SMC Rabbit 126 K + 200 TI>K>Rb>> 30 mV 30-60mV/TO-fold - Benham et aT. 1986 mesenteric ‘ Na,Cs artery SMC 178 Rabbit 126 K + 210 K>>Na yes 60mV/l0-fold 30mM for total Mayer et at. 1990 colonic SMC V0(5tM)=0mV block externally Canine 140 K + 265 K>>Na yes lOOmV/l0-fold NE 0.18 mM Carl et at. 1990 gastric SMC Rabbit 142K 273 K>>Na - V0(l.4RM)=OmV NE 0.1mM Inoueetal. 1985 portal vein SMC Rat cerebral 140 K + 207 K>>Na,Cs 14 mV 45 mV/l0-fold Kd(-t-40)1=0.83mM Present study artery SMC V0(23 M)=+40mV a = concentration is in mM. Symmetrical solutions were used. b = parameters determined in planar bitayers. For all other channels, patch-clamp technique was used.(a) = expressed as c-fold change in P0 (fraction of the time in the open state) per x mV. (b) = expressed as x mV change in V0 (voltage at whichP0=0.5) per 10-fold increase in [Ca2+]; V0 (x mM)1 indicates the voltage at whichP0=0.5 at given [Ca2+]i. Otherwise the lowest [Ca2jis given at which channel activity can be seen. (c) Kd(0)1 indicates concentration of internally applied TEA causing 50% block of single channel current at 0 mV. Kd(0)0 is corresponding value during external application of TEA. If data were obtained at other membrane voltages, this is indicated in brackets. SMC = Smooth muscle cell. NE = No effect of internally applied TEA. 179 T h e K ( C a ) L c h a n n e l a l s o s h o w e d n e g l i g i b l e p e r m e a b i l i t y t o C s + ( P C / P K < 0 . 0 5 ) . U n d e r c o n d i t i o n s w h i c h f a v o u r e d t h e e n t r y o f C s + i n t o t h e c h a n n e l , t h e a m p l i t u d e o f p o t a s s i u m c u r r e n t s w a s s i g n i f i c a n t l y d e p r e s s e d . Q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n m a d e i n t h e c a s e o f B K c h a n n e l s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s d e r i v e d f r o m g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y . I n t h i s p r e p a r a t i o n , h o w e v e r , B K c h a n n e l s e x h i b i t a m u c h h i g h e r s e n s i t i v i t y t o t h e b l o c k i n g e f f e c t o f C s + t h a n w a s e v i d e n t i n t h e p r e s e n t s t u d y , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e t w o c h a n n e l p o p u l a t i o n s , d e s p i t e t h e i r s i m i l a r c o n d u c t a n c e , a r e p r o b a b l y n o t i d e n t i c a l ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e a c t i o n o f C s + o n t h e p r e s e n t c h a n n e l c a n b e e x p l a i n e d b y t h e t h e o r y o f i o n i c b l o c k a d e ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ; H i l l e 1 9 9 1 ) . I t i s a s s u m e d C s + b i n d s t o a s i t e i n t h e o p e n c h a n n e l a n d b l o c k s i t . A t e q u i l i b r i u m , t h e c h a n n e l w i l l f l u c t u a t e b e t w e e n c l o s e d , o p e n a n d b l o c k e d s t a t e s . T h e f r e q u e n c y o f b l o c k i n g e v e n t s i n c r e a s e s a t p o t e n t i a l s w h i c h p r o m o t e t h e e n t r y o f C s + i n t o t h e c h a n n e l . I f t h e a v e r a g e l i f e t i m e o f t h e b l o c k e d s t a t e w e r e l e s s t h a n t h e t i m e r e s o l u t i o n o f t h e r e c o r d i n g s y s t e m , t h e n t h e o p e n c h a n n e l c u r r e n t w o u l d r e p r e s e n t a t i m e - a v e r a g e d c u r r e n t , r e f l e c t i n g t h e p r o p o r t i o n o f t i m e t h e c h a n n e l s p e n t i n t h e b l o c k e d s t a t e d u r i n g a n o p e n i n g ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e f l i c k e r b l o c k o f K ( C a ) L c h a n n e l s b y C s + s h o w e d v o l t a g e d e p e n d e n c y . T h e e f f e c t i v e v a l e n c e f o r i n t e r n a l C s + b l o c k w a s o n l y 0 . 0 7 , w h i l e e x t e r n a l l y a p p l i e d C s + b l o c k e d w i t h a n e f f e c t i v e v a l e n c e ô o f - 0 . 6 6 . T h i s t e n f o l d d i f f e r e n c e i n d i c a t e s t h a t t h e t w o s i t e s o f C s + b i n d i n g a r e n o t l o c a t e d a t e q u a l d e p t h s i n t h e m e m b r a n e f i e l d . A s i m i l a r r e s u l t w a s o b t a i n e d b y Y e l l e n 1 8 0 ( 1 9 8 4 a ) i n a s t u d y o f C s + b l o c k o f B K c h a n n e l s i n c h r o m a f f i n c e l l s . H o w e v e r . t h e v a l u e s o f 8 w e r e d i f f e r e n t ( 0 . 2 5 f o r i n t e r n a l b l o c k , - 1 . 0 f o r e x t e r n a l b l o c k ) . B e n h a m e t a l . ( 1 9 8 6 ) r e p o r t e d a v a l u e o f 8 = - 1 . 4 f o r e x t e r n a l b l o c k o f B K c h a n n e l s i n m e s e n t e r i c a r t e r y V S M C s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e l a r g e c o n d u c t a n c e K C a c h a n n e l s f o u n d i n t h e s e t h r e e p r e p a r a t i o n s e x h i b i t s o m e f i n e d i f f e r e n c e s w i t h r e s p e c t t o t h e i r i o n o p h o r e s t r u c t u r e s . 4 . 4 . 1 . 2 . C a2+ d e p e n d e n c e o f K ( C a ) L c h a n n e l o p e n i n g T h e o p e n p r o b a b i l i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s w a s s e n s i t i v e t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i o n s . A t a m e m b r a n e p o t e n t i a l o f V = + 4 0 m V , t h e K ( C a ) L c h a n n e l w a s o p e n f o r h a l f o f t h e t i m e a t [ C a2 + ] i = 2 3 M . A s c a n b e s e e n i n T a b l e I I , t h e c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f B K c h a n n e l s v a r i e s a p p r e c i a l l y a m o n g d i f f e r e n t c e l l t y p e s . B K c h a n n e l s i n c e r t a i n s e c r e t o r y c e l l s , i n c l u d i n g m o u s e p a r o t i d a c i n a r c e l l s a r e h i g h l y c a l c i u m - s e n s i t i v e , b e i n g o p e n 5 0 % o f t h e t i m e a t [ C a2 + ] i v a l u e s b e t w e e n 1 0 - 8 - 1 0 - 7 M ( V = 0 m V ) ( M a r u y a m a e t a l 1 9 8 3 ) . F o r B K c h a n n e l s f o u n d i n s k e l e t a l m u s c l e f i b r e s , t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e o f [ C a2 + ] i i s a r o u n d 5 j L M ( B a r r e t t e t a l . 1 9 8 2 ; M e t h f e s s e l a n d B o h e i m 1 9 8 2 ) , w h i l e f o r n o n v a s c u l a r a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , e s t i m a t e s i n t h e r a n g e 0 . 5 - 1 M h a v e b e e n r e p o r t e d ( C a r l e t a l . 1 9 9 0 ; B e i i h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e l o w a p p a r e n t c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l h a s i m p l i c a t i o n s f o r t h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s c h a n n e l , a s w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r i n t h i s t h e s i s . I n i h e p r e s e n t s t u d y , a s e c o n d p o w e r r e l a t i o n s h i p w a s f o u n d b e t w e e n t h e p r o b a b i l i t y o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l o p e n i n g a n d t h e v a l u e o f [ C a2 + J i , w h e n m e a s u r e d o v e r t h e r a n g e o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m l i k e l y t o p e r t a i n u n d e r 1 8 1 p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s . T h i s r e s u l t i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s c o n d u c t e d o n B K c h a n n e l s i n o t h e r t i s s u e s , w h i c h s u g g e s t t h a t 2 - 4 c a l c i u m i o n s a r e r e q u i r e d t o f u l l y a c t i v a t e e a c h c h a n n e l ( B a r r e t t e t a ! . 1 9 8 2 ; M e t h f e s s e l a n d B o h e i m 1 9 8 2 ; M o c z y d l o w s k i a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ) . O p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s f o r K ( C a ) L c h a n n e l s w e r e w e l l f i t t e d b y t h e s u m o f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s , w h e n i n v e s t i g a t e d f o r [ C a2 + ] i v a l u e s o v e r t h e r a n g e 1 0 - 8 - 1 0 - 3 M . I n c r e a s i n g [ C a2 + ] i h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e v a l u e o f t h e f a s t t i m e c o n s t a n t f i t t e d t o t h e s e d i s t r i b u t i o n s , w h i l e t h e s l o w t i m e c o n s t a n t w a s e l e v a t e d b y t h i s p r o c e d u r e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e r e p o r t e d i n t h e c a s e o f B K c h a n n e l s i n r a t s k e l e t a l m u s c l e ( B a r r e t t e t a ! . 1 9 8 2 ; M a g l e b y a n d P a l l o t t a 1 9 8 3 a ) . H o w e v e r , i n B K c h a n n e l s s t u d i e d i n s m o o t h m u s c l e c e l l s i s o l a t e d f r o m m e s e n t e r i c a r t e r y , o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s w e r e w e l l f i t b y a s i n g l e e x p o n e n t i a l t e r m a t l o w [ C a2 + f t ( < 1 0 - 6 M ) . O n r a i s i n g [ C a2 + ] j , a s e c o n d , f a s t f i t c o m p o n e n t a p p e a r e d i n t h e s e d i s t r i b u t i o n s , a n d t h e t i m e c o n s t a n t o f t h e o r i g i n a l c o m p o n e n t i n c r e a s e d ( B e r t h a m e t a ! . 1 9 8 6 ) . T h e p r e s e n t r e s u l t s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e f o l l o w i n g m i n i m u m s t a t e d i a g r a m f o r t h e g a t i n g o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l ( c l o s e d ) K 1 [ C a ] ( c l o s e d ) K 2 [ C a ] ( c l o s e d ) S < > S C a < > S C a 2 K 1 1 1 C 2 a ’ a S C a * S C a 2 * ( o p e n ) ( o p e n ) H e r e , m o s t o f t h e b r i e f c h a n n e l o p e n i n g s a r e t o t h e m o n o l i g a n d e d s t a t e S C a * , w h i l e t h e m a j o r i t y o f l o n g o p e n i n g s a r e t o s t a t e S C a 2 * , w i t h t w o c a l c i u m i o n s b o u n d p e r c h a n n e l . 1 8 2 T h i s m o d e l p r e d i c t s t h a t t h e r a t i o o f o p e n i n g s i n t h e f a s t f i t c o m p o n e n t s t o t h e n u m b e r i n t h e s l o w c o m p o n e n t s h o u l d f a l l a t h i g h e r [ C a2 + ] i , a s w a s s e e n e x p e r i m e n t a l l y . H o w e v e r , t h i s s c h e m e d o e s n o t a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d i n c r e a s e i n t h e t i m e c o n s t a n t o f t h e s l o w f i t c o m p o n e n t o n r a i s i n g [ C a2 + ] j . T h e r e a r e a n u m b e r o f p o s s i b l e m e c h a n i s m s w h i c h c o u l d p r o d u c e t h i s e f f e c t . F i r s t l y , s t a t e S C a 2 * c o u l d b i n d a f u r t h e r c a l c i u m i o n a n d m a k e a t r a n s i t i o n t o a f u r t h e r o p e n s t a t e , S C a 3 * , i n c r e a s i n g t h e o b s e r v e d o p e n t i m e o f t h e l o n g o p e n d i s t r i b u t i o n ( M a g l e b y a n d P a l l o t t a 1 9 8 3 b ) . H o w e v e r , t h i s w o u l d l i k e l y r e s u l t i n o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s r e q u i r i n g t h r e e e x p o n e n t i a l f i t c o m p o n e n t s , w h i c h w a s n o t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . N e i t h e r w a s t h e s l o p e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y v e r s u s [ C a2 + I i p l o t s t e e p e n o u g h t o i n d i c a t e t h r e e c a l c i u m i o n s w e r e n e e d e d t o f u l l y a c t i v a t e e a c h c h a n n e l . A l t e r n a t i v e l y , o n e m a y p o s t u l a t e t h e o c c u r r e n c e o f d i r e c t t r a n s i t i o n s b e t w e e n t h e o p e n s t a t e s S C a * a n d S C a 2 * , a c c o m p a n i e d b y t h e l o s s o r g a i n o f c a l c i u m i o n s a s r e q u i r e d . H o w e v e r , t h i s m o d e l p r e d i c t s t h a t t h e t i m e c o n s t a n t o f t h e f a s t f i t c o m p o n e n t s h o u l d d e c r e a s e a s [ C a2 + ] i i s r a i s e d . A t r e n d o f t h i s t y p e w a s s e e n i n t h e p r e s e n t d a t a , b u t t h i s d i d n o t r e a c h s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e . T h e i n c r e a s e i n t h e s l o w t i m e c o n s t a n t w i t h [ C a2+ ] j c o u l d a l s o r e s u l t f r o m t h e o c c u r r e n c e o f v e r y s h o r t l i v e d c l o s e d s t a t e s i n t e r p o s e d b e t w e e n s t a t e s S C a 2 a n d S C a 2 * . A t l e a s t o n e o f t h e t r a n s i t i o n s b e t w e e n t h e s e i n t e r p o s e d c l o s e d s t a t e s w o u l d h a v e t o b e d e p e n d e n t o n [ C a2 + J i , a n d t h e l i f e t i m e o f t h e s e s t a t e s w o u l d n e e d t o b e t o o b r i e f t o a l l o w d e t e c t i o n w i t h t h e p r e s e n t r e c o r d i n g s y s t e m . I n t h i s s c h e m e , c a l c i u m d r i v e n r e o p e n i n g s t o S C a 2 * f r o m t h e s e s h o r t l i v e d c l o s e d s t a t e s w o u l d l e a d t o a n a p p a r e n t i n c r e a s e i n t h e m a g n i t u d e o f t h e s l o w t i m e c o n s t a n t . F i n a l l y , a s l o w t i m e c o n s t a n t d e p e n d e n t o n [ C a2 + ] i c a n a l s o 1 8 3 b e g e n e r a t e d b y m o d e l E w h i c h p r o p o s e t h a t i n t r a c e l l u l a r C a2 + b o t h a c t i v a t e s a n d b l o c k s K C a c h a n n e l s ( M e t h f e s s e l a n d B o h e i m 1 9 8 2 ) . T h e p r e s e n t d a t a d o n o t a l l o w a c l e a r c h o i c e t o b e m a d e b e t w e e n t h i s m o d e l a n d t h a t o f t h e s h o r t - l i v e d c l o s e d s t a t e s . B K c h a n n e l s i n r a t s k e l e t a l m u s c l e h a v e b e e n o b s e r v e d o c c a s i o n a l l y t o e n t e r a l t e r n a t i v e m o d e s o f g a t i n g i n w h i c h o p e n p r o b a b i l i t i e s m a y b e v e r y d i f f e r e n t f r o m t h e n o r m a l c o n d i t i o n ( M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . W h e n l a r g e n u m b e r s o f t r a n s i t i o n s a r e a n a l y z e d ( > 3 0 , 0 0 0 ) , i t i s o b s e r v e d t h a t a b o u t 9 6 % o f t h e s e f a l l i n t o t h e n o r m a l g a t i n g m o d e , t h e r e m a i n d e r b e i n g d i s t r i b u t e d i n t h e s o - c a l l e d i n t e r m e d i a t e o p e n ( 3 . 2 % ) , b r i e f o p e n ( 0 . 5 % ) a n d b u z z m o d e s ( 0 . 1 % ) . T h e l a t e r t h r e e m o d e s r e a l l a s s o c i a t e d w i t h a m u c h b r i e f e r m e a n o p e n t i m e t h a n i s s e e n i n t h e n o r m a l g a t i n g m o d e . I n a d d i t i o n , a n a l y s i s o f l a r g e n u m b e r s o f t r a n s i t i o n s ( u p t o 1 0 6 ) i n t h e n o r m a l m o d e r e v e a l t h a t o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s i n t h i s m o d e c o n t a i n a t l e a s t t h r e e t o f o u r e x p o n e n t i a l c o m p o n e n t s , n o t t h e t w o d e t e c t e d i n e a r l i e r s t u d i e s ( M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s w e r e c a l c u l a t e d f o r u p t o 2 0 0 0 t r a n s i t i o n s , t h i s b e i n g l i m i t e d b y t h e l i f e t i m e o f e x c i s e d p a t c h e s , w h i c h r a r e l y e x c e e d e d 2 0 m i n u t e s . F o r t h e s e r e a s o n s , t h e p o s s i b i l i t y t h a t r a r e m o d e s o f g a t i n g a n d a d d i t i o n a l o p e n s t a t e s a l s o e x i s t f o r K ( C a ) L c h a n n e l s c a n n o t b e e x c l u d e d . 4 . 4 . 1 . 3 . V o l t a g e d e p e n d e n c e o f o p e n i n g o f K ( C a ) L c h a n n e l s T h e p r o b a b i l i t y o f o p e n i n g f o r K ( C a ) L c h a n n e l s i n c r e a s e d e - f o l d f o r a 1 4 m V m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n , w h e n [ C a2 + ] i w a s a t l o w l e v e l s . A s i m i l a r v o l t a g e d e p e n d e n c y ( e - f o l d f o r 1 1 - 1 6 m V c h a n g e ) h a s b e e n r e p o r t e d i n B K c h a n n e l s s t u d i e d i n r a t s k e l e t a l m u s c l e ( B a r r e t t e t a ! . 1 9 8 2 ; M e t h f e s s e l a n d 1 8 4 B o h e i m 1 9 8 2 ; B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 ) , r e n a l e p i t h e l i a l c e l l s ( K o l b e t a l . 1 9 8 6 ) a n d i n c h r o m a f f i n c e l l s ( M a r t y 1 9 8 1 ) , s e e T a b l e I I . B K c h a n n e l s i n a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l l s a n d i n t o a d s t o m a c h s m o o t h m u s c l e c e l l s s h o w a s t e e p e r v o l t a g e d e p e n d e n c y ( e - f o l d f o r 8 - 9 m V c h a n g e ( W o n g a n d A d l e r 1 9 8 6 ; L a n g a n d R i t c h i e 1 9 8 8 ; S i n g e r a n d W a l s h 1 9 8 7 ) . B K c h a n n e l s i n m e s e n t e r i c a r t e r y s m o o t h m u s c l e c e l l s e x h i b i t e d a l o w e r v o l t a g e d e p e n d e n c y t h a n s e e n i n K ( C a ) L c h a n n e l s ( e - f o l d f o r 3 0 m V c h a n g e ) ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . V o l t a g e c o u l d a l t e r c h a n n e l k i n e t i c s d i r e c t l y b y c h a n g i n g t h e r a t e c o n s t a n t s g o v e r n i n g s t a t e t r a n s i t i o n s , o r c o u l d a c t i n d i r e c t l y b y c h a n g i n g t h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o f C a2 + a t b i n d i n g s i t e s l o c a t e d p a r t w a y t h r o u g h t h e m e m b r a n e f i e l d ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ; B a r r e t t e t a l . 1 9 8 2 ) . U s i n g B K c h a n n e l s f r o m r a t s k e l e t a l m u s c l e i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a r l i p i d b i l a y e r s , M o c z y d l o s k i a n d L a t o r r e ( 1 9 8 3 ) f o u n d t h a t t h e v o l t a g e d e p e n d e n c y o f c h a n n e l o p e n i n g c o u l d b e e n t i r e l y a c c o u n t e d f o r b y t h e p o t e n t i a l - s e n s i t i v e b i n d i n g o f C a 2 + t o s i t e s i n t h e m e m b r a n e f i e l d . C a l c u l a t i o n s u g g e s t e d t h a t c a l c i i i m i o n s b i n d t o s i t e s w h i c h s e n s e 7 5 - 9 5 % o f t h e t o t a l m e m b r a n e f i e l d . S u c h s i t e s c o u l d b e l o c a t e d i n a w i d e , d e e p a t r i u m l e a d i n g t o t h e i o n i c s e l e c t i v i t y f i l t e r , o r c o u l d r e s i d e a t a p a r t o f t h e c h a n n e l n o t d i r e c t l y c o n n e c t e d w i t h i o n t r a n s l o c a t i o n . T h e r e i s e v i d e n c e w h i c h f a v o u r s t h e l a t t e r p o s s i b i l i t y , s i n c e C a2 + a c t i v a t i o n s i t e s a r e m o r e s e n s i t i v e t o m e m b r a n e s u r f a c e p o t e n t i a l t h a n i s t h e K + c o n d u c t i o n p r o c e s s i n t h e s e c h a n n e l s . T h u s , t h e a d d i t i o n o f n e g a t i v e l y c h a r g e d m e m b r a n e l i p i d s m a r k e d l y i n c r e a s e s t h e a p p a r e n t C a2 + s e n s i t i v i t y o f B K c h a n n e l g a t i n g w h i l e l i t t l e c h a n g e i s s e e n i n t h e p o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y o f t h e c h a n n e l ( M o c z y d l o w s k i e t a l . 1 9 8 5 ) . 1 8 5 I n t h e p r e s e n t s t u d y . m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n a t c o n s t a n t [ C a2 + ] i h a d n o e f f e c t o n t h e f a s t t i m e c o n s t a n t o f o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s , w h i l e i n c r e a s i n g t h e v a l u e o f t h e s l o w t i m e c o n s t a n t . M e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n t h e r e f o r e m i m i c k e d t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g [ C a2 + ] i a t a c o n s t a n t m e m b r a n e v o l t a g e . T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e v i e w t h a t t h e v o l t a g e d e p e n d e n c y o f K ( C a ) L c h a n n e l g a t i n g s i m p l y r e f l e c t s t h e p o t e n t i a l - d e p e n d e n t b i n d i n g o f C a2 + t o s i t e s o n t h e c h a n n e l c o m p l e x . 4 . 4 . 1 . 4 . B l o c k a d e o f K ( C a ) L c h a n n e l s b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A I n t e r n a l l y a p p l i e d T E A r e d u c e d t h e a p p a r e n t s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t i n K ( C a ) L c h a n n e l s w i t h a K d o f 0 . 8 3 m M a t + 4 0 m V m e m b r a n e p o t e n t i a l . A s s h o w n i n T a b l e I I , B K c h a n n e l s i n c h r o m a f f i n c e l l s ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ) , r a t s k e l e t a l m u s c l e ( B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 ) a n d r a b b i t t - t u b u l e c e l l s ( V e r g a r a a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ) s h o w a m u c h h i g h e r K d f o r i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A , v a l u e s b e i n g i n t h e r a n g e 2 7 - 6 0 m M . B K c h a n n e l s i n V S M C s f r o m r a b b i t p o r t a l v e i n w e r e u n a f f e c t e d b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A a t c o n c e n t r a t i o n s u p t o 1 0 m M ( I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ) . I n m a r k e d c o n t r a s t , B K c h a n n e l s i n c l o n a l a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l l s ( W o n g a n d A d l e r 1 9 8 6 a n d B K c h a n n e l s f r o m r a t b r a i n s y n a p t o s o m e s ( F a r l e y a n d R u d y 1 9 8 8 ) b o t h e x h i b i t v e r y h i g h s e n s i t i v i t y t o i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A , w i t h K d o f 0 . 0 8 m M a n d 0 . 8 m M r e s p e c t i v e l y . T h e h i g h s e n s i t i v i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s t o t h e b l o c k i n g e f f e c t o f i n t e r n a l T E A i s u n l i k e l y t o b e a n a r t i f a c t c a u s e d b y e n z y m e t r e a t m e n t o f C V S M C s , s i n c e s i m i l a r d i s s o c i a t i o n p r o c e d u r e s w e r e e m p l o y e d i n o t h e r s t u d i e s w h i c h d i d n o t e x h i b i t t h i s p h e n o m e n o n ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 5 ; I n o u e e t a ! . 1 9 8 5 ) . T h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e p r e s e n t d a t a r e s u l t e d f r o m i n a d v e r t e n t f o r m a t i o n o f o u t s i d e - o u t 1 8 6 m e m b r a n e p a t c h e s a l s o s e e m s u n l i k e l y , s i n c e t h e r e c o r d i n g p i p e t t e s c o n t a i n e d o n l y 0 . 0 1 M C a2 + , i n s u f f i c i e n t t o y i e l d t h e o b s e r v e d c h a n n e l o p e n p r o b a b i l i t y , i f a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . I n t h e c a s e o f t h e A - c u r r e n t K + c h a n n e l c o d e d b y t h e S h a k e r g e n e i n D r o s o p h i l a , a s i n g l e a m i n o a c i d r e s i d u e c r i t i c a l l y a f f e c t s t h e a f f i n i t y o f t h e c h a n n e l f o r i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A ( Y e l l e n e t a ! . 1 9 9 1 ) . T h i s r e s i d u e l i e s a t p o s i t i o n 4 4 1 i n t h e s o c a l l e d S S 1 - S S 2 r e g i o n o f t h e c h a n n e l , w h i c h i s h i g h l y c o n s e r v e d a m o n g v o l t a g e - g a t e d K + c h a n n e l s , a n d m a y c r o s s t h e m e m b r a n e t w i c e t o f o r m t h e i o n c o n d u c t i n g p o r e i t s e l f ( M a c K i n n o n a n d Y e l l e n 1 9 9 0 ) . W i l d t y p e f l i e s s h o w e d c h a n n e l s w i t h a t h r e o n i n e r e s i d u e a t p o s i t i o n 4 4 1 , a n d e x h i b i t e d a K d f o r i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A o f a b o u t 0 . 7 m M . T h e m u t a n t T 4 4 1 S p o s s e s s e d a s e r i n e r e s i d u e a t p o s i t i o n 4 4 1 a n d t h e K d f o r i n t e r n a l T E A i n c r e a s e d b y t e n f o l d a s a r e s u l t o f t h i s s i n g l e s u b s t i t u t i o n ( Y e l l e n e t a l . 1 9 9 1 ) . T h e s e n s i t i v i t y o f t h e c h a n n e l t o e x t e r n a l l y a p p l i e d T E A w a s u n a l t e r e d b y t h i s m u t a t i o n . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s w e r e n o t p e r f o r m e d o n g e n e c o d i n g f o r a K C a c h a n n e l , t h e y d o i l l u s t r a t e t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f T E A a f f i n i t y t o c h a n g e s i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f p o t a s s i u m c h a n n e l s . I t m a y b e r e l e v a n t t o n o t e t h a t a l l t h r e e o f t h e c e l l t y p e s w h i c h e x h i b i t B K c h a n n e l s w i t h h i g h i n t e r n a l s e n s i t i v i t y t o T E A a r e d e r i v e d f r o m b r a i n t i s s u e , s u g g e s t i n g t h a t a s l i g h t l y d i f f e r e n t f o r m o f t h e B K c h a n n e l m a y b e e x p r e s s e d i n t h i s o r g a n . T h e p r e s e n t d a t a o n T E A b l o c k w e r e t r a n s f o r m e d i n t o a H i l l p l o t b y r e p l o t t i n g a s l o g ( R / 1 - R ) v e r s u s l o g [ T E A ] , w h e r e R i s t h e r e d u c t i o n i n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s s e e n i n t h e p r e s e n c e o f t h e d r u g . T h i s p l o t y i e l d e d a s l o p e o f 0 . 8 2 , s u g g e s t i n g t h a t T E A i n t e r a c t s w i t h t h e c h a n n e l i n a o n e - t o - o n e f a s h i o n , p r e s u m a b l y b y t r a n s i e n t l y e n t e r i n g t h e c h a n n e l a n d b l o c k i n g m o v e m e n t o f K + . 1 8 7 A n a p p r o x i m a t e v a l u e f o r t h e d w e l l t i m e o f T E A a t i t s b l o c k i n g s i t e c a n b e d e r i v e d f r o m t h e K d f o r T E A , w h e r e K d = K - i / K i ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 5 ) . T h e m a x i m u m v a l u e f o . t h e b l o c k i n g r a t e c o n s t a n t , K ] . i s l i m i t e d b y t h e d r u g d i f f u s i o n r a t e a n d i s t h o u g h t t o b e a b o u t 1 0 8 s - i M - i ( G u t f r e u n d 1 9 7 2 ) . T h u s K - 1 m a y b e e s t i m a t e d a t 8 . 3 x 1 0 4 s - i a n d h e n c e t h e m e a n b l o c k t i m e w a s a b o u t 1 2 s , o n e o r d e r o f m a g n i t u d e t o o b r i e f t o b e d e t e c t e d b y t h e p r e s e n t m e a s u r i n g s y s t e m . T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t T E A b l o c k w a s n o t a c c o m p a n i e d b y a m a r k e d i n c r e a s e i n c u r r e n t n o i s e i n t h e c h a n n e l , a s s t u d i e d a t a b a n d w i d t h o f D C - 2 k H z . T h e b l o c k o f K C a c h a n n e l s b y i n t e r n a l T E A m a y b e e x p e c t e d t o b e v o l t a g e - d e p e n d e n t , s i n c e p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s f a v o u r t h e e n t r y o f t h e T E A c a t i o n i n t o t h e c h a n n e l s . H o w e v e r , t h e d e g r e e o f v o l t a g e - d e p e n d e n c y i s g o v e r n e d b y t h e f r a c t i o ’ i o f t h e m e m b r a n e f i e l d s e n s e d b y t h e T E A m o l e c u l e a t i t s b i n d i n g s i t e ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ) . E x p e r i m e n t s p e r f o r m e d o n B K c h a n n e l s i n s e v e r a l c e l l t y p e s h a v e i n d i c a t e d t h a t b l o c k b y i n t e r n a l T E A i s o n l y w e a k l y v o l t a g e - d e p e n d e n t , e x h i b i t i n g a n e q u i v a l e n t v a l e n c e o f 0 . 0 6 - 0 . 1 ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ; L a n g t o n e t a ! . 1 9 9 1 ; Y e l l e n e t a l . 1 9 9 1 ) . T h e t h e o r e t i c a l m a x i m u m v a l u e o f t h e e q u i v a l e n t v a l e n c e f o r a m o n o v a l e n t b l o c k i n g i o n i n t e r a c t i n g i n a 1 : 1 f a s h i o n w i t h t h e c h a n n e l i s 1 . 0 ( B e n h a m e t a l . 1 9 8 6 ) . T h i s c o r r e s p o n d s t o a n e - f o l d i n c r e a s e i n a f f i n i t y f o r a 2 5 m V d e p o l a r i z a t i o n ( Y e l l e n e t a l . 1 9 8 4 a ) . L e t i t b e a s s u m e d t h e p r e s e n t K C a c h a n n e l s p o s s e s s a T E A a f f i n i t y a t 0 m V m e m b r a n e p o t e n t i a l t y p i c a l o f B K c h a n n e l s s t u d i e d i n s k e l e t a l m u s c l e , i . e . K d ( 0 m V ) = 3 0 m M . I f m e a s u r e d a t + 4 0 m M , t h e K d s h o u l d s t i l l b e g r e a t e r t h a n 4 m M , e v e n o f t h e e q u i v a l e n t v a l e n c e o f T E A i s a s s u m e d t o b e 1 . 0 . I t s e e m s u n l i k e l y , t h e r e f o r e , 1 8 8 t h a t t h e h i g h s e n s i t i v i t y o f K ( C a ) L c h a n n e l s t o i n t e r n a l T E A i s d u e s o l e l y t o a v e r y s t e e p v o l t a g e d e p e n d e n c y o f c h a n n e l b l o c k . 4 . 4 . 2 . P r o p e r t i e s o f K ( C a ) I c h a n n e l s I n a d d i t i o n t o t h e K ( C a ) L c h a n n e l , a K C a c h a n n e l o f i n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e ( 1 K c h a n n e l ) w a s d e t e c t e d i n t h e m i n o r i t y o f i n s i d e - o u t p a t c h e s e x c i s e d f r o m i s o l a t e d C V S M C s . T h i s K ( C a ) I c h a n n e l s h o w e d a s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e o f 9 2 p S a n d w a s h i g h l y s e l e c t i v e f o r K + o v e r N a + a n d C s + . T h i s c h a n n e l w a s a c t i v a t e d b y i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m a n d b y m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n . A p p l i c a t i o n o f T E A t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e r e d u c e d t h e c u r r e n t i n t h i s c h a n n e l i n a d o s e - d e p e n d e n t f a s h i o n w i t h a K d o f 0 . 3 1 m M . T h e s e d a t a w e r e r e p l o t t e d a s a H i l l p l o t , l o g ( R / 1 - R ) v e r s u s l o g [ T E A ] w h e r e R i s t h e r e d u c t i o n i n m e a n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t c a u s e d b y a g i v e n c o n c e n t r a t i o n o f T E A . T h e s l o p e o f t h i s p l o t w a s 0 . 7 0 , s u g g e s t i n g t h a t T E A b l o c k s t h i s c h a n n e l i n a o n e - t o - o n e f a s h i o n , a s s e e n f o r t h e K ( C a ) L c h a n n e l . N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e K d v a l u e s f o u n d f o r b l o c k o f t h e K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s b y i n t e r n a l T E A . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s e c h a n n e l s s h a r e a c o m m o n s t r u c t u r e i n t h e r e g i o n o f t h e T E A b i n d i n g s i t e . I t s e e m s u n l i k e l y , h o w e v e r , t h a t t h e K ( C a ) I c h a n n e l s i m p l y r e p r e s e n t s a c o n d u c t a n c e s u b s t a t e o f t h e K ( C a ) L c h a n n e l , s i n c e a m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s f o r c u r r e n t f l o w i n b o t h s p e c i e s w e r e w e l l f i t t e d b y s i n g l e G a u s s i a n t e r m s . K C a c h a n n e l s o f i n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e ( 3 0 - 1 2 0 p S ) h a v e p r e v i o u s l y b e e n d e t e c t e d i n a w i d e v a r i e t y o f c e l l t y p e s ( L a t o r r e e t a l . 1 9 8 9 ; E d w a r d s a n d W e s t o n 1 9 9 0 ; K o i b 1 9 9 0 ) . 1 K c h a n n e l s o f c o n d u c t a n c e 9 0 - 1 0 0 p S h a v e b e e n r e p o r t e d i n V S M C s i s o l a t e d f r o m r a b b i t p o r t a l v e i n ( I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ) a n d f r o m 1 8 9 h u m a n c y s t i c a r t e r y ( A k b a r a l i e t a l 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , t h e 1 K c h a n n e l r e p o r t e d i n r a b b i t p o r t a l v e i n i s u n a f f e c t e d b y T E A a p p l i e d t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e , i n m a r k e d c o n t r a s t t o t h e p r e s e n t r e s u l t s ( I n o u e e t a l . 1 9 8 5 ) . A n 1 K c h a n n e l h a s b e e n r e p o r t e d i n a o r t i c s m o o t h m u s c l e o f t h e r a t , b u t t h i s c h a n n e l s h o w s a c o n d u c t a n c e o f o n l y 5 5 p S , a p p r e c i a b l y l o w e r t h a n t h a t o f t h e K ( C a ) I c h a n n e l ( S h o e m a k e r a n d W o r r e l l 1 9 9 1 ) . T w o t y p e s o f 1 K c h a n n e l h a v e b e e n o b s e r v e d f o l l o w i n g i n c o r p o r a t i o n o f r a t b r a i n s y n a p t o s o m a l p r o t e i n s i n t o l i p i d b i l a y e r s ( F a r l e y a n d R u d y 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , b o t h o f t h e s e c h a n n e l s a r e l i t t l e a f f e c t e d b y a p p l i c a t i o n 1 0 m M T E A t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e . 4 . 4 . 3 . P h y s i o l o g i c a l r o l e s f o r K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s T h e l o w a p p a r e n t c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f t h e K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s w o u l d s e e m t o p r e c l u d e a s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n o f t h e s e c h a n n e l t o r e s t i n g p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e , s i n c e [ C a2 + ] j i n u n s t i m u l a t e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e h a s b e e n e s t i m a t e d a s 4 0 - 1 3 0 n M ( N a b i k a e t a l . 1 9 8 5 ; T a k a t a e t a ! . 1 9 8 8 ; K u r i y a m a e t a ! . 1 9 8 2 ; p r e s e n t s t u d y ) . H o w e v e r , d u r i n g t h e f u l l y c o n t r a c t e d s t a t e , v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s m a y s h o w [ C a2 + 1 1 v a l u e s a p p r o a c h i n g 1 0 M ( K u r i y a m a e t a ! . 1 9 8 2 ) . M i c r o m o l a r l e v e l s o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c a n a l s o b e a t t a i n e d d u r i n g t h e a c t i o n o f c e r t a i n v a s o c o n s t r i c t o r h o r m o n e s , i n c l u d i n g a n g i o t e n s i n I I ( C a p p o n i e t a l . 1 9 8 6 ) . [ C a2 + I i l e v e l s i n t h e l o w m i c r o m o l a r r a n g e w o u l d s u f f i c e t o a c t i v a t e a f e w p e r c e n t o f t h e a v a i l a b l e K ( C a ) L c h a n n e l s a t d e p o l a r i z e d m e m b r a n e p o t e n t i a l s . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e o p e n i n g o f e v e n a s m a l l f r a c t i o n o f t h e a v a i l a b l e K ( C a ) L c h a n n e l s w o u l d m a r k e d l y r e d u c e t h e i n p u t r e s i s t a n c e o f a 3 G O c e l l , a s w e l l a s p r o v i d i n g a s t r o n g h y p e r p o l a r i z i n g i n f l u e n c e o n m e m b r a n e p o t e n t i a l . I n a d d i t i o n , i t i s p o s s i b l e t h a t l o c a l l y v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f [ C a2 + ] i a r e e s t a b l i s h e d n e a r t h e i n n e r f a c e o f v o l t a g e - s e n s i t i v e 1 9 0 C a2 + c h a n n e l s . I f K C a c h a n n e l s w e r e l o c a t e d c l o s e t o t h e s e s i t e s , t h e i r c o n t r i b u t i o n t o m e m b r a n e r e p o l a r i z a t i o n d u r i n g t h e a c t i o n p o t e n t i a l c o u l d b e g r e a t l y e n h a n c e d ( B e n h a m e t a ! . 1 9 8 6 ) . T h e c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f K ( C a ) L a n d K ( C a ) I c h a n n e l s m a y a l s o b e e n h a n c e d i n v i v o , b y t h e p r e s e n c e o f i n t r a c e l l u l a r m o d u l a t o r s s u c h a s M g2 + ( S q u i r e a n d P e t e r s e n 1 9 8 7 ) . F o r t h e s e r e a s o n s , i t s e e m s p r o b a b l e t h e K ( C a ) L , a n d p o s s i b l y a l s o K ( C a ) I c h a n n e l s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l i n C V S M C s . T h e a c t i o n p o t e n t i a l i n C V S M C s o f i n t a c t r a t b a s i l a r a r t e r i e s h a s b e e n s t u d i e d f o l l o w i n g p a r t i a l b l o c k a d e o f p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e s b y e x t e r n a l l y a p p l i e d T E A ( H i r s t e t a ! . 1 9 8 6 ) . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e s p i k e c o n s i s t s o f a r a p i d d e p o l a r i z a t i o n o f a b o u t 5 6 m V a m p l i t u d e f o l l o w e d b y a f a s t r e p o l a r i z a t i o n . T h i s i s f o l l o w e d b y a n a f t e r - d e p o l a r i z a t i o n o f a b o u t 1 3 m V , l a s t i n g 3 0 0 - 1 0 0 0 m s . I n m o s t c e l l s , a s l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n o f a f e w m i l l i v o l t s i s s e e n a t t h e e n d o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l . B o t h t h e i n i t i a l s p i k e d e p o l a r i z a t i o n a n d t h e a f t e r - d e p o l a r i z a t i o n r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f C a2+ i n t h e b a t h i n g m e d i u m , w h i l e t h e s l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n p r o b a b l y r e f l e c t s a n i n c r e a s e i n K + c o n d u c t a n c e . T h e l a t t e r p o t e n t i a l i s a l s o a b o l i s h e d b y r e m o v a l o f C a2+ f r o m t h e b a t h i n g m e d i u m , s u g g e s t i n g t h a t i t i s p r o b a b l y m e d i a t e d b y a K C a c o n d u c t a n c e . T h i s c o n d u c t a n c e a p p a r e n t l y s e r v e s t o t e r m i n a t e t h e a f t e r - d e p o l a r i z a t i o n , w h i c h p r o b a b l y r e f l e c t s t h e e n t r y o f c a l c i u m t h r o u g h n o n - i n a c t i v a t i n g C a2+ c h a n n e l s . T h e m a j o r i t y o f c a l c i u m e n t r y i n t o t h e f i b r e t a k e s p l a c e d u r i n g t h i s a f t e r d e p o l a r i z a t i o n p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l ( H i r s t e t a l . 1 9 8 6 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t K C a c h a n n e l s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f a c t i o n p o t e n t i a l d u r a t i o n a n d o f c a l c i u m e n t r y i n t o c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . 1 9 1 4 . 5 C o n c l u s i o n s a n d s i g n i f i c a n c e A t l e a s t 5 0 % o f n e u r o l o g i c a l p a t i e n t s e x h i b i t s i g n s o f c e r e b r o v a s u l a r d i s e a s e , o f t e n i n c l u d i n g t h e m a j o r c a t e g o r i e s o f s t r o k e , a n e u r y s m , m i g r a i n e o r t r a n s i e n t i s c h e m i c a t t a c k ( A d a m s a n d V i c t o r 1 9 8 5 ) . I n t h e h y p e r t e n s i o n o f t e n a s s o c i a t e d w i t h s t r o k e , a n u m b e r o f a b n o r m a l i t i e s h a v e b e e n d e t e c t e d i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e , i n c l u d i n g i n c r e a s e d m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y , a l t e r e d m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d e l e c t r o g e n i c p u m p a c t i v i t y , a n d a n i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o v a s o c o n s t r i c t o r s , i n c l u d i n g s e r o t o n i n ( W e b b a n d B o h r 1 9 8 4 ; B o h r a n d W e b b 1 9 8 8 ; M i c h e l e t a l . 1 9 9 0 ) . S i m i l a r c h a n g e s h a v e b e e n f o u n d t o o c c u r i n a t h e r o m a a n d d u r i n g t h e n o r m a l a g i n g p r o c e s s ( M i c h e l e t a l . 1 9 9 0 ; M i c h e l 1 9 8 7 ) . A t h e r o s c l e r o t i c d a m a g e t o t h e e n d o t h e l i a l l a y e r o f c e r e b r a l v e s s e l s p r o b a b l y e x a c e r b a t e s h y p e r s e n s i t i v i t y o f s m o o t h m u s c l e t o s e r o t o n i n . T h i s i s b e c a u s e t h e e n d o t h e l i u m n o r m a l l y p r o d u c e s E D R F , w h i c h m e d i a t e s e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t v a s o d i l a t i o n ( B u r n s t o c k , 1 9 9 0 ) a n d p r o s t a c y c l i n , w h i c h i n h i b i t s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( M o n c a d a e t a l . 1 9 7 6 ) . E n d o t h e l i a l c e l l s a l s o c o n t r i b u t e t o t h e d e g r e i a t i o n o f s e r o t o n i n b y m o n o a m i n e o x i d a s e ( P e a c h e t a l . 1 9 8 5 ) . T h e e n h a n c e d r e s p o n s i v e n e s s o f V S M C s t o s e r o t o n i n m a y c o n t r i b u t e t o a r t e r i a l s p a s m i n v i v o ( B e a m i s h e t a l . 1 9 8 4 ) . C e r e b r a l v a s o s p a s m d e v e l o p s i n m o s t p a t i e n t s f o l l o w i n g r u p t u r e o f a n i n t r a c r a n i a l a n e u r y s m . T h i s p h e n o m e n o n i s o f g r e a t c l i n i c a l i m p o r t a n c e , s i n c e t h e r e s u l t i n g i s c h e m i a c a n g r e a t l y c o m p o u n d t h e n e u r o l o g i c a l d a m a g e d o n e b y t h e i n i t i a l h e m o r r h a g e , a n d m a y p r o v e f a t a l ( S t e e l e e t a l . 1 9 9 1 ) . I n a n a n i m a l m o d e l o f c e r e b r a l v a s o s p a s m , e v i d e n c e h a s b e e n f o u n d f o r d e p o l a r i z a t i o n a n d i n c r e a s e d a c t i o n p o t e n t i a l a c t i v i t y i n V S M C s o f t h e b a s i l a r a r t e r y . T h e s e 1 9 2 c h a n g e s a p p e a r e d t o r e s u l t f r o m d e c r e a s e d p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e i n t h e c e l l s . T h e o b s e r v e d v a s o s p a s m c o u l d b e p a r t i a l l y s u p r e s s e d b y a p p l i c a t i o n o f t h e p o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r n i c o r a n d i l ( W a t e r s a n d H a r d e r 1 9 8 5 ; H a r d e r e t a l . 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g v a s o d i l a t i o n b y p o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r s r e m a i n s a s u b j e c t t o c o n t r o v e r s y . C r o m a k a l i m h a s b e e n c l a i m e d t o a c t i v a t e K C a c h a n n e l s i n V S M C s i s o l a t e d f r o m r a b b i t a o r t a ( K r e y e e t a ! . 1 9 8 7 ) a n d f r o m g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y ( N a k a o e t a ! . 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , S t a n d e n e t a ! . ( 1 9 8 9 ) a t t r i b u t e d t h e v a s o d i l a t o r y a c t i o n o f c r o m a k a l i m o n t h e l a t t e r p r e p a r a t i o n t o a c t i v a t i o n o f K A T p c h a n n e l s . T h e r e l a x a t i o n o f i n t a c t d o g c e r e b r a l a r t e r i e s b y c r o m a k a l i m h a s a l s o b e e n a t t r i b u t e d t o a c t i v a t i o n o f K A T p , r a t h e r t h a n t o K C a c h a n n e l s ( M a s u z a w a e t a l . 1 9 9 0 ) . I n v i e w o f t h e g r e a t c l i n i c a l i m p o r t a n c e o f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e , a n d o f t h e u r g e n t n e e d f o r r a t i o n a l a n d e f f e c t i v e m e a n s o f p r e v e n t i n g a r t e r i a l s p a s m , i t i s i m p e r a t i v e t h a t t h e p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e s o f C V S M C s b e w e l l u n d e r s t o o d . T h e p r e s e n t s t u d y h a s c o n t r i b u t e d t o t h i s g o a l b y d e v e l o p i n g a p r e p a r a t i o n i n w h i c h t o s t u d y t h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f K C a c h a n n e l s i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . T h e m o d u l a t i o n o f t h e s e c h a n n e l s b y c l i n i c a l l y i m p o r t a n t d r u g s a n d b y p h y s i o l o g i c a l s t i m u l i c a n a l s o b e s t u d i e d i n t h e p r e s e n t i n v i t r o p r e p a r a t i o n . 1 9 3 R E F E R E N C E S A d a m s , P . R . , C o n s t a n t i , A . , B r o w n , D . A . a n d C l a r k , R . B . ( 1 9 8 2 ) . I n t r a c e l l u l a r C a2+ a c t i v a t e s a f a s t v o l t a g e - s e n s i t i v e K + c o n d u c t a n c e i n v e r t e b r a t e s y m p a t h e t i c n e u r o n e s . N a t u r e , 2 9 6 : 7 4 6 - 7 4 9 . A d a m s , R . D . a n d V i c t o r , M . ( 1 9 8 5 ) . P r i n c i p l e s o f N e u r o l o g y . M c g r a w - H i l l , N e w Y o r k . A d e i s t e i n , R . S . a n d S e l l e r s , J . R . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f c a l c i u m o n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n . A m . 3 . C a r d i o l . 5 9 : 4 B - 1 O B . A d r i a n , R . H . ( 1 9 6 9 ) . R e c t i f i c a t i o n i n m u s c l e m e m b r a n e . P r o g . B i o p h y s . M o l e c . B i o l . 1 9 : 3 4 0 - 3 9 6 . A k b a r a l i , H . , N a k a j a m a , T . , W y s e , D . G . a n d G i l e s , W . ( 1 9 9 0 ) . C a2+ - a c t i v a t e d K + c u r r e n t s i n s m o o t h m u s c l e . C a n a d i a n J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 6 8 : 1 4 8 9 - 1 4 9 4 . A r m s t r o n g , C . M . ( 1 9 7 1 ) . I n t e r a c t i o n o f t e t r a e t h y l a m m o n i u m i o n d e r i v a t i v e s w i t h t h e p o t a s s i u m c h a n n e l s o f g i a n t a x o n s . J . G e n . P h y s i o l . 5 8 : 4 1 3 - 4 3 7 . A s h i d a , T . , S c h a e f f e r , J . , G o l d m a n , W . F . , W a d e , J . B . , a n d B l a u s t e i n , M . P . ( 1 9 8 8 ) . R o l e o f s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m i n a r t e r i a l c o n t r a c t i o n : C o m p a r i s o n o f r y a n o d i n e ’ s e f f e c t i n a c o n d u i t a n d a m u s c u l a r a r t e r y . C i r c . R e s . 6 2 : 8 5 4 - 8 6 3 . A v e n e t , P . , H o f m a r m , F . a n d L i n d e m a n n , B . ( 1 9 8 7 ) . C l o s u r e o f K - c h a n n e l s b y c A M P - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n i n i s o l a t e d t a s t e r e c e p t o r c e l l s f r o m t h e f r o g t o n g u e . P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : R 3 5 . B a n k s , B . E . C . , B r o w n , C . , B u r g e s s , G . M . , B u r n s t o c k , G . , C l a r e t , M . , C o c k s , T . a n d J e n k i n s o n , D . H . ( 1 9 7 9 ) . A p a m i n b l o c k s c e r t a i n n e u r o t r a n s m i t t e r - i n d u c e d i n c r e a s e s i n p o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y . N a t u r e 2 8 2 : 4 1 5 - 4 1 7 . B a r a b a n , 3 . M . S n y d e r , S . H . a n d A l g e r , B . E . ( 1 9 8 5 ) . P h o r b o l e s t e r e f f e c t s o n n e u r o t r a n s m i s s i o n : i n t e r a c t i o n w i t h n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d c a l c i u m i n s m o o t h m u s c l e . P r o c . N a t n . A c a d . S c i . U . S . A . 8 2 : 2 5 3 8 - 2 5 4 2 . B a r r e t t , E . F . a n d B a r r e t t , ‘ . N . ( 1 9 7 6 ) . S e p a r a t i o n o f t w o v o l t a g e - s e n s i t i v e p o t a s s i u m c u r r e n t s a n d d e m o n s t r a t i o n o f t e t r o d o t o x i n - r e s i s t a n t c a l c i u m c u r r e n t i n f r o g m o t o n e u r o n s . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 5 5 : 7 3 7 - 7 7 4 . B a r r e t t , J . N . , B a r r e t t , E . F . a n d D r i b i n . L . B . ( 1 9 8 1 ) . C a l c i u m - d e p e n d e n t s l o w p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e i n r a t s k e l e t a l m y o t u b e s . D e v . B i o l . 8 2 : 2 5 8 - 2 6 6 . B a r r e t t , J . N . , M a g l e b y , K . L . , P a l l o t t a , B . S . ( 1 9 8 2 ) . P r o p e r t i e s o f s i n g l e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t m u s c l e . J P h y s i o l . ( L o n d ) 3 3 1 : 2 1 1 - 2 3 0 . B e a m i s h , R . E . , K a r m z y n , M . , P a n a c i a . V . a n d D h a l i a N . 5 . ( 1 9 8 4 ) . M e c h a n i s m s o f c o r o n a r y s p a s m i n s t r e s s - i n d u c e d h e a r t d i s e a s e , i n S m o o t h M u s c l e C o n t r a c t i o n . e d . S t e p h e n s , N . L . M a r c e l D e k k e r I n c . N e w Y o r k a n d B a s e l . p 5 Y 7 - S S O 1 9 4 B e n h a m , C . D . a n d B o l t o n , T . B . ( 1 9 8 3 ) . P a t c h - c l a m p s t u d i e s o f s l o w p o t e n t i a l - s e n s i t i v e p o t a s s i u m c h a n n e l s i n l o n g i t u d i n a l s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i t j e j u n u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 4 0 : 4 6 9 - 4 8 6 . B e n h a m , C . D . , B o l t o n , T . B . a n d L a n g , R . J . ( 1 9 8 4 ) M e m b r a n e p o t e n t i a l a n d v o l t a g e c l a m p r e c o r d i n g f r o m s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i t j e j u n u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 3 : 6 7 P . B e n h a m , C . D . , B o l t o n , T . B . , D e n b i g h , J . S . a n d L a n g , R . J . ( 1 9 8 7 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n i n f r e s h l y i s o l a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e r a b b i t j e j u n u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 8 3 : 4 6 1 - 4 7 6 . B e n h a m , C . D . , B o l t o n , T . B . , L a n g , K . J . , T a k e w a k i , T . ( 1 9 8 5 ) . T h e m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f B a2 + a n d T E A o n s i n g l e C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s i n a r t e r i a l a n d i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e c e l l m e m b r a n e . P f l u g e r s A r c h . 4 3 0 ; 1 2 0 - 1 2 7 . B e n h a m , C . D . , B o l t o n , T . B . , L a n g , R . J . a n d T a k e w a k i , T . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i t j e j u n u m a n d g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 7 1 : 4 5 - 6 7 . B e r g e r , W . , G r y g o r c y k , R . , S c h w a r z , W . ( 1 9 8 4 ) . S i n g l e K + c h a n n e l s i n m e m b r a n e e v a g i n a t i o n s o f s m o o t h m u s c l e c e l l s . P f l u g e r s A r c h . 4 0 2 : 1 8 - 2 3 . B e r k , B . C . a n d A l e x a n d e r , R . W . ( 1 9 9 0 ) . V a s o a c t i v e e f f e c t s o f g r o w t h f a c t o r s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 8 : 2 1 9 - 2 2 5 . B e r r i d g e , M . T . a n d I r v i n e , R . F . ( 1 9 8 9 ) . I n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d c e l l s i g n a l l i n g . N a t u r e 3 4 1 : 1 9 7 - 2 0 5 . B e z a n i l l a , F . , D i P l o l , P . R . , C a p u t o , C . , R o j a s , H . a n d T o r r e s , M . E . ( 1 9 8 5 ) . K c u r r e n t i n s q u i d a x o n i s m o d u l a t e d b y A T P . B i o p h y s . J . 4 7 : 2 2 2 a . B l a t z , A . L . a n d M a g l e b y , K . L . ( 1 9 8 6 ) . S i n g l e a p a m i n - b l o c k e d C a - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s o f s m a l l c o n d u c t a n c e i n c u l t u r e d r a t s k e l e t a l m u s c l e . N a t u r e 3 2 3 : 7 1 8 - 7 2 0 . B l a t z , A . L . , M a g l e b y , K . L . ( 1 9 8 4 ) . I o n c o n d u c t a n c e a n d s e l e c t i v i t y o f s i n g l e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t m u s c l e . J . G e n . P h y s i o l . 8 4 : 1 - 2 3 . B o h r , F D . a n d W e b b , C . ( 1 9 8 8 ) . V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e m e m b r a n e i n h y p e r t e n s i o n . A n n u . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 2 8 : 3 8 9 - 3 0 9 . B o l t o n , T . ( 1 9 7 9 ) . M e c h a n i s m s o f a c t i o n o f t r a n s m i t t e r s a n d o t h e r s u b s t a n c e s o n s m o o t h m u s c l e . P h y s i o l . R e v . 5 9 : 6 0 6 - 7 1 8 . B o l t o n , T . B . ( 1 9 7 2 ) . T h e d ’ p o l a r i z i n g a c t i o n o f a c e t y i c h o l i n e o f c a r b a c h o l i n i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 2 0 : 6 4 7 - 6 7 1 . B o l t o n , T . B . , L a n g , R . J . a n d T a k e w a k i , T . ( 1 9 8 4 ) . M e c h a n i s m s o f a c t i o n o f n o r a d r e n a l i n e a n d c a r b a c h o l o n s m o o t h m u s c l e o f g u i n e a - p i g a n t e r i o r m e s e n t e r i c a r t e r y . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 1 : 5 4 9 - 5 7 2 . 1 9 5 B o l t o n , T . B . , L a n g , R . J . , T a k e w a k i , T . a n d B e n h a m , C . D . ( 1 9 8 5 ) . P a t c h a n d w h o l e - c e l l v o l t a g e c l a m p o f s i n g l e m a m m a l i a n v i s c e r a l a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . E x p e r i e n t i a 4 1 : 8 8 7 - 8 9 4 . B o l t o n , T . B . , L a n g , R . J . , T a k e w a k i , T . a n d B e n h a m , C . D . ( 1 9 8 6 ) . P a t c h a n d w h o l e - c e l l v o l t a g e - c l a m p s t u d i e s o n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s . J . C a r d i o v a s c u l a r . P h a r . 8 ( S u p p l . 8 ) : S 2 0 - S 2 4 . B o n d , M . ( 1 9 8 8 ) . E l e v a t e d c e l l u l a r c a l c i u m i n d i s e a s e s t a t e s : c a u s e o r e f f e c t ? C e l l C a l c i u m 9 : 2 0 1 - 2 0 3 . B r a d l e y , P . B . , H u m p h r e y , P . P . A . , a n d W i l l i a m s , R . H . ( 1 9 8 6 ) . E v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e r e c e p t o r s , w h i c h a r e n o t o f t h e 5 - H T 2 t y p e , m e d i a t i n g t h e c o n t r a c t i o n o f r a b b i t i s o l a t e d b a s i l a r a r t e r y . B r . J . P h a r m a c o l . 8 7 : 3 - 4 . B r a y d e n , J . E . , Q u a y l e , J . M . , S t a n d e n , N . B . a n d N e l s o n M . T . ( 1 9 9 1 ) . R o l e o f p o t a s s i u m c h a n n e l s i n t h e v a s c u l a r r e s p o n s e o f e n d o g e n o u s a n d p h a r m a c o l o g i c a l v a s o d i l a t o r s . B l o o d V e s s e l s 2 8 : 1 4 7 - 1 5 3 . B r i s m a r , T . a n d C o l l i n s , V . P . ( 1 9 8 9 ) . I n w a r d r e c t i f y i n g p o t a s s i u m c h a n n e l s i n h u m a n m a l i g n a n t g l i o m a c e l l s . B r a i n R e s . 4 8 0 : 2 4 9 - 2 5 8 . B r o w n , D . A . ( 1 9 8 8 ) . M - c u r r e n t s : a n u p d a t e . T r e n d s N e u r o s c i . 1 1 : 2 9 4 - 2 9 9 . B r o w n , D . A . a n d A d a m s , P . R . ( 1 9 8 0 ) . M u s c a r i n i c s u p p r e s s i o n o f a n o v e l v o l t a g e - s e n s i t i v e K + - c u r r e n t i n a v e r t e b r a t e n e u r o n e . N a t u r e 2 8 3 - 6 7 3 - 6 7 6 . B r u s c h i , G . , B r u s c h i , M . E . , R e g o l i s t i , G . a n d B o r g h e t t e , A . ( 1 9 8 8 ) . M y o p l a s m i c C a2+ - f o r c e r e l a t i o n s h i p s s t u d i e d w i t h f u r a - 2 d u r i n g s t i m u l a t i o n o f r a t a o r t i c s m o o t h m u s c l e . A m . J . P h y i o l . 2 4 5 : H 8 4 0 - H 8 5 4 . B r y a n t , H . J . , H a r d e r , D . R . , P a m n a n i , M . B . a n d H a d d y , F . J . ( 1 9 8 5 ) . I n v i v o m e m b r a n e p o t e n t i a l s o f s m o o t h m u s c l e c e l l s i n t h e c a u d a l a r t e r y o f t h e r a t . A m . J . P h y s i o l . 2 4 9 : C 7 8 - C 8 3 . B u l b r i n g , E . a n d T o m i t a , T . ( 1 9 6 9 ) . I n c r e a s e o f m e m b r a n e c o n d u c t a n c e b y a d r e n a l i n e i n t h e s m o o t h m u s c l e o f g u i n e a - p i g t a e n i a c o l i . P r o c . R . S o c . L o n d . B , 1 7 2 : 8 9 - 1 0 2 . B u l b r i n g , E . a n d T o m i t a , T . ( 1 9 8 7 ) C a t e c h o l a m i n e a c t i o n o n s m o o t h m u s c l e . P h a r m a c . R e v . 3 9 ; 4 9 - 9 6 . B u r n s t o c k , 0 . ( 1 9 8 6 ) . T h e f i r s t v o n E u l e r L e c t u r e i n P h y s i o l o g y : T h e c h a n g i n g f a c e o f a u t o n o m i c n e u r o t r a n s m i s s i o n . A c t a . P h y s i o l . S c a n d . 1 2 : 6 7 - 9 1 . B u r n s t o c k , 0 . ( 1 9 9 0 ) . L o c a l m e c h a n i s m s o f b l o o d f l o w c o n t r o l b y p e r i v a s c u l a r n e r v e s a n d e n d o t h e l i u m . J o u r n a l o f H y p e r t e n s i o n . 8 ( s u p p l 7 ) : S 5 9 - S 1 6 0 . B u r t o n , F . L . a n d H u t t e r , O . F . ( 1 9 9 0 ) . S e n s i t i v i t y t o f l o w o f i n t r i n s i c g a t i n g i n i n w a r d l y r e c t i f y i n g p o t a s s i u m c h a n n e l f r o m m a m m a l i a n s k e l e t a l m u s c l e . 3 . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 4 : 2 5 3 - 2 6 1 . 1 9 6 C a f f r e y , J . M . , J o s e p h s o n , I . R . a n d B r o w n , A . M . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m c h a n n e l s o f a m p h i b i a n s t o m a c h a n d m a m m a l i a n a o r t a s m o o t h m u s c l e c e l l s . B i o p h y s . J . 4 9 : 1 2 3 7 - 1 2 4 2 . C a l l e w a e r t , G . , V e r e e c k e , J . a n d C a r m e l i e t , E . ( 1 9 8 6 ) . E x i s t e n c e o f a c a l c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m c h a n n e l i n t h e m e m b r a n e o f c o w c a r d i a c P u r k i n j e c e l l s . P f l u g e r s A r c h . 4 0 6 : 4 2 4 - 4 2 6 . C a p p o n i , A . M , L e w P . D . a n d V a l l o t t o n M . B . ( 1 9 8 6 ) . C u l t u r e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s : A m e t h o d f o r m e a s u r i n g c h a n g e s i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i n d u c e d b y v a s o c o n s t r i c t o r h o r m o n e s . J . C a r d i o v a s c u l a r P h a r m . 8 ( S u p p l . 8 ) : S 1 3 6 - 1 3 8 . C a p p o n i , A . M . , L e w , P . D . , a n d V a l l o t t o n , M . B . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t o f s e r o t o n i n o n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i n a d r e n a l g l o m e r u l o s a a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 4 4 : 5 3 - 6 0 . C a r l , A . , M c h a l e , N . G . , P u b l i c o v e r , N . G . a n d S a n d e r s , K . M . ( 1 9 9 0 ) . P a r t i c i p a t i o n o f C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s i n e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f c a n i n e g a s t r i c s m o o t h m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 9 : 2 0 5 - 2 2 1 . C e c c h i , X . , A l v a r e z , 0 . a n d W o l f f , D . ( 1 9 8 6 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l f r o m r a b b i t i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a r b i l a y e r s . J . M e m b r . B i o l . 9 1 : 1 1 - 1 8 . C h a n g , J . a n d O w m a n , C . ( 1 9 8 7 ) . I n v o l v e m e n t o f s p e c i f i c r e c e p t o r s a n d c a l c i u m m e c h a n i s m s i n s e r o t o n e r g i c c o n t r a c t i l e r e s p o n s e o f i s o l a t e d c e r e b r a l a n d p e r i p h e r a l a r t e r i e s f r o m r a t s . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 4 2 : 6 2 9 - 6 3 6 . C h a n g , 3 . Y . , O w m a n , C . a n d S t e i n b u s c h , H . W . ( 1 9 8 8 ) . E v i d e n c e f o r c o e x i s t e n c e o f s e r o t o n i n a n d n o r a d r e n a l i n e i n s y m p a t h e t i c n e r v e s s u p p l y i n g b r a i n v e s s e l s o f g u i n e a p i g . B r a i n R e s e a r c h . 4 3 8 : 2 3 7 - 2 4 6 . C h r i s t e n s e n , 0 . a n d Z e u t h e n T . ( 1 9 8 7 ) . M a x i K ± c h a n n e l s i n l e a k y e p i t h e l i a a r e r e g u l a t e d b y i n t r a c e l l u l a r C a + , p H a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l . P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : 2 4 9 - 2 5 9 . C l a r k e , R . B . , N a k a j i m a , T . , G i l e s , W . , K a n a i , K . , M o m o s e , Y . a n d S z a b o , G . ( 1 9 9 0 ) . T w o d i s t i n c t t y p e s o f i n w a r J l y r e c t i f y i n g K + c h a n n e l s i n b u l l - f r o g a r t e r i a l m y o c y t e s . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 4 : 2 2 9 - 2 5 1 . C o c k s , T . M . , A n g u s , J . A . ( 1 9 8 4 ) . E n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b l o o d v e s s e l r e a c t i v i t y . I n T h e P e r i p h e r a l C i r c u l a t i o n , e d . S . H u n y o r , 3 . L u d b r o o k , J . S h a w , M . M c G r a t h , p p . 9 - 2 1 . N e w Y o r k : E l s e v i e r . C o h e n , M . L . a n d C o l b e r t , W . E . ( 1 9 8 6 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n r e c e p t o r s m e d i a t i n g s e r o t o n i n ( 5 - H T ) c o n t r a c t i o n s i n t h e c a n i n e b a s i l a r a r t e r y t o 5 - H T 1 , 5 - H T 2 a n d r a t s t o m a c h f u n d u s 5 - H T r e c e p t o r s . 3 . P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 3 7 : 7 1 3 - 7 1 8 . C o l e , W . C . a n d S a n d e r s , K . M . ( 1 9 8 9 ) . G p r o t e i n s m e d i a t e s u p p r e s s i o n o f C a2+ a c t i v a t e d K + c u r r e n t b y a c e t y l c h o l i n e i n s m o o t h m u s c l e c e l l s . A m . 3 . P h y s i o l . 2 5 7 : C 5 9 6 - C 6 0 0 . 1 9 7 C o i q u h o u n , D . a n d S i g w o r t h , F . J . ( 1 9 8 3 ) . F i t t i n g a n d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f s i n g l e - c h a n n e l r e c o r d s , i n S i n g l e - C h a n n e l R e c o r d i n g . ( e d ) S a k m a n n , B . & N e h e r , E . P l e n u m , N e Y o r k p p 1 9 1 - 2 6 4 . C o n n , P . J . a n d S a n d e r s - B u s h , E . ( 1 9 8 7 ) . C e n t r a l s e r o t o n i n r e c e p t o r s : e f f e c t o r s y s t e m s , p h y s i o l o g i c a l r o l e s a n d r e g u l a t i o n . P s y c h o p h a r m a c o l o g y . 9 2 : 2 6 7 - 2 7 7 . C o n n o r , 3 . A . a n d S t e v e n s , C . F . ( 1 9 7 1 ) . V o l t a g e - c l a m p s t u d i e s o f a t r a n s i e n t o u t w a r d m e m b r a n e c u r r e n t i n g a s t r o p o d n e u r a l s o m a t a . 3 . P h y s i o l . ( L o n d . ) , 2 1 3 : 3 1 - 5 3 . C o n s t a n t i , A . , A d a m s , P . R . a n d B r o w n , D . A . ( 1 9 8 1 ) . W h y d o b a r i u m i o n s i m i t a t e a c e t y i c h o l i n e ? B r a i n R e s . 2 0 6 : 2 4 4 - 2 5 0 . C o n t i , F . a n d N e h e r , E . ( 1 9 8 0 ) . S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s o f K + c u r r e n t s i n s q u i d a x o n s . N a t u r e 2 8 5 : 1 4 0 - 1 4 3 . C o o k , D . L . , I k e u c h i , M . a n d F u j i m o t o ( 1 9 8 4 ) . L o w e r i n g o f p H i n h i b i t s C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s i n p a n c r e a t i c B - c e l l s . N a t u r e 3 1 1 : 2 6 9 - 2 7 3 . C o o k , N . S . a n d H a y l e t t , D . G . ( 1 9 8 5 ) . E f f e c t s o f a p a m i n , q u i n i n e a n d n e u r o m u s c u l a r b l o c k e r s i n c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n g u i n e a - p i g h e p a t o c y t e s . 3 . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 8 - 3 7 3 - 3 9 4 . C o r n e j o , M . , G u g g i n o , S . E . a n d G u g g i n o , W . B . ( 1 9 8 7 ) . M o d i f i c a t i o n o f C a2+ - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s i n c u l t u r e d m e d u l l a r y t h i c k a s c e n d i n g l i m b c e l l s b y N b r o m o a c e t a m i d e . 3 . M e m b r . B i o l . 9 9 : 1 4 7 - 1 5 5 . C r e p e l , F . a n d P e n i t - S o r i a , J . ( 1 9 8 6 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n a n d l o w t h r e s h o l d c a l c i u m c o n d u c t a n c e i n r a t c e r e b e l l a r p u r k i n j e c e l l s . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 7 2 : 1 - 2 3 . D e C l e r c k , F . , a n d D a v i d , J . L . ( 1 9 8 1 ) . P h a r m a c o l o g i c a l c o n t r o l o f p l a t e l e t a n d r e d b l o o d c e l l f u n c t i o n i n t h e m i c r o c i r c u l a t i o n . 3 . C a r d i o v a s c . P h a r m a c o l . 3 : 1 3 8 8 - 1 4 1 2 . D i g l i o , C . A . , G r a m m a s , P . , G i a c o m e l l i , F . , a n d W i e n e r , J . ( 1 9 8 6 ) . R a t c e r e b r a l n i i c r o v a s c u l a r s m o o t h c e l l s i n c u l t u r e . J . C e l l . P h y s i o l . 1 2 9 : 1 3 1 - 1 4 1 . D o y l e , V . M . , C r e b a , J . A . , R u e g g , U . T . a n d H o y e r , D . ( 1 9 8 6 ) . S e r o t o n i n i n c r e a s e s t h e p r o d u c t i o n o f i n o s i t o l p h o s p h a t e s a n d m o b i l i z e s c a l c i u m v i a t h e 5 - H T 2 r e c e p t o r i n A 7 r 5 s m o o t h m u s c l e c e l l s . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 3 3 : 9 8 - 1 0 3 . E d v i n s s o n , L . , D e g u e u r c e , A . , D u v e r g e r , D . , M a c k e n z i e , E . T . , S c a t t o n , B . a n d U d d m a n , R . ( 1 9 8 4 ) . C o u p l i n g b e t w e e n c e r e b r a l b l o o d f l o w a n d m e t a b o l i s m : A r o l e f o r s e r o t o n i n ? I n n e u r o t r a r s m i t t e r s a n d t h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o n . E d i t e d b y M a c K e n z i e , E . T . , S e y l e s , J . a n d B e s , A . p p . 1 2 1 - 1 3 6 , R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . E d w a r d s , F . R . a n d H i r s t , G . D . S . ( 1 9 8 8 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n i n s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o f g u i n e a - p i g i l e u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 0 4 : 4 3 7 - 4 5 4 . E d w a r d s , F . R . , H i r s t , G . D . S . a n d S i i v e r b e r g , G . D . ( 1 9 8 8 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n i n r a t c e r e b r a l a r t e r i o l e s : i n v o l v e m e n t o f p o t a s s i u m i o n s i n a u t o r e g u l a t i o n , J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 0 4 : 4 5 5 - 4 6 6 . 1 9 8 E d w a r d s , 0 . a n d W e s t o n , A . H . ( 1 9 9 0 ) . P o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r s a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e r e l a x a t i o n . P h a r m a c . T h e r . 4 8 : 2 3 7 - 2 5 8 . E w a l d , D . A . , W i l l i a m s , A . a n d L e v i t a n , I . B . ( 1 9 8 5 ) . M o d u l a t i o n o f s i n g l e C a2+ - d e p e n d e n t K + - c h a n n e l a c t i v i t y b y p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n . N a t u r e 3 1 5 : 5 0 3 - 5 0 6 . F a r l e y , 3 . a n d A u e r b a c h , S . ( 1 9 8 6 ) . P r o t e i n k i n a s e C a c t i v a t i o n i n d u c e s c o n d u c t a n c e c h a n g e s i n H e r m i s s e n d a p h o t o r e c e p t o r s l i k e t h o s e s e e n i n a s s o c i a t i v e l e a r n i n g . N a t u r e 3 1 9 : 2 2 0 - 2 2 3 . F a r l e y , J . a n d R u d y , B . ( 1 9 8 8 ) . M u l t i p l e t y p e s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t C a - a c t i v a t e d K c h a n n e l s o f l a r g e c o n d u c t a n c e i n r a t b r a i n s y n a p t o s o m a l m e m b r a n e s . B i o p h y s . J . 5 3 : 9 1 9 - 9 3 4 . F e n w i c k , E . M . , M a r t y , A . a n d N e h e r , E . ( 1 9 8 2 ) . S o d i u m a n d c a l c i u m c h a n n e l s i n b o v i n e c h r o m a f f i n c e l l s . J . P h y s i o l ( L a n d . ) 3 3 1 : 5 9 9 - 6 3 6 . F i n d l a y , I . M . , D u n n e , M . 3 . P e t e r s e n , 0 . H . ( 1 9 8 5 ) . H i g h c o n d u c t a n c e K + c h a n n e l i n p a n c r e a t i c i s l e t c e l l s c a n b e a c t i v a t e d a n d i n a c t i v a t e d b y i n t e r n a l c a l c i u m . J . M e m b r . B i o l . 8 3 : 1 6 9 - 1 7 5 . F r a n k e , W . W . , S c h m i d , E . , V a n d e k e r c k h o v e , J . a n d W e b e r , K . ( 1 9 8 0 ) . A p e r m a n e n t l y p r o l i f e r a t i n g r a t v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l w i t h m a i n t a i n e d e x p r e s s i o n o f s m o o t h m u s c l e c h a r a c t e r i s t i c s , i n c l u d i n g a c t i n o f t h e v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t y p e . J . C e l l . B i o l . 8 7 : 5 9 4 - 6 0 0 . F r e i s s m u t h , M . , C a s e y , P a n d G i l m a n , A . ( 1 9 8 9 ) . 0 p r o t e i n s c o n t r o l d i v e r s e p a t h w a y s o f t r a n s m e m b r a n e s i g n a l i n g . F A S E B J . 3 : 2 1 2 5 - 2 1 3 1 . F r i n d t , 0 . a n d P a l m e r , L . G . ( 1 9 8 7 ) . C a - a c t i v a t e d K c h a n n e l s i n a p i c a l m e m b r a n e o f m a m m a l i a n C C T , a n d t h e i r r o l e i n K s e c r e t i o n . A m . J . P h y s i o l . 2 5 2 : F 4 5 8 - F 4 6 7 . F u j i w a r a , S . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 3 ) . E f f e c t s o f a g e n t s t h a t m o d u l a t e p o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y o n s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e g u i n e a - p i g b a s i l a r a r t e r y . B r . J . P h a r m a c o l . 7 9 : 2 3 - 3 5 . F u j i w a r a , S . , I t o h , T . a n d S u z u k i , H . ( 1 9 8 2 ) . M e m b r a n e p r o p e r t i e s a n d e x c i t a t o r y n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n i n t h e s m o o t h m u s c l e o f d o g c e r e b r a l a r t e r i e s . B r . J . P h a r m a c . 7 7 : 1 9 7 - 2 0 8 . F u r c h g o t t , R . F . a n d Z a w a d s k i , J . V . ( 1 9 8 0 ) . T h e o b l i g a t o r y r o l e o f e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e r e l a x a t i o n o f a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e b y a c e t y i c h o l i n e . N a t u r e 2 8 8 : 3 7 3 - 3 7 6 . F u r c h g o t t , R . F . ( 1 8 9 4 ) . T h e r o l e o f e n d o t h e l i u m i n t h e r e s p o n s e s o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o d r u g s . A n n u . R e v . P h a r m a c . T o x i c . 2 4 : 1 7 5 - 1 9 7 . G a b b i a n i , 0 . E . , S c h m i d , E . , W i n t e r , . S . , C h a p o n n i e r , D e c h a s t o n y , C . , V a n d e k e r c k h o v e , J . , W e b e r , K . , a n d F r a n k e , W . W . ( 1 9 8 1 ) . V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s d i f f e r f r o m o t h e r s m o o t h m u s c l e c e l l s : p r e d o m i n a n c e o f v i m e n t i n f i l a m e n t s a n d a s p e c i f i c a l p h a - t y p e a c t i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 : 2 9 8 - 3 0 2 . G a l l i n , E . K . ( 1 9 8 4 ) . C a l c i i m - a n d v o l t a g e - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n h u m a n m a c r o p h a g e s . B i o p h y s . J . 4 6 : 8 2 1 - 8 2 7 . 1 9 9 G e l b a n d , C . H . , L o d g e , N . J . a n d V a n B r e e m e n , C . ( 1 9 8 9 ) . A C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l f r o m r a b b i t a o r t a : m o d u l a t i o n b y c r o m a k a l i m . E u r . J . P h a r m a c . 1 6 7 : 2 0 1 - 2 1 0 . G e l b a n d , C . H . , M c C u l l o u g h , 3 . R . a n d V a n B r e e m e n , C . ( 1 9 9 0 ) . M o d u l a t i o n o f v a s c u l a r C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s b y c r o m a k a l i m , p i n a c i d i l a n d g l y b u r i d e . B i o p h y s . J . 5 7 : 5 0 9 a G e l b a n d , C . H . , S i l b e r b e r g , S . D . a n d G r o s c h n e r K . ( 1 9 9 0 ) . A T P i n h i b i t s s m o o t h m u s c l e a2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l s . P r o c . R . S o c . L o n d . B 2 3 - 2 8 . G i t t e r , A . H . , B e y e n b a c h , K . W . , C h a d w i c h , C . W . , G r o s s , P . , M i n u t h , W . W . a n d F r o m t e r , E . ( 1 9 8 7 ) . H i g h - c o n d u c t a n c e K + c h a n n e l s i n a p i c a l m e m b r a n e s o f p r i n c i p a l c e l l s c u l t u r e d f r o m r a b b i t r e n a l c o r t i c a l c o l l e c t i n g d u c t a n l a g e n . P f l u g e r s . A r c h . 4 0 8 : 2 8 2 - 2 9 0 . G o l d m a n , D . E . ( 1 9 4 3 ) . P o t e n t i a l , i m p e d a n c e , a n d r e c t i f i c a t i o n i n m e m b r a n e s . J . G e n . P h y s i o l . 2 7 : 3 7 - 6 0 . G r a y , M . A . , G r e e n w e l l , A . R . , G a r t o n , A . J . a n d A r g e n t . ( 1 9 9 0 ) . R e g u l a t i o n o f M a x i - K + c h a n n e l s o n p a n c r e a t i c d u c t c e l l s b y c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n . J . M e m b r a n e B i o l . 1 1 5 : 2 0 3 - 2 1 5 . G r e e n , K . A . F o s t e r , R . W . a n d S m a l l R . C . ( 1 9 9 1 ) . A p a t c h - c l a m p s t u d y o f K + - c h a n n e l a c t i v i t y i n b o v i n e i s o l a t e d t r a c h e a l s m o o t h m u s c l e c e l l s . B r . 3 . P h a r m a c o l . 1 0 2 : 8 7 1 - 8 7 8 . G r y n k i e w i c z , G , P o e n i e , M . a n d T s i e n , R . Y . ( 1 9 8 5 ) . A n e w g e n e r a t i o n o f C a2+ i n d i c a t o r s w i t h g r e a t l y i m p r o v e d f l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 3 4 4 0 - 3 4 5 0 . G u g i n o , S . E . , S u a r e z - I s l a , B . A . , G u g g i n o , W . B . , G r e e , N . a n d S a c k t o r , B . ( 1 9 8 5 ) . T h e i n f l u e n c e o f b a r i u m o n a p i c a l m e m b r a n e p o t e n t i a l s a n d p o t a s s i u m c h a n n e l a c t i v i t y i n c u l t u r e d r a b b i t m e d u l l a r y a s c e n d i n g l i m b c e l l s ( M T A L ) . F e d . P r o c . 4 4 : 4 4 3 - 4 5 1 . G u t f r e u n d , H . ( 1 9 7 2 ) . E n z y m e s : P h y s i c a l P r i n c i p l e s . W i l e y , L o n d o n . H a g i w a r a , S . a n d J a f f e , L . A . ( 1 9 7 9 ) . E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f e g g c e l l m e m b r a n e s . A . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 8 : 3 8 5 - 4 1 6 . H a g i w a r a , S . , M i y a z a k i , S . a n d R o s e n t h a l , N . P . ( 1 9 7 6 ) . P o t a s s i u m c u r r e n t a n d t h e e f f e c t o f c e s i u m o n t h i s c u r r e n t d u r i n g a n o m a l o u s r e c t i f i c a t i o n o f t h e e g g c e l l m e m b r a n e o f a s t a r f i s h . J . G e n . P h y s i o l . 6 7 : 6 2 1 - 6 3 8 . H a g i w a r a , S . , M i y a z a k i , S . , M o o d y , W . J , a n d P a t l a k , J . ( 1 9 7 8 ) . B l o c k i n g e f f e c t s o f b a r i u m a n d h y d r o g e n i o n s o n t h e p o t a s s i u m c u r r e n t d u r i n g a n o m a l o u s r e c t i f i c a t i o n i n t h e s t a r f i s h e g g . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 7 9 : 1 6 7 - 1 8 5 . H a i , C - M a n d M u r p h y , R . ( 1 9 8 9 ) . C a2+ , c r o s s b r i d g e p h o s p h o r y l a t i o n , a n d c o n t r a c t i o n . A n n u . R e v . P h y s i o l . 5 1 : 2 8 5 - 2 9 8 . H a l l i w e l l , J . V . a n d A d a m s , P . R . ( 1 9 8 2 ) . V o l t a g e - c l a m p a n a l y s i s o f m u s c a r i n i c e x c i t a t i o n i n h i p p o c a m p a l n e u r o n s . B r a i n R e s . 2 5 0 : 7 1 - 9 2 . 2 0 0 H a m i l l . , o . P , M a r t y , A . , N e h e r , E . , S a k m a n n , B . a n d S i g w o r t h , F . 3 . ( 1 9 8 1 ) . I m p r o v e d p a t c h - c l a m p t e c h n i q u e f o r h i g h - r e s o l u t i o n c u r r e n t r e c o r d i n g f r o m c e l l s a n d c e l l - f r e e m e m b r a n e p a t c h e s . P f l u g e r s A r c h i v . 3 9 1 : 8 5 - 1 0 0 . H a m l i n , K . E . a n d F i s c h e r , F . E . ( 1 9 5 1 ) . T h e s y n t h e s i s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e . J . A m . C h e m . S o c . , 7 3 : 5 0 0 7 - 5 0 0 8 . H a r d e r , D . R . ( 1 9 8 0 ) . C o m p a r i s o n o f e l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f m i d d l e c e r e b r a l a n d m e s e n t e r i c a r t e r y i n c a t . A m . J . P h y s i o l . 2 3 9 : C 2 3 - C 2 6 . H a r d e r , D . R . , A d e l , P . W . a n d H e r m s m e y e r , K . ( 1 9 8 1 ) M e m b r a n e e l e c t r i c a l m e c h a n i s m s o f b a s i l a r a r t e r y c o n s t r i c t i o n a n d p i a l a r t e r y d i l a t i o n b y n o r e p i n e p h r i n e . C i r c . R e s . 4 9 ; 1 2 3 7 - 1 2 4 2 . H a r d e r , D . R . , D e r n b a c h , P . a n d W a t e r s , A . ( 1 9 8 7 ) . P o s s i b l e c e l l u l a r m e c h a n i s m f o r c e r e b r a l v a s o s p a s m a f t e r e x p e r i m e n t a l s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e i n t h e d o g . J . C l i n . I n v e s t . 8 0 : 8 7 5 - 8 8 0 . H a s h i m o t o , T . , H i r a t a , M . , I t o h , T . , K a n m u r a , Y . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) . I n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e a c t i v a t e s p h a r m a c o m e c h a n i c a l c o u p l i n g i n s m o o t h m u s c l e o f t h e r a b b i t m e s e n t e r i c a r t e r y . J . P h y s i o l . 3 7 0 : 6 0 5 - 6 1 8 . H a t h a w a y , D R . a n d M a r c h . K . L . ( 1 9 8 9 ) . M o l e c u l a r c a r d i o l o g y : N e w a v e n u e s f o r t h e d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e . J . A m . C e l l . C a r d i o l . 1 3 : 2 6 5 - 2 8 2 . H a t h a w a y , D . R . , K o n i c k i . M . V . a n d C o l l i c a n , S . A . ( 1 9 8 5 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e f r o m v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e b y c A M P - a n d c G M P d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s . J . M o ! . C e l l . C a r d i o l . 1 7 : 8 4 1 - 8 5 0 . H a t h a w a y , D . R . , M a r c h , K . L . , L a s h , J . A . , A d a m , L . P . a n d W i l e n s k y , R . L . ( 1 9 9 1 ) . V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . A r e v i e w o f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f c o n t r a c t i l i t y . C i r c u l a t i o n . 8 3 : 3 8 2 - 3 9 0 . H e r m s m e y e r , K . ( 1 9 7 6 ) . C e l l u l a r b a s i s f o r i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i n s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e r a t s . C i r c . R e s . 3 8 : ( s u p p l I I ) : 1 1 5 3 - 1 1 5 7 . H i g a s h i d a , H . a n d B r o w n , D . A . ( 1 9 8 6 ) . C a2+ - d e p e n d e n t K + c h a n n e l s i n n e u r o b l a s t o m a h y b r i d c e l l s a c t i v a t e d b y i n t r a c e l l u l a r i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d e x t r a c e l l u l a r b r a d y k i n i n . F E B S L e t t . 3 2 8 : 3 9 5 - 4 0 0 . H i l l e , B . ( 1 9 8 4 ) . I o n i c c h a n n e l s o f e x c i t a b l e m e m b r a n e s . S i n a u e r A s s o c i a t e s , S u n d e r l a n d , M a s s . F i r s t E d i t i o n . H i l l e , B . ( 1 9 9 1 ) . I o n i c c h a n n e l s o f e x c i t a b l e m e m b r a n e s . S i n a u e r A s s o c i a t e s , I n c . , S u n d e r l a n d , M a s s . S e c o n d E d i t i o n . H i r s t , G . D . S . , S i l v e r b e r g , D . G . a n d V a n H e l d e n , D . F . ( 1 9 8 6 ) . T h e a c t i o n p o t e n t i a l a n d u n d e r l y i n g i o n i c c u r r e n t s i n p r o x i m a l r a t m i d d l e c e r e b r a l a r t e r i o l e s . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 7 1 : 2 8 9 - 3 0 4 . 2 0 1 H i s a d a , T . , O r d w a y , R . W . , K i r b e r , M . T . , S i n g e r , J . J . a n d W a l s h , J . V . J r . ( 1 9 9 1 ) . H y p e r p o l a r i z a t i o n - a c t i v a t e d c a t i o n i c c h a n n e l s i n s m o o t h m u s c l e c e l l s a r e s t r e t c h s e n s i t i v e . P f l u g e r s A r c h i v . 4 1 7 : 4 9 3 - 4 9 9 . H o d g k i n , A . L . a n d H u x e l y , A . F . ( 1 9 5 2 ) . T h e c o m p o n e n t s o f m e m b r a n e c o n d u c t a n c e i n t h e g i a n t a x o n o f L o l i g o . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 1 1 6 : 4 7 3 - 4 9 6 . H o d g k i n , A . . a n d K a t z , B . ( 1 9 4 9 ) . T h e e f f e c t o f s o d i u m i o n s o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f t h e s q u i d g i a n t a x o n . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 1 0 8 : 3 7 - 7 7 . H u S . L . , K i m , H . S . a n d J e n , A . Y . ( 1 9 9 1 ) . D u a l a c t i o n o f e n d o t h e l i n - 1 o n t h e C a + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l i n s m o o t h m u s c l e c e l l s o f p o r c i n e c o r o n a r y a r t e r y . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 9 4 : 3 1 - 3 6 . H u b b a r d , J . I . , L l i n a s , R . a n d Q u a s t e l , D . M . J . ( 1 9 6 9 ) . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l A n a l y s i s o f S y n a p t i c T r a n s m i s s i o n . E d w a r d A r n o l d , L o n d o n . H u n t e r , M . , L o p e s , A . G . , B o u l p a e p , E . L . a n d C o h e n , B . ( 1 9 8 4 ) . S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n t h e a p i c a l m e m b r a n e o f r a b b i t c o r t i c a l c o l l e c t i n g t u b u l e . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A 8 1 : 4 2 3 7 - 4 2 3 9 . H u x l e y , H . ( 1 9 9 0 ) . S l i d i n g f i l a m e n t s a n d m o l e c u l a r m o t i l e s y s t e m s . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 : 8 3 4 7 - 8 3 5 0 . I g n a r r o , L . J . , B y r n s R . E . a n d W o o d , K . 5 . ( 1 9 8 6 ) . P h a r m a c o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F ) : e v i d e n c e t h a t i t i s c l o s e l y r e l a t e d t o n i t r i c o x i d e ( N O ) r a d i c a l . C i r c u l a t i o n . 7 4 ( s u p p l I I ) : 1 1 2 8 7 . I k e b e , M . a n d R e a r d o n , S . i l 9 9 O ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f s m o o t h m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e b y s m o o t h m u s c l e C a2+ / c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t m u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n k i n a s e . J . B i O l . C h e m . 2 6 5 : 8 9 7 5 - 8 9 7 8 . I n o m a t a , H . a n d K a o , C . Y . ( 1 9 7 9 ) . I o n i c m e c h a n i s m s o f r e p o l a r i s a t i o n i n t h e g u i n e a - p i g t a e n i a c o l i a s r e v e a l e d b y t h e a c t i o n s o f s t r o n t i u m . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 9 7 : 4 4 3 - 4 6 2 . I n o u e , R . , K i t a m u r a , K . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 5 ) . T w o C a - d e p e n d e n t K - c h a n n e l s c l a s s i f i e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f t e t r a e t h y l a m m o n i u m d i s t r i b u t e t o s m o o t h m u s c l e m e m b r a n e s o f t h e r a b b i t p o r t a l v e i n . P f l u g e r s A r c h 4 0 5 : 1 7 3 - 1 7 9 . I n o u e , R . , O k a b e , K . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) . A n e w l y i d e n t i f i e d C a2+ d e p e n d e n t K + c h a n n e l i n t h e s m o o t h m u s c l e m e m b r a n e o f s i n g l e c e l l s d i s p e r s e d f r o m t h e r a b b i t p o r t a l v e i n . P f l u g e r s A r c h . 4 0 6 : 1 3 8 - 1 4 3 . I s e n b e r g , G . a n d K l o c k n e r , V . ( 1 9 8 6 ) . E l e m e n t a r y c u r r e n t s t h r o u g h s i n g l e C a - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s ( s m o o t h m u s c l e c e l l s i s o l a t e d f r o m t r a c h e a o r u r i n a r y b l a d d e r ) . P f l u g e r s . A r c h . 4 0 5 : R 6 2 . I s h i i , N . , S i m p s o n , W . M . a n d A s h l e y , C . C . ( 1 9 8 9 ) . E f f e c t s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( s e r o t o n i n ) a n d f o r s k o l i n o n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i n i s o l a t e d a n d f u r a - 2 l o a d e d s m o o t h - m u s c l e c e l l s f r o m t i e a n t e r i o r b y s s u s r e t r a c t o r ( c a t c h ) m u s c l e o f M y t i l u s e d u l i s . P f l u g e r s A r c h . 4 1 4 : 1 6 2 - 1 7 0 . 2 0 2 I t o h , T . ( 1 9 9 1 ) . P h a r m a c o m e c h a n i c a l c o u p l i n g i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . J a p a n . J . P h a r m a c o l . 5 5 : 1 0 9 . J o h n s , A . , L e i j t e n , P . , Y a m a m o t o , H . , H w a n g , K . a n d V a n B r e e m e n , C . ( 1 9 8 7 ) . C a l c i u m r e g u l a t i o n i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i l i t y . A m . J . C a r d i o l . 5 9 : 1 8 a - 2 3 a . K a c z m a r e k , L . K . a n d L e v i t a n , I . B . ( 1 9 8 7 ) N e u r o m o d u l a t i o n : t h e b i o c h e m i c a l c o n t r o l o f n e u r o n a l e x c i t a b i l i t y . O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k . K a c z m a r e k , L . K . a n d S t r u m w a s s e r , R . ( 1 9 8 4 ) . A v o l t a g e - c l a m p a n a l y s i s o f c u r r e n t u n d e r l y i n g c A M P - i n d u c e d m e m b r a n e m o d u l a t i o n i n i s o l a t e d p e p t i d e r g i c n e u r o n s o f A p l y s i a . J . N e u r o p h y s i o l . 5 2 : 3 4 0 - 3 4 9 . K a m m , K . E . n d S t u l l , J . T . ( 1 9 8 9 ) . R e g u l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i l e e l e m e n t s b y s e c o n d m e s s e n g e r s . A n n u . R e v . P h y s i o l . 5 1 : 2 9 9 - 3 1 3 . K a r a s h i m a , T . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 1 ) . E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f s m o o t h m u s c l e c e l l m e m b r a n e a n d n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n i n t h e g u i n e a - p i g b a s i l a r a r t e r y . B r . J . P h a r m a c . 7 4 : 4 9 5 - 5 0 4 . K a t z , B . ( 1 9 4 9 ) . L e s c o n s t a n t s e l e c t r i q u e s d e l a m e m b r a n e d u m u s c l e . A r c h . S c i . P h y s i o l . 3 : 2 8 5 - 2 9 9 . K a w a i , T . , a n d W a t a n a b e , M . ( 1 9 8 6 ) . B l o c k a d e o f C a - a c t i v a t e d K c o n d u c t a n c e b y a p a m i n i n r a t s y m p a t h e t i c n e u r o n s . B r . J . P h a r m a c o l . 8 7 : 2 2 5 - 2 3 2 . K i o c k n e r , U . a n d I s e n b e r g , G . ( 1 9 8 5 ) . A c t i o n p o t e n t i a l s a n d n e t m e m b r a n e c u r r e n t s o f i s o l a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s ( u r i n a r y b l a d d e r o f t h e g u i n e a - p i g ) . P f l u g e r s . A r c h . 4 0 5 : 3 2 9 - 3 3 9 . K i o c k n e r , U . , T r i e s c h m a n n , U . a n d I s e n b e r g , G . ( 1 9 8 9 ) . P h a r m a c o l o g i c a l m o d u l a t i o n o f c a l c i u m a n d p o t a s s i u m c h a n n e l i n i s o l a t e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . D r u g R e s . 3 9 : 1 2 0 - 1 2 6 . K o i b , H . ( 1 9 9 0 ) . P o t a s s i u n L c h a n n e l s i n e x c i t a b l e a n d n o n - e x c i t a b l e c e l l s . R e v . P h y s i o l . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 1 5 : 5 1 - 9 1 . K o n i s h i , M . , O l s o n , A . , H o l l i n g s w o r t h , a n d B a y l o r , S . M . ( 1 9 8 8 ) . M y o p l a s m i c b i n d i n g o f f u r a - 2 i n v e s t i g a t e d b y s t e a d y - s t a t e f l u o r e s c e n c e a n d a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s . B i o p h y s . 3 . 5 5 : 1 0 8 9 - 1 1 0 4 . K r e y e , V . A . W . , G e r s t h e i m e r , F . a n d W e a t o n , A . H . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f B R L 3 4 9 1 5 o n r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d 8 6 R b e f f l u x i n r a b b i t t o n i c v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . P h a r m a c . 3 3 5 : R 6 4 . K r e y e , V . A . W . , G e r s t h e i m e r , F . a n I W e s t o n , A . H . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f B R L 3 4 9 1 5 o n r e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d O6R b e f f l u x i n r a b b i t t o n i c v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . P h a r m a c . 3 3 5 : R 6 4 . K u l l a k , A . , D o n o s o , M . V . a n d H u i d o b o r o - T o r o , 3 . P . ( 1 9 8 7 ) . E x t r a c e l l u l a r c a l c i u m d e p e n d e n c e o f t h e n e u r o t e n s i n i n d u c e d r e l a x a t i o n o f i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e s s t u d i e s u s i n g c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s a n d B A Y K 8 6 4 4 . E u r . J . P h a r m a c o l . 1 3 5 : 2 9 7 - 3 0 5 . 2 0 3 K u m e , H . T a k a i , A . , T o k u n o , H . a n d T o m i t a , T . ( 1 9 8 9 ) . R e g u l a t i o n o f C a2+ - d e p e n d e n t K + - c h a n n e l a c t i v i t y i n t r a c h e a l m y o c y t e s b y p h o s p h o r y l a t i o n . N a t u r e . 3 4 1 : 1 5 2 - 1 5 4 . K u r i y a m a , H . a n d K i t a m u r a , K . ( 1 9 8 5 ) . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l a s p e c t s o f r e g u l a t i o n o f p r e c a p i l l a r y v e s s e l t o n e i n s m o o t h m u s c l e s o f v a s c u l a r t i s s u e s . J . C a r d i o v a s c u l a r P h a r m . 7 ( s u p p l . 3 ) : S 1 1 9 - S 1 2 8 . K u r i y a m a , H . , I t o , Y . , S u z u k i , H . K i t a m u r a , K . a n d I t o h , T . ( 1 9 8 2 ) . F a c t o r s m o d i f y i n g c o n c e n t r a t i o n - r e l a x a t i o n c y c l e i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e s . A m . 3 . P h y s i o l . 2 4 3 : H 6 4 1 - H 6 6 2 . K u s a n o , K . , B a r r o s , F . , K a t z , G . , G a r c i a , M . , K a c z o r o w s k i , G . a n d R e u b e n , J . P . ( 1 9 8 7 ) . M o d u l a t i o n o f K c h a n n e l a c t i v i t y i n a o r t i c s m o o t h m u s c l e b y B R L 3 4 9 1 5 a n d a s c o r p i o n t o x i n . B i o p h y s . 3 . 5 1 : 5 5 a . L a b a r c a , P . , C o r o n a d o , R . a n d M i l l e r , C . ( 1 9 8 0 ) . T h e r m o d y n a m i c a n d k i n e t i c s t u d i e s o f t h e g a t i n g b e h a v i o r o f a K + - s e l e c t i v e c h a n n e l f r o m t h e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e . J . G e n . P h y s i o l . 7 6 : 3 9 7 - 4 2 4 . L a n c e , J . W . ( 1 9 8 2 ) . M e c h a n i s m a n d M a n a g e m e n t o f H e a d a c h e , p p . 1 6 2 - 1 6 3 , B u t t e r w o r t h , L o n d o n . L a n g , D . G . a n d A i l e e n , K . R . ( 1 9 9 0 ) . T e t r a e t h y l a m m o n i u m i o n s e n s i t i v i t y o f a 3 5 - p S Ca2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l i n G H 3 c e l l s t h a t i s a c t i v a t e d b y t h y r o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e . P f l u g e r s A r c h . 4 1 6 ; 7 0 4 - 7 0 9 . L a n g , D . G . a n d R i t c h i e , A . K . ( 1 9 8 8 ) . P h a r m a c o l o g i c a l s e n s i t i v i t i e s o f l a r g e a n d s m a l l c o n d u c t a n c e C a2+ - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s . B i o p h y s . J . 5 3 - 1 4 4 a . L a n g t o n , P . D . , N e l s o n , M . T . , H u a n g , Y . a n d S t a n d e n , N . B . ( 1 9 9 1 ) . B l o c k o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n m a m m a l i a n a r t e r i a l m y o c y t e s b y t e t r a e t h y l a m m o n i u m i o n s . A m . J . P h y s i o l . 2 6 0 : H 9 2 7 - H 9 3 4 . L a t o r r e , R . a n d M i l l e r , C . ( 1 9 8 3 ) . C o n d u c t i o n a n d s e l e c t i v i t y i n p o t a s s i u m c h a n n e l s . J . M e m b r . B i o l . 7 1 : 1 1 - 3 0 . L a t o r r e , R . , A l v a r e z , 0 , C e c c h i , X . a n d V e r g a r a , C . ( 1 9 8 5 ) . P r o p e r t i e s o f r e c o n s t i t u t e d i o n c h a n n e l s . A n n u . R e v . B i o p h y s . C h e m . 1 4 : 7 9 - 1 1 1 . L a t o r r e , R . , O b e r h a u s e r , A . , L a b a r c a , P . a n d A l v a r e z , 0 . ( 1 9 8 9 ) . V a r i e t i e s o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s . A n n u . R e v . P h y s i o l . 5 1 : 3 8 5 - 3 9 9 . L a t o r r e R . , V e r g a r a , C . , H i d a l g o , C . ( 1 9 8 2 ) . R e c o n s t i t u t i o n i n p l a n a r l i p i d b i l a y e r s o f a C a + - d e p e n d e n t K + c h a n n e l f r o m t r a n s v e r s e t u b u l e m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e . P r o c . N a t ! . A c a d . S c i . U S A 7 7 : 7 4 8 4 - 7 4 8 6 . L a u g e r , P . ( 1 9 8 7 ) . V o l t a g e - d e p e n d e n c e o f s o d i u m - c a l c i u m e x c h a n g e : P r e d i c t i o n s f r o m k i n e t i c m o d e l s . J . M e m b r . B i o l . 9 9 : 1 - 1 1 . L i n d e m a u n , J . P . , J o n e s , L . R . a n d H a t h a w a y , D . R . ( 1 9 8 3 ) . B - A d r e n e r g i c s t i m u l a t i o n o f p h o s p h o l a m b a n p h o s p h o r y l a t i o n a n d C a2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n g u i n e a p i g v e n t r i c l e s . 3 . B i o l . C h e m . 2 5 8 : 4 6 4 - 4 7 1 . 2 0 4 L o i r a n d , G . , P a c a u d , P . , M i r o n n e a u , C . a n d M i r o n n e a u , J . ( 1 9 8 6 ) . E v i d e n c e f o r t w o d i s t i n c t c a l c i u m c h a n n e l s i n r a t v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s i n s h o r t - t e r m p r i m a r y c u l t u r e . P f l u g e r s A r c h . 4 0 7 : 5 6 6 - 5 6 8 . L o n g m o r e , J . a n d W e s t o n , A . H . ( 1 9 8 9 ) . T h e r o l e o f K + - c h a n n e l s i n t h e m o d u l a t i o n o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e . I n : P o t a s s i u m C h a n n e l s : S t r u c t u r e , C l a s s i f i c a t i o n , F u n c t i o n a n d T h e r a p e u t i c P o t e n t i a l , p p . 2 5 9 - 2 7 8 , C o o k , N . S . ( e d ) E l l i s H o r w o o d , C h i c h e s t e r . L u s c h e r , R . F . ( e d ) : E n d o t h e l i a l V a s o a c t i v e S u b s t a n c e s a n d C a r d i o v a s c u l a r D i s e a s e . B a s e l : K a r g e r . L y o n , R . A . , D a v i s , K . H . , a n d T i t e l e r , M . ( 1 9 8 7 ) . 3 H - D O B l a b e l s a g u a n y l n u c l e o t i d e s e n s i t i v e s t a t e o f c o r t i c a l 5 - H T 2 r e c e p t o r s . M o l . P h a r m a c o l . 3 1 : 1 9 4 - 1 9 9 . M a c K i n n o n , R . a n d M i l l e r , C . ( 1 9 8 8 ) . M e c h a n i s m o f c h a r y b d o t o x i n b l o c k o f t h e h i g h - c o n d u c t a n c e , C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l . J . G e n . P h y s i o l . 3 3 5 - 3 4 5 . M a c K i n n o n , R . a n d Y e l l e n G . ( 1 9 9 0 ) . M u t a t i o n s a f f e c t i n g T E A b l o c k a d e a n d i o n p e r m e a t i o n i n v o l t a g e - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s . S c i e n c e 2 5 0 : 2 7 6 - 2 7 9 . M a g l e b y , K . L . a n d P a l l o t t a , B . S . ( 1 9 8 3 a ) . C a l c i u m - d e p e n d e n c e o f o p e n a n d s h u t i n t e r v a l d i s t r i b u t i o n s f r o m c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 4 4 : 5 8 5 - 6 0 4 . M a g l e b y , K . L . a n d P a l l o t t a , B . S . ( 1 9 8 3 b ) . B u r s t k i n e t i c s o f s i n g l e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d ) 3 4 4 : 6 0 5 - 6 2 3 . M a r t y , A . ( 1 q 8 1 ) C a l c i u m - d e p e n d e n t c h a n n e l s w i t h l a r g e u n i t a r y c o n d u c t a n c e i n c h r o m a f f i n c e l l m e m b r a n e s . N a t u r e 2 9 1 : 4 9 7 - 5 0 0 . M a r t y , A . ( 1 9 8 3 ) . C a2+ - d e p e n d e n t K c h a n n e l s w i t h l a r g e u n i t a r y c o n d u c t a n c e . T r e n d s N e u r o s c i . 6 : 2 6 2 - 2 6 5 . M a r t y , A . a n d N e h e r , E . ( 1 9 8 2 ) . I o n i c c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t p a n c r e a t i c i s l e t c e l l s . J . P h y s i o l . ( L o n d ) 3 2 6 : 3 6 P - 3 7 P . M a r u y a m a , Y . , G a l l a g h e r , D . V . , P e t e r s o n , 0 . H . ( 1 9 8 3 ) . V o l t a g e a n d c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n b a s o - l a t e r a l a c i n a r c e l l m e m b r a n e s o f m a m m a l i a n s a l i v a r y g l a n d s . N a t u r e 3 0 2 : 8 2 7 - 8 2 9 . M a s u z a w a , K . , A s a n o , M . , M a t s u d a , T . , I m a i z u m i , Y . a n d W a t a n a b e , M . ( 1 9 9 0 ) . P o s s i b l e i n v o l m e n t o f A T P - S e n s i t i v e K + c h a n n e l s i n t h e r e l a x a n t r e s p o n s e o f d o g m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y t o c r o m a k a l i m . J . P h a r m . E x p e r . T h e r . 2 5 5 : 8 1 8 - 8 2 5 . M a y e r , M . E . , L o o , D . F . , S n a p e , W . J . J r . a n d S a c h s , G . ( 1 9 9 0 ) T h e a c t i v a t i o n o f c a l c i u m a n d c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n m a m m a l i a n c o l o n i c s m o o t h m u s c l e b y s u b s t a n c e P . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 0 : 4 7 - 7 1 . M a y e r , M . L . a n d W e s t b r o o d , G . L . ( 1 9 8 3 ) . A v o l t a g e - c l a m p a n a l y s i s o f i n w a r d ( a n o m a l o u s ) T e c t i f i c a t i o n i n m o u s e s p i n a l s e n s o r y g a n g l i o n n e u r o n e s . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 4 0 : 1 9 - 4 5 . 2 0 5 M c C a n n . J . D . a n d W e l s h . M . J . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c a n i n e a i r w a y s m o o t h m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) . 3 7 2 : 1 1 3 - 1 2 7 . M c C l e s k e y , E . W . , F o x , A . P . , F e l d m a n , D . a n d T s i e n , R . W . ( 1 9 8 6 ) . D i f f e r e n t t y p e s o f c a l c i u m c h a n n e l s . J . E x p . B i o l . 1 2 4 : 1 1 7 - 1 9 0 . M c M a n u s , 0 . B . a n d M a g l e b y , K . L . ( 1 9 8 8 ) . K i n e t i c s t a t e s a n d m o d e s o f s i n g l e l a r g e - c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t s k e l e t a l m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 0 2 : 7 9 - 1 2 0 . M e e c h , R . W . ( 1 9 7 8 ) . C a l c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m a c t i v a t i o n i n n e r v o u s t i s s u e s . A . R e v . B i o p h y s . B i o e n g i n e . 7 : 1 - 1 8 . M e k a t a , F . ( 1 9 7 6 ) . R e c t i f i c a t i o n i n t h e s m o o t h m u s c l e c e l l m e m b r a n e o f r a b b i t a o r t a . 3 . P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 5 8 : 2 6 9 - 2 7 8 . M e n e , P . , P u g l i e s e , F . a n d C i n o t t i , G . A . ( 1 9 9 1 ) . S e r o t o n i n a n d t h e g l o m e r u l a r m e s a n g i u m . M e c h a n i s m s o f i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g . H y p e r t e n s i o n 1 7 : 1 5 1 - 1 6 0 . M e t h f e s s e l , C . a n d B o h e i m , G . ( 1 9 8 2 ) . T h e g a t i n g o f s i n g l e c a l c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m c h a n n e l s i s d e s c r i b e d b y a n a c t i v a t i o n / b l o c k a d e m e c h a n i s m . B i o p h y s . S t r u c . M e c h . 9 : 3 5 - 6 0 . M i c h e l , J . B . , A z i z i , M . , S a l z m a n n , J . L . , L e v y , B . a n d M e n a r d J . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t o f v a s o d i l a t o r s o n t h e s t r u c t u r e o f t h e a o r t a i n n o r m o t e n s i v e a g i n g r a t s . 3 . H y p e r t e n s . 5 ( s u p p l 5 ) : S 1 6 5 - 1 6 8 . M i c h e l , J . , R o u x , N . D . , P l i s s o n n i e r , D . , A n i d j a r , S . , S a l z m a n n , J . a n d L e v y , B . ( 1 9 9 0 ) . P a t h o p h y s i o l o g i c a l r o l e o f t h e v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l . 3 . C a r d i o v a s c . P h a r m . 1 6 ( S u p p l . 1 ) : S 4 - S 1 1 . M i l l e r , C . , M o c z y d l o w s k i , E . , L a t o r r e , R . a n d P h i l l i p s , M ( 1 9 8 5 ) . C h a r y b d o t o x i n , a p r o t e i n i n h i b i t o r o f s i n g l e C a 2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s f r o m m a m m a l i a n s k e l e t a l m u s c l e . N a t u r e 3 1 3 : 3 1 6 - 3 1 8 . M i o n e , M . C . , R a l e v i c , V . a n d B u r n s t o c k , G . ( 1 9 9 0 ) . P e p t i d e s a n d v a s o m o t o r m e c h a n i s m s . 1 ? h a r m a c o l . T h e r . 4 6 : 4 2 9 - 4 6 8 . M o c z y d l o w s k i , E . a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 3 ) . G a t i n g k i n e t i c s o f C a2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l s f r o m r a t m u s c l e i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a r l i p i d b i l a y e r s : E v i d e n c e f o r t w o v o l t a g e - d e p e n d e n t C a2+ b i n d i n g r e a c t i o n s . J . G e n . P h y s i o l . 8 2 : 5 1 1 - 5 4 2 . M o c z y d l o w s k i , E . , A l v a r e z , 0 . , V e r g a r a , C . a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 5 ) . E f f e c t o f p h o s p h o l i p i d s u r f a c e c h a r g e o n t h e c o n d u c t a n c e a n d g a t i n g o f a C a2+ - a c t i v a t e d K + c h a n n e l i n p l a n a r l i p i d b i l a y e r s . J . M e m b r . B i o l . 8 3 : 2 7 3 - 2 8 2 . M o n c a d a , S . , G r y g l e w s k i , R . J . , B u n t i n g , S . a n d V a n e , 3 . R . ( 1 9 7 6 ) . A n e n z y m e i s o l a t e d f r o m a r t e r i e s t r a n s f o r m s p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d a s e s t o a n u n s t a b l e s u b s t a n c e s t h a t i n h i b i t s p l a t e l e t a g g r e g a t i o n . N a t u r e 2 6 3 : 6 6 3 - 6 6 5 . M o n c a d a , S . a n d V a n e , J . R . ( 1 9 7 9 ) . P h a r m a c o l o g y a n d e n d o g e n o u s r o l e s o f p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d e s , t h r o m b o x a n e A 2 , a n d p r o s t a c y c l i n . P h a r m a c o l . R e v . 3 0 : 2 9 3 - 3 1 2 0 6 M o o r e , S . A . , S t r a u c h , A . R . , Y o d e r , E J . , R u b e n s t e i n , P . a n d H a r t , M . N . ( 1 9 8 4 ) . C e r e b r a l m i c r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i n t i s s u e c u l t u r e . I n V i t r o 2 0 : 5 1 2 - 5 2 0 . M o r r i s , A . P . , G a l l a c h e r , D . V . , I r v i n e , R . F . a n d P e t e r s e n , 0 . H . ( 1 9 8 7 ) . S y n e r g i s m o f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d t e t r a k i s p h o s p h a t e i n a c t i v a t i n g C a2+ - d e p e n d e n t K + c h a n n e l s . N a t u r e 3 3 0 : 6 5 3 - 6 5 5 . M u l l e r - S c h w e i n i t z e r , E . a n d E n g e l , G . ( 1 9 8 3 ) . E v i d e n c e f o r m e d i a t i o n b y 5 - H T 2 r e c e p t o r s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - i n d u c e d c o n t r a c t i o n o f c a n i n e b a s i l a r a r t e r y . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l . 3 2 4 : 2 8 7 - 2 9 2 . M u l v a n y , M . J . ( 1 9 8 6 ) . V a s c u l a r e f f e c t s o f a l t e r e d s o d i u m , p o t a s s i u m p u m p a c t i v i t y . S c a n d . J . C l i n . L a b . I n v e s t . [ S u p p l ] 1 8 0 : 4 0 - 4 8 . N a b i k a , T . , V e l l e t r i , P . A . , L o v e n b e r g , W . a n d B e a v e n , M . A . ( 1 9 8 5 ) . I n c r e a s e i n c y t o s o l i c c a l c i u m a n d p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m i n d u c e d b y a n g i o t e n s i n I I a n d [ A r g ] v a s o p r e s s i n i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 4 6 6 1 - 4 6 7 0 . N a k a o , K . , O k a b e , K . K i t a m u r a , K . , K u r i y a m a , H . a n d W e s t o n , A . H . ( 1 9 8 8 ) . C h a r a c t e r i s t i c s o f c r o m a k a l i m - i n d u c e d r e l a x a t i o n s i n t h e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f g u i n e a - p i g m s e n t e r i c a r t e r y a n d v e i n . B r . J . P h a r m a c . 9 5 : 7 9 5 - 8 0 4 . N e l s o n , M . T . , S t a n d e n , N . B . , B r a y d e n , J . E . a n d W o r l e y , 3 . F . ( 1 9 8 8 ) . N o r a d r e n a l i n e c o n t r a c t s a r t e r i e s b y a c t i v a t i n g v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s . N a t u r e . 3 3 6 : 3 8 2 - 3 8 5 . N e l s o n , M . , P a t l a k , 3 . , W o r l e y , J . a n d S t a n d e n , N . ( 1 9 9 0 ) . C a l c i u m c h a n n e l s , p o t a s s i u m c h a n n e l s a n d t h e v o l t a g e d e p e n d e n c e o f a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e t o n e . A m . J . P h y s i o l . 2 5 9 : C 3 - C 1 8 . N i s h i k a w a , M . S h i r a k a w a , S a n d A d e i s t e i n , R . S . ( 1 9 8 5 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e b y p r o t e i n k i n a s e C . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 8 9 7 8 - 8 9 8 3 . N i s h i k a w a , M . , d e L a m e r o l l e , P . , L i n c o l n , T . a n d A d e l s t e i n , R . A . ( 1 9 8 4 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f m a m m a l i a n m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e s b y t h e c a t a l y t i c s u b u n i t o f c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d b y c y c l i c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 8 4 2 9 - 8 4 3 6 . N i s h i z u k a , Y . ( 1 9 8 8 ) . T h e m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y o f p r o t e i n k i n a s e C a n d i t s i m p l i c a t i o n s f o r c e l l u l a r r e g u l a t i o n . N a t u r e . 3 3 4 : 6 6 1 - 6 6 6 . N o b l e , D . ( 1 9 8 4 ) . T h e s u r p r i s i n g h e a r t : a r e v i e w o f r e c e n t p r o g r e s s i n c a r d i a c e l e c t r o p h y s i o l o g y . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 3 : 1 5 6 - 1 5 9 . N o m a , A . ( 1 9 8 3 ) . A T P - r e g u l a t e d K + c h a n n e l s i n c a r d i a c m u s c l e . N a t u r e 3 0 5 : 1 4 7 - 1 4 8 . N o r t h , R . A . ( 1 9 8 9 ) . D r u g r e c e p t o r s a n d t h e i n h i b i t i o n o f n e r v e c e l l s . B r . J . P h a r m a c . 9 3 : 1 3 - 2 8 . O h r n o r i , H . , Y o s h i d a , S . a n d H a g i w a r a , S . ( 1 9 8 1 ) . S i n g l e K c h a n n e l c u r r e n t s o f a n o m a l o u s r e c t i f i c a t i o n i n c u l t u r e d r a t m y o t u b e s . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A 7 8 : 4 9 6 0 - 4 9 6 4 . 2 0 7 O h y a , Y . , T e r a d a , K . , K i t a m u r a , K . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) . M e m b r a n e c u r r e n t s r e c o r d e d f r o m a f r a g m e n t o f r a b b i t i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e c e l l . A m . J . P h y s i o l . 2 5 1 : C 3 5 5 - C 3 4 6 . O k a b e , K . , K i t a m u r a , K . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 7 ) . F e a t u r e s o f 4 - a m i n o p y r i d i n e s e n s i t i v e o u t w a r d c u r r e n t o b s e r v e d i n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s f r o m t h e r a b b i t p u l m o n a r y a r t e r y . P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : 5 6 1 - 5 6 8 . O w e n s , G . K . , L o e b , A . , G o r d o n , D . , a n d T h o m p s o n , M . M . ( 1 9 8 6 ) . E x p r e s s i o n o f s m o o t h m u s c l e s p e c i f i c - i s o a c t i n i n c u l t u r e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s : R e l a t i o n s h i p b e t w e e n g r o w t h a n d c y t o d i f f e r e n t i a t i o n . 3 . C e l l . B i o l . 1 0 2 : 3 4 3 - 3 5 2 . P a l l o t t a , B . S . , M a g l e b y , K . L . a n d B a r r e t t , J . N . ( 1 9 8 1 ) . S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s o f a Ca2+ - a c t i v t e d K + c u r r e n t i n r a t m u s c l e c e l l c u l t u r e . N a t u r e 2 9 3 : 4 7 1 - 4 7 4 . P a l m e r , R . M . 3 . , F e r r i g e , A . G . a n d M o n c a d a , S . ( 1 9 8 7 ) . N i t r i c o x i d e r e l e a s e a c c o u n t s f o r t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r . N a t u r e . 3 2 7 : 5 2 4 - 5 2 6 . P a s m u s s e n , H . , T a k u w a , Y . a n d P a r k , S . ( 1 9 8 7 ) . P r o t e i n k i n a s e C i n t h e r e g u l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n . F A S E B 3 . 1 : 1 7 7 - 1 8 5 . P a y n e , M . E . , E l i z i n g a M . a n d A d e i s t e i n . R . A . ( 1 9 8 6 ) . S m o o t h m u s c l e m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e : A m i n o a c i d s e q u e n c e a t t h e s i t e p h o s p h o r y l a t e d b y a d e n o s i n e c y c l i c 3 ’ , 5 ’ - p h o s p h a t e d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e w h e t h e r o r n o t c a l m o d u l i n i s b o u n d . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 6 3 4 6 - 1 6 3 5 0 . P e a c h , M . J . , L o e b , A . L . , S i n g e r , H . A . a n d S a y e , J . ( 1 9 8 5 ) . E n d o t h e l i u m - d e r i v e d v a s c u l a r r e l a x i n g f a c t o r . H y p e r t e n s i o n 7 ( s u p p l 1 ) : 1 9 4 - 1 1 0 0 . P e n n e f a t h e r , P . , L a n c a s t e r , B . , A d a m s , P . R . a n d N i c o l l , R . A . ( 1 9 8 5 ) . T w o d i s t i n c t C a - d e p e n d e n t K c u r r e n t s i n b u l l f r o g s y m p a t h e t i c g a n g l i o n c e l l s . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A 8 2 : 3 0 4 0 - 3 0 4 4 . P e r o u t k a , S . J a n d S n y d e r , S . H . ( 1 9 7 9 ) . M u l t i p l e s e r o t o n i n r e c e p t o r s : D i f f e r e n t i a l b i n d i n g o f 3 H 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e , 3 H l y s e r g i c a c i d d i e t h y l a m i d e a n d 3 H s p i r o p e r i d o l . M o l . P h a r m a c o l . 1 6 : 6 8 7 - 6 9 9 . P e r o u t k a , S . J . ( 1 9 8 7 ) . S e r o t o n i n r e c e p t o r s . I n P s y c h o p h a r m a c o l o g y , e d . H . Y . M e l t z e r , p p 3 0 3 - 3 1 1 , R a v e n P r e s s , N e w Y o u k . P e r o u t k a , S . 3 . a n d K u h a r , M . J . ( 1 9 8 4 ) . A u t o r a d i o g r a p h i c l o c a l i z a t i o n o f 5 - H T 1 r e c e p t o r s t o h u m a n a n d c a n i n e b a s i l a r a r t e r i e s . B r a i n R e s . 3 1 0 : 1 9 3 - 1 9 6 . P e r o u t k a , S . J . a n d S n y d e r , S . H . ( 1 9 7 9 ) . M u l t i p l e s e r o t o n i n r e c e p t o r s : D i f f e r e n t i a l b i n d i n g o f 3 H - 5 - H T , 3 H - L S D a n d 3 1 - i - s p i r o p e r i d o l . M o l . P h a r m a c o l . 1 6 : 6 8 7 - 6 9 5 . P e r o u t k a , S . J . , N o g u c h i , M . , T o l n e r , D . 3 . , A l l e n , G . S . ( 1 9 8 3 ) . S e r o t o n i n - i n d u c e d c o n t r a c t i o n o f c a n i n e b a s i l a r a r t e r y : m e d i a t i o n b y 5 - H T 1 r e c e p t o r s . B r a i n R e s 2 5 9 : 3 2 7 - 3 3 0 . P e t e r s e n , 0 . H . a n d M a r u y a m a , Y . ( 1 9 8 4 ) . C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s a n d t h e i r r o l e i n s e c r e t i o n . N a t u r e 3 0 7 : 6 9 3 - 6 9 6 . 2 0 8 P r i t c h a r d , K . a n d A s h l e y , C . C . ( 1 9 8 6 ) . N a + / C a2 + e x c h a n g e i n i s o l a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s d e m o n s t r a t e d b y t h e f l u o r e s c e n t c a l c i u m i n d i c a t o r f u r a - 2 . F E B S . 1 9 5 : 2 3 - 2 7 . R a p p o r t , M . M . , G r e e n , A . A . a n d P a g e , I . H . ( 1 9 4 8 ) . S e r u m v a s o c o n s t r i c t o r ( s e r o t o n i n ) . I V . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . J . B i o l . C h e m . , 1 7 6 : 1 2 4 3 - 1 2 5 1 . R e m b o l d , C . M . a n d M u r p h y R . A . ( 1 9 8 8 ) . M y o p l a s m i c [ C a2+ ] d e t e r m i n e s m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n a g o n i s t - s t i m u l a t e d s w i n e a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e . C i r c . R e s . 6 3 : 5 9 3 - 6 0 3 . R h o d i n , J . A . G . ( 1 9 8 0 ) . A r c h i t e c t u r e o f t h e v e s s e l w a l l . I n H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y . T h e C a r d i o v a s c u l a r S y s t e m . V a s c u l a r S m o o t h M u s c l e . B e t h e s d a , M D : A m . P h y s i o l . S o c . s e c t . 2 , v o l . I I , c h a p t . 1 , p . 1 - 3 1 . R o d g e r , I . W . a n d S m a l l , R . C . ( 1 9 9 1 ) . P h a r m a c o l o g y o f a i r w a y s m o o t h m u s c l e . I n h a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y : P h a r m a c o l o g y o f A s t h m a . e d . B a r n e s , P . J . a n d P a g e , C . P . B e r l i n : S p r i n g e r - V e r l a g . R o m e y , G . a n d L a z d u n s k i , M ( 1 9 8 4 ) . T h e c o e x i s t e n c e i n r a t m u s c l e c e l l s o f t w o d i s t i n c t c l a s s e s o f C a 2 + - d e p e n d e n t K + c h a n n e l s w i t h d i f f e r e n t p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s a n d d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 1 8 : 6 6 9 - 6 7 4 . R o s e , G . G . ( 1 9 7 0 ) . A t l a s o f V e r t e b r a t e C e l l s i n T i s s u e C u l t u r e . p p . 1 1 9 - 1 3 1 . A c a d e m i c P r e s s , I n c . N e w Y o r k . R o s s , M . a n d R e i t h . E . ( 1 9 8 5 ) . H i s t o l o g y : A T e x t a n d A t l a s . H a r p e r & R o w . N e w Y o r k . S a d o s h i m a , J . A k a i k e , N . , K a n a i d e , H . a n d N a k a m u r a , M . ( 1 9 8 8 ) . C a - a c t i v a t e d K c h a n n e l i n c u l t u r e d s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a t a o r t i c m e d i a . A m . J . P h y s i o l . 2 5 5 : H 4 1 0 - H 4 1 8 . S a k m a n n , B . t n d N e h e r , E . ( 1 9 8 3 ) . G e o m e t r i c p a r a m e t e r s o f p i p e t t e s a n d m e m b r a n e p a t c h e s . i n S i n g l e - C h a n n e l R e c o r d i n g . ( e d ) S a k m a n n , B . & N e h e r , E . P l e n u m , N e w Y o r k p p . 3 7 - 5 2 S c h m i d t , A . W . a n d P e r o u t k a , S . J . ( 1 9 8 9 ) . 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e r e c e p t o r “ f a m i l i e s ” . F A S E B J o u r n a l 3 : 2 2 4 2 - 2 2 4 9 . S c h u s t e r , S . A . , C a m a r d o , J . S . , S i e g e l b a u m , S . A . a n d K a n d e l , E . R . ( 1 9 8 5 ) . C y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e c l o s e s t h e s e r o t o n i n - s e n s i t i v e K + c h a n n e l s o f A p l y s i a s e n s o r y n e u r o n s i n c e l l - f r e e m e m b r a n e p a t c h e s . N a t u r e 3 1 3 : 3 9 2 - 3 9 5 . S e l l e r s , J . ( 1 9 8 5 ) . M e c h a n i s m o f t h e p h o s p h o r y l a t i o n - d e p e n d e n t r e g u l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e h e a v y a u t o m y o s i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 5 8 1 5 - 1 5 8 1 9 . S h o e m a k e r , R . L . a n d W o r r e l l , R . T . ( 1 9 9 1 ) . C a+ - s e n s i t i v e K + c h a n n e l i n a o r t i c s m o o t h m u s c l e o f r a t s . J o u r n a l P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y f o r E x p e r i m e n t a l B i o l o g y & M e d i c i n e . 1 9 6 : 3 2 5 - 3 3 2 . S h u b a , M . F . ( 1 9 8 1 ) . S m o o t h m u s c l e o f t h e u r e t e r : t h e a c t i o n o f e x c i t a t i o n a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f c a t e c h o l a r n i n e s a n d h i s t a m i n e . I n : S m o o t h M u s c l e : A n 2 0 9 A s s e s s m e n t o f C u r r e n t K n o w l e d g e , p p . 3 7 7 - 3 8 4 , e d . B u i b r i n g , E . , B r a d i n g , A . F . , J o n e s , J o n e s , A . W . a n d T o m i t a , T . ( e d s ) A r n o l d , L o n d o n . S h u b a , M . F . a n d V i a d i m i r o v a , I . A . ( 1 9 8 0 ) . E f f e c t o f a p a m i n o n t h e e l e c t r i c a l r e s p o n s e s o f s m o o t h m u s c l e t o a d e n o s i n e 5 ’ - t r i p h o s p h a t e a n d t o n o n - a d r e n e r g i c , n o n - c h o l i n e r g i c n e r v e s t i m u l a t i o n . N e u r o s c i e n c e 5 : 8 5 3 - 8 5 9 . S i e g e l b a u m , S . A . , C a m a r d o , J . S . a n d K a n d e l , E . R . ( 1 9 8 2 ) . S e r o t o n i n a n d c y c l i c A M P c l o s e s i n g l e K c h a n n e l s i n A p l y s i a s e n s o r y n e u r o n e s . N a t u r e 2 9 9 : 4 1 3 - 4 1 7 . S i g w o r t h , F . J . a n d S i n e , S . M . ( 1 9 8 7 ) . D a t a t r a n s f o r m a t i o n f o r i m p r o v e d d i s p l a y a n d f i t t i n g o f s i n g l e - c h a n n e l d w e l l t i m e h i s t o g r a m e . B i o p h y . J . 5 2 : 1 0 4 7 - 1 0 5 4 . S i l b e r b e r g , S . D . a n d v a n B r e e m e n , C . ( 1 9 9 0 ) . A n A T P , c a l c i u m a n d v o l t a g e s e n s i t i v e p o t a s s i u m c h a n n e l i n p o r c i n e c o r o n a r y a r t e r y s m o o t h m u s c l e c e l l s . B i o c h e m i c a l a n d B i o p h y s i c a l R e s e a r c h C o n m i n u n i c a t i o n s . 1 7 2 : 5 1 7 - 5 2 2 . S i m s , S . M . , S i n g e r , J . J . a n ’ J W a l s h , J . V . J r . ( 1 9 8 5 ) . C h o l i n e r g i c a g o n i s t s s u p p r e s s a p o t a s s i u m c u r r e n t i n f r e s h l y d i s s o c i a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e t o a d . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 6 7 : 5 0 3 - 5 2 7 S i n g e r , J . J . a n d W a l s h , J . V . ( 1 9 8 7 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s u s i n g t h e p a t c h - c l a m p t e c h n i q u e . P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : 9 8 - 1 1 1 . S k a l l e , 0 . , R o p r a z , P . , T r z e c i a k , A . , B e n z o n a n a , G . , G i l l e s s i n , D . a n d G a b b i a n i , G . ( 1 9 8 6 ) . A m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t a - s m o o t h m u s c l e a c t i n : A n e w p r o b e f o r s m o o t h m u s c l e d i f f e r e n t i a t i o n . J . C e l l . B i o l . 1 0 3 : 2 7 8 7 - 2 7 9 6 . S o m l y o , A . P . a n d H i m p e n s , B . ( 1 9 8 9 ) . C e l l c a l c i u m a n d i t s r e g u l a t i o n i n s m o o t h m u s c l e . F A S E B J . 3 : 2 2 6 6 - 2 2 7 6 . S o m l y o , A . P . , S o m l y , A . V . , S h u m a n , H . a n d S t e w a r t , M . ( 1 9 7 9 ) . E l e c t r o n p r o b e a n a l y s i s o f m u s c l e a n d x - r a y m a p p i n g o f b i o l o g i c a l s p e c i m e n t s w i t h a f i e l d e m i s s i o n g u n . S c a n . E l e c t r o n . M i c r o s c . 3 : 7 1 1 - 7 2 2 . S o m l y o , A . V . ( 1 9 8 0 ) . U l t r a s t r u c t u r e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . I n : H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y . T h e C a r d i o v a s c u l a r S y s t e m . V a s c u l a r S m o o t h M u s c l e . B e t h e s d a , M D : A m . P h y s i o l . S o c . s e c t . 2 , v o l . I I , c h a p t . 2 , p .3 3-6 7. S p a t z , M . , D o d s o n , R . F . a n d B e m b r y , J . ( 1 9 8 3 ) . C e r e b r o v a s c u l a r m u s c l e c u l t u r e s . 1 . I s o l a t i o n , g r o v t h a n d m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n . B r a i n R e s . 2 8 0 : 3 8 7 - 3 9 1 . S p e r e l a k i s , N . , a n d O h y a , Y . ( 1 9 8 9 ) . E l e c t r o p h y s i o l o g y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . P h y s i o l o g y a n d p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e h e a r t . 2 n d e d . E d i t e d b y N . S p e r e l a k i s . K l u w e r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , N o r w e l l , M A . p p . 7 7 3 - 8 1 2 . S q u i r e , L . G . a n d P e t e r s e n , 0 . H . ( 1 9 8 7 ) . M o d u l a t i o n o f C a2+ - a n d v o l t a g e - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s b y i n t e r n a l M g2+ i n s a l i v a r y a c i n a r c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 8 9 9 : 1 7 1 - 1 7 5 . S t a n d e n , N . B . , Q u a y l e , J . M . , D a v i e s , N . W . , B r a y d e n , J . E . , H u a n g , Y . a n d N e l s o n , M . T . ( 1 9 8 9 ) . H y p e r p o l a r i z i n g v a s o d i l a t o r s a c t i v a t e A T P - s e n s i t i v e K + c h a n n e l s i n a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e . S c i e n c e 2 4 5 : 1 7 7 - 1 8 0 . 2 1 0 S t a n d e n , N . B . , S t a n f i e l d , P . R . a n d W a r d , T . A . ( 1 9 8 5 ) . P r o p e r t i e s o f s i n g l e p o t a s s i u m c h a n n e l s i n v e s L i e s f r o m t h e s a r c o l e m m a o f f r o g s k e l e t a l m u s c l e . J . P h y s i o l . ( L a n d . ) 3 6 4 : 3 3 9 - 3 5 8 . S t e e l e , J . A . S t o c k b r i d g e , N . , M a l k o v i c , G . a n d W e i r , B . ( 1 9 9 1 ) . F r e e r a d i c a l s m e d i a t e a c t i o n s o f o x y h e m o g l o b i n o n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . C i r c . R e s . 6 8 : 4 1 6 - 4 2 3 . S t o c k b r i d g e , N . ( 1 9 8 7 ) E G T A . C o m p u t . B i o l . M e d . 1 7 : 2 9 9 - 3 0 4 . S t u r e k , M . a n d H e r m s m e y e r , K . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m a n d s o d i u m c h a n n e l s i n s p o n t a n e o u s l y c o n t r a c t i n g v a s c u l a r m u s c l e c e l l s . S c i e n c e 2 3 3 : 4 7 5 - 4 7 8 . S u p r e n a n t , A . , N e i l d , T . O . a n d H o l m a n , M . E . ( 1 9 8 7 ) . M e m b r a n e p r o p e r t i e s o f r a b b i t b a s i l a r a r t e r i e s a n d t h e i r r e s p o n s e s t o t r a n s m u r a l s t i m u l a t i o n . P f l u g e r s A r c h i v . 4 1 0 : 9 2 - 1 0 1 . S u t t e r , M . C . ( 1 9 9 0 ) . T h e m e s e n t e r i c - p o r t a l v e i n i n r e s e a r c h . P h a r m a c o l o g i c a l R e v i e w s . 4 2 : 2 8 7 - 3 2 5 . S u z u k i , H . a n d F u j i w a r a , S . ( 1 9 8 2 ) . N e u r o g e n i c e l e c t r i c a l r e s p o n s e s o f s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e d o g m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y . C i r c u l a t i o n R e s e a r c h 5 1 : 7 5 1 - 7 5 9 . T a k a t a , S . , H i r a t a , Y . , T a k g i , Y . , Y o s h i m i , H . , F u k u d u , Y . a n d F u j u t a , T . ( 1 9 8 8 ) . P h o r b o l e s t e r m o d u l a t e s s e r o t o n i r i r e c e p t o r - m e d i a t e d i n c r e a s e s i n i n o s i t o l p h o s p h a t e p r o d u c t i o n a n d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n i n c u l t u r e d r a t v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . F E B S L e t t e r s 2 3 4 : 2 2 8 - 2 3 0 . T a y l o r , D . A . , B o w m a n , B . F . a n d S t u l l , J . T . ( 1 9 8 9 ) . C y t o p l a s m i c C a2+ i s a p r i m a r y d e t e r m i n a n t f o r m y o s i n p h o s p h o r y l a t i o n i n s m o o t h m u s c l e c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 6 2 7 0 - 6 2 1 3 . T a y l o r , P . S . ( 1 9 8 7 ) . S e l e c t i v i t y a n d p a t c h m e a s u r e m e n t s o f A - c u r r e n t c h a n n e l s i n H e l i x a s p e r s a n e u r o n s . J . P h y s i o l ( L o n d . ) 3 8 8 : 4 3 7 - 4 4 7 . T o m i t a , T . ( 1 9 6 6 ) . E l e c t r i a l r e s p o n s e s o f s m o o t h m u s c l e t o e x t e r n a l s t i m u l a t i o n i n h y p e r t o n i c s o l u t i o n . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 1 8 3 : 4 5 0 - 4 6 8 . T o m i t a , T . ( 1 9 8 2 ) . I o n i c b a s i s o f s m o o t h m u s c l e a c t i o n p o t e n t i a l s . I n : H a n d b o o d o f E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y , e d . b y B e r t a c c i n i , G . , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n . p p . ’ 7 9 - 1 1 5 . T o m i t a , T . ( 1 9 8 8 ) . I o n i c c h a n n e l s i n s m o o t h m u s c l e s t u d i e d w i t h p a t c h - c l a m p m e t h o d s . J a p a n . J . P h y s i o l . 3 8 : 1 - 1 8 . T o r o , L . , G o n z a l e z - R o h l e s . A . a n d S t e f a n i , E . ( 1 9 8 6 ) . E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s a n d m o r p h o l o g y o f s i n g l e v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s i n c u l t u r e . A m . J . P h y s i o l . 2 5 1 : C 7 6 3 - 7 7 3 . T s i e n , R . Y . ( 1 9 8 8 ) . F l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t a n d p h o t o c h e m i c a l m a n i p u l a t i o n o f c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m . T r e n d s . N e u r . S c i . 1 1 : 4 1 9 - 4 2 4 . 2 1 1 V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 2 ) . 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e , v a s o s p a s m a n d h y p e r t e n s i o n . I n 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e a n d P e r i p h e r a l R e a c t i o n s , e d . F . D e C l e r c k , P . M . V a n h o u t t e , p p . 1 6 3 - 1 7 4 . N e w Y o r k : R a v e n . V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 3 ) . 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e a n d v a s c u l a r d i s e a s e . F e d . P r o c . 4 2 : 2 3 3 - 3 7 . V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 5 ) . P e r i p h e r a l s e r o t o n e r g i c r e c e p t o r s a n d h y p e r t e n s i o n . I n S e r o t o n i n a n d t h e C a r d i o v a s c u ’ a r S y s t e m , e d . b y P . M . V a n h o u t t e , p p . 1 2 3 - 1 3 4 . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . V a n h o u t t e , P . M . , V e r b e u r e n , T . J . a n d W e b b , R . C . ( 1 9 8 1 ) . L o c a l m o d u l a t i o n o f a d r e n e r g i c n e u r o e f f e c t o r i n t e r a c t i o n i n t h e b l o o d v e s s e l w a l l . P h y s i o l . R e v . 6 1 : 1 5 1 - 2 4 7 . V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 1 ) . C o n t r o l o f V a s c u l a r F u n c t i o n . E a r l H . W o o d S c i e n t i f i c S y m p o s i u m . p p . 2 0 - 2 7 . V e r g a r a , C . a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 3 ) . K i n e t i c s o f C a2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l s f r o m r a b b i t m u s c l e i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a r l i p i d b i l a y e r s : e v i d e n c e f o r a C a2+ a n d B a2+ b l o c k a d e . J . G e n . P h y s i o l . 8 2 : 5 4 3 - 5 6 8 . V e r g a r a , C . , M o c z y d l o w s k i , E . a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 4 ) . C o n d u c t i o n , b l o c k a d e , a n d g a t i n g i n a C a2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a r b i l a y e r s . B i o p h y s . J . 4 5 : 7 3 - 7 6 . V r o l i x , M . R a e y m a e k e r s , L . a n d W u y t a c k F . ( 1 9 8 8 ) . C y c l i c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s t i m u l a t e s t h e p l a s m a l e m m a l C a2+ - p u m p o f s m o o t h m u s c l e v i a p h o s p h o r y l a t i o n o f p h o s p h a t i d y l - i n o s i t o l . B i o c h e m . J . 2 5 5 : 8 5 5 - 8 6 3 . W a g o n e r , P . K . a n d O x f o r d , C . S . ( 1 9 8 7 ) . C a t i o n p e r m e a t i o n t h r o u g h t h e v o l t a g e - d e p e n d e n t p o t a s s i u m c h a n ’ e l i n t h e s q u i d a x o n . C h a r a c t e r i s t i c s a n d m e c h a n i s m s . 3 . G e n . P h y s i o l . 9 0 : 2 6 1 - 2 9 0 . W a h i s t r o m , B . ( 1 9 7 1 ) . T h e e f f e c t o f c h a n g e s i n t h e i o n i c e n v i r o n m e n t o n v e n o u s s m o o t h m u s c l e d i s t r i b u t i o n o f s o d i u m a n d p o t a s s i u m . A c t a . P h y s i o l . S c a n d . 8 2 : 3 8 2 - 3 9 2 . W a n g , Y . a n d M a t h e r s , D . A . ( 1 9 9 1 ) . H i g h s e n s i t i v i t y t o i n t e r n a l t e t r a e t h y l a m m o n i u m i n K ( C a ) c h a n n e l s o f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s . 1 3 2 : 2 2 2 - 2 2 4 . W a n g , 3 . , B a i m b r i d g e , K . G . , a n d L e u n g , P . C . K . ( 1 9 8 9 ) . C h a n g e s i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i o n c o n c e n t r a t i o n s i n i n d i v i d u a l r a t g r a n u l o s a c e l l s : E f f e c t o f l u t e i n i z i n g h o r m o n e - r e l e a s i n g h o r n i o n e . E n d o c r i n o l o g y . I n P r e s s . W a r r e n , 3 . B . ( 1 9 9 0 ) . T h e E n d o t h e l i u m . W i l e y - L i s s , I n c . N e w Y o r k . W a t e r s , A . a n d H a r d e r , D . R . ( 1 9 8 5 ) . A l t e r e d m e m b r a n e p r o p e r t i e s o f c e r e b r a l v a s c u l a r m u s c l e f o l l o w i n g s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e i n c a t : a n e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d y . S t r o k e 1 6 : 9 9 0 - 9 9 7 . W e i n r e i c h , D . ( 1 9 8 6 ) . B r a d y k i n i n i n h i b i t s a s l o w s p i k e a f t e r h y p e r p o l a r i s a t i o n i n v i s c e r a l s e n s o r y n e u r o n s . N a t u r e 3 3 0 : 6 5 3 - 6 5 5 . 2 1 2 W i l k i n s , R . H . 1 9 8 0 . C e r e b r a l A r t e r i a l S p a s m . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e . W i l l i a m s , D . L . , K a t z , G . M . , R o y - C o n t a n c i n , L . a n d R e u b e n , J . P . ( 1 9 8 8 ) . G u a n o s i n e 5 ’ - m o n o p h o s p h a t e m o d u l a t e s g a t i n g o f h i g h - c o n d u c t a n c e C a 2 + - a c t i v a t e d K + c h a n n e l s i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U . S . A . 8 5 : 9 3 6 0 - 9 3 6 4 . W i l l i a m s , D . A . , F o g a r t y , K . E . , T s i e n , R . Y . , a n d F a y , F . S . ( 1 9 8 5 ) . C a l c i u m g r a d i e n t s i n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s r e v e a l e d b y t h e d i g i t a l i m a g i n g m i c r o s c o p e u s i n g F u r a 2 . N a t u r e 3 1 8 : 5 5 8 - 5 6 1 . W o n g , B . S . a n d A d l e r . M . ( 1 9 8 6 ) . T e t r a e t h y l a m m o n i u m b l o c k a d e o f c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c l o n a l a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l l s . P f l u g e r s A r c h . 4 0 7 : 2 7 9 - 2 8 4 . W o n g , B . S . L e c a r , F T . a n d A d l e r , M . ( 1 9 8 2 ) . S i n g l e c a l c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c l o n a l a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l l s . B i o p h y s . J . 3 9 : 3 1 3 - 3 1 7 . W o o d h u l l , A . M . ( 1 9 7 3 ) . I o n i c b l o c k a g e o f s o d i u m c h a n n e l s i n n e r v e . J . G e n . P h y s i o l . 6 1 : 6 8 7 - 7 0 8 . Y a m a m o t o , Y a n d H o t t a , K . ( 1 9 8 6 ) . E l e c t r i c a l r e s p o n s e s o f t h e s m o o t h m u s c l e o f t h e g u i n e a - p i g c e r e b r a l a r t e r y t o b r i e f e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n . J a p a n . J . P h y s i o l . 3 6 : 7 7 - 9 0 . Y a g i , S . B e c k e r , P . C . a n d F a y , F . S . ( 1 9 8 8 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n f o r c e a n d C a2+ c o n c e n t r a t i o n i n s m o o t h m u s c l e a s r e l e a s e d b y m e a s u r m e n t o n s i n g l e c e l l s . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A 8 5 : 4 1 0 9 - 4 1 1 3 . Y a n a g i s a w a , M . , K u r i h a r a , H . , K i m u r a , S . e t a l . ( 1 9 8 8 ) . A n o v e l p o t e n t v a s o c o n s t r i c t o r p e p t i d e p r o d u c e d b y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . N a t u r e . 3 2 : 4 1 1 - 4 1 5 . Y e l l e n , G . ( 1 9 8 4 a ) . I o n i c p e r m e a t i o n a n d b l o c k a d e i n Ca2+ - a c t i v t e d K + c h a n n e l s o f b o v i n e c h r o m a f f i n c e l l s . J . G e n . P h y s i o l . 8 4 : 1 5 7 - 1 8 6 . Y e l l e n , G . ( 1 9 8 4 b ) . R e l i e f o f N a + b l o c k o fCa2± - a c t i v t e d K + c h a n n e l s b y e x t e r n a l c a t i o n s . J . G e n . P h y s i o l . 8 4 : 1 8 7 - 1 9 9 . Y e l l e n , G . , J u r m a n , M . E . , A b r a m s o n , T . a n d M a c K i n n o n , R . ( 1 9 9 1 ) . M u t a t i o n s a f f e c t i n g i n t e r n a l T E A b l o c k a d e i d e n t i f y t h e p r o b a b l e p o r e - f o r m i n g r e g i o n o f a K + c h a n n e l . S c i e n c e 2 5 1 : 9 3 9 - 9 4 2 . Y o u n g , A . R . , H a m e l , E . , a n d M a c k e n z i e , E . T . ( 1 9 8 6 ) . R e c e n t s t u d i e s o n t h e s e r o t o n e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o n : a r e v i e w . I n N e u r a l R e g u l a t i o n o f B r a i n C i r c u l a t i o n . e d . b y C . O w m a n a n d J . E . H a r d e b o . E l s e v i e r , A m s t e r d a m . p p . 1 9 5 - 2 1 7 . Y o u n g , A . R . , M a c k e n z i e , E . T . , S e y l e z , J . , a n d V e r r e c c h i a , C . ( 1 9 8 6 ) . R e c e p t o r s i n v o l v e d i n t h e 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - i n d u c e d c o n t r a c t i o n o f i s o l a t e d c e r e b r a l a r t e r i e s . A c t a P h y s i o l . S c a n d . 1 2 7 : 5 4 - 5 7 . 2 1 3 Z h a n g , H . , S t o c k b r i d g e , N . , W e i r , B . , K r u e g e r , C . a n d C o o k , P . ( 1 9 9 1 ) . G l i b e n c l a m i d e r e l a x e s v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n p r o d u c e d b y p r o s t a g l a n d i n F 2 a l p h a . E u r o p e a n J . o f S u r g e r y . 1 9 5 : 2 7 - 3 5 . 2 1 4

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