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CA²⁺-activated potassium channels in smooth muscle cell from cerebral artery of adult rat Wang, Yihong 1992

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CA2+ACTIVATED POTASSIUM CHANNELS IN SMOOTH MUSCLECELL FROM CEREBRAL ARTERY OF ADULT RATByYIHONG WANGM. D., Beijing Second Medical College, 1983M. Sc., Peking Union Medical College, 1985A THESIS SUBMIT thD IN PARTIAL FULFILLMENT OFTHE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OFDOCTOR OF PHILOSOPHYinTHE FACULTY OF GRADUATE STUDIESFACULTY OF MEDICINEDEPARTMENT OF PHYSIOLOGYWe accept this thesis as conforming the required standardTHE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIAApril 1992© Yihong Wang, 1992In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanceddegree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make itfreely available for reference and study. I further agree that permission for extensivecopying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of mydepartment or by his or her representatives. It is understood that copying orpublication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my writtenpermission.Department of ph f(( 7The University of British ColumbiaVancouver, CanadaDate__________________DE-6 (2/88)A b s t r a c tP a t c h c l a m p m e t h o d s w e r eu s e d t o s t u d y t h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e so fC a2+- a c t i v a t e d p o t a s s i u m( K C a )c h a n n e l s i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s( C V S M C s )d e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a la r t e r i e so fa d u l t r a t s . P r o c e d u r e s w e r ed e v e l o p e d f o r t h e e n z y m a t i c d i s s o c i a t i o n o f C V S M C s f r o m c e r e b r a la r t e r i e s .D i s s o c i a t e d c e l l s w e r e m a i n t a i n e da t4 ° C o r c u l t u r e da t 3 7 ° Cf o r 1 - 3d a y s p r i o rt ou s e .C V S M C s w e r e i d e n t i f i e d u s i n gam o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t hm u s c l ea- a c t i n . T h ec a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t p r o b ef u r a - 2 w a s e m p l o y e dt om e a s u r e t h t r e s t i n g a n d s e r o t o n i n ( 5 - H T ) s t i m u l a t e d l e v e l s o f f r e e i n t r a c e l l u l a rc a l c i u m ,[ C a2+]i n t h e s e c e l l s .A r e s t i n g [ C a2+ ] il e v e l o f4 1 j5 . 6n M w a s o b t a i n e d f r o mat o t a l o f 1 1 0C V S M C s i n c u l t u r e . S e r o t o n i n ( 5 - H T , 1 0 n Mt o1 0 0 M ) i n d u c e da t r a n s i e n ti n c r e a s e o f[ C a2+J ia b o v e r e s t i n g l e v e l s . T h e e f f e c t s o f t h r e e k n o w nb l o c k e r s o fv o l t a g e - d e p e n d e n t C a2+c h a n n e l s , n i f e d i p i n e , L a 3+a n dC o2+w e r e t e s t e db yc o a p p l i c a t i o nw i t h5 - H T .I tw a sf o u n d t h e n e i t h e r 1 0 m M L a C 1 3n o r 1 0 m MC 0 C 1 2r e d u c e d t h e r i s e i n[ C a2+f te v o k e db ya p p l i c a t i o n o f 1p . .M5 - H T .N i f e d i p i n e ( 1 0 M ) a l s o f a i l e dt os i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h e r i s e i n[ C a2+ ] ia c t i v a t e db y1 M 5 - H T .T h e e f f e c t s o f t h e p a r t i a l l y s e l e c t i v e5 - H T 2r e c e p t o r a n t a g o n i s t ,k e t a n s e r i n( 5n M )r e v e r s i b l y a t t e n u a t e d t h e 5 - H T r e s p o n s ei n a l l c e l l st e s t e d .T h ee f f e c t o f 5 - H T o n [ C a2+J iw a sc l e a r l yd o s e - d e p e n d e n t a n d t h e c o n c e n t r a t i o no f5 -H T p r o d u c i n g ah a l f - m a x i m a l i n c r e a s e i n[ C a2+ ] iw a s f o u n dt o b e1 0 n M .D u r i n g c e l l - a t t a c h e dp a t c h c l a m pr e c o r d i n g s f r o m C V S M C s k e p ta t4 ° Cu n t i l u s e ,5 - H T ( 1 - 1 0p .M ) i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f i n w a r d l yd i r e c t e d ,8- 1 0 p As i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s s t u d i e da t ap i p e t t e p o t e n t i a l o f0m V . 5 - H T( 1 0 - 1 0 0 p . M )a l s o i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f b r i e f b i p h a s i c c u r r e n t s p i k e s w i t hp e a k - t o - p e a ka m p l i t u d e o f 1 0 p A .T h e s e o b s e r v a t i o n si n d i c a t e t h a t i s o l a t e dC V S M C s r e t a i n e dUe l e c t r o - r e s p o n s i v e n e s st o5 - H T a f t e r 2 - 3d a y s i nv i t r o . D u r i n gw h o l e - c e l l , c u r r e n tc l a m p r e c o r d i n g s f r o m t h e s e c e l l s , t h e r e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a l o f C V S M C sw a s f o u n d t o b e- 4 1±1 1 . 7 m V . A p p l i c a t i o n o f s t r o n gd e p o l a r i z i n g s t i m u l ie v o k e do n l y s m a l l ( 1 0 - 1 5 m V ) r e g e n e r a t i v e r e s p o n s e s a n d a c t i o n p o t e n t i a l s w e r en o to b s e r v e d . W h e n m e a s u r e d a t z e r o a p p l i e d c u r r e n t , t h e s l o p e m e m b r a n er e s i s t a n c e ,R mo f C V S M C sw a s3 . 2 ±0 . 4 8 G o . T h e a v e r a g em e m b r a n e t i m ec o n s t a n t ,r mw a s7 8±2 6 m s a n d c e l l c a p a c i t a n c e ,C mw a s2 4±2 . 3p F .I s o l a t e d , i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o m C V S M C s d i s p l a y e dt w o c l a s s e s o fK C ac h a n n e l . T h e f i r s t c l a s s o f c h a n n e l s , d e s i g n a t e da sK ( C a ) Lc h a n n e l s , h a dam e a n c o n d u c t a n c e o f 2 0 7±1 0p Si n s y m m e t r i c a l 1 4 0m M K C 1s o l u t i o n s . T h e p e r m e a b i l i t y o f t h e o p e n c h a n n e l t o p o t a s s i u m w a s c a l c u l a t e d u s i n gt h e G o l d m a n - H o d g k i n - K a t zc o n s t a n t f i e l d e q u a t i o na tP K= 3 . 9x1 0 - 1 3c m/ s .T h e s ec h a n n e l s s h o w e dah i g h d e g r e e o f s e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s( P N a / P K< 0 . 0 5 )a n d f o r p o t a s s i u m o v e r c e s i u mi o n s( P C s / P K< 0 . 0 5 ) . C s +c a u s e d av o l t a g e - d e p e n d e n tf l i c k e r i n g b l o c ko fo p e nK ( C a ) Lc h a n n e l s .T h ee f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] io n t h e o p e n p r o b a b i l i t y a n d o p e n t i m ed i s t r i b u t i o n so fK ( C a ) Lc h a n n e l s w a s s t u d i e d . T h e t h r e s h o l d l e v e l o f[ C a2+ ] ja tw h i c h c h a n n e lo p e n i n g s w e r ej u s td e t e c t a b l e w a sa b o u t0 . 0 1 j I M . T h e m e a n v a l u eo f[ C a2+ ] ja tw h i c h s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r e o p e n h a l f o f t h e t i m e ,P o ( o . 5 )w a s 2 3 Mw h e n t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l ( V ) w a s+4 0 m V . O v e r t h e r a n g e o fm e m b r a n e p o t e n t i a l s ( - 8 0 t o + 8 0 m V )a n d[ C a2+ J il e v e l s( 0 . 0 1 M t o 1 m M )s t u d i e d ,o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s f o rK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r e w e l l f i t t e db yt h e s u mo ft w oe x p o n e n t i a l s ,i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o fa tl e a s tt w ok i n e t i c a l l yd i s t i n g u i s h 4 b l eo p e ns t a t e sf o r t h i s c h a n n e l . R a i s i n g[ C a2+] ii n c r e a s e d t h e t i m ec o n s t a n t o f t h e s l o w c o m p o n e n t , w h i l e h a v i n g n o e f f e c t o n t h a t o f t h e f a s tc o m p o n e n t .T h e e f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y a n d o p e nt i m e d i s t r i b u t i o n w e r e a l s o s t u d i e d . A t l o w[ C a2+ I i( < 5 0 M ) ,a1 4 m V1 1 1d e p o l a r i z a t i o n i n d u c e d a n e - f o l d i n c r e a s ei n P o . A t[ C a2+] j> 5 0 M , P oa p p r o a c h e d u n i t y a n d s h o w e d l i t t l e f u r t h e ri n c r e a s e o n m e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n .A t[ C a2+ ] j= 1 0 P M , t h e v a l u eo f t h e s l o w t i m e c o n s t a n td e r i v e d f r o mo p e n t i m ed i s t r i b u t i o n sw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da tp o s i t i v e m e m b r a n ep o t e n t i a l s ,w h i l et h a t o f t h e f a s t t i m ec o n s t a n t w a s u n a f f e c t e d .T h e e f f e c t o f t e t r a e t h y l a m m o n i u mi o n s ( T E A ) o n c u r r e n tf l o w i nK ( C a ) Lc h a n n e l sw a ss t u d i e d .T E Ac a u s e d ad o s e - d e p e n d e n t ,r e v e r s i b l e r e d u c t i o ni n t h ea m p l i t u d e o f c u r r e n t i n t h eK ( C a ) Lc h a n n e l s , w h e n a p p l i e dt ot h ec y t o p l a s m i cf a c e o f t h e m e m b r a n e . T h i s e f f e c tw a sc h a r a c t e r i z e db y a d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t ,K do f0 . 8 3±0 . 0 9 m Ma t am e m b r a n e p o t e n t i a lo f+ 4 0m V , a n d w i t h[ C a2+ =1 0 0 , L M . T E A h a d n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h ep r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l sa d o p t i n g t h e o p e ns t a t e .T h e s e c o n d c l a s s o fK C ac h a n n e l s ,d e s i g n a t e da sK ( C a ) Ic h a n n e l s ,w a sd e t e c t e do nam i n o r i t y o f p a t c h e ss t u d i e d .K ( C a ) Ic h a n n e l s s h o w e da c o n d u c t a n c eo f9 2 ±2 . 6p Si n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M K C 1 s o l u t i o n s . T h ep o t a s s i u m p e r m e a b i l i t yo f t h e o p e n c h a n n e l w a s 1 . 7 5. ±0 . 1 2 x1 0 - 1 3c m / s .K ( C a ) Ic h a n n e l sa r e h i g h l ys e l e c t i v e f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s( P N a / P K<0 . 0 5 )a n df o r p o t a s s i u m o v e rc e s i u m( P C s / P K< 0 . 0 5 ) .T h e o p e n p r o b a b i l i t y ,P o o fK ( C a ) Jc h a n n e l s i n c r e a s e da s [ C a2+] jw a s e l e v a t e d o v e r t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g e 0 . 1 Mt o1 0 0M . P o a l s oi n c r e a s e d o n d e p o l a r i z a t i o n o ft h e m e m b r a n e p a t c h .T E A c a u s e dar e v e r s i b l e ,d o s e - d e p e n d e n tr e d u c t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f c u r r e n t i n t h eK ( C a ) Ic h a n n e l ,w h e n a p p l i e dt ot h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e( K d= 0 . 3 1m M ±0 . 0 3 ) .T h ep r e s e n t p r e p a r a t i o n r e p r e s e n t sau s e f u l m o d e l w i t h w h i c ht o s t u d yt h ei o n i c c o n d u c t a n c e sp r e s e n t i n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s .T h i sp r e p a r a t i o nc a n a l s ob ee m p l o y e dt oi n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o fv a s o c o n s t r i c t o r s a n dv a s o d i l a t o r s o n c a l c i u mm o b i l i z a t i o n i ns m o o t h m u s c l ec e l l so f t h e c e r e b r a lv a s c u l a t u r e .l vTable of ContentsAbstract iiList of Figures ixList of Tables xiiiList of Abbreviations xivAcknowledgements xviCHAPTER 1: INTRODUCIION 11.1.The role of vascular smooth muscle cells (VSMCS)in the control of blood flow 11.1.1.Contractile mechanisms in VSMCs 21.1.2.Factors influencing [Ca2+]i in VSMCs 31.1.3.Hormonal and neural regulation of contraction in VSMCs 51.1.4.Vasoconstrictor action of serotonin on VSMCs 71.2.Electrophysiological properties of VSMCs 81.3.Potassium currents in the membrane of VSMCs 101.3.1.The delayed (outward) rectifier K-current 111.3.2.The transient outward current (A-current) 111.3.3.Inwardly rectifying K-currents 121.3.4.ATP-sensitive K-current 141.3.5.ça-activated potassium channels 141.4.Calcium-activated K-channels 151.4.1.Large conductance calcium-activated potassium channels 151.4.2.Intermediate conductance calcium-activated potassium channels 181.4.3.Small conductance calcium-activated potassium channels 191.4.4.Modulation of ionic currents through KCa channels 201.5.Rationale 21VC H A P T h R 2 : E X P E R I M E N T A LP R O C E D U R E S. 2 42 . 1 . D i s p e r s a lo f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s2 42 . 1 . 1 . C o v e r s l i pp r e p a r a t i o n2 72 . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f i s o l a t e dC V S M C s2 82 . 2 . 1 . M a s s o n t r i c h r o m et e s t2 82 . 2 . 2 . I m m u n o f l o u r e s c e n ta n d i n i m u n o p e r o x i d a s es t a i n i n go f C V S M C s2 82 . 3 . D e t e r m i n a t i o no f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni ni s o l a t e dC V S M C s3 02 . 3 . 1 . L o a d i n go ft h e f u r a - 2 - A M i n d i c a t o ri n t oC V S M C s3 02 . 3 . 2 . C e l l c h a m b e ra n d p e r f u s i o ns y s t e m f o r f u r a - 2 m e a s u r e m e n t s3 12 . 3 . 3 . M e a s u r e m e n to f[ C a2+ ] j i n C V S M C s3 22 . 3 . 4 . C a l c u l a t i o no f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u mi n C V S M C s3 82 . 3 . 5 . C a l i b r a t i o no f t h e f u r a - 2s y s t e mf o r d e t e r m i n a t i o n o f[ C a2+ ] j i n C V S M C s3 92 . 4 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o n i s o l a t e d C V S M C s3 92 . 4 . 1 . P r e p a r a t i o no f p a t c he l e c t r o d e s4 02 . 4 . 2 . G r a v i t yp e r f u s i o n s y s t e mf o r a p p l i c a t i o no fe x p e r i m e n t a l s o l u t i o n s4 32 . 4 . 3 . E x p e r i m e n t a ls o l u t i o n s4 42 . 4 . 4 . A n a l y s i s o f p a t c hc l a m pd a t a4 5C A H P T E R3 :R E S U L T S5 03 . 1 . M o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f C V S M C si nv i t r o5 03 . 2 . I n t r a c e l l u l a rf r e e c a l c i u m o f C V S M C si n c u l t u r e5 33 . 2 . 1 . R e s t i n g[ C a2+ ] i o f C V S M C s i n c u l t u r e5 3v i3 . 2 . 2 . E f f e c to f s e r o t o n i no n [Ca2+ ] jo fC V S M C s i nc u l t u r e.5 33 . 3 . E l e c t r i c a l properties o f i s o l a t e dC V S M C s7 83 . 3 . 1 . B a s i ce l e c t r o p h y s i o l o g i c a l properties o f i s o l a t e d C V S M C ss t u d i e dw i t hc e l l - a t t a c h e da n dw h o l e - c e l l ,c u r r e n tc l a m p r e c o r d i n g s7 83 . 4 . K C ac h a n n e l si n i n s i d e - o u t membrane p a t c h e s e x c i s e df r o mC V S M C s9 43 . 4 . 1 . C o n d u c t a n c ea n di o n i c s e l e c t i v i t yo ft h e K(Ca)L c h a n n e l 9 73 . 4 . 2 . E f f e c t o fK+ replacement b y C s +o n c u r r e n tf l o w t h r o u g hK(Ca)L c h a n n e l s1 0 93 . 4 . 3 . E f f e c to fv a i y i n g [Ca2+]i o n t h eo p e np r o b a b i l i t yo fK(Ca)L c h a n n e l s1 1 53 . 4 . 4 . E f f e c t o fv a r y i n g [Ca2+]j o n t h eo p e nt i m ed i s t r i b u t i o no f K(Ca)L c h a n n e l s1 1 83 . 4 . 5 . E f f e c to fm e m b r a n e potential o n t h e open p r o b a b i l i t yo fK(Ca)L c h a n n e l s1 2 83 . 4 . 6 . E f f e c to f membrane potential o n t h e o p e n t i m ed i s t r i b u t i o no f K(Ca)L c h a n n e l s1 3 13 . 4 . 7 . 1 f f e c t o f i n t e r n a l l ya p p l i e d TEA o n K(Ca)L c h a n n e l s 1 3 43 . 5 . K ( C a ) Ic h a n n e l si ni n s i d e - o u t m e m b r a n ep a t c h e s e x c i s e df r o mi s o l a t e dC V S M C s1 4 1CHAPTER 4 : D I S C U S S I O N1 6 24 . 1 . M o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f C V S M C si nv i t r o1 6 24 . 2 . I n t r a c e l l u l a rf r e e c a l c i u mi nc u l t u r e dC V S M C s1 6 44 . 2 . 1 . M o d u l a t i o no f [Ca2+]ib ys e r o t o n i ni nC V S M C s1 6 54 . 3 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l properties o f i s o l a t e d C V S M C s1 6 74.4.Ca2+- a c t i v a t e dK c h a n n e l si ni n s i d e - o u tm e m b r a n ep a t c h e s1 7 04 . 4 . 1 . P r o p e r t i e so fK ( C a ) Lc h a n n e l s1 7 1v u4 . 4 . 1 . 1 .I o n i c s e l e c t i v i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l . 1 7 14 . 4 . 1 . 2 .C a2+d e p e n d e n c e o fK ( C a ) Lc h a n n e l o p e n i n g1 7 44 . 4 . 1 . 3 . V o l t a g e d e p e n d e n c e o f o p e n i n g o fK ( C a ) Lc h a n n e l s1 7 84 . 4 . 1 . 4 . B l o c k a d e o fK ( C a ) Lc h a n n e l s b y i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A1 7 94 . 4 . 2 . P r e p e r t i e so fK ( C a ) Ic h a n n e l s1 8 14 . 4 . 3 . T h ep o s s i b l e r o l e o fK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l s 1 8 24 . 5 . C o n c l u s i o n sa n d s i g n i f i c a n c e1 8 4R E F E R E N C E S1 8 7y i nL i s t o f F i g u r e sF i g u r e 1 . V e n t r a la s p e c to f t h ea d u l tr a tb r a i n s h o w i n g p o s i t i o n s o ft h eb a s i l a r , p o s t e r i o r c o m m u n i c a t i n g , p o s t e r i o r a n dm i d d l e c e r e b r a la r t e r i e su s e di n t h i ss t u d y2 5F i g u r e 2 .S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f t h e s y s t e m f o r m e a s u r i n g[ C a2+I iu s i n gt h e f l u o r e s c e n t p r o b ef u r a - 23 4F i g u r e3 .E x c i t a t i o n s p e c t r a o f 1 m M f u r a - 23 6F i g u r e 4 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h ep r o c e d u r e s u s e dt om a k e t h e w h o l e -c e l la n di n s i d e - o u t p a t c h r e c o r d i n g s r e p o r t e d i n t h i ss t u d y4 1F i g u r e5 .. . B l o c k d i a g r a m o f t h e p a t c h c l a m p r e c o r d i n gs y s t e m 4 6F i g u r e6 .P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d r a t c e r e b r a l a r t e r ys m o o t h m u s c l ec e l l si nv i t r o , t r e a t e dw i t h t h e M a s s o n t r i c h r o m e s t a i n 5 1F i g u r e7 .P h o t o m i c r o g r a p h s o fd i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t ham o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l ea - a c t i n a n dv i s u a l i z e d u s i n gaf l o u r e s c e n t m a r k e r5 4F i g u r e8 .P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e d C V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t ham o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t s m o o t h m u s c l e a - a c t i na n dv i s u a l i z e d u s i n gap e r o x i d a s e m a r k e r5 6F i g u r e9 .T h e i n c r e a s e i n[ C a2+ ] it r i g g e r e db ya p p l i c a t i o n o f 5 - H Tt o aC V S M C5 9F i g u r e 1 0 .A v e r a g e t i m e c o u r s e o f t h e i n c r e a s e i n[ C a2+] it r i g g e r e db ya p p l i c a t i o n o f 5 - H T t oa n i s o l a t e dC V S M C s 6 1F i g u r e 1 1 .I n c r e a s e i n[ C a2+ ] it r i g g e r e db ya p p l i c a t i o n o f K +t o a C V S M CF i g u r e 1 2 .E f f e c t o f L a 3+a n dC o 2+o n s e r o t o n i n - i n d u c e d c h a n g e si n[ C a 2 + ] j o f a C V S M C6 5F i g u r e 1 3 . E f f e c t o f n i f e d i p i n e o n t h e r i s e i n[ C a2+ ] it r i g g e r e db y5 - H Ti naC V S M C6 7l xF i g u r e 1 4 . E f f e c to f k e t a n s e r i n o n t h e r i s e i n[ C a2+ J ie v o k e db y5 - H T i naC V S M C a f t e r 2d a y s i nv i t r o7 1F i g u r e 1 5 . D e c r e a s i n gr e s p o n s i v e n e s s o faC V S M Ct or e p e a t e da p p l i c a t i o n so f 5 - H T7 3F i g u r e 1 6 . L o g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h o w i n g t h ep e r c e n t a g e i n c r e a s e i n[ C a2+] it r i g g e r e db yv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f 5 - H T7 5F i g u r e 1 7 . S p o n t a n e o u s , s m a l l a m p l i t u d e s i n g l e c h a n n e lc u r r e n t s r e c o r d e di n c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s7 8F i g u r e 1 8 . L a r g e a m p l i t u d e , i n w a r d l yd i r e c t e d s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t se v o k e d i nac e l l - a t t a c h e d p a t c h d u r i n ga p p l i c a t i o n o f 5 - H T8 0F i g u r e 1 9 . B i p h a s i c c u r r e n t sr e c o r d e d f r o m a C V S M C u s i n g t h ec e l l - a t t a c h e d c o n f i g u r a t i o n8 2F i g u r e2 0 .R e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l s r e c o r d e df r o m C V S M C s8 5F i g u r e 2 1 . V o l t a g e c h a n g e s i n d u c e db ya p p l i c a t i o n o f c o n s t a n t c u r r e n tp u l s e s i naC V S M C s t u d i e d u s i n g t h e w h o l e - c e l l , c u r r e n tc l a m pt e c h n i q u e8 7F i g u r e 2 2 . C u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s h i p s o b t a i n e d i n t h e w h o l e - c e l l ,c u r r e n tc l a m p r e c o r d i n g m o d e8 9F i g u r e 2 3 . S e m i - l o g a r i t h m i cp l o t o f t h ed e c a yp h a s e o fah y p e r p o l a r i z i n ge l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l e v o k e d i naC V S M C u n d e r w h o l e c e l l ,c u r r e n t - c l a m p c o n d i t i o n s9 1F i g u r e 2 4 . P l o t o f c u r r e n t - v o l t a g e( I - V ) r e l a t i o n s h i p s o f s i n g l eK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l c u r r e n t s f r o m p a t c h e s b a t h e d i n s y m m e t r i c a lp o t a s s i u m s o l u t i o n s9 4F i g u r e 2 5 . S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s f l o w i n g t h r o u g has i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e li na n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h v o l t a g e - c l a m p e da t v a r i o u sp o t e n t i a l s9 7xF i g u r e 2 6 . A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s f o rK ( C a ) Lc h a n n e l c u r r e n t so b t a i n e df r o ma ni n s i d e - o u tp a t c h9 9f i g u r e 2 7 . C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e lc u r r e n t s i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u ms o l u t i o n s 1 0 1F i g u r e 2 8 . E f f e c t so fN a +o rC s +r e p l a c e m e n t o fK +o n s i n g l e c h a n n e lc u r r e n t s i nK ( C a ) Lc h a n n e l s1 0 4F i g u r e 2 9 . C u r r e n t - v o l t a g e( I - V )r e l a t i o n s h i p o f s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e lc u r r e n t s w h e n8 0m M K C 1a tc y t o p l a s m i c o r e x t e r n a lm e m b r a n ef a c e w a s r e p l a c e d b y N a C l 1 0 6F i g u r e3 0 .C u r r e n t - v o l t a g e ( I - V ) r e l a t i o n s h i p o f s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e lc u r r e n t s w h e n8 0m M K C 1a tc y t o p l a s m i c o r e x t e r n a l m e m b r a n ef a c e w a sr e p l a c e db yC s C 11 1 0F i g u r e 3 1 .S i n g l e - c h a n n e lK ( C a ) Lc u r r e n t s r e c o r d e d f r o m a n i n s i d e - o u tp a t c ha td i f f e r e n t f i l t e r b a n d w i d t h s 1 1 2F i g u r e 3 2 .E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] io n t h e o p e n i n g o fK ( C a ) Lc h a n n e l s1 1 6F i g u r e3 3 .E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] io n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l 1 1 8F i g u r e 3 4 .D i s t r i b u t i o n o f o p e n t i m e s f o r t h eK ( C a ) Lc h a n n e l s t u d i e d i n a ni s o l a t e d p a t c h c o n t a i n i n g o n e a c t i v ec h a n n e l1 2 1F i g u r e3 5 .E f f e c to f v a r y i n g[ C a2+] io n t h e t i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n g o p e nt i m e d i s t r i b u t i o n so fK ( C a ) Lc h a n n e l s 1 2 4F i g u r e 3 6 .E f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] io n r e l a t i v e n e m b e r o f o p e n i n g s o fK ( C a ) Lc h a n n e l s g o v e r n e db yt h e t i m e c o n s t a n t s r f a n dr s1 2 6F i g u r e3 7 .D e p e n d e n c eo f t h e o p e n p r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l s o nm e m b r a n e p o t e n t i a l a n d [ C a2+I i1 2 9F i g u r e3 8 .E f f e c t o f m e m b r a n ep o t e n t i a l o n t h e t i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n gt h e o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s o fK ( C a ) Lc h a n n e l s 1 3 2x lF i g u r e3 9 .B l o c k i n g e f f e c t o fi n t e r n a l T E Ao n t h eK ( C a ) Lc h a n n e l 1 3 4F i g u r e 4 0 . D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e b l o c k o f c u r r e n t f l o w i n t h eK ( C a ) Lc h a n n e lb yT E A1 3 7F i g u r e 4 1 .E f f e c to fi n t e r n a l l y a p p l i e d T E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t yo f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l1 3 9F i g u r e 4 2 . S i n g l e - c h a n n e lc u r r e n t sf l o w i n g i nK ( C a ) Ic h a n n e l sa tv a r i o u sm e m b r a n e p o t e n t i a l s 1 4 1F i g u r e 4 3 .A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d f o rK ( C a ) Ic h a n n e l c u r r e n t s1 4 4F i g u r e 4 4 . C o n d u c t a n c ea n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l 1 4 6F i g u r e4 5 . E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] io n t h e a c t i v i t y o fK ( C a ) Ic h a n n e l s . . . 1 4 9F i g u r e4 6 . E f f e c t o f[ C a2+ ] jo n t h eo p e n p r o b a b i l i t y o f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l1 5 1F i g u r e 4 7 .D e p e n d e n c e o f t h e o p e n p r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Ic h a n n e l s o nm e m b r a n ep o t e n t i a l a n d[ C a2+] i1 5 3F i g u r e 4 8 .B l o c k i n g e f f e c t o f T E A o n c u r r e n tf l o w i n t h eK ( C a ) Ic h a n n e l1 5 5F i g u r e 4 9 .D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r b l o c ko f t h eK ( C a ) Ic h a n n e lb yi n t e r n a l l y a p p l i e d T E A1 5 7F i g u r e 5 0 .E f f e c t o fT E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t yo f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l1 5 9x l iL i s t o fT a b l e sT a b l eI : T h ei n f l u e n c e o fC o2 + , L a 3 + ,a n dn i f e d i p i n eo n t h e p e r c e n t a g ei n c r e a s e i n [ C a2+ ] ii n d u c e db y 5 - H Ti n c u l t u r e dr a t C V S M C s6 9T a b l e I I :C h a r a c t e r i s t i c s o f B K c h a n n e l si nv a r i o u s p r e p a r a t i o n s1 7 4X I I ’L i s t o f A b b r e v i a t i o n s[ C a2+] j :C o n c e n t r a t i o no f i n t r a c e l l u l a r f r e ec a l c i u m4 - A P :4 - a m i n o p y r i d i n e5 - H T : 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e , s e r o t o n i nA C H : A c e t y i c h o l i n eA D P : A d e n o s i n ed i p h o s p h a t eA N O V A : A n a l y s i s o f v a r i a n c eA N P :A t r i a ln a t r i u r e t i c p e p t i d eA P : A c t i o n p o t e n t i a lA T P : A d e n o s i n et r i p h o s p h a t eA T P a s e s : E n z y m e s t h a t c a t a l y z e t h eh y d r o l y s i s o f A T Pc A M P :C y c l i ca d e n o s i n e - 3 ’ , 5 ’ - m o n o p h o s p h a t ec G M P : C y c l i cg u a n o s i n e - 3 ’ , 5 ’ - m o n o p h o s p h a t eC V S M C : C e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l lC V S M C s C e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l sD A B :3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n eD A G : D i a c y i g l y c e r o lD M S O : D i m e t h y l s u l f o x i d eE B S S :E a r l ’ s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o nE D R F :E n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n gf a c t o rE G T A : E t h y l e n e g l y c o l - b i s Q 3 - a m i n o e t h y l e t h e r )N , N , N ’ , N ’ - t e t r a a c e t i ca c i dF I T C : F l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t eG - p r o t e i n : G u a n i n e n u c l e o t i d e b i n d i n g p r o t e i n .G I P : G a s t r i c i n h i b i t o r y p e p t i d eH B S S : H a n k ’ sb a l a n c e d s a l t s o l u t i o nH E P E S :N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ’ - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i dx i v1 P 3 : I n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t eK C ac h a n n e l : C a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e lK C ac u r r e n t : C a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc u r r e n tK ( C a ) Ic h a n n e l : I n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e lK ( C a ) Lc h a n n e l : L a r g e c o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e lK G s o l u t i o n : P o t a s s i u mg l u t a m a t e s o l u t i o nM L C K : M y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s eM W :M o l e c u l a rw e i g h tP B S : P h o s p h a t e b u f f e r s a l i n eP I P 2 :L - - p h o s p h a t i d y li n o s i t o l d i p h o s p h a t eP K C : P r o t e i nk i n a s eCP L C :P h o s p h o l i p a s eCP o :O p e np r o b a b i l i t yS E M :S t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a nS M C : S m o o t h m u s c l ec e l lS M C s :S m o o t h m u s c l ec e l l sS R : S a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mT E A : T e t r a e t h y l a m m o n i u mT T X : .T e t r o d o t o x i nV S M C :V a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l lV S M C s :V a s c u l a r s m o o t h m u s c l ec e l l sx vAcknowledgementsI wish to express my deepest gratitude to my supervisor, Dr. David A.Mathers, for his encouragement, knowledgeable direction, patience, and supportthroughout the course of research in his laboratory and during the preparation ofthis thesis. The confidence that Dr. Mathers showed in my abilities allowed meto continue this study at a time when my own confidence was waning, andenabled me to complete the work.I would like to thank other members of my thesis committee, Dr. RalphKeeler, Dr. Steve Kehi, and Dr. David Quastel for their valuable suggestions andconstructive comments which made this project interesting and relevant.I would like to express my sincere thanks to Dr. Kenneth G. Baimbridgefor providing me with laboratory equipment and chemicals for intracellular freecalcium measurements. I thank Dr. Morley Sutter for his valuable advice andencouragement.Also thanks are due to those in the Department of Physiology for theirhelp and friendship. They are Dr. Alison Buchan, Dr. Tony Pearson, Dr. PeterVaughan, Mr. John Sariker, Mr. Joe Tay, Miss Stella Atmadja, and MissNarinder Dhatt.I especially thank Veronica Corvalan-Grossling for her many hours ofgraphic work on the computer. People working in the departmentadministration, workshop and animal room were always very kind and helpfuland I thank them very much.xviT h i s t h e s i s i s d e d i c a t e dt om yp a r e n t s Z e n g g a oW a n ga n dZ h e n g z h u a n g Y a o , m yh u s b a n d P i n g a n d m y d a u g h t e r D i a n a f o rt h e i re m o t i o n a l s u p p o r t a n d e n c o u r a g e m e n t .C h a p t e r1I n t r o d u c t i o nA l t e r e dc o n t r a c t i l i t yo fc e r e b r o v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s ( C V S M C s )i sb e l i e v e dt op l a y ar o l e i ns e v e r a l c e r e b r o v a s c u l a rd i s e a s e so fc l i n i c a li m p o r t a n c e( M i c h e l .e ta l . 1 9 9 0 ) . T h ec o n t r a c t i l e s t a t eo fC V S M C s i s i n t u r n r e g u l a t e db yt h el e v e l o f f r e e i n t r a c e l l u l a rc a l c i u m( [ C a2+] i )a n db yt h e f l o w o fi o n i cc u r r e n ti ns e v e r a lt y p e so fm e m b r a n ec h a n n e l s ( J o h n se ta l . 1 9 8 7 ;T o m i t a1 9 8 8 ;H a t h a w a ye ta l . 1 9 9 1 ) .A m o n g t h e s ea r e t h e s o - c a l l e dc a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l s( K C ac h a n n e l s ) ,w h i c ha r e p r o b a b l yi m p o r t a n ti n t h em o d u l a t i o n o f c e l lr e s t i n gm e m b r a n e p o t e n t i a la n d c e l l m e m b r a n er e p o l a r i z a t i o na f t e r e x c i t a t i o n( T o m i t a1 9 8 8 ;L a t o r r e e ta l .1 9 8 9 ; E d w a r d sa n d W e s t o n1 9 9 0 ;K o i b 1 9 9 0 ) . T od a t e ,h o w e v e r ,m o s td e t a i l e ds t u d i e so n f r e ei n t r a c e l l u l a rc a l c i u m a n d c a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l si n s m o o t hm u s c l e c e l l sh a v e b e e np e r f o r m e d o n c e l l si s o l a t e df r o mp e r i p h e r a lv e s s e l s o rf r o m n o n v a s c u l a rt i s s u e s .T h eg o a l o ft h i ss t u d y ,t h e r e f o r ew a s t oi n v e s t i g a t eu s i n g p a t c hc l a m p t e c h n i q u e s( H a m i l le ta l .1 9 8 1 )t h ep r o p e r t i e so fK C ac h a n n e l si n C V S M C sd e r i v e df r o m t h ec e r e b r a l v a s c u l a t u r eo fa d u l tr a t s :T h ec a l c i u m s e n s i t i v ed y ef u r a - 2 w a sa l s ou s e dt os t u d yt h el e v e lo f f r e ei n t r a c e l l u l a rc a l c i u mi n t h e s e c e l l s .1 . 1 . T h er o l e o fv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ( V S M C s )i nt h e c o n t r o lo f b l o o df l o w .V a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ( V S M C s )p l a ya p r e d o m i n a n tr o l ei nr e g u l a t i n gt h eb l o o df l o w o f t h eb r a i na n d o t h e ro r g a n s .T h e c o n t r a c t i o na n dr e l a x a t i o no fs m o o t hm u s c l ec e l l s i nt h e b l o o dv e s s e l w a l lc o n t r i b u t et ot h e1m a i n t e n a n c e o f n o r m a l v a s c u l a rf u n c t i o n . T h e f o l l o w i n g p a r a g r a p h ss u m m a r i z ec u r r e n tk n o w l e d g eo ft h e b a s i cc o n t r a c t i l e m e c h a n i s m s f o u n d i nV S M C s .1 . 1 . 1 . C o n t r a c t i l e m e c h a n i s m s i n V S M C sT h e c o n t r a c t i l i t y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i sd e p e n d e n t o n t h ei n t e r a c t i o n b e t w e e n t w o m a j o rt y p e so f c o n t r a c t i l ep r o t e i n s , a c t i n a n d m y o s i n .M o s t i n v e s t i g a t o r s e n v i s a g e s m o o t h m u s c l ec o n t r a c t i o n i n t e r m s o f t h es l i d i n g -f i l a m e n t m o d e l o r i g i n a l l y p r o p o s e d f o r s t r i a t e d m u s c l e ( H u x l e y1 9 9 0 ) . I n t h i sm o d e l , t h e h e a d s o f m y o s i n m o l e c u l e s , w h i c h a r e b u n d l e d t o g e t h e r i n t ot h i c k( m y o s i n )f i l a m e n t s , u n d e r g oac y c l eo fh i g h -a n d l o w - a f f i n i t y b i n d i n gt o t h i nf i l a m e n t s( a c t i n ,t r o p o m y o s i n a n d o t h e r p r o t e i n s ) i nar e a c t i o n d r i v e nb ya d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ( A T P )h y d r o l y s i s . T e n s i o n g e n e r a t i o n o c c u r sa s a r e s u l to f r o t a t i o n o f t h e h e a d s o f m y o s i n , w h i c h a r e b o u n d i n c r o s s - b r i d g es t r u c t u r e st oa c t i n m o l e c u l e s , f r o m a na n g l eo f9 0 0t o4 5 0w i t h r e s p e c tt ot h e l o n g a x i s o fa c t i n - a n d m y o s i n - c o n t a i n i n g f i l a m e n t s . T h e d i r e c t i o n o f f o r c eg e n e r a t i o n i sp a r a l l e l e dt ot h e o r i e n t a t i o n o f t h e s e f i l a m e n t s .I n V S M C s , c o n t r a c t i o n m e d i a t e db ym y o s i n a n d a c t i n f i l a m e n t si sr e g u l a t e d b yC a2+t h r o u g han u m b e r o f d i f f e r e n tm e c h a n i s m s ( B o l t o n 1 9 7 9 ;J o h n se ta ! . 1 9 8 7 ;H a t h a w a ye ta l . 1 9 9 1 ) . T h e m o s t i m p o r t a n to f t h e s e i n v o l v e st h e p h o s p h o r y l a t i o n o fm y o s i n m o l e c u l e s ( A d e i s t e i n a n dS e l l e r s 1 9 8 7 ) . I n t h i sm e c h a n i s m , C a2+b i n d st oc a l m o d u l i n a n d t h e r e s u l t i n gc o m p l e x a c t i v a t e s t h ee n z y m e m y o s i n l i g h t - c h a i n k i n a s e ( M L C K ) , w h i c h i n t u r nc a t a l y z e s m y o s i np h o s p h o r y l a t i o n a n d i n i t i a t e s r a p i d s h o r t e n i n g . A f t e rd e p h o s p h o r y l a t i o n ,t h ea c t o m y o s i n p a s s e s t h r o u g ha“ l a t c h ”s t a t eb a c kt or e s t ( H a ia n d M u r p h y 1 9 8 9 ) .V a s c u l a rm y o s i ni sc o m p o s e do f t w o h e a v y c h a i n s ( M W , 2 0 0 , 0 0 0a n d 2 0 4 , 0 0 0 )2and two sets of light-chain subunits [regulatory, or 20,000 Da, light chains (i.e.,LC2O) and alkali, or 17,000 Da, light chains]. The serine-19 residue of LC2O isthe site of phosphorylation by MLCK. Investigations with the fluorescent Ca2+indicator fura-2 or the photoprotein aequorin have demonstrated that the levelof free intracellular Ca2+ closely regulates the extent of LC2O phosphorylation(Rembold et al. 1988; Taylor et al. 1989). Phosphorylation of LC2O activatesthe ATPase activity actomyosin (Sellers 1985) initiating the cycling of cross-bridge formation and, hence, of contraction. The state of phosphorylation insmooth muscle myosin is also regulated by the opposing action of myosinphosphatase and by the modulation of MLCK activity. In vitro, MLCK can bephosphorylated by several protein kinases, including cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP)-dependent protein kinase (Payne et a!. 1986), cyclicguanosine 3’,5’-monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (Nishikawaet a!. 1984; Hathaway et a!. 1985), Ca2/calmodulin-dependent protein kinaseII (Ikebe and Reardon 1990), and protein kinase C (Nishikawa et al. 1985).In vascular smooth muscle, tension can be maintained while LC2Odephosphorylation and [Ca2+] levels decrease. This mechanical state oftension maintenance with slowly cycling cross-bridges has been called the “latchstate” by Hai and Murphy (1989). The latch state is energy efficient becausetension is maintained at reduced ATP consumption. The molecularmechanisms that produce the latch state are unknown. Hai and Murphy (1989)hypothesized that dephosphorylation of LC2O while in a high-affinity bindingconformation might alter the kinetics of cross-bridge detachment. Slowing ofcross-bridge detachment would prolong high-affinity binding and tension.1.1.2. Factors influencing [Ca2+]i in VSMCs3T h e g e n e r a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f t e n s i o n i n v a s c u l a rs m o o t h m u s c l ea r e d e p e n d e n t o n p r o c e s s e s t h a t m o d u l a t e i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o f f r e eC a2+ .C a l c i u mm a y e n t e r t h e c y t o p l a s m i c c o m p a r t m e n to f V S M C s i nan u m b e r o fw a y s , i n c l u d i n g t r a n s - s a r c o l e m m a l e n t r y t h o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n tC a2+c h a n n e l s ,N a + - C a2+e x c h a n g e , a n d r e c e p t o r - o p e r a t e dC a2+c h a n n e l s . T h ed e p o l a r i z a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l sb ye l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n , i n c r e a s e de x t e r n a l p o t a s s i u m , o r v a r i o u s n e u r o t r a n s m i t t e r s e v o k e s a n i n w a r dc u r r e n tc a r r i e d b y C a2+i o n s t h r o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n tC a2+c h a n n e l s w h i c h s h a r ec e r t a i n f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s w i t h L - t y p eC a2+c h a n n e l s o fs t r i a t e d m u s c l e( N e l s o ne ta l . 1 9 8 8 ) . C a l c i u m m a y a l s ob er e l e a s e d f r o m i n t e r n a ls t o r e s v i ar y a n o d i n er e c e p t o r - l i k eC a2+c h a n n e l s o f t h e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m( S R )( A s h i d a 1 9 8 8 ) a n d r e l e a s e d f r o m o t h e r i n t e r n a l s i t e s v i a a ni n o s i t o l - 1 , 4 , 5 -t r i p h o s p h a t e ( 1 P 3 ) - a c t i v a t e d c h a n n e l ( N e l s o ne ta l . 1 9 9 0 ) .S e v e r a lt y p e so fK +c h a n n e l s h a v e b e e nd e t e c t e di n v a s c u l a r m u s c l ec e l l s ,i n c l u d i n gC a2+ - a c t i v a t e dK +c h a n n e l s , d e l a y e d r e c t i f i e rK +c h a n n e l s ,a n dA T P - s e n s i t i v eK +c h a n n e l s . I n c r e a s e s i nK +c o n d u c t a n c ea s a r e s u l t o fa c t i v a t i o no f a n y o f t h e s e c h a n n e l s l e a d st om e m b r a n eh y p e r p o l a r i z a t i o n w i t hs u b s e q u e n tc l o s u r e o f v o l t a g e - d e p e n d e n tC a2+c h a n n e l s ( S t a n d e ne t a l . 1 9 8 9 )a n d e n h a n c e dC a2+e x t r u s i o n v i aN a + - C a2+e x c h a n g e ( L a u g e r 1 9 8 7 ) .I n a l lc a s e s ,t h ep h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e i sar e d u c t i o ni n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e t o n e .V a r i o u sh o r m o n e s a c t i n gt h r o u g h m e m b r a n e - b o u n dg u a n i n e n u c l e o t i d eb i n d i n g p r o t e i n s ( G - p r o t e i n s ) ( F r e i s s m u t he ta ! . 1 9 8 9 ) a c t i v a t ep h o s p h o l i p a s eC( P L C ) , w h i c h c o n v e r t s L - a - p h o s p h a t i d y l i n o s i t o ld i p h o s p h a t e( P I P 2 )t od i a c y i g l y c e r o l ( D A G ) a n d i n o s i t o l - 1 , 4 , 5 - t r i p h o s p h a t e ( 1 P 3 ) .1 P 3 i n t u r n4s t i m u l a t e s r e l e a s e o fC a2+f r o mt h e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u mv i a a n d 1 P 3 -r e c e p t o r p r o t e i n , w h i c h i sa t y p e o fC a2+c h a n n e l( H a s h i m o t oe ta l . 1 9 8 6 ;B e r r i d g e 1 9 8 9 ) .D A G a c t i v a t e s t h e e n z y m e p r o t e i nk i n a s eCi n t h es a r c o l e n i m aw h i c h i n t u r np h o s p h o r y l a t e s m a n y o t h e rm e m b r a n e p r o t e i n s , s u c ha s r e c e p t o r sa n d t h e N a + - K + e x c h a n g e r( N i s h i z u k a 1 9 8 8 ) .O t h e r s e c o n d m e s s e n g e r s ,s u c h a s c A M P a n d c G M Pr e g u l a t ei n t r a c e l l u l a rC a2+a n d / o r c h a n g e t h eC a2+- s e n s i t i v i t yo f c o n t r a c t i l e p r o t e i n si n s m o o t h m u s c l e c e l l s ( K a m ma n d S t u l l 1 9 8 9 ) . c A M P i st h o u g h t m a i n l yt os t i m u l a t eC a2+u p t a k e i n t o t h e S R , w h e r e a sc G M P i s t h o u g h tt o a c t p r i n c i p a l l yb y s t i m u l a t i n g s a r c o l e m m a l A T P a s e s ( L i n d e m a n ne t a .1 9 8 3 ;V r o l i xe ta l . 1 9 8 8 ) .1 . 1 . 3 . H o r m o n a l a n d n e u r a l r e g u l a t i o no f c o n t r a c t i o n i n V S M C sT h e c o n t r a c t i l ea c t i v i t y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s i sr e g u l a t e db y av a r i e t y o f l o c a l a n d s y s t e m i c m e c h a n i s m s .S y m p a t h e t i c a n d p a r a s y m p a t h e t i cn e r v e s p l a yam a j o r r o l e i n t h e s y s t e m i c c o n t r o l o f v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e t o n e ,w h i l ean u m b e r o f o t h e ra g e n t sm o d u l a t et h e r e s p o n s i v e n e s s o f V S M C sa t al o c a l l e v e l .K n o w l e d g e c o n c e r n i n g t h e s e l o c a l r e g u l a t i n g m e c h a n i s m sh a s p r o g r e s s e dr a p i d l y i n r e c e n t y e a r s . L o c a l r e g u l a t i o n i s b r o u g h ta b o u t b yt h ei n t r i n s i cc o n t r a c t i l r e s p o n s e o f s m o o t h m u s c l et os t r e t c h , a n db yt h ea c t i o n s o fv a s o d i l a t o r y m e t a b o l i t e s a n d l o c a l v a s o c o n s t r i c t o r s . S i n c eF u r c h g o t t a n dZ a w a d s k i ( 1 9 8 0 )f i r s t r e p o r t e d t h a t t h ev a s o d i l a t o r y r e s p o n s e o f v a s c u l a rs m o o t h m u s c l et oa c e t y i c h o l i n e r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f a n i n t a c t e n d o t h e l i u m ,t h e r o l e o f t h e e n d o t h e l i u mi n t h er e g u l a t i o n o f v a s c u l a rt o n eh a s a t t r a c t e d5c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t .A c t i v a t i o n o f e n d o t h e l i a lr e c e p t o r sb y an u m b e r o fv a s o a c t i v e s u b s t a n c e s s t o r e d a n d r e l e a s e db yp l a t e l e t s , e n d o t h e l i u m ,o rs u r r o u n d i n gt i s s u e s s t i m u l a t e st h e p r o d u c t i o n o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e dr e l a x i n go rc o n s t r i c t i n g f a c t o r s ( V a n h o u t t e 1 9 8 1 ; D e C l e r c ka n d D a v i d 1 9 8 1 ; B u r n s t o c k1 9 9 0 ) . T h e s e s u b s e q u e n t l y m o d i f y v a s c u l a r t o n eb yc o n t r a c t i n g o rr e l a x i n g t h ev a s c u l a r s m o o t h m u s c l e ( B u r n s t o c k 1 9 9 0 ) .T h ee n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F )h a s n o w b e e ni d e n t i f i e da sn i t r i c o x i d e ( I g n a r r o e t a l . 1 9 8 6 , P a l m e re ta l . 1 9 8 7 ) . I n a d d i t i o nt oa c e t y i c h o l i n e ,e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t v a s o d i l a t i o nh a s a l s o b e e n s h o w nt oo c c u r i n r e s p o n s e t o o t h e r v a s o a c t i v e s u b s t a n c e s , i n c l u d i n g A T P , a d e n o s i n ed i p h o s p h a t e ( A D P ) ,a r a c h i d o n i c a c i d , s u b s t a n c e P , n e u r o k i n i nA ,5 -h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 5 - H T ) ,b r a d y k i n i n , h i s t a m i n e , n e u r o t e n s i n ,v a s o p r e s s i n ,a n g i o t e n s i n I I a n d t h r o m b i n ( M i o n e e t a l . 1 9 9 0 ) . S o m e o f t h e v a s o a c t i v es u b s t a n c e s w h i c hr e q u i r et h ep r e s e n c eo fe n d o t h e l i u mt o p r o d u c e v a s o d i l a t i o na l s oa c t a sv a s o c o n s t r i c t o r s w h e n r e l e a s e d f r o m p e r i v a s c u l a r n e r v e s .T h e r ea p p e a r s ,t h e r e f o r e ,t o b e ar e s t i n g d y n a m i c b a l a n c e b e t w e e n e n d o t h e l i u md e r i v e d v a s o d i l a t o r yt o n e a n d s y m p a t h e t i c v a s o c o n s t r i c t o r t o n e , w h i c hi s a l t e r e du n d e r d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a la n d p a t h o p h y s i o l o g i c a lc i r c u m s t a n c e s .A l t h o u g h t h en a t u r e o f t h e e n d o t h e l i u m - d e p e n d e n tc o n t r a c t i n g f a c t o r i ss t i l l u n c l e a r ,a tl e a s tt h r e e d i f f e r e n t c l a s s e s o f e n d o t h e l i a lv a s o c o n s t r i c t o rs u b s t a n c e sh a v e b e e n r e c o g n i z e d ( L u s c h e r 1 9 8 8 ) . T h e s e c o n s i s t o f m e t a b o l i t e so f a r a c h i d o n i c a c i d ,p o l y p e p t i d e - l i k e f a c t o r s , s u c ha se n d o t h e l i n ,a 2 1 - r e s i d u ep e p t i d ei s o l a t e d f r o m p o r c i n e a o r t i c e n d o t h e l i a l c e l l s ( Y a n a g i s a w a ,1 9 8 8 ) a n da n u n i d e n t i f i e d d i f f u s i b l e f a c t o rr e l e a s e df r o m a n o x i c / h y p o x i c e n d o t h e l i u mc e l l s .6S y s t e m i cr e g u l a t i o n o f v a s c u l a r s m o o t hm u s c l et o n e i s b r o u g h ta b o u t b yc i r c u l a t i n g s u b s t a n c e sa n db yt h ea c t i o no f v a s o m o t o rn e r v e s . C i r c u l a t i n gv a s o d i l a t o r ya g e n t si n c l u d ek i n i n s a n d a t r i a ln a t r i u r e t i cp e p t i d e ( A N P ) .C i r c u l a t i n g v a s o c o n s t r i c t o r si n c l u d e v a s o p r e s s i n ,n o r e p i n e p h r i n e ,e p i n e p h r i n e ,a n d a n g i o t e n s i n I I . I nt h e n e u r a l r e g u l a t i o no f V S M Cc o n t r a c t i o n ,s y m p a t h e t i cn e r v e s p l a yad o m i n a n tr o l e .W i t h v e r yf e we x c e p t i o n s , n o r e p i n e p h r i n er e l e a s e d f r o m a d r e n e r g i c n e r v et e r m i n a l sa c t i v a t e sa i p h a - a d r e n o c e p t o r sa tt h em e m b r a n eo fV S M C s( p o s t j u n c t i o n a l a l p h a - a d r e n o c e p t o r s )( B u r n s t o c k1 9 8 6 ;1 9 9 0 ) .1 . 1 . 4 . V a s o c o n s t r i c t o ra c t i o no f s e r o t o n i no nV S M C sS e r o t o n i ni s o n e o ft h e m o s tp o t e n tv a s o c o n s t r i c t o ra g e n t si n t h ec e r e b r a lc i r c u l a t i o no f m a m m a l s( E d v i n s s o ne ta l . 1 9 8 4 ; Y o u n ge ta l . 1 9 8 6 a ,1 9 8 6 b ;C h a n ga n dO w m a n1 9 8 7 ) .I t w a sf i r s ti s o l a t e d a n dc r y s t a l l i z e db yR a p p o r t , G r e e na n dP a g e ( 1 9 4 8 ) a n d w a ss y n t h e s i z e db yH a m l o na n d F i s h e r( 1 9 5 1 ) .S e r o t o n i nm a y p l a yar o l e i nt h e e t i o l o g yo f s e v e r a l i m p o r t a n td i s o r d e r so f t h e v a s c u l a rs y s t e m ,i n c l u d i n gm i g r a i n e ,h y p e r t e n s i o n ,v a s o s p a s ma s s o c i a t e dw i t hs u b a r a c h n o i dh a e m o r r h a g ea n di s c h e m i a( B o h ra n dW e b b1 9 8 8 ;M i c h e le ta l . 1 9 9 0 ;L a n c e1 9 8 2 ;V a n h o u t t e1 9 8 5 ;W i l k i n s1 9 8 0 ) .N e r v ef i b e r s c o n t a i n i n g5 - H Th a v e b e e nd e m o n s t r a t e di m m u n o h i s t o c h e m i c a l l ya r o u n dt h e p i a la r t e r i e so f m a n ys p e c i e s( C h a n g ,O w m a na n d S t e i n b u s c h1 9 8 8 ) .S e r o t o n i nr e c e p t o rs u b t y p e sc a nb ec a t e g o r i z e di n t ot h r e em a j o rf a m i l i e s ,5 - H T 1 ,5 - H T 2a n d5 -H T 3 r e c e p t o r s ,a n de a c h f a m i l yc o n s i s t so fm u l t i p l er e c e p t o rs u b t y p e st h a ts h a r es i m i l a r i t i e si n t h e i rm o l e c u l a rb i o l o g i c a l ,p h a r m a c o l o g i c a l ,b i o c h e m i c a l ,a n d / o rp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s( S c h m i d ta n d P e r o u t k a1 9 8 9 ) .7I n t h e p e r i p h e r a l v a s c u l a t u r e , i t i s w e l le s t a b l i s h e d t h a t 5 - H Ti n d u c e dc o n t r a c t i o n o f t e n i n v o l v e s t h e b i n d i n go f s e r o t o n i nt o5 - H T 2r e c e p t o r s o n t h em e m b r a n e o f V S M C s . I n t h e s e v e s s e l s ,5 - H T 2r e c e p t o r o c c u p a t i o nt r i g g e r sp h o s p h o i n o s i t i d e h y d r o l y s i s , y i e l d i n g t h es e c o n d m e s s e n g e r 1 P 3 . 1 P 3t h e ni n i t i a t e s c o n t r a c t i o nb yr e l e a s i n gC a2+f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s( P e r o u t k a a n dS n y d e r 1 9 7 9 ;C o n na n dS a u n d e r s - B u s h 1 9 8 7 ; P e r o u t k a 1 9 8 7 ) .I n t h ec a s eo f c e r e b r o v a s c u l a r v e s s e l s , h o w e v e r ,t h e m e c h a n i s m sb yw h i c h s e r o t o n i n p r o d u c e s c o n t r a c t i o n i ns m o o t h m u s c l e a r e l e s s w e l lu n d e r s t o o d .I n c o n d u c t i n g c e r e b r a la r t e r i e s o f t h e r a t ,s e r o t o n i n - i n d u c e dc o n t r a c t i o n s a r e b l o c k e db yn a n o m o l a r c o n c e n t r a t i o n so f t h e5 - H T 2r e c e p t o ra n t a g o n i s t k e t a n s e r i n , s u g g e s t i n g t h e i n v o l v e m e n t o f5 - H T 2r e c e p t o r s i n t h i st i s s u e ( C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , i n s i m i l a r s t u d i e s c o n d u c t e do nc a n i n e b a s i l a ra r t e r i e s , s e r o t o n i ne f f e c t s h a v e b e e n a s c r i b e dt oa c t i v a t i o n o f5 -H T 1r e c e p t o r s ( P e r o u t k a a n d K u h a r 1 9 8 4 ) ,5 - H T 2r e c e p t o r s ( M u l l e rS c h w e i n i t z e r a n d E n g e l 1 9 8 3 ) , o r t o a na s y e tu n c l a s s i f i e d r e c e p t o rt y p e( C o h e na n d C o l b e r t1 9 8 6 ) . C o n t r a c t i l e r e s p o n s e st o5 - H T w h i c hc a n n o tb er e a d i l ya s c r i b e dt ot h e a c t i v a t i o n o f5 - H T 2r e c e p t o r s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i nc e r e b r a l a r t e r i e s f r o mt h ec a t( Y o u n ge t a l . 1 9 8 6 b ) a n d t h e r a b b i t ( B r a d l e ye t a l .1 9 8 6 ) .F a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e5 - H T 2r e c e p t o r m e d i a t e d c h a n g e si ni n t r a c e l l u l a rf r e e c a l c i u m h a v e b e e n s t u d i e d i n s e v e r a lt y p e s o f V S M C f r o mp e r i p h e r a l v e s s e l s u s i n g c a l c i u m - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n td y e s( N a b i k ae t a l . 1 9 8 5 ;C a p p o n i e ta l . 1 9 8 7 ; T a k a t ae ta l . 1 9 8 8 ) . T h e r e h a v ea s y e t b e e n n o d i r e c tm e a s u r e m e n t so n t h e i n f l u e n c e o fs e r o t o n i n o n f r e e i n t r a c e l l u l a rC a2+i n8c e r e b r o v a s c u l a rV S M C s t o p e r m i t c o m p a r i s o nw i t h t h ed a t a o b t a i n e d f r o mp e r i p h e r a lt i s s u e s .1 . 2 .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e so f V S M C sV a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s f r o m d i f f e r e n tp r e p a r a t i o n se x h i b i t w i d ev a r i a t i o n si n t h e i r p a s s i v e a n d a c t i v e p r o p e r t i e s .I n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g s f r o mC V S M C s s h o w r e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a l s w i t h i n t h e r a n g eo f - 4 0 m V a n d- 7 0m V i n i n t a c t g u i n e a - p i g c e r e b r a l a r t e r y( K a r a s h i m a a n dK u r i y a m a 1 9 8 1 ;Y a m a m o t o a n d H o t t a 1 9 8 6 ) ,d o g c e r e b r a l a r t e r y ( S u z u k i a n dF u j i w a r a1 9 8 2 ;F u j i w a r ae ta l . 1 9 8 2 ) ,a n d c a t m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y( H a r d e r 1 9 8 0 ;H a r d e re ta l . 1 9 8 1 ) . I n i n t a c t g u i n e a - p i gc e r e b r a l a r t e r y , t h e m e m b r a n eo f C V S M C sw a sf o u n dt o b ee l e c t r i c a l l y q u i e s c e n t , a n d n e i t h e rs p o n t a n e o u s a c t i o np o t e n t i a l sn o r m i n i a t u r e e x c i t a t o r y j u n c t i o n p o t e n t i a l s w e r eo b s e r v e d . A s i n g l e , b r i e fs t i m u l u s i n d u c e das p i k e p o t e n t i a l f o l l o w e db y ad e p o l a r i z i n gs l o w - p o t e n t i a l ,a n d t h e s e e v e n t s w e r e a s s o c i a t e d w i t h m u s c l e c o n t r a c t i o n .E x t e r n a l a p p l i c a t i o no f t e t r a e t h y l a m m o n i u m( T E A ) ,aK +c h a n n e l b l o c k e r , e n h a n c e dt h e a m p l i t u d eo f t h e s p i k e p o t e n t i a l ( K a r a s h i m a a n d K u r i y a m a 1 9 8 1 ;Y a m a m o t o a n d H o t t a1 9 8 6 ) . I n t h ei n t a c td o gc e r e b r a l a r t e r y ,C V S M C s o n l y g e n e r a t e ds p i k e s i nr e s p o n s et oo u t w a r d c u r r e n t p u l s e s u n d e r c o n d i t i o n s o f p r e t r e a t m e n tw i t h 1 0m M T E A .I n C V S M C s o f i n t a c t r a b b i t b a s i l a ra r t e r y , t h e m e a n r e s t i n gp o t e n t i a l w a s - 6 1 m V ,m e m b r a n ei n p u t r e s i s t a n c e a n d t i m e c o n s t a n tw e r e 5 - 4 0M f 2a n d 5 - 3 0m s , r e s p e c t i v e l y . A c t i o n p o t e n t i a l s w e r e r e a d i l ye v o k e db yd e p o l a r i z i n gc u r r e n t s , e v e n i n t h ea b s e n c e o f T E A ( S u r p r e n a n te ta l .1 9 8 7 ) .9W h o l e - c e l l , p a t c hc l a m pr e c o r d i n g s h a v e b e e n m a d e i nV S M C s i s o l a t e df r o m m e s e n t e r i c a r t e r y ( B o l t o ne ta l . 1 9 8 5 ) , a o r t a( T o r oe ta ! . 1 9 8 6 ) , a n dr a tc e r e b r a l a r t e r y S t e e l ee ta l 1 9 9 1 ; Z h a n ge t a l . 1 9 9 1 ) . S i n g l e a o r t aV S M C s w e r ef o u n dt oe x h i b i t i n p u t r e s i s t a n c e s i n t h e3G ( ] r a n g e , m u c hh i g h e r t h a n f o u n du s i n g c o n v e n t i o n a l i n t r a c e l l u l a r m i c r o e l e c t r o d e s . T h e s ec e l l s h a dam e a nc a p a c i t a n c e o f 1 7 p F a i i d i n m a n yc a s e s c o u l d g e n e r a t eC a2+- d e p e n d e n t a c t i o np o t e n t i a l So n d e p o l a r i z a t i o n ( T o r oe ta ! .1 9 8 6 ) . C V S M C s i s o l a t e d f r o mr a tc e r e b r a l a r t e r i e s e x h i b i t e d i n p u t r e s i s t a n c e s i n t h e r a n g e 4- 9G o ,a g a i n m u c hh i g h e r t h a n t y p i c a l o f c e r e b r a l a r t e r i e ss t u d i e d w i t h i n t r a c e l l u l a rm i c r o e l e c t r o d e s( S t e e l ee ta l .1 9 9 1 ) .I n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s , t h e d e p o l a r i z i n g p h a s eo f t h e a c t i o np o t e n t i a l h a s b e e n r e g a r d e d m a i n l ya st h e r e s u l t o f i n w a r df l o w o fC a2+t h r o u g h v o l t a g e - d e p e n d e n tC ac h a n n e l s ( B o l t o n 1 9 7 9 ; T o m i t a1 9 8 2 ) . I n w a r dm e m b r a n ec u r r e n t s g e n e r a t i n g t h ea c t i o n p o t e n t i a l a r e l i t t l e e f f e c t e db yc o m p l e t e r e p l a c e m e n to f N a w i t h T E A o rT r i s + .T e t r o d o t o x i n ,as e l e c t i v eb l o c k e r o f v o l t a g e - s e n s d v e N a c h a n n e l s i s a l s o i n e f f e c t i v e . I n c o n t r a s t ,t h e s ei n w a r d c u r r e n t s a r e s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e e x t e r n a l c o n c e n t r a t i o no fC a2+o r B a2+( T o m i t a 1 9 8 8 ) . T w o d i s t i n c t c l a s s e s o f v o l t a g e - d e p e n d e n t c a l c i u mc h a n n e l s e x i s t i n r a t v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s . O n e o f t h e s e c h a n n e l sh a sal o w t h r e s h o l d a n daf a s t i n a c t i v a t i o n r a t e ( “ f a s t c h a n n e l ” ) , w h i l e t h e o t h e rd i s p l a y sah i g h t h r e s h o l d a n das l o w i n a c t i v a t i o n r a t e ( “ s l o w c h a n n e l ” )( L o i r a n de t a l . 1 9 8 6 ) .T h e s e “ f a s t ” a n d “ s l o w ”C ac h a n n e l s s e e mt oc o r r e s p o n dt ot h e “ T( t r a n s i e n t ) - t y p e ” a n d “ L ( l o n g - l a s t i n g ) - t y p e ”C ac h a n n e l s s e e n i n o t h e rt i s s u e s( M c C l e s k e y e ta l . 1 9 8 6 ) . As t u d yo n g u i n e a - p i g t h o r a c i c a o r t as m o o t h m u s c l ec e l l s , h o w e v e r , o n l y s h o w e d t h e e x i s t e n c e o f t h e s l o w c h a n n e lt y p e( C a f f r e ye ta l . 1 9 8 6 ) . T h e i n a b i l i t y o f s o m e V S M C st og e n e r a t e a c t i o np o t e n t i a l s o n1 0m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o nb y i n j e c t e d c u r r e n tp r o b a b l y r e f l e c t s t h e i rm a r k e do u t w a r dr e c t i f i c a t i o nd u e t oe n h a n c e dK c o n d u c t a n c e , r a t h e rt h a nal a c ko fC ac h a n n e l s ( M e k a t a 1 9 7 6 ) .1 . 3 . P o t a s s i u m c u r r e n t s i n t h em e m b r a n e o fV S M C sT h e g e n e r a l r o l e o f p o t a s s i u m( K ) c u r r e n t s i n t h em o d u l a t i o no f v a s c u l a re x c i t a b i l i t y i s n o w w e l lr e c o g n i z e d . I n s m o o t h m u s c l ec e l l s ,p o t a s s i u m c u r r e n t sp l a yac r u c i a l r o l e i nt h ev a s c u l a rr e s p o n s et o e n d o g e n o u s a n dp h a r m a c o l o g i c a lv a s o d i l a t o r sb yd e t e r m i n i n g t h e r e s t i n gm e m b r a n e p o t e n t i a l , a n dt h e t i m ec o u r s e , a m p l i t u d e a n d p o l a r i t y o f e l e c t r i c a lc h a n g e s ( B r a y d e ne ta l .1 9 9 1 ) . I ng e n e r a l , a n i n c r e a s e i n Kc o n d u c t a n c e r a i s e s t h e m e m b r a n ep o t e n t i a l( h y p e r p o l a r i z a t i o n ) a n d d e p r e s s e s e l e c t r i c a le x c i t a b i l i t y ( B u l b r i n g a n dT o m i t a1 9 8 7 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e i s r e l a x a t i o n o rr e d u c t i o n o f v a s c u l a r t o n e .K - c u r r e n t s m a yb ec l a s s i f i e d i n t ov a r i o u s c a t e g o r i e s u s i n g t h ec r i t e r i a o fc h a n n e l g a t i n g p r o p e r t i e s , c o n d u c t a n c e a n dp h a r m a c o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s .B a s e d o n t h e s e c r i t e r i a , K - c u r r e n t s c a nb ed i v i d e d i n t o t h ef o l l o w i n g c l a s s e s .1 . 3 . 1 . T h ed e l a y e d ( o u t w a r d ) r e c t i f i e r K - c u r r e n tT h i sc u r r e n t c o n t r i b u t e st ot h e m a c r o s c o p i c o u t w a r d K - c u r r e n t w h i c hi sm a i n l yr e s p o n s i b l e f o r t h e r e p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a li n m a n yc e l lt y p e s .I t w a s f i r s t d e s c r i b e d i n t h e s q u i d g i a n t a x o n ( H o d g k i n a n d H u x l e y1 9 5 2 ) .S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s c o n d u c t e d i n n e u r o n e s ( C o n t ia n d N e h e r1 9 8 0 ) a n di n s k e l e t a l m u s c l e ( S t a n d e ne ta l . 1 9 8 5 ) , h a v e s h o w n a n e l e m e n t a r y1 1c o n d u c t a n c e o f 1 5 - 2 0p S .W h o l e - c e l lc u r r e n t f l o w i n g i n t h e s e c h a n n e l si n c r e a s e ss i g m o i d a l l y o n m e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n . U n d e ra c o n s t a n td e p o l a r i z i n gs t i m u l u s ,as l o w ,e x p o n e n t i a l i n a c t i v a t i o n o c c u r s , r e q u i r i n gu p t os e v e r a l s e c o n d s f o r c o m p l e t i o n .T h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e v o l t a g ed e p e n d e n c eo f a c t i v a t i o n a n d i n a c t i v a t i o n c a nb em o d u l a t e db yp r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n( B e z a n i l l ae ta l . 1 9 8 5 ) . N o s e l e c t i v ep h a r m a c o l o g i c a l a g o n i s t s a r e k n o w n f o rt h i s c u r r e n t . L i k e m o s t K c u r r e n t s , t h e d e l a y e d r e c t i f i e rc a nb eb l o c k e db y C s+ ,B a 2 +( W a g o n e r a n d O x f o r d 1 9 8 7 ) ,i n t r a c e l l u l a r T E A ( A r m s t r o n g 1 9 7 1 ) , a n de x t e r n a l T E A ( H i l l e 1 9 9 2 ) .I n s m o o t h m u s c l e c e l l s , d e l a y e d r e c t i f i e r c h a n n e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e di n p u l m o n a r y a r t e r y ( O k a b ee ta l . 1 9 8 7 ) , r a b b i tj e j u n u m( B e n h a m a n dB o l t o n1 9 8 3 ; B e n h a me ta l . 1 % 7 ) , b l a d d e r ( K i o c k n e r a n d I s e n b e r g 1 9 8 5 ) a n di ni n t e s t i n a ls m o o t h m u s c l e ( O h y ae ta l . 1 9 8 6 ) . I n t h e s e t i s s u e s , t h ed e l a y e dr e c t i f i e rc h a n n e l s m a y o p e n d u r i n g t h e r e p o l a r i z a t i o n p h a s e o f s l o we l e c t r i c a lw a v e s .1 . 3 . 2 . T h et r a n s i e n t o u t w a r d c u r r e n t ( A - c u r r e n t )T h e t r a n s i e n to u t w a r d c u r r e n t , a l s o k n o w na s “ t h e A - c u r r e n t ”( I A )w a sf i r s t d e s c r i b e di n m o l l u s c a n n e u r o n s ( C o n n o r a n d S t e v e n s1 9 7 1 ) . P a t c h c l a m ps t u d i e sh a v e s h o w n t h a t t h i s c u r r e n t i s m e d i a t e db ys i n g l e c h a n n e l so fc o n d u c t a n c e1 5 - 2 0p 5w h i c h c a nb eb l o c k e db ye x t e r n a l a p p l i c a t i o no f 4 -a m i n o p y r i d i n e( 4 - A P , T a y l o r 1 9 8 7 ) . A - c u r r e n t c h a n n e l sa c t i v a t e a n d i n a c t i v a t ev e r yr a p i d l y d u r i n g m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n s . A - c u r r e n t c h a n n e l s a r eo p e n i nt h e s u b t h r e s h o l d r e g i o n o f t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l , a n dc a n t h e r e f o r e p l a yar o l e i n d e t e r m i n i n gc e l l f i r i n gf r e q u e n c y . I n n e u r o n e s , t h i s c u r r e n tp a r t i c i p a t e s1 2i n t h e c o n t r o lo f n e u r o n a l f i r i n g r a t e ,s p i k e l a t e n c ya n d a c t i o np o t e n t i a lr e p o l a r i z a t i o n( H i l l e 1 9 8 4 ) .I n s m o o t h m u s c l ec e l l s ,ac u r r e n tw i t h p r o p e r t i e ss i m i l a rt o n e u r o n a lA -c u r r e n t s h a sb e e n d e s c r i b e d i np u l m o n a r ya r t e r y( O h y ae ta ! .1 9 8 6 ) . T h ef u n c t i o n a ls i g n i f i c a n c e o f t h i sc u r r e n ti n V S M C sr e m a i n s ,h o w e v e r ,u n c l e a r .1 . 3 . 3 . I n w a r d r e c t i f y i n gK - c u r r e n t sT h e e x i s t e n c e o fp o t a s s i u mc u r r e n t sw h i c h a r e a c t i v a t e db ym e m b r a n eh y p e r p o l a r i z a t i o nh a s b e e n r e p o r t e di n v a r i o u st i s s u e s .I n g e n e r a l ,t h e s ec u r r e n t s f a l l i n t ot w ob r o a dc a t e g o r i e s .T h ef i r s t t y p e o f c u r r e n ti sc h a r a c t e r i z e db y ah i g h s e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u mo v e r s o d i u m i o n s .T h e v o l t a g er a n g eo v e rw h i c h t h i s c u r r e n t i s a c t i v a t e d s h i f t sm a r k e d l y w h e nt h ee x t e r n a lc o n c e n t r a t i o no f p o t a s s i u mi s a l t e r e d . T h i sc u r r e n t i s b l o c k e db yl o w( 1 m M )c o n c e n t r a t i o n so f B a2+o rC s+ .C u r r e n t s o f t h i st y p e h a v eb e e n c l a s s i c a l l yd e s c r i b e d i n t h em e m b r a n eo f s t a r f i s he g g s ( H a g i w a r ae ta l . 1 9 7 6 , 1 9 7 8 ,1 9 7 9 ) , s k e l e t a lm u s c l e( A d r i a n1 9 6 9 )a n dc a r d i a c m u s c l e ( N o b l e 1 9 8 4 ) .S i n g l e c h a n n e ls t u d i e s u s i n gt h e p a t c hc l a m pt e c h n i q u e s h o wt h a t m e m b r a n ec h a n n e l s c a r r y i n gt h i st y p eo fi n w a r d r e c t i f i e rc u r r e n t h a v ea m o d e s t c o n d u c t a n c e( 2 0 - 3 0p S ) w h e n m e a s u r e di n p h y s i o l o g i c a l l ya p p r o p r i a t e p o t a s s i u ms o l u t i o n s ( B r i s m a re ta l .1 9 8 9 ; B u r t o na n dH u t t e r 1 9 9 0 ; C l a r k ee t a l . 1 9 9 0 ) . A s e c o n dc l a s s o f i n w a r dr e c t i f i e r c u r r e n th a s b e e nf o u n d i n m a n yt y p e so fn e u r o n e( H a l l i w e l l a n d A d a m s1 9 8 2 ;M a y e ra n d W e s t b r o o k1 9 8 3 ; C r e p e le ta l . 1 9 8 6 )a s w e l la si ng u ts m o o t hm u s c l ef i b r e s( B e n h a me ta l . 1 9 8 7 ) . T h i s c l a s so f i o n i cc o n d u c t a n c e s h o w sa p p r e c i a b l ep e r m e a b i l i t yt o s o d i u mi o n sa sw e l la s t oK + .T h ev o l t a g er a n g e f o ra c t i v a t i o no f t h i s c o n d u c t a n c e i si n s e n s i t i v et oc h a n g e si n t h ec o n c e n t r a t i o no f1 3e x t r a c e l l u l a r p o t a s s i u m . B a r i u mi o n s a r e r e l a t i v e l y i n e f f e c t i v e i nb l o c k i n g t h i sc u r r e n t .T od a t e ,t h e r e h a v e b e e n r e l a t i v e l yf e w d e t a i l e d s t u d i e sc o n d u c t e d o nt h e i n w a r d r e c t i f i e r c h a n n e l sf o u n d i n s m o o t h m u s c l ec e l l s . H o w e v e r ,i n m a n yt y p e so f S M C , e l e c t r o t o n i c p o t e n t i a l si n d u c e db yl a r g e h y p e r p o l a r i z i n gc u r r e n t sr e a c hap e a k a n d t h e nd e c a yw i t ht i m e . T h i s i n w a r d r e c t i f i c a t i o nh a s b e e no b s e r v e d i n S M C s i s o l a t e d f r o m g u i n e a - p i g t a e n i a c a e c i( T o m i t a 1 9 6 6 ), t o a ds t o m a c h ( S i m se ta ! . 1 9 8 5 ) a n d r a b b i tj e j u n u m( B e n h a me ta l . 1 9 8 7 ) .T h ei n w a r d r & c t i f i e r c u r r e n t p r e s e n t i n r a b b i t j e j u n u m S M C sh a s b e e n a n a l y z e du s i n g t h e w h o l e - c e l l p a t c h c l a m p t e c h n i q u e ( H a m i l le ta l . 1 9 8 1 ) .T h i s c u r r e n tb e l o n g st ot h e s e c o n d c l a s s d e s c r i b e da b o v e .A n i n w a r d l y r e c t i f y i n gc h a n n e lp e r m e a b l e t oK + , N a +a n dC a2+h a s a l s o b e e n d e s c r i b e d i n S M C s i s o l a t e df r o m t h e s t o m a c h o f t h e t o a d ( H i s a d ae ta l . 1 9 9 1 ) . T h i s c h a n n e l h a sac o n d u c t a n c e o f6 4p Si np h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n s a n d i s a c t i v a t e db ym e m b r a n eh y p e r p o l a r i z a t i o n .I n c o n t r a s tt ot h e s e f i n d i n g s i ng u ts m o o t hm u s c l e , e v i d e n c ei n d i c a t e s t h a t i n w a r d r e c t i f i e r s o f t h e f i r s t c l a s s a r e p r e s e n t i nC V S M C s t h ep r o x i m a ls e g m e n t o f r a t c e r e b r a l a r t e r i o l e s ( E d w a r d se ta l . 1 9 8 8 ) a n d i nC V S M C si n s u b m u c o s a l a r t e r i o l e s o f t h e g u i n e a - p i g i l e u m( E d w a r d s a n d H i r s t1 9 8 8 ) .T h e s e c u r r e n t s d r e u n a f f e c t e db yr e m o v a l o f e x t e r n a lN a +b u t a r eb l o c k e dh yl o w c o n c e n t r a t i o n so fB a 2+ .1 . 3 . 4 .A T P - s e n s i t i v e K - c u r r e n t .A n A T P - s e n s i t i v e K - c u r r e n t( K A T p )w a sf i r s ti d e n t i f i e d i n c a r d i a cm u s c l e ( N o m a 1 9 8 3 ) . T h i s c u r r e n tw a sf i r s t d e m o n s t r a t e da t t h e s i n g l e c h a n n e ll e v e l i n V S M C s b yS t a n d e ne t a l . ( 1 9 8 9 ) . A p r i m a r yc h a r a c t e r i s t i c o f t h i s1 4c u r r e n t i s i t s a c t i v a t i o nb yt h eh y p e r p o l a r i z i n gv a s o d i l a t o rc r o m a k a l i m a n di t si r i h i b i t i o n . b y c y t o p l a s m i cA T P ,a sw e l la s b y s u l f o n y l u r e ac o m p o u n d s ,s u c ha sg l i b e n c l a m i d e a n db y l o w c o n c e n t r a t i o n so fB a2+ .M o s tK A T Pc h a n n e l sd e s c r i b e d s h o wn o a p p a r e n t i n t r a c e l l u l a rc a l c i u md e p e n d e n c y a n d o n l ys l i g h tv o l t a g e s e n s i t i v i t y . S o m e r e c e n tr e p o r t s , h o w e v e r ,h a v ed e m o n s t r a t e dal a r g ec o n d u c t a n c e v o l t a g e a n dC a2+- s e n s i t i v e c h a n n e li n V S M C sf r o m p o r c i n ec o r o n a r y a r t e r y ( S i l b e r b e r ga n d B r e e m e n 1 9 9 0 )a n d r a b b i t a o r t a ,r a b b i tt r a c h e aa n dp i gc o r o n a r y a r t e r y ( G e l b a n de ta l . 1 9 9 0 ) w h i c h i s a l s os e n s i t i v et oc y t o p l a s m i c A T P a n dt oc r o m a k a l i m .T h i s c h a n n e lh a sb e e ni sd e s i g n a t e da st h eB K A T pc h a n n e l .K A T Pc h a n n e l si n v a r i o u st y p e s o f S M C s m a y p l a yar o l ei n p r o t e c t i o na g a i n s t i s c h e m i c a n d a n o x i ci n s u l t s( G e l b a n de ta l .1 9 9 0 ;S i l b e r b e r g a n d B r e e m e n 1 9 9 0 ) .1 . 3 . 5 . C a - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l sA t p r e s e n t t h r e e g r o u p s o fc a l c i u m - d e p e n d e n tK - c h a n n e l s ,K C ah a v eb e e nd e s c r i b e di n m a n y t i s s u e s ,b a s e d o n t h e i rs i n g l e c h a n n e lc o n d u c t a n c e ,c a l c i u m s e n s i t i v i t y ,v o l t a g e d e p e n d e n c e ,a n dp h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e s .T h e s et h r e e g r o u p so fK C ac h a n n e l sa r e d e s i g n a t e da sl a r g ec o n d u c t a n c ec a l c i u m -a c t i v a t e dc h a n n e l s ( B K ) , i n t e r m e d i a t ec o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e dc h a n n e l s( 1 K ) , a n d s m a l lc o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e dc h a n n e l s( S K ) . An u m b e r o fr e v i e w sa b o u tt h e s e c h a n n e l s h a v eb e e n p u b l i s h e d( T o m i t a 1 9 8 8 ;L a t o r r ee t a l .1 9 8 9 ;E d w a r d s a n d W e s t o n1 9 9 0 ; K o I b 1 9 9 0 ) .P r o p e r t i e s o ft h e s e c h a n n e lt y p e sa r ed i s c u s s e d i nt h e f o l l o w i n g s e c t i o n .1 . 4 .C a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s1 51 . 4 . 1 . L a r g e c o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s , B KB Ko rm a x i - Kc h a n n e l sh a v e b e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d i n m a n yc e l lt y p e s .E l e m e n t a r y c u r r e n t sf l o w i n gi n B K c h a n n e l sw e r ef i r s t o b s e r v e d i n b o v i n ea d r e n a lc c i r o m a f f i nc e l l s( M a r t y , 1 9 8 1 )a n d l a t e r i nc e l l s f r o m s k e l e t a lm u s c l e( M e t h f e s s e l a n d B o h e i m1 9 8 2 ;L a t o r r ee ta l .1 9 8 2 ;V e r g a r a a n d L a t o r r e1 9 8 3 ;V e r g a r ae ta l .1 9 8 4 ;B l a t za n d M a g l e b y 1 9 8 4 ,1 9 8 6 ;M o c z y d l o w s k i 1 9 8 3 ,1 9 8 5 ) ,c a r d i a cm u s c l e( C a l l e w a e r te t a l .1 9 8 6 ) , e n d o c r i n ec e l l s( W o n ge ta l .1 9 8 2 ;M a r t y1 9 8 3 ;Y e l l e n 1 9 8 4 ;W o n g a n d A d l e r1 9 8 6 ) ,e x o c r i n e c e l l s( M a r u y a m ae ta l . 1 9 8 3 ;C o o k e ta l . 1 9 8 4 ;F i n d l a ye ta l .1 9 8 5 ; G i t t e re t a l . 1 9 8 7 ;G r a ye ta l .1 9 9 0 ) , e p i t h e l i a lc e l l s( C h r i s t e n s e na n dZ e u t h e n1 9 8 7 ) a n di m m u n ec e l l s( G a l l i n 1 9 8 4 ) .B Kc h a n n e l sh a v eb e e ni d e n t i f i e di nS M C s d e r i v e df r o mt h ei n t e s t i n e ( B e n h a me ta l . 1 9 8 5 ,1 9 8 6 ;C e c c h i e ta l . 1 9 8 6 ; M a y e re ta ! .1 9 9 0 ) ,s t o m a c h ( B e r g e re ta l . 1 9 8 4 ;C a r le ta l . 1 9 9 0 ) ,p e r i p h e r a la r t e r i e s( B e n h a me ta ! .1 9 8 5 , 1 9 8 6 ;B o l t o ne t a l . 1 9 8 5 ; I n o u ee ta l . 1 9 8 5 ) ,a i r w a y ( M c C a n na n dW e l s h , 1 9 8 6 ) ,u r e t e r ( S h u b a1 9 8 1 ) a n dt a e n i a c a e c i( I n o m a t a a n d K a o1 9 7 9 ) .B Kc h a n n e l se x h i b i tt h e f o l l o w i n gp r o p e r t i e s :( 1 )l a r g es i n g l e c h a n n e lc o n d u c t a n c ei nt h er a n g e o f1 5 0 - 3 0 0p Sa t as y m m e t r i c a l ,h i g h Kc o n c e n t r a t i o n s ;( 2 ) h i g hs e l e c t i v i t yf o rK +o v e ro t h e rm o n o v a l e n tc a t i o n s ;( 3 )a c t i v a t i o nb yi n t r a c e l l u l a rc a l c i u m( 1 -1 0M ) a n d m e m b r a n ev o l t a g e ( e - f o l di n c r e a s ei n c u r r e n tf o r 9 - 1 5m V d e p o l a r i z a t i o n ) ;( 4 )b l o c k a d eb ye x t e r n a l l ya p p l i e dT E A( K d< 1 m M ) ,q u i n i n e ,B a2 + a n d , i n m o s tc a s e sb yt h es c o r p i o nt o x i nc h a r y b d o t o x i n .B Kc h a n n e l sa r e h i g h l ys e l e c t i v ef o r K ±o v e r N a +( P N a / K< 0 . 0 5 ) .I ng e n e r a l ,t h ep e r m e a b i f l t ys e q u e n c ef o r t h em o n o v a l e n tc a t i o n si nt h e s ec h a n n e l s1 6a p p e a r st o b es u b s t a n t i a l l yi n d e p e n d e n t o f t h e c e l lt y p e ( T o n i l i n se ta l .1 9 8 4 ;B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ; A k b a r a k ie t a l . 1 9 8 9 ; E m e r a ne ta l . 1 9 9 0 ) .T h i s s e q u e n c ei sT I + > K +> R b +> N H 4 +> > C s + > N a + > L j + .T h e s e n s i t i v i t y o f B K c h a n n e l st o [ C a2+] iv a r i e s s i g n i f i c a n t l ya m o n gd i f f e r e n t c e l lt y p e s .F o r e x a m p l e , i nr a b b i t j e j u n u m a n dg u i n e a - p i gm e s e n t e r i ca r t e r y S M C , 1 0 - 9M[ C a2+] ji s s u f f i c i e n tt oa c t i v a t e B Kc h a n n e l s ( B e n h a me ta ! . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , i nc a n i n ea i r w a y S M C , B K c h a n n e l s r e q u i r e[ C a2+ J j > 1 0 -7Mf o r a c t i v a t i o n ( M c C a n n a n dW e l s h 1 9 8 6 ) . B K c h a n n e lo p e n p r o b a b i l i t y i sa l s o s e n s i t i v e t om e m b r a n ep o t e n t i a l . A g a i n , h o w e v e r , t h e v o l t a g ed e p e n d e n c yo f c h a n n e l o p e n i n g v a r i e s a m o n g d i f f e r e n t c e l lt y p e s .T h i sv o l t a g e d e p e n d e n c es e e m st or e s u l t f r o m t h e p o t e n t i a l d e p e n d e n t b i n d i n g o fC a2+t o t h e c h a n n e l ,r a t h e r t h a nf r o m a n i n t r i n s i c c h a n n e l d i p o l e ( K o l b 1 9 9 0 ) .T h e g a t i n g k i n e t i c s o f B K c h a n n e l s c a nb ev e r y c o m p l e x . B K c h a n n e l si nc u l t u r e d r a t m u s c l e s h o w f o u r d i s t i n c t m o d e s o f g a t i n g , d e f i n e da sn o r m a l ,i n t e r m e d i a t e o p e n ,b r i e f o p e n a n d b u z z ( M c M a n u sa n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . T h en o r m a l g a t i n g m o d e ( 9 6 % o fa l l t r a n s i t i o n s )i t s e l f d i s p l a y s a t l e a s t t h r e et of o u ro p e ns t a t e sa n d s i xt oe i g h t s h u t s t a t e s o f t h e c h a n n e l ,a si n d i c a t e db yt h e m u l t i -e x p o n e n t i a ln a t u r e o f d w e l l t i m e d i s t r i b u t i o n s . I n c o n t r a s t , B Kc h a n n e l s i nV S M C si s o l a t e d f r o m m e s e n t e r i c a r t e r y d i s p l a y a p p a r e n t l y s i m p l e rk i n e t i c s ( t w oo p e n s t a t e sa n d t h r e e c l o s e ds t a t e s ,B e n h a me ta ! . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , i t i s n o tc l e a r w h e t h e r t h i s s i m p l i c i t y r e f l e c t s t h e u s e o f s h o r t e r l e n g t h s o fd a t af o ra n a l y s i s , w h i c h w o u l d e l i m i n a t e i n f r e q u e n t l y o c c u r r i n g o p e ns t a t e sa n d l o n gd u r a t i o n c l o s e d s t a t e s( M c M a n u s a n d M a g l e b y1 9 8 8 ) .1 7E x p e r i m e n t s w i t hB K c h a n n e l s r e c o n s t i t u t e di n t ol i p i d b i l a y e r ss t r o n g l yi n d i c a t e t h a tC a2+a c t s a s a s i m p l e l i g a n dt op r o m o t ec h a n n e lo p e n i n g ,r a t h e rt h a n a c t i v a t i n ga c a l c i u m - d e p e n d e n t r e a c t i o np a t h w a y , s u c ha s C a2+ -c a l m o d u l i n o rp r o t e i n k i n a s e C - d e p e n d e n tp h o s p h o r y l a t i o n( L a t o r r ee ta l .1 9 8 5 ) . C o m p l e xs t a t ed i a g r a m sh a v e b e e n d e v e l o p e df o rt h e B K c h a n n e l i nw h i c h 1 - 3 c a l c i u m i o n s b i n d s e q u e n t i a l l yt ot h ec h a n n e l , s t a b i l i z i n g o n eo fan u m b e r o f o p e n o r c l o s e ds t a t e s .U n i l i g a n d e dc h a n n e l s a r e p r e s u m e dt o b er e s p o n s i b l ef o r t h e m a j o r i t y o f s h o r t d u r a t i o nc h a n n e l o p e n i n g s ,w h i l e t h eb i n d i n go f t h e s e c o n d a n d t h i r dc a l c i u mi o n s s t a b i l i z e s t h el o n g e r - l i v e do p e ns t a t e s( B a r r e t t e ta l .1 9 8 2 ;M o c z y d l o w s k ia n d L a t o r r e1 9 8 3 : M c M a n u sa n dM a g l e b y1 9 8 8 ) .I n B K c h a n n e l s o fs k e l e t a lm u s c l e f i b e r s ,i n t r a c e l l u l a rm a g n e s i u mi o n s c a n p r o m o t e c h a n n e lo p e n i n g a t p h y s i o l o g i c a lc o n c e n t r a t i o n so f t h i s c a t i o n ( 0 . 4- 3m M )( S q u i r e a n dP e t e r s e n 1 9 8 7 ) . T h ef u n c t i o n a ls i g n i f i c a n c eo f t h i s p h e n o m e n o n i sa s y e tu n c l e a r .B K c h a n n e l si n m o s t ,b u tn o t a l l p r e p a r a t i o n sa r e b l o c k e db y n a n o m o l a rc o n c e n t r a t i o n so f t h es c o r p i o n t o x i nc h a r y b d o t o x i na p p l i e dt ot h ee x t e r n a lm e m b r a n ef a c e( M i l l e re ta l . 1 9 8 5 ) .T h i s t o x i na p p e a r st oa c t a sa n o p e nc h a n n e l b l o c k e r .I n m o s t p r e p a r a t i o n s ,l o w c o n c e n t r a t i o n s( 0 . 1 - 1 m M ) o f T E Aa p p l i e dt ot h e e x t e r n a lm e m b r a n e f a c er e v e r s i b l y b l o c k c u r r e n tf l o w i n B Kc h a n n e l s i nam a n n e r o n i y w e a k l yd e p e n d e n t o nm e m b r a n ev o l t a g e .T h i si n t e r a c t i o nm a yb ed e s c r i b e da s am o n o m o l e c u l a r r e a c t i o nw i t h a na p p a r e n td i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ,K d= 0 . 3m M ( Y e l l e n1 9 8 4 a , 1 9 8 4 b ; V e r g a r aa n dL a t o r r e1 9 8 3 ; B l a t za n dM a g l e b y 1 9 8 4 ) .T E Aa l s o b l o c k s c u r r e n tf l o w i n B K c h a n n e l sw h e n a p p l i e dt o t h ei n t e r n a l m e m b r a n ef a c e . I n c u l t u r e d m y o t u b e s( B l a t za n dM a g l e b y1 9 8 4 ) ,1 8c h r o m a f f i nc e l l s( Y e l l e n 1 9 8 4 a ,1 9 8 4 b ) ,a n d i nm e s e n t e r i ca r t e r y V S M C s( B e n h a me ta L .1 9 8 5 ) , t h eK df o rb l o c kb yi n t e r n a l l ya p p l i e d T E Ai s 1 2 m Mo rh i g h e r . I n m a r k e dc o n t r a s t , B K c h a n n e l si n c l o n a l p i t u i t a r yc e l l s ( W o n g a n dA d l e r 1 9 8 6 )a n di n b r & ns y n a p t o s o m a lm e m b r a n e s ( F a r l e ya n d R u d y 1 9 8 8 )d i s p l a yam u c hh i g h e r s e n s i t i v i t yt o i n t e r n a l T E A , w i t haK di n t h e 0 . 1 m Mr a n g e .B Kc h a n n e l sa r e a l s ob l o c k e db yC s+a p p l i e dt oe i t h e rm e m b r a n e f a c e .T h i s b l o c ki s i n t e n s i f i e da t m e m b r a n ev o l t a g e sw h i c h d r i v eC si o n s i n t ot h eo p e nc h a n n e l .T y p i c a l l y ,t h eb l o c k i st o of a s tt o b ek i n e t i c a l l yr e s o l v e d ,a n dr e s u l t si n a n a p p a r e n tr e d u c t i o n i n m e a n s i n g l ec h a n n e lc u r r e n t ( Y e l l e n1 9 8 4 a ,1 9 8 4 b ) .I n n e u r o n e s ,c u r r e n t f l o w i nB K c h a n n e l ss e r v e st or e p o l a r i z et h em e m b r a n et o w a r d sE K ,t e r m i n a t i n gv o l t a g e - d e p e n d e n tc a l c i u m e n t r ya n dr e s t o r i n gf i r i n gf r e q u e n c yt or e s t i n gl e v e l s .B K c h a n n e l sa p p a r e n t l ym e d i a t e t h em a c r o s c o p i cm e m b r a n ec u r r e n td e s i g n a t e da sI ci nm a n yt y p e so f e x c i t a b l ec e l l .T h i s c u r r ç n tg e n e r a t e st h e f a s t a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o ns e e nd u r i n g a c t i o np o t e n t i a lf i r i n gi n t h e s ec e l l s( K a c z m a r e ka n dL e v i t a n1 9 8 7 ) .I t h a sa l s ob e e np r o p o s e dt h a tB K c h a n n e l sm a yp l a yar o l ei n t h ea f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o ns e e ni n C V S M C so fc e r e b r a l a r t e r i e s( H i r s t e ta ! . 1 9 8 6 ;S t e e l ee t a l .1 9 9 1 ) .1 . 4 . 2 .I n t e r m e d i a t ec o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s ,1 K1 Kc h a n n e l sh a v eb e e n i d e n t i f i e di nag r e a t v a r i e t yo f t i s s u e si n c l u d i n gn e u r o n e s( E w a l d e ta l .1 9 8 5 ) ,r a t k i d n e yt u b u l e s( F r i n d ta n dP a l m e r1 9 8 7 )a n dr a tb r a i n s y n a p t o s o m e s( F a r l e ya n dR u d y1 9 8 8 ) .T h e s ec h a n n e l s s o m e t i m e sc o e x i s tw i t hB K c h a n n e l s( A k b a r a l ie ta ! .1 9 9 0 ) . C h a n n e lc o n d u c t a n c ev a r i e s1 9f r o m 3 0t o1 2 0p S .Q u i n i n e ,q u i n i d i n e , T E A a n d c h a r y b d o t o x i na c t a s b l o c k e r so f1 Kc h a n n e l s( K o i b1 9 9 0 ; E d w a r d s a n dW e s t o n 1 9 9 0 ) .1 K c h a n n e l s o f c o n d u c t a n c ea r o u n d 1 0 0p Sh a v e b e e nd e t e c t e d i nV S M C s i s o l a t e d f r o m r a b b i tp o r t a l v e i n ( I n o u ee ta l .1 9 8 5 , 1 9 8 6 )a n d h u m a nc y s t i ca r t e r y ( A k a r a l ie ta l . 1 9 9 0 ) . T h e s ec h a n n e l s s h o w a ni n c r e a s e d o p e np r o b a b i l i t y o n c e l l d e p o l a r i z a t i o n o r i n c r e a s i n g[ C a2+I i ,b u tt h eo p e np r o b a b i l i t y i s q u i t e l o wa tn o r m a lr e s t i n g p o t e n t i a l s o f- 5 0 m V t o- 5 5m V .T h e s e1 K c h a n n e l s m a yt h e r e f o r e b e m o r e i m p o r t a n t i nr e p o l a r i z a t i o n a f t e r t h ea c t i o n p o t e n t i a l t h a n i n m a i n t a i n i n g t h er e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a l ( I n o u ee ta l . 1 9 8 5 ) .1 . 4 . 3 . S m a l l c o n d u c t a n c e c a l c i u m - a c t i v a t e d c h a n n e l s ,S K .T h e S Kc h a n n e l s e x h i b i ta c o n d u c t a n c e i n t h e r a n g e o f 1 0 - 1 4p Sa n dw e r ef i r s t d e s c r i b e d i nc u l t u r e dr a ts k e l e t a l m u s c l e c e l l s ( B l a t z a n dM a g l e b y1 9 8 6 ) a n d i n g u i n e a - p i g h e p a t o c y t e s ( C o o k a n d H a y l e t t 1 9 8 5 ) .S K c h a n n e l se x h i b i t n ov o l t a g e s e n s i t i v i t y a n d i ng e n e r a l t h e s e c h a n n e l s a r e m o r es e n s i t i v et h a n B Kc h a n n e l st o [ C a2+] j .S K c h a n n e l s m e d i a t e t h e s l o wa f t e r h y p e p o I a r i z a t i o n( A H P ) w h i c h f o l l o w s t h e a c t i o n p o t e n t i a l i nm a n y c e l lt y p e s( P e n n e f a t h e re ta l . 1 9 8 5 ) . T h e s l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n p l a y sa k e yr o l e i n s p i k e f r e q u e n c y a d a p t a t i o n i n n e u r o n e s ( B a r r e t t a n d B a r r e t t 1 9 7 6 ;B a r r e t t e ta l . 1 9 8 1 ; K a w a i a n d W a t a n a b e 1 9 8 6 ) .E x t e r n a l l y a p p l i e d T E Aa tc o n c e n t r a t i o n su p t o2 5 m M h a s n os i g n i f i c a n t b l o c k i n ge f f e c t o n S K c h a n n e l s i n s k e l e t a lm u s c l e c e l l s ( R o m e y a n dL a z d u n s k i1 9 8 4 ; B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 6 ) o r i n t h e s y m p a t h e t i cn e u r o n e s2 0(Pennefather et al. 1986). SK channels are however blocked by nanomolarconcentrations of the bee toxin apamin (Kolb 1990). Among smooth musclecells, SK channels have yet to be studied at the single channel level ofresolution. However, apamin is known to block neurotensin induced relaxationin rat ileum smooth muscle, suggesting that SK channels are indeed present insome SMCs (Kullack et a!. 1987)1.4.4. Modulation of the ionic current through KCa channelsBoth single channel and whole-cell studies have suggested that thecurrent through KCa cl’annels can be modulated by neurotransmitters orintracellular second messengers, and by putative K+ channel openers, such ascromakalim and penacidil.The relaxation of guinea-pig taenia coli mediated bya-adrenergicagonists involves activation of KCa channels, with subsequent membranehyperpolarization (Buibring and Tomita 1987). As noted above, neurotensininduced relaxation of rat ileum smooth muscle can be blocked by apamin,suggesting the involvement of SK channels in this process (Kullack et al. 1987).cAMP has been shown to activate KCa channels in rat aorta VSMCs, suggestingthat phosphorylation may play a role in the activation of these channels(Sadoshima et a!. 1988). In tracheal myocytes, protein kinase A activates KCachannels (Kume et al. 1989) while the muscarinic activation of canine colonicsmooth muscle appears to involve suppression of KCa channel activity via apertussis toxin sensitive G protein (Cole and Sanders 1989). In porcinecoronary artery, the newly discovered vasoactive peptide endothelin has beenfound to enhance the probability of opening of BK channels, while higher doses21o f t h ep e p t i d e( >1 0 n M ) i r r e v e r s i b l y i n h i b i t e d t h i s c h a n n e l .T h e s e a c t i o n sc o u l d p l a y r o l e s i n t h e v a s o d i l a t o r a n dv a s o c o n s t r i c t o r e f f e c t s o f t h i sp e p t i d e( H ue ta l . 1 9 9 1 ) . T h ep o t e n tv a s o d i l a t o rn i t r o p r u s s i d e a p p e a r st or e l a xa o r t i cV S M C sb ya c t i v a t i n gK C ac h a n n e l s( W i l l i a m se ta ! . 1 9 8 8 ) . T h ep o t a s s i u mc h a n n e l o p e n e r c r o m a k a l i m a c t i v a t e s B Kc h a n n e l s i n h u m a nm e s e n t e r i c a r t e r yb yd e c r e a s i n g t h e m e a n s h u t t i m e o ft h e s e c h a n n e l s ( K i o c k n e re ta l .1 9 8 9 ) .1 . 5 .R a t i o n a l eI t i s e v i d e n t f r o m t h i s r e v i e wt h a tK C ac h a n n e l s h a v e b e e n w e l ls t u d i e di n V S M C sf r o m i s o l a t e dp e r i p h e r a l v e s s e l s ,a sw e l la si n s m o o t hm u s c l e c e l l sf r o mn o n - v a s c u l a r t i s s u e s ( T o m i t a1 9 8 8 ; S p e r e l a k i s a n d O h y a 1 9 8 9 ;A l c b a r a k ie ta l . 1 9 9 0 ; E d w a r d s a n dW e s t o n1 9 9 0 ) . I n c o n t r a s t , h o w e v e r ,K C ac h a n n e l s h a v eb e e n l i t t l e s t u d i e di nS M C sd e r i v e d f r o m t h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o no f m a m m a l s .T h e f e wp a p e r s w h i c h h a v e a p p e a r e d o n t h i s t o p i c h a v e c l e a r l y d e m o n s t r a t e dt h e p r e s e n c e o fK C ac u r r e n t s i n C V S M C s i s o l a t e d f r o m r a tc e r e b r a l a r t e r i e s ,b u t a s y e tf e w d e t a i l so f t h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e s ec h a n n e l s a r ea v a i l a b l e ( Z h a n g e ta ! . 1 9 9 1 ; S t e e l ee ta ! . 1 9 9 1 ) .T h i s a b s e n c e o fk n o w l e d g ei s r e g r e t t a b l e , i n v i e w o f t h e a p p a r e n ti m p o r t a n c e o ft h e s e c h a n n e l s i n r e g u l a t i n g t h e c o n t r a c t i l es t a t e o f V S M C s .K C ac h a n n e l s m a ya l s o p l a yai m p o r t a n t r o l e i n t h ee t i o l o g y o f t h e v a s o s p a s mt h a t o c c u r s i nm a n y p a t i e n t s f o l l o w i n gs u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e ( M i c h e le t a l .1 9 9 0 ) .I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t f r e e r a d i c a l s m a y m e d i a t e t h ev a s o c o n s t r i c t o ra c t i o n o f o x y h e m o g l o h i n o nc e r e b r o v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e .O x y h e m o g l o b i ni n d u c e d c b n t r a c t i o n s a r e a c c o m p a n i e db ya n i n c r e a s e i nK C ac u r r e n t si n2 2CVSMCs, presumably as a result of an elevated level of free intracellularcalcium (Steele et al. 1991).With these considerations in mind, it was decided to perform a studydesigned to elucidate the biophysical properties of KCa channels in CVSMCsderived from adult rats. Conventional intracellular recording techniques werenot suitable for this preect, since these methods cannot resolve current flow inindividua’ membrane channels. For this purpose it was necessary to employ thepatch clamp method, devised by Neher and Sakmann (Hamill et al. 1981;Sakmann and Neher 1983). This decision in turn required the use ofenzymatically dissociated CVSMCs, since the membrane of smooth muscle cellsis invested by a tough connective tissue matrix in intact vessels (Ross and Reith1985).The goals of this project may then be stated as follows:1. To devise methods for the enzymatic dispersion of CVSMCs from thecerebral arteries of adult rats. Isolated cells were found to remain viablein Vitro for several days after isolation. Histological andimmunocytochemical methods were employed to identify dispersedCVSMCS in these preparations.2. To perform patch clamp recordings in the whole-cell, current clampmode to determine the basic electrophysiological properties of dispersedCVSMCs.233. To perform patch clamp recordings in the isolated, inside-out patchmode in order to investigate the biophysical properties of single KCachannels in the CVSMC membrane. These properties included singlechannel conductance, channel kinetics, modulation of channel gating bymembrane voltage and intracellular free calcium, and the sensitivity ofthese channels to the potassium channel blockers TEA and Cs +.4. Since the gating of KCa channels is critically dependent on thelevel of intracellular free calcium, it was also decided to estimate thevalue of this parameter in dispersed CVSMCs, using the calcium-sensitive probe fura-2.5. As noted previously, there is some uncertainty as to the mode ofaction of the vasoconstrictor 5-HT on cerebrovascular smooth muscle. Itwas therefore decided to investigate this matter using the fura-2 assay ofintracellular calcium.24Chapter 2Experimental Procedures2.1. Disprsal of cerebrovascular smooth muscle cellsExperiments were performed on cerebrovascular smooth muscle cells(CVSMCs) isolated from the middle, basilar, posterior communicating andposterior cerebral arteries of adult Wistar rats (200-250 g, Charles River,Montreal). Rats were sacrificed by decapitation under sodium pentobarbitalanaesthesia (30 mg/kg). The cerebral hemispheres and cerebellum wereexposed by removing the parietal bone. The brain was carefully removed underaseptic conditions and placed in a 60 mm culture dish with brain dissectingbuffer solution containing Ca2+ and Mg2+ free Hank’s Balanced Salt solution(HBSS, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) of the following composition, inmM: 138 NaC1, 5 KC1, 0.3 KH2PO4, 0.3 Na2HPO4.7H20, 18 Dextrose, 4NaHCO3, 15.7 HEPES with penicillin 100 U/mi and streptomycin 100g/ml(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), pH 7.4. Under the low power of adissecting light microscope, the basilar, middle, posterior communicating andposterior cerebral arteries and their first order and second order side branches(Fig 1) were removed (Fig 1) using iridectomy scissors and fine forceps andplaced in a 65 mm culture dish filled with potassium glutamate (KG) buffersolution containing, in mM: 140 glutamic acid monopotassium, 16 NaHCO3, 0.5NaH2PO4, 16.5 Dextrose and 25 HEPES, pH 7.4. After incubation in KGsolution for 10 minutes at 370C, the vessels were minced with iridectomy scissorsinto 0.5 mm fragments. The fragments were then transferred into a 15 mlcentrifuge tube containing 3 ml of 0.1% trypsin (Type C, Sigma, dissolved in KGsolution) and incubated at 37oC for 10 minutes. The tissue suspension was then25F i g u r e1 .V e t 4 r a la s p e c to ft h ea d u l tr a tb r a i ns h o w i n gp o s i t i o n so ft h eb a s i l a r ,p o s t e r i o rc o m m u n i c a t i n g ,p o s t e r i o ra n dm i d d l ec e r e b r a la r t e r i e su s e di nt h i ss t u d y .2 6- M i d d l eC e r e b r a lA r t e r yP o s t e r i o rC o m m u n i c a t i n gA r t e r yP o s t e r i o rC e r e b r a lA r t e r yB a s i l a rA r t e r y2 7c e n t r i f u g e d , a n d r e s u s p e n d e d i na t u b ec o n t a i n i n g3m l o f0 . 3 %c o l l a g e n a s e( T y p e 1 A , S i g m a , d i s s o l v e d i n K G s o l u t i o n ) a n d 0 . 2 m l o f0 . 5 %t r y p s i n i n h i b i t o r( S i g m a , d i s s o l v e d i n K Gs o l u t i o n ) .F o l l o w i n g i n c u b a t i o na t 3 7 ° Cf o r 1 5m i n u t e s ,t h e c e l ls u s p e n s i o nw a sa l l o w e dt o s e d i m e n t f o r3m i n u t e s a n d t h es u p e r n a t a n tw a sr e m o v e d . C e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n3m l o f h o r s es e r u m ( h e a t - i n a c t i v a t e d ,G i b c o)a t 4 ° C i no r d e rt oi n h i b i t t h ea c t i v i t yo fe n z y m e s . T h i s s u s p e n s i o nw a sc e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n tw a sd i s c a r d e d . A6m l v o l u m e o fK G s o l u t i o nw a sp l a c e d i n t h et u b ea n d c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d , w a s h e d a n d c e n t r i f u g e d . Af i n a l r e s u s p e n s i o ni n 1 m l o f K G s o l u t i o nw a sm a d e . A0 . 2 m l o f t h i s c e l ls u s p e n s i o n w a sp i p e t t e d o n t oap r e - c o a t e dg l a s sc o v e r s l i p( s e e S e c t i o n 2 . 1 . 1 . )a n d a l l o w e dt os e t t l e f o ra tl e a s t3 0m i n u t e sa tr o o m t e m p e r a t u r e ( 2 1 - 2 3 ° C ) . I fi n t e n d e d f o ru s ei n f u r a - 2 d e t e r m i n a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , t h e c o v e r s l i pw a s t r a n s f e r r e di n t oa 3 5m m c u l t u r e d i s h w i t h 2 m l o f M i n i m u m E s s e n t i a lM e d i u m ( M E M , G i b c o )c o n t a i n i n g , i n m M : 4 L - g l u t a m i n e , 1 6 N a H C O 3 , 2 0H E P E S , a n d1 5 %h o r s e s e r u m( G i b c o ) ( S t u r e k a n d H e r m s m e y e r 1 9 8 6 ) . T h e s ec u l t u r e sw e r e i n c u b a t e d i na 1 0 %C 0 2i n c u b a t o ra t 3 7 ° Cf o r 2 - 4d a y s p r i o rt ou s e .I n t h ec a s eo f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a ls t u d i e s , c o v e r s l i p s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o3 5m m c u l t u r ed i s h e s w i t h 2 m l o f m a i n t e n a n c e s o l u t i o n c o n t a i n i n g , i n m M : 1 3 3N a C 1 ,5K C 1 ,0 . 8C a C 1 2 ,1 . 3M g C 1 2 ,5G l u c o s e , 1 0 H E P E S w i t h p e n i c i l l i n ( 1 0 0U / m i , S i g m a )a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0 j . g / m 1 , S i g m a ) ( Z h a n ge ta l . 1 9 9 1 ) . C e l l sw e r em a i n t a i n e da t4 o Ci nar e f r i g e r a t o r a n d u s e dw i t h i n7 2h o u r so f p l a t i n g .2 . 1 . 1 . C o v e r s l i pp r e p a r a t i o n1 8m m c i r c l e g l a s s c o v e r s l i p s ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o m p a n y , c a t . n o . 1 2 - 5 4 5 -1 0 0 )w e r e c l e a n e d i nc o n c e n t r a t e d n i t r i c a c i da t 6 0 ° Cf o r3 0m i n u t e s a n d t h e n2 8s t e r i l i z e d i n a n a u t o c l a v e f o r 4 0 m i n u t e s .A f t e r s o a k i n g o v e r n i g h t i n1 0 g / m lp o l y - D - l y s i n e ( S i g m a ) d i s s o l v e d i n 0 . 1 5 M b o r a t eb u f f e r s o l u t i o n ( p H8 . 4 ) ,c o v e r s l i p s w e r e r i n s e d i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . 0 . 2 m lH B S S ( G i b c o ) c o n t a i n i n g1 6 . 7gl a m i n i n ( S i g m a )w a s a d d e d t oe a c h c o v e r s l i p2 - 3 h o u r s b e f o r eu s e .2 . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f i s o l a t e d C V S M C s2 . 2 . 1 . M a s s o n t r i c h r o m e t e s tS m o o t h m u s c l e c e l l s c a nb ei d e n t i f i e db yt h eu s eo f t h eM a s s o n t r i c h r o m es t a i n ( M a s s o n 1 9 2 9 ; S p a t ze ta l . 1 9 8 3 ) . I n t h i s m e t h o d , t h e c e l l s o n t h e c o v e rs l i p w e r ef i r s t f i x e d w i t h2 . 5 %f o r m a l i n i n p h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o n ( P B S )c o n t a i n i n g ,i n m M : 1 4 9 N a C l , 2K H 2 P O 4 ,4 . 2N a 2 H P O 4 ,p H 7 . 4 f o r 1 0 m i n u t e s .N u c l e i w e r es t a i n e d w i t h5 0 %i r o n h e m a t o x y l i n ( 1 : 1 i nH 2 0 )i n5m i n u t e sf o l l o w e d b yd i f f e r e n t i a t i o n w i t h1 %a c i d a l c o h o l f o r 1 s e c o n d . A f t e r w a s h i n gw i t hd i s t i l l e d w a t e r , t h e c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h2 %P o n c e a u a c i d s o l u t i o n( d i s s o l v e d i n1 %a c e t i ca c i d ) f o r 2 . 5 m i n u t e s . T h i sd y es t a i n st h e c y t o p l a s m o fs m o o t hm u s c l e c e l l s . T h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d f i n a l l yd i f f e r e n t i a t e dw i t h1 %p h o s p h o t u n g s t i c a c i d f o r5m i n u t e s . S t a i n e d c e l l s w e r ed e h y d r a t e db ys e q u e n t i a la p p l i c a t i o n o f7 0 % , 9 5 % ,a n d1 0 0 %e t h a n o ls o l u t i o n s ,c l e a n e di ux y l e n e a n d m o u n t e d o n p r e c l e a n e d g l a s s m i c r o s c o p e s l i d e s ( F i s h e r )w i t h m o u n t i n gm e d i a ( C o v e r b o n d , S c i e n t i f i c P r o d u c t s , M c G r a w P a r k , I l l i n o i s ) .T h en u c l e i o f C V S M C s a n d b a c k g r o u n dc e l l s ( e n d o t h e l i a l c e l l s ,f i b r o b l a s t s ) w e r es t a i n e db l a c k . T h e c y t o p l a s m o f C V S M C s w a s s t a i n e d r e d , w h i l e t h e c y t o p l a s mo fc e l l so f c o n n e c t i v e t i s s u e o r i g i n w a s s t a i n e d b l u e .2 92 . 2 . 2 . I m m u n o f l u o r e s c e n t a n d i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n go f C V S M C sS m o o t hm u s c l e c e l l sc a n a l s ob ei d e n t i f i e db ya p p l i c a t i o no fam o n o c l o n a la n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t h m u s c l ea - a c t i n ( F r a n k ee ta l . 1 9 8 0 ) . I nt h i s m e t h o d ,c o v e r s l i p s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S , f i x e d i n2 . 5 % f o r m a l i n( d i s s o l v e d i nP B S ) f o r5m i n u t e s , a i rd r i e d , a n d w a s h e d t h r e e t i m e s w i t hP B S . A f t e r b l o c k i n gn o n s p e c i f i c b i n d i n g w i t h5 0 %g o a ts e r u m ( G i b c o ) f o r 2 0m i n u t e sa tr o o mt e m p e r a t u r e , c o v e r s l i p s w e r e i n c u b a t e dw i t h t h e p r i m a r y a n t i b o d y ,a m o n o c l o n a la n t i b o d y s p e c i f i c f o r s m o o t h m u s c l ea- a c t i n ( C G A 7 , S i g m a , d i l u t e d1 : 4 0 0 w i t hP B S ) o v e r n i g h ta t4 ° C . C o v e r s l i p s w e r e r i n s e dt h r e e t i m e s w i t h P B Sa n di n c u b a t e d w i t ha1 : 5 0 0 0 d i l u t i o n i n P B So f t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y , b i o t i n - A Pa f f i n i p u r eg o a ta n t i - m o u s e I g G ( J a c k s o n I m m u n o r e s e a r c hL a b o r a t o r i e s I n c . ,W e s t G r o v e ,P A ) .F o r i m m u n o f l u o r e s c e n t s t u d i e s , t h e b i o t i n y l a t e d I g G w a s l o c a l i z e db yi n c u b a t i o n w i t h a 1 : 5 0 0 0d i l u t i o n o f f l u o r e s c e n t c o n j u g a t e de g g - w h i t e a v i d i n( J a c k s o nI m m u n o r e s e a r c h L a b . I n c . ) f o r t w o h o u r sa tr o o m t e m p e r a t u r e .S t a i n e d c o v e r s l i p sw e r e g i v e naf i n a l r i n s e i n P B S a n d m o u n t e d . o ng l a s sm i c r o s c o p e s l i d e s w i t h m o u n t i n g m e d i a ( C o v e r b o n d ) . T h e s e p r e p a r a t i o n s w e r ev i s u a l i s e da n d p h o t o g r a p h e d u s i n gaf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e ( Z e i s s ,W e s tG e r m a n y ) .F o ri m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g , t h e b i o t i n y l a t e d I g Gw a sl o c a l i z e db yi n c u b a t i n g w i t h ap e r o x i d a s e c o n j u g a t e d e g g - w h i t e a v i d i n ( V e c t o rL a b ) f o r t w oh o u r s a tr o o m t e m p e r a t u r e . C o v e r s l i p s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s i n P B S . T h ep e r o x i d a s e r e a c t i o n w a s d e v e l o p e db yi n c u b a t i n g t h ec o v e r s l i p sw i t h t h ep e r o x i d a s e s u b s t r a t e 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e ( D A B , 1 0 m g / m i i n P B S )f o r 1 03 0m i n u t e s a n d0 . 0 3 %h y d r o g e np e r o x i d e( H 2 0 2 )f o r3 0m i n u t e s .T h e s e c o v e r s l i p sw e r e g i v e naf i n a lr i n s ei nP B S . C e l l s w e r e d e h y d r a t e di n g r a d e de t h a n o l - w a t e rs o l u t i o n s , c l e a r e d i n x y l e n e a n dm o u n t e d o n t o m i c r o s c o p es l i d e s w i t h m o u n t i n gm e d i a . I m m u n o p e r o x i d a s ep r e p a r a t i o n s w e r e v i s u a l i z e d a n dp h o t o g r a p h e du n d e r l i g h t m i c r o s c o p y ( O l y m p u s C C K - 1 ,x 3 0 0 m a g n i f i c a t o n ) .T h e f o l l o w i n gc o n t r o l s f o r s p e c i f i c i t y o f s t a i n i n g w e r ed o n e f o r b o t h t h ei m m u n o p e r o x i d a s e a n d i m m u n o f l u o r e s c e n t p r o c e d u r e sd e s c r i b e da b o v e : ( a )r e p l a c e m e n t o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y ,C G A 7 ,b ya n i r r e l e v a n t a n t i b o d ys p e c i f i cf o r g a s t r i c i n h i b i t o r y p e p t i d e ( G I P ,M R Cp e p t i d eg r o u p , D e p t . P h y s i o l o g y ,U B C ) ,( b )o m i s s i o n o f t h e p r i m a r y a n t i b o d y ,( c )i n c u b a t i o nw i t h5 0 %g o a ts e r u m( G i b c o ) .2 . 3 . D e t e r m i n a t i o n o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n i s o l a t e dC V S M C sT h e f l u o r e s c e n tC a2+i n d i c a t o r f u r a - 2 A M ( G r y n k i e w i c ze ta l , 1 9 8 5 )w a su s e d t om e a s u r e t h e l e v e l o f f r e ei n t r a c e l l u l a r c a l c i u m[ C a2+I ip r e s e n t i ni s o l a t e dC V S M C s . T h i s m e t h o d w a s a l s oa p p l i e dt o d e t e r m i n e t h e s e n s i t i v i t y o ft h e c e l l s t ot h e v a s o c o n t r i c t o r s e r o t o n i n ( 5 - H T )( C a p p o me t a ! . 1 9 8 7 ) . T h e s ee x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m e d o n 2 - 3d a yo l d c u l t u r e si n c u b a t e da t3 7 0 C ,a sd e s c r i b e dp r e v i o u s l y . T h e s e c u l t u r e s w e r e u s e d ,s i n c e t h e s p h e r i c a lC V S M C sb e c a m e m o r p h o l o g i c a l l yd i s t i n c t f r o m t h e f l a t b a c k g r o u n d c e l l s a f t e r 2 - 3d a y si n c u b a t i o na t 3 7 0 C , a sr e v e a l e db yM a s s o ns t a i n i n g a n di m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n gf o r s m o o t h m u s c l e a - a c t i n ( s e eR e s u l t ss e c t i o n ) .3 12 . 3 . 1 . L o a d i n g o f t h e f u r a - 2 - A M i n d i c a t o r i n t oC V S M C s .F u r a - 2 A M ( M o l e c u l a rP r o b e s I n c . , E u g e n e , O R ) 1 m gw a s d i s s o l v e d i n 1m l o f c h l o r o f o r m , a n d5 01 a l i q u o t so f t h i s s o l u t i o n w e r e p i p e t t e d i n t o2 0 s m a l lp l a s t i c a m p u l e s . T h e s e a m p u l e s w e r e p l a c e d i na d i s s i c a t o r , a n dv a c u u m - d r i e df o r3h o u r s . T h e d r i e d a l i q u o t s w e r e s t o r e da t- 7 0 0 C .F o r e a c h c o v e r s l i pu s e d ,5go f f u r a - 2 A M p e rp l a s t i ca m p u l e w a s d i s s o l v e d i n5 01 o f d i m e t h y ls u l f o x i d e( D M S O , S i g m a ) , p r o d u c i n g a n 1 m M s t o c k s o l u t i o n . 2 O j d o f t h i ss t o c k s o l u t i o nw e r ea d d e d t o2 m l o f E a r l ’ s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( E B S S ) c o n t a i n i n g( m M ) :5K C 1 , 0 . 8M g C 1 2 ,1 . 8C a C 1 2 ,1 1 7 N a C l ,2 6 N a H C O 3 , 1N a H 2 P O 4 ,5 . 6D e x t r o s e ,a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 , t e m p e r a t u r e3 7 0C .1 m l o f t h i s s o l u t i o nw a si m m e d i a t e l ya d d e d t o a 3 5m m c u l t u r e d i s h c o n t a i n i n g 1 m lE B S S . T h ec o v e r s l i p w i t h t h e s m o o t h m u s c l e c e l l s w a s p l a c e d f a c e - u p i n t h e d i s h . F u r a2 A M i s h y d r o p h o b i ca n d t h e r e f o r e p e n e t r a t e s t h e p l a s m am e m b r a n e w i t h o u td i f f i c u l t y . C e l l s w e r ei n c u b a t e d w i t h f u r a - 2 A M f o r 1 . 5 h o u r sa t 3 7 ° C t oa l l o wt h e u p t a k et or e a c h e q u i l i b r i u m .O n c e i n s i d e t h e c e l l , c y t o s o l i ce s t e r a s e s c l e a v et h e a c e t o x y m e t h y l g r o u p s f r o m t h ei n d i c a t o rt or e l e a s ef r e e f u r a - 2 w h i c h i sm e m b r a n ei m p e r m e a n t a n d i s t h e r e f o r e t r a p p e di n s i d et h e c e l l s . A f t e rar i n s ew i t h E B S S ,af u r t h e r i n c u b a t i o n o f3 0m i n u t e sa t 3 7 ° Cw a s c a r r i e do u ti n2m lo ff r e s h E B S S t ow a s ho u te x c e s s f u r a - 2 A M . T h e s e l o a d i n g c o n d i t i o n s w e r e c h o s e nt om i n i m i z e t h e r i s k o fo v e r l o a d i n g t h e c e l l s w i t hd y e ,a n d a l s os e r v e dt os u p p r e s s t h ef o r m a t i o n o f p a r t i a l l y h y d r o l y z e d f u r a - 2 d e r i v a t i v e s ( T s i e n1 9 8 8 ) .2 . 3 . 2 . C e l l c h a m b e r a n dp e r f u s i o ns y s t e mf o r f u r a - 2 m e a s u r e m e n t s .A f t e r l o a d i n g , c o v e r s l i p s w e r e m o u n t e d f a c e - d o w n i n t oas p e c i a l l yd e s i g n e dl a m i n a r f l o w - t h r o u g h c h a m b e r ( v o l u m e3 5 0l ) f i l l e d w i t h H a n k ’ s3 2b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( H B S S ) . c o n s i s t i n g o f ( m M ) : 1 5 0N a C 1 , 4 K C 1 , 1C a C 1 2 ,1M g C 1 2a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . S i l i c o n eg r e a s e w a su s e d t o c o m p l e t eaw a t e rt i g h t s e a l b e t w e e n t h e c o v e r s l i p a n dc h a m b e r . T h e c h a m b e rw a s i n s e r t e d i n t oas t a i n l e s s s t e e l h o l d e r , a n d t h e n t h e e n t i r e a s s e m b l yw a sm o u n t e do n t o t h es t a g eo f aJ e n a l u m a r Z e i s sf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e . C e l l s w e r e v i e w e du n d e r o i li m m e r s i o na tl O O x m a g n i f i c a t i o n o n t h e m i c r o s c o p e .D u r i n g d e t e r m i n a t i o no f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m , c e l l s w e r ec o n t i n u o u s l y p e r f u s e dw i t hH B S S a t 2 1 - 2 3 ° C u s i n gaf l o w r a t e o f 4 m I / m m .T h eH B S S c o n t a i n e d 1m MC a2+ i n a l le x p e r i m e n t s u t l i l i z i n g f u r a - 2 . T h i sc o n c e n t r a t i o n o fC a2+w a ss e l e c t e dt oa l l o wc o m p a r i s o n o f r e s u l t s w i t hap r e v i o u s s t u d y o ft h i st y p e ,c o n d u c t e do n a o r t i c V S M C s ( N a b i k ae ta l . , 1 9 8 5 ) .K e t a n s e r i n( J a n s s e n B i o t e c h , B e e r s e , B e l g i u m ) , l a n t h a n u mc h l o r i d e ( S i g m a ) ,c o b a l tc h l o r i d e ( S i g m a ) a n d n i f e d i p i n e ( S i g m a ) w e r e d i s s o l v e d i n H B S Sa n dp e r f u s e d o v e r t h e c e l l si n p l a c e o f d r u g - f r e e H B S S . S e r o t o n i n( 5 -h y d r o x y t r y p t a m i n e , 5 - H T , S i g m a ) w a sd i s s o l v e d i n 1 0 0 lH B S S a n d i n j e c t e di n t ot h e i n l e t t u b eo f t h e p e r f u s i o n c h a m b e r . W h e n t h e e f f e c t s o f a n t a g o n i s t sw e r eb e i n g s t u d i e d ,t h e s ea g e n t sw e r e a l s o p r e s e n t i n t h e 1 0 0p . lv o l u m e c o n t a i n i n g5 -H T , a tt h e s a m ed o s e a sa p p l i e d t o t h e c e l l c h a m b e r . A p p l i c a t i o n o f d r u g - f r e eH B S S i n t h i s w a y p r o d u c e d at r a n s i e n t i n c r e a s e i n[ C a2+] ii n m o s t c e l l st e s t e d .T h e p e a ki n c r e a s e i n[ C a2+] is e e n d u r i n g t h e s e a r t i f a c t u a l r e s p o n s e s a v e r a g e d2 3 ±5 %o v e r b a s e l i n e l e v e l so f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m ( n= 3 9c e l l s ,m e a n ±S E M ) .F o r q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s , t h i sa r t i f a c t u a li n c r e a s e w a s s u b t r a c t e d f r o mt h es i g n a l i n d u c e d b y s e r o t o n i na p p l i c a t i o nt oy i e l dam o r ea c c u r a t e e s t i m a t e o ft h e e f f e c to f 5 - H T o n[ C a2+] i .T o r e d u c e t h e i n f l u e n c e o f e r r o r s i n t r o d u c e db ya r t i f a c t s u b t r a c t i o n ,o n l y c o r r e c t e d i n c r e a s e s i n[ C a2+] it h a te x c e e d e d b a s e l i n e3 3l e v e l sb y at o t a lo f5 0 %o r m o r e w e r ec o n s i d e r e d d u r i n gq u a n t i t a t i v ea n a l y s e s o f5 - H T r e s p o n s e s . .2 . 3 . 3 . M e a s u r e m e n t o f[ C a2+f ti nC V S M C sF r e e i n t r a c e l l u l a rc a l c i u m w a sd e t e r m i n e d i n i n d i v i d u a lC V S M C sb yu s i n gaZ e i s s J e n a l u m a rm i c r o s c o p e e q u i p p e dw i t h a ne p i f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r .T h e l i g h ts o u r c e w a sa2 0 0Wm e r c u r ya r c l a m p p o w e r e db y aD Cp o w e r s u p p l y .T h e l i g h tw a sf i r s tp a s s e dt h r o u g h o n e o f t h r e ed i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ef i l t e r sw h i c hs e l e c t i v e l yp a s s e dt h e f o l l o w i n gw a v e l e n g t h s :3 5 0 ±1 0 ,3 8 0 ±1 0 o r3 6 5 ±1 0 u r n( F i g . 2 ) . T h e s e f i l t e r sw e r e h e l di nat u r r e tw h i c h c o u l db e r o t a t e db y ac o m p u t e r - c o n t r o l l e ds t e p p i n gm o t o r .T h e l i g h tw a s t h e np a s s e dt h r o u g ha4 1 0n md i c h r o i c m i r r o r a n dal O O xa p o c h r o m a t i c o i li m m e r s i o nl e n sw i t han u m e r i c a la p e r t u r e o f 1 . 4 a n d a n a d j u s t a b l e d i a p h r a g mt o r e d u c et h e l i g h ti n t e n s i t y . Af i e l d d i a p h r a g m i n t h e l i g h tp a t h p r i o rt ot h e d i c h r o i cm i r r o rw a s u s e d t o r e d u c et h e a r e ao f i l l u m i n a t i o nt ot h es i z eo fas i n g l eC V S M C . A l lf l u o r e s c e n t l i g h tp a s s e db a c k t h r o u g h t h e d i c h r o i cm i r r o r a n da4 5 0 u r nb a n dp a s sf i l t e rt or e d u c eb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e . T h e3 6 5n m f i l t e rw a s e m p l o y e dd u r i n gc e l ls e l e c t i o n ,s i n c e b o t h t h eC a2+- b o u n d a n d u n b o u n df u r a - 2m o l e c u l e s e m i tas i m i l a ri n t e n s i t yo f f l u o r e s c e n c ea tt h i s e x c i t a t i o nw a v e l e n g t h ( F i g .3 ) ( G r y i i k i e w i c ze ta l .1 9 8 5 ) . T h e e m i t t e df l u o r e s c e n c e t a k e na t 3 5 0 u r n ( i n d i c a t o rf l u o r e s c e n c ee n h a n c e db yC a2+ b i n d i n g ) a n d3 8 0r i m ( d e c r e a s e db y C a2+ b i n d i n g )w a se i t h e ro b s e r v e db yd e f l e c t i n gt h e l i g h tt ot h em i c r o s c o p ee y e p i e c e , o rq u a n t i f i e db yd e f l e c t i n gt h el i g h tt oa p h o t o m u l t i p l i e rt u b ep l a c e d i nt h ec a m e r ap o s i t i o no ft h e m i c r o s c o p e .T h e p h o t o m u l t i p l i e rc o n v e r t e dt h el i g h t s i g n a li n t oaD Cv o l t a g e ( F i g . 2 ) . T h i sv o l t a g e w a s t h e n c o n v e r t e dt od i g i t a lf o r mb ya n a n a l o g u et od i g i t a lc o n v e r t e r b o a r d i na n I B Mc o m p a t i b l ec o m p u t e r , a n ds t o r e d o nt h e3 4F i g u r e2 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e s y s t e m f o rm e a s u r i n g[ C a2+I iu s i n g t h ef l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2 .3 51 .M e r c u r yA r cL a m pw e i g h tb a l a n c e s( n of i l t e r s )9 .P h o t o m u l t i p l i c rT u b e8 .i fw a v e l e n g t ho fl i g h t s> 4 1 0 n m3 .D i c h . r o i cM i r r o r5 .E x c i t a t i o na t3 5 0o r3 8 0n m1 0 .D A T AA N A L Y S I SD i g i t a ld a t ac o n v e r t e dt o( C a2iI .I IIIC o m p u t e rc o n v e r t sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yt od i g i t a lf o r m2 .F i l t e rt u r r e tj7 . G 2 5 1f i l t e r3 6 5 n m3 S O n s n— 4 . i fw a v e l e n g t ho fl i g h ti s< 4 1 0n m3 S O n m6 .E m i s s i o na t5 0 0 n . mI I3 6F i g u r e3 .E x c i t a t i o ns p e c t r a o f 1m M f u r a - 2 .B o t ht h eC a2+b o u n da n d t h eu n b o u n df u r a - 2e m i t a s i m i l a ri n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c ea ta ne x c i t a t i o nw a v e l e n g t ho f3 6 5 m n .3 77. peak at 335 nm6— Ca2-BOUND FURA-2— a-UNBOUND FURA-24. pcaka3ó2nm00LE1O(/JjV1 equal intensityat 356 nmII300 320 340 360 380 400EXCITATION WAVELENGTH (nm)EXCITATION SPECTRA OF 1 mM FURA—2.Adapted from Grynkicwicz et. al. 1985.38computer hard disk. Measurements of fluorescence ratios were obtained on a 5second time base. Transient changes in [Ca2+ Ii occurring in less than 5 secondscould have gone undetected by this system.Fu.ra-2 measurements were made from a total of 110 cells in 40 culturesderived from 20 dissections. No significant trends were noted in the baseline or5-HT stimulated calcium levels as a function of the number of days passed invitro. This observation makes it unlikely that 5-HT sensitivity was beinggradually down-regulated by the presence of serotonin in the culture medium.However, cultures derived from different dissections did show appreciablevariability in the proportion of cells responsive to 5-HT, and in the degree ofresponsiveness the cells showed to serotonin. This variability could haveresulted in part from the use of proteolytic enzymes, since it was very difficult toensure that each dissection exposed the cells to the same degree of enzymeactivity. However, the possibility that some of the variability noted is alsopresent in vivo cannot be discounted.2.3.4. Calculation of free intracellular calcium in CVSMCs.The concentration of free intracellular calcium [Ca2+ Ji in the cellsstudied was calculated using the following formula (Grynkiewicz et a!., 1985):[Ca2+ = Kd x x R - Rmin/Rmax - Rwhere Kd = the equilibrium dissociation constant for the association of fura-2with cytosolic free calcium: 224 M.= ratio of values: the fluorescence intensity at 380 nm with zero[Ca2+ ]/380 nm with infinite [Ca2139R= e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d r a t i o o f t h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t ya t 3 5 0n m / 3 8 0n m .R m i n= r a t i o o f v a l u e s : t h e f l u o r e s c e n c eo f i n t e n s i t ya t 3 5 0m n / 3 8 0r i mw i t h z e r o[ C a21 .R m a x= r a t i o o f v a l u e s : t h e f l u o r e s c e n c eo f i n t e n s i t ya t 3 5 0 n m / 3 8 0 r i mw i t h i n f i n i t e[ C a2+ 1 .T h ev a l u e s o fi 3 ,R m i na n dR m a xw e r e d e t e r m i n e db y c a l i b r a t i o n o f t h es y s t e m ,a sd e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n .F o r t h i s s t u d y ,f 3= 7 . 4 6 4 ,R m j n =0 . 5 8 4 , a n dR m a x= 5 . 5 4 9 .2 . 3 . 5 . C a l i b r a t i o n o f t h ef u r a - 2s y s t e m f o r d e t e r m i n a t i o n o f[ C a2+ ] ji n C V S M C s .C a l i b r a t i o n p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e do u tu s i n g 2 - 4d a yo l dC V S M Cc u l t u r e s l o a d e d w i t hf u r a - 2 A M i n t h e m a n n e r p r e v i o u s l yd e s c r i b e d . A p a i r o fc u l t u r e sw a sf i r s t p l a c e d i n t h e m e a s u r i n g c h a m b e r f i l l e d w i t h H B S S , c o n t a i n i n g1 . 0 m MC a2+a n d 0 . 8m MM g2+ .O n e c u l t u r ew a st h e ne x p o s e d t oC a2+f r e eH B S S c o n t a i n i n g5m M E G T A a n d 1 0 P MB r - A 2 3 1 8 7 ,a n o n - f l u o r e s c e n tc a l c i u mi o n o p h o r e ( H S C R e s e a c h D e v e l o p m e n t C o r p o r a t i o n , T o r o n t o ,C a n a d a ) .A f t e r 1 5 m i n u t e s , t h e r a t i o o f f l o u r e s c e n c e i n t e n s i t ya t 3 5 0r i m a n d3 8 0r i mw a sm e a s u r e d i n3 0c e l l s , u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h[ C a2+] iw a s e f f e c t i v e l y0m M .T h i s r a t i o y i e l d e d t h ev a l u e o fR m i n .T h e s e c o n d c u l t u r ew a sn o w e x p o s e dt os t a n d a r dH B S S c o n t a i n i n g 1 m MC a2+ a n d 1 0 J L M B r - A 2 3 1 8 7 . T h e r a t i o o ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e s a t 3 5 0n m a n d3 8 0n mw a sm e a s u r e d i n3 0 c e l l s ,a se x t r a c e l l u l a r C a2+q u i c k l y e n t e r e d t h e c e l l a n d[ C a2+J ib e c a m e e f f e c t i v e l y1m M .T h i s r a t i o y i e l d e d t h e v a l u e o fR m a x .T h e v a l u e o f1 3w a s c a l c u l a t e db y4 0d i v i d i n g t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t ya t 3 8 0n m o b t a i n e df r o m t h e f i r s tc u l t u r eb yt h e v a l u e o b t a i n e df r o m o f t h e s e c o n dc u l t u r e . T h i s e n t i r ep r o c e d u r ew a sr e p e a t e d i nt w o f u r t h e r c u l t u r e s p r e p a r e df r o mad i f f e r e n td i s s e c t i o n . T h ev a l u e s o fR n i j n , R m a xa n df 3 o b t a i n e d f r o m t h e s e c u l t u r e sd i d n o t d i f f e rf r o m t h eo r i g i n a l e s t i m a t e sb ym o r et h a n1 0 % .T h e a v e r a g ev a l u e s w e r eu s e di ns u b s e q u e n t c a l c u l a t i o n s o f[ C a2+] j .2 . 4 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e so n i s o l a t e d C V S M C s .P a t c h c l a m p r e c o r d i n g s w e r ec a r r i e do u t a tr o o mt e m p e r a t u r e( 2 1 - 2 3 o C ) .A t t h e t i m e o f r e c o r d i n g , o n e c u l t u r e d i s hc o n t a i n i n g c e l l sw a st a k e no u to f t h er e f r i g e r a t p r . T h e m a i n t e n a n c e s o l u t i o nw a sd r a w n o f f a n dr e p l a c e d w i t h 2m l o fab a t h i n g s o l u t i o n a p p r o p r i a t et o t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n . T h ec u l t u r e d i s hw a st h e n m o u n t e d o n t h e s t a g e o f a n i n v e r t e d , p h a s e - c o n t r a s tm i c r o s c o p e ( O l y m p u sC K , T o k y o , x 3 0 0 m a g n i f i c a t i o n ) . T h e m i c r o s c o p e , p a t c h c l a m pa m p l i f i e r h e a d -s t a g e a n dt h e p e r f u s i o n s y s t e m w e r e m o u n t e do nav i b r a t i o n d a m p i n g t a b l e( K i n e t i c S y s t e m s I n c . , B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s ) a n d s h i e l d e df r o me l e c t r o m a g n e t i cr a d i a t i o nb y aF a r a d a yc a g e .R e c o r d i n g s w e r e m a d e u s i n g t h e c e l l - a t t a c h e d , w h o l e - c e l l( c u r r e n t -c l a m p ) , i n s i d e - o u t p a t c h c o n f i g u r a t i o n s ( F i g . 4 ) o f t h e p a t c h c l a m p t e c h n i q u e .I nt h i st e c h n i q u e ,al o w r e s i s t a n c e s e a l i s p r o d u c e d u p o n m e c h a n i c a lc o n t a c tb e t w e e n t h e e l e c t r o d e a n d t h e c e l l m e m b r a n e . W i t h g e n t l e s u c t i o n , t h es e a li n c r e a s e s i n r e s i s t a n c eb y2 - 3 o r d e r s o f m a g n i t u d e , r e s u l t i n g i na c e l l - a t t a c h e dg i g a o h m s e a l .B a c k g r o u n d n o i s e i s g r e a t l yr e d u c e d w i t h t h i s s e a l , l e a d i n gt oi m p r o v e d r e s o l u t i o no f r e c o r d i n g s .A d d i t i o n a l s u c t i o n a p p l i e dt ot h e p a t c hc r e a t e d t h e w h o l e - c e l l r e c o r d i n g c o n f i g u r a t i o n f o rs t u d yo f b a s i c4 1F i g u r e4 .S c b e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h ep r o c e d u r e su s e dt om a k et h ew h o l e - c e l la n di n s i d e - o u tp a t c hr e c o r d i n g sr e p o r t e di nt h i ss t u d y .4 2L O WR E S I S T A N C ES E A L( 5 0 M f l )S U C T I O NJ G I G A O H MS E A LC E L LA T T A C H E DP U L S E O FS U C T I O N , , / /\ P U L L//v1 7A I R E X P O S U R E LW H O L EC E L LpI N S I D E - O U TR E C O R D I N GP A T C H4 3electrophysiological properties of the cells. To form an inside-out patch, theelectrode was drawn away from the cell surface, creating a membrane vesicle atthe electrode tip. The outer membrane of this vesicle was ruptured by briefpassage through the solution/air interface (Hamill et al. 1981).2.4.1. Preparation of patch electrodesPatch electrodes were pulled from capillary tubes of borosilicate glass(1.5 mm OD x 0.75 mm ID, Frederick Haer Corp, Brunswick, ME) in twosuccessive steps on a modified David Kopf 700 vertical microelectrode puller.Electrode tip diameters ranged from 1-2 iL m. Electrodes were coated to within50 m of their tips with 3140 RTV sealant (Dow Corning Corporation, Midland,Michigan) which reduced pipette-bath capacitance by forming a hydrophobicsurface and increasing the wall thickness (Hamill et al. 1981). Patch clamprecordings of KCa channel activity were made from CVSMCs cultured for 2-3days at 370C or alternatively from cells maintained at 40C, as describedpreviously. It was evident that the latter procedure produced a higherprobability of obtaining inside-out patches containing functional KCa channels.It was therefore decided to employ cells maintained at 4°C for allelectrophysiological studies reported in this thesis.A disadvantage of using the cooled cell preparation was that bothCVSMCsand other cell types retained a spherical morphology over theincubation period (see Results). For this reason, it was necessary to confirm theidentity of each cell by means of the Masson trichrome test performed at the endof the recording session. Recordings were made from several cells in the samefield. After completion of recording, the entire plate of cells was stained using44the Masson technique, without changing the field of cells visible in themicroscope. Data from cells which failed to react positively to this test, or whichdissociated from the cuture dish during staining were not used in this study.At the time of the experiment, the tip of each electrode was fire-polishedto produce a clean and smooth tip rim. This facilitated the formation of a largeresistance seal between the electrode and the cell membrane (Hamill et al.1981). To carry out this step, the electrode was placed on the stage of acompound microscope (x480). The tip of electrode was brought to within 160m of a platinum filament heated by the passage of DC current for about 1second. After fire-polishing and filling with physiological saline, electrodes hadresistances of 5-10 M2.2.4.2. Gravity perfusion system for application of experimental solutions.A perfusion system was designed to apply experimental solutions to thecytoplasmic face of isolated membrane patches. The system comprised of eight60 ml syringe barrels mounted above the stage of the microscope. Plastic tapswere connected tightly to the end of each cylinder to allow for selection of theappropriate test solution. A short length of plastic tubing ran from this assemblyto an L-shaped glass tube held in a micromanipulator. Following patch isolation,the orifice of this tube was moved to within 200 jm of the patch electrode tip.Tests performed using isolated inside-out patches containing KCa channels andsolutions containing various concentrations of Ca2+ showed that membranepatches equilibrated with a new test solution within 25 seconds.2.4.3. Experimental solutions45P r i o rt or e c o r d i n g , t h em e d i u m b a t h i n gt h e c e l l sw a s c h a n g e dt oas t a n d a r d e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n c o n t a i n i n g( i n m M ) : 1 4 0N a C 1 ;4 K C 1 ; 1C a C 1 2 ;1M g C 1 2 ;1 0 H E P E S ,p H 7 . 4 . I nc e l l - a t t a c h e d a n di n w h o l e - c e l lr e c o r d i n g s ,p a t c hp i p e t t e sw e r e f i l l e d w i t has o l u t i o no f c o m p o s i t i o n ( m M ) : 1 4 0 K C 1 ;3 N a C 1 ;0 . 6 5C a C 1 2 ;3E G T A ;1 0H E P E S , p H 7 . 4 . T h ef r e eC a2 + c o n c e n t r a t i o ni n t h i ss o l u t i o nw a s c a l c u l a t e da t1 0 - 8Mu s i n gp r o c e d u r e s d e v i s e db yS t o c k b r i d g e( 1 9 8 7 ) . T h e l e v e lo f f r e eC a2+p r e s e n ta s a c o n t a m i n a n ti n o t h e rs a l t sw a sf o u n dt o b eb e l o w1 0 - 5 M ,a s m e a s u r e db y a c a l c i u m - s e n s i t i v ee l e c t r o d e( M o d e l9 3 - 2 0 ,O r i o n ,M a s s a c h u s e t t s ) .T h i sv a l u e w a ss m a l lc o m p a r e dt ot h et o t a lc a l c i u m c o n c e n t r a t i o nn e e d e d i na l l t h eE G T Ab u f f e r e d s a l i n e s .Ac o n t a m i n a t i o n l e v e lo f8 x1 0 - 6M w a s a s s u m e dw h e n c a l c u l a t i n gt h e t o t a lc o n c e n t r a t i o no fC a C l 2r e q u i r e d i ne x p e r i m e n t a ls o l u t i o n s . D u r i n gr e c o r d i n g sf r o mi n s i d e - o u tm e m b r a n ep a t c h e s ,p i p e t t e su s u a l l y c o n t a i n e das o l u t i o no fc o m p o s i t i o n( i nm M ) :1 4 0 K C 1 ;1 0 H E P E S ;3E G T A ;0 . 6 5C a C 1 2 ,p H 7 . 4 .T h ef r e e c a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni n t h i s s o l u t i o nw a sc a l c u l a t e da t1 0 n M( S t o c k b r i d g e1 9 8 7 ) . T h ec y t o p l a s m i cf a c eo f t h e i s o l a t e d m e m b r a n ep a t c h e sw a s n o r m a l l ye x p o s e d t o as o l u t i o nc o n t a i n i n g( i n m M ) :1 4 0K C 1 , 1 0H E P E S ,3E G T A ,p H7 . 4 ,a n dt h e f o l l o w i n gc o n c e n t r a t i o n so ft o t a la n d f r e eC a2 + :0 . 3 6m M ,5 n M ;0 . 6 5m M ,1 0 n M ;1 . 7 2m M ,5 0 n M ; 2 . 1 9n M ,0 . 1 M M ;2 . 5 4m M ,0 . 2 M M ;2 . 7 9m M , 0.51M; 2 . 7 m M , 1 M M ; 2 . 9 8 m M ,51L M ; 3 m M ,1 O J L Ma n d3 . 1m M ,1 0 0 M M( S t o c k b r i d g e1 9 8 7 ) .T od e t e r m i n et h ep o t a s s i u ms e l e c t i v i t yo fK C ac h a n n e l s ,8 0m MK C 1w a sr e p l a c e db ya ne q u i m o l a ra m o u n to f N a C 1o rC s C 1 ,i n e i t h e r t h ep i p e t t es o l u t i o no ri n t h e s o l u t i o nb a t h i n g t h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n ef a c e .R e p l a c e m e n to fK +b yi o n s o f d i f f e r e n tm o b i l i t yi ns o l u t i o nl e a dt ot h ea p p e a r a n c eo f l i q u i dj u n c t i o n4 6p o t e n t i a l s . { H u b b a r de ta l . 1 9 6 9 ) .T h e s ev o l t a g e sw e r em e a s u r e db yf l o w i n ge x p e r i m e n t a l s a l i n e sp a s tt h et i p o fap a t c he l e c t r o d e f i l l e dw i t h s t a n d a r de x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n . L i q u i dj u n c t i o np o t e n t i a l sw e r ei n d i c a t e da s t h e c h a n g e i nz e r o - c u r r e n t p i p e t t e v o l t a g em e a s u r e db yt h ep a t c h c l a m pa m p l i f i e r .A p p r o p r i a t e c o r r e c t i o n s w e r ea p p l i e dt o t h e p a t c h p o t e n t i a l sm e a s u r e d d u r i n ge x p e r i m e n t a l s o l u t i o n c h a n g e s .C o r r e c t i o n f a c t o r s w e r el e s st h a n ± 5m V .T h ee f f e c t o f t h e p o t a s s i u m c h a n n e lb l o c k e r t e t r a e t h y l a m m o n i u m( T E A )o nK C ac h a n n e l s w a s d e t e r m i n e db yd i s s o l v i n gt h e c h l o r i d e s a l t o f t h ed r u g ( E a s t m a nK o d a k , R o c h e s t e r , N e wY o r k ) i nt h e s o l u t i o n b a t h i n gt h ec y t o p l a s m i cf a c e o fi s o l a t e d m e m b r a n ep a L h e s .2 . 4 . 4 . A n a l y s i s o f p a t c h c l a m pd a t aT h eg e n e r a l a r r a n g m e n to f t h e a n a l y s i ss y s t e m i s s h o w ni nF i g u r e5 .P a t c h e l e c t r o d ec u r r e n t s a n dv o l t a g e s w e r e r e c o r d e du s i n gaL i s t E P C - 5a m p l i f i e r( M e d i c a l S y s t e m C o r p ,N e wJ e r s e y ) .S i g n a l s w e r ec a p t u r e do n F Mw i d e b a n dt a p e a t ab a n d w i d t ho f D C - 3 k H z ( - 3 d B ,B e s s e l )u s i n ga ni n s t r u m e n t a t i o n r e c o r d e r ( S t o r e 4 D S , R a c a l - D e c c a ,E n g l a n d ) a n dd i s p l a y e d o nar e c t i l i n e a rp e n r e c o r d e r( D C - 1 0 0 H z , G o u l d ,O h i o ) . D a t aa n a l y s i s p r o c e e d e do f f - l i n eu s i n g a nA t a r i M e g a 4 c o m p u t e r( A t a r i ,S u n n y v a l e , C a l i f o r n i a )a n ds o f t w a r e d e v i s e db yI n s t r u t e c h C o r p o r a t i o n ,N e w Y o r k . A f t e ra n a l o g u e - t od i g i t a l ( A - D )c o n v e r s i o na t 8k H z ,c u r r e n t r e c o r d s8k B y t e si n l e n g t hw e r ed i s p l a y e d o nah i g h - r e s o l u t i o n m o n i t o r ,a n d o b v i o u sa r t i f a c t s w e r ee d i t e do u t .G a u s s i a nd i g i t a l f i l t e r i n gw a s a p p l i e dt oy i e l daf i n a l c o r n e r f r e q u e n c y ,f= 2k H z ( - 3 d B )u s i n g t h e r e l a t i o n1 / f c2= 1 / f1 2+ 1 / f 2 2 w h e r ef ii s t h eG a u s s i a nf i l t e rc u to f f a n df 2i s t h a t o f t h et a p er e c o r d e ro u t p u tf i l t e r ( C o i q u h o u na n dS i g w o r t h ,1 9 8 3 ) . A t h r e s h o l df o r e v e n t d e t e c t i o nw a s s e t a t5 0 %o f t h e m e a n4 7F i g u r e5 . B l o c k d i a g r a mo ft h ep a t c h c l a m pr e c o r d i n gs y s t e m .4 8[1P a t C hC u r r e n tC e l lC u l t u r eD i s hD C - 3 K H zP i p e t t eV o l t a g eC ,0, 00c J o ’ - oS04 9single channel current for KCa channels encountered in the patch under study.Under-estimation of the durations of brief openings and closings barely crossingthis threshold was addressed by applying a frequency correction factor. Opentime distributions were valid down to the dead-time of the recording system,given as Td = 0.179/fc i.e. 90J.Ls (Colquhoun and Sigworth 1983).Frequency histograms of channel open times and amplitudes wereconstructed using bin widths 0.4 % of the total range of the parameter beingplotted. Open time distributions were plotted on a logarithmic time axis. Thistransformed the exponential function y = A.e -t/r into a curve with peakamplitude at the time constant r and an area proportional to the number ofevents in that component (Sigworth and Sine 1987). Simplex maximization oflikelihood was used to fit one, two or three exponential components to theobserved open time distributions (Coiquhoun and Sigworth 1983). Curve fittingdisregarded channel openings briefer than twice the system dead-time.Frequency distributions of current amplitudes were fitted by eye with computer-generated Gaussian functions. Currents and voltages were denoted with respectto the cytoplasmic face of the membrane in all recording configurations used.Reversal potentials for single channel currents were determined as the zerocurrent intercepts of theoretical curves fitted to the data points by linear or nonlinear regression, as appropriate.The probability, Po of finding a single KCa channel in the open stateduring a recording of total duration, Ttt was calculated from the relationP0 = (Ti + T2 + ... + TN)/NTtotHere, N is the total number of functional KCa channels in the patch. Ti, T2,TN are the times when at least 1, 2 ... N channels were open (Mayer et al. 1990).50N t o o k v a l u e s i nt h e r a n g e0 t o4 ,a se s t i m a t e db yd e p o l a r i z i n g e a c hp a t c ht o+5 0m V w i t h1m MC a2+ p r e s e n ta tt h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e .A c t i v ep a t c h e s g e n e r a l l y h a d 1 - 2K C ac h a n n e l s p r e s e n t . A sn o t e d e a r l i e rC V S M C sw h i c h h a d b e e nc u l t u r e da t 3 7 ° Ct y p i c a l l y s h o w e dm o r ei n s i d e - o u t p a t c h e sd e v o i d o fK C aa c t i v i t yt h a nw a s t h ec a s ei n c e l l sm a i n t a i n e da t4 o Cu n t i lu s e .F o r t h i s r e a s o n ,t h el a t t e rp r o c e d u r e w a s a d a p t e d i n a l ls i n g l e c h a n n e ls t u d i e s o nK C ac u r r e n t sp r e s e n t e di n t h i s t h e s i s .R e s u l t s w e r ee x p r e s s e d a sm e a n ±S . E . M .T h e S t u d e n t ’ st - t e s to r A N O V Aw a s u s e d t oe v a l u a t ed i f f e r e n c e sb e t w e e ne x p e r i m e n t a lg r o u p s .5 1Chapter 3Results3.1. Morphological characteristics of CVSMCs in vitro.Collagenase-trypsin treatment of isolated vessel fragments yielded aheterogeneous preparation consisting of various cell types and debris. Thesedispersed CVSMCs did not readily attach to the culture substrate, making itdifficult to conduct fura-2 or electrophysiological studies on freshly isolated cells,However, after 2-3 days in vitro, many CVSMCs did become firmly attached tothe substrate. The appearance of these preparations was dependent on theincubation protocol followed. After 2-3 days maintenance at 4°C, CVSMCsusually appeared as Masson positive cells of spherical shape with an averagediameter of 12± O.6m (mean± SEM, n = 31). Occasionally, CVSMCs wereslightly fusiform in shape on these plates. Small clusters of incompletelydissociated CVSMCs were also present in these preparations. These platescontained a number of Masson-negative cells , which were also of sphericalshape (Fig. 6A).In preparations cultured for 2-3 days at 37°C, Masson positive CVSMCsretained the spherical morphology seen after low temperature incubation (Fig.6B). However, the Masson negative cells in these cultures adopted flattened,extended morphologies characteristic of fibroblasts (Rose 1970) and polygonalendothelial cells maintained in vitro (Warren 1990). The cytoplasm of thesebackground cells stained blue-grey under the Masson trichrome test (Fig. 6B).52F i g u r e 6 . P h o t o n i i c r o g r a p h so f d i s p e r s e dr a tc e r e b r a la r t e r y s m o o t hm u s c l ec e l l si n v i t r o , t r e a t e d w i t ht h e M a s s o n t r i c h r o m es t a i n . A , P r e p a r a t i o n i n c u b a t e da t4 0 Cf o r 3 d a y s . M a s s o n p o s i t i v eC V S M C s a r e s t a i n e d r e da n d a p p e a r a s s i n g l ec e l l s ( b l a c k a r r o w s ) o ra ss m a l l c l u s t e r so f c e l l s ( o p e n a r r o w s ) . M a s s o nn e g a t i v ec e l l s ( w h i t e a r r o w s )a n d d e b r i s a r e a l s op r e s e n t . B , A s e c o n dp l a t e i n c u b a t e da t3 7 ° Cf o r3 d a y s . T h eM a s s o np o s i t i v e C V S M C s( r e d )h a v er e t a i n e da s p h e r i c a ls h a p e ( b l a c ka r r o w s ) . T h e M a s s o n n e g a t i v eb a c k g r o u n d c e l l s( b l u e - g r e y )h a v ed i f f e r e n t i a t e d i n t of l a t t e n e d , e x t e n d e ds h a p e s ( w h i t ea r r o w s ) .5 3EDC0I•0‘“p.,.,.S.I•“SED00IP‘.90,;:,mC V S M C si n c u b a t e d e i t h e ra t4 ° C( F i g . 7 A ) o ra t 3 7 ° C( F i g .7 B ) f o r 2 - 3d a y sa l s o r e a c t e dp o s i t i v e l y o n i n c u b a t i o nw i t h a n t i - a- a c t i na n t i b o d y ,a n d w e r er e a d i l y v i s u a l i z e d u s i n gt h e f l u o r e s c e n tF I T C m a r k e r . O m i s s i o no f t h ep r i m a r ya n t i b o d y f r o m t h i s p r o c e d u r e l e a dt ot h el o s s o fs p e c i f i c l a b e l l i n g i na l lp r e p a r a t i o n st e s t e d( F i g .7 C ) . C V S M C se x p o s e dt ot h e a n t i - a- a c t i na n t i b o d yw e r e a l s or e a d i l y v i s u a l i z e d u s i n gt h ep e r o x i d a s em a r k e r ( F i g . 8 ) .T h em o r p h o l o g y a n d s i z e o f a n t i b o d y - p o s i t i v ec e l l s a g r e e dw e l lw i t hr e s u l t so b t a i n e du s i n g t h e M a s s o nt e s t .3 . 2 . I n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u ml e v e l o f C V S M C si nc u l t u r e3 . 2 . 1 .R e s t i n g [Ca2+]i o f C V S M C s i n c u l t u r e[Ca2+]i w a s d e t e r m i n e d u s i n g 2 - 3 d a y o l d c u l t u r e s o f C V S M C si n c u b a t e da t 3 7 ° C ,s i n c et h e s m o o t hm u s c l ec e l l s i nt h e s e p l a t e s w e r e m o r p h o l o g i c a l l yd i s t i n c tf r o m b a c k g r o u n dc e l l s . M e a s u r e m e n t so f f l u o r e s c e n c er a t i o sf r o mat o t a l o f 3 1C V S M C si nt h e s a m ec u l t u r e p l a t e su s e d f o r c a l i b r a t i o ny i e l d e da na v e r a g ev a l u e o fr e s t i n g[Ca2+]io f3 9. ±3 . 6n M .F l u o r e s c e n c e r a t i o sw e r ea l s om e a s u r e di n1 1 0 a d d i t i o n a lc e l l si n 2 8o t h e rc u l t u r e s .[Ca2+]jw a s c a l c u l a t e di nt h e s e c e l l su s i n gt h ec a l i b r a t i o nf a c t o r sd e t e r m i n e df r o mt h ef i r s tg r o u po f p l a t e s .T h e s ec e l l sy i e l d e dar e s t i n g[ C a2+] il e v e l o f 4 1±5 . 6n M .T h i s v a l u ew a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o m t h a td e t e r m i n e di n t h ec a l i b r a t i o np l a t e s( P> 0 . 0 5 ,S t u d e i t ’ st - t e s t ) ,i n d i c a t i n gt h a t f l u o r e s c e n c er a t i om e a s u r e m e n t sw e r e s t a b l eo v e rt h e c o u r s eo f t h i ss t u d y .3 . 2 . 2 . E f f e c to fs e r o t o n i no n[ C a2+ ] jo f C V S M C Si n c u l t u r e5 5F i g u r e7 . P h o t o m i c r o g r a p h so f d i s p e r s e dC V S M C s a f t e ri n c u b a t i o nw i t ham o n o c l o n a la n t i b o d yd i r e c t e d a g a i n s t s m o o t hm u s c l e c r - a c t i na n dv i s u a l i z e du s i n gt h ef l u o r e s c e n t m a r k e rF I T C . A ,Ac u l t u r ei n c u b a t e da t4 ° Cf o r 3 d a y s .A n t i b o d yp o s i t i v eC V S M C sa p p e a r b r i g h tg r e e n( w h i t ea r r o w s ) .B . Ac u l t u r ei n c u b a t e d f o r3 d a y sa t 3 7 ° C .A n t i b o d yp o s i t i v eC V S M C sa g a i na p p e a rb r i g h tg r e e n( w h i t ea r r o w s ) .F a i n t l ys t a i n e db a c k g r o u n dc e l l se x h i b i t e dad e g r e eo fa u t o - f l u o r e s c e n c e .C .A u t o - f l u o r e s c e n c ei s a l s op r e s e n ti nan e g a t i v ec o n t r o lc u l t u r e ,i n c u b a t e da t3 7 o Cf o r3 d a y sa n d p r o c e s s e di n t h ea b s e n c eo f t h ep r i m a r ya n t i b o d y .C a l i b r a t i o nb a ri s1 0 0j m f o ra l l m i c r o g r a p h s .5 6Lc3SVwn001F i g u r e8 .P h o t o m i c r o g r a p h s o f d i s p e r s e dC V S M C s a f t e r i n c u b a t i o n w i t ham o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s ts m o o t hm u s c l ea- a c t i na n d v i s u a l i z e d u s i n g t h ep e r o x i d a s em a r k e r .A , Ac u l t u r e i n c u b a t e da t 3 7 ° Cf o r3 d a y s . A n t i b o d yp o s i t i v e C V S M C s a p p e a rd a r k b r o w n a n d a p p e a r e da ss i n g l e c e l l s( b l a c k a r r o w s )o r s m a l lc l u s t e r s ( o p e n a r r o w s ) . A n t i b o d y n e g a t i v e b a c k g r o u n d c e l l s a r e a l s op r e s e n t . B , A n e g a t i v e c o n t r o lc u l t u r e i n c u b a t e da t3 7 0 Cf o r3d a y s i n t h ea b s e n c e o f t h e p r i m a r ya n t i b o d y .C a l i b r a t i o n b a ri s 1 0 0 c m f o r b o t hm i c r o g r a p h s .5 84.wrj1C 0 C 3S40 0 C 35 - H T ( 1 0 n M t o1 0 0 1A M )w a sa p p l i e db yi n j e c t i n g 1 0 0 1 v o l u m e s o f t h ea g o n i s t i n t o t h e i n l e tp o r t o f t h e c e l l c h a m b e r . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ,5 - H Ti n d u c e dar a p i d , t r a n s i e n t i n c r e a s e o f [ C a2+] ia b o v er e s t i n gl e v e l s f r o m 8 4o u to f1 1 0 c e l l s t e s t e d .A t y p i c a l r e s p o n s e o f t h i st y p e ,i n d u c e db ya p p l i c a t i o no f 1 M5 - H T , i ss h o w n i n F i g .9 .T h e a v e r a g e t i m e c o u r s e o f t h e r e s p o n s e o f 1 3 c e l l st o1 M5 - H T i s s h o w n i n F i g . 1 0 . N o e v i d e n c e w a s s e e n f o r o s c i l l a t o r y o r l o n g -l a s t i n g c h a n g e s o ff r e eC a2+l e v e l s f o l l o w i n g t h e t r a n s i e n t a p p l i c a t i o n o fs e r o t o n i n t o C V S M C s .I t s e e m e dp o s s i b l e t h a t t h e 5 - H T i n d u c e d r i s e i n[ C a2+ I is i m p l y r e f l e c t e da n i n f l u x o fe x t r a c e l l u l a rC a2+t h r o u g h v o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u m c h a n n e l s i n t h es m o o t h m u s c l e c e l lm e m b r a n e . T h a t s u c h c h a n n e l s w e r e i n d e e d p r e s e n t o nC V S M C m e m b r a n e s w a si n d i c a t e db yt h e f a c t t h a t d e p o l a r i z a t i o nb yh i g hp o t a s s i u m s o l u t i o n sa l s o e v o k e dai n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m ( F i g . 1 1 ) .T o a d d r e s s t h i s p o s s i b i l i t y ,t h e e f f e c t o f t h r e e k n o w n b l o c k e r s o f v o l t a g e -d e p e n d e n t C a2+ f l u x e s ,n i f e d i p i n e , L a3 + a n dC o 2+ ( S u p r e n a n te ta ! . 1 9 8 7 )w e r et e s t e d b yc o a p p l i c a t i o n w i t h 5 - H T . I t w a sf o u n d t h a tn e i t h e r 1 0 m M L a C 1 3( 4o u to f4 c e l l s ) n o r 1 0 m MC 0 C 1 2( 4 o u t o f4 c e l l s ) r e d u c e d t h e r i s ei n[ C a2+I ie v o k e db ya p p l i c a t i o n o f 1 M 5 - H T ( F i g . 1 2 ,T a b l e I ) . N i f e d i p i n e( 1 O J L M )a l s of a i l e dt os i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h er i s e i n[ C a2+ ] ia c t i v a t e db y1 M5 - H Ti n 4o u to f 4 c e l l s t e s t e d( F i g . 1 3 , T a b l e I ) .I n c r e a s e s i n[ C a2+] iw e r e a l s o s e e n w h e n5 -H T w a sa p p l i e dt oC V S M C s b a t h e di nac a l c i u m - f r e e m e d i u m( 0m MC a2± +0 . 1 m M E G T A ) .H o w e v e r , u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s c e l l r e s p o n s i v e n e s sw a s t o oe r r a t i c f o rq u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n sw i t h n o r m a l m e d i u m . T h e T r y p a nB l u e d y ee x c l u s i o nt e s tc o m f i r m e dt h a t t h e v i a b i l i t yo fC V S M C s c e l l sw a s g r e a t l y r e d u c e do n e x p o s u r et o C a2+- f r e e m e d i u m .6 0F i g u r e9 .T h e i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r f r e ec a l c i u m ,[ C a2+I i ,t r i g g e r e db ya p p l i c a t i o n o f 5 - H Tt oas i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l lc u l t u r e d f o r3 d a y sp r i o rt ou s e . A t t h e t i m e m a r k e db yt h e a r r o w ,5 - H T w a sa p p l i e db yr a p i d i n j e c t i o no fa1 0 0j L 1v o l u m eo fH B S S s o l u t i o n c o n t a i n i n g1 Ma g o n i s t i n t ot h e i n l e tt u b eo ft h e c e l lc h a m b e r . N o t e t h e e x p a n d e dt i m e s c a l ec o m p a r e dw i t h5 - H T r e s p o n s e ss h o w n i nm o s ts u b s e q u e n tf i g u r e s .T h e l o n gl a t e n c y o f t h e r e s p o n s ei s l a r g e l yt h e r e s u l to f p e r f u s i o nd e l a y si n t h ed r u g d e l i v e r ys y s t e m .T e m p e r a t u r e2 1 ° C .6 12 0 01 , u M 5 — H T.1 5 0C . ‘i o oL — JNA0 •00 . 40 . 81 . 21 . 62 . 0T i m e( m m )6 2F i g u r e1 0 .A v e r a g et i m ec o u r s e o f t h e i n c r e a s e i n[ C a2+] it r i g g e r e db ya p p l i c a t i o n o fl jM 5 - H Tt o1 3C V S M C s i n 1 2 d i f f e r e n t c u l t u r ep l a t e s .T h e s er e s p o n s e sh a v e b e e n n o r m a l i z e db y p e a ka m p l i t u d e a n d a l i g n e dt e m p o r a l l yb yd e n o t i n gt h e t i m ea to n s e t o fe a c hr e s p o n s ea s t = 0 .D a t ap o i n t s r e p r e s e n tt h em e a n r e s p o n s e o f t h e1 3 c e l l s m e a s u r e da t a p a r t i c u l a r t i m e a f t e rr e s p o n s eo n s e t .6 3/ \0( 1 )Io0 . 5NIIII .I0Iz0 . . . i . . — , - -00 . 40 . 81 . 2 1 . 6 2 . 0T i m e ( m m )6 4Figure 11. Increase in [Ca2+Ji triggered by application of 100mM K+ saline toa cultured smooth muscle cell after 3 day in vitro. This solution was prepared byreplacing sodium chloride isotonically with potassium chloride. A 100 .tl volumeof this solution was injected into the inlet tube of the cell chamber at the timeindicated by the arrow.652 0 01 0 0 m MK +1 5 0C1 0 0+c \ JQ0L _ JI s000 . 40 . 81 . 21 . 62 . 0T i m e( m m )6 6F i g u r e 1 2 .E f f e c to fL a3+ a n dC o 2+ o ns e r o t o n i n - i n d u c e d c h a n g e s i n[ C a2+ ] jo f a C V S M Cc u l t u r e df o r3d a y s p r i o r t o u s e . 5 - H T ( 1 M )w a s a p p l i e db yi n j e c t i o no f1 0 0 l v o l u m e s o f t h ea g e n t d i s s o l v e d i n H B S S i n t o t h ei n l e t t u b e o ft h e c e l l c h a m b e r . T h e t i m e s o f t h e s e i n j e c t i o n s a r e i n d i c a t e db y t h e a r r o w s .A p p l i c a t i o n o f d r u g - f r e e H B S S s o l u t i o n i n t h i s m a n n e r ( c o n t r o l )r e s u l t e d i nas m a l l r i s e i n[ C a2+] iw h i c h w a s b e l o w t h e t h r e s h o l d l e v e l r e q u i r e d f o rar e s p o n s e . D u r i n gt h e t i m e s i n d i c a t e db yt h e h o r i z o n t a l b a r ,L a3+o rC o2+w a sp e r f u s e dt h r o u g h t h e c e l l c h a m b e ra s1 0 m M s o l u t i o n s o f t h e i r r e s p e c t i v ec h l o r i d e s a l t s .6 7200LaCI3 CoCI2(10mM) (10mM)5—HT 5—HT 5—HT Control 5—HT150 (1pM)100c ’ 10( 3‘‘ 50A A A A00 10 20 30 40Time (mm)6 8Figure 13. Effect of nifedipine (10 M) on the rise in [Ca2+]i triggered by 1 M5-HT in a CVSMC cultured for 3 days prior to use. Serotonin applications weremade as shown by the arrows, using the procedure described for Fig. 12.Nifedipine was dissolved in HBSS and perfused over the cells, as indicated bythe horizontal bar.6 91 5 0l O u MN i f e d i p i n e1 2 0l u M 5 — H Tl u M 5 — H T. 1C1 ’ ./ \_ _6 0( _ )L J3 0AA0; 1 .T i m e ( m m )7 0T a b l e I T h e i n f l u e n c e o fC o2+ , L a3+ ,a n d n i f e d i p i n eo nt h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n[ C a2ji n d u c e db y5 - H T i n c u l t u r e d r a t C V S M C sT r e a t m e n t%i n c r e a s e i n[ C a2jS t u d e n t ’ st - t e s to v e r b a s e l i n e l e v e l5 - H T ( 1 M )1 1 5 ± 1 8P < O . O 15 - H T+ k e t a n s e r i n( 5n M )6 3±9( n= 5 ) V5 - H T ( 11L M )1 8 7 ± 3 8P > O . 0 55 - H T + C o2( l O m M )1 9 0 ± 3 3( n = 4 )5 - H T ( 11M ) 1 6 2 ± 4 8P > 0 . 0 55 - H T + L a3( 1 0 m M )1 6 5 ± 4 1( n = 4 )5 - H T ( 1 M ) 1 4 1 ±1 6P > 0 . 0 55 - H T + n i f e d i p i n e ( 1 0M )1 3 8 ± 2 7( n = 4 )7 1T h e e f f e c t s o f t h e p a r t i a l l ys e l e c t i v e5 - H T 2r e c e p t o ra n t a g o n i s t ,k e t a n s e r i n ,w e r e e x a m i n e d i n 1 0 c e l l s . K e t a n s e r i n( 5n M ) r e v e r s i b l ya t t e n u a t e dt h e 5 - H i ’ r e s p o n s e i n a l l5c e l l st e s t e d( F i g . 1 4 ,T a b l e I ) . W h e na p p l i e da t ac o n c e n t r a t i o n o f 1 0 M , k e t a n s e r i np r o d u c e dac o m p l e t e b l o c ko f t h e r i s e i n[ C a2h ] jt r i g g e r e db y1 j M 5 - H Ti n S o u t o f5c e l l st e s t e d .I n m a n yc a s e s ,r e p e a t e d e x p o s u r eo f 5 - H T r e a c t i v e c e l l st oac o n s t a n td o s e o f s e r o t o n i n l e a d t oag r a d u a l l o s s o f r e s p o n s i v e n e s st ot h e a g o n i s t .T h el o s s o fr e s p o n s es e e n d u r i n g r e p e a t e d a p p l i c a t i o no f 5 - H T c o u l do c c u r i n t h ea b s e n c e o f a n y i n c r e a s e i n t h e b a s e l i n el e v e l o f f r e e c a l c i u m i nt h e c e l l ( F i g . 1 5 ) .T h i s d e c l i n e c o u l d n o t b e c o m p l e t e l y r e v e r s e d ,e v e n b y w a s h i n g t h e c e l lu n d e rs t u d yi n s e r o t o n i n - f r e e s a l i n ef o r a p e r i o d o f3 0m i n u t e s .H o w e v e r , r o b u s tr e s p o n s e st o5 - H T c o u l d s t i l lb e d e t e c t e di n o t h e rc e l l s i n t h e s a m ec u l t u r e ,w h i c h h a d n o t p r e v i o u s l yb e e n e x p o s e dt op h o t o e x c i t a t i o n .T h e e f f e c t o f 5 - H T o n[ C a2+] jw a s c l e a r l y d o s e - d e p e n d e n t ,a si s s h o w n i nF i g . 1 6 . T h i s l o g d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o nw a s o b t a i n e d f r o m 8 4C V S M C s e x p o s e dt o as i n g l e , t r a n s i e n t a p p l i c a t i o n o f 5 - H T ,t om i n i m i z e t h ed e l e t e r i o u s e f f e c t s o fp h o t o e x c i t a n t w a v e l e n g t h s .Q u a n t i t a t i v ea s p e c t so f t h i s l o gd o s e - r e s p o n s er e l a t i o n s h o u l d , h o w e v e r ,b ei n t e r p r e t e d w i t hc a u t i o n . T h e 1 0 01i l v o l u m e s o fa g o n i s tu s e dm a y h a v e b e e ns u b j e c t t od i l u t i o n d u r i n gp a s s a g e t h r o u g h t h e c e l lc h a m b e r . I n a d d i t i o n , t h e a r t i f i c i a l i n c r e a s e i n[ C a2+] ic a u s e db yf l u i di n j e c t i o np r e c l u d e d a c c u r a t e m e a s u r e m e n t s f o r s e r o t o n i nd o s e s b e l o w 1 0 n M .U n d e r t h ec o n d i t i o n s u s e d , h o w e v e r , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e r e s p o n s eo f m o s tC V S M C sw a sa l r e a d y m a x i m a la t as e r o t o n i nd o s e o f 1 j L M . T h e c o n c e n t r a t i o no f 5 - H Tp r o d u c i n gah a l f - m a x i m a l i n c r e a s e i n[ C a2+ ] iw a s 1 0 n M ( F i g . 1 6 ) .T h e7 2F i g u r e1 4 .E f f e c to f5n Mk e t a n s e r i no n t h e r i s e i n[ C a2+ ] ie v o k e db y 1 M5 -H Ti na C V S M C s t u d i e d a f t e r2 d a y s i n v i t r o . 5 - H Tw a sa p p l i e db yi n j e c t i o no f a1 0 0 J L 1 v o l u m eo fd r u g ,a sd e s c r i b e di n p r e v i o u s f i g u r e s .D u r i n gt h e t i m ei n d i c a t e db yt h eh o r i z o n t a lb a r , t h ec u l t u r ew a s p e r f u s e dw i t h H B S Ss o l u t i o nc o n t a i n i n g5n Mk e t a n s e r i n .T h ea n t a g o n i s tr e d u c e d ,b u td i d n o t a b o l i s ht h er e s p o n s eo f t h i sc e l lt o 5 - H T .I n j e c t i o no fd r u g - f r e eH B S Sp r o d u c e do n l yas m a l l ,a r t i f a c t u a li n c r e a s e i n[ C a2+J j( c o n t r o l ) .7 32 0 0k e t a n s e r i n( 5 n M )c o n t r o l5 — H T ( 1M )5 — H T ( 1 , i M )5 — H T ( 1 i i M )1 6 0.S 1 2 0 .r i+0 18 0ooL _ J4 0 -AAAA0II0 4 81 21 62 0 2 4T i m e( m m )7 4F i g u r e1 5 . D e c r e a s i n gr e s p o n s i v e n e s so faC V S M C c u l t u r e df o r3d a y s t or e p e a t e da p p l i c a t i o n so f0 . 1jM 5 - H T .S e r o t o n i n w a s a p p l i e db yi n j e c t i o no f 1 0 01 v o l u m e so f t h ea g e n t a tt h e t i m e si n d i c a t e d b y t h e a r r o w s .7 5200 0.1 uM 5—HT150C+100 \(“100 IJ50____•N_Y.A A A A0 5 10 115W 20 25Time (mm)76F i g u r e 1 6 . L o g - d o s er e s p o n s e r e l a t i o n s h o w i n g t h e p e r c e n t a g e i n c r e a s e i n[ C a2jt r i g g e r e db yv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f5 - H T , t e s t e d i n a t o t a l o f 8 4 C V S M C s a f t e r 2 - 4d a y s i n v i t r o . S y m b o l s s h o w t h em e a n±S E M v a l u e s f o r e a c h 5 - H T c o n c e n t r a t i o n u s e d .T h e s m o o t h c u r v ew a sd r a w nt o t h e e q u a t i o n : R e s p o n s e = 1 0 0 % I ( 1+ K / [ 5 - H T I )w i t hK = 1 On M .7 71 0 0 -a )c i :o8 0/6 0. — c iC , ,4 0C )— a )C )2 00i oi o8i oi o61 o1 oI oS e r o t o n i n ( M )7 8m a x i m a l l e v e l o f[ C a2+ ] ia t t a i n e d d u r i n g s t i m u l a t i o nb y5 - H Tw a sa p p r o x i m a t e l y 1 7 0 n M .3 . 3 .E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f i s o l a t e dC V S M C sT h e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s w e r ec o n d u c t e do n C V S M C s m a i n t a i n e d f o r 2 - 3d a y s a t4 ° C p r i o rt o u s e .I tw a s f o u n d t h a t c e l l st r e a t e d i n t h i s m a n n e r c o n s i s t e n t l y y i e l d e dag r e a t e rp e r c e n t a g e o f m e m b r a n ep a t c h e s h a v i n g f u n c t i o n a lK C ac h a n n e l s t h a nw a st h ec a s e f o r C V S M C si n c u b a t e da t3 7 ° C .3 . 3 . 1 . B a s i c e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f i s o l a t e d C V S M C ss t u d i e d w i t h c e l l -a t t a c h e d a n d w h o l e - c e l l , c u r r e n tc l a m pr e c o r d i n g s .D u r i n g p a t c h c l a m p r e c o r d i n g , p a t c h e l e c t r o d e s f o r m e d h i g hr e s i s t a n c e( 1 0 - 5 0 G O ) s e a l s o n t h e m e m b r a n e o f C V S M C s i na b o u t7 0 %o fa t t e m p t s . P a t c he l e c t r o d e s w e r ef i l l e d w i t has o l u t i o n o f c o m p o s i t i o n( m M ) : 1 4 0 K C 1 ,3N a C 1 ,0 . 6 5C a C 1 2 ,3E G T A a n d 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . T h e p i p e t t e v o l t a g ew a s0m V .U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , a b o u t2 5 %o f t h e c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s h o w e d n od i s c e r n a b l e s i n g l e c h a n n e l a c t i v i t y( F i g . 1 7 A ) .I n t h e r e m a i n i n g7 5 %o f t h ep a t c h e s ,i n w a r d l yd i r e c t e ds m a l l a m p l i t u d e ( 1 - 2 p A ) s i n g l ec h a n n e l c u r r e n t s w e r eo b s e r v e d ( F i g . 1 7 B ) . S i n g l e c h a n n e l a c t i v i t y c o u l db em o d i f i e d i n c e l l - a t t a c h e dp a t c h e sb yb a t h a p p l i c a t i o n o f 5 - H T i n t h e s t a n d a r d e x t e r n a l s a l i n e b a t h i n g t h ec e l l s . 5 - H T ( 1 - 1 0 M ) i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f i n w a r d l y d i r e c t e d ,8 - 1 0 p As i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s i n 6 / 1 0 c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e da t ap i p e t t ep o t e n t i a l o f0m V ( F i g . 1 8 ) . T h e i d e n t i t y o f t h e s e c h a n n e l sw a s n o t i n v e s t i g a t e d7 9F i g u r e 1 7 . R e c o r d i n g s o b t a i n e d f r o m t w oc e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e di nt w oC V S M C si n c u b a t e da t4 ° C f o r3d a y sp r i o rt o u s e .P a t c h e l e c t r o d e sw e r e f i l l e d w i t has o l u t i o nc o n t a i n i n g 1 4 0 m M K C 1 . B a n d w i d t h D C - 2 k H z ,p i p e t t e p o t e n t i a l0m V . A . N od i s c e r n a b l es i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w e r e p r e s e n t i n t h i sp a t c h . B . S m a l l a m p l i t u d es i n g l ec h a n n e l c u r r e n t s w e r e p r e s e n t i n t h i s r e c o r d i n g . I n t h i s a n di n a l ls u b s e q u e n tt r a c e s ,i n w a r d m e m b r a n ec u r r e n t i s d e n o t e db yd o w n w a r d d e f l e c t i o n f r o mb a s e l i n e .8 018SW0gElVF i g u r e1 8 .U p p e rp a n e l .L a r g e a m p l i t u d e ,i n w a r d l y d i r e c t e ds i n g l ec h a n n e lc u r r e n t s e v o k e di n ac e l l - a t t a c h e d p a t c hd u r i n gb a t h a p p l i c a t i o n ( b a r ) o f 1 0 0 M5 - H T t ot h e e x p o s e dm e m b r a n es u r f a c eo faC V S M C . B a n d w i d t hD C - 2 0 0H z .L o w e r p a n e l .P a r t o ft h e r e c o r d i n gs h o w ni n u p p e r p a n e la t i n c r e a s e dt i m er e s o l u t i o n( D C - 2k H z ) . P i p e t t e p o t e n t i a l0 m V .T h ep a t c he l e c t r o d ec o n t a i n e d1 4 0 m M K C I .8 2SWVdOlS01ydoi0JA.Jrl001LH5f u r t h e ri nt h i ss t u d y . W h e n a p p l i e da t ah i g h e r c o n c e n t r a t i o nr a n g e( 1 0 - 1 0 0M M ) , 5 - H T a l s o i n d u c e d t h e a p p e a r a n c eo f b r i e f , b i p h a s i c c u r r e n ts p i k e s i n 6 / 1 0c e l l - a t t a c h e d p a t c h e s s t u d i e d ( F i g . 1 9 ) . T h e s ee v e n t s w e r ea b o u t1 0p A i n p e a k -t o - p e a ka m p l i t u d e , w h e n m e a s u r e da t ap i p e t t ep o t e n t i a l o f0m V .T h e s ec u r r e n t s w e r e s i m i l a r i n f o r m a n d a m p l i t u d et ot h o s ea s s o c i a t e d w i t ha c t i o np o t e n t i a l d i s c h a r g e i nh i g hi n p u t i m p e d a n c e c e l l s s t u d i e d u s i n gt h ec e l l - a t t a c h e dc o n f i g u r a t i o n ( F e n w i c k e t a l . 1 9 8 2 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n si n d i c a t e t h a t i s o l a t e dC V S M C sr e t a i n e de l e c t r o - r e s p o n s i v e n e s st o5 - H i ’ a f t e r 2 - 3d a y s i n v i t r o .T h er e s t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l o fal a r g e s a m p l e o fC V S M C s w e r em e a s u r e d u s i n g t h e w h o l e - c e l l , c u r r e n t - c l a m p r e c o r d i n g t e c h n i q u e .I n t h e s es t u d i e s t h e p a t c h p i p e t t e s w e r e a g a i n f i l l e d w i t has a l i n eo f c o m p o s i t i o n ( m M ) :1 4 0 K C 1 ,3N a C 1 , 0 . 6 5C a C 1 2 ,3E G T A , 1 0 H E P E S , p H 7 . 4 . T h er e s t i n gp o t e n t i a l so f C V S M C sw e r e u n i m o d a l l yd i s t r i b u t e d w i t h a n a v e r a g e o f - 4 11 1 . 7 m V ( n = 6 9 ) ,a n d r a n g e df r o m - 1 8 m Vt o- 6 9 m V ( F i g . 2 0 ) . T h er e s i s t a n c e ,c a p a c i t a n c e a n d t i m e c o n s t a n t o f t h e C V S M C m e m b r a n e w e r e e s t i m a t e db ya p p l y i n gs m a l l d e p o l a r i z i n ga n dh y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t st o t h e p a t c h e l e c t r o d e( F i g . 2 1 ) . F l u c t u a t i o n si n m e m b r a n e p o t e n t i a l w e r e n o t e da ta l l m e m b r a n ev o l t a g e s , a n d t h e s ew e r e p a r t i c u l a r l y a p p a r e n t w h e n t h e m e m b r a n ew a s s t r o n g l yh y p e r p o l a r i z e do r d e p o l a r i z e d . A p p l i c a t i o n o f s t r o n g d e p o l a r i z i n g s t i m u l ie v o k e do n l y s m a l l ( 1 0 - 1 5 m V ) r e g e n e r a t i v e r e s p o n s e s a n d a c t i o n p o t e n t i a l s w e r en o t o b s e r v e d .T h i s r e s u l t i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e sc o n d u c t e d o n r a tC V S M C si n i n t a c t v e s s e l s ( H i r s te ta l . 1 9 8 6 ) .T h e c u r r e n t - v o l t a g er e l a t i o n s o ft w ot y p i c a lC V S M C sa r es h o w n i n F i g .2 2 . T h e r e s t i n gm e m b r a n e p o t e n t i a l so ft h e s e c e l l sw e r e - 3 1 m V a n d - 4 9 m V . I tc a nb es e e n t h a tt h e m e a n s l o p e r e s i s t a n c e o f t h e s e c e l l s d e c r e a s e dm a r k e d l ya t8 4F i g u r e1 9 .B i p h a s i cc u r r e n t sr e c o r d e df o m aC V S M Ca f t e r2 d a y s i nv i t r o u s i n gt h ec e l l - a t t a c h e dc o n f i g u r a t i o n .T h es o l u t i o nb a t h i n gt h ec e l l c o n t a i n e d1 O O M5 - H T .P i p e t t ep o t e n t i a l 0m V .B a n d w i d t hD C - 2 k H z .T h e p i p e t t es o l u t i o nc o n t a i n e d1 4 0m MK C 1 .8 598‘Vd01SJA.T11001in-cF i g u r e2 0 .R e s t i n gmembrane p o t e n t i a l s recorded f r o m 6 9 C V S M C s a f t e r 2 - 3d a y s i nv i t r oa t4 ° C .W h o l e - c e l lr e c o r d i n gm e t h o d sw e r e u s e d t oobtain t h e s ed a t a .P a t c hp i p e t t e sc o n t a i n e d1 4 0 m M K C 1a n d3m MN a C 1 .8 71 41 2( I ,co1 0 -4 - ,Ca )U )- o° 6 -d4 .z2 -— ,—0— 1 0 — 2 0— 3 0— 4 0— 5 0— 6 0— 7 0— 8 0— 1 0 0R e s t i n gM e m b r a n eP o t e n t i a l( m V )8 8Figure 21. Voltage changes (lower traces) induced by application of constantcurrent pulses (upper traces) in a CVSMC studied using the whole-cell, currentclamp technique. Resting potential -31 mV, cell diameter 12.5 J L m. Pipettesolution contained 140 mM KC1 and 3 mM NaCl. Bandwidth DC-200 Hz.8 906SIAWifdozFigure 22. Current-voltage relationships for two CVSMCs studied in the whole-cell, current clamp recording mode. The resting membrane potentials of thesecells were -31 mV (closed circles) and -49 mV (open circles). The graph showsthe change in. resting membrane potential, z V, evoked by application of constantcurrent pulses of amplitude, I. Lines were fitted to data points by eye.Recording pitettes contained 140 mM KC1 and 3 mM NaCl. Temperature 21°C.91V ( m V )6 02 5- 1 0- y3I ( p A )17- 6 0- 8 0I I— i 2 0— 1 4 09 2p o t e n t i a l s n e a rt o ,a n d d e p o l a r i z e d f r o m t h er e s t i n g m e m b r a n ev o l t a g e . T h es l o p e o f t h e I - V r e l a t i o n s h i pa t t h e r e s t i n g p o t e n t i a l s i n d e c a t e da m e m b r a n er e s i s t a n c e , R o f 3 . 2±0 . 4 8 G ) ( n= 2 0 ) . C e l l c a p a c i t a n c e a n d t i m ec o n s t a n tw e r ea s s e s s e df r o m t h ed e c a yo f h y p e r p o l a r i z i n ge l e c t r o t o n i cp o t e n t i a l s o fa b o u t2 0 m V a m p l i t u d e i n7c e l l s . T h e s ed e c a y sw e r ew e l l f i t t e db y as i n g l ee x p o n e n t i a l t e r m , y i e l d i n g a n a v e r a g e m e m b r a n et i m e c o n s t a n t o fm= 7 8±2 6m s ( n= 7 )( F i g . 2 3 ) . C e l l c a p a c i t a n c ew a s c a l c u l a t e d f r o m t h e r e l a t i o nC m =T m / R m .A m e a n v a l u e o f 2 4±2 . 3 p Fw a so b t a i n e d f r o m7c e l l s . T h i s v a l u e i sl a r g e r t h a n t h a t c a l c u l a t e d f o r l 2 j L m d i a m e t e rc e l l s , a s s u m i n g s p h e r i c a ls h a p ea n das p e c i f i c m e m b r a n ec o m p a c i t a n c e o f 1j LF / c m2.3 . 4 .K C ac h a n n e l s i n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e se x c i s e d f r o m C V S M C sI s o l a t e d i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c h e s e x c i s e d f r o mC V S M C s d i s p l a y e dav a r i e t y o f s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s w h e n e x p o s e dt o1 4 0 m M K C 1 s o l u t i o n sa t b o t hm e m b r a n e f a c e s . I n s o m ec a s e s ,s m a l l c u r r e n t s c o r r e s p o n d i n gt os i n g l e c h a n n e lc o n d u c t a n c e s i n t h e r a n g e 1 0 - 2 5p S w e r e o b s e r v e d . T h e s e e v e n t s c o u l d r e a d i l yb ed i s t i n g u i s h e d f r o m t h e a c t i v i t y o fK C ac h a n n e l sb y t h e i r s m a l l e r c o n d u c t a n c ea n d i n s e n s i t i v i t yt oc h a n g e s i n c a l c i u m i o n c o n c e n t r a t i o na t t h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n e f a c e .E v i d e n c ew a so b t a i n e d f o rt h e p r e s e n c e o f t w o c l a s s e s o fK C ac h a n n e l i nt h e s e p a t c h e s . T h e s e w e r e d i s t i n g u i s h e do nt h eb a s i c o fal a r g e d i f f e r e n c ei ns i n g l ec h a n n e l c o n d u c t a n c e ,a s m e a s u r e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s( F i g . 2 4 ) . T h e f i r s t c l a s s o f c h a n n e l s , d e s i g n a t e da sK ( C a ) L( l a r g e c o n d u c t a n c e )c h a n n e l s , w a s c h a r a c t e r i z e db y am e a n s i n g l e c h a n n e lc o n d u c t a n c e o f 2 0 7±1 0p S( n = 1 6 ) . T h e s e c o n dc a t e g o r y , d e s i g n a t e da sK ( C a ) I( i n t e r m e d i a t e9 3F i g u r e 2 3 . S e m i - l o g a r i t h m i cp l o to ft h ed e c a yp h a s e o fah y p e r p o l a r i z i n ge l e c t r o t o n i cp o t e n t i a le v o k e d i n aC V S M Cm e m b r a n eu n d e rw h o l e c e l l , c u r r e n t -c l a m pc o n d i t i o n s .T h i s c e l lh a d ar e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a lo f- 3 9m V . T h eg r a p hs h o w st h ed e v i a t i o n ,V o ft h em e m b r a n ep o t e n t i a lf r o mt h i sr e s t i n g l e v e la s af u n c t i o n o ft i m es i n c e t h et e r m i n a t i o no f t h es t i m u l a t i n g c u r r e n t p u l s e . D a t ap o i n t sw e r ef i t t e db y as t r a i g h tl i n e u s i n gl i n e a r r e g r e s s i o n .T h ea r r o wi n d i c a t e st h em e m b r a n et i m ec o n s t a n ti -= 9 8 m s .9 43 02 01 0• e .....1•05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 5 0T i m e( m s )9 5F i g u r e 2 4 .C u r r e n t - v o l t a g e( I - V ) r e l a t i o n s h i p so fs i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l s( c i r c l e s ,n= 1 6p a t c h e s )a n dK ( C a ) Ic h a n n e l s( t r i a n g l e s ,n= 1 0p a t c h e s )s t u d i e di ni n s i d e - o u tm e m b r a n ep a t c h e s bathed i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m M p o t a s s i u ms o l u t i o n s .T h es t r a i g h tl i n e sw e r ef i t t e dt ot h e data b y l i n e a r r e g r e s s i o n , a n drepresent t h e mean s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e f o r K ( C a ) L c h a n n e l s ( 2 0 7 ± 1 0p S )a n df o rK ( C a ) Ic h a n n e l s (92± 2 . 6 p S ) .9 6L691—..(Aw)A09090179—..170—017—09—09—9.91(yd)Ic o n d u c t a n c e c h a n n e l s ) d i s p l a y e das i g n i f i c a n t l y s m a l l e r c o n d u c t a n c e ,9 2±2 . 6p S( n = 1 0 ) , P< 0 . 0 5i n S t u d e n t ’ st - t e s tw i t hK ( C a ) Lc l a s s .A s s h o w n i n F i g . 2 4 ,t h e r ew a sl i t t l e o v e r l a p i n t h e c o n d u c t a n c e r a n g e sc h a r a c t e r i z e db yt h e s em e a nv a l u e s , s u g g e s t i n g t h a t i n d e e d t w o d i s t i n c t c l a s s e s o f e v e n t s w e r ep r e s e n t . I tw a sa l s o n o t e d t h a t t h e m e a nK ( C a ) Lc h a n n e lc o n d u c t a n c ew a sn o t s i m p l ya n i n t e g e rm u l t i p l e o f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l c o n d u c t a n c e , i n d i c a t i n g t h a tt h e f o r m e r e v e n t sd i d n o t r e s u l t f r o m t h e s i m u l t a n e o u s o p e n i n g o ft w o o r m o r eK ( C a ) Ic h a n n e l s .F o r t h e s e r e a s o n s , i t w a s d e c i d e dt ot r e a tK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic u r r e n t sa s t w od i s t i n c t c l a s s e s o f e v e n t , a n dt o a s s e s st h e i r p r o p e r t i e s w i t h r e g a r dt o i o n i cs e l e c t i v i t y ,C a2+a n d v o l t a g e d e p e n d e n c e a n d s e n s i t i v i t yt ot h e b l o c k i n ga c t i o no f T E A . T h ep r o p e - t i e s o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l w i l lb ed e s c r i b e d f i r s t , s i n c e t h i st y p e w a se n c o u n t e r e d m o r e f r e q u e n t l y t h a n t h e s m a l l e rK ( C a ) Ic h a n n e l .3 . 4 . 1 . C o n d u c t a n c ea n d i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lS i n g l e c h a n n e l c u r r e n t sa s c r i b e dt ot h e o p e n i n go fK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r eo b s e r v e di n 1 6 / 2 0 i n s i d e - o u t p a t c h e s s t u d i e d . F i g . 2 5 s h o w s c u r r e n t s f l o w i n gt h r o u g h as i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l i n a n i n s i d e - o u t p a t c h v o l t a g e - c l a m p e da tv a r i o u sm e m b r a n e p o t e n t i a l s . T h i s p a t c hw a sb a t h e d i ns y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK ± s o l u t i o n sa n d[ C a2+ ] i w a s1 0 A M . F i g . 2 6 s h o w s t h e a m p l i t u d ed i s t r i b u t i o n so b t a i n e d f o rK ( C a ) Lc h a n n e l c u r r e n t s r e c o r d e d f r o map a t c ha t m e m b r a n ep o t e n t i a l s- 3 0m V a n d+3 0 m V . A tm e m b r a n ep o t e n t i a l s i n t h e r a n g e- 8 0m Vt o+ 8 0V ,t h e s e d i s t r i b u t i o n s w e r e w e l l f i t t e db y as i n g l e G a u s s i a n t e r mi n a l l 1 6p a t c h e s s t u d i e d . T h i s r e s u l t s h o w s t h a tt h eK ( C a ) Lc h a n n e l d i d n o t e x h i b i ts i g n i f i c a n ts u b s t a t ec o n d u c t a n c e b e h a v i o r w h e n s t u d i e d i n e x c i s e d m e m b r a n ep a t c h e s .9 8Figure 25. Single-channel currents flowing through a K(Ca)L channel in aninside-out patch voltage-clamped at various membrane potentials, V. This patchwas bathed in symmetrical 140 mM K+ solutions, [Ca2+]j and [Ca2+Jo were 10J L Mand 0.01 M respectively. 0 indicates channel closed and 1 indicates channelopen. Bandwidth DC-200 Hz.9 96 5U ’14 5rrTwrflr1112 5 1Tt 1 P ’ I ’ f r r T T l I ‘ ‘ r r g w n 1 r ’ i 1 r L V ‘ j r v 1 T r ’ 1 T . 7 I q T r I 1 j ’ i r r n p ’ I f ’ T ‘ T I ’ 1 1 n q ’0— 2 5i i I l h l l L HH L L h L . L I 1 i i I . d L i I I L Il i i iL I L L l i L . i J1L L i i i L i l I t I l LJ d I i i i i I I . l I . 1 1 1 1 1 1 1 I A . I- 4 5- 6 5. - — — - - — — — — - . - — — - - — - - . . -* 1 I aIIS5 sl O p AV ( m V )01001 0 0F i g u r e 2 6 . A m p l i t u d ed i s t r i b u t i o n so fK ( C a ) Lc h a n n e l c u r r e n t so b t a i n e d f r o mai n s i d e - o u t p a t c h v o l t a g e - c l a m p e dt o m e m b r a n ep o t e n t i a l so f( A )+3 0 m V ,( B ) -3 0m V .B o t h d i s t r i b u t i o n sw e r e w e l lf i t t e db ys i n g l eG a u s s i a nt e r m s ( s m o o t hc u r v e s )w i t h m o d a lv a l u e sa c c u r r i n ga t 6 . 2 7p A i n ( A )a n da t - 6 . 4 8 p A i n( B ) .P a t c h w a s b a t h e d i ns y m m e t r i c a l1 4 0m MK +s o l u t i o n sa n d[Ca2+]iw a s1 O M .[Ca2+Jo = 0 . O 1 , L M .1 0 1A1 2 0 -, ,1 0 0 -C0>L . .a )C ’ )-04 0 -2 : ]1 ’ 21 ’ 60A m p l i t u d e( p A )B1 O o08 00 6 00L .c i )0 4 0z2 00— - j - - - - -O p A51 0A m p l i t u d e ( p A )1 0 2In patches bathed in symmetrical 140 mM KC1 solutions, the I-Vrelationship of the K(Ca)L channel was linear over the voltage range -80 mV to+ 80 mV, showed a reversal potential of 0 mV and a mean slope conductance of207± 10 pS (n = 16, Fig. 27). The range of conductance values encountered indifferent patches was from 170 pS to 267 pS.The permeability of the open channel to potassium, PK was calculatedfrom the I-V relation in symmetrical 140 mM K+, using the Goldman-Hodgkin-Katz constant-field equation (Goldman, 1943; Hodgkin & Katz, 1949):‘K = PK.VF2/RT{[K + ]o-[K + Ji exp(VF/RT)}/ { 1-exp(VF/RT)} (1)When [K+]o = [K+Jj, Equation 1 simplifies to1K = PK.VF2[K+]/(RT) (2)Here, 1K is the current through an open channel, V is membrane potential,[K+ ]o = [K+ Ji = 140 mM, F is Faraday’s constant, R is the gas constant, T isthe absolute temperature and o and i indicate outside and inside (cytoplasmic)concentrations of ions respectively (Benham et al. 1986). Using Equation 2, aPK of 3.9 x 10-13 cm/s was calculated from the I-V plots averaged from sixteenpatches (Fig. 27).When 80 mM KC1 in the solution bathing the external membrane facewas replaced by an equimolar amount of NaCI, currents flowing in singleK(Ca)L channels reversed at a potential around -21 mV (Fig. 28A). An averageVrev of 21.2 0.50 mV was obtained from 5 patches (see Fig. 29). This value103Figure 27. Current-voltage (I-V) relationship of single K(Ca)L channel currentsaveraged from 16 patches bathed in symmetrical 140 mM potassium solutions. Itwas found that the I-V relationship of the K(Ca)L channel was linear over thevoltage range -80 mV to + 80 mV, showed a reversal potential at 0 mV, and amean slope conductance of 207± 10 pS. Error bars are ±SEM. In this and inall subsequent figures showing standard errors, this parameter is omitted if itsvalue is less than the size of the symbol.1041 6i ( p A )1 2O u t w a r d. 4— 8 0— 6 0— 4 0— 2 0LIIIIIIIIIII1III2 04 06 08 0V ( m V ). 41 2I n w a r d1 61 0 5F i g u r e 2 8 . E f f e c t s o fN a +o rC s +r e p l a c e m e n t o fK +o n t h e s i n g l ec h a n n e lc u r r e n t s i nK ( C a ) Lc h a n n e i s .S i n g l e c h a n n e l c u r r e n t sa tv a r i o u sm e m b r a n ep o t e n t i a l s , V ; w e r e o b t a i n e df r o map a t c h w i t h o n e a c t i v e c h a n n e l w h e n8 0 m MK C 1 i n t h ep i p e t t ew a sr e p l a c e db ya n e q u i m o l a r a m o u n t o f N a C 1 i n A , a n d o fC s C 1 i n B . 0i n d i c a t e s c h a n n e l c l o s e d a n d 1 i n d i c a t e sc h a n n e lo p e n . B a n d w i d t hD C - 2 k F I z . [ C a2+ J j ,1 0 0 M a n d[ C a21 o ,0 . 0 1 M .A a n dBw e r eo b t a i n e df r o md i f f e r e n t p a t c h e s .1 0 6SW001yds:‘W001yd11::z0$,(wALOI—I—I——-I_—-.—.---—-‘--.:.09-IZLILLLVFigure 29. Current-voltage (I-V) relationship of single K(Ca)L channel currentswhen 80 mM KCI at the cytoplasmic (open squares) or external membrane face(filled diamonds) was replaced by NaC1. The symbols show mean currentscalculated from 5 patches. Standard error bars were omitted if less than thesymbol size. The thick solid lines show currents predicted from constant-fieldtheory, assuming PK = 3.5 x 10-13 cm/s (external K+ replacement) or PlC 4.0x 10-13 cm/s (cytoplasmic K+ replacement). All the currents observed fallwithin the range of values predicted from the constant-field equation, using theextreme values of PK seen in symmetrical 140 mM solutions (thin lines).[Ca2+]j = 100PM. [Ca2+]o 0.0lM.1081 6i ( p A )1 2O u t w a r d1 0 - o- o8V ( m V )4 0 6 0 8 0• 8I n w a r d1 21 61 0 9i s v e r y c l o s et ot h e r e v e r s a l p o t e n t i a l e x p e c t e d f o ra p o t a s s i u m s e l e c t i v ec h a n n e lu n d e r t h e s e c o n d i t i o n s( V r e v= - 2 1 . 4 m V ) .W h e n8 0m M K C 1 i n t h es o l u t i o nb a t h i n g t h e c y t o p l a s m i cf a c ew a s r e p l a c e db ya n e q u i m o l a ra m o u n t o f N a C 1 ,c u r r e n t s i nK ( C a ) Lc h a n n e lr e v e r s e da t am e m b r a n e p o t e n t i a l o f+ 2 1 . 2 ±0 . 3 7m V ( n= 5 ,s e e F i g . 2 9 ) ,a g a i nv e r y c l o s et ot h e N e r n s t i a n r e v e r s a lp o t e n t i a lv a l u e f o rK +( +2 1 . 4 m V ) . T h e s e r e v e r s a lp o t e n t i a l s w e r eu s e d t o c a l c u l a t e t h ep e r m e a b i l i t yt a t i oP N a / P K ,e m p l o y i n g t h e r e l a t i o nV r e v= ( R T / z F ) l n [ ( P N a [ N a ] o+ P K [ K ] o ) / ( P N a [ N a ] j + P K [ K ] j ) ]( 3 )( B e n h a m e ta l . 1 9 8 6 ) . H e r eV r e vi s t h e o b s e r v e d r e v e r s a l p o t e n t i a l , a n dz i s t h ev a l e n c e . A v a l u eo fP N a / P K< 0 . 0 5 w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n gah i g h d e g r e eo fs e l e c t i v i t y f o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s i n t h i s c h a n n e l . I tw a sa l s on o t e d t h a t ,s i n c e E Q w a s 0 m V t h r o u g h o u tt h e s e e x p e r i m e n t s ,t h e p e r m e a b i l i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lt oC l - m u s tb e v e r yl o w . T h e p o t a s s i u ms e l e c t i v e n a t u r e o f t h i sc h a n n e l w a s l a t e rc o n f i r m e di n e x p e r i m e n t s w i t h t h e p o t a s s i u m c h a n n e lb l o c k e r sC s+a n d T E A ,a sw i l lb ed e s c r i b e d i nal a t e r s e c t i o n .U n d e r t h e a s s u m p t i o n o fn e g l i g i b l e p e r m e a b i l i t yt oN a+ ,t h e c o n s t a n t - f i e l d r e l a t i o n( E q u a t i o n 1 )w a su s e dt o c a l c u l a t et h e e x p e c t e d c u r r e n t t h r o u g hK ( C a ) Lc h a n n e l s w h e n8 0m MK +w a sr e p l a c e db ya n e q u i m o l a r a m o u n t o fN a +a tt h e c y t o p l a s m i c o ra t t h ee x t e r i a lm e m b r a n e f a c e . I n c a l c u l a t i n g t h e s e c u r r e n t s ,t h e p a r a m e t e rP Kw a sa l l o w e d t o v a r y b e t w e e n 3 . 3 x1 0 - 1 3c m / sa n d4 . 9 x1 0 - 1 3c m / s , t h e e x t r e m ev a l u e s n o t e d f o rK ( C a ) Lc h a n n e l s s t u d i e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s .I t c a nb es e e n t h a t t h em e a n c u r r e n t so b s e r v e di n5p a t c h e sw e r e w e l l p r e d i c t e db yc o n s t a n t - f i e l dt h e o r y w h e nP K= 3 . 5x1 0 - 1 3c m / s( r e p l a c e m e n t o f8 0m Me x t e r n a l K +b yN a + ) a n dP K= 4 . 0 x1 0 - 1 3c m / s( r e p l a c e m e n t o f8 0m Mi n t e r n a l K ±b yN a + ) ( F i g .2 9 ) .F i g .2 9a l s os h o w s( a st h i n s o l i d l i n e s )t h e1 1 0c u r r e n t t h r o u g ht h eK ( C a ) Lc h a n n e l c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x t r e m e v a l u e o fP Kn o t e d e a r l i e r , n a m e l y3 . 3x1 0 - 1 3c m / sa n d 4 . 9 x l O - l3 c m / s . I t i s e v i d e n t t h a t a l lt h e c u r r e n t s o b s e r v e dd u r i n gN a +r e p l a c e m e n to fK +f a l l w i t h i nt h e r a n g e o fv a l u e sp r e d i c t e d f r o m t h e c o n s t a n t - f i e l d e q u a t i o n . I tw a st h e r e f o r ec o n c l u d e dt h a tN a +i o n s d on o t i n t e r f e r e w i t h t h ep a s s a g eo fK +i o n s t h r o u g h t h eK ( C a ) Lc h a n n e l , u n d e r t h e c o n d i t i o n su s e di n t h i s s t u d y .3 . 4 . 2 . E f f e c t o fK +r e p l a c e m e n t b y C s+o n c u r r e n t f l o w t h r o u g hK ( C a ) Lc h a n n e l s .T h e e f f e c t so f r e p l a c i n g8 0m M K C 1b ya n e q u i m o l a ra m o u n t o f C s C 1 i ne i t h e rt h e c y t o p l a s m i c o r t h e e x t e r n a l b a t h i n g s o l u t i o n w e r e e a c h s t u d i e di n5p a t c h e s .W h e nC s +r e p l a c e dK +a tt h e e x t e r n a l m e m b r a n e f a c e , t h e s i n g l ec h a n n e lc u r r e n t s h a dar e v e r s a l p o t e n t i a l c l o s et o- 2 1 m V ( F i g . 2 8 B ) . A na v e r a g e v a l u e o fV r e v= - 2 1 . 3±0 . 4 6 m Vw a so b t a i n e d f r o m5p a t c h e s( s e eF i g .3 0 ) .R e p l a c e m e n t o f 8 0m M K ± i n t h e c y t o p l a s m i c b a t h i n g s o l u t i o nb ye q u i m o l a r C s+r e s u l t e d i nar e v e r s a l p o t e n t i a l o f+2 1 . 2±0 . 5 1 m V( 5p a t c h e s ,s e eF i g .3 0 ) .T h e s e r e v e r s a lp o t e n t i a l s w e r eu s e d t o c a l c u l a t e t h e p e r m e a b i l i t yr a t i oP C s / P K ,e m p l o y i n g E q u a t i o n3 .A v a l u e o fP C s / P K< 0 . 0 5 w a so b t a i n e d ,i n d i c a t i n gt h a t t h eK ( C a ) Lc h a n n e l i s v e r y p o o r l y p e r m e a b l et o C s+ .I t w a sa l s on o t e dt h a t c u r r e n t s i n s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l s r e c o r d e d i n t h ep r e s e n c e o fC s+e x h i b i t e dag r e a t e r n o i s e v a r i a n c e , w h e n c o m p a r e d w i t hc u r r e n t s r e c o r d e di n s y m m e t r i c a lK +g r a d i e n t s , o r d u r i n g r e p l a c e m e n to fK +b yN a +( s e eF i g s . 2 5 a n d 2 8 ) . T h i s o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t haf l i c k e r i n gb l o c ko f o p e nK ( C a ) Lc h a n n e l sb y C s+ ,a sh a s p r e v i o u s l y b e e no b s e r v e d i n o t h e rt y p e s1 1 1F i g u r e3 0 .C u r r e n t - v o l t a g e( I - V )r e l a t i o n s h i p o f s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e lc u r r e n t sw h e n8 0m M K C 1 a tt h e c y t o p l a s m i c( f i l l e d t r i a n g l e s ) o r e x t e r n a l m e m b r a n ef a c e( o p e n t r i a n g l e s )w a sr e p l a c e db yC s C l .S y m b o l ss h o w m e a n c u r r e n t so b t a i n e df r o m5p a t c h e s .S t a n d a r de r r o rb a r s w e r e o m i t t e di f s m a l l e r t h a ns y m b o l . S o l i dl i n e s s h o wp r e d i c t e d c u r r e n t sa s s u m i n g c o n s t a n t - f i e l db e h a v i o r , c a l c u l a t e df o rt h ee x t r e m e v a l u e so fP Ks e e n i ns y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s . M e a nc u r r e n t sw e r es m a l l e r t h a np r e d i c t e d b y t h ec o n s t a n t - f i e l de q u a t i o n , e s p e c i a l l yu n d e rc o n d i t i o n sp r o m o t i n g t h e e n t r yo fC s+i n t ot h eK ( C a ) Lc h a n n e l( i . e .a tn e g a t i v e p o t e n t i a l sw h e nC+w a sp r e s e n ti n t h e e x t e r n a l s o l u t i o na n d a t t h ep o s i t i v ep o t e n t i a l sw h e nC s+w a sa p p l i e dt ot h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n e f a c e .[ C a2+ ] j = 1 0 0 P M .[ C a2± ] o = O . 0 l M .1 1 21 6i ( p A )1 2O u t w a r d- 8 0 - 6 0— 4 0— 2 / , , , , ,,VV4 06 08 0V ( m V )1 2I n w a r d1 61 1 3o fK C ac h a n n e l ( B e n h a me t a l . 1 9 8 6 ) . I n d i v i d u a lb l o c k i n g a n du n b i o c k i n ge v e n t ; w e r ea tl e a s t p a r t i a l l yr e s o l v e da ta 2 k H z b a n d w i d t h .T h i si n d i c a t e d t h a tt h e r a t ec o n s t a n t s f o r c h a n n e l b l o c ka n du n b l o c k w e r en o t v e r y f a s t ,s i n c e t h i sw o u l d r e s u l t i na s m o o t h e d ,t i m e - a v e r a g e dv a l u e o fc u r r e n tt h r o u g h t h ec h a n n e l( Y e l l e n 1 9 8 4a , b ) .T h e o c c u r r e n c e o fs i g n i f i c a n t n o i s ed u r i n g c u r r e n t f l o wi n t h ep r e s e n c e o fC s+m a d e i t d i f f i c u l tt o d e t e r m i n e a na p p r o p r i a t em e a nc h a n n e lc u r r e n t f o ru s ei nI - V p l o t s . F o rt h i s r e a s o n , t h e s ec u r r e n t sw e r es u b j e c t e dt of u r t h e rd i g i t a l f i l t e r i n gt or e d u c et h e i re f f e c t i v e b a n d w i d t ht o D C - 4 0 0 H z . A ss h o w n i n F i g .3 1 , t h i sp r o c e d u r e r e s u l t e d i nas m o o t h ,t i m e - a v e r a g e dc u r r e n t s u i t a b l ef o r t h ec o n s t r u c t i o no f I - V p l o t s ( B e n h a me t a ! . 1 9 8 6 ) .M e a nv a l u e so f s u c hc u r r e n t so b t a i n e df r o m5p a t c h st e s t e dw i t hc y t o p l a s m i c o r e x t e r n a ls u b s t i t u t i o n o f8 0m MK +b y C s+a r es h o w ni nF i g .3 0 .T h i s F i g u r e a l s o s h o w st h e r a n g e o fe x p e c t e d c u r r e n t st h r o u g h t h eK ( C a ) Lc h a n n e l ,u n d e r t h e a s s u m p t i o nt h a tC s+i sn o n - p e r m e a b l eb u t d o e sn o tb l o c k t h ep a s s a g eo fK +t h r o u g h t h e c h a n n e l . A sw a s t h ec a s ei n F i g .2 9 ,t h e s et h e o r e t i c a lc u r r e n t s w e r ec a l c u l a t e d f r o mt h ec o n s t a n t - f i e l dr e l a t i o n ,u s i n g t h ee x t r e m e v a l u e s o fP Kn o t e d i ns y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s .I tw a sn o t e d t h a t t h eo b s e r v e d c u r r e n t sw e r e s m a l l e rt h a np r e d i c t e db yc o n s t a n t - f i e l dt h e o r y ,e s p e c i a l l y u n d e rc o n d i t i o n sp r o m o t i n g t h ee n t r y o fC s+i n t o t h eK ( C a ) Lc h a n n e l ,t h a ti sa tn e g a t i v e m e m b r a n ep o t e n t i a l sw i t hC s+i nt h e e x t e r n a l s o l u t i o n ,a n da tp o s i t i v em e m b r a n e p o t e n t i a l sw i t hC s+a tt h ec y t o p l k s m i cm e m b r a n e f a c e ( F i g .3 0 ) . A s s u m i n gt h a t t h ef l i c k e r b l o c kb yC s+ i sn o ti n f l u e n c e db yo t h e r i o n s ,t h e n t h et i m e - a v e r a g e d c u r r e n tt h r o u g ht h e b l o c k e dc h a n n e li s g i v e na s :1 1 4F i g u r e 3 1 .S i n g l ec h a n n e lK ( C a ) Lc u r r e n tr e c o r d i n g sf r o ma ni n s i d e - o u t p a t c hb a t h e d i n1 4 0m MK ± s o l u t i o nw i t h1 0 01L M[ C a2+f t .T h ep a t c h e l e c t r o d ec o n t a i n e d6 0m M K+a n d8 0 m MC s+0 i n d i c a t e sc h a n n e lc l o s e da n d1i n d i c a t e sc h a n n e lo p e n .T h e s a m eg r o u p o f s i n g l ec h a n n e lc u r r e n t si s s e e na taf i l t e r b a n d w i d t ho fD C - 2 k H z ( u p p e rt r a c e ) ,a n d a taf i l t e rb a n d w i d t ho fD C4 0 0 H z( l o w e rt r a c e ) . M e m b r a n ep o t e n t i a l+ 6 0m V .1 1 59L1SWOS-0-I0—IiiIII. IIIiliiiIiIII!‘1’•iIr’ir•T1J.I[.1< i ( V ) > = i o ( V ) [ 1+ [ C s ]/K ( o ) e x p ( F Ô V/R T ) ] - 1( 4 )w h e r e i o ( V ) i s t h e c u r r e n t t h r o u g h t h e u n b l o c k e d c h a n n e l ,Vi sp o t e n t i a l , K ( o ) i st h e z e r o v o l t a g ee q u i l i b r i u m c o n s t a n ta n d . 3 i s t h e f r a c t i o n o f t h e m e m b r a n ef i e l df e l tb y C s+a ti t s b l o c k i n g s i t e , s o m e t i m e s r e f e r r e dt o a st h e“ e f f e c t i v e v a l e n c e ”( W o o d h u l l 1 9 7 3 ; Y e l l e n 1 9 8 4 a ) . P l o t s o fl n ( i o/i - 1 ) v e r s u sVs h o u l dt h e r e f o r ey i e l das t r a i g h t l i n e o fs l o p eF . 3 / R T . T h e v a l u e o f. 3p r o v i d e sa m e a s u r e o f t h es t e e p n e s s o f v o l t a g e d e p e n d e n t b l o c k i n g . V a l u e s o f i0 w e r eo b t a i n e d f r o m t h e5p a t c h e s i n w h i c hN a +r e p l a c e dK + ,s i n c e n o e v i d e n c e f o rN a +b l o c k o ft h eK ( C a ) Lc h a n n e l w a s s e e n . U s i n g t h ed a t as h o w n i n F i g . 2 9 a n d F i g .3 0 ,p l o t s o ft h i st y p ew e r e f o u n t ’ t ob ea p p r o x i m a t e l y l i n e a r o v e r t h e v o l t a g e r a n g e- 7 0 m Vt o+7 0 m y . W h e n C s+w a sp r e s e n ta t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e ,av a l u e o f. 3 = 0 . 0 7w a s o b t a i n e d , i n d i c a t i n g t h a t t h e c a t i o nd e t e c t sv e r y l i t t l e o ft h em e m b r a n e f i e l da tt h i s s i t e . I n c o n t r a s t , e x t e r n a l l y a p p l i e dC s+y i e l d e dav a l u eo f6 = - 0 . 6 6 ,s u g g e s t i n g t h a t t h e i o n m u s t t r a n s v e r s e a n a p p r e c i a b l e f r a c t i o n o ft h e m e m b r a n e t or e a c h i t s b i n d i n g s i t e , i f a p p l i e d e x t e r n a l l y .3 . 4 . 3 .E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] io n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l sT o d e t e r m i n et h e e f f e c t o f[ C a2+ J io n t h e p r o b a b i l i t y o ft h e s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l sb e i n g i n t h e o p e ns t a t e ,r e c o r d i n g s w e r em a d e f r o m i s o l a t e di n s i d e - o u t p a t c h e se x p o s e dt os y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s .[ C a2+I iw a sv a r i e d w h i l e t h em e m b r a n e p o t e n t i a l o f t h e p a t c hw a s v o l t a g e - c l a m p e dt o+ 4 0m V .F i g . 3 2 s h o w s s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t s o b t a i n e d f r o map a t c hc o n t a i n i n gas i n g l e a c t i v eK ( C a ) Lc h a n n e l .W h e n [ C a2+ ] iw a s 0 . 5 , L M , f e w c h a n n e l o p e n i n g s1 1 7F i g u r e 3 2 .E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+f to n t h e o p e n i n g o fK ( C a ) Lc h a n n e l s .S i n g l ec h a n n e l c u r r e n tr e c o r d i n g s w e r e o b t a i n e d f r o m a n i s o l a t e d i n s i d e - o u tp a t c hc o n t a i n i n go n e a c t i v e c h a n n e la n d b a t h e d i n s y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s .T h e r e c o r d i n gp i p e t t e c o n t a i n e d 0 . 0 1 MC a2+ .M e m b r a n e p o t e n t i a lw a s+ 4 0m V .0i n d i c a t e s c h a n n e l c h i s e da n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n .B a n d w i d t h D C2 0 0 H z .1 1 8ydSiS61!rl$.I001‘I”3IPS00—---I——0—0--—-rimrannrm1,rr1rnrw01‘njifI———w e r e s e e n ( P o= 0 . 0 0 4 5 )a n d t h em e a n c h a n n e l o p e n t i m ew a s c l e a r l y v e r yb r i e f .O n i n c r e a s i n g[ C a2+ ] it o 1 , 1 0 a n d 1 0 0 M , P oi n c r e a s e d m a r k e d l y( P o= 0 . 6 0a t1 0 0 M M[ C a2+ ] i ) .T h e m e a ns h u t t i m e o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lw a s g r e a t l yr e d u c e da t [ C a2+] j= 1 0 0 M , w h i l e t h e m e a no p e n t i m e a p p e a r e dg r e a t e r t h a nt h a t s e e na tl o wc y t o p l a s m i c c a l c i u m .T h e e f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+ ] if r o m0 . 0 1 Mt o1 m Mo n P o v a l u e sm e a s u r e di n5p a t c h e sa tV = + 4 0 m V i ss h o w n i n F i g . 3 3 A .T h e t h r e s h o l d l e v e lo f[ C a2+ ] ia tw h i c hc h a n n e l o p e n i n g s w e r ej u s t d e t e c t a b l ew a s a b o u t 0 . 0 1 M .T h e m e a n v a l u e o f[ C a2+] ia tw h i c h s i n g l eK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r eo p e n h a l f o ft h e t i m e ,P o ( 0 . 5 )w a s 2 3 J L M .F i g . 3 3 B s h o w s t h e s ed a t ap r e s e n t e da s aH i l lp l o t , i . e . l o g P o / ( 1 - P o )v e r s u s l o g[ C a2+] j .A l i n e a r r e g r e s s i o n l i n e h a s b e e nf i t t e dt ot h ed a t ap o i n t so b t a i n e d f o r [ C a2+ ] jv a l u e s b e t w e e n0 . 0 5 LM a n d 1j LM , t h ep r o b a b l ep h y s i o l o g i c a lr a n g eo f t h i s p a r a m e t e r i n s m o o t h m u s c l e c e l l s( K i o c k n e re ta l .1 9 8 9 ) . O v e r t h i s r a n g e , t h i s l i n e h a dam e a n s l o p eo f 2 . 0 0 T h i s r e s u l t s h o w st h a t2 c a l c i u m i o n s m u s t b i n dt of u l l y s t a b i l i z e e a c hK ( C a ) Lc h a n n e l i n t h eo p e n s t a t e( B a r r e t te ta l . 1 9 8 2 ) . A t v e r y l o w a n d v e r y h i g h[ C a2+ J i ,t h es l o p e f a c t o rw a sg r e a t l y r e d u c e d , a s h a sp r e v i o u s l yb e e n n o t e d i nK C ac h a n n e l ss t u d i e d i n r a ts k e l e t a lm u s c l e f i b r e s ( B a r r e t te ta l . 1 9 8 2 ) .3 . 4 . 4 . T h e e f f e c t o f v a r y i n g [ C a2+ ] i o n t h e o p e n t i m e o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l .O v e r t h e r a n g e o f m e m b r a n e p o t e n t i a l s( - 8 0 t o+ 8 0m V ) a n d[ C a2+l e v e l s ( 0 . 0 1 M t o 1m M )u s e d i n t h i ss t u d y ,o p e n t i m ed i s t r i b u t i o n s f o rK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r e w e l l d e s c r i b e db yt h e s u m o ft w oe x p o n e n t i a lt e r m s , i n d i c a t i n g t h e1 2 0F i g u r e3 3 .E f f e c to f [Ca2+ Ii o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h e K(Ca)L c h a n n e l .( A ) Mean open p r o b a b i l i t y P o i s plotted a s a f u n c t i o n o f [Ca2+]i o ns e m i l o g a r i t b m i cc o - o r d i n a t e s .T h e s m o o t hc u r v ew a sf i t t e d t o data p o i n t su s i n gp o l y n o m i a lr e g r e s s i o n . ( B )H i l lp l o t o ft h e s ed a t a ,i . e . l o g Po/(1-Po)a g a i n s tl o g[Ca2+ Ii. O v e r r a n g e o f [Ca2+ Ji f r o m 0 . 0 51M t o 1 j I M , data w e r e w e l l f i t t e d b yl i n e a rr e g r e s s i o nl i n e ( s o l i dl i n e )o fs l o p en2 . 0 0 . Data w e r eo b t a i n e d f r o mf i v ep a t c h e s .M e m b r a n e potential w a s + 4 0 m V d u r i n gt h e s er e c o r d i n g s .[Ca2+]o = 0 . 0 11 2 1AP00 . 30 . 6 -0 . 4I0 . 2100 . 0 0 10 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 01 0 0 0[ C a2J1( j j 4 )P ( 1 - P0)1 0// /0 . 0 10 . 0 0 10 . 0 0 0 10 . 0 0 10 . 0 10 . 111 01 0 01 0 0 0[ C a2J1( J . L M )1 2 2• qp r e s e n c e o fa t l e a s t t w o k i n e t i c a l l y d i s t i n g u i s h a b l e o p e ns t a t e s f o r t h i s c h a n n e l( F i g . 3 4 ) . T h e s e d i s t r i b u t i o n sw e r e t h e r e f o r e w e l l f i tb y a n e q u a t i o n o f t h ef o r my= N f . e - t / r f+ N s . e t / r s( 5 )H e r e N f a n d N s a r e t h e z e r ot i m e a m p l i t u d e s o ft w o e x p o n e n t i a l f u n c t i o n sg o v e r n e d ,r e s p e c t i v e l y , b y a f a s t t i m e c o n s t a n tr fa n das l o wt i m ec o n s t a n tr s .F r o m t h e s ep a r a m e t e r s , t h e t o t a l n u m b e r o f o p e n i n g sr e p r e s e n t e db ye i t h e rc o m p o n e n t w a s c a l c u l a t e d u s i n gt h e r e l a t i o n sA f = N f . r f / B i n w i d t h( 6 )a n dA s= N s . r s / B i nw i d t h( 7 )H e r e ,A fa n dAa r e t h e n u m b e r s o f o p e n i n g si n t h e e x p o n e n t i a l t e r m s g o v e r n e db yt h e f a s tt i m e c o n s t a n t ,r fa n d t h e s l o wt i m e c o n s t a n t ,T Sr e s p e c t i v e l y .T h ev a l u e o f t h e b i n w i d t h p a r a m e t e r w a s o b t a i n e d d i r e c t l y f r o m t h eo p e n t i m eh i s t o g r a m s . T h e e f f e c t o f c h a n g i n g[ C a2+] io n t h e o p e n t i m ed i s t r i b u t i o n s o fK ( C a ) Lc h a n n e l s w a s i n v e s t i g a t e d i n5p a t c h e sv o l t a g e - c l a m p e da t am e m b r a n ep o t e n t i a l o f+ 4 0m V( F i g .3 5 ) .I t w a sf o u n d t h a ti n c r e a s i n g[ C a2+ I ih a d n os i g n i f i c a n t e f f e c to n t h e m e a nv a l u e o f t h ef a s t t i m ec o n s t a n tr fi n t h e s e p a t c h e s( F i g . 3 5 A ) . A t [ C a2+ ] i = O . O 1 M ,am e a nv a l u e o fr f= 0 . 5 8 ±0 . 0 8m sw a so b t a i n e dw h i l ea t [ C a2+ I i= 1 0 M ,T f= 0 . 5 20 . 1 5m sw a s s e e n ( P >0 . 0 5 ,A N O V A ) . I n c o n t r a s t ,r sw a s f o u n dt oi n c r e a s e o n e l e v a t i n g[ C a2+ ] i( F i g . 3 5 B ) .A t[ C a2± ] i= 0 . 0 1 M M ,am e a n v a l u e o fr s= 5 . 9 ±0 . 8 5m sw a s o b t a i n e d , w h i l ea t [ C a2+ ] j= 1 0 A M ,s=1 4 . 6 ±2 . 2 4 m s w a s o b s e r v e d ( P< 0 . 0 5 , A N O V A ) .1 2 3F i g u r e 3 4 .D i s t r i b u t i o n o fo p e n t i m e s f o rt h eK ( C a ) Lc h a n n e ls t u d i e di n o n ei s o l a t e d p a t c h c o n t a i n i n gas i n g l ea c t i v ec h a n n e l .[Ca2+]i=1 J . L M i nAa n d1m M i n B .B o t hd i s t r i b u t i o n sw e r e plotted o nal o g a r i t h m i ct i m ea x i sa n d f i t t e db yt h es u mo ft w o e x p o n e n t i a lt e r m s( s m o o t hc u r v e s )u s i n gt h e S i m p l e xa l g o r i t h m . In A , t h ef a s tf i tc o m p o n e n th a dat i m ec o n s t a n t rf = 0 . 4 1 m s , t h i sc o m p o n e n t m a d eu p2 9 %o f t h e t o t a lo p e n i n g s .T h es l o w f i tc o m p o n e n tw a sg o v e r n e db yat i m ec o n s t a n t rs = 1 1 . 4 m s , a n d m a d e u p t h e r e m a i n i n g7 1 %o fo p e n i n g s .C o r r e s p o n d i n gv a l u e sf o rt h ed i s t r i b u t i o ns h o w ni n Bw e r e rf = 0 . 3 8m s( 1 9 % o fo p e n i n g s )a n d7 s=1 4 . 3m s( 8 1 %o fo p e n i n g s ) .M e m b r a n epotential w a s + 4 0 m V i n b o t h Aa n dB . [Ca2+]o = 0 . 0 1 cM.1 2 4AU )1 0 00c t i>L8 0a )C ’ )Do. 6 00U )D4 0Ez2 00- 5- 4 - 3- 2- 1 0123L o go p e nt i m e( s )B6 0( I )C0• : ;5 0>( 1 )4 0( I )- o03 002 0Sz1 00- 5- 4- 3- 2 - 1 01 23L o go p e nt i m e( s )1 2 5F i g u r e3 5 .E f f e c t o f v a r y i n g[ C a2+] jo n t h et i m e c o n s t a n t s g o v e r n i n go p e n t i m ed i s t r i b u t i o n o fK ( C a ) Lc h a n n e l s s t u d i e di n S i n s i d e - o u t p a t c h e sv o l t a g e - c l a m p e da t+4 0 m V . A , T h e f a s t t i m e c o n s t a n t( i - f )v e r s u s[ C a2+I i .B , T h es l o w t i m ec o n s t a n t( r s )v e r s u s[ C a2+i i .[ C a2+] o= 0 . 0 1 1A M .1 2 6A0 . 0 0 I0 . 0 10 . 11 1 01 0 0 1 0 0 0I C a 2 + I i( t M )2 0rB0 0 0 10 . 0 10 . 1I1 01 0 01 0 0 0i C a 2 + I i( J . L M )1 2 7T h u s , i n c r e a s i n g[ C a2+] ji n c r e a s e d t h e t i m ec o n s t a n t o f t h e s l o we x p o n e n t i a lc o m p o n e n t , w h i l e h a v i n g n oe f f e c t o n t h a t o f t h e f a s te x p o n e n t i a lc o m p o n e n t .C h a n g i n g[ C a2+J ia l s oh a d a n e f f e c t o n t h e r e l a t i v en u m b e r s o fo p e n i n g sg o v e r n e db yt h e t i m e c o n s t a n t si - f a n di - s .A s s h o w n i n F i g .3 6 ,i n c r e a s i n g[ C a2+ ] jf r o m 0 . 0 1 Mt o 1 m M l e a dt o am o n o t o n i ci n c r e a s e i n t h ev a l u e o f t h er a t i o A5/ ( A f +A s )( F i g . 3 6 B ) , w i t hac o r r e s p o n d i n gd e c r e a s e i n t h e r a t i oA f / ( A f +A s )( F i g . 3 6 A ) .T h e s e o b s e r v a t i o n s s h o w t h a ti n c r e a s i n g[ C a2+p r e f e r e n t i a l l y s t a b i l i z e d o p e n i n g s o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l g o v e r n e db y t h e s l o wt i m e c o n s t a n ti - s .T h e m e a n o p e n t i m e ,r m e a no f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lw a s c a l c u l a t e d f r o mt h e a b o v e d a t a u s i n g t h e r e l a t i o nr m e a n= A f / ( A f + A s ) . r f + A5/ ( A f+A s ) . r s( 8 )A tam e m b r a n e p o t e n t i a l o f+4 0 m V ,i - m e a ni n c r e a s e df r o m 2 . 7 0 . 2 3 m s( n = 5 )a t0 . 0 1 M M[ C a2+ ] it o1 3 . 5 ±0 . 3 5m sa t1 0 A M[ C a2+ ] j ( P< 0 . 0 5 ,S t u d e n t s ’ t - t e s t ) .T h i s5f o l d r i s e i ni - m e a nw a s m u c ht o os m a l lt of u l l ya c c o u n tf o r t h e 4 2 5 f o l d i n c r e a s e s e e n i n o p e n p r o b a b i l i t y o n e l e v a t i n g[ C a2+ ] if r o m0 . 0 1M t o1 0 P M( s e eF i g .3 3 ) .I tw a st h e r e f o r e c o n c l u d e d t h a tt h e m a j o r e f f e c t o fi n c r e a s i n g i n t e r n a l f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n w a st od e c r e a s e t h e m e a ns h u tt i m e o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l .3 . 4 . 5 . E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n p r o b a b i l i t yo f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l1 2 8F i g u r e 3 6 . E f f e c to f v a r y i n g [ C a2+ ] jo n t h e r e l a t i v en u m b e ro fo p e n i n g so fK ( C a ) Lc h a n n e l sg o v e r n e d b yt h e t i m e c o n s t a n t si - fa n di - s .D a t a a r em e a n ±S E M f r o m3 - 5i n s i d e - o u t p a t c h e sv o l t a g e - c l a m p e da t+4 0 m V . I n A , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e r a t i o A f / ( A f+ A s )a n d[ C a2+ ] ii s i l l u s t r a t e d . I nB ,t h e e f f e c t o f [ C a2+ ] jo n t h e r a t i oA5/ ( A f+A s ) i s s h o w n .[ C a2+ ] oO . 0 1 M .1 2 9AF‘ H s . . H0 . 0 0 10 . 0 10 . 1 I1 0 1 0 01 0 0 0l C a 2 + I i ( M )BU iO . 60 . 0 0 I 0 . 0 10 . 1 11 01 0 01 0 0 0l C a 2 + I i( j i M )1 3 0T h e p r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l sb e i n g i n t h e o p e ns t a t e w a s a l s oaf u n c t i o n o f t h e p o t e n t i a l a p p l i e da c r o s s t h e m e m b r a n e p a t c ha s s h o w n i n F i g .3 7 .W h e n[ C a2+] iw a sl e s s t h a n5 0 M , t h e d e p e n d e n c e o f P oo n m e m b r a n ep o t e n t i a l w a s w e l l d e s c r i b e db yt h e B o l t z m a n nr e l a t i o n ( K o i b1 9 9 0 )P o = [ 1 +e x p ( - K ( V - V o ) ) ] - l( 9 )w h e r e V o i s t h e p o t e n t i a l a tw h i c hP o= 0 . 5( F i g .3 7 ) .I n5p a t c h e s e x p o s e dt o [ C a2+] i< 5 0 . M , t h e m e a n v a l u e o f t h ec o n s t a n tK w a s0 . 0 4 5+ 0 . 0 0 6m V - i .A t[ C a2+ J jl e v e l s b e t w e e n 0 . 0 1 M a n d5 0M , t h ep r i n c i p a l e f f e c t o f i n c r e a s i n g i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u mw a s t o s h i f t t h eB o l t z m a n n r e l a t i o n t o t h e l e f t o n t h e v o l t a g e a x i s . I n 4 p a t c h e s s t u d i e di n t h i sr a n g e o f[ C a2+J i ,t h e m e a n s h i f t o f t h eV o w a s4 5 m Vp e r d e c a d e c h a n g e i ni n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m .A t [ C a2+ I i> 5 0j I M , P o a p p r o a c h e d u n i t y a n d s h o w e dl i t t l e f u r t h e ri n c r e a s eo n m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n ( F i g .3 7 ) .I n d e e dat e n d e n c yw a sn o t e dt o w a r d r e d u c e d P oa tm e m b r a n e p o t e n t i a l s m o r e p o s i t i v e t h a n+4 0 m V( F i g .3 7 ) .R e d u c e dP oa tp o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s h a s p r e v i o u s l yb e e n n o t e d i nK C ac h a n n e l s s t u d i e d i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e g u i n e a - p i g( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) a n d i nK C ac h a n n e l s i n c o r p o r a t e d i n t o l i p i d b i l a y e r s( V e r g a r aa n d L a t o r r e 1 9 8 3 ) .3 . 4 . 6 .E f f e c t o f m e m b r a n e p o t e n t i a l o n t h e o p e n t i m e o fK C ac h a n n e l s .1 3 1F i g u r e3 7 .D ç p e n d e n c e o f t h e o p e np r o b a b i l i t y , P0 o fK ( C a ) Lc h a n n e l s o nm e m b r a n ep o t e n t i a l ( V ) a n d [ C a2+I im e a s u r e d i n 4 i n s i d e - o u t p a t c h e s . W h e n[ C a2+ J jw a s1 m M ( c i r c l e s ) a n d1 0 0J LM ( d i a m o n d s ) , f i t t i n g l i n e s w e r e d r a w nb yt h ep o l y n o m i a l r e g r e s s i o n .W h e n[ C a2+ J iw a s 5 0M( s q u a r e s )a n d0 . 5 M( t r i a n g l e s ) ,t h e f i t t i n g c u r v e sw e r e d r a w nt ot h e B o l t z m a n n e q u a t i o n P0 =[ 1 + e x p ( - K (V - V0) ) ] - 1w h e r e V oi s t h e p o t e n t i a la tw h i c h P o = 0 . 5 . A t b o t h5 0M a n d 0 . 5 J LM f r e ei n t r a c e l l u l a r c a l c i u m ,t h e c o n s t a n t K h a d t h e v a l u e 0 . 0 4 5m V - i .A t5 0J L M f r e ec a l c i u m , V o= - 5m V .a t0 . 5 j M c a l c i u m ,V o = + 8 8m V .1 3 2(Aw)A0809OtOt08 00ZV090t°dThe effect of varying membrane potential on the distribution of opentimes for K(Ca)L channels was studied inS patches exposed to [Ca2+]j = 10,iM. These distributions were well described by the sum of two exponentialterms, as noted previously. It was found that changes in membrane potential didnot significantly alter the value of the fast time constant, Tf in these patches (Fig.38A). The mean value of if at V = -60 mV was 0.45± 0.06 ms, not significantlydifferent from the value obtained at V = +60 mV (if = 0.38± 0.04 ms, P>0.05, ANOVA). In contrast, the slow time constant, iS describing open timedistributions was significantly altered by membrane potential in these patches(Fig. 38B). r8 was weakly voltage-dependent, increasing from 8.4 ± 0.55 ms atV = -60 mV to 16.6 ± 1.64 ms at V = +60 mV (P <0.05, ANOVA). It shouldhowever be noted that these value ofrf are close to the deadtime of therecording system. Small changes in if could therefore have gone undetected.3.4.7. The effect of TEA applied to the cytoplasmic membrane face on currentflow in the K(Ca)L channel.The effect of TEA on the K(Ca)L channel was studied in 6 inside-outmembrane patches voltage-clamped at +40 mV with [Ca2+]i = 100PM. Fig. 39shows single channel currents recording during an experiment of this kind inwhich TEA was applied by bath perfusion to the cytoplasmic membrane face.Under these conditions, TEA caused a dose-dependent, reversible reduction inthe amplitude of current in the K(Ca)L channel. It was noted that the blockingaction of TEA was not accompanied by a large increase in the variance ofcurrent noise in the open channel as observed at a bandwidth of DC-2-kHz (Fig.39). TEA did not alter the reversal potential of the current through K(Ca)Lchannels, which was 0 mV in these experiments.134Figure 38. Effect of membrane potential on the time constants governing theopen time distribution of K(Ca)L channels. A. Fast time constant (i-f) versusmembrane potential. B. Slow time constant (rs) versus membrane potential.Data points are mean ±SEM from three to five patches. [Ca2+ Ji = 10 p. M and[Ca2±lo = 001p.MinbothAandB.135A‘ t f ( m s )I II III I— 8 0— 6 0 — 4 0 — 2 00 2 04 0 6 08 0V( m V )B( m s )f - - - - -15III I I— 8 0— 6 0— 4 0— 2 00 2 0 4 06 08 0V( m y ) .1 3 6F i g u r e3 9 .B l o c k i n g e f f e c t o f i n t e r n a l T E A o n t h eK ( C a ) Lc h a n n e l . S i n g l ec h a n n e l c u r r e n t sw e r e r e c o r d e d f r o m a n i n s i d e - o u t m e m b r a n e p a t c hb a t h e d i ns y m m e t r i c a l1 4 0 m M p o t a s s i u ms o l u t i o n s .T E A w a sa p p l i e dt o t h e c y t o p l a s m i cf a c e o ft h e m e m b r a n ea tt h ec o n c e n t r a t i o n si n d i c a t e d . 0 i n d i c a t e s c h a n n e lc l o s e d a n d 1 i n d i c a t e s c h a n n e l o p e n .B a n d w i d t h D C - 2 k H z ,m e m b r a n e p o t e n t i a l+ 4 0 m V . [ C a2+ ] o= O . 0 1 $ M .1 3 7N OT E A1 - - - -‘ r l i 9L d0 . 5 m MT E A1 - - - -1 m MT E A: : : :2p A5 0m s1 3 8T h ep e r c e n t a g er e d u c t i o n ,R ii n s i n g l e c h a n n e lc u r r e n tc a u s e d b y v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o f T E A a p p l i e dt o t h ec y t o p l a s n i i cm e m b r a n ef a c ei s s h o w n i nF i g . 4 0 . I tw a sf o u n d t h a tt h e v a l u eo f R jw a s w e l l d e s c r i b e db y t h e r e l a t i o nR j= 1 0 0 %/( 1+ K d/[ T E A ] )( 1 0 )w h e r eK d0 . 8 3±0 . 0 9m M ( n= 5p a t c h e s )a tam e m b r a n ep o t e n t i a lo f+4 0m V a n d [ C a2+]j = 100A M .T h ep r e s e n td a t ao n T E Ab l o c k w e r et r a n s f o r m e d i n t oaH i l l p l o tb yr e p l o t t i n g a sl o g( R i / i - R i )v e r s u sl o g[ T E A ] , w h e r eR i st h er e d u c t i o ni ns i n g l ec h a n n e l c u r r e n t ss e e n i nt h e p r e s e n c eo ft h ed r u g . T h i s p l o ty i e l d e das l o p eo f0 . 8 2 , s u g g e s t i n gt h a t T E Ai n t e r a c t sw i t h t h ec h a n n e l i nao n e - t o - o n ef a s h i o n ,p r e s u m a b l y b yt r a n s i e n t l ye n t e r i n g t h ec h a n n e la n d b l o c k i n g m o v e m e n to fK + .I n t h e s ee x p e r i m e n t s ,T E A h a d n os i g n i f i c a n te f f e c t o nt h ep r o b a b i l i t yo fK ( C a ) Lc h a n n e l sa d o p t i n gt h e o p e n s t a t e( F i g . 4 1 ) .T h u s P o= 0 . 5 5 ±0 . 1 5( n =3 )i n t h ea b s e n c eo f T E A ,a n d P0= 0 . 5 3±0 . 1 7( n= 3 )i nt h e p r e s e n c eo f 1 0 m MT E Aa tt h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n ef a c e( P >0 . 0 5 , A N O V A ) .3 . 5 .K ( C a ) Ic h a n n e l si n i n s i d e - o u tm e m b r a n ep a t c h e se x c i s e d f r o mi s o l a t e dC V S M C s .1 3 9F i g u r e 4 0 .D o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e b l o c k o f c u r r e n t f l o w i n t h eK ( C a ) Lc h a n n e lb yi n t e r n a l T E A . T h e p e r c e n t a g e r e d u c t i o n i n s i n g l e c h a n n e lc u r r e n t i sp l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o fT E Aa t t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e .T h es o l i d l i n e p l o t s t h e r e l a t i o n R i = 1 0 0 % / ( 1+ K d/[ T E A ] ) w h e r et h ea p p a r e n td i s s o c i a t i o n c o n s t a n tK dw a s 0 . 8 3m M a n d [ T E A ]w a st h ec o n c e n t r a t i o no f T E A . D a t a p o i n t s a r e m e a n±S E M f r o m3 - 5 p a t c h e s . T h ec a l c u l a t e d c u r v e w a sf i t t e dt ot h ed a t ap o i n t sb yn o n - l i n e a rr e g r e s s i o n .V= +4 0m V ,[ C a2+ ] j= 1 O 0 M .[ C a2± ] o= 0 . 0 1 , L M .1 4 0H ruPercentagereductionofsinglechannelcurrent— CH-iF i g u r e4 1 . E f f e c t o f T E A o n t h e o p e n p r o b a b i l i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l .T h eo p e np r o b a b i l i t y o f t h e c h a n n e l i s p l o t t e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o no f i n t e r n a lT E A . D a t a p o i n t sa r em e a n ±S E M f r o m3 - 5p a t c h e s .N o s i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e m e a nv a l u e so fP0c a l c u l a t e d a te a c hT E A c o n c e n t r a t i o n ( P>0 . 0 5A N O V A ) . M e m b r a n e p o t e n t i a l + 4 0 m V ,[ C a2+ ] j= 1 0 O M .[ C a2+ ] j= 0 . 0 1jM .1 4 21 . 0 -P00 . 8 -0 . 6 -0 . 4 -0 . 2 -0C o n t r o l0 . 11 1 01 0 0T E A( m M )1 4 3K ( C a ) Ic h a n n e l s w e r ed e t e c t e d i n a b o u t2 5 %o f t h ei n s i d e - o u t p a t c h e se x a m i n e d i n t h i ss t u d y .W h e n m e a s u r e d i ns y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s ,c u r r e n t s i nK ( C a ) Lc h a n n e l ss h o w e dar e v e r s a l p o t e n t i a l o f0 m V ( F i g . 4 2 ) .U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h ec u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n o f t h i sc h a n n e l w a s l i n e a rw i t ham e a n s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e o f9 2±2 . 6p S( n = 1 0p a t c h e s ) .A m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s o fc u r r e n t s f l o w i n g i nK ( C a ) Ic h a n n e l s w e r e w e l ld e s c r i b e db ys i n g l e G a u s s i a n t e r m s , i n d i c a t i n gt h a t t h i s c h a n n e l d i dn o t d i s p l a yas i g n i f i c a n ts u b s t a t eo r s u p e r s t a t e c o n d u c t a n c e ( F i g . 4 3 ) .F r o m t h e s ed a t a ,t h ep o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y o f t h e o p e n c h a n n e lw a s c a l c u l a t e du s i n gt h ec o n s t a n t -f i e l d r e l a t i o n( E q u a t i o n2 ) . A m e a n v a l u e o fP K= 1 . 7 5±0 . 1 2 x1 0 - 1 3c m / sw a so b t a i n e df r o m1 0p a t c h e s .T h e i n f r e q u e n t o c c u r r e n c e o fK ( C a ) Ic h a n n e l si n t h e s e p a t c h e s p r e c l u d e dad e t a i l e dq u a n t i t a t i v e e x a m i n a t i o no f t h e i o n i c s e l e c t i v i t y o f t h i s c h a n n e lo r i t ss e n s i t i v i t yt oc h a n g e s i n[ C a2+] ja n d m e m b r a n ep o t e n t i a l . H o w e v e r , i tw a sp o s s i b l e t od e m o n s t r a t e q u a l i t a t i v e l y t h a tK ( C a ) Ic h a n n e l s a r e i n d e e d s e l e c t i v ef o r p o t a s s i u m i o n s , a n d a r e m o d u l a t e db yb o t h m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d[ C a 2 h ] j .W h e n8 0m M K C 1 w a s r e p l a c e db ya n e q u i m o l a ra m o u n t o f N a C 1 ,c u r r e n t s t h r o u g h s i n g l eK ( C a ) Ic h a n n e l s r e v e r s e da t+2 1 . 1 m V ( c y t o p l a s m i cf a c eK C 1 r e p l a c e m e n t ) a n d - 2 1 . 1 m V ( e x t e r n a l f a c e K C 1 r e p l a c e m e n t , F i g . 4 4 ) . T h er a t i oP N a / P Kw a s c a l c u l a t e d f r o m t h e s e d a t a u s i n g E q u a t i o n3 .A v a l u e o fP N a / P K< 0 . 0 5 w a so b t a i n e d , i n d i c a t i n g t h a tK ( C a ) Jc h a n n e l s a r e h i g h l ys e l e c t i v ef o r p o t a s s i u m o v e r s o d i u m i o n s . I n s i m i l a re x p e r i m e n t s w h e r eC s+r e p l a c e dK + ,t h e r a t i oP C s / P Kw a s a l s o f o u n dt o b el e s st h a n0 . 0 5 .I n t h ep r e s e n c e o fC s+ ,c u r r e n t f l o w i n t h eK ( C a ) Ic h a n n e lw a s l e s s t h a n p r e d i c t e d1 4 4F i g u r e 4 2 . S i n g l e - c h a n n e lc u r r e n t r e c o r d i n g s o f t h ea c t i v i t y o fK ( C a ) Ic h a n n e l sa tv a r i o u s m e m b r a n ep o t e n t i a l s ( m V ) . A l l t r a c e s w e r e r e c o r d e df r o mas i n g l ei n s i d e - o u tp a t c h c o n t a i n i n gf o u r a c t i v e c h a n n e l s . T h i sp a t c hw a s b a t h e d i ns y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s .0i n d i c a t e sa l lc h a n n e l s w e r e c l o s e d ,w h i l et h e n u m b e r s1 ,2 ,3 a n d4i n d i c a t e c u r r e n tl e v e l s a s s o c i a t e d w i t h1 ,2 ,3a n d 4c h a n n e l so p e n ,r e s p e c t i v e l y .B a n d w i d t h D C - 2 0 0H z . C a l i b r a t i o nb a r s a p p l yt oa l l t r a c e s . T h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n ef a c e w a s e x p o s e dt o [ C a2+I i= 1 L M .T h ep i p e t t e c o n t a i n e d[ C a2+ ] o = 0 . 0 1 r i M .1 4 509IScVdOZkAlLfb4LL,4L.LL.zt--1r Ij11•11I’IIIITII’0-OLr4iL4MJw0(Aw)Figure 43. Amplitude distributions obtained for K(Ca)I channel currentsrecorded from a single inside-out patch voltage-clamped at a membranepotential of + 30 mV in A and -30 mV in B. Both distributions were well fittedby single Gaussian terms (smooth curves) with modal values of 2.44 pA in A and-2.43 pA in B. The patch was bathed in symmetrical 140 mM K+ solutions.[Ca2+ ]j = 10 M, [Ca2+ ]o = 0.01 M.147A1 2 0 -C ’ ,C1 0 o( ‘ I>0 )C , ,I :Z2 061 2 1 ‘ 6 2 ’ OA m p l i t u d e( p A )B7 0( I )C6 0c c l>5 0C I )- Do4 000 )61 ’ 21 ’ 6A m p l i t u d e( p A )1 4 8F i g u r e 4 4 .C o n d u c t a n c ea n d i o n i cs e l e c t i v i t yo f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l .C u r r e n t -v o l t a g ep l o t s o f s i n g l e - c h a n n e lc u r r e n t sr e c o r d e df r o m f i v e i n s i d e - o u tp a t c h e si nf i v e d i f f e r e n t i o n i c g r a d i e n t s :( f i l l e dc i r c l e s ) s y m m e t r i c a l1 4 0 m M K+ s o l u t i o n s ;( o p e ns q u a r e s )8 0m Minternal K +r e p l a c e db ya ne q u i m o l a ra m o u n to fNa+;( f i l l e d d i a m o n d s )8 0m Me x t e r n a lK +r e p l a c e db ya ne q u i m o l a r a m o u n to fNa+;( f i l l e dt r i a n g l e s )8 0 m M i n t e r n a lK +r e p l a c e db ya n e q u i m o l a ra m o u n to fCs+;( o p e nt r i a n g l e s )8 0m Me x t e r n a lK +r e p l a c e db ya n e q u i m o l a ra m o u n to fCs+. [Ca2+]o a n d [Ca2+]i w e r e O.01M a n d 1 0 0 P Mr e s p e c t i v e l y .C o n t i n u o u s l i n e sa r et h e o r e t i c a l c u r v e sf i tb yl i n e a rr e g r e s s i o n (data o b t a i n e d i ns y m m e t r i c a l p o t a s s i u ms o l u t i o n s ) o r n o n - l i n e a rr e g r e s s i o nt ot h e GoldmanH o d g k i n - K a t zc o n s t a n t - f i e l de q u a t i o n ,u s i n gt h e d a t ap o i n t so b t a i n e dd u r i n greplacement o f K+ b y Na+.1 4 9• 1 0i ( p A )8v.O u t w a r d7.AAA— 8 0— 6 0— 4 0— 2III7 - ? o4 06 08 0V ( m V ). 4A•ADAI n w a r d- 1 01 5 0from the constant-field relation. This effect was especially marked underconditions tending to drive Cs + into the open channel, i.e. at negativemembrane potentials with Cs + present in the external solution, and at positivemembrane potentials when Cs + was present at the cytoplasmic membrane face(Fig. 44).The open probability of K(Ca)I channels increased as [Ca2±]i waselevated over the coicentration range 0.1 M to 100MM (Fig. 45). Fig. 46Ashowsthe dependence of P0 on [Ca2+ ]i for one membrane patch voltage-clamped at V = + 4OmV. These data were replotted as a Hill plot, i.e. as logPo/(1-Po) against log [Ca2+Ji (Fig. 46B). It is evident that P0 was steeplydependent on [Ca2+Ji over the probable physiological range of this parameter(0.05-1 PM). In this range, the slope of the Hill plot was 2.17, suggesting thatmore than one calcium ion must bind to fully activate each K(Ca)I channel.The open probability of K(Ca)I channels also increased on depolarizationof the membrane patch (Fig. 47). The dependance of Po on membrane potentialwas well described by the Boltzmann relation (Equation 9). The effect ofincreasing [Ca2+ ]i was to shift the Boltzmann relation to the left on the voltageaxis, by about 40 mV per decade increase in free intracellular calcium (Fig. 47).The effect of TEA on the K(Ca)I channel was examined quantitatively in6 inside-out patches voltage-clamped at V = + 40 mV with [Ca2+ ]j 100 M.TEA was applied by bath perfusion to the cytoplasmic membrane face. Underthese conditions, TEA caused a reversible, dose-dependent reduction in theamplitude of current in the K(Ca)I channel (Fig. 48). TEA had no effect on thereversal potential of the current in K(Ca)I channels (0 mV).1 5 1F i g u r e4 5 .E f f e c t o fv a r y i n g[ C a2+ J io n t h e a c t i v i t yo fK ( C a ) Ic h a n n e l s .S i n g l ec h a n n e l c u r r e n t r e c o r d i n g sw e r eo b t a i n e df r o m a ni s o l a t e di n s i d e - o u tp a t c hw i t ht w o a c t i v e c h a n n e l sb a t h e di ns y m m e t r i c a l1 4 0 m Mp o t a s s i u ms o l u t i o n s .M e m b r a n ep o t e n t i a lw a s + 4 0 m V .0i n d i c a t e sc h a n n e lc l o s e d ,w h i l e t h en u m e r a l sl a n d2 i n d i c a t ec u r r e n t l e v e l sa s s o c i a t e d w i t h1 a n d2 c h a n n e l so p e n ,r e s p e c t i v e l y .B a n d w i d t hD C - 2 0 0H z . [Ca2+Jo= 0 . 0 1 M.1 5 20 . 1M Ca2J iL Iii. fli1 - iLIL j1b L f ’ I10M1 0 0lOpA1 5 3F i g u r e4 6 . E f f e c to f [Ca2+]i o nt h e o p e n p r o b a b i l i t yo f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l .( A )O p e np r o b a b i l i t yp l o t t e d a g a i n s t[ C a2+ ] io ns e m i l o g a r i t h m i cc o - o r d i n a t e s .( B )F u l lp l o t o f t h e s ed a t a ,i . e .l o gP o / ( 1 - P o )a g a i n s t l o g [Ca2+]i. O v e rr a n g e o f[ C a2+] jf r o m0 . 0 5M t o1 M ,d a t a w e r ew e l l f i t t e db yl i n e a rr e g r e s s i o n l i n e( s o l i d l i n e ) o fs l o p en= 2 . 1 7 .D a t aw e r e o b t a i n e df r o m o n ei n s i d e - o u tp a t c h .V= + 4 0m V , [Ca2+Jo 0 . 0 1t M .1 5 4AP00 . 80 . 6 -0 . 40 . 2 -00 . 0 0 10 . 0 10 . 111 01 0 01 0 0 0[ C a2]( i i M )BP0/ ( 1 - P)0 . 0 1 -0 . 0 01. .0 . 0 0 0 1 III0 . 0 0 10 . 0 1 0 . 111 01 0 01 0 0 0[ C a2]( t M )1 5 5F i g u r e4 7 . D e p e n d e n c eo f t h e o p e np r o b a b i l i t y ,P o o fK ( C a ) Ic h a n n e l so nm e m b r a n e p o t e n t i a lV( m Y )a t d i f f e r e n tv a l u e s o f[ C a2+I i .T h ed a t a w e r eo b t a i n e df r o m4i n s i d e - o u tp a t c h e se x p o s e dt ot h ef o l l o w i n g[ C a2+] j :1 M( o p e ns q u a r e s ) ;1 O t M( f i l l e ds q u a r e s ) ;1 O O M( f i l l e dt r i a n g l e s ) ;1 m M ( f i l l e dd i a m o n d s ) .T h e f i t c u r v e sw e r ed r a w nt ot h eB o l t z m a n ne q u a t i o nP o =[ 1+ e x p ( - K (V-V0))]-1w h e r eV o i s t h e p o t e n t i a la tw h i c hP o0 . 5 .V oa t1 M,1 O M ,1 0 0 P Ma n d 1 m M [Ca2+]i w e r e + 4 0 m V , + 1 8 m V , 0 m V a n d - 6 5 m V ,r e s p e c t i v e l y . T h e c o n s t a n tK t o o kt h e f o l l o w i n gv a l u e s :0 . 1 6m V - ia t[Ca2+]i =1 A M ;0 . 0 9 6m V - ia t [Ca2+]j = i0M; 0 . 0 3 5 m V - ia t[Ca2+]j =i 0 O M a n d0 . 0 1 1 m V - ia t [Ca2+]j = 1 m M . [Ca2+]o = 0 . 0 1 M M .1 5 6P01 . 0 -0 . 8 -A•44AA0 . 4Ap aaI I I I II- 8 0- 6 0- 4 0 - 2 00 2 04 06 08 0V ( m V )1 5 7F i g u r e4 8 . B l o c k i n ge f f e c to fT E A o nc u r r e n t f l o wi n t h eK ( C a ) Ic h a n n e l . S i n g l ec h a n n e lc u r r e n tr e c o r d i n g s f r o ma n i n s i d e - o u tp a t c h w i t ho n e a c t i v ec h a n n e l .T E Aw a s a p p l i e dt ot h ec y t o p l a s m i cf a c eo ft h e m e m b r a n e .0 i n d i c a t e sc h a n n e lc l o s e da n d1i n d i c a t e s c h a n n e lo p e n .B a n d w i d t hD C - 2 k H z ,V =+ 4 0 m V .[Ca2+Jj 1 0 0 , L M , [Ca2+]o = O . O l M . T h e p a t c h w a s b a t h e d i n s y m m e t r i c a l1 4 0m MK ±s o l u t i o n s .1 5 8N O T E A0 . 5 m MT E A1 m MT E Aoj5 p 4l O O m s1 5 9The percentage reduction, Ri in single channel current caused by variousconcentrations of TEA applied to the cytoplasmic membrane face is shown in Fig.49. The value of Ri was well predicted by the relation Rj = 100% / (1 + Kd /[TEA]), where the constant Kd had the value 0.31 mM under these conditions.These data were replotted as a Hill plot, log (Ri/i-Ri) versus log [TEA] where R isthe reduction in mean single channel current caused by a given concentration ofTEA. The slope of this plot was 0.70, suggesting that TEA blocks this channel in aone-to-one fashion, as seen for the K(Ca)L channel. TEA had no significant effecton the probability of K(Ca)I channels adopting an open state (Fig. 50). AnANOVA test was performed to compare these results with comparable dataobtained for the K(Ca)L channel. It was found that no significant differencesexisted between these two data sets (P > 0.05). This result indicates that theK(Ca)L and the K(Ca)I channels have comparable sensitivities to internally appliedTEA.160F i g u r e 4 9 . D o s e - r e s p o n s e c u r v ef o r b l o c k o f t h eK ( C a ) Ic h a n n e lb yT E A . T h ep e r c e n t a g e r e d u c t i o no f s i n g l e c h a n n e l c u r r e n t i s p l o t t e d a g a i n s t t h ec o n c e n t r a t i o n o f T E Aa p p l i e dt ot h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n ef a c e . D a t a p o i n t sa r e t h em e a n ±S E M f r o m 3 - 5p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e d a t V= +4 0 m V a n de x p o s e dt os y m m e t r i c a l 1 4 0 m MK +s o l u t i o n s . T h e s o l i d l i n ep l o t st h e r e l a t i o nR i= 1 0 0 %/( 1+ K d / [ T E A ] ) .T h e a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n tK dw a s 0 . 3 1m M .[ C a2+ ] j= 1 0 0 M M ,[ C a2± ] o= 0 . 0 11 6 1mPercentagereductionofsinglechannelcurrent00000% 000 00pHH0F i g u r e5 0 .E f f e c to f TEAo nt h eo p e np r o b a b i l i t yo ft h eK ( C a ) Ic h a n n e l .O p e n i n gp r o b a b i l i t yo ft h e c h a n n e l ,P oi s plotted a g a i n s tt h e c o n c e n t r a t i o no finternal TEA a p p l i e dt ot h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n ef a c e . [Ca2+ Ii 1 0 0 M ,[Ca2+Jo = 0 . 0 1 M. P a t c h e s w e r e bathed i n s y m m e t r i c a l1 4 0 m M K+s o l u t i o n s . Data p o i n t sa r e mean± S E M f r o m 3 - 5 p a t c h e s v o l t a g e - c l a m p e da t+4 0 m V .N os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s w e r ef o u n db e t w e e nt h e s em e a n s (P>0 . 0 5 ,A N O V A ) .1 6 3l . 0C o n t r o lo . i11 00 0[ T E A ]( m M )1 6 4C h a p t e r 4D i s c u s s i o nT h e p r e s e n ts t u d y h a s r e s u l t e di n t h ed e v e l o p m e n t o fan o v e li nv i t r op r e p a r a t i o no f C V S M C s d e r i v e df r o mt h e c e r e b r a l a r t e r i e so f a d u l t r a t s .T h e s ec e l l s w e r e , i d e n t i f i e du s i n gt h e M a s s o nt r i c h r o m et e s ta n d a n a n t i b o d ys p e c i f i ct os m o o t h m u s c l ea- a c t i n . T h ec a l c i u m - s e n s i t i v ef l u o r e s c e n t p r o b e f u r a - 2w a se m p l o y e dt om e a s u r et h e r e s t i n g l e v e lo f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u mi n C V S M C sa n dt o s t u d yt h ee f f e c to f 5 - H T o n c a l c i u mm o b i l i z a t i o n i n t h e s e c e l l s .P a t c hc l a m p m e t h o d sw e r eu s e dt o m e a s u r e t h e b a s i ce l e c t r o p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e so f C V S M C si nv i t r o .T h eb i o p h y s i c a l p r o p e r t i e so f t w o t y p e s o fK C ac h a n n e lw e r e s t u d i e di ni n s i d e - o u tm e m b r a n e p a t c h e se x c i s e df r o m t h e s e c e l l s .T h es i g n i f i c a n c eo f t h e s er e s u l t sw i l l n o wb ed i s c u s s e di n r e l a t i o nt o p r e v i o u s f i n d i n g sf r o m o t h e r l a b o r a t o r i e s .4 . 1 . M o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f C V S M C si nv i t r oS e v e r a lr e p o r t s h a v e a p p e a r e dd e s c r i b i n gt h ei nv i t r o g r o w t ho fC V S M C sf r o m c e r e b r a l r e s i s t a n c ev e s s e l s ( S p a t ze ta l . 1 9 8 3 ; D i g l i oe t a l . 1 9 8 6 ) .H o w e v e r ,t h e p r e s e n ts t u d y i sa p p a r e n t l y t h e f i r s tt od e s c r i b e s h o r t - t e r mc u l t u r e s o fC V S M C s d e r i v e d f r o mc o n d u c t i n g c e r e b r o v a s c u l a ra r t e r i e so f t h e r a t . W h e ne x a m i n e d a f t e r 1 - 4d a y s i nv i t r o , t h e c e l l so b t a i n e dt y p i c a l l yd i s p l a y e da s p h e r i c a ls h a p e . T h e s h a p e o ft h e s e c e l l sw a st h es a m e r e g a r d l e s so f w h e t h e rp l a t e s w e r ei n c u b a t e da t3 7 o Ci n c u l t u r e m e d i u mo r k e p ta t4 0 Ci nam a i n t e n a n c e s o l u t i o n .S i m i l a rm o r p h o l o g y h a sa l s o b e e no b s e r v e di n s h o r t - t e r mc u l t u r e s o fC V S M C sd e r i v e df r o m p e n e t r a t i n g v e s s e l ss u p p l y i n g t h e r a tb r a i n ,w h e r em o r et h a nf o u r1 6 5d a y s i n v i t r o w e r e r e q u i r e df o rt h e c e l l s t oa d o p taf u s i f o r mo rp o l y g o n a ls h a p e( S p a t ze ta l . 1 9 8 3 ; D i g l i oe t a l . 1 9 8 6 ) .C e r e b r a la r t e r i e sm a yb ec l a s s i f i e da st h e“ m u s c u l a r ”t y p eo f b l o o dv e s s e l ,i nw h i c h t h et u n i c am e d i ac o n t a i n s o n l yaf e we l a s t i c l a m i n a ea n dr e l a t i v e l yl i t t l ei n t e r c e l l u j a rs p a c e ,w h e nc o m p a r e dt o“ e l a s t i c ”a r t e r i e s , s u c ha s t h e a o r t a .C V S M C s a r es p i n d l es h a p e dw h e n r e l a x e d ,b u tl a c k t h eh i g h l yf u s i f o r mm o r p h o l o g yt y p i c a l o f g a s t r o i n t e s t i n a ls m o o t hm u s c l e ,t h er a t i o o f m a x i m u mt om i n i m u ma x e sb e i n ga b o u t9 : 1( R h o d i n ,1 9 8 0 ) .S t e e l ee t a l . ( 1 9 9 1 )h a v ed e s c r i b e dap r o c e d u r eb yw h i c hC V S M C sa p p r o x i m a t i n gt h i ss h a p e c a nb ep r o d u c e d f o l l o w i n ge n z y m a t i cd i s s o c i a t i o no f r a t b a s i l a ra r t e r i e s .T h er e a s o nw h yt h i s r e s u l tw a s n o to b t a i n e di nt h e p r e s e n ts t u d yr e m a i n su n c l e a r .I t i sp o s s i b l et h a tt h ed i s s o c i a t i o np r o c e d u r e su s e d r e s u l t e di nc y t o s k e l e t a ld a m a g e ,a sr e p o r t e df o r o t h e rC V S M C sf o l l o w i n ge n z y m a t i c t r e a t m e n ta n d p l a t i n go n t of o r e i g n s u b s t r a t e s ( S p a t ze ta l .1 9 8 3 ;D i g l i oe ta l .1 9 8 6 ) .I t i sa l s o k n o w nt h a tC V S M C sd i s s o c i a t e df r o mr a t b a s i l a r a r t e r i e sa r eu n a b l et or e l a xf o l l o w i n gab r i e fp e r i o do fa c t i v ec o n t r a c t i o n ,p r e s u m a b l yb e c a u s eo ft h ea b s e n c eo fe l a s t i ce l e m e n t si n t h e s ep r e p a r a t i o n s( S t e e l e e ta l .1 9 9 1 ) .T h ep r e s e n ts t u d yi n d i c a t e st h a tt h e i n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u ml e v e lo f C V S M C sw a sa b o u t4 0n M ,f a rb e l o wt h em i c r o m o l a rl e v e l sr e q u i r e dt oa c t i v a t em u s c l ec o n t r a c t i o n( J o h n se ta l .1 9 8 7 ) .T h e r e f o r e ,i ti sp r o b a b l et h a tt h es p h e r i c a ls h a p eo ft h eC V S M C su s e di nt h i ss t u d yw a st h e r e s u l to ff a i l u r eo ft h e c e l l st or e l a xp a s s i v e l y ,r a t h e rt h a n o fa na c t i v e l ym a i n t a i n e dc o n t r a c t i o n .T h em a j o r i t yo ft h e s p h e r i c a lc e l l s p r e s e n ti n o u rs h o r t t e r mp r i m a r yc u l t u r e sw e r ef o u n dt or e a c t p o s i t i v e l yt o b o t hM a s s o n ’ st r i c h r o m es t a i na n dt o am o n o c l o n a la n t i b o d yd i r e c t e da g a i n s ts m o o t hm u s c l ea - a c t i n .I nd i f f e r e n t i a t e d1 6 6S M C s ,s m o o t h m u s c l e o e - a c t i na n d ‘ y - a c t i n p r e d o m i n a t e o v e ro t h e r , n o n - S M Cs p e c f f i cf o r m so f t h e p r o t e i n . I nv a s c u l a r S M C s s t u d i e dt od a t e , m o s to f t h ea c t i np r e s e n ti s i n t h ea - i s o a c t i n f o r m( G a b b i a n ie ta l . 1 9 8 1 ;O w e n se ta l .1 9 8 6 ) . I na d d i t i o n ,t h e a - i s o a c t i no fS M C si s i m m u n o l o g i c a l l yd i s t i n c t f r o m t h a t f o u n di ns k e l e t a lo rc a r d i a c m u s c l ec e l l s ( O w e n s e t a l . 1 9 8 6 ) .S M Ca- a c t i ni st h e r e f o r ec o n s i d e r e dt ob e ar e l i a b l em a r k e r f o r s m o o t hm u s c l et i s s u es t u d i e d i n v i t r o( M o o r ee ta l . 1 9 8 4 ;D i g l i oe ta l . 1 9 8 6 ) , a l t h o u g h c e r t a i nt u m o r s m a ya l s oe x p r e s st h ea n t i g e n ( S k a l l e e ta l . 1 9 8 6 ) .T h e s ec o n s i d e r a t i o n ss t r o n g l ys u g g e s t t h a t t h ec e l l su s e d i n t h ep r e s e n ts t u d yw e r e i n d e e dS M C so f v a s c u l a ro r i g i n .4 . 2 . I n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u m i nc u l t u r e dC V S M C sT h e r e s t i n gl e v e l o f f r e ei n t r a c e l l u l a rc a l c i u mi n t h eC V S M C sc u l t u r e da t3 7 ° Cw a s f o u n dt o b e a b o u t4 0 n M . T h i sv a l u ei s c o m p a r a b l ew i t h t h e v a l u eo f5 0 n Mc y t o s o l i cf r e e[ C a2+ ] o b t a i n e d f r o m r e s t i n g a i r w a ys m o o t hm u s c l e c e l l so b t a i n e dp s i n gf l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t s( R o d g e r a n dS m a l l , 1 9 9 1 ) .H o w e v e r ,i t i s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a tf o u n di nV S M C s d i s p e r s e df r o m a p e r i p h e r a lv e s s e l ,t h e r a ta o r t a ,i n w h i c h[ C a2+] jw a sf o u n dt o b e 1 2 6n M ,( T a k a t ae t a l .1 9 8 8 ) ; 1 5 3n M , ( C a p p o n ie ta l . 1 9 8 7 ) ;a n d 1 1 4n M , ( N a b i k ae ta l .1 9 8 5 ) .I nt h ep r e s e n ts t u d y ,b a s e l i n el e v e l so f[ C a2+] iw e r e d e t e r m i n e di n t h es a m ec u l t u r e su s e dt oc a l i b r a t et h e m e a s u r e m e n to f f r e ei n t r a c e l l u l a rc a l c i u m .I n a d d i t i o n ,i ns i t uc a l i b r a t i o nu s i n gc e l l s i sg e n e r a l l yc o n s i d e r e dt o b em o r er e l i a b l et h a nm e t h o d se m p l o y i n gf l u o r e s c e n c er a t i o sd e t e r m i n e di n c e l l - f r e es y s t e m s( I s h i ie ta l .1 9 8 9 ) . T h em e a nr e s t i n gl e v e lo f [Ca2+]j w h i c h w a s o b t a i n e d s h o u l dt h e r e f o r eb er e l i a b l e .1 6 7[ C a2+] ji sk n o w nt o d e c l i n ew h e n e x t r a c e l l u l a rc a l c i u mi s l o w e r e d b e l o wa b o u t2m M , a tl e a s t i n t h ec a s e o f S M C s d e r i v e d f r o m t h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t( W i f f i a m se ta l . 1 9 8 5 ; P r i t c h a r da n dA s h l e y 1 9 8 6 ) . I nb o t ht h e p r e s e n ts t u d y ,a n di no n e o f t h e s t u d i e s q u o t e da b o v e ,1 m MC a2 + w a s e m p l o y e di n t h e e x t e r n a lb a t h i n gs o l u t i o n( N a b i k ae t a l . 1 9 8 5 ) .I t s e e m s u n l i k e l yt h e r e f o r e t h a tt h es m a l l e rv a l u e o f[ C a 2+] jo b t a i n e df r o mc u l t u r e dc e r e b r o v a s c u l a rS M C sw a sd u ee n t i r e l yt ot h e u s eo fa r e l a t i v e l yl o w c o n c e n t r a t i o n o fC a2 + i n t h e e x t e r n a lb a t h i n gs o l u t i o n .B i n d i n go f t h ef r e e a c i db y c e l l u l a rp r o t e i n sc a n l e a dt o ac h a n g e i na f f i n i t yo f f u r a - 2f o r c a l c i u m ,a n dt o a nu n d e r e s t i m a t eo f[ C a2+] j( K o n i s h ie t a l .1 9 8 8 ) .H o w e v e r ,c o m p a r i s o no ff u r a - 2d a t aw i t h r e s u l t so b t a i n e du s i n g c a l c i u ms e n s i t i v em i c r o e l e c t r o d e ss u g g e s t st h a tt h e u n d e r e s t i m a t ei n t r o d u c e db yf u r a - 2i sn om o r e t h a nt w o - f o l d( S o m l y oa n d H i m p e n s 1 9 8 9 ) .I na d d i t i o n ,t h i se r r o rs h o u l d a p p l yt oa l ls t u d i e s i nw h i c hac u v e t t ec a l i b r a t i o no f f u r a - 2c a l c i u ma f f i n i t yw a se m p l o y e d .4 . 2 . 1 . M o d u l a t i o no f[ C a2+ ] ib ys e r o t o n i ni n C V S M C sT h er e s u l t s p r e s e n t e di nh e r e s h o wt h a t5 - H Ti n c r e a s e sf r e ei n t r a c e l l u l a rC a2 + l e v e l si nC V S M C sd e r i v e df r o m r a tc e r e b r a la r t e r i e s .T h i s e f f e c ts h o w e da n a p p a r e n tE C 5 Oo f1 0 n M ,av a l u ec l o s e t ot h a t s e e ni ns i m i l a rs t u d i e sc o n d u c t e do n a na o r t aS M C l i n e ,E C 5 0=2 6 n M , ( D o y l ee ta l . 1 9 8 6 ) .I na d d i t i o n ,t h e e f f e c to f 5 - l I To n c a l c i u mm o b i l i z a t i o nw a s s h o w nt ob e m a x i m a la ta s e r o t o n i nd o s eo f 1 u Mi n a l l t h r e eo f t h e s ep r e p a r a t i o n s( D o y l ee t a l .1 9 8 6 ;C a p p o n ie ta l . 1 9 8 7 ) .1 6 8I ns t u d i e sc o n d u c t e do n c u l t u r e dr a t a o r t a V S M C s ,i t w a sf o u n dt h a t5 -H T i n c r e a s e d[ C a2+] jt o a m a x i m a l l e v e l o f1 8 7 n M , s i m i l a rt o t h a ts e e n i nt h ep r e s e n ts t u d y( T a k a t ae ta l . 1 9 8 8 ) .H o w e v e r , C a p p o n ie t a l .( 1 9 8 8 ) , a l s o u s i n gr a t a o r t aV S M C si nc u l t u r e , f o u n d t h a t5 - H T a p p l i c a t i o nc o u l de l e v a t e[ C a2+] it o4 0 0n Mi nt h e s ec e l l s . T h er e a s o nf o rt h i sd i s c r e p a n c yi sn o tc l e a r , a l t h o u g ht h e s es t u d i e su s e dc e l l s a f t e r d i f f e r i n gn u m b e r s o fp a s s a g ei n c u l t u r e ( C a p p o n ie ta l . 1 9 8 8 ; T a k a t ae t a l . 1 9 8 8 ) .S i m u l t a n e o u sm e a s u r e m e n t so f[ C a2+]a n df o r c ed e v e l o p m e n ti ni n d i v i d u a lv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l ss u g g e s tt h a tt h e t h r e s h o l dl e v e lo f[ C a2+J if o r t e n s i o np r o d u c t i o ni sa r o u n d1 2 5 n Ma n d t h a tm a x i m a l f o r c ec a nb ep r o d u c e da t a[Ca2+]i o f 5 0 0 - 6 0 0n M( Y a g ie t a l . 1 9 8 8 ) .T h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t t h em a x i m a ll e v e l s o f[ C a2+] ir e a c h e di n t h ep r e s e n ts t u d yw o u l db es u f f i c i e n tf o rt e n s i o n d e v e l o p m e n ti n i s o l a t e dC V S M C s .I t s h o u l da l s ob en o t e dt h a tt h e s e n s i t i v i t y o f t h e c o n t r a c t i l es y s t e mt o [ C a2+I ih a sb e e n f o u n dt o v a r yw i t h t h em a n n e ri nw h i c h v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e c e l l sa r es t i m u l a t e d .T h u s ,a o r t a V S M C ss t i m u l a t e dw i t h n o r e p i n e p h r i n ee x h i b i t e d h a l f - m a x i m a lt e n s i o na ta [ C a2+ I io f o n l y1 0 0 n M , w h i l e c e l l ss t i m u l a t e db yt h e c a l c i u mi o n o p h o r ei o n o m y c i nr e q u i r e d6 0 0n M t o r e a c hac o m p a r a b l et e n s i o n( B r u s c h ie ta l . 1 9 8 8 ) .I t i s k n o w nt h a tm y o s i nl i g h t c h a i nk i n a s ec a nb e p h o s p h o r y l a t e db y p r o t e i nk i n a s eC ,a n e n z y m ea c t i v a t e db yt h ed i a c y l g l y c e r o ll i b e r a t e do n a c t i v a t i o no f5 -H T 2r e c e p t o r s .I t h a s b e e ns u g g e s t e dt h a tt h i sp h o s p h o r y l a t i o np r o c e s s c o u l dr e d u c et h e c a l c i u mr e q u i r e df o rm a i n t a i n e dc o n t r a c t i o n( B r u s c h ie ta l . 1 9 8 8 ) .T h e s ec o n s i d e r a t i o n sm a k ei t d i f f i c u l tt oa c c u r a t e l ya s s e s s t h ed e g r e eo fc o n t r a c t u r ew h i c hw o u l db ep r o d u c e db yag i v e nr i s e i n[ C a2+] i ,f o l l o w i n ga c t i v a t i o no f t h ep r e s e n tc e l l sb y 5 - H T .1 6 9T h e 5 - H T i n d u c e d i n c r e a s e i n[ C a2+I iw a s n o t p r e v e n t e db yt h ep r e s e n c eo f o r g a n i c o r i n o r g a n i cC a2+c h a n n e l b l o c k e r s . I nc o n t r a s t , i t i s k n o w nt h a ta c t i o np o t e n t i a lg e n e r a t i o ni nr a t b a s i l a r a r t e r y C V S M C si s p o w e r f u l l yb l o c k e db yb o t hC o2+a n d n i f e d i p i n e( S u p r e n a n te ta l . 1 9 8 7 ) . T a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a t t h e r i s e i n[ C a2+] ie v o k e db y 5 - H T d i d n o td e p e n d o n t h ee n t r y o fC a 2 +t h r o u g h v o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u m c h a n n e l s ,d u r i n g a c t i o np o t e n t i a lf i r i n g .As i m i l a rc o n c l u s i o n w a s r e a c h e d i n t h ec a s e o f s e r o t o n i ni n d u c e d c a l c i u m r e l e a s e o c c u r r i n g i n V S M C s d i s s o c i a t e df r o m t h e r a t a o r t a( C a p p o n ie ta l . 1 9 8 7 ) .A t d o s e s o f 1 - 5 O M , 5 - H T t r i g g e r sas m a l l d e p o l a r i z a t i o na n dab r i e fb u r s t o fG a2+s p i k e s i n c e r e b r o v a s c u l a r S M C s ( S u p r e n a n te ta ! . 1 9 8 7 ) . C a l c i u me n t r yt h r o u g h v o l t a g e - g a t e dC ac h a n n e l s a c t i v a t e d i n t h i sw a ym i g h th a v e b e e ne x p e c t e d t og i v e r i s et oa n e n h a n c e d f u r a - 2 s i g n a la t 5 - H Td o s e so f 1 M o rg r e a t e r . T h i s s i g n a l s h o u l db es e n s i t i v et oc a l c i u m c h a n n e lb l o c k e r s . N oe v i d e n c e f o r t h i s e f f e c t w a s s e e n i n t h e p r e s e n t r e s u l t s . T h i ss u g g e s t s t h a tC a2+e n t r y t h r o u g h m e m b r a n e c h a n n e l s w a s r e l a t i v e l y m i n o r , i n c o m p a r i s o nt oC a2+r e l e a s e df r o m i n t e r n a l s t o r e s . I t r e m a i n s p o s s i b l e , h o w e v e r ,t h a t c a l c i u m c h a n n e lb l o c k a d ew o u l db em o r e e f f e c t i v e i n r e d u c i n g t h e r e s p o n s et o 5 - H Tc o n c e n t r a t i o n s a b o v e t h e 1 Md o s e u s e di n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s .I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e e f f e c t o f 5 - H T o n[ C a2+I iw a s r e d u c e db y a b o u t5 0%i n t h ep r e s e n c e o f5n M k e t a n s e r i n . T h i s c o n c e n t r a t i o ni s s i m i l a rt ot h ea f f i n i t y o f k e t a n s e r i n m e a s u r e da ta g o n i s t l a b e l l e d5 - H T 2r e c e p t o r s i t e s i nr a tb r a i nc o r t e x , w h i c h s h o waK d= 1 . 4 n M , ( L y o ne ta l . 1 9 8 7 ) .1 n M k e t a n s e r i na l s o s u p p r e s s e s w h a t a p p e a r t o b e5 - H T 2r e c e p t o r m e d i a t e d c a l c i u m f l u x e si nt h e A 7 r 5s m o o t h m u s c l e c e l l l i n eb y a b o u t 5 0%( D o y l ee t a l . 1 9 8 6 ) . K e t a n s e r i n1 7 0i s k n o w nt ob l o c k r e s p o n s e s m e d i a t e db yt h e5 - H T 1 Cr e c e p t o r ,b u tt h e a f f i n i t yo f t h i s s i t e i s a p p a r e n t l y t w o o r d e r s o f m a g n i t u d et o ol o wt or e a d i l y a c c o u n t f o rt h e p r e s e n t r e s u l t s ( C o n n a n d S a n d e r s - B u s h 1 9 8 7 ) .I n t h e p r e s e n ts t u d y ,t h e o b s e r v e d i n s e n s i t i v i t y o f 5 - H T a c t i o nt oc a l c i u mc h a n n e lb l o c k e r s , a n d t h e h i g h s e n s i t i v i t yt ob l o c k a d eb yk e t a n s e r i n a r ec o m p a t i b l e w i t ham e c h a n i s m i n w h i c h5 - H T 2r e c e p t o r a c t i v a t i o n r e s u l t s i n t h em o b i l i z a t i o n o f c a l c i u m f r o m i n t e r n a l s t o r e s . S e r o t o n i n i n d u c e d c o n t r a c t i o n s i ni n t a c t r a t c e r e b r a l a r t e r i e s a r e s u p p r e s s e db yn a n o m o l a r l e v e l s o f k e t a n s e r i n( C h a n g a n d O w m a n 1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e s e c o n t r a c t i o n s a r e a l s o s t r o n g l yi n h i b i t e d b yl o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s ( C h a n ga n d O w m a n1 9 8 7 ) .I t s e e m s l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t f u l l a c t i v a t i o n o f t h e c o n t r a c t i l em e c h a n i s m i n c e r e b r o v a s c u l a r S M C s r e q u i r e sC a2+- d e p e n d e n t p r o c e s s e s o v e ra n da b o v et h e r e l e a s e o f c a l c i u m f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s .T h e e f f e c t s o f 5 - H T o nm e m b r a n e p o t e n t i a l a n d o n c a l c i u m r e l e a s e f r o mi n t e r n a ls t o r e s h a v e b e e n s t u d i e d i nd e t a i l i n r a t m e s a n g i a l c e l l s ,ac o n t r a c t i l e ,s m o o t h m u s c l e - l i k e c e l lf r o m t h e k i d n e y g l o m e r u l u s ( M e n ee ta l . 1 9 9 1 ) . I tw a sf o u n dt h a t 5 - H T a c t i v a t e da5 - H T 2r e c e p t o r ,w h i c h t r i g g e r e d i m m e d i a t e dd i s c h a r g eo f c a l c i u m f r o m i n t e r n a l s t o r e s . T h e e l e v a t i o n o f [ C a2+J ia c t i v a t e dac a l c i u m - d e p e n d e n tc h l o r i d e c o n d u c t a n c e ,p r o d u c i n gas m a l l , m a i n t a i n e dd e p o l a r i z a t i o no f t h e c e l l w h i c h w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n t i n u e d o c c u p a t i o n o f5 - H T 2r e c e p t o r sb yt h ea g o n i s t . T h i s d e p o l a r i z a t i o n i n t u r n a c t i v a t e d v o l t a g es e n s i t i v e C ac h a n n e l s , l e a d i n g t o t o n i ce n t r y o f c a l c i u m i n t o t h e c e l l ( M e n ee ta l .1 9 9 1 ) . I t h a sb e e ns u g g e s t e dt h a tat o n i ci n f l u xo fC a2+t h r o u g h v o l t a g es e n s i t i v ec h a n n e l s m a y a l s o o c c u r i n 5 - H T s t i m u l a t e d V S M C s , a n d t h a t t h i s1 7 1i n f l u x m a yb en e c e s s a r yt om a i n t a i n t h e c o n t r a c t i l es t a t e ,p o s s i b l yb y f a c i l i t a t i n gt h e r e c y c l i n g o f i n t e r n a l c a l c i u m ( S u t t e r 1 9 9 0 ) .I n s o m e c e l l s i n v e s t i g a t e d i n t h i ss t u d y , a m a r k e d l o s s o f 5 - H Tr e s p o n s i v e n e s sw a ss e e n o n r e p e a t e d a p p l i c a t i o n o f t h ea g o n i s t . T h i sp h e n o m e n o nh a s a l s ob e e n r e p o r t e d i n s t u d i e s o f 5 - H T i n d u c e d c a l c i u mm o b i l i z a t i o n i n S M C s f r o m t h e p e r i p h e r a l v a s c u l a t u r e ( C a p p o n ie ta l .1 9 8 7 ;T a k a t ae ta l . 1 9 8 8 ) . T h e p r o g r e s s i v e d e c l i n e i nr e s p o n s e t o 5 - H T w a s m o s tm a r k e d i n t h e c e l l b e i n g e x p o s e dt ot h e p h o t o e x c i t a n t w a v e l e n g t h s . I ts e e m sl i k e l y ,t h e r e f o r e , t h a t t h i s p h e n o m e n o n i n v o l v e dad e g r e eo f p h o t o d y n a m i cd a m a g e ,a sh a s b e e n n o t e di n p r e v i o u ss t u d i e su s i n gf u r a - 2 ( T s i e n 1 9 8 8 ) . I n t h ec e l l b e i n g i l l u m i n a t e d , p h o t o d y n a m i c d a m a g em a y a l s oh a v e e n h a n c e d t h ed e l e t e r i o u s e f f e c t o f e l e v a t e d[ C a2+] i ,w h i c h i s k n o w nt oa c t i v a t eC a2+ -d e p e n d e n t p r o t e a s e s i n m a n y t i s s u e s ( B o n d , 1 9 8 8 ) . T h e d e c r e a s e d r e s p o n s et o5 - H Ts e e n o n r e p e a t e d a g o n i s t a p p l i c a t i o n o c c u r r e d i n t h e a b s e n c e o f e l e v a t i n gb a s e l i n e l e v e l s o f f r e ec a l c i u m ,s u g g e s t i n gt h a t m e m b r a n e i n t e g r i t yw a s n o tg r e a t l y c o m p r o m i s e dd u r i n g t h i s p h e n o m e n o n . I t s e e m su n l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a tg r o s sd a m a g et ot h e c e l l m e m b r a n e w a sr e s p o n s i b l e f o rt h ed e c l i n i n gr e s p o n s i v e n e s st o5 - H T .I n s u m m a r y ,t h e p r e s e n t r e s u l t s s h o w t h a t C V S M C s c u l t u r e d f r o m r a tc e r e b r a la r t e r i e s p r o v i d e a n u s e f u l p r e p a r a t i o n i n w h i c ht o s t u d y C a2+m o b i l i z a t i o nb ys e r o t o n i na n d o t h e r a g e n t s a c t i v e i n t h e c e r e b r o v a s c u l a rc i r c u l a t i o n o f m a m m a l s .4 . 3 . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s o f i s o l a t e d C V S M C s1 7 2I n t h e p r e s e n ts t u d y ,t h em e a nr e s t i n g p o t e n t i a l o fi s o l a t e dC V S M C s f r o mr a tc e r e b r a la r t e r i e s w a s f o u n dt ob ea b o u t - 4 0 m V . T h e s ec e l l ss h o w e da n i n p u tr e s i s t a n c eo f a b o u t3G Oa tt h er e s t i n g p o t e n t i a l a n da t o t a lm e m b r a n ec a p a c i t a n c eo f2 4 p F . S i m i l a rv a l u e s o f i n p u t r e s i s t a n c eh a v e b e e nr e p o r t e d i nap r e v i o u sp a t c hc l a m ps t u d yo f i s o l a t e d C V S M C s d e r i v e df r o mr a tb a s i l a ra r t e r y( S t e e l ee ta l . 1 9 9 1 ) . A s s u m i n ga s p e c i f i cm e m b r a n ec a p a c i t a n c eo f1 p F / c m2,a sh a sb e e n s u g g e s t e d f o r V S M C s( T o r oe ta l . 1 9 8 6 ) ,a2 4p Fc e l l s h o u l d p o s s e s sas u r f a c ea r e ao f2 4 0 0 m2. T h i si sg r e a t l yi n e x c e s so f t h es u r f a c ea r e a c a l c u l a t e df o r1 2 j L m d i a m e t e rc e l l s o fp u r e l ys p h e r i c a ls h a p e( 4 5 2 m2). T h i s r e s u l ti n d i c a t e st h a t t h e m e m b r a n es u r f a c eo ft h e p r e s e n tc e l l s i sh i g h l y i n v o l u t e d ,p r e s u m a b l ya sac o n s e q u e n c eo f c e l l c o n t r a c t i o na n d o f t h ep r e s e n c e o fn u m e r o u sc a v e o l a e i n v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e c e l l s( M u l v a n y1 9 8 6 ) .H i r s te ta l . ( 1 9 8 6 )s t u d i e dt h e e l e c t r i c a lp r o p e r t i e so fa r t e r i o l a r s e g m e n t so f r a tm i d d l e c e r e b r a la r t e r y u s i n gi n t r a c e l l u l a rr e c o r d i n gt e c h n i q u e s .T h e yo b t a i n e dam e a nr e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a lo f- 6 3m V . S i m i l a re x p e r i m e n t sc o n d u c t e do ni n t a c t c a tb a s i l a ra r t e r i e s( H a r d e re ta l . 1 9 8 1 )a n d o n g u i n e a - p i gb a s i l a r a r t e r y( F u j i w a r ae ta l . 1 9 8 2 )y i e l d e dm e a n r e s t i n gp o t e n t i a l so f- 5 5m Va n d- 5 0m V r e s p e c t i v e l y .T h es l i g h t l y l o w e rv a l u e so f r e s t i n gp o t e n t i a lo b s e r v e di nt h e p r e s e n ts t u d yc o u l db et h e r e s u l to fs e v e r a lf a c t o r s .F o l l o w i n gf o r m a t i o no f t h ew h o l e - c e l lr e c o r d i n gc o n f i g u r a t i o n ,d i a l y s i s o ft h ec e l l u l a rc o n t e n t so c c u r s ,l e a d i n gt ot h ef o r m a t i o no fan e we q u i l i b r i u mb e t w e e nt h e b a t h i n gs o l u t i o na n dt h e s o l u t i o nf i l l i n gt h e p a t c hp i p e t t e( S a k m a n na n dN e h e r1 9 8 3 ) .T h el a t t e rs o l u t i o n m u s tt h e r e f o r ea c c u r a t e l yr e f l e c t t h ei o n i c c o m p o s i t i o no f t h es a r c o p l a s mi n c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s , i fr e l i a b l e v a l u e so f r e s t i n gp o t e n t i a la r et ob eo b t a i n e d .1 7 3T h e m e m b r a n e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s s h o w ss i g n i f i c a n t r e s t i n gp e r m e a b i l i t y t o N a + a n d C l - ,a sw e l la s t oK + ( S u t t e r 1 9 9 0 ;F u j i w a r ae ta l . 1 9 8 2 ;J o h a n s s o n a n d S o m l y o 1 9 8 0 ) . E l e c t r o n p r o b e a n a l y s i ss t u d i e s c o n d u c t e d o nm e s e n t e r i c p o r t a l v e i n s h a v e i n d i c a t e d t h e f o l l o w i n gv a l u e s f o r i n t r a c e l l u l a ri o n i cc o n c e n t r a t i o n s , i n m m o l e / k g d r y w e i g h t : N a + 1 6 7 ;K + 6 1 1 ; C l - 2 7 8 ; M g2+3 6a n dC a2+1 . 9 ( S o m l y oe ta ! .1 9 7 9 ) . T h e s e v a l u e s i n d i c a t e t h a t , i ni n t a c tC V S M C s ,[ K + J i / [ N a +] jm a yb e a p p r e c i a b l y s m a l l e r t h a n t h e v a l u e w h i c hp e r t a i n e d d u r i n g w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s r e p o r t e d i n t h i ss t u d y ( 4 7 : 1 ) . W a h i s t r o m( 1 9 7 1 ) e s t i m a t e d t h a t t h e N e r n s t p o t e n t i a l f o rN a +i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l ei sp r o b a b l y n o m o r e p o s i t i v e t h a n 2 1 m V , w h i l eE Kw a s - 8 6 m V . T h eu s eo f l o wi n t e r n a lN a +i n w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s c o u l d t h e r e f o r e h a v er e s u l t e d i n a nu n d e r e s t i m a t e o f t h e t r u e m e m b r a n e p o t e n t i a l i n i s o l a t e d C V S M C s . I na d d i t i o n ,ao u a b a i ns e n s i t i v eN a +/ K +p u m p i s k n o w nt or e g u l a t ei o n i c c o n c e n t r a t i o n s i nV S M C s a n dt oe l e c t r o g e n i c a l l y c o n t r i b u t e s e v e r a l m i l l i v o l t st ot h e r e s t i n gp o t e n t i a l o f t h e s e c e l l si nv i v o ( S u t t e r 1 9 9 0 ; F u j i w a r a e t a l . 1 9 8 2 ) . T h i s p u m pw a sp r e s u m a b l y i n h i b i t e dd u r i n g m a i n t e n a n c e o f t h e c e l l sa t 4 ° C a n d d e p r e s s e dd u r i n g w h o l e - c e l l r e c o r d i n g s , s i n c e e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e da t2 1 0 Ca n d t h ep i p e t t e s o l u t i o n d i d n o tc o n t a i n A T P .T h e i n p u tr e s i s t a n c eo f t h ei s o l a t e d C V S M C su s e d i n t h e p r e s e n ts t u d yw a sf o u n dt oa v e r a g e3G O ,av a l u e c o m p a r a b l et or e s u l t s o b t a i n e d i np a t c hc l a m p s t u d i e s o n S M C si s o l a t e d f r o mr a tc a u d a l v e i n , 1 . 4 G O ( T o r oe t a l . 1 9 8 6 ) ,r a b b i t j e j u n u m , 2 G O ( B o l t o ne ta l . 1 9 8 5 ) , a n d r a tb a s i l a ra r t e r y , 4 G O ( S t e e l ee ta ! . 1 9 9 1 ) . T h em e a s u r e d v a l u e i n c l u d e s t h e l e a k a g er e s i s t a n c e b e t w e e n t h ep i p e t t ea n dt h e m e m b r a n e , w h i c hw a st y p i c a l l ya b o u t1 0G O . H e n c e t h e1 7 4m e a s u r e di n p u t r e s i s t a n c e s s l i g h t l yu n d e r e s t i m a t e d t h e t r u e v a l u eo f t h i sp a r a m e t e r .T h e s e r e s i s t a n c e si n t h e g i g a o h mr a n g e g r e a t l y e x c e e dv a l u e sd e t e r m i n e di n i s o l a t e d V S M C s u s i n gi n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n gm e t h o d s , w h i c h a r et y p i c a l l y i nt h e r a n g e0 . 4 5- 0 . 5 9G O( T o r oe ta l . 1 9 8 6 ) . T h i sd i f f e r e n c e p r o b a b l y r e f l e c t st h ep r e s e n c eo f a p p r e c i a b l e l e a k a g ec u r r e n t s a r o u n d t h em i c r o e l e c t r o d e i n s e r t i o n( S a k m a n n a n d N e h e r1 9 8 3 ) . I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g sf r o m V S M C s i ni n t a c tb l o o d v e s s e l sy i e l dy e tl o w e r e s t i m a t e so f m e m b r a n er e s i s t a n c e , i nt h e o r d e ro f1 0 - 1 0 0 M O .T h i s p r o b a b l y r e f l e c t st h e s y n c y t i a l n a t u r e o fs m o o t h m u s c l ep r e p a r a t i o n si n i n t a c t v e s s e l s( H i r s te ta l . 1 9 8 6 ; H e r m s m e y e r 1 9 7 6 ;S o m l y o 1 9 8 0 ;S u p r e n a n te t a ! . 1 9 8 7 ) .C V S M C s i s o l a t e df r o m r a t c e r e b r a la r t e r i e s s h o w e dam a r k e d f a l li ni n p u t r e s i s t a n c eo n m e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n , a n d o n l y s m a l lr e g e n e r a t i v er e s p o n s e sc o u l db ee v o k e db yd i r e c te l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n . T h e s ep r o p e r t i e sw e r e a l s o s e e ni n C V S M C s s t u d i e dw i t h i n t r a c e l l u l a rm i c r o e l e c t r o d e si n i n t a c tc e r e b r a l a r t e r i e so f t h e r a t ( H i r s t e ta l . 1 9 8 6 )a n dg u i n e a - p i g ( F u g i w a r a a n dK u r i y a m a 1 9 8 3 ) .I n c o n t r a s t ,C V S M C si n i n t a c tr a b b i t b a s i l a ra r t e r yd o g e n e r a t el a r g e a c t i o n p o t e n t i a l so n d e p o l a r i z a t i o ni n n o r m a l b a t h i n g m e d i a( S u p r e n a n te ta ! . 1 9 8 7 ) .I n C V S M C s s t u d i e di n i n t a c t r a t b a s i l a ra r t e r i e s ,l a r g ea c t i o np o t e n t i a l sw e r e e v o k e d o n d i r e c te l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n , f o l l o w i n gs u p p r e s s i o no fo u t w a r d p o t a s s i u mc u r r e n tb yT E A .I n w a r d c u r r e n td u r i n g t h e s ea c t i o np o t e n t i a l w a s c a r r i e db yc a l c i u m i o n s( H i r s te ta ! . 1 9 8 6 ) .T h e e n h a n c e dl e v e lo fi n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u ms e e n i n t h e p r e s e n tc e l l s o nd e p o l a r i z a t i o nb yh i g hp o t a s s i u ms o l u t i o n ss u g g e s t s t h a tv o l t a g e - s e n s i t i v e c a l c i u mc h a n n e l sw e r e a l s op r e s e n t i n t h i sp r e p a r a t i o n . I t s e e m sl i k e l y , h o w e v e r ,t h a t t h ei n w a r dc u r r e n t1 7 5f l o w i n g i n t h e s e c h a n n e l sw a si n s u f f i c i e n tt o o v e r c o m e t h e d a m p i n ge f f e c t o fr e c t i f i e r c u r r e n t s , d u r i n gd i r e c te l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n .D u r i n g a p p l i c a t i o n o fs e r o t o n i nt ot h ep r e s e n t c e l l s ,b i p h a s i cc u r r e n t sw e r e o b s e r v e di n c e l l - a t t a c h e dm e m b r a n e p a t c h e s .T h e s e c u r r e n t ss t r o n g l yr e s e m b l e d t h ec a p a c i t a n c ec u r r e n t s r e c o r d e di n c e l l - a t t a c h e dp a t c h e s d u r i n ga c t i o n p o t e n t i a l a c t i v i t y i no t h e rt y p e so fh i g hi m p e d a n c e c e l l( F e n w i c ke ta l .1 9 8 2 ) . S e r o t o n i n( 1 - 5 O M ) i s k n o w nt o c a u s eas m a l ld e p o l a r i z a t i o n i nc e r e b r a l a r t e r y V S M C s , a n dt oi n i t i a t eab u r s t o f a c t i o np o t e n t i a l s i nt h e s e c e l l s( S u p r e n a n te ta l . 1 9 8 7 ) .C a l c i u me n t r y d u r i n g t h e s ea c t i o n p o t e n t i a l sm i g h tb ee x p e c t e dt oa c t i v a t eK C ac h a n n e l si n t h e p r e s e n t c e l l s .L a r g ea m p l i t u d e s i n g l ec h a n n e l c u r r e n t s w e r e i n d e e do b s e r v e d i n c e l l - a t t a c h e dp a t c h e sd u r i n ge x p o s u r eo f C V S M C st os e r o t o n i n .F u r t h e r w o r k i s n e e d e d ,h o w e v e r ,t oi d e n t i f yt h e s ec u r r e n t sd e f i n i t i v e l y .4 . 4 .Ca2+ - a c t i v t e d K +c h a n n e l si n i n s i d e - o u tm e m b r a n ep a t c h e sI n t h i ss t u d y ,e v i d e n c ew a so b t a i n e df o r t w ot y p e so f v o l t a g ea n dC a -d e p e n d e n t K - c h a n n e l si n C V S M C sd i s p e r s e d f r o mr a t c e r e b r a l a r t e r i e s .O n t h eb a s i s o fal a r g e d i f f e r e n c e i nm e a n s i n g l e c h a n n e lc o n d u c t a n c e ,t h e s ew e r ed e s i g n a t e da sK ( c D a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l s .4 . 4 . 1 . P r o p e r t i e so ft h eK ( C a ) Lc h a n n e lT h eK ( C a ) Lc h a n n e l sd e s c r i b e d i n t h i sp a p e r s h o w e da c o n d u c t a n c eo f2 0 7±1 0 p Ai ns y m m e t r i c a l h i g h p o t a s s i u ms o l u t i o n s ,s i m i l a rt o t h a t o f B K1 7 6c h a n n e l s s t u d i e d i n V S M C s f r o mm e s e n t e r i c a r t e r y , a n dav a r i e t yo f o t h e rs m o o t h m u s c l ep r e p a r a t i o n s( S e eT a b l e I I ) . M e a s u r e dc o n d u c t a n c e v a l u e so fK ( C a ) Lc h a n n e l s v a r i e d f r o m1 7 0p S t o2 6 7p Sw h e n m e a s u r e du n d e r c o n s t a n ti o n i c c o n d i t i o n s . S i m i l a r v a r i a t i o n h a s b e e n s e e n i n t h ec o n d u c t a n c e o f B Kc h a n n e l s i n c h r o m a f f i n c e l l s , 1 9 0- 3 3 0 p S( M a r t y1 9 8 1 ) a n d i n r a t s k e l e t a lm u s c l e , 1 5 0 - 2 4 0p S( B a r r e t te ta ! .1 9 8 2 ) . T h e m e a n i n g o f t h e s ev a r i a t i o n s i nt e r m so fc h a n n e ls t r u c t u r e r e m a i n s , h o w e v e r , u n c l e a r . Am o r e d e f i n i t i v ea s s i g n m e n t o f t h e p r e s e n t c h a n n e lt ot h e B Kc a t e g o r y a w a i t s d e t e r m i n a t i o no fc h a n n e l s e n s i t i v i t yt oc h a r y b d o t o x i n ,as e l e c t i v e b l o c k e r o f B Kc h a n n e l s i n m a n yt i s s u e s ( L a n g a n d R i t c h i e 1 9 9 0 ; M a c K i n n o n a n d M i l l e r1 9 8 8 ) .4 . 4 . 1 . 1 . I o n i c s e l e c t i v i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r e h i g h l y s e l e c t i v e f o r K + o v e r N a +( P N a / P K <0 . 0 5 ) , a sh a s b e e no b s e r v e d f o r B K c h a n n e l s i n o t h e r s m o o t h m u s c l ec e l l s( B e n h a me ta ! . 1 9 8 6 ; I n o u e e ta l .1 9 8 5 ; G r e e n e ta l .1 9 9 1 ; M a y e re ta l . 1 9 9 0 ) .N a + d i d n o t s i g n i f i c a n t l y i n t e r f e r ew i t h t h ep a s s a g e o f K + t h r o u g h o p e nK ( C a ) Lc h a n n e l s , e v e n w h e n p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 8 0 m M . S i m i l a r r e s u l t s h a v eb e e no b t a i n e d f o r t h e B K c h a n n e l f o u n d i n g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , c u r r e n t f l o w i n t h eB Kc h a n n e l s o f b o v i n ec h r o m a f f i n c e l l s i s s u b j e c t t o a f a s tf l i c k e r b l o c kb y 5m M i n t e r n a lN a+ ,p r o v i d i n g * K +i s a b s e n t f r o m t h e e x t e r n a l m e d i u m ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ) . U n d e r t h ei o n i c c o n d i t i o n s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , af l i c k e rb l o c k o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e lb yi n t e r n a lN a +m a yh a v e b e e n r e l i e v e db y t h ep r e s e n c eo f 1 4 0 m MK +i n t h ee x t e r n a l s o l u t i o n , a n d c o u l d t h e r e f o r e h a v e g o n e u n d e t e c t e d ( Y e l l e n 1 9 8 4 b ) .1 7 7Table II Characteristics of BK channels in various preparationsVoltage Calcium TEATonic Conductance dependence dependence block(c)Preparation conditionsa (pS) Selectivity (a) (b) Kd(0)i Kd(0)0 ReferenceBovine 160 K + 265 K>Rb>Na,Cs 12-15 mV lOnM 27mM 0.2mMMarty 1981, 1983,chromaffinYellen 1984acellRat myotubes 140 K + 240 TI>K>Rb>NH4>> 11-16 mV 4OmV/10-fold 60mM 0.3mMBarret et aT. 1982,Na,Li,Cs V0(l sM)=40rnV Blatz and Magleby 1984,1986Rabbit lOOK + 260 Ti>K>Rb>NH4>> 11-13 mV 4OmV/10-fold 45mM 0.29mMLatorreetal. 1982,Ttubulesb Na>Li>Cs V0(1 M)=40mV Moczydlowski et al.1983,1985,Vergara 1983 et al.1984Rat anterior 140 K + 200 - 9 mV 6OmV/10-fold 0.08mM 52.2mMWong and Adler 1986,pituitary cells V0(1 iM)=-30mV Wong et al. 1982(AtT2O/D16-16)Rat anterior 150 K + 250-300 K>>Na 8 mV V0(1 M)=50mV Kd(60)02mMLang and Ritchie 1988pituitary (GH3)Mouse parotid 145 K + 250 K>>Na 12 mV 1 nM - Maruyama et al 1983aciniRat panceatic 140 K + 244 K>>Na 15 mV llOmV/10-fold -Cook et al.l984,B-cell , V0(1 M)=0mV Findlay et aL1985Rabbit 140 K + 180 K>>Na 17 mV 100 nM -Gitter et al. 1987collectingduct cellsRat pancreatic 150 K + 200 - yes 60-7OmV/1 00-fold -Gray et al. 1990duct cells V(3jiM)=-4mVRabbit 100K + 230 K>Rb>Na,Li,Cs 15 mV 3OmV/10-fold -Cecchi et al. 1986intestinal SMCb V0(2jM)60mVToad 130K + 250 K>>Na 9 mV 8OmV/l0-fold - Singer and Walsh 1987stomach SMC V0(1 JLM)=lOmVFrog and toad 120 K + 200 K>>Na yes 10 nM 20mM forBergeret al. 1984stomach SMC total block externallyRabbit 126 K + 200 K>>Na yes 10 nM 12mM - Benham et al. 1985intestinal SMCRabbit 126 K + 200 TI>K>Rb>> 30 mV 30-60mV/TO-fold - Benhamet aT. 1986mesenteric ‘ Na,Csartery SMC178Rabbit 126 K + 210 K>>Na yes 60mV/l0-fold 30mM for total Mayer et at. 1990colonic SMC V0(5tM)=0mV block externallyCanine 140 K + 265 K>>Na yes lOOmV/l0-fold NE 0.18 mM Carl et at. 1990gastric SMCRabbit 142K 273 K>>Na- V0(l.4RM)=OmV NE 0.1mM Inoueetal. 1985portal vein SMCRat cerebral 140 K + 207 K>>Na,Cs 14 mV 45 mV/l0-fold Kd(-t-40)1=0.83mM Present studyartery SMC V0(23 M)=+40mVa= concentration is in mM. Symmetrical solutions were used.b= parameters determined in planar bitayers. For all other channels, patch-clamp technique was used.(a) = expressed as c-fold change in P0 (fraction of the time in the open state) per x mV.(b) = expressed as x mV change in V0 (voltage at whichP0=0.5) per 10-fold increase in [Ca2+]; V0 (x mM)1 indicates the voltage atwhichP0=0.5 at given [Ca2+]i. Otherwise the lowest [Ca2jis given at which channel activity can be seen.(c) Kd(0)1 indicates concentration of internally applied TEA causing 50% block of single channel current at 0 mV. Kd(0)0 iscorresponding value during external application of TEA. If data were obtained at other membrane voltages, this is indicated inbrackets.SMC = Smooth muscle cell.NE = No effect of internally applied TEA.179T h eK ( C a ) Lc h a n n e l a l s o s h o w e d n e g l i g i b l e p e r m e a b i l i t yt o C s +( P C / P K< 0 . 0 5 ) .U n d e r c o n d i t i o n s w h i c h f a v o u r e d t h e e n t r y o fC s + i n t o t h ec h a n n e l , t h e a m p l i t u d e o f p o t a s s i u m c u r r e n t sw a ss i g n i f i c a n t l y d e p r e s s e d .Q u a l i t a t i v e l ys i m i l a r o b s e r v a t i o n sh a v e b e e n m a d e i n t h ec a s eo f B K c h a n n e l s i ns m o o t h m u s c l e c e l l s d e r i v e df r o mg u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y . I n t h i sp r e p a r a t i o n , h o w e v e r , B K c h a n n e l s e x h i b i tam u c h h i g h e r s e n s i t i v i t yt ot h eb l o c k i n ge f f e c t o fC s+t h a n w a s e v i d e n t i n t h e p r e s e n ts t u d y ,s u g g e s t i n gt h a tt h e s e t w oc h a n n e l p o p u l a t i o n s , d e s p i t e t h e i r s i m i l a r c o n d u c t a n c e , a r e p r o b a b l yn o t i d e n t i c a l( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) .T h e a c t i o no fC s+o n t h ep r e s e n tc h a n n e l c a nb ee x p l a i n e db yt h et h e o r yo f i o n i cb l o c k a d e ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ; H i l l e 1 9 9 1 ) . I t i s a s s u m e dC s+ b i n d st o as i t ei n t h e o p e nc h a n n e l a n d b l o c k s i t . A t e q u i l i b r i u m , t h e c h a n n e l w i l l f l u c t u a t eb e t w e e nc l o s e d , o p e n a n d b l o c k e d s t a t e s . T h ef r e q u e n c y o fb l o c k i n g e v e n t si n c r e a s e s a tp o t e n t i a l s w h i c h p r o m o t e t h e e n t r y o fC s+i n t o t h e c h a n n e l . I f t h ea v e r a g el i f e t i m e o f t h e b l o c k e ds t a t ew e r e l e s s t h a n t h e t i m e r e s o l u t i o n o f t h er e c o r d i n gs y s t e m , t h e n t h e o p e n c h a n n e l c u r r e n t w o u l d r e p r e s e n tat i m e -a v e r a g e dc u r r e n t , r e f l e c t i n g t h e p r o p o r t i o n o f t i m et h e c h a n n e ls p e n t i n t h eb l o c k e ds t a t ed u r i n ga n o p e n i n g ( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) .T h ef l i c k e r b l o c k o fK ( C a ) Lc h a n n e l sb y C s+ s h o w e d v o l t a g ed e p e n d e n c y .T h e e f f e c t i v e v a l e n c e f o r i n t e r n a l C s+b l o c k w a s o n l y0 . 0 7 ,w h i l ee x t e r n a l l y a p p l i e d C s+b l o c k e d w i t h a n e f f e c t i v e v a l e n c eôo f- 0 . 6 6 .T h i s t e nf o l d d i f f e r e n c e i n d i c a t e s t h a t t h e t w o s i t e so fC s+b i n d i n g a r en o t l o c a t e da te q u a l d e p t h s i n t h em e m b r a n e f i e l d . A s i m i l a r r e s u l tw a so b t a i n e db yY e l l e n1 8 0( 1 9 8 4 a ) i nas t u d y o fC s+ b l o c k o f B Kc h a n n e l s i n c h r o m a f f i nc e l l s . H o w e v e r .t h e v a l u e so f8w e r ed i f f e r e n t ( 0 . 2 5 f o r i n t e r n a lb l o c k , - 1 . 0 f o re x t e r n a l b l o c k ) .B e n h a me ta l . ( 1 9 8 6 ) r e p o r t e dav a l u eo f8= - 1 . 4 f o r e x t e r n a lb l o c k o f B Kc h a n n e l s i n m e s e n t e r i c a r t e r yV S M C s . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t t h a t t h e l a r g ec o n d u c t a n c eK C ac h a n n e l s f o u n d i n t h e s e t h r e ep r e p a r a t i o n se x h i b i t s o m e f i n ed i f f e r e n c e s w i t hr e s p e c t t o t h e i r i o n o p h o r e s t r u c t u r e s .4 . 4 . 1 . 2 .C a2+d e p e n d e n c e o fK ( C a ) Lc h a n n e l o p e n i n gT h e o p e n p r o b a b i l i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l s w a s s e n s i t i v et ot h ec o n c e n t r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i o n s .A t a m e m b r a n e p o t e n t i a lo fV=+ 4 0m V ,t h eK ( C a ) Lc h a n n e l w a s o p e n f o r h a l f o f t h et i m ea t [ C a2+ ] i= 2 3M . A sc a nb es e e n i n T a b l e I I ,t h e c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f B K c h a n n e l sv a r i e sa p p r e c i a l l y a m o n g d i f f e r e n t c e l lt y p e s .B K c h a n n e l s i n c e r t a i n s e c r e t o r yc e l l s ,i n c l u d i n g m o u s ep a r o t i d a c i n a r c e l l sa r eh i g h l yc a l c i u m - s e n s i t i v e , b e i n g o p e n5 0 %o f t h e t i m e a t[ C a2+ ] iv a l u e sb e t w e e n1 0 - 8- 1 0 - 7 M( V = 0m V )( M a r u y a m ae ta l 1 9 8 3 ) . F o r B K c h a n n e l s f o u n d i n s k e l e t a lm u s c l e f i b r e s , t h ec o r r e s p o n d i n gv a l u e o f[ C a2+] ii s a r o u n d5 j LM ( B a r r e t te ta l .1 9 8 2 ; M e t h f e s s e la n d B o h e i m 1 9 8 2 ) , w h i l e f o r n o n v a s c u l a r a n dv a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l l s ,e s t i m a t e si n t h e r a n g e0 . 5- 1 M h a v e b e e n r e p o r t e d ( C a r le ta l . 1 9 9 0 ; B e i i h a me ta l . 1 9 8 6 ) .T h e l o w a p p a r e n t c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l h a si m p l i c a t i o n s f o r t h ef u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s c h a n n e l ,a sw i l lb e d i s c u s s e dl a t e r i n t h i st h e s i s .I n i h e p r e s e n t s t u d y , as e c o n dp o w e rr e l a t i o n s h i pw a sf o u n db e t w e e n t h ep r o b a b i l i t yo f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l o p e n i n g a n d t h e v a l u e o f[ C a2+ J i ,w h e nm e a s u r e do v e r t h e r a n g e o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m l i k e l yt op e r t a i n u n d e r1 8 1p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s . T h i s r e s u l t i s i na g r e e m e n t w i t h p r e v i o u ss t u d i e sc o n d u c t e d o n B K c h a n n e l s i n o t h e r t i s s u e s ,w h i c hs u g g e s tt h a t 2 - 4c a l c i u m i o n sa r e r e q u i r e dt of u l l y a c t i v a t e e a c hc h a n n e l ( B a r r e t te ta ! . 1 9 8 2 ;M e t h f e s s e l a n dB o h e i m1 9 8 2 ; M o c z y d l o w s k i a n d L a t o r r e 1 9 8 3 ) .O p e n t i m e d i s t r i b u t i o n sf o rK ( C a ) Lc h a n n e l s w e r e w e l lf i t t e db yt h es u mo f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s , w h e n i n v e s t i g a t e df o r[ C a2+] iv a l u e s o v e r t h er a n g e1 0 - 8 - 1 0 - 3M . I n c r e a s i n g[ C a2+ ] ih a d n o s i g n i f i c a n te f f e c t o n t h e v a l u e o ft h ef a s t t i m e c o n s t a n t f i t t e dt ot h e s e d i s t r i b u t i o n s , w h i l et h e s l o w t i m e c o n s t a n tw a se l e v a t e db yt h i s p r o c e d u r e . S i m i l a r r e s u l t s w e r er e p o r t e d i n t h ec a s eo f B Kc h a n n e l s i n r a t s k e l e t a l m u s c l e ( B a r r e t te ta ! . 1 9 8 2 ;M a g l e b y a n d P a l l o t t a 1 9 8 3 a ) .H o w e v e r , i nB K c h a n n e l s s t u d i e d i ns m o o t h m u s c l ec e l l si s o l a t e d f r o mm e s e n t e r i c a r t e r y , o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s w e r e w e l l f i tb y as i n g l ee x p o n e n t i a lt e r m a tl o w[ C a2+f t( < 1 0 - 6M ) . O n r a i s i n g[ C a2+ ] j ,a s e c o n d , f a s t f i tc o m p o n e n t a p p e a r e d i n t h e s e d i s t r i b u t i o n s , a n d t h e t i m e c o n s t a n t o ft h e o r i g i n a lc o m p o n e n t i n c r e a s e d( B e r t h a me ta ! .1 9 8 6 ) .T h e p r e s e n t r e s u l t s a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e f o l l o w i n g m i n i m u ms t a t ed i a g r a m f o r t h e g a t i n g o f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l( c l o s e d ) K 1 [ C a ] ( c l o s e d )K 2 [ C a ]( c l o s e d )S <> S C a <> S C a 2K 111 C 2a ’ aS C a *S C a 2 *( o p e n )( o p e n )H e r e , m o s t o ft h e b r i e f c h a n n e l o p e n i n g s a r et o t h e m o n o l i g a n d e ds t a t eS C a * ,w h i l e t h e m a j o r i t y o f l o n g o p e n i n g s a r e t o s t a t eS C a 2 * ,w i t h t w o c a l c i u m i o n sb o u n d p e rc h a n n e l .1 8 2T h i s m o d e l p r e d i c t s t h a t t h e r a t i o o f o p e n i n g si n t h e f a s t f i tc o m p o n e n t st ot h e n u m b e r i n t h e s l o wc o m p o n e n t s h o u l d f a l la th i g h e r[ C a2+] i ,a sw a s s e e ne x p e r i m e n t a l l y . H o w e v e r , t h i s s c h e m ed o e s n o t a c c o u n t f o r t h eo b s e r v e di n c r e a s e i nt h e t i m e c o n s t a n t o f t h e s l o w f i tc o m p o n e n t o n r a i s i n g[ C a2+] j .T h e r e a r ean u m b e r o f p o s s i b l e m e c h a n i s m s w h i c hc o u l d p r o d u c e t h i se f f e c t .F i r s t l y ,s t a t eS C a 2 *c o u l d b i n daf u r t h e r c a l c i u mi o n a n d m a k eat r a n s i t i o nt o af u r t h e r o p e ns t a t e ,S C a 3 * ,i n c r e a s i n gt h e o b s e r v e d o p e n t i m e o ft h e l o n g o p e nd i s t r i b u t i o n ( M a g l e b y a n d P a l l o t t a 1 9 8 3 b ) . H o w e v e r ,t h i s w o u l d l i k e l y r e s u l ti no p e n t i m ed i s t r i b u t i o n sr e q u i r i n g t h r e e e x p o n e n t i a l f i t c o m p o n e n t s ,w h i c h w a sn o t o b s e r v e di nt h e p r e s e n t s t u d y . N e i t h e r w a s t h e s l o p e o f t h e o p e np r o b a b i l i t yv e r s u s[ C a2+I ip l o ts t e e pe n o u g ht oi n d i c a t e t h r e e c a l c i u m i o n sw e r e n e e d e dt of u l l ya c t i v a t e e a c h c h a n n e l . A l t e r n a t i v e l y , o n e m a y p o s t u l a t e t h eo c c u r r e n c e o fd i r e c tt r a n s i t i o n s b e t w e e n t h eo p e n s t a t e sS C a *a n dS C a 2 * ,a c c o m p a n i e db yt h el o s s o rg a i n o f c a l c i u m i o n sa sr e q u i r e d . H o w e v e r , t h i s m o d e l p r e d i c t st h a t t h et i m e c o n s t a n t o f t h e f a s t f i t c o m p o n e n t s h o u l d d e c r e a s e a s[ C a2+] ii s r a i s e d . At r e n d o f t h i st y p ew a s s e e n i n t h e p r e s e n td a t a , b u tt h i s d i d n o t r e a c h s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e .T h ei n c r e a s e i n t h e s l o w t i m e c o n s t a n t w i t h[ C a2+] jc o u l d a l s o r e s u l tf r o m t h e o c c u r r e n c e o f v e r y s h o r t l i v e d c l o s e d s t a t e s i n t e r p o s e d b e t w e e ns t a t e sS C a 2a n dS C a 2 * .A t l e a s t o n e o f t h e t r a n s i t i o n s b e t w e e n t h e s e i n t e r p o s e dc l o s e d s t a t e s w o u l dh a v et o b ed e p e n d e n t o n[ C a2+J i ,a n d t h el i f e t i m e o f t h e s es t a t e sw o u l dn e e d t o b e t o ob r i e ft oa l l o w d e t e c t i o n w i t h t h e p r e s e n t r e c o r d i n gs y s t e m . I n t h i s s c h e m e ,c a l c i u m d r i v e n r e o p e n i n g st oS C a 2 *f r o m t h e s e s h o r tl i v e d c l o s e d s t a t e sw o u l d l e a dt oa n a p p a r e n ti n c r e a s e i n t h e m a g n i t u d e o f t h es l o w t i m ec o n s t a n t . F i n a l l y ,as l o w t i m ec o n s t a n t d e p e n d e n t o n[ C a2+] ic a n a l s o1 8 3b eg e n e r a t e db ym o d e l E w h i c h p r o p o s e t h a t i n t r a c e l l u l a rC a2+b o t h a c t i v a t e sa n d b l o c k sK C ac h a n n e l s ( M e t h f e s s e l a n d B o h e i m1 9 8 2 ) . T h e p r e s e n td a t a d on o t a l l o wac l e a r c h o i c et o b em a d eb e t w e e n t h i s m o d e l a n d t h a to ft h es h o r t -l i v e d c l o s e ds t a t e s .B K c h a n n e l s i n r a t s k e l e t a l m u s c l e h a v e b e e n o b s e r v e do c c a s i o n a l l yt oe n t e r a l t e r n a t i v e m o d e s o f g a t i n g i nw h i c h o p e n p r o b a b i l i t i e s m a yb e v e r yd i f f e r e n t f r o m t h e n o r m a l c o n d i t i o n ( M c M a n u sa n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . W h e nl a r g en u m b e r s o f t r a n s i t i o n s a r e a n a l y z e d( > 3 0 , 0 0 0 ) ,i t i s o b s e r v e dt h a t a b o u t9 6 %o ft h e s e f a l l i n t o t h e n o r m a l g a t i n g m o d e , t h e r e m a i n d e r b e i n gd i s t r i b u t e d i n t h es o - c a l l e d i n t e r m e d i a t e o p e n ( 3 . 2 % ) , b r i e f o p e n( 0 . 5 % )a n d b u z zm o d e s ( 0 . 1 % ) .T h el a t e r t h r e e m o d e s r e a l l a s s o c i a t e d w i t ha m u c h b r i e f e r m e a n o p e n t i m et h a n i s s e e n i n t h e n o r m a l g a t i n g m o d e . I n a d d i t i o n , a n a l y s i s o f l a r g en u m b e r s o ft r a n s i t i o n s( u p t o1 0 6 )i n t h e n o r m a l m o d e r e v e a l t h a t o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n si nt h i s m o d e c o n t a i na tl e a s t t h r e e t o f o u r e x p o n e n t i a l c o m p o n e n t s , n o t t h et w od e t e c t e di ne a r l i e rs t u d i e s ( M c M a n u s a n d M a g l e b y 1 9 8 8 ) . I n t h e p r e s e n ts t u d y ,o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s w e r e c a l c u l a t e d f o ru p t o2 0 0 0 t r a n s i t i o n s ,t h i sb e i n gl i m i t e db yt h e l i f e t i m e o f e x c i s e d p a t c h e s , w h i c h r a r e l y e x c e e d e d 2 0 m i n u t e s .F o r t h e s e r e a s o n s , t h e p o s s i b i l i t y t h a t r a r e m o d e s o f g a t i n g a n d a d d i t i o n a lo p e ns t a t e sa l s o e x i s t f o rK ( C a ) Lc h a n n e l s c a n n o tb e e x c l u d e d .4 . 4 . 1 . 3 . V o l t a g ed e p e n d e n c eo fo p e n i n g o fK ( C a ) Lc h a n n e l sT h e p r o b a b i l i t y o f o p e n i n g f o rK ( C a ) Lc h a n n e l s i n c r e a s e d e - f o l df o ra1 4m V m e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n ,w h e n[ C a2+] iw a sa tl o w l e v e l s . A s i m i l a rv o l t a g ed e p e n d e n c y ( e - f o l d f o r 1 1 - 1 6m Vc h a n g e )h a s b e e n r e p o r t e d i n B Kc h a n n e l s s t u d i e d i n r a ts k e l e t a lm u s c l e ( B a r r e t te ta ! . 1 9 8 2 ; M e t h f e s s e l a n d1 8 4B o h e i m 1 9 8 2 ; B l a t z a n dM a g l e b y1 9 8 4 ) , r e n a l e p i t h e l i a l c e l l s ( K o l be ta l .1 9 8 6 )a n d i n c h r o m a f f i n c e l l s ( M a r t y 1 9 8 1 ) ,s e eT a b l e I I . B Kc h a n n e l s i n a n t e r i o rp i t u i t a r y c e l l s a n d i n t o a d s t o m a c h s m o o t h m u s c l e c e l l s s h o was t e e p e rv o l t a g ed e p e n d e n c y( e - f o l d f o r8 - 9m V c h a n g e ( W o n g a n dA d l e r 1 9 8 6 ; L a n g a n d R i t c h i e1 9 8 8 ;S i n g e r a n dW a l s h1 9 8 7 ) .B K c h a n n e l s i n m e s e n t e r i c a r t e r ys m o o t h m u s c l ec e l l s e x h i b i t e d al o w e r v o l t a g e d e p e n d e n c yt h a n s e e n i nK ( C a ) Lc h a n n e l s( e - f o l df o r 3 0m V c h a n g e ) ( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) . V o l t a g e c o u l da l t e r c h a n n e l k i n e t i c sd i r e c t l yb yc h a n g i n g t h e r a t e c o n s t a n t s g o v e r n i n gs t a t et r a n s i t i o n s , o rc o u l da c ti n d i r e c t l y b y c h a n g i n gt h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n o fC a2+a t b i n d i n g s i t e sl o c a t e dp a r tw a yt h r o u g h t h e m e m b r a n e f i e l d ( W o o d h u l l 1 9 7 3 ;B a r r e t te ta l .1 9 8 2 ) .U s i n g B K c h a n n e l s f r o m r a t s k e l e t a l m u s c l e i n c o r p o r a t e d i n t o p l a n a rl i p i d b i l a y e r s ,M o c z y d l o s k i a n d L a t o r r e ( 1 9 8 3 ) f o u n d t h a t t h e v o l t a g ed e p e n d e n c y o f c h a n n e l o p e n i n g c o u l db ee n t i r e l y a c c o u n t e d f o rb yt h e p o t e n t i a l -s e n s i t i v e b i n d i n g o fC a 2 +t os i t e s i nt h em e m b r a n e f i e l d . C a l c u l a t i o ns u g g e s t e dt h a t c a l c i i i m i o n s b i n d t os i t e s w h i c h s e n s e7 5 - 9 5 %o f t h e t o t a l m e m b r a n e f i e l d .S u c h s i t e sc o u l db el o c a t e d i naw i d e , d e e pa t r i u m l e a d i n gt ot h e i o n i c s e l e c t i v i t yf i l t e r , o r c o u l dr e s i d ea t ap a r t o f t h e c h a n n e l n o t d i r e c t l y c o n n e c t e d w i t h i o nt r a n s l o c a t i o n .T h e r e i s e v i d e n c e w h i c h f a v o u r s t h e l a t t e r p o s s i b i l i t y , s i n c eC a2+a c t i v a t i o n s i t e s a r e m o r e s e n s i t i v e t om e m b r a n e s u r f a c e p o t e n t i a l t h a n i s t h eK +c o n d u c t i o np r o c e s s i n t h e s e c h a n n e l s . T h u s ,t h e a d d i t i o n o f n e g a t i v e l y c h a r g e dm e m b r a n e l i p i d s m a r k e d l y i n c r e a s e s t h ea p p a r e n tC a2+s e n s i t i v i t y o fB Kc h a n n e lg a t i n g w h i l e l i t t l e c h a n g e i s s e e n i n t h ep o t a s s i u m p e r m e a b i l i t yo f t h ec h a n n e l ( M o c z y d l o w s k i e ta l . 1 9 8 5 ) .1 8 5I n t h e p r e s e n ts t u d y .m e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o na tc o n s t a n t[ C a2+] ih a dn o e f f e c t o n t h e f a s t t i m e c o n s t a n t o f o p e n t i m e d i s t r i b u t i o n s ,w h i l e i n c r e a s i n gt h e v a l u e o f t h e s l o w t i m e c o n s t a n t . M e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n t h e r e f o r em i m i c k e d t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g[ C a2+] ia t a c o n s t a n t m e m b r a n e v o l t a g e .T h i sr e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e v i e w t h a t t h e v o l t a g ed e p e n d e n c y o fK ( C a ) Lc h a n n e lg a t i n g s i m p l y r e f l e c t s t h e p o t e n t i a l - d e p e n d e n t b i n d i n g o fC a2+t os i t e s o n t h ec h a n n e lc o m p l e x .4 . 4 . 1 . 4 . B l o c k a d e o fK ( C a ) Lc h a n n e l sb yi n t e r n a l l ya p p l i e d T E AI n t e r n a l l y a p p l i e d T E A r e d u c e d t h e a p p a r e n t s i n g l ec h a n n e l c u r r e n t i nK ( C a ) Lc h a n n e l s w i t haK do f0 . 8 3m Ma t+ 4 0 m V m e m b r a n e p o t e n t i a l .A ss h o w n i n T a b l e I I , B K c h a n n e l s i n c h r o m a f f i n c e l l s ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ) , r a t s k e l e t a lm u s c l e ( B l a t z a n d M a g l e b y 1 9 8 4 ) a n dr a b b i t t - t u b u l e c e l l s( V e r g a r a a n d L a t o r r e1 9 8 3 )s h o wam u c h h i g h e rK df o r i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A , v a l u e s b e i n g i n t h er a n g e 2 7 - 6 0 m M . B K c h a n n e l s i n V S M C s f r o m r a b b i t p o r t a l v e i n w e r eu n a f f e c t e d b yi n t e r n a l l y a p p l i e d T E Aa tc o n c e n t r a t i o n su p t o1 0 m M ( I n o u ee ta l . 1 9 8 5 ) . I nm a r k e d c o n t r a s t , B K c h a n n e l s i n c l o n a l a n t e r i o rp i t u i t a r y c e l l s( W o n g a n d A d l e r 1 9 8 6 a n d B K c h a n n e l s f r o m r a tb r a i ns y n a p t o s o m e s ( F a r l e ya n d R u d y 1 9 8 8 ) b o t he x h i b i t v e r y h i g h s e n s i t i v i t yt oi n t e r n a l l ya p p l i e d T E A , w i t hK do f0 . 0 8m M a n d 0 . 8 m M r e s p e c t i v e l y .T h e h i g h s e n s i t i v i t yo fK ( C a ) Lc h a n n e l st ot h eb l o c k i n g e f f e c t o f i n t e r n a lT E A i s u n l i k e l y t o b ea n a r t i f a c tc a u s e d b ye n z y m e t r e a t m e n t o fC V S M C s , s i n c es i m i l a r d i s s o c i a t i o np r o c e d u r e s w e r e e m p l o y e d i n o t h e r s t u d i e s w h i c h d i dn o te x h i b i tt h i s p h e n o m e n o n ( B e n h a me ta ! . 1 9 8 5 ; I n o u ee ta ! . 1 9 8 5 ) .T h e p o s s i b i l i t yt h a t t h e p r e s e n t d a t ar e s u l t e d f r o m i n a d v e r t e n t f o r m a t i o no f o u t s i d e - o u t1 8 6m e m b r a n e p a t c h e sa l s o s e e m s u n l i k e l y , s i n c e t h e r e c o r d i n gp i p e t t e sc o n t a i n e do n l y 0 . 0 1 MC a2+ , i n s u f f i c i e n tt oy i e l d t h e o b s e r v e d c h a n n e l o p e np r o b a b i l i t y ,i f a p p l i e d t o t h ec y t o p l a s m i c m e m b r a n ef a c e .I n t h e c a s e o f t h e A - c u r r e n tK +c h a n n e lc o d e d b yt h e S h a k e rg e n e i nD r o s o p h i l a ,as i n g l e a m i n o a c i d r e s i d u e c r i t i c a l l y a f f e c t s t h e a f f i n i t yo f t h ec h a n n e l f o ri n t e r n a l l ya p p l i e d T E A ( Y e l l e ne ta ! . 1 9 9 1 ) . T h i s r e s i d u el i e s a tp o s i t i o n4 4 1i n t h e s o c a l l e d S S 1 - S S 2 r e g i o n o f t h e c h a n n e l , w h i c h i s h i g h l yc o n s e r v e d a m o n g v o l t a g e - g a t e dK +c h a n n e l s , a n d m a y c r o s s t h em e m b r a n et w i c et of o r m t h e i o n c o n d u c t i n g p o r e i t s e l f ( M a c K i n n o n a n d Y e l l e n 1 9 9 0 ) .W i l dt y p ef l i e s s h o w e d c h a n n e l s w i t hat h r e o n i n e r e s i d u ea tp o s i t i o n 4 4 1 ,a n de x h i b i t e daK df o r i n t e r n a l l y a p p l i e d T E A o fa b o u t 0 . 7m M . T h e m u t a n t T 4 4 1 Sp o s s e s s e das e r i n er e s i d u ea tp o s i t i o n 4 4 1a n d t h eK df o ri n t e r n a l T E A i n c r e a s e db yt e n f o l d a s ar e s u l to ft h i s s i n g l e s u b s t i t u t i o n ( Y e l l e ne ta l . 1 9 9 1 ) .T h es e n s i t i v i t y o f t h e c h a n n e l t oe x t e r n a l l y a p p l i e dT E A w a su n a l t e r e db y t h i sm u t a t i o n . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s w e r e n o tp e r f o r m e do n g e n e c o d i n g f o raK C ac h a n n e l , t h e y d oi l l u s t r a t e t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f T E A a f f i n i t yt oc h a n g e si nt h ep r i m a r y s t r u c t u r e o f p o t a s s i u m c h a n n e l s . I t m a yb er e l e v a n tt on o t e t h a t a l lt h r e e o f t h e c e l l t y p e sw h i c h e x h i b i t B K c h a n n e l s w i t h h i g h i n t e r n a l s e n s i t i v i t yt oT E A a r e d e r i v e df r o mb r a i n t i s s u e , s u g g e s t i n gt h a tas l i g h t l yd i f f e r e n t f o r m o ft h e B K c h a n n e lm a yb ee x p r e s s e d i n t h i s o r g a n .T h ep r e s e n td a t a o n T E Ab l o c k w e r e t r a n s f o r m e di n t oaH i l l p l o tb yr e p l o t t i n g a s l o g ( R / 1 - R ) v e r s u s l o g [ T E A ] , w h e r e R i s t h e r e d u c t i o n i n s i n g l ec h a n n e l c u r r e n t s s e e ni n t h e p r e s e n c eo ft h e d r u g . T h i sp l o t y i e l d e das l o p e o f0 . 8 2 , s u g g e s t i n g t h a t T E Ai n t e r a c t sw i t h t h e c h a n n e l i nao n e - t o - o n e f a s h i o n ,p r e s u m a b l yb yt r a n s i e n t l y e n t e r i n g t h e c h a n n e l a n d b l o c k i n gm o v e m e n t o fK + .1 8 7A n a p p r o x i m a t e v a l u e f o r t h e d w e l l t i m e o f T E Aa ti t s b l o c k i n gs i t e c a nb ed e r i v e df r o m t h eK df o r T E A , w h e r eK d = K - i / K i( B e n h a me ta l . 1 9 8 5 ) .T h e m a x i m u m v a l u e f o . t h e b l o c k i n g r a t e c o n s t a n t , K ] . i sl i m i t e db yt h e d r u gd i f f u s i o n r a t e a n d i s t h o u g h tt o b e a b o u t1 0 8s - iM - i( G u t f r e u n d1 9 7 2 ) . T h u s K -1m a y b ee s t i m a t e da t 8 . 3x 1 0 4s - i a n d h e n c e t h e m e a n b l o c k t i m ew a s a b o u t 1 2s ,o n e o r d e r o fm a g n i t u d et o ob r i e ft o b e d e t e c t e d b y t h e p r e s e n t m e a s u r i n gs y s t e m .T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t T E A b l o c kw a s n o ta c c o m p a n i e db y am a r k e d i n c r e a s e i n c u r r e n t n o i s e i n t h ec h a n n e l ,a ss t u d i e da tab a n d w i d t ho f D C - 2 k H z .T h eb l o c k o fK C ac h a n n e l sb yi n t e r n a l T E A m a yb e e x p e c t e dt o b ev o l t a g e - d e p e n d e n t , s i n c e p o s i t i v e m e m b r a n e p o t e n t i a l s f a v o u r t h e e n t r yo f t h eT E A c a t i o ni n t o t h e c h a n n e l s . H o w e v e r , t h e d e g r e e o f v o l t a g e - d e p e n d e n c yi sg o v e r n e d b yt h e f r a c t i o ’ i o f t h e m e m b r a n e f i e l d s e n s e db yt h e T E A m o l e c u l ea ti t s b i n d i n g s i t e( W o o d h u l l 1 9 7 3 ) . E x p e r i m e n t s p e r f o r m e d o n B Kc h a n n e l s i ns e v e r a l c e l lt y p e sh a v e i n d i c a t e dt h a t b l o c kb y i n t e r n a l T E A i s o n l y w e a k l yv o l t a g e - d e p e n d e n t ,e x h i b i t i n g a n e q u i v a l e n t v a l e n c e o f 0 . 0 6 - 0 . 1 ( Y e l l e n 1 9 8 4 a ;L a n g t o ne ta ! . 1 9 9 1 ; Y e l l e n e ta l . 1 9 9 1 ) . T h e t h e o r e t i c a l m a x i m u m v a l u e o ft h ee q u i v a l e n tv a l e n c e f o ram o n o v a l e n t b l o c k i n gi o n i n t e r a c t i n gi n a 1 : 1 f a s h i o nw i t h t h e c h a n n e l i s1 . 0 ( B e n h a me ta l . 1 9 8 6 ) . T h i s c o r r e s p o n d st oa n e - f o l di n c r e a s ei n a f f i n i t y f o r a 2 5 m Vd e p o l a r i z a t i o n ( Y e l l e ne ta l .1 9 8 4 a ) . L e t i t b ea s s u m e d t h ep r e s e n tK C ac h a n n e l sp o s s e s s aT E A a f f i n i t ya t 0m V m e m b r a n ep o t e n t i a lt y p i c a l o f B K c h a n n e l s s t u d i e d i n s k e l e t a l m u s c l e , i .e .K d ( 0m V )= 3 0m M .I f m e a s u r e da t+4 0 m M , t h eK ds h o u l d s t i l lb e g r e a t e r t h a n 4 m M , e v e n o ft h e e q u i v a l e n t v a l e n c e o f T E Ai sa s s u m e d t o b e 1 . 0 . I t s e e m s u n l i k e l y , t h e r e f o r e ,1 8 8t h a t t h e h i g h s e n s i t i v i t y o fK ( C a ) Lc h a n n e l st oi n t e r n a l T E A i sd u es o l e l yt o av e r ys t e e pv o l t a g e d e p e n d e n c y o f c h a n n e l b l o c k .4 . 4 . 2 . P r o p e r t i e s o fK ( C a ) Ic h a n n e l sI n a d d i t i o nt ot h eK ( C a ) Lc h a n n e l ,aK C ac h a n n e l o f i n t e r m e d i a t ec o n d u c t a n c e ( 1 K c h a n n e l ) w a sd e t e c t e di n t h e m i n o r i t y o f i n s i d e - o u tp a t c h e se x c i s e d f r o m i s o l a t e d C V S M C s . T h i sK ( C a ) Ic h a n n e l s h o w e das i n g l ec h a n n e lc o n d u c t a n c eo f 9 2p Sa n dw a sh i g h l y s e l e c t i v e f o r K+o v e rN a+a n dC s+ .T h i sc h a n n e l w a sa c t i v a t e db yi n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m a n db ym e m b r a n ed e p o l a r i z a t i o n .A p p l i c a t i o n o f T E At ot h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c er e d u c e dt h e c u r r e n ti n t h i s c h a n n e l i nad o s e - d e p e n d e n t f a s h i o n w i t haK do f 0 . 3 1 m M .T h e s e d a t aw e r e r e p l o t t e da s aH i l l p l o t , l o g ( R / 1 - R ) v e r s u s l o g [ T E A ] w h e r e Ri s t h e r e d u c t i o ni n m e a n s i n g l e c h a n n e l c u r r e n tc a u s e d b y ag i v e n c o n c e n t r a t i o no f T E A . T h e s l o p eo ft h i sp l o tw a s 0 . 7 0 ,s u g g e s t i n g t h a t T E A b l o c k s t h i sc h a n n e li nao n e - t o - o n e f a s h i o n , a s s e e nf o r t h eK ( C a ) Lc h a n n e l . N o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n t h eK dv a l u e s f o u n d f o rb l o c ko f t h eK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l s b yi n t e r n a l T E A . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s e c h a n n e l s s h a r eac o m m o ns t r u c t u r e i n t h er e g i o no ft h e T E A b i n d i n g s i t e . I t s e e m s u n l i k e l y , h o w e v e r , t h a tt h eK ( C a ) Ic h a n n e ls i m p l y r e p r e s e n t sac o n d u c t a n c es u b s t a t eo f t h eK ( C a ) Lc h a n n e l ,s i n c e a m p l i t u d e d i s t r i b u t i o n s f o r c u r r e n tf l o w i nb o t h s p e c i e s w e r e w e l lf i t t e d b ys i n g l e G a u s s i a n t e r m s .K C ac h a n n e l s o fi n t e r m e d i a t e c o n d u c t a n c e ( 3 0 - 1 2 0p S )h a v e p r e v i o u s l yb e e nd e t e c t e di naw i d e v a r i e t y o fc e l lt y p e s( L a t o r r ee ta l . 1 9 8 9 ;E d w a r d s a n dW e s t o n 1 9 9 0 ;K o i b 1 9 9 0 ) . 1 K c h a n n e l s o f c o n d u c t a n c e 9 0 - 1 0 0p Sh a v e b e e nr e p o r t e d i n V S M C s i s o l a t e d f r o m r a b b i tp o r t a l v e i n ( I n o u ee t a l . 1 9 8 5 ) a n d f r o m1 8 9h u m a nc y s t i ca r t e r y ( A k b a r a l ie t a l 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , t h e 1 K c h a n n e lr e p o r t e d i nr a b b i tp o r t a l v e i n i s u n a f f e c t e db yT E Aa p p l i e dt ot h e c y t o p l a s m i cm e m b r a n ef a c e , i n m a r k e dc o n t r a s tt ot h e p r e s e n t r e s u l t s( I n o u ee ta l . 1 9 8 5 ) .A n 1 Kc h a n n e l h a sb e e n r e p o r t e d i n a o r t i c s m o o t h m u s c l eo f t h e r a t ,b u tt h i sc h a n n e ls h o w sa c o n d u c t a n c e o f o n l y5 5 p S ,a p p r e c i a b l y l o w e rt h a n t h a t o f t h eK ( C a ) Ic h a n n e l ( S h o e m a k e ra n d W o r r e l l 1 9 9 1 ) . T w ot y p e so f 1 Kc h a n n e l h a v eb e e no b s e r v e d f o l l o w i n g i n c o r p o r a t i o n o fr a t b r a i n s y n a p t o s o m a l p r o t e i n si n t o l i p i db i l a y e r s ( F a r l e y a n dR u d y 1 9 8 8 ) . H o w e v e r , b o t ho f t h e s e c h a n n e l s a r e l i t t l ea f f e c t e db ya p p l i c a t i o n 1 0 m M T E At ot h ec y t o p l a s m i c m e m b r a n e f a c e .4 . 4 . 3 . P h y s i o l o g i c a lr o l e s f o rK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l sT h e l o w a p p a r e n t c a l c i u ms e n s i t i v i t y o f t h eK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l sw o u l d s e e mt op r e c l u d eas i g n i f i c a n tc o n t r i b u t i o n o f t h e s e c h a n n e lt o r e s t i n gp o t a s s i u m c o n d u c t a n c e , s i n c e[ C a2+] ji n u n s t i m u l a t e dv a s c u l a r s m o o t h m u s c l eh a s b e e n e s t i m a t e da s4 0 - 1 3 0 n M ( N a b i k ae ta l . 1 9 8 5 ; T a k a t ae ta ! . 1 9 8 8 ;K u r i y a m ae ta ! . 1 9 8 2 ; p r e s e n ts t u d y ) .H o w e v e r , d u r i n g t h e f u l l yc o n t r a c t e ds t a t e ,v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s m a y s h o w[ C a2+ 1 1v a l u e s a p p r o a c h i n g1 0 M( K u r i y a m a e ta ! . 1 9 8 2 ) . M i c r o m o l a r l e v e l so ff r e ei n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c a na l s ob ea t t a i n e dd u r i n gt h ea c t i o no f c e r t a i n v a s o c o n s t r i c t o r h o r m o n e s , i n c l u d i n ga n g i o t e n s i n I I ( C a p p o n ie ta l . 1 9 8 6 ) .[ C a2+ I il e v e l s i n t h e l o wm i c r o m o l a r r a n g ew o u l ds u f f i c et o a c t i v a t e af e wp e r c e n t o f t h e a v a i l a b l eK ( C a ) Lc h a n n e l sa td e p o l a r i z e dm e m b r a n e p o t e n t i a l s . I t s h o u l db en o t e dt h a t t h e o p e n i n g o f e v e nas m a l l f r a c t i o n o f t h e a v a i l a b l eK ( C a ) Lc h a n n e l s w o u l dm a r k e d l y r e d u c e t h ei n p u t r e s i s t a n c e o f a 3 G O c e l l , a s w e l l a s p r o v i d i n gas t r o n g h y p e r p o l a r i z i n gi n f l u e n c e o n m e m b r a n e p o t e n t i a l . I n a d d i t i o n , i t i s p o s s i b l et h a t l o c a l l yv e r yh i g hc o n c e n t r a t i o n so f[ C a2+] ia r e e s t a b l i s h e d n e a r t h e i n n e r f a c e o fv o l t a g e - s e n s i t i v e1 9 0C a2+c h a n n e l s .I fK C ac h a n n e l s w e r e l o c a t e d c l o s et o t h e s e s i t e s , t h e i rc o n t r i b u t i o nt om e m b r a n e r e p o l a r i z a t i o nd u r i n g t h e a c t i o n p o t e n t i a lc o u l db eg r e a t l ye n h a n c e d ( B e n h a me ta ! . 1 9 8 6 ) . T h e c a l c i u ms e n s i t i v i t y o fK ( C a ) La n dK ( C a ) Ic h a n n e l s m a y a l s ob e e n h a n c e d i n v i v o ,b yt h e p r e s e n c eo f i n t r a c e l l u l a rm o d u l a t o r s s u c ha sM g2+( S q u i r e a n d P e t e r s e n1 9 8 7 ) . F o r t h e s er e a s o n s , i ts e e m s p r o b a b l e t h eK ( C a ) L ,a n d p o s s i b l y a l s oK ( C a ) Ic h a n n e l s p l a y a ni m p o r t a n tr o l e i nt h e r e p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a li n C V S M C s .T h e a c t i o n p o t e n t i a l i n C V S M C s o f i n t a c t r a t b a s i l a ra r t e r i e s h a s b e e ns t u d i e df o l l o w i n gp a r t i a lb l o c k a d eo f p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e sb y e x t e r n a l l ya p p l i e d T E A ( H i r s te ta ! . 1 9 8 6 ) . U n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , t h e s p i k ec o n s i s t s o far a p i d d e p o l a r i z a t i o n o f a b o u t 5 6 m V a m p l i t u d e f o l l o w e db y af a s tr e p o l a r i z a t i o n .T h i si s f o l l o w e db ya n a f t e r - d e p o l a r i z a t i o n o fa b o u t1 3 m V ,l a s t i n g 3 0 0 - 1 0 0 0 m s .I n m o s tc e l l s ,as l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o n o faf e w m i l l i v o l t s i s s e e na tt h e e n do ft h e a c t i o n p o t e n t i a l . B o t h t h e i n i t i a ls p i k e d e p o l a r i z a t i o na n d t h e a f t e r -d e p o l a r i z a t i o nr e q u i r e t h e p r e s e n c e o fC a2+i n t h e b a t h i n g m e d i u m , w h i l e t h es l o w a f t e r - h y p e r p o l a r i z a t i o np r o b a b l y r e f l e c t s a n i n c r e a s e i nK +c o n d u c t a n c e .T h e l a t t e rp o t e n t i a l i s a l s o a b o l i s h e db yr e m o v a l o fC a2+f r o m t h e b a t h i n gm e d i u m , s u g g e s t i n gt h a t i t i s p r o b a b l ym e d i a t e db y aK C ac o n d u c t a n c e . T h i sc o n d u c t a n c e a p p a r e n t l ys e r v e st ot e r m i n a t e t h e a f t e r - d e p o l a r i z a t i o n , w h i c hp r o b a b l y r e f l e c t s t h ee n t r y o f c a l c i u m t h r o u g h n o n - i n a c t i v a t i n gC a2+c h a n n e l s .T h em a j o r i t y o f c a l c i u me n t r y i n t o t h e f i b r e t a k e s p l a c e d u r i n g t h i s a f t e rd e p o l a r i z a t i o np h a s e o f t h e a c t i o np o t e n t i a l ( H i r s te ta l .1 9 8 6 ) . T h e s eo b s e r v a t i o n ss t r o n g l ys u g g e s tt h a tK C ac h a n n e l s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h er e g u l a t i o n o f a c t i o np o t e n t i a l d u r a t i o n a n d o f c a l c i u m e n t r y i n t o c e r e b r o v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e c e l l s .1 9 14 . 5C o n c l u s i o n s a n d s i g n i f i c a n c eA t l e a s t5 0 %o f n e u r o l o g i c a l p a t i e n t s e x h i b i t s i g n so f c e r e b r o v a s u l a rd i s e a s e , o f t e n i n c l u d i n g t h e m a j o r c a t e g o r i e s o f s t r o k e ,a n e u r y s m , m i g r a i n eo rt r a n s i e n t i s c h e m i c a t t a c k ( A d a m s a n d V i c t o r 1 9 8 5 ) . I nt h e h y p e r t e n s i o no f t e na s s o c i a t e d w i t h s t r o k e ,an u m b e r o f a b n o r m a l i t i e sh a v e b e e nd e t e c t e di nc e r e b r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e , i n c l u d i n g i n c r e a s e dm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y ,a l t e r e d m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d e l e c t r o g e n i c p u m p a c t i v i t y , a n d a ni n c r e a s e ds e n s i t i v i t y t o v a s o c o n s t r i c t o r s , i n c l u d i n g s e r o t o n i n( W e b ba n d B o h r 1 9 8 4 ;B o h ra n d W e b b 1 9 8 8 ;M i c h e le ta l . 1 9 9 0 ) . S i m i l a rc h a n g e s h a v e b e e n f o u n dt oo c c u ri n a t h e r o m aa n d d u r i n g t h e n o r m a l a g i n g p r o c e s s ( M i c h e le t a l . 1 9 9 0 ; M i c h e l1 9 8 7 ) . A t h e r o s c l e r o t i c d a m a g e t o t h e e n d o t h e l i a l l a y e r o f c e r e b r a l v e s s e l sp r o b a b l y e x a c e r b a t e s h y p e r s e n s i t i v i t y o f s m o o t h m u s c l et os e r o t o n i n . T h i s i sb e c a u s et h e e n d o t h e l i u m n o r m a l l y p r o d u c e s E D R F , w h i c h m e d i a t e se n d o t h e l i u m - d e p e n d e n tv a s o d i l a t i o n ( B u r n s t o c k , 1 9 9 0 ) a n d p r o s t a c y c l i n ,w h i c hi n h i b i t s p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ( M o n c a d ae ta l . 1 9 7 6 ) . E n d o t h e l i a lc e l l s a l s oc o n t r i b u t et ot h e d e g r e i a t i o n o fs e r o t o n i nb ym o n o a m i n eo x i d a s e ( P e a c he ta l .1 9 8 5 ) .T h e e n h a n c e d r e s p o n s i v e n e s s o f V S M C s t o s e r o t o n i n m a y c o n t r i b u t et oa r t e r i a l s p a s m i n v i v o( B e a m i s he ta l . 1 9 8 4 ) .C e r e b r a l v a s o s p a s m d e v e l o p s i n m o s t p a t i e n t s f o l l o w i n g r u p t u r eo f a ni n t r a c r a n i a la n e u r y s m . T h i s p h e n o m e n o n i so fg r e a t c l i n i c a li m p o r t a n c e , s i n c et h e r e s u l t i n g i s c h e m i a c a n g r e a t l y c o m p o u n d t h e n e u r o l o g i c a l d a m a g e d o n eb yt h e i n i t i a l h e m o r r h a g e , a n d m a y p r o v e f a t a l ( S t e e l ee ta l . 1 9 9 1 ) . I na n a n i m a lm o d e l o f c e r e b r a l v a s o s p a s m , e v i d e n c e h a s b e e n f o u n d f o rd e p o l a r i z a t i o n a n di n c r e a s e d a c t i o n p o t e n t i a l a c t i v i t y i n V S M C s o f t h e b a s i l a ra r t e r y . T h e s e1 9 2c h a n g e s a p p e a r e dt or e s u l t f r o md e c r e a s e d p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e i n t h e c e l l s .T h e o b s e r v e d v a s o s p a s m c o u l db ep a r t i a l l y s u p r e s s e db y a p p l i c a t i o n o ft h ep o t a s s i u m c h a n n e l o p e n e r n i c o r a n d i l ( W a t e r s a n d H a r d e r1 9 8 5 ; H a r d e re t a l .1 9 8 7 ) . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n gv a s o d i l a t i o nb yp o t a s s i u mc h a n n e lo p e n e r s r e m a i n s as u b j e c t t oc o n t r o v e r s y . C r o m a k a l i m h a s b e e nc l a i m e dt oa c t i v a t eK C ac h a n n e l s i n V S M C si s o l a t e d f r o m r a b b i t a o r t a ( K r e y ee ta ! .1 9 8 7 )a n d f r o m g u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y( N a k a o e ta ! .1 9 8 8 ) . H o w e v e r , S t a n d e ne ta ! . ( 1 9 8 9 ) a t t r i b u t e d t h e v a s o d i l a t o r y a c t i o n o f c r o m a k a l i mo n t h e l a t t e rp r e p a r a t i o n t o a c t i v a t i o n o fK A T pc h a n n e l s . T h e r e l a x a t i o no f i n t a c td o gc e r e b r a l a r t e r i e sb yc r o m a k a l i m h a sa l s o b e e n a t t r i b u t e dt oa c t i v a t i o no f K A T p ,r a t h e r t h a nt oK C ac h a n n e l s ( M a s u z a w ae ta l .1 9 9 0 ) .I n v i e w o f t h e g r e a t c l i n i c a l i m p o r t a n c e o f c e r e b r o v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e , a n d o f t h e u r g e n t n e e d f o r r a t i o n a l a n d e f f e c t i v e m e a n s o f p r e v e n t i n ga r t e r i a l s p a s m , i t i s i m p e r a t i v e t h a t t h e p o t a s s i u m c o n d u c t a n c e s o f C V S M C sb ew e l l u n d e r s t o o d . T h ep r e s e n ts t u d y h a sc o n t r i b u t e dt ot h i sg o a lb yd e v e l o p i n gap r e p a r a t i o n i n w h i c ht o s t u d yt h e b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s o fK C ac h a n n e l s i nc e r e b r o v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l l s . T h e m o d u l a t i o n o f t h e s e c h a n n e l sb yc l i n i c a l l y i m p o r t a n t d r u g s a n d b yp h y s i o l o g i c a l s t i m u l i c a n a l s ob e s t u d i e d i n t h ep r e s e n ti nv i t r o p r e p a r a t i o n .1 9 3R E F E R E N C E SA d a m s , P .R . , C o n s t a n t i , A . , B r o w n , D . A . a n d C l a r k , R . B . ( 1 9 8 2 ) .I n t r a c e l l u l a rC a2+a c t i v a t e saf a s t v o l t a g e - s e n s i t i v eK +c o n d u c t a n c e i nv e r t e b r a t e s y m p a t h e t i cn e u r o n e s .N a t u r e , 2 9 6 : 7 4 6 - 7 4 9 .A d a m s , R . D . a n d V i c t o r , M . ( 1 9 8 5 ) . P r i n c i p l e s o f N e u r o l o g y . M c g r a w - H i l l ,N e wY o r k .A d e i s t e i n ,R .S .a n d S e l l e r s ,J .R . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t so f c a l c i u m o n v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e c o n t r a c t i o n . A m .3 .C a r d i o l . 5 9 : 4 B - 1 O B .A d r i a n ,R . H . ( 1 9 6 9 ) . R e c t i f i c a t i o n i n m u s c l e m e m b r a n e . P r o g .B i o p h y s . M o l e c .B i o l . 1 9 : 3 4 0 - 3 9 6 .A k b a r a l i , H . , N a k a j a m a , T . , W y s e , D .G .a n d G i l e s ,W .( 1 9 9 0 ) .C a2+ - a c t i v a t e d K +c u r r e n t s i n s m o o t hm u s c l e . C a n a d i a nJ .P h y s i o l . P h a r m a c o l .6 8 : 1 4 8 9 - 1 4 9 4 .A r m s t r o n g ,C .M .( 1 9 7 1 ) . I n t e r a c t i o n o ft e t r a e t h y l a m m o n i u m i o n d e r i v a t i v e s w i t ht h e p o t a s s i u mc h a n n e l s o f g i a n t a x o n s .J .G e n . P h y s i o l .5 8 : 4 1 3 - 4 3 7 .A s h i d a ,T . , S c h a e f f e r ,J . ,G o l d m a n , W . F . ,W a d e , J .B . , a n d B l a u s t e i n ,M . P . ( 1 9 8 8 ) .R o l e o f s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m i n a r t e r i a l c o n t r a c t i o n :C o m p a r i s o n o f r y a n o d i n e ’ se f f e c t i nac o n d u i t a n d am u s c u l a ra r t e r y . C i r c . R e s . 6 2 : 8 5 4 - 8 6 3 .A v e n e t , P . ,H o f m a r m , F . a n d L i n d e m a n n , B . ( 1 9 8 7 ) . C l o s u r e o f K - c h a n n e l sb yc A M P - d e p e n d e n tp h o s p h o r y l a t i o n i n i s o l a t e dt a s t er e c e p t o r c e l l s f r o m t h ef r o gt o n g u e .P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : R 3 5 .B a n k s , B . E .C . ,B r o w n ,C . ,B u r g e s s ,G . M . ,B u r n s t o c k ,G . , C l a r e t , M . , C o c k s , T . a n dJ e n k i n s o n , D .H . ( 1 9 7 9 ) . A p a m i n b l o c k s c e r t a i n n e u r o t r a n s m i t t e r - i n d u c e d i n c r e a s e si np o t a s s i u m p e r m e a b i l i t y .N a t u r e2 8 2 : 4 1 5 - 4 1 7 .B a r a b a n , 3 . M .S n y d e r ,S .H . a n d A l g e r , B . E . ( 1 9 8 5 ) . P h o r b o l e s t e r e f f e c t s o nn e u r o t r a n s m i s s i o n :i n t e r a c t i o n w i t h n e u r o t r a n s m i t t e r s a n d c a l c i u m i n s m o o t hm u s c l e . P r o c .N a t n . A c a d . S c i .U . S .A . 8 2 : 2 5 3 8 - 2 5 4 2 .B a r r e t t ,E . F . a n d B a r r e t t , ‘ . N . ( 1 9 7 6 ) . S e p a r a t i o n o f t w o v o l t a g e - s e n s i t i v ep o t a s s i u mc u r r e n t s a n d d e m o n s t r a t i o n o f t e t r o d o t o x i n - r e s i s t a n t c a l c i u m c u r r e n t i nf r o gm o t o n e u r o n s .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 5 5 : 7 3 7 - 7 7 4 .B a r r e t t , J .N . , B a r r e t t , E . F .a n d D r i b i n .L .B . ( 1 9 8 1 ) .C a l c i u m - d e p e n d e n ts l o wp o t a s s i u m c o n d u c t a n c e i n r a t s k e l e t a l m y o t u b e s . D e v .B i o l .8 2 : 2 5 8 - 2 6 6 .B a r r e t t , J . N . ,M a g l e b y , K . L . , P a l l o t t a , B .S .( 1 9 8 2 ) . P r o p e r t i e s o f s i n g l e c a l c i u m -a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l si n c u l t u r e d r a t m u s c l e .JP h y s i o l . ( L o n d )3 31 : 2 1 1 - 2 3 0 .B e a m i s h , R . E . , K a r m z y n ,M . , P a n a c i a .V .a n d D h a l i a N .5 .( 1 9 8 4 ) . M e c h a n i s m s o fc o r o n a r ys p a s m i n s t r e s s - i n d u c e d h e a r t d i s e a s e , i n S m o o t h M u s c l e C o n t r a c t i o n .e d .S t e p h e n s ,N . L . M a r c e l D e k k e rI n c .N e w Y o r k a n dB a s e l. p 5 Y 7 - S S O1 9 4B e n h a m ,C .D . a n d B o l t o n , T . B . ( 1 9 8 3 ) . P a t c h - c l a m p s t u d i e s o f s l o w p o t e n t i a l -s e n s i t i v e p o t a s s i u m c h a n n e l s i n l o n g i t u d i n a l s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i tj e j u n u m .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 4 0 : 4 6 9 - 4 8 6 .B e n h a m ,C .D . , B o l t o n , T . B . a n d L a n g , R .J .( 1 9 8 4 )M e m b r a n e p o t e n t i a l a n dv o l t a g e c l a m p r e c o r d i n g f r o m s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i tj e j u n u m .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 3 : 6 7 P .B e n h a m ,C .D . , B o l t o n , T . B . , D e n b i g h ,J . S .a n d L a n g , R .J .( 1 9 8 7 ) .I n w a r dr e c t i f i c a t i o ni n f r e s h l y i s o l a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s o f t h e r a b b i tj e j u n u m . J . P h y s i o l .( L o n d . ) 3 8 3 : 4 6 1 - 4 7 6 .B e n h a m ,C .D . ,B o l t o n , T . B . , L a n g , K .J . ,T a k e w a k i , T . ( 1 9 8 5 ) . T h e m e c h a n i s m so fa c t i o n o f B a2+a n d T E A o n s i n g l eC a2+- a c t i v a t e d K+c h a n n e l s i n a r t e r i a l a n di n t e s t i n a l s m o o t hm u s c l e c e l l m e m b r a n e . P f l u g e r s A r c h .4 3 0 ;1 2 0 - 1 2 7 .B e n h a m , C .D . , B o l t o n , T . B . , L a n g , R .J .a n d T a k e w a k i , T . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m -a c t i v a t e d p o t a s s i u mc h a n n e l s i n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s o f r a b b i t j e j u n u m a n dg u i n e a - p i g m e s e n t e r i c a r t e r y . J .P h y s i o l . ( L o n d . )3 71 : 4 5 - 6 7 .B e r g e r ,W . ,G r y g o r c y k , R . , S c h w a r z , W . ( 1 9 8 4 ) .S i n g l e K + c h a n n e l si n m e m b r a n ee v a g i n a t i o n so f s m o o t h m u s c l e c e l l s . P f l u g e r s A r c h . 4 0 2 : 1 8 - 2 3 .B e r k , B .C .a n d A l e x a n d e r ,R .W .( 1 9 9 0 ) . V a s o a c t i v e e f f e c t s o f g r o w t h f a c t o r s .B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 8 : 2 1 9 - 2 2 5 .B e r r i d g e , M . T . a n dI r v i n e , R . F . ( 1 9 8 9 ) . I n o s i t o l p h o s p h a t e sa n dc e l l s i g n a l l i n g .N a t u r e 3 4 1 : 1 9 7 - 2 0 5 .B e z a n i l l a , F . , D i P l o l ,P .R . , C a p u t o , C . ,R o j a s , H .a n d T o r r e s , M . E . ( 1 9 8 5 ) . Kc u r r e n t i n s q u i da x o n i s m o d u l a t e db yA T P . B i o p h y s .J .4 7 : 2 2 2 a .B l a t z , A . L . a n dM a g l e b y , K . L . ( 1 9 8 6 ) . S i n g l ea p a m i n - b l o c k e d C a - a c t i v a t e d K +c h a n n e l so f s m a l l c o n d u c t a n c ei n c u l t u r e d r a t s k e l e t a l m u s c l e . N a t u r e 3 2 3 : 7 1 8 - 7 2 0 .B l a t z , A . L . ,M a g l e b y , K . L .( 1 9 8 4 ) . I o n c o n d u c t a n c e a n d s e l e c t i v i t y o f s i n g l ec a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l s i nc u l t u r e d r a t m u s c l e .J .G e n . P h y s i o l . 8 4 : 1 -2 3 .B o h r , F D . a n d W e b b , C .( 1 9 8 8 ) .V a s c u l a r s m o o t h m u s c l e m e m b r a n e i nh y p e r t e n s i o n .A n n u . R e v .P h a r m a c o l . T o x i c o l . 2 8 : 3 8 9 - 3 0 9 .B o l t o n , T . ( 1 9 7 9 ) .M e c h a n i s m s o fa c t i o n o f t r a n s m i t t e r s a n d o t h e r s u b s t a n c e s o ns m o o t hm u s c l e . P h y s i o l . R e v .5 9 : 6 0 6 - 7 1 8 .B o l t o n , T . B .( 1 9 7 2 ) . T h e d ’ p o l a r i z i n ga c t i o n o f a c e t y i c h o l i n e o f c a r b a c h o l i ni n t e s t i n a l s m o o t hm u s c l e . J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 2 0 : 6 4 7 - 6 7 1 .B o l t o n , T . B . ,L a n g , R .J .a n dT a k e w a k i , T . ( 1 9 8 4 ) . M e c h a n i s m s o f a c t i o n o fn o r a d r e n a l i n ea n d c a r b a c h o l o ns m o o t h m u s c l e o f g u i n e a - p i g a n t e r i o r m e s e n t e r i ca r t e r y .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 51 : 5 4 9 - 5 7 2 .1 9 5B o l t o n , T .B . ,L a n g , R .J . ,T a k e w a k i , T .a n dB e n h a m ,C .D . ( 1 9 8 5 ) . P a t c h a n d w h o l e -c e l l v o l t a g e c l a m p o f s i n g l em a m m a l i a nv i s c e r a l a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s .E x p e r i e n t i a 4 1 : 8 8 7 - 8 9 4 .B o l t o n , T . B . ,L a n g ,R .J . ,T a k e w a k i ,T . a n d B e n h a m ,C .D . ( 1 9 8 6 ) . P a t c ha n d w h o l e -c e l l v o l t a g e - c l a m p s t u d i e s o n s i n g l e s m o o t h m u s c l e c e l l s .J . C a r d i o v a s c u l a r . P h a r .8 ( S u p p l . 8 ) : S 2 0 - S 2 4 .B o n d , M . ( 1 9 8 8 ) . E l e v a t e d c e l l u l a r c a l c i u m i n d i s e a s es t a t e s : c a u s e o r e f f e c t ? C e l lC a l c i u m9 : 2 0 1 - 2 0 3 .B r a d l e y , P . B . , H u m p h r e y , P .P .A . , a n dW i l l i a m s ,R . H . ( 1 9 8 6 ) . E v i d e n c e f o r t h ee x i s t e n c e o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e r e c e p t o r s , w h i c h a r e n o t o f t h e5 - H T 2t y p e ,m e d i a t i n g t h e c o n t r a c t i o n o fr a b b i ti s o l a t e d b a s i l a r a r t e r y . B r .J .P h a r m a c o l . 8 7 : 3 - 4 .B r a y d e n ,J .E . , Q u a y l e ,J .M . , S t a n d e n , N . B . a n d N e l s o n M . T . ( 1 9 9 1 ) . R o l e o fp o t a s s i u m c h a n n e l s i n t h ev a s c u l a rr e s p o n s e o f e n d o g e n o u s a n d p h a r m a c o l o g i c a lv a s o d i l a t o r s . B l o o dV e s s e l s 2 8 : 1 4 7 - 1 5 3 .B r i s m a r , T . a n d C o l l i n s ,V .P . ( 1 9 8 9 ) . I n w a r d r e c t i f y i n g p o t a s s i u m c h a n n e l s i nh u m a nm a l i g n a n t g l i o m a c e l l s . B r a i n R e s . 4 8 0 : 2 4 9 - 2 5 8 .B r o w n , D . A .( 1 9 8 8 ) . M - c u r r e n t s : a nu p d a t e .T r e n d s N e u r o s c i .1 1 : 2 9 4 - 2 9 9 .B r o w n , D . A . a n d A d a m s , P .R .( 1 9 8 0 ) . M u s c a r i n i c s u p p r e s s i o n o fan o v e l v o l t a g e -s e n s i t i v eK +- c u r r e n t i nav e r t e b r a t e n e u r o n e . N a t u r e 2 8 3 - 6 7 3 - 6 7 6 .B r u s c h i ,G . ,B r u s c h i , M . E . , R e g o l i s t i ,G .a n d B o r g h e t t e , A . ( 1 9 8 8 ) . M y o p l a s m i cC a2+- f o r c er e l a t i o n s h i p s s t u d i e d w i t h f u r a - 2 d u r i n g s t i m u l a t i o n o f r a t a o r t i c s m o o t hm u s c l e . A m .J .P h y i o l . 2 4 5 : H 8 4 0 - H 8 5 4 .B r y a n t ,H .J . ,H a r d e r , D . R . ,P a m n a n i ,M .B . a n d H a d d y , F .J .( 1 9 8 5 ) . I n v i v om e m b r a n e p o t e n t i a l so f s m o o t h m u s c l e c e l l s i n t h e c a u d a l a r t e r y o f t h e r a t . A m .J .P h y s i o l . 2 4 9 : C 7 8 - C 8 3 .B u l b r i n g , E . a n dT o m i t a ,T .( 1 9 6 9 ) . I n c r e a s e o f m e m b r a n e c o n d u c t a n c eb ya d r e n a l i n e i nt h e s m o o t h m u s c l e o fg u i n e a - p i g t a e n i a c o l i . P r o c . R .S o c . L o n d . B ,1 7 2 : 8 9 - 1 0 2 .B u l b r i n g ,E . a n d T o m i t a , T .( 1 9 8 7 ) C a t e c h o l a m i n e a c t i o n o n s m o o t h m u s c l e .P h a r m a c . R e v . 3 9 ; 4 9 - 9 6 .B u r n s t o c k ,0 .( 1 9 8 6 ) .T h e f i r s t v o n E u l e r L e c t u r ei n P h y s i o l o g y : T h e c h a n g i n g f a c eo fa u t o n o m i c n e u r o t r a n s m i s s i o n .A c t a . P h y s i o l . S c a n d . 1 2 : 6 7 - 9 1 .B u r n s t o c k , 0 .( 1 9 9 0 ) . L o c a lm e c h a n i s m s o f b l o o d f l o w c o n t r o lb yp e r i v a s c u l a rn e r v e s a n d e n d o t h e l i u m .J o u r n a l o f H y p e r t e n s i o n . 8( s u p p l 7 ) : S 5 9 - S 1 6 0 .B u r t o n , F .L . a n d H u t t e r , O . F .( 1 9 9 0 ) . S e n s i t i v i t yt of l o w o f i n t r i n s i c g a t i n g i ni n w a r d l yr e c t i f y i n g p o t a s s i u mc h a n n e l f r o m m a m m a l i a n s k e l e t a l m u s c l e .3 .P h y s i o l .( L o n d . ) 4 2 4 : 2 5 3 - 2 6 1 .1 9 6C a f f r e y , J . M . ,J o s e p h s o n , I . R . a n d B r o w n , A . M . ( 1 9 8 6 ) . C a l c i u m c h a n n e l s o fa m p h i b i a n s t o m a c h a n d m a m m a l i a n a o r t a s m o o t h m u s c l e c e l l s . B i o p h y s .J .4 9 : 1 2 3 7 -1 2 4 2 .C a l l e w a e r t , G . ,V e r e e c k e ,J .a n d C a r m e l i e t , E . ( 1 9 8 6 ) . E x i s t e n c e o fac a l c i u m -d e p e n d e n t p o t a s s i u mc h a n n e l i n t h e m e m b r a n eo f c o w c a r d i a c P u r k i n j e c e l l s .P f l u g e r s A r c h .4 0 6 : 4 2 4 - 4 2 6 .C a p p o n i , A . M , L e w P . D . a n d V a l l o t t o n M . B . ( 1 9 8 6 ) . C u l t u r e d v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s : A m e t h o d f o r m e a s u r i n g c h a n g e s i nc y t o s o l i cf r e e c a l c i u mi n d u c e db yv a s o c o n s t r i c t o r h o r m o n e s .J .C a r d i o v a s c u l a r P h a r m .8 ( S u p p l . 8 ) : S 1 3 6 - 1 3 8 .C a p p o n i , A .M . , L e w , P . D . ,a n dV a l l o t t o n , M . B .( 1 9 8 7 ) . E f f e c t o f s e r o t o n i n o nc y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i n a d r e n a l g l o m e r u l o s a a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s .E u r .J .P h a r m a c o l . 1 4 4 :5 3 - 6 0 .C a r l , A . ,M c h a l e , N .G . ,P u b l i c o v e r , N .G .a n d S a n d e r s , K . M . ( 1 9 9 0 ) .P a r t i c i p a t i o no fC a2+- a c t i v a t e dK +c h a n n e l si ne l e c t r i c a l a c t i v i t yo fc a n i n e g a s t r i c s m o o t hm u s c l e .J .P h y s i o l . ( L o n d . )4 2 9 : 2 0 5 - 2 2 1 .C e c c h i , X . ,A l v a r e z ,0 .a n d W o l f f , D . ( 1 9 8 6 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o fac a l c i u m -a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e lf r o m r a b b i t i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l ei n c o r p o r a t e d i n t op l a n a r b i l a y e r s . J .M e m b r . B i o l . 9 1 : 1 1 - 1 8 .C h a n g ,J .a n dO w m a n ,C .( 1 9 8 7 ) . I n v o l v e m e n t o f s p e c i f i c r e c e p t o r s a n d c a l c i u mm e c h a n i s m s i n s e r o t o n e r g i cc o n t r a c t i l er e s p o n s e o f i s o l a t e d c e r e b r a l a n dp e r i p h e r a la r t e r i e s f r o m r a t s .J .P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 4 2 : 6 2 9 - 6 3 6 .C h a n g ,3 .Y . , O w m a n ,C .a n d S t e i n b u s c h , H .W .( 1 9 8 8 ) . E v i d e n c e f o r c o e x i s t e n c e o fs e r o t o n i na n d n o r a d r e n a l i n e i n s y m p a t h e t i c n e r v e s s u p p l y i n g b r a i n v e s s e l s o f g u i n e ap i g . B r a i nR e s e a r c h . 4 3 8 : 2 3 7 - 2 4 6 .C h r i s t e n s e n , 0 .a n d Z e u t h e nT . ( 1 9 8 7 ) .M a x iK ± c h a n n e l s i n l e a k y e p i t h e l i a a r er e g u l a t e d b yi n t r a c e l l u l a rC a+ ,p H a n d m e m b r a n e p o t e n t i a l . P f l u g e r s A r c h .4 0 8 : 2 4 9 - 2 5 9 .C l a r k e , R . B . ,N a k a j i m a , T . , G i l e s , W . , K a n a i , K . , M o m o s e , Y . a n d S z a b o ,G .( 1 9 9 0 ) .T w o d i s t i n c t t y p e so f i n w a r J l y r e c t i f y i n gK +c h a n n e l s i n b u l l - f r o g a r t e r i a l m y o c y t e s .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 4 : 2 2 9 - 2 5 1 .C o c k s , T .M . , A n g u s ,J .A . ( 1 9 8 4 ) . E n d o t h e l i u m - d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b l o o dv e s s e lr e a c t i v i t y . I n T h eP e r i p h e r a l C i r c u l a t i o n ,e d . S .H u n y o r ,3 .L u d b r o o k ,J . S h a w ,M . M c G r a t h ,p p .9 - 2 1 . N e w Y o r k : E l s e v i e r .C o h e n , M .L . a n d C o l b e r t , W . E . ( 1 9 8 6 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n r e c e p t o r s m e d i a t i n gs e r o t o n i n ( 5 - H T )c o n t r a c t i o n s i n t h e c a n i n e b a s i l a r a r t e r yt o5 - H T 1 , 5 - H T 2a n d r a ts t o m a c hf u n d u s 5 - H T r e c e p t o r s .3 .P h a r m a c o l . E x p . T h e r . 2 3 7 : 7 1 3 - 7 1 8 .C o l e , W . C .a n d S a n d e r s , K . M .( 1 9 8 9 ) .Gp r o t e i n s m e d i a t e s u p p r e s s i o n o fC a2+a c t i v a t e dK +c u r r e n tb ya c e t y l c h o l i n e i n s m o o t h m u s c l e c e l l s . A m .3 .P h y s i o l .2 5 7 : C 5 9 6 - C 6 0 0 .1 9 7C o i q u h o u n , D . a n d S i g w o r t h , F . J . ( 1 9 8 3 ) . F i t t i n g a n d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f s i n g l e -c h a n n e l r e c o r d s , i n S i n g l e - C h a n n e l R e c o r d i n g .( e d )S a k m a n n , B .&N e h e r , E .P l e n u m , N e Y o r kp p1 9 1 - 2 6 4 .C o n n , P .J .a n d S a n d e r s - B u s h , E . ( 1 9 8 7 ) . C e n t r a l s e r o t o n i n r e c e p t o r s :e f f e c t o rs y s t e m s , p h y s i o l o g i c a l r o l e s a n d r e g u l a t i o n . P s y c h o p h a r m a c o l o g y .9 2 : 2 6 7 - 2 7 7 .C o n n o r ,3 .A . a n d S t e v e n s ,C .F . ( 1 9 7 1 ) .V o l t a g e - c l a m p s t u d i e s o fat r a n s i e n to u t w a r d m e m b r a n e c u r r e n t i n g a s t r o p o d n e u r a l s o m a t a .3 .P h y s i o l .( L o n d . ) , 2 1 3 : 3 1 -5 3 .C o n s t a n t i , A . , A d a m s , P . R . a n dB r o w n ,D . A . ( 1 9 8 1 ) . W h y d o b a r i u m i o n s i m i t a t ea c e t y i c h o l i n e ?B r a i n R e s . 2 0 6 : 2 4 4 - 2 5 0 .C o n t i , F . a n dN e h e r ,E .( 1 9 8 0 ) . S i n g l e c h a n n e l r e c o r d i n g s o f K +c u r r e n t s i n s q u i da x o n s . N a t u r e 2 8 5 : 1 4 0 - 1 4 3 .C o o k , D . L . ,I k e u c h i , M . a n d F u j i m o t o ( 1 9 8 4 ) . L o w e r i n g o f p H i n h i b i t sC a2 + -a c t i v a t e dK +c h a n n e l s i np a n c r e a t i cB - c e l l s . N a t u r e 3 1 1 : 2 6 9 - 2 7 3 .C o o k , N .S .a n d H a y l e t t , D . G . ( 1 9 8 5 ) . E f f e c t s o f a p a m i n , q u i n i n e a n dn e u r o m u s c u l a rb l o c k e r s i n c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n g u i n e a - p i gh e p a t o c y t e s . 3 .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 8 - 3 7 3 - 3 9 4 .C o r n e j o , M . ,G u g g i n o ,S .E . a n d G u g g i n o ,W .B . ( 1 9 8 7 ) . M o d i f i c a t i o n o fC a2+ -a c t i v a t e dK +c h a n n e l si n c u l t u r e d m e d u l l a r y t h i c k a s c e n d i n g l i m b c e l l sb yNb r o m o a c e t a m i d e . 3 .M e m b r . B i o l . 9 9 : 1 4 7 - 1 5 5 .C r e p e l , F . a n dP e n i t - S o r i a ,J .( 1 9 8 6 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n a n d l o w t h r e s h o l d c a l c i u mc o n d u c t a n c ei n r a t c e r e b e l l a rp u r k i n j e c e l l s .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 7 2 : 1 - 2 3 .D e C l e r c k , F . , a n dD a v i d ,J .L . ( 1 9 8 1 ) . P h a r m a c o l o g i c a lc o n t r o l o fp l a t e l e t a n d r e db l o o dc e l l f u n c t i o n i n t h em i c r o c i r c u l a t i o n .3 .C a r d i o v a s c . P h a r m a c o l . 3 : 1 3 8 8 - 1 4 1 2 .D i g l i o ,C . A . ,G r a m m a s , P . ,G i a c o m e l l i ,F . ,a n d W i e n e r ,J .( 1 9 8 6 ) . R a t c e r e b r a ln i i c r o v a s c u l a r s m o o t hc e l l s i n c u l t u r e .J .C e l l . P h y s i o l . 1 2 9 : 1 3 1 - 1 4 1 .D o y l e , V . M . ,C r e b a , J . A . , R u e g g , U . T .a n d H o y e r , D . ( 1 9 8 6 ) . S e r o t o n i n i n c r e a s e st h e p r o d u c t i o no f i n o s i t o lp h o s p h a t e s a n d m o b i l i z e s c a l c i u m v i a t h e5 - H T 2r e c e p t o ri nA 7 r 5 s m o o t hm u s c l e c e l l s . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ sA r c h . P h a r m a c o l .3 3 3 : 9 8 -1 0 3 .E d v i n s s o n , L . , D e g u e u r c e ,A . , D u v e r g e r , D . , M a c k e n z i e , E .T . , S c a t t o n , B . a n dU d d m a n , R .( 1 9 8 4 ) . C o u p l i n g b e t w e e n c e r e b r a lb l o o d f l o w a n d m e t a b o l i s m : A r o l ef o r s e r o t o n i n ?I n n e u r o t r a r s m i t t e r s a n d t h ec e r e b r a l c i r c u l a t i o n . E d i t e db yM a c K e n z i e , E . T . , S e y l e s , J .a n d B e s , A .p p .1 2 1 - 1 3 6 , R a v e nP r e s s ,N e w Y o r k .E d w a r d s , F . R . a n dH i r s t ,G .D .S .( 1 9 8 8 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o ni n s u b m u c o s a la r t e r i o l e so f g u i n e a - p i g i l e u m . J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 0 4 : 4 3 7 - 4 5 4 .E d w a r d s , F .R . , H i r s t ,G .D . S .a n d S i i v e r b e r g ,G .D . ( 1 9 8 8 ) . I n w a r d r e c t i f i c a t i o n i nr a tc e r e b r a l a r t e r i o l e s :i n v o l v e m e n t o f p o t a s s i u m i o n s i n a u t o r e g u l a t i o n ,J .P h y s i o l .( L o n d . ) 4 0 4 : 4 5 5 - 4 6 6 .1 9 8E d w a r d s ,0 .a n dW e s t o n , A . H . ( 1 9 9 0 ) .P o t a s s i u m c h a n n e lo p e n e r sa n d v a s c u l a rs m o o t h m u s c l er e l a x a t i o n . P h a r m a c . T h e r .4 8 : 2 3 7 - 2 5 8 .E w a l d , D . A . , W i l l i a m s ,A .a n dL e v i t a n , I . B .( 1 9 8 5 ) .M o d u l a t i o n o fs i n g l eC a2+ -d e p e n d e n t K + - c h a n n e la c t i v i t yb yp r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n . N a t u r e3 1 5 : 5 0 3 - 5 0 6 .F a r l e y ,3 .a n d A u e r b a c h ,S .( 1 9 8 6 ) . P r o t e i nk i n a s eCa c t i v a t i o ni n d u c e sc o n d u c t a n c ec h a n g e si nH e r m i s s e n d ap h o t o r e c e p t o r sl i k e t h o s e s e e ni n a s s o c i a t i v el e a r n i n g .N a t u r e3 1 9 : 2 2 0 - 2 2 3 .F a r l e y ,J .a n d R u d y , B .( 1 9 8 8 ) . M u l t i p l et y p e s o fv o l t a g e - d e p e n d e n tC a - a c t i v a t e d Kc h a n n e l so f l a r g ec o n d u c t a n c e i nr a t b r a i ns y n a p t o s o m a lm e m b r a n e s .B i o p h y s .J .5 3 : 9 1 9 - 9 3 4 .F e n w i c k ,E . M . , M a r t y ,A .a n dN e h e r , E . ( 1 9 8 2 ) .S o d i u m a n dc a l c i u mc h a n n e l si nb o v i n ec h r o m a f f i nc e l l s .J .P h y s i o l( L a n d . )3 31 : 5 9 9 - 6 3 6 .F i n d l a y ,I . M . , D u n n e , M .3 .P e t e r s e n ,0 .H . ( 1 9 8 5 ) . H i g hc o n d u c t a n c e K +c h a n n e li np a n c r e a t i ci s l e t c e l l s c a nb ea c t i v a t e d a n di n a c t i v a t e db y i n t e r n a l c a l c i u m .J .M e m b r .B i o l . 8 3 : 1 6 9 - 1 7 5 .F r a n k e , W .W . ,S c h m i d ,E . ,V a n d e k e r c k h o v e , J .a n dW e b e r , K . ( 1 9 8 0 ) .Ap e r m a n e n t l y p r o l i f e r a t i n gr a t v a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l w i t hm a i n t a i n e de x p r e s s i o n o f s m o o t hm u s c l e c h a r a c t e r i s t i c s ,i n c l u d i n ga c t i no f t h ev a s c u l a rs m o o t hm u s c l e t y p e .J .C e l l .B i o l .8 7 :5 9 4 - 6 0 0 .F r e i s s m u t h , M . ,C a s e y ,P a n d G i l m a n ,A . ( 1 9 8 9 ) .0p r o t e i n sc o n t r o ld i v e r s ep a t h w a y so f t r a n s m e m b r a n es i g n a l i n g .F A S E BJ . 3 : 2 1 2 5 - 2 1 3 1 .F r i n d t ,0 .a n dP a l m e r , L .G .( 1 9 8 7 ) .C a - a c t i v a t e d K c h a n n e l si n a p i c a lm e m b r a n e o fm a m m a l i a nC C T , a n d t h e i rr o l e i n K s e c r e t i o n . A m .J . P h y s i o l .2 5 2 : F 4 5 8 - F 4 6 7 .F u j i w a r a ,S .a n dK u r i y a m a , H . ( 1 9 8 3 ) .E f f e c t s o f a g e n t s t h a tm o d u l a t e p o t a s s i u mp e r m e a b i l i t yo n s m o o t h m u s c l ec e l l s o f t h e g u i n e a - p i gb a s i l a ra r t e r y . B r .J .P h a r m a c o l . 7 9 : 2 3 - 3 5 .F u j i w a r a ,S . ,I t o h , T . a n d S u z u k i ,H . ( 1 9 8 2 ) . M e m b r a n ep r o p e r t i e sa n d e x c i t a t o r yn e u r o m u s c u l a rt r a n s m i s s i o n i nt h e s m o o t h m u s c l e o fd o g c e r e b r a la r t e r i e s . B r .J .P h a r m a c .7 7 : 1 9 7 - 2 0 8 .F u r c h g o t t , R . F .a n dZ a w a d s k i ,J . V .( 1 9 8 0 ) . T h e o b l i g a t o r yr o l e o fe n d o t h e l i a lc e l l si n t h e r e l a x a t i o no f a r t e r i a l s m o o t hm u s c l eb y a c e t y i c h o l i n e .N a t u r e2 8 8 : 3 7 3 - 3 7 6 .F u r c h g o t t ,R . F . ( 1 8 9 4 ) . T h er o l eo f e n d o t h e l i u mi n t h e r e s p o n s e s o f v a s c u l a rs m o o t hm u s c l et od r u g s .A n n u . R e v .P h a r m a c . T o x i c .2 4 : 1 7 5 - 1 9 7 .G a b b i a n i ,0 .E . ,S c h m i d ,E . ,W i n t e r , . S . ,C h a p o n n i e r ,D e c h a s t o n y ,C . ,V a n d e k e r c k h o v e ,J . ,W e b e r , K . ,a n d F r a n k e ,W . W .( 1 9 8 1 ) .V a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l sd i f f e r f r o mo t h e r s m o o t h m u s c l ec e l l s : p r e d o m i n a n c eo f v i m e n t i nf i l a m e n t s a n das p e c i f i ca l p h a - t y p e a c t i n .P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A 7 8 : 2 9 8 - 3 0 2 .G a l l i n ,E .K . ( 1 9 8 4 ) .C a l c i i m - a n d v o l t a g e - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l si n h u m a nm a c r o p h a g e s .B i o p h y s .J .4 6 : 8 2 1 - 8 2 7 .1 9 9G e l b a n d ,C .H . ,L o d g e , N . J . a n d V a n B r e e m e n ,C . ( 1 9 8 9 ) . AC a2 + - a c t i v a t e d K +c h a n n e l f r o m r a b b i ta o r t a : m o d u l a t i o nb yc r o m a k a l i m .E u r .J .P h a r m a c .1 6 7 : 2 0 1 -2 1 0 .G e l b a n d ,C .H . ,M c C u l l o u g h , 3 . R . a n d V a nB r e e m e n ,C .( 1 9 9 0 ) .M o d u l a t i o n o fv a s c u l a rC a2+- a c t i v a t e d K+c h a n n e l sb y c r o m a k a l i m , p i n a c i d i la n d g l y b u r i d e .B i o p h y s .J . 5 7 : 5 0 9 aG e l b a n d ,C .H . , S i l b e r b e r g ,S .D . a n dG r o s c h n e r K . ( 1 9 9 0 ) .A T P i n h i b i t ss m o o t hm u s c l ea2+ - a c t i v t e dK +c h a n n e l s .P r o c . R .S o c .L o n d . B2 3 - 2 8 .G i t t e r ,A .H . , B e y e n b a c h ,K . W . , C h a d w i c h ,C .W . , G r o s s , P . , M i n u t h ,W .W .a n dF r o m t e r , E . ( 1 9 8 7 ) .H i g h - c o n d u c t a n c eK +c h a n n e l s i na p i c a l m e m b r a n e so fp r i n c i p a l c e l l s c u l t u r e d f r o m r a b b i t r e n a lc o r t i c a l c o l l e c t i n gd u c t a n l a g e n .P f l u g e r s .A r c h . 4 0 8 : 2 8 2 - 2 9 0 .G o l d m a n , D . E . ( 1 9 4 3 ) . P o t e n t i a l , i m p e d a n c e , a n dr e c t i f i c a t i o n i n m e m b r a n e s .J .G e n . P h y s i o l . 2 7 : 3 7 - 6 0 .G r a y , M . A . , G r e e n w e l l , A . R . ,G a r t o n , A .J .a n d A r g e n t .( 1 9 9 0 ) . R e g u l a t i o n o fM a x i - K +c h a n n e l s o n p a n c r e a t i cd u c tc e l l sb y c y c l i c A M P - d e p e n d e n tp h o s p h o r y l a t i o n .J .M e m b r a n e B i o l .1 1 5 : 2 0 3 - 2 1 5 .G r e e n , K . A . F o s t e r , R .W .a n d S m a l l R .C . ( 1 9 9 1 ) . A p a t c h - c l a m ps t u d y o f K + -c h a n n e l a c t i v i t y i n b o v i n e i s o l a t e d t r a c h e a ls m o o t h m u s c l e c e l l s . B r .3 . P h a r m a c o l .1 0 2 : 8 7 1 - 8 7 8 .G r y n k i e w i c z ,G ,P o e n i e , M . a n d T s i e n , R . Y .( 1 9 8 5 ) . A n e w g e n e r a t i o n o fC a2+i n d i c a t o r s w i t h g r e a t l yi m p r o v e df l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e s .J .B i o l .C h e m . 2 6 0 : 3 4 4 0 -3 4 5 0 .G u g i n o ,S .E . , S u a r e z - I s l a , B . A . , G u g g i n o ,W .B . , G r e e ,N . a n d S a c k t o r , B .( 1 9 8 5 ) .T h e i n f l u e n c e o f b a r i u m o n a p i c a l m e m b r a n e p o t e n t i a l s a n dp o t a s s i u m c h a n n e la c t i v i t yi n c u l t u r e d r a b b i t m e d u l l a r y a s c e n d i n g l i m bc e l l s( M T A L ) .F e d . P r o c .4 4 : 4 4 3 - 4 5 1 .G u t f r e u n d , H . ( 1 9 7 2 ) . E n z y m e s : P h y s i c a l P r i n c i p l e s . W i l e y ,L o n d o n .H a g i w a r a ,S .a n d J a f f e , L . A . ( 1 9 7 9 ) . E l e c t r i c a lp r o p e r t i e s o fe g gc e l l m e m b r a n e s .A .R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 8 : 3 8 5 - 4 1 6 .H a g i w a r a ,S . ,M i y a z a k i ,S .a n d R o s e n t h a l , N . P . ( 1 9 7 6 ) . P o t a s s i u mc u r r e n t a n d t h ee f f e c t o f c e s i u m o n t h i s c u r r e n t d u r i n g a n o m a l o u s r e c t i f i c a t i o no f t h ee g gc e l lm e m b r a n e o fas t a r f i s h .J .G e n . P h y s i o l . 6 7 : 6 2 1 - 6 3 8 .H a g i w a r a ,S . ,M i y a z a k i ,S . ,M o o d y ,W . J ,a n d P a t l a k ,J . ( 1 9 7 8 ) . B l o c k i n g e f f e c t so fb a r i u m a n dh y d r o g e n i o n s o n t h e p o t a s s i u mc u r r e n t d u r i n g a n o m a l o u sr e c t i f i c a t i o ni n t h e s t a r f i s he g g . J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 2 7 9 : 1 6 7 - 1 8 5 .H a i , C - M a n d M u r p h y , R . ( 1 9 8 9 ) .C a2+ ,c r o s s b r i d g e p h o s p h o r y l a t i o n ,a n dc o n t r a c t i o n .A n n u . R e v . P h y s i o l . 5 1 : 2 8 5 - 2 9 8 .H a l l i w e l l , J . V .a n d A d a m s , P . R . ( 1 9 8 2 ) .V o l t a g e - c l a m p a n a l y s i s o fm u s c a r i n i ce x c i t a t i o ni n h i p p o c a m p a l n e u r o n s . B r a i n R e s .2 5 0 : 7 1 - 9 2 .2 0 0H a m i l l . ,o .P , M a r t y , A . , N e h e r , E . , S a k m a n n ,B .a n dS i g w o r t h ,F .3 .( 1 9 8 1 ) .I m p r o v e d p a t c h - c l a m p t e c h n i q u e f o r h i g h - r e s o l u t i o n c u r r e n t r e c o r d i n gf r o m c e l l sa n d c e l l - f r e em e m b r a n e p a t c h e s . P f l u g e r s A r c h i v .3 9 1 : 8 5 - 1 0 0 .H a m l i n , K . E . a n d F i s c h e r , F . E . ( 1 9 5 1 ) . T h e s y n t h e s i s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e .J .A m . C h e m . S o c . , 7 3 : 5 0 0 7 - 5 0 0 8 .H a r d e r , D . R . ( 1 9 8 0 ) .C o m p a r i s o n o f e l e c t r i c a l p r o p e r t i e so f m i d d l e c e r e b r a l a n dm e s e n t e r i c a r t e r y i n c a t . A m . J .P h y s i o l .2 3 9 : C 2 3 - C 2 6 .H a r d e r , D . R . , A d e l , P . W . a n d H e r m s m e y e r , K . ( 1 9 8 1 ) M e m b r a n e e l e c t r i c a lm e c h a n i s m so f b a s i l a r a r t e r y c o n s t r i c t i o n a n d p i a l a r t e r y d i l a t i o nb yn o r e p i n e p h r i n e .C i r c .R e s . 4 9 ; 1 2 3 7 - 1 2 4 2 .H a r d e r , D . R . ,D e r n b a c h , P . a n d W a t e r s , A . ( 1 9 8 7 ) . P o s s i b l e c e l l u l a rm e c h a n i s m f o rc e r e b r a l v a s o s p a s m a f t e re x p e r i m e n t a l s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e i n t h ed o g .J .C l i n .I n v e s t . 8 0 : 8 7 5 - 8 8 0 .H a s h i m o t o , T . ,H i r a t a , M . , I t o h , T . , K a n m u r a , Y . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) .I n o s i t o l1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t ea c t i v a t e s p h a r m a c o m e c h a n i c a l c o u p l i n g i n s m o o t h m u s c l eo f t h er a b b i t m e s e n t e r i ca r t e r y .J .P h y s i o l .3 7 0 : 6 0 5 - 61 8 .H a t h a w a y ,D R . a n d M a r c h .K .L .( 1 9 8 9 ) . M o l e c u l a rc a r d i o l o g y : N e w a v e n u e s f o rt h e d i a g n o s i sa n d t r e a t m e n t o fc a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e .J .A m . C e l l .C a r d i o l . 1 3 : 2 6 5 -2 8 2 .H a t h a w a y , D . R . ,K o n i c k i . M . V . a n d C o l l i c a n ,S .A . ( 1 9 8 5 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o fm y o s i n l i g h t c h a i nk i n a s e f r o mv a s c u l a rs m o o t hm u s c l eb yc A M P - a n d c G M Pd e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e s . J .M o ! . C e l l . C a r d i o l . 1 7 : 8 4 1 - 8 5 0 .H a t h a w a y ,D . R . , M a r c h ,K . L . , L a s h ,J .A . , A d a m , L . P .a n d W i l e n s k y ,R . L . ( 1 9 9 1 ) .V a s c u l a rs m o o t h m u s c l e . Ar e v i e w o f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f c o n t r a c t i l i t y .C i r c u l a t i o n . 8 3 : 3 8 2 - 3 9 0 .H e r m s m e y e r ,K . ( 1 9 7 6 ) .C e l l u l a r b a s i s f o r i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e i n s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s . C i r c . R e s . 3 8 : ( s u p p l I I ) : 1 1 5 3 - 1 1 5 7 .H i g a s h i d a , H .a n d B r o w n , D . A .( 1 9 8 6 ) . C a2+ - d e p e n d e n t K + c h a n n e l s i nn e u r o b l a s t o m ah y b r i d c e l l s a c t i v a t e d b yi n t r a c e l l u l a r i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n de x t r a c e l l u l a rb r a d y k i n i n .F E B S L e t t . 3 2 8 : 3 9 5 - 4 0 0 .H i l l e , B .( 1 9 8 4 ) .I o n i c c h a n n e l s o f e x c i t a b l em e m b r a n e s . S i n a u e r A s s o c i a t e s ,S u n d e r l a n d ,M a s s .F i r s t E d i t i o n .H i l l e , B .( 1 9 9 1 ) . I o n i c c h a n n e l so f e x c i t a b l e m e m b r a n e s .S i n a u e r A s s o c i a t e s , I n c . ,S u n d e r l a n d ,M a s s . S e c o n dE d i t i o n .H i r s t , G .D .S . ,S i l v e r b e r g , D .G .a n d V a n H e l d e n , D . F . ( 1 9 8 6 ) . T h e a c t i o n p o t e n t i a la n d u n d e r l y i n gi o n i c c u r r e n t si n p r o x i m a l r a t m i d d l e c e r e b r a la r t e r i o l e s .J .P h y s i o l .( L o n d . )3 7 1 : 2 8 9 - 3 0 4 .2 0 1H i s a d a , T . , O r d w a y , R . W . , K i r b e r , M . T . , S i n g e r ,J . J .a n d W a l s h ,J . V . J r . ( 1 9 9 1 ) .H y p e r p o l a r i z a t i o n - a c t i v a t e d c a t i o n i c c h a n n e l s i n s m o o t h m u s c l ec e l l s a r e s t r e t c hs e n s i t i v e . P f l u g e r s A r c h i v . 4 1 7 : 4 9 3 - 4 9 9 .H o d g k i n , A . L . a n d H u x e l y ,A .F . ( 1 9 5 2 ) .T h e c o m p o n e n t s o f m e m b r a n ec o n d u c t a n c e i n t h e g i a n t a x o n o f L o l i g o .J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 1 1 6 : 4 7 3 - 4 9 6 .H o d g k i n , A . . a n d K a t z , B . ( 1 9 4 9 ) . T h ee f f e c t o f s o d i u m i o n s o n t h e e l e c t r i c a la c t i v i t y o f t h e s q u i d g i a n t a x o n . J . P h y s i o l . ( L o n d . ) 1 0 8 : 3 7 - 7 7 .H uS .L . , K i m , H .S .a n d J e n , A . Y . ( 1 9 9 1 ) .D u a l a c t i o n o f e n d o t h e l i n - 1 o nt h eC a + - a c t i v a t e dK +c h a n n e l i n s m o o t h m u s c l e c e l l s o fp o r c i n e c o r o n a r y a r t e r y . E u r .J .P h a r m a c o l . 1 9 4 : 3 1 - 3 6 .H u b b a r d ,J .I . , L l i n a s , R . a n dQ u a s t e l ,D . M .J .( 1 9 6 9 ) .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l A n a l y s i so f S y n a p t i c T r a n s m i s s i o n .E d w a r d A r n o l d , L o n d o n .H u n t e r , M . , L o p e s , A .G . ,B o u l p a e p ,E . L . a n d C o h e n , B . ( 1 9 8 4 ) . S i n g l e c h a n n e lr e c o r d i n g s o fc a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n t h e a p i c a lm e m b r a n e o fr a b b i tc o r t i c a l c o l l e c t i n g t u b u l e . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A 8 1 : 4 2 3 7 - 4 2 3 9 .H u x l e y , H . ( 1 9 9 0 ) .S l i d i n g f i l a m e n t s a n d m o l e c u l a r m o t i l e s y s t e m s .J .B i o l .C h e m .2 6 5 : 8 3 4 7 - 8 3 5 0 .I g n a r r o , L .J . ,B y r n s R . E . a n d W o o d , K .5 .( 1 9 8 6 ) . P h a r m a c o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F ) : e v i d e n c e t h a t i t i sc l o s e l y r e l a t e dt on i t r i co x i d e( N O )r a d i c a l .C i r c u l a t i o n .7 4( s u p p lI I ): 1 1 2 8 7 .I k e b e ,M . a n d R e a r d o n ,S .i l 9 9 O ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f s m o o t h m y o s i n l i g h t c h a i nk i n a s eb ys m o o t hm u s c l eC a2+/ c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t m u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i nk i n a s e .J .B i O l . C h e m . 2 6 5 : 8 9 7 5 - 8 9 7 8 .I n o m a t a , H . a n d K a o ,C .Y . ( 1 9 7 9 ) . I o n i c m e c h a n i s m s o f r e p o l a r i s a t i o n i n t h eg u i n e a - p i gt a e n i a c o l ia sr e v e a l e d b yt h e a c t i o n s o f s t r o n t i u m .J .P h y s i o l . ( L o n d . )2 9 7 : 4 4 3 - 4 6 2 .I n o u e , R . , K i t a m u r a ,K . a n dK u r i y a m a ,H . ( 1 9 8 5 ) .T w oC a - d e p e n d e n t K - c h a n n e l sc l a s s i f i e d b yt h e a p p l i c a t i o n o ft e t r a e t h y l a m m o n i u m d i s t r i b u t et os m o o t h m u s c l em e m b r a n e s o f t h er a b b i t p o r t a l v e i n . P f l u g e r s A r c h 4 0 5 : 1 7 3 - 1 7 9 .I n o u e , R . , O k a b e ,K . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) . An e w l y i d e n t i f i e dC a2+d e p e n d e n tK +c h a n n e l i n t h es m o o t h m u s c l e m e m b r a n e o f s i n g l e c e l l s d i s p e r s e d f r o m t h er a b b i tp o r t a l v e i n . P f l u g e r sA r c h . 4 0 6 : 1 3 8 - 1 4 3 .I s e n b e r g , G .a n d K l o c k n e r , V .( 1 9 8 6 ) . E l e m e n t a r y c u r r e n t s t h r o u g h s i n g l eC a -a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l s( s m o o t h m u s c l e c e l l s i s o l a t e d f r o m t r a c h e a o r u r i n a r yb l a d d e r ) . P f l u g e r s .A r c h . 4 0 5 : R 6 2 .I s h i i ,N . ,S i m p s o n , W . M .a n d A s h l e y ,C . C .( 1 9 8 9 ) . E f f e c t s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e( s e r o t o n i n )a n d f o r s k o l i no n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i n i s o l a t e d a n d f u r a - 2l o a d e ds m o o t h - m u s c l ec e l l s f r o mt i ea n t e r i o r b y s s u s r e t r a c t o r ( c a t c h ) m u s c l e o fM y t i l u se d u l i s . P f l u g e r sA r c h . 4 1 4 : 1 6 2 - 1 7 0 .2 0 2I t o h , T . ( 1 9 9 1 ) . P h a r m a c o m e c h a n i c a lc o u p l i n g i n v a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s .J a p a n .J .P h a r m a c o l .5 5 : 1 0 9 .J o h n s , A . , L e i j t e n ,P . , Y a m a m o t o , H . , H w a n g ,K . a n d V a nB r e e m e n ,C .( 1 9 8 7 ) .C a l c i u m r e g u l a t i o n i n v a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec o n t r a c t i l i t y . A m .J . C a r d i o l .5 9 : 1 8 a -2 3 a .K a c z m a r e k , L . K . a n d L e v i t a n , I . B .( 1 9 8 7 )N e u r o m o d u l a t i o n : t h eb i o c h e m i c a lc o n t r o l o f n e u r o n a l e x c i t a b i l i t y . O x f o r dU n i v e r s i t y P r e s s , N e wY o r k .K a c z m a r e k ,L .K . a n dS t r u m w a s s e r , R . ( 1 9 8 4 ) .A v o l t a g e - c l a m p a n a l y s i so f c u r r e n tu n d e r l y i n g c A M P - i n d u c e d m e m b r a n em o d u l a t i o n i ni s o l a t e d p e p t i d e r g i cn e u r o n s o fA p l y s i a .J .N e u r o p h y s i o l .5 2 : 3 4 0 - 3 4 9 .K a m m , K . E . n d S t u l l ,J . T .( 1 9 8 9 ) .R e g u l a t i o n o fs m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i l ee l e m e n t sb ys e c o n d m e s s e n g e r s . A n n u .R e v . P h y s i o l . 5 1 : 2 9 9 - 31 3 .K a r a s h i m a , T . a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 1 ) .E l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o fs m o o t h m u s c l e c e l lm e m b r a n e a n d n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o ni n t h e g u i n e a - p i g b a s i l a ra r t e r y . B r .J .P h a r m a c . 7 4 : 4 9 5 - 5 0 4 .K a t z , B . ( 1 9 4 9 ) . L e s c o n s t a n t s e l e c t r i q u e sd el am e m b r a n ed um u s c l e . A r c h .S c i .P h y s i o l . 3 : 2 8 5 - 2 9 9 .K a w a i , T . , a n d W a t a n a b e , M . ( 1 9 8 6 ) .B l o c k a d e o f C a - a c t i v a t e d K c o n d u c t a n c eb ya p a m i n i n r a t s y m p a t h e t i c n e u r o n s . B r .J .P h a r m a c o l .8 7 : 2 2 5 - 2 3 2 .K i o c k n e r ,U .a n d I s e n b e r g ,G . ( 1 9 8 5 ) . A c t i o n p o t e n t i a l s a n d n e tm e m b r a n e c u r r e n t so f i s o l a t e d s m o o t h m u s c l e c e l l s ( u r i n a r y b l a d d e r o f t h e g u i n e a - p i g ) .P f l u g e r s . A r c h .4 0 5 : 3 2 9 - 3 3 9 .K i o c k n e r ,U . ,T r i e s c h m a n n ,U .a n d I s e n b e r g ,G .( 1 9 8 9 ) . P h a r m a c o l o g i c a lm o d u l a t i o no fc a l c i u m a n d p o t a s s i u m c h a n n e l i ni s o l a t e d v a s c u l a r s m o o t h m u s c l ec e l l s . D r u g R e s . 3 9 : 1 2 0 - 1 2 6 .K o i b , H . ( 1 9 9 0 ) . P o t a s s i u n Lc h a n n e l s i ne x c i t a b l e a n d n o n - e x c i t a b l e c e l l s . R e v .P h y s i o l .B i o c h e m . P h a r m a c o l . 1 1 5 : 5 1 - 9 1 .K o n i s h i , M . ,O l s o n , A . , H o l l i n g s w o r t h , a n d B a y l o r , S . M . ( 1 9 8 8 ) . M y o p l a s m i cb i n d i n go f f u r a - 2 i n v e s t i g a t e d b y s t e a d y - s t a t ef l u o r e s c e n c e a n da b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s .B i o p h y s .3 . 5 5 :1 0 8 9 - 1 1 0 4 .K r e y e ,V .A .W . ,G e r s t h e i m e r , F . a n d W e a t o n , A . H . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f B R L 3 4 9 1 5o n r e s t i n g m e m b r a n ep o t e n t i a l a n d8 6 R be f f l u x i n r a b b i t t o n i cv a s c u l a r s m o o t hm u s c l e .N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . P h a r m a c .3 3 5: R 6 4 .K r e y e , V . A . W . ,G e r s t h e i m e r , F .a n IW e s t o n , A . H . ( 1 9 8 7 ) . E f f e c t s o f B R L 3 4 9 1 5o n r e s t i n gm e m b r a n e p o t e n t i a la n dO6R be f f l u x i n r a b b i t t o n i c v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g sA r c h . P h a r m a c .3 3 5 : R 6 4 .K u l l a k , A . , D o n o s o ,M .V .a n d H u i d o b o r o - T o r o ,3 .P . ( 1 9 8 7 ) . E x t r a c e l l u l a rc a l c i u md e p e n d e n c eo f t h e n e u r o t e n s i ni n d u c e dr e l a x a t i o n o f i n t e s t i n a l s m o o t h m u s c l e ss t u d i e s u s i n g c a l c i u mc h a n n e l b l o c k e r s a n d B A Y K 8 6 4 4 . E u r .J . P h a r m a c o l .1 3 5 : 2 9 7 - 3 0 5 .2 0 3K u m e , H . T a k a i ,A . , T o k u n o , H .a n d T o m i t a ,T . ( 1 9 8 9 ) .R e g u l a t i o n o fC a2+ -d e p e n d e n tK +- c h a n n e la c t i v i t y i n t r a c h e a lm y o c y t e sb y p h o s p h o r y l a t i o n .N a t u r e .3 4 1 : 1 5 2 - 1 5 4 .K u r i y a m a , H . a n dK i t a m u r a , K . ( 1 9 8 5 ) .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a la s p e c t s o fr e g u l a t i o n o fp r e c a p i l l a r yv e s s e l t o n e i n s m o o t hm u s c l e s o f v a s c u l a r t i s s u e s .J .C a r d i o v a s c u l a rP h a r m .7 ( s u p p l . 3 ) : S 1 1 9 - S 1 2 8 .K u r i y a m a ,H . , I t o ,Y . , S u z u k i , H . K i t a m u r a ,K . a n d I t o h , T .( 1 9 8 2 ) .F a c t o r sm o d i f y i n gc o n c e n t r a t i o n - r e l a x a t i o nc y c l ei n v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e s .A m .3 .P h y s i o l .2 4 3 : H 6 4 1 - H 6 6 2 .K u s a n o , K . , B a r r o s ,F . , K a t z ,G . , G a r c i a , M . ,K a c z o r o w s k i ,G .a n dR e u b e n ,J .P .( 1 9 8 7 ) . M o d u l a t i o no f K c h a n n e la c t i v i t y i na o r t i c s m o o t h m u s c l eb yB R L 3 4 9 1 5 a n das c o r p i o nt o x i n . B i o p h y s .3 .5 1 : 5 5 a .L a b a r c a ,P . , C o r o n a d o , R . a n dM i l l e r ,C .( 1 9 8 0 ) .T h e r m o d y n a m i ca n dk i n e t i cs t u d i e so f t h eg a t i n gb e h a v i o ro faK+- s e l e c t i v e c h a n n e lf r o m t h es a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m m e m b r a n e .J .G e n . P h y s i o l .7 6 : 3 9 7 - 4 2 4 .L a n c e ,J . W .( 1 9 8 2 ) .M e c h a n i s m a n dM a n a g e m e n t o fH e a d a c h e ,p p .1 6 2 - 1 6 3 ,B u t t e r w o r t h , L o n d o n .L a n g , D .G .a n d A i l e e n ,K . R . ( 1 9 9 0 ) .T e t r a e t h y l a m m o n i u mi o ns e n s i t i v i t y o fa 3 5 -p SCa2+ - a c t i v t e dK + c h a n n e li n G H 3 c e l l s t h a ti s a c t i v a t e db yt h y r o t r o p i nr e l e a s i n g h o r m o n e .P f l u g e r sA r c h .4 1 6 ; 7 0 4 - 7 0 9 .L a n g , D .G .a n dR i t c h i e , A . K . ( 1 9 8 8 ) .P h a r m a c o l o g i c a ls e n s i t i v i t i e so f l a r g ea n ds m a l l c o n d u c t a n c eC a2+- a c t i v a t e dK +c h a n n e l s .B i o p h y s .J .5 3 - 1 4 4 a .L a n g t o n , P . D . ,N e l s o n , M .T . , H u a n g , Y . a n dS t a n d e n , N . B .( 1 9 9 1 ) . B l o c k o fc a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s i n m a m m a l i a n a r t e r i a l m y o c y t e sb yt e t r a e t h y l a m m o n i u mi o n s . A m .J .P h y s i o l . 2 6 0 :H 9 2 7 - H 9 3 4 .L a t o r r e , R .a n d M i l l e r ,C .( 1 9 8 3 ) . C o n d u c t i o na n d s e l e c t i v i t yi n p o t a s s i u mc h a n n e l s .J .M e m b r . B i o l .7 1 : 1 1 - 3 0 .L a t o r r e ,R . ,A l v a r e z ,0 ,C e c c h i ,X .a n dV e r g a r a ,C .( 1 9 8 5 ) . P r o p e r t i e so fr e c o n s t i t u t e di o n c h a n n e l s .A n n u .R e v .B i o p h y s .C h e m . 1 4 : 7 9 - 1 1 1 .L a t o r r e ,R . , O b e r h a u s e r , A . ,L a b a r c a ,P .a n d A l v a r e z ,0 .( 1 9 8 9 ) . V a r i e t i e so fc a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s . A n n u .R e v .P h y s i o l .5 1 : 3 8 5 - 3 9 9 .L a t o r r e R . , V e r g a r a ,C . ,H i d a l g o ,C .( 1 9 8 2 ) .R e c o n s t i t u t i o ni n p l a n a rl i p i db i l a y e r so faC a +- d e p e n d e n tK +c h a n n e lf r o m t r a n s v e r s e t u b u l em e m b r a n e si s o l a t e d f r o mr a b b i ts k e l e t a lm u s c l e . P r o c . N a t ! .A c a d . S c i .U S A 7 7 : 7 4 8 4 - 7 4 8 6 .L a u g e r ,P . ( 1 9 8 7 ) .V o l t a g e - d e p e n d e n c eo fs o d i u m - c a l c i u me x c h a n g e: P r e d i c t i o n sf r o m k i n e t i cm o d e l s . J .M e m b r . B i o l .9 9 : 1 - 1 1 .L i n d e m a u n ,J .P . , J o n e s , L .R . a n dH a t h a w a y , D .R . ( 1 9 8 3 ) . B - A d r e n e r g i cs t i m u l a t i o no f p h o s p h o l a m b a np h o s p h o r y l a t i o na n dC a2+ - A T P a s ea c t i v i t y i n g u i n e ap i g v e n t r i c l e s .3 .B i o l .C h e m . 2 5 8 : 4 6 4 - 4 7 1 .2 0 4L o i r a n d ,G . , P a c a u d , P . ,M i r o n n e a u ,C .a n d M i r o n n e a u ,J .( 1 9 8 6 ) .E v i d e n c e f o rt w od i s t i n c t c a l c i u m c h a n n e l s i n r a t v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l l s i n s h o r t - t e r mp r i m a r yc u l t u r e . P f l u g e r s A r c h . 4 0 7 : 5 6 6 - 5 6 8 .L o n g m o r e ,J .a n dW e s t o n , A .H .( 1 9 8 9 ) . T h e r o l e o fK +- c h a n n e l si n t h e m o d u l a t i o no f v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e t o n e . I n : P o t a s s i u mC h a n n e l s : S t r u c t u r e ,C l a s s i f i c a t i o n ,F u n c t i o n a n d T h e r a p e u t i c P o t e n t i a l ,p p .2 5 9 - 2 7 8 , C o o k , N .S . ( e d )E l l i sH o r w o o d ,C h i c h e s t e r .L u s c h e r , R . F . ( e d ) :E n d o t h e l i a lV a s o a c t i v e S u b s t a n c e s a n dC a r d i o v a s c u l a r D i s e a s e .B a s e l : K a r g e r .L y o n , R . A . , D a v i s ,K . H . , a n d T i t e l e r ,M . ( 1 9 8 7 ) . 3 H - D O B l a b e l sag u a n y ln u c l e o t i d e s e n s i t i v e s t a t e o fc o r t i c a l5 - H T 2r e c e p t o r s . M o l . P h a r m a c o l .3 1 : 1 9 4 - 1 9 9 .M a c K i n n o n ,R . a n d M i l l e r ,C .( 1 9 8 8 ) . M e c h a n i s m o fc h a r y b d o t o x i n b l o c k o f t h eh i g h - c o n d u c t a n c e , C a2+ - a c t i v a t e d K + c h a n n e l .J . G e n . P h y s i o l . 3 3 5 - 3 4 5 .M a c K i n n o n ,R . a n d Y e l l e nG .( 1 9 9 0 ) . M u t a t i o n s a f f e c t i n g T E A b l o c k a d ea n d i o np e r m e a t i o ni n v o l t a g e - a c t i v a t e dK +c h a n n e l s . S c i e n c e 2 5 0 : 2 7 6 - 2 7 9 .M a g l e b y , K . L .a n d P a l l o t t a , B .S .( 1 9 8 3 a ) . C a l c i u m - d e p e n d e n c eo f o p e n a n d s h u ti n t e r v a l d i s t r i b u t i o n s f r o m c a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a tm u s c l e .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 4 4 : 5 8 5 - 6 0 4 .M a g l e b y , K . L .a n d P a l l o t t a , B .S .( 1 9 8 3 b ) . B u r s t k i n e t i c s o f s i n g l e c a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l si n c u l t u r e d r a t m u s c l e .J .P h y s i o l . ( L o n d ) 3 4 4 : 6 0 5 - 6 2 3 .M a r t y , A . ( 1 q 8 1 ) C a l c i u m - d e p e n d e n tc h a n n e l s w i t h l a r g e u n i t a r y c o n d u c t a n c e i nc h r o m a f f i n c e l l m e m b r a n e s .N a t u r e 2 9 1 : 4 9 7 - 5 0 0 .M a r t y , A .( 1 9 8 3 ) .C a2+ - d e p e n d e n tK c h a n n e l s w i t hl a r g eu n i t a r y c o n d u c t a n c e .T r e n d s N e u r o s c i . 6 : 2 6 2 - 2 6 5 .M a r t y , A . a n dN e h e r , E . ( 1 9 8 2 ) . I o n i c c h a n n e l s i n c u l t u r e d r a t p a n c r e a t i c i s l e t c e l l s .J .P h y s i o l . ( L o n d ) 3 2 6 : 3 6 P - 3 7 P .M a r u y a m a , Y . ,G a l l a g h e r , D . V . ,P e t e r s o n ,0 .H . ( 1 9 8 3 ) . V o l t a g e a n d c a l c i u m -a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l si n b a s o - l a t e r a l a c i n a r c e l l m e m b r a n e s o f m a m m a l i a ns a l i v a r y g l a n d s .N a t u r e 3 0 2 : 8 2 7 - 8 2 9 .M a s u z a w a , K . , A s a n o , M . ,M a t s u d a , T . , I m a i z u m i , Y . a n d W a t a n a b e , M . ( 1 9 9 0 ) .P o s s i b l e i n v o l m e n t o fA T P - S e n s i t i v eK +c h a n n e l s i n t h e r e l a x a n t r e s p o n s e o fd o gm i d d l e c e r e b r a la r t e r yt oc r o m a k a l i m .J .P h a r m . E x p e r . T h e r . 2 5 5 : 8 1 8 - 8 2 5 .M a y e r ,M . E . , L o o , D . F . , S n a p e , W . J . J r . a n d S a c h s ,G .( 1 9 9 0 ) T h ea c t i v a t i o n o fc a l c i u m a n d c a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l s i n m a m m a l i a n c o l o n i c s m o o t hm u s c l eb ys u b s t a n c eP .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 2 0 : 4 7 - 7 1 .M a y e r , M .L . a n d W e s t b r o o d , G .L . ( 1 9 8 3 ) . A v o l t a g e - c l a m p a n a l y s i s o f i n w a r d( a n o m a l o u s )T e c t i f i c a t i o n i n m o u s e s p i n a l s e n s o r y g a n g l i o n n e u r o n e s .J .P h y s i o l .( L o n d . )3 4 0 : 1 9 - 4 5 .2 0 5M c C a n n . J .D .a n d W e l s h .M .J .( 1 9 8 6 ) .C a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l si nc a n i n e a i r w a y s m o o t h m u s c l e .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) .3 7 2 : 1 1 3 - 1 2 7 .M c C l e s k e y , E . W . , F o x , A . P . ,F e l d m a n ,D . a n d T s i e n , R .W .( 1 9 8 6 ) .D i f f e r e n tt y p e so f c a l c i u m c h a n n e l s .J .E x p . B i o l .1 2 4 : 1 1 7 - 1 9 0 .M c M a n u s ,0 .B . a n d M a g l e b y , K . L . ( 1 9 8 8 ) . K i n e t i cs t a t e s a n d m o d e s o f s i n g l el a r g e - c o n d u c t a n c ec a l c i u m - a c t i v a t e d p o t a s s i u m c h a n n e l s i n c u l t u r e dr a t s k e l e t a lm u s c l e .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 4 0 2 : 7 9 - 1 2 0 .M e e c h , R .W .( 1 9 7 8 ) . C a l c i u m - d e p e n d e n t p o t a s s i u m a c t i v a t i o n i nn e r v o u s t i s s u e s .A . R e v .B i o p h y s . B i o e n g i n e . 7 : 1 - 1 8 .M e k a t a , F .( 1 9 7 6 ) .R e c t i f i c a t i o n i n t h e s m o o t h m u s c l e c e l lm e m b r a n e o f r a b b i ta o r t a .3 .P h y s i o l . ( L o n d . )2 5 8 : 2 6 9 - 2 7 8 .M e n e , P . ,P u g l i e s e , F . a n d C i n o t t i ,G .A .( 1 9 9 1 ) . S e r o t o n i n a n d t h e g l o m e r u l a rm e s a n g i u m . M e c h a n i s m s o f i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g . H y p e r t e n s i o n 1 7 : 1 51 - 1 6 0 .M e t h f e s s e l ,C .a n dB o h e i m ,G .( 1 9 8 2 ) .T h e g a t i n g o f s i n g l ec a l c i u m - d e p e n d e n tp o t a s s i u m c h a n n e l s i s d e s c r i b e db ya n a c t i v a t i o n / b l o c k a d em e c h a n i s m . B i o p h y s .S t r u c .M e c h .9 : 3 5 - 6 0 .M i c h e l ,J .B . , A z i z i , M . , S a l z m a n n ,J .L . , L e v y , B . a n d M e n a r dJ .( 1 9 8 7 ) . E f f e c t o fv a s o d i l a t o r s o n t h e s t r u c t u r eo f t h e a o r t ai n n o r m o t e n s i v e a g i n g r a t s .3 .H y p e r t e n s .5 ( s u p p l 5 ) : S 1 6 5 - 1 6 8 .M i c h e l ,J . ,R o u x ,N .D . , P l i s s o n n i e r , D . , A n i d j a r ,S . ,S a l z m a n n ,J .a n dL e v y , B .( 1 9 9 0 ) .P a t h o p h y s i o l o g i c a l r o l e o f t h e v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l .3 .C a r d i o v a s c .P h a r m . 1 6 ( S u p p l .1 ) : S 4 - S 1 1 .M i l l e r ,C . ,M o c z y d l o w s k i , E . , L a t o r r e , R . a n d P h i l l i p s , M ( 1 9 8 5 ) . C h a r y b d o t o x i n ,ap r o t e i ni n h i b i t o r o f s i n g l eC a 2 +- a c t i v a t e dK +c h a n n e l s f r o m m a m m a l i a n s k e l e t a lm u s c l e . N a t u r e3 1 3 : 3 1 6 - 3 1 8 .M i o n e , M . C . ,R a l e v i c , V .a n d B u r n s t o c k ,G .( 1 9 9 0 ) . P e p t i d e s a n d v a s o m o t o rm e c h a n i s m s .1 ? h a r m a c o l . T h e r . 4 6 : 4 2 9 - 4 6 8 .M o c z y d l o w s k i ,E . a n dL a t o r r e , R . ( 1 9 8 3 ) . G a t i n g k i n e t i c s o f C a2+ - a c t i v t e d K +c h a n n e l s f r o mr a t m u s c l ei n c o r p o r a t e di n t op l a n a r l i p i d b i l a y e r s : E v i d e n c e f o rt w ov o l t a g e - d e p e n d e n t C a2+b i n d i n gr e a c t i o n s .J .G e n . P h y s i o l . 8 2 : 5 1 1 - 5 4 2 .M o c z y d l o w s k i ,E . , A l v a r e z ,0 . ,V e r g a r a ,C .a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 5 ) . E f f e c t o fp h o s p h o l i p i d s u r f a c ec h a r g e o n t h e c o n d u c t a n c e a n dg a t i n go f aC a2+- a c t i v a t e dK +c h a n n e li n p l a n a r l i p i db i l a y e r s .J .M e m b r . B i o l . 8 3 : 2 7 3 - 2 8 2 .M o n c a d a ,S . ,G r y g l e w s k i ,R .J . ,B u n t i n g ,S .a n d V a n e ,3 .R . ( 1 9 7 6 ) . A n e n z y m ei s o l a t e df r o m a r t e r i e st r a n s f o r m s p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d a s e st oa n u n s t a b l es u b s t a n c e st h a t i n h i b i t sp l a t e l e t a g g r e g a t i o n . N a t u r e 2 6 3 : 6 6 3 - 6 6 5 .M o n c a d a , S .a n d V a n e ,J .R . ( 1 9 7 9 ) . P h a r m a c o l o g y a n d e n d o g e n o u s r o l e so fp r o s t a g l a n d i ne n d o p e r o x i d e s , t h r o m b o x a n eA 2 ,a n d p r o s t a c y c l i n . P h a r m a c o l . R e v .3 0 : 2 9 3 - 3 12 0 6M o o r e ,S . A . ,S t r a u c h , A . R . , Y o d e r , E J . ,R u b e n s t e i n , P . a n d H a r t , M . N . ( 1 9 8 4 ) .C e r e b r a l m i c r o v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e i n t i s s u ec u l t u r e . I n V i t r o 2 0 :5 1 2 - 5 2 0 .M o r r i s , A . P . , G a l l a c h e r , D . V . , I r v i n e , R . F . a n d P e t e r s e n ,0 .H . ( 1 9 8 7 ) .S y n e r g i s mo f i n o s i t o l t r i s p h o s p h a t e a n d t e t r a k i s p h o s p h a t e i n a c t i v a t i n gC a2+- d e p e n d e n tK +c h a n n e l s . N a t u r e 3 3 0 : 6 5 3 - 6 5 5 .M u l l e r - S c h w e i n i t z e r , E .a n d E n g e l ,G . ( 1 9 8 3 ) . E v i d e n c e f o rm e d i a t i o nb y5 - H T 2r e c e p t o r s o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - i n d u c e d c o n t r a c t i o no f c a n i n e b a s i l a ra r t e r y .N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ’ s A r c h . P h a r m a c o l .3 2 4 : 2 8 7 - 2 9 2 .M u l v a n y , M . J . ( 1 9 8 6 ) .V a s c u l a r e f f e c t so f a l t e r e d s o d i u m , p o t a s s i u mp u m p a c t i v i t y .S c a n d .J .C l i n . L a b . I n v e s t . [ S u p p l ] 1 8 0 : 4 0 - 4 8 .N a b i k a , T . , V e l l e t r i , P . A . ,L o v e n b e r g ,W . a n d B e a v e n ,M . A . ( 1 9 8 5 ) . I n c r e a s e i nc y t o s o l i c c a l c i u ma n d p h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s mi n d u c e db ya n g i o t e n s i nI I a n d[A r g]v a s o p r e s s i n i n v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e c e l l s .J .B i o l .C h e m . 2 6 0 : 4 6 6 1 - 4 6 7 0 .N a k a o , K . , O k a b e , K . K i t a m u r a , K . , K u r i y a m a , H . a n d W e s t o n ,A . H . ( 1 9 8 8 ) .C h a r a c t e r i s t i c so f c r o m a k a l i m - i n d u c e d r e l a x a t i o n s i n t h e s m o o t hm u s c l e c e l l s o fg u i n e a - p i gm s e n t e r i c a r t e r y a n d v e i n . B r .J .P h a r m a c . 9 5 : 7 9 5 - 8 0 4 .N e l s o n ,M . T . , S t a n d e n , N . B . , B r a y d e n ,J .E . a n d W o r l e y ,3 .F .( 1 9 8 8 ) .N o r a d r e n a l i n ec o n t r a c t s a r t e r i e sb ya c t i v a t i n g v o l t a g e - d e p e n d e n tc a l c i u m c h a n n e l s .N a t u r e . 3 3 6 : 3 8 2 - 3 8 5 .N e l s o n , M . , P a t l a k ,3 . ,W o r l e y , J .a n dS t a n d e n , N . ( 1 9 9 0 ) . C a l c i u m c h a n n e l s ,p o t a s s i u m c h a n n e l sa n d t h e v o l t a g e d e p e n d e n c eo fa r t e r i a l s m o o t hm u s c l e t o n e .A m .J .P h y s i o l . 2 5 9 : C 3 - C 1 8 .N i s h i k a w a , M .S h i r a k a w a ,Sa n d A d e i s t e i n , R .S .( 1 9 8 5 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o fs m o o t hm u s c l em y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e b y p r o t e i n k i n a s eC . J .B i o l . C h e m . 2 6 0 : 8 9 7 8 - 8 9 8 3 .N i s h i k a w a , M . ,d e L a m e r o l l e ,P . , L i n c o l n ,T .a n d A d e l s t e i n , R .A . ( 1 9 8 4 ) .P h o s p h o r y l a t i o n o fm a m m a l i a n m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e sb yt h ec a t a l y t i c s u b u n i t o fc y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s ea n db yc y c l i c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e .J .B i o l .C h e m . 2 5 9 : 8 4 2 9 - 8 4 3 6 .N i s h i z u k a , Y . ( 1 9 8 8 ) .T h em o l e c u l a rh e t e r o g e n e i t y o f p r o t e i n k i n a s eCa n d i t si m p l i c a t i o n s f o r c e l l u l a rr e g u l a t i o n . N a t u r e . 3 3 4 : 6 6 1 - 6 6 6 .N o b l e , D . ( 1 9 8 4 ) . T h es u r p r i s i n g h e a r t :ar e v i e w o f r e c e n t p r o g r e s s i n c a r d i a ce l e c t r o p h y s i o l o g y .J .P h y s i o l . ( L o n d . ) 3 5 3 : 1 5 6 - 1 5 9 .N o m a , A . ( 1 9 8 3 ) .A T P - r e g u l a t e d K + c h a n n e l s i n c a r d i a c m u s c l e . N a t u r e 3 0 5 : 1 4 7 -1 4 8 .N o r t h , R . A . ( 1 9 8 9 ) .D r u g r e c e p t o r s a n d t h e i n h i b i t i o n o f n e r v e c e l l s . B r .J .P h a r m a c . 9 3 : 1 3 - 2 8 .O h r n o r i ,H . , Y o s h i d a , S .a n d H a g i w a r a ,S .( 1 9 8 1 ) . S i n g l e K c h a n n e l c u r r e n t s o fa n o m a l o u s r e c t i f i c a t i o ni n c u l t u r e d r a t m y o t u b e s . P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S A7 8 : 4 9 6 0 - 4 9 6 4 .2 0 7O h y a ,Y . , T e r a d a , K . , K i t a m u r a , K . a n dK u r i y a m a , H . ( 1 9 8 6 ) .M e m b r a n ec u r r e n t sr e c o r d e df r o maf r a g m e n to f r a b b i t i n t e s t i n a ls m o o t h m u s c l e c e l l .A m .J .P h y s i o l .2 5 1 : C 3 5 5 - C 3 4 6 .O k a b e , K . ,K i t a m u r a , K .a n d K u r i y a m a , H . ( 1 9 8 7 ) .F e a t u r e so f4 - a m i n o p y r i d i n es e n s i t i v e o u t w a r dc u r r e n t o b s e r v e d i ns i n g l e s m o o t hm u s c l ec e l l s f r o mt h e r a b b i tp u l m o n a r ya r t e r y .P f l u g e r s A r c h .4 0 8 : 5 6 1 - 5 6 8 .O w e n s ,G .K . ,L o e b ,A . ,G o r d o n ,D . ,a n d T h o m p s o n ,M . M .( 1 9 8 6 ) .E x p r e s s i o no fs m o o t h m u s c l es p e c i f i c - i s o a c t i n i nc u l t u r e d v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s :R e l a t i o n s h i pb e t w e e n g r o w t h a n dc y t o d i f f e r e n t i a t i o n .3 .C e l l . B i o l .1 0 2 :3 4 3 - 3 5 2 .P a l l o t t a ,B .S . ,M a g l e b y , K .L .a n dB a r r e t t ,J .N . ( 1 9 8 1 ) .S i n g l e c h a n n e lr e c o r d i n g s o faCa2+ - a c t i v t e d K +c u r r e n t i n r a tm u s c l e c e l l c u l t u r e .N a t u r e2 9 3 : 4 7 1 - 4 7 4 .P a l m e r , R . M .3 . ,F e r r i g e , A .G .a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 8 7 ) . N i t r i c o x i d er e l e a s ea c c o u n t s f o r t h eb i o l o g i c a la c t i v i t y o fe n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n gf a c t o r . N a t u r e .3 2 7 : 5 2 4 - 5 2 6 .P a s m u s s e n ,H . ,T a k u w a ,Y . a n d P a r k ,S .( 1 9 8 7 ) . P r o t e i nk i n a s eCi nt h e r e g u l a t i o no fs m o o t h m u s c l e c o n t r a c t i o n .F A S E B3 . 1 : 1 7 7 - 1 8 5 .P a y n e ,M .E . , E l i z i n g aM .a n d A d e i s t e i n .R . A .( 1 9 8 6 ) . S m o o t hm u s c l e m y o s i nl i g h tc h a i n k i n a s e :A m i n o a c i d s e q u e n c ea tt h es i t e p h o s p h o r y l a t e db ya d e n o s i n ec y c l i c3 ’ , 5 ’ - p h o s p h a t ed e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s ew h e t h e r o r n o t c a l m o d u l i ni sb o u n d .J .B i o l . C h e m .2 6 1 : 1 6 3 4 6 - 1 6 3 5 0 .P e a c h , M . J . ,L o e b ,A . L . , S i n g e r , H .A . a n dS a y e , J .( 1 9 8 5 ) .E n d o t h e l i u m - d e r i v e dv a s c u l a r r e l a x i n gf a c t o r . H y p e r t e n s i o n7( s u p p l1 ) : 1 9 4 - 1 1 0 0 .P e n n e f a t h e r ,P . , L a n c a s t e r , B . , A d a m s ,P . R .a n d N i c o l l , R . A . ( 1 9 8 5 ) .T w od i s t i n c tC a - d e p e n d e n tK c u r r e n t s i n b u l l f r o gs y m p a t h e t i cg a n g l i o n c e l l s .P r o c . N a t i .A c a d .S c i .U S A 8 2 : 3 0 4 0 - 3 0 4 4 .P e r o u t k a ,S . Ja n dS n y d e r , S .H . ( 1 9 7 9 ) .M u l t i p l e s e r o t o n i nr e c e p t o r s :D i f f e r e n t i a lb i n d i n g o f 3 H5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e ,3 Hl y s e r g i c a c i d d i e t h y l a m i d ea n d3 Hs p i r o p e r i d o l .M o l . P h a r m a c o l .1 6 : 6 8 7 - 6 9 9 .P e r o u t k a ,S . J .( 1 9 8 7 ) .S e r o t o n i nr e c e p t o r s .I nP s y c h o p h a r m a c o l o g y ,e d .H . Y .M e l t z e r ,p p3 0 3 - 3 1 1 ,R a v e nP r e s s , N e w Y o u k .P e r o u t k a ,S . 3 .a n dK u h a r ,M . J . ( 1 9 8 4 ) .A u t o r a d i o g r a p h i cl o c a l i z a t i o no f5 - H T 1r e c e p t o r st oh u m a na n dc a n i n e b a s i l a r a r t e r i e s .B r a i nR e s .3 1 0 : 1 9 3 - 1 9 6 .P e r o u t k a ,S . J .a n d S n y d e r , S . H .( 1 9 7 9 ) .M u l t i p l e s e r o t o n i nr e c e p t o r s : D i f f e r e n t i a lb i n d i n go f3 H -5 - H T ,3 H - L S Da n d3 1 - i -s p i r o p e r i d o l . M o l .P h a r m a c o l . 1 6 :6 8 7 - 6 9 5 .P e r o u t k a ,S .J . ,N o g u c h i , M . ,T o l n e r ,D .3 . ,A l l e n ,G . S .( 1 9 8 3 ) . S e r o t o n i n - i n d u c e dc o n t r a c t i o no f c a n i n eb a s i l a ra r t e r y :m e d i a t i o nb y5 - H T 1r e c e p t o r s .B r a i n R e s2 5 9 : 3 2 7 - 3 3 0 .P e t e r s e n ,0 .H .a n d M a r u y a m a , Y .( 1 9 8 4 ) . C a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l sa n d t h e i rr o l e i ns e c r e t i o n . N a t u r e3 0 7 : 6 9 3 - 6 9 6 .2 0 8P r i t c h a r d , K . a n d A s h l e y ,C . C . ( 1 9 8 6 ) . N a+ / C a2+ e x c h a n g e i ni s o l a t e d s m o o t hm u s c l e c e l l sd e m o n s t r a t e d b yt h ef l u o r e s c e n t c a l c i u mi n d i c a t o r f u r a - 2 . F E B S .1 9 5 :2 3 - 2 7 .R a p p o r t ,M .M . ,G r e e n , A .A . a n d P a g e ,I . H . ( 1 9 4 8 ) . S e r u mv a s o c o n s t r i c t o r( s e r o t o n i n ) .I V .I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n .J .B i o l .C h e m . ,1 7 6 : 1 2 4 3 - 1 2 5 1 .R e m b o l d ,C .M . a n d M u r p h yR .A . ( 1 9 8 8 ) .M y o p l a s m i c[ C a2+ ] d e t e r m i n e s m y o s i np h o s p h o r y l a t i o n i n a g o n i s t - s t i m u l a t e ds w i n e a r t e r i a l s m o o t h m u s c l e .C i r c . R e s .6 3 : 5 9 3 - 6 0 3 .R h o d i n ,J .A .G .( 1 9 8 0 ) .A r c h i t e c t u r e o f t h e v e s s e l w a l l . I nH a n d b o o k o fP h y s i o l o g y .T h e C a r d i o v a s c u l a r S y s t e m . V a s c u l a rS m o o t h M u s c l e .B e t h e s d a , M D : A m . P h y s i o l .S o c . s e c t . 2 , v o l . I I , c h a p t . 1 ,p .1 - 3 1 .R o d g e r , I .W .a n d S m a l l , R .C .( 1 9 9 1 ) .P h a r m a c o l o g y o f a i r w a y s m o o t hm u s c l e . I nh a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a lP h a r m a c o l o g y : P h a r m a c o l o g y o f A s t h m a .e d . B a r n e s , P .J .a n d P a g e ,C .P . B e r l i n : S p r i n g e r - V e r l a g .R o m e y ,G .a n d L a z d u n s k i , M ( 1 9 8 4 ) . T h ec o e x i s t e n c e i n r a t m u s c l e c e l l s o ft w od i s t i n c t c l a s s e s o fC a 2 + - d e p e n d e n tK +c h a n n e l s w i t hd i f f e r e n t p h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e s a n d d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n .1 1 8 : 6 6 9 - 6 7 4 .R o s e ,G . G .( 1 9 7 0 ) . A t l a s o f V e r t e b r a t eC e l l s i n T i s s u e C u l t u r e . p p . 1 1 9 - 1 3 1 .A c a d e m i c P r e s s , I n c . N e wY o r k .R o s s , M . a n dR e i t h . E . ( 1 9 8 5 ) .H i s t o l o g y : A T e x t a n d A t l a s . H a r p e r&R o w . N e wY o r k .S a d o s h i m a ,J .A k a i k e , N . ,K a n a i d e , H .a n d N a k a m u r a , M . ( 1 9 8 8 ) . C a - a c t i v a t e d Kc h a n n e l i n c u l t u r e ds m o o t h m u s c l e c e l l so fr a t a o r t i c m e d i a .A m .J .P h y s i o l .2 5 5 : H 4 1 0 - H 4 1 8 .S a k m a n n ,B . t n d N e h e r , E .( 1 9 8 3 ) .G e o m e t r i c p a r a m e t e r s o f p i p e t t e s a n dm e m b r a n e p a t c h e s .i n S i n g l e - C h a n n e l R e c o r d i n g .( e d )S a k m a n n ,B .&N e h e r , E .P l e n u m , N e w Y o r kp p . 3 7 - 5 2S c h m i d t , A .W .a n d P e r o u t k a , S . J . ( 1 9 8 9 ) . 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e r e c e p t o r “ f a m i l i e s ” .F A S E B J o u r n a l 3 : 2 2 4 2 - 2 2 4 9 .S c h u s t e r ,S .A . , C a m a r d o , J . S . ,S i e g e l b a u m ,S . A .a n d K a n d e l ,E . R . ( 1 9 8 5 ) . C y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e c l o s e s t h e s e r o t o n i n - s e n s i t i v eK +c h a n n e l s o fA p l y s i a s e n s o r yn e u r o n s i n c e l l - f r e e m e m b r a n ep a t c h e s .N a t u r e31 3 : 3 9 2 - 3 9 5 .S e l l e r s ,J .( 1 9 8 5 ) . M e c h a n i s mo f t h ep h o s p h o r y l a t i o n - d e p e n d e n t r e g u l a t i o n o fs m o o t h m u s c l eh e a v y a u t o m y o s i n .J .B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 5 8 1 5 - 1 5 8 1 9 .S h o e m a k e r , R . L . a n dW o r r e l l , R .T . ( 1 9 9 1 ) .C a+ - s e n s i t i v eK +c h a n n e l i na o r t i cs m o o t h m u s c l eo f r a t s . J o u r n a l P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y f o rE x p e r i m e n t a l B i o l o g y&M e d i c i n e . 1 9 6 : 3 2 5 - 3 3 2 .S h u b a , M . F .( 1 9 8 1 ) . S m o o t h m u s c l e o f t h e u r e t e r : t h e a c t i o no f e x c i t a t i o n a n dm e c h a n i s m s o f a c t i o no f c a t e c h o l a r n i n e s a n dh i s t a m i n e . I n : S m o o t h M u s c l e :A n2 0 9A s s e s s m e n t o f C u r r e n t K n o w l e d g e ,p p .3 7 7 - 3 8 4 , e d . B u i b r i n g , E . , B r a d i n g ,A . F . ,J o n e s ,J o n e s , A . W . a n d T o m i t a , T .( e d s ) A r n o l d , L o n d o n .S h u b a , M . F . a n d V i a d i m i r o v a , I .A . ( 1 9 8 0 ) . E f f e c to f a p a m i n o n t h ee l e c t r i c a lr e s p o n s e s o f s m o o t h m u s c l et o a d e n o s i n e 5 ’ - t r i p h o s p h a t e a n dt o n o n - a d r e n e r g i c ,n o n - c h o l i n e r g i c n e r v e s t i m u l a t i o n .N e u r o s c i e n c e5 : 8 5 3 - 8 5 9 .S i e g e l b a u m ,S .A . , C a m a r d o , J .S .a n dK a n d e l , E . R . ( 1 9 8 2 ) .S e r o t o n i n a n dc y c l i cA M P c l o s e s i n g l e K c h a n n e l si n A p l y s i a s e n s o r yn e u r o n e s . N a t u r e2 9 9 : 4 1 3 - 4 1 7 .S i g w o r t h , F .J .a n d S i n e ,S . M . ( 1 9 8 7 ) . D a t at r a n s f o r m a t i o n f o ri m p r o v e d d i s p l a y a n df i t t i n g o f s i n g l e - c h a n n e ld w e l l t i m eh i s t o g r a m e .B i o p h y .J . 5 2 : 1 0 4 7 - 1 0 5 4 .S i l b e r b e r g ,S .D . a n d v a nB r e em e n ,C .( 1 9 9 0 ) .A n A T P , c a l c i u m a n dv o l t a g es e n s i t i v e p o t a s s i u m c h a n n e l i n p o r c i n ec o r o n a r y a r t e r ys m o o t h m u s c l e c e l l s .B i o c h e m i c a la n d B i o p h y s i c a l R e s e a r c hC o n m i n u n i c a t i o n s . 1 7 2 : 5 1 7 - 5 2 2 .S i m s ,S .M . , S i n g e r ,J .J . a n ’ JW a l s h ,J . V . J r . ( 1 9 8 5 ) . C h o l i n e r g i c a g o n i s t ss u p p r e s sap o t a s s i u m c u r r e n t i n f r e s h l y d i s s o c i a t e d s m o o t hm u s c l e c e l l s o f t h et o a d . J . P h y s i o l .( L o n d . )3 6 7 : 5 0 3 - 5 2 7S i n g e r ,J . J .a n d W a l s h , J . V .( 1 9 8 7 ) .C h a r a c t e r i z a t i o no f c a l c i u m - a c t i v a t e dp o t a s s i u m c h a n n e l si n s i n g l e s m o o t hm u s c l e c e l l s u s i n g t h ep a t c h - c l a m p t e c h n i q u e .P f l u g e r s A r c h . 4 0 8 : 9 8 - 1 1 1 .S k a l l e ,0 . ,R o p r a z , P . , T r z e c i a k , A . , B e n z o n a n a ,G . ,G i l l e s s i n , D .a n d G a b b i a n i ,G .( 1 9 8 6 ) . Am o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s ta - s m o o t h m u s c l e a c t i n : A n e w p r o b e f o rs m o o t h m u s c l e d i f f e r e n t i a t i o n . J .C e l l .B i o l . 1 0 3 : 2 7 8 7 - 2 7 9 6 .S o m l y o , A . P . a n dH i m p e n s , B .( 1 9 8 9 ) . C e l l c a l c i u m a n d i t s r e g u l a t i o n i ns m o o t hm u s c l e . F A S E BJ . 3 :2 2 6 6 - 2 2 7 6 .S o m l y o , A . P . , S o m l y , A . V . ,S h u m a n ,H . a n d S t e w a r t , M . ( 1 9 7 9 ) . E l e c t r o np r o b ea n a l y s i s o f m u s c l ea n d x - r a y m a p p i n g o f b i o l o g i c a ls p e c i m e n t s w i t haf i e l d e m i s s i o ng u n .S c a n . E l e c t r o n . M i c r o s c . 3 : 7 1 1 - 7 2 2 .S o m l y o ,A . V .( 1 9 8 0 ) . U l t r a s t r u c t u r e o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . I n : H a n d b o o ko fP h y s i o l o g y . T h e C a r d i o v a s c u l a rS y s t e m . V a s c u l a r S m o o t h M u s c l e .B e t h e s d a , M D :A m .P h y s i o l .S o c . s e c t .2 , v o l .I I , c h a p t .2 ,p .3 3-6 7.S p a t z , M . , D o d s o n ,R . F . a n d B e m b r y ,J .( 1 9 8 3 ) .C e r e b r o v a s c u l a r m u s c l e c u l t u r e s . 1 .I s o l a t i o n , g r o v t h a n dm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n . B r a i n R e s . 2 8 0 : 3 8 7 - 3 9 1 .S p e r e l a k i s , N . , a n d O h y a ,Y . ( 1 9 8 9 ) .E l e c t r o p h y s i o l o g y o f v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e .P h y s i o l o g ya n d p a t h o p h y s i o l o g y o f t h e h e a r t . 2 n de d .E d i t e db yN . S p e r e l a k i s .K l u w e rA c a d e m i c P u b l i s h e r s ,N o r w e l l ,M A .p p .7 7 3 - 81 2 .S q u i r e , L . G .a n d P e t e r s e n ,0 .H .( 1 9 8 7 ) . M o d u l a t i o n o fC a2+ -a n d v o l t a g e -a c t i v a t e dK +c h a n n e l s b yi n t e r n a lM g2+i n s a l i v a r y a c i n a r c e l l s . B i o c h i m .B i o p h y s .A c t a . 8 9 9 : 1 7 1 - 1 7 5 .S t a n d e n , N . B . ,Q u a y l e ,J .M . , D a v i e s , N .W . ,B r a y d e n ,J . E . , H u a n g , Y . a n d N e l s o n ,M . T . ( 1 9 8 9 ) .H y p e r p o l a r i z i n gv a s o d i l a t o r sa c t i v a t eA T P - s e n s i t i v eK +c h a n n e l s i na r t e r i a l s m o o t hm u s c l e . S c i e n c e 2 4 5 : 1 7 7 - 1 8 0 .2 1 0S t a n d e n , N . B . , S t a n f i e l d , P . R .a n d W a r d ,T .A . ( 1 9 8 5 ) .P r o p e r t i e s o f s i n g l ep o t a s s i u m c h a n n e l si n v e s L i e sf r o mt h e s a r c o l e m m ao f f r o gs k e l e t a l m u s c l e .J .P h y s i o l .( L a n d . )3 6 4 : 3 3 9 - 3 5 8 .S t e e l e ,J . A . S t o c k b r i d g e ,N . ,M a l k o v i c ,G .a n d W e i r , B .( 1 9 9 1 ) .F r e e r a d i c a l sm e d i a t ea c t i o n s o fo x y h e m o g l o b i no nc e r e b r o v a s c u l a rs m o o t h m u s c l e c e l l s .C i r c .R e s .6 8 : 4 1 6 - 4 2 3 .S t o c k b r i d g e ,N . ( 1 9 8 7 )E G T A .C o m p u t . B i o l .M e d .1 7 : 2 9 9 - 3 0 4 .S t u r e k ,M . a n d H e r m s m e y e r , K . ( 1 9 8 6 ) .C a l c i u m a n d s o d i u mc h a n n e l s i ns p o n t a n e o u s l y c o n t r a c t i n gv a s c u l a rm u s c l e c e l l s . S c i e n c e2 3 3 :4 7 5 - 4 7 8 .S u p r e n a n t , A . , N e i l d ,T . O .a n d H o l m a n ,M . E .( 1 9 8 7 ) .M e m b r a n e p r o p e r t i e s o fr a b b i tb a s i l a ra r t e r i e s a n dt h e i rr e s p o n s e st ot r a n s m u r a ls t i m u l a t i o n . P f l u g e r sA r c h i v .4 1 0 : 9 2 - 1 0 1 .S u t t e r ,M .C .( 1 9 9 0 ) .T h em e s e n t e r i c - p o r t a lv e i ni n r e s e a r c h .P h a r m a c o l o g i c a lR e v i e w s .4 2 : 2 8 7 - 3 2 5 .S u z u k i ,H .a n d F u j i w a r a ,S .( 1 9 8 2 ) .N e u r o g e n i c e l e c t r i c a lr e s p o n s e so f s i n g l es m o o t hm u s c l ec e l l so f t h e d o gm i d d l ec e r e b r a la r t e r y .C i r c u l a t i o nR e s e a r c h5 1 : 7 5 1 - 7 5 9 .T a k a t a ,S . ,H i r a t a ,Y . , T a k g i , Y . ,Y o s h i m i ,H . ,F u k u d u ,Y . a n d F u j u t a , T . ( 1 9 8 8 ) .P h o r b o le s t e rm o d u l a t e ss e r o t o n i r ir e c e p t o r - m e d i a t e di n c r e a s e si ni n o s i t o lp h o s p h a t ep r o d u c t i o na n dc a l c i u mm o b i l i z a t i o ni nc u l t u r e d r a tv a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s . F E B SL e t t e r s2 3 4 :2 2 8 - 2 3 0 .T a y l o r ,D . A . ,B o w m a n ,B .F . a n d S t u l l ,J . T .( 1 9 8 9 ) .C y t o p l a s m i cC a2+ i sap r i m a r yd e t e r m i n a n tf o rm y o s i np h o s p h o r y l a t i o ni n s m o o t h m u s c l ec e l l s .J .B i o l . C h e m .2 6 4 : 6 2 7 0 - 6 2 1 3 .T a y l o r ,P .S .( 1 9 8 7 ) .S e l e c t i v i t ya n dp a t c hm e a s u r e m e n t so f A - c u r r e n tc h a n n e l s i nH e l i xa s p e r s an e u r o n s . J .P h y s i o l ( L o n d . )3 8 8 : 4 3 7 - 4 4 7 .T o m i t a ,T . ( 1 9 6 6 ) .E l e c t r i a lr e s p o n s e so fs m o o t hm u s c l et o e x t e r n a ls t i m u l a t i o ni nh y p e r t o n i cs o l u t i o n .J .P h y s i o l .( L o n d . )1 8 3 : 4 5 0 - 4 6 8 .T o m i t a ,T . ( 1 9 8 2 ) .I o n i cb a s i s o f s m o o t hm u s c l ea c t i o np o t e n t i a l s .I n : H a n d b o o do fE x p e r i m e n t a lP h a r m a c o l o g y , e d . b y B e r t a c c i n i ,G . ,S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n .p p . ’ 7 9 -1 1 5 .T o m i t a ,T .( 1 9 8 8 ) .I o n i c c h a n n e l si n s m o o t hm u s c l es t u d i e dw i t h p a t c h - c l a m pm e t h o d s .J a p a n .J .P h y s i o l .3 8 : 1 - 1 8 .T o r o ,L . ,G o n z a l e z - R o h l e s .A .a n dS t e f a n i ,E .( 1 9 8 6 ) . E l e c t r i c a lp r o p e r t i e sa n dm o r p h o l o g yo fs i n g l ev a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s i nc u l t u r e .A m .J .P h y s i o l .2 5 1 :C 7 6 3 - 7 7 3 .T s i e n ,R . Y .( 1 9 8 8 ) .F l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n ta n d p h o t o c h e m i c a lm a n i p u l a t i o no fc y t o s o l i cf r e ec a l c i u m .T r e n d s .N e u r . S c i .1 1 :4 1 9 - 4 2 4 .2 1 1V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 2 ) . 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n e , v a s o s p a s ma n d h y p e r t e n s i o n .I n 5 -H y d r o x y t r y p t a m i n e a n d P e r i p h e r a lR e a c t i o n s ,e d .F . D e C l e r c k , P .M . V a n h o u t t e ,p p .1 6 3 - 1 7 4 .N e wY o r k : R a v e n .V a n h o u t t e , P .M . ( 1 9 8 3 ) .5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e a n d v a s c u l a rd i s e a s e . F e d . P r o c .4 2 :2 3 3 - 3 7 .V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 5 ) . P e r i p h e r a ls e r o t o n e r g i c r e c e p t o r s a n dh y p e r t e n s i o n . I nS e r o t o n i na n dt h e C a r d i o v a s c u ’ a rS y s t e m ,e d . b yP . M .V a n h o u t t e ,p p .1 2 3 - 1 3 4 .R a v e n P r e s s , N e w Y o r k .V a n h o u t t e , P . M . , V e r b e u r e n , T .J .a n dW e b b , R .C .( 1 9 8 1 ) .L o c a l m o d u l a t i o no fa d r e n e r g i cn e u r o e f f e c t o r i n t e r a c t i o n i nt h e b l o o dv e s s e l w a l l . P h y s i o l . R e v .6 1 : 1 5 1 -2 4 7 .V a n h o u t t e , P . M . ( 1 9 8 1 ) . C o n t r o l o f V a s c u l a rF u n c t i o n . E a r l H .W o o d S c i e n t i f i cS y m p o s i u m .p p .2 0 - 2 7 .V e r g a r a ,C .a n d L a t o r r e , R . ( 1 9 8 3 ) . K i n e t i c s o fC a2+ - a c t i v t e d K +c h a n n e l s f r o mr a b b i t m u s c l e i n c o r p o r a t e di n t o p l a n a rl i p i d b i l a y e r s : e v i d e n c e f o raC a2+a n dB a2+b l o c k a d e .J .G e n . P h y s i o l . 8 2 : 5 4 3 - 5 6 8 .V e r g a r a ,C . ,M o c z y d l o w s k i , E . a n d L a t o r r e ,R . ( 1 9 8 4 ) . C o n d u c t i o n ,b l o c k a d e , a n dg a t i n g i na C a2+- a c t i v a t e d K+c h a n n e li n c o r p o r a t e d i n t op l a n a r b i l a y e r s . B i o p h y s .J .4 5 : 7 3 - 7 6 .V r o l i x , M . R a e y m a e k e r s , L . a n d W u y t a c k F .( 1 9 8 8 ) . C y c l i c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i nk i n a s e s t i m u l a t e s t h e p l a s m a l e m m a lC a2+ - p u m po f s m o o t hm u s c l e v i ap h o s p h o r y l a t i o no f p h o s ph a t i d y l - in o s i t o l .B i o c h e m . J . 2 5 5 : 8 5 5 - 8 6 3 .W a g o n e r , P .K . a n d O x f o r d ,C .S . ( 1 9 8 7 ) . C a t i o n p e r m e a t i o n t h r o u g ht h e v o l t a g e -d e p e n d e n t p o t a s s i u mc h a n ’ e l i n t h e s q u i da x o n . C h a r a c t e r i s t i c s a n d m e c h a n i s m s .3 .G e n . P h y s i o l . 9 0 : 2 6 1 - 2 9 0 .W a h i s t r o m , B .( 1 9 7 1 ) .T h ee f f e c t o f c h a n g e s i n t h ei o n i c e n v i r o n m e n t o nv e n o u ss m o o t h m u s c l ed i s t r i b u t i o n o f s o d i u m a n d p o t a s s i u m .A c t a . P h y s i o l . S c a n d .8 2 : 3 8 2 -3 9 2 .W a n g , Y . a n d M a t h e r s , D . A . ( 1 9 9 1 ) . H i g h s e n s i t i v i t yt oi n t e r n a lt e t r a e t h y l a m m o n i u mi nK ( C a )c h a n n e l s o f c e r e b r o v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s .N e u r o s c i e n c eL e t t e r s . 1 3 2 : 2 2 2 - 2 2 4 .W a n g , 3 . ,B a i m b r i d g e ,K . G . , a n dL e u n g , P . C . K . ( 1 9 8 9 ) . C h a n g e s i n c y t o s o l i cf r e ec a l c i u m i o n c o n c e n t r a t i o n s i n i n d i v i d u a l r a t g r a n u l o s a c e l l s : E f f e c t o f l u t e i n i z i n gh o r m o n e - r e l e a s i n gh o r n i o n e . E n d o c r i n o l o g y . I nP r e s s .W a r r e n ,3 .B . ( 1 9 9 0 ) .T h e E n d o t h e l i u m .W i l e y - L i s s , I n c . N e w Y o r k .W a t e r s , A . a n d H a r d e r , D . R . ( 1 9 8 5 ) . A l t e r e d m e m b r a n ep r o p e r t i e s o f c e r e b r a lv a s c u l a r m u s c l e f o l l o w i n g s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e i nc a t :a ne l e c t r o p h y s i o l o g i c a ls t u d y .S t r o k e 1 6 : 9 9 0 - 9 9 7 .W e i n r e i c h , D . ( 1 9 8 6 ) . B r a d y k i n i n i n h i b i t sa s l o w s p i k e a f t e rh y p e r p o l a r i s a t i o n i nv i s c e r a l s e n s o r y n e u r o n s . N a t u r e3 3 0 : 6 5 3 - 6 5 5 .2 1 2W i l k i n s ,R . H . 1 9 8 0 .C e r e b r a lA r t e r i a lS p a s m . W i l l i a m sa n d W i l k i n s ,B a l t i m o r e .W i l l i a m s ,D . L . , K a t z ,G .M . , R o y - C o n t a n c i n ,L . a n d R e u b e n ,J .P . ( 1 9 8 8 ) .G u a n o s i n e5 ’ - m o n o p h o s p h a t e m o d u l a t e s g a t i n go fh i g h - c o n d u c t a n c eC a 2+ -a c t i v a t e dK +c h a n n e l s i n v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e . P r o c .N a t i .A c a d .S c i .U . S . A .8 5 : 9 3 6 0 - 9 3 6 4 .W i l l i a m s ,D . A . , F o g a r t y , K . E . , T s i e n , R . Y . ,a n d F a y , F . S .( 1 9 8 5 ) . C a l c i u mg r a d i e n t si n s i n g l es m o o t h m u s c l e c e l l s r e v e a l e db y t h e d i g i t a l i m a g i n gm i c r o s c o p eu s i n gF u r a2 . N a t u r e3 1 8 : 5 5 8 - 5 6 1 .W o n g ,B .S .a n dA d l e r .M .( 1 9 8 6 ) .T e t r a e t h y l a m m o n i u mb l o c k a d e o fc a l c i u m -a c t i v a t e dp o t a s s i u mc h a n n e l s i n c l o n a la n t e r i o r p i t u i t a r yc e l l s . P f l u g e r sA r c h .4 0 7 : 2 7 9 - 2 8 4 .W o n g , B . S .L e c a r , F T . a n d A d l e r , M . ( 1 9 8 2 ) .S i n g l ec a l c i u m - d e p e n d e n tp o t a s s i u mc h a n n e l si n c l o n a l a n t e r i o rp i t u i t a r y c e l l s . B i o p h y s .J . 3 9 : 3 1 3 - 3 1 7 .W o o d h u l l , A . M .( 1 9 7 3 ) . I o n i c b l o c k a g eo f s o d i u mc h a n n e l s i n n e r v e .J .G e n .P h y s i o l .6 1 : 6 8 7 - 7 0 8 .Y a m a m o t o , Y a n d H o t t a ,K .( 1 9 8 6 ) .E l e c t r i c a lr e s p o n s e so f t h e s m o o t hm u s c l e o ft h eg u i n e a - p i g c e r e b r a la r t e r yt ob r i e fe l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n .J a p a n .J . P h y s i o l .3 6 : 7 7 -9 0 .Y a g i , S .B e c k e r , P .C .a n d F a y , F .S .( 1 9 8 8 ) .R e l a t i o n s h i pb e t w e e n f o r c ea n dC a2+c o n c e n t r a t i o ni n s m o o t hm u s c l ea s r e l e a s e db ym e a s u r m e n to n s i n g l ec e l l s . P r o c .N a t i .A c a d . S c i .U S A 8 5 : 4 1 0 9 - 4 1 1 3 .Y a n a g i s a w a ,M . ,K u r i h a r a , H . , K i m u r a ,S . e t a l . ( 1 9 8 8 ) . A n o v e lp o t e n tv a s o c o n s t r i c t o rp e p t i d e p r o d u c e db y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s . N a t u r e .3 2 : 4 1 1 - 4 1 5 .Y e l l e n ,G .( 1 9 8 4 a ) .I o n i cp e r m e a t i o n a n d b l o c k a d ei nCa2+ - a c t i v t e d K +c h a n n e l so f b o v i n ec h r o m a f f i nc e l l s .J .G e n . P h y s i o l .8 4 : 1 5 7 - 1 8 6 .Y e l l e n ,G .( 1 9 8 4 b ) .R e l i e f o fN a + b l o c ko fCa2± - a c t i v t e d K + c h a n n e l sb ye x t e r n a lc a t i o n s .J .G e n .P h y s i o l .8 4 : 1 8 7 - 1 9 9 .Y e l l e n ,G . ,J u r m a n ,M .E . ,A b r a m s o n ,T .a n d M a c K i n n o n ,R . ( 1 9 9 1 ) . M u t a t i o n sa f f e c t i n gi n t e r n a lT E A b l o c k a d e i d e n t i f yt h e p r o b a b l e p o r e - f o r m i n gr e g i o n o faK +c h a n n e l .S c i e n c e 2 51 : 9 3 9 - 9 4 2 .Y o u n g , A .R . , H a m e l ,E . , a n dM a c k e n z i e , E . T .( 1 9 8 6 ) . R e c e n t s t u d i e so n t h es e r o t o n e r g i ci n n e r v a t i o no ft h e c e r e b r a l c i r c u l a t i o n :ar e v i e w . I n N e u r a lR e g u l a t i o no fB r a i n C i r c u l a t i o n .e d . b y C .O w m a n a n dJ .E .H a r d e b o . E l s e v i e r , A m s t e r d a m .p p . 1 9 5 - 2 1 7 .Y o u n g ,A . R . ,M a c k e n z i e , E .T . , S e y l e z ,J . , a n d V e r r e c c h i a ,C .( 1 9 8 6 ) . R e c e p t o r si n v o l v e d i n t h e5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e - i n d u c e dc o n t r a c t i o n o f i s o l a t e dc e r e b r a la r t e r i e s . A c t aP h y s i o l .S c a n d . 1 2 7 : 5 4 - 5 7 .2 1 3Z h a n g , H . , S t o c k b r i d g e ,N . , W e i r , B . ,K r u e g e r ,C .a n d C o o k , P . ( 1 9 9 1 ) .G l i b e n c l a m i d e r e l a x e sv a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c o n t r a c t i o n p r o d u c e db yp r o s t a g l a n d i n F 2 a l ph a . E u r o p e a nJ . o f S u r g e r y . 1 9 5 : 2 7 - 3 5 .2 1 4

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