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Presence of cell-cycle dependent substructure at low dose in the radiation survival response of asynchronous… Skwarchuk, Mark William 1990

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831-UBC_1990_A6_7 S58.pdf [ 6.59MB ]
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P R E S E N C E O F C E L L - C Y C L E D E P E N D E N T S U B S T R U C T U R E A T L O W D O S E IN T H E R A D I A T I O N S U R V I V A L R E S P O N S E O F A S Y N C H R O N O U S V 7 9 - W N R E C E L L S b y M A R K W I L L I A M S K W A R C H U K B . S c , U n i v e r s i t y o f S a s k a t c h e w a n , 1987 A T H E S I S S U B M I T T E D IN P A R T I A L F U L F I L L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F M A S T E R O F S C I E N C E i n T H E F A C U L T Y O F G R A D U A T E S T U D I E S T H E D E P A R T M E N T O F P H Y S I C S We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A A p r i l 1990 © M a r k W i l l i a m S k w a r c h u k , 1 9 9 0 In p re sent ing this thesis in partial fu l f i lment of the requ i rement s fo r an advanced deg ree at the Univers i ty of British C o l u m b i a , I agree that t he Library shall make it freely available fo r re ference and study. I further agree that pe rmi s s i on fo r extens ive c o p y i n g of this thesis f o r scholar ly pu rpo se s may b e g ranted by the head of m y depa r tmen t or by his o r her representat ives. It is u n d e r s t o o d that c o p y i n g o r pub l i c a t i on of this thesis fo r f inancial gain shall no t b e a l l o w e d w i t hou t my wr i t ten pe rmi s s i on . Depa r tmen t of P h y ^ t C 5  The Univers i ty of British C o l u m b i a Vancouve r , C a n a d a Date ftp>hl 2H. 1940 DE-6 (2/88) i i A B S T R A C T S u r v i v a l s t u d i e s u s i n g c e l l s o r t i n g t e c h n i q u e s t o g e t h e r w i t h d a t a a v e r a g i n g o n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s r e v e a l s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t e v i d e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e a t l o w d o s e (2 t o 3 G y ) t h a t c a n n o t b e a d e q u a t e l y c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e l i n e a r - q u a d r a t i c f u n c t i o n , S = e x p ( -ctD -(3D ). T h e d a t a s u g g e s t a t w o -c o m p o n e n t r e s p o n s e t h a t i s p a r t i c u l a r l y e v i d e n t w h e n p l o t t e d i n t h e l i n e a r f o r m o f t h e l i n e a r - q u a d r a t i c e q u a t i o n , - l n ( S ) / D - a + (3D. A p p l i c a t i o n o f o t h e r s u r v i v a l m o d e l s ( S i n g l e H i t + M u l t i T a r g e t a n d R e p a i r - M i s r e p a i r ) d o e s n o t e l i m i n a t e t h e s u b s t r u c t u r e . T h e s u b s t r u c t u r e m a y r e s u l t f r o m s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e , w h i c h d i f f e r i n t h e i r r a d i o s e n s i t i v i t y , g i v i n g r i s e t o a t w o - c o m p o n e n t s u r v i v a l r e s p o n s e . I n o r d e r t o e x p l o r e t h i s h y p o t h e s i s , s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t w i t h p o p u l a t i o n s o f p a r t i a l l y s y n c h r o n i z e d c e l l s . T h e m i t o t i c s e l e c t i o n t e c h n i q u e w a s e m p l o y e d a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h 12 h o u r s e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n t o o b t a i n l a r g e n u m b e r s o f s y n c h r o n i z e d c e l l s . G 1 / S p h a s e p o p u l a t i o n s o b t a i n e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n d o n o t s h o w t h e s u b s t r u c t u r e f o u n d f o r a s y n c h r o n o u s c e l l s , t h u s s u p p o r t i n g t h e h y p o t h e s i s . G1 p h a s e p o p u l a t i o n s o b t a i n e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e r e v e a l e d s u b s t r u c t u r e w h i c h c o u l d b e c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e f i t t o t h e R M R o r S H + M T m o d e l s . S t r u c t u r e w a s a l s o p r e s e n t i n t h e r e s p o n s e o f h e t e r o g e n e o u s S / G 2 p h a s e p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y h y d r o x y u r e a , b u t m a y n o t b e p r e s e n t i n t h e r e s p o n s e o f S p h a s e p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e . T h e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e s u b s t r u c t u r e i s a r e s u l t o f s e n s i t i v e ( G 1 , G 2 o r M ) a n d r e s i s t a n t ( S ) s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s . i i i T A B L E O F C O N T E N T S A B S T R A C T i i T A B L E O F C O N T E N T S i i i L I S T O F T A B L E S v i L I S T O F F I G U R E S v i i A C K N O W L E D G E M E N T S i x 1 . I N T R O D U C T I O N 1 1 .1 R A D I A T I O N 1 1 . 2 M O D E L S O F C E L L U L A R I N A C T I V A T I O N 4 1 . 2 . 1 S I M P L E T A R G E T T H E O R Y 5 1 . 2 . 2 S H O U L D E R E D S U R V I V A L M O D E L S 7 1 . 3 T H E C E L L C Y C L E 1 3 1 . 3 . 1 I N T E R P H A S E 1 5 1 . 3 . 2 M I T O S I S 1 6 1 . 3 . 3 S Y N C H R O N I Z E D P O P U L A T I O N S O F C E L L S . . . . 1 8 1 . 4 I M P O R T A N C E O F LOW D O S E S T U D I E S 21 1 . 5 P U R P O S E O F T H E S I S 2 4 2 . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 2 6 2 . 1 C U L T U R E T E C H N I Q U E 2 6 2 . 2 S Y N C H R O N Y T E C H N I Q U E 2 7 2 . 2 . 1 T A B L E - S H A K E M E T H O D 2 7 2 . 2 . 2 M I T O T I C S E L E C T I O N U S I N G T H E T A L A N D I C C C A . 2 8 2 . 2 . 2 . 1 P R E P A R A T I O N O F T H E R O L L E R B O T T L E S 3 0 2 . 2 . 2 . 2 S E E D I N G T H E R O L L E R B O T T L E S . . . . 3 1 i v 2 . 2 . 2 . 3 O B T A I N I N G M I T O T I C C E L L S 3 4 2 . 2 . 3 M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y A D R U G B L O C K 3 5 2 . 3 E X P E R I M E N T A L T E C H N I Q U E 3 6 2 . 3 . 1 E X P E R I M E N T S U S I N G A S Y N C H R O N O U S C E L L S . . . 3 6 2 . 3 . 2 E X P E R I M E N T S U S I N G S Y N C H R O N I Z E D C E L L S . . . 3 7 2 . 3 . 2 . 1 M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E 3 7 2 . 3 . 2 . 2 M I T O T I C S E L E C T I O N W I T H D R U G B L O C K 3 8 2 . 3 . 3 I R R A D I A T I O N A N D P L A T I N G P R O C E D U R E . . . . 3 8 2 . 3 . 4 C A L C U L A T I O N O F S U R V I V I N G F R A C T I O N . . . . 4 1 2 . 3 . 5 C A L C U L A T I O N O F T H E R M S D E V I A T I O N 4 2 2 . 3 . 6 S T A T I S T I C A L A N A L Y S I S T E S T S 4 3 2 . 4 P R O C E D U R E S F O R D E T E R M I N I N G D E G R E E O F S Y N C H R O N Y . 4 3 2 . 4 . 1 D E T E R M I N A T I O N O F M I T O T I C I N D E X 4 4 2 . 4 . 2 S I N G L E D O S E R E S P O N S E O F S Y C H R O N I Z E D C E L L S 4 5 2 . 4 . 3 H I S T O G R A M S O F T H E D N A D I S T R I B U T I O N . . . . 4 6 3 . R E S U L T S 4 8 3 . 1 E V A L U A T I N G T H E Q U A L I T Y O F S Y N C H R O N Y 4 8 3 . 1 . 1 M I T O T I C I N D E X 4 8 3 . 1 . 2 S I N G L E D O S E R E S P O N S E O F S Y N C H R O N I Z E D C E L L S 5 3 3 . 1 . 3 F L O U R E S C E N C E A N A L Y S I S O F D N A D I S T R I B U T I O N S 5 6 3 . 2 A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S 6 1 3 . 2 . 1 I N I T I A L S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S E X P E R I M E N T S 6 1 3 . 2 . 2 S E C O N D S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S E X P E R I M E N T S 7 0 3 . 3 S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S 7 9 3 . 3 . 1 M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E 7 9 3 . 3 . 1 . 1 R E S P O N S E O F G 1 P H A S E C E L L S . . . . 7 9 V . 3 . 3 . 1 . 2 G1 P H A S E C E L L S E X P O S E D T O T R Y P S I N 8 1 3 . 3 . 1 . 3 R E S P O N S E O F S P H A S E C E L L S . . . . 8 2 3 . 3 . 2 M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y A D R U G B L O C K 9 1 3 . 3 . 2 . 1 H Y D R O X Y U R E A 9 1 3 . 3 . 2 . 2 A P H I D I C O L I N 9 3 4 . D I S C U S S I O N 1 0 8 4 . 1 D E G R E E O F S Y N C H R O N Y 1 0 8 4 . 1 . 1 S Y C H R O N I Z A T I O N B Y M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E 1 0 8 4 . 1 . 2 M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y A D R U G B L O C K 1 1 1 4 . 2 A S Y N C H R O N O U S E X P E R I M E N T S 1 1 3 4 . 3 P O S S I B L E C A U S E S O F T H E S U B S T R U C T U R E 1 1 6 4 . 3 . 1 H Y P O T H E S I S 1 1 1 7 4 . 3 . 2 H Y P O T H E S I S 2 1 1 8 4 . 3 . 3 H Y P O T H E S I S 3 1 2 6 4 . 3 . 3 . 1 M I T O T I C S E L E C T I O N + D R U G B L 6 C K . . 1 2 7 4 . 3 . 3 . 2 M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E 1 3 3 5 . C O N C L U S I O N 1 4 1 6 . A P P E N D I X 1 4 3 7 . B I B L I O G R A P H Y 1 4 9 v i L I S T O F T A B L E S T a b l e T i t l e P a g e I M o d e l s O f C e l l I n a c t i v a t i o n 6 I I V a l u e s F o r M i t o t i c I n d e x a n d I n d e x o f S y n c h r o n y . . . 5 1 I I I S t a t i s t i c a l R e s u l t s - A s y n c h r o n o u s C e l l D a t a . . . . 7 1 I V S t a t i s t i c a l R e s u l t s - M i t o t i c S e l e c t i o n A l o n e . . . . 8 3 V S t a t i s t i c a l R e s u l t s - M i t o t i c S e l e c t i o n + H U o r A P H . 9 5 V I M o d e l F i t P a r a m e t e r s - S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a . . 1 2 2 V I I M o d e l F i t P a r a m e t e r s - S e r i e s 2 A s y n c h r o n o u s D a t a . . 1 2 3 V I I I M o d e l F i t P a r a m e t e r s - M i t o t i c S e l e c t i o n + H U ( G 1 / S ) 1 2 9 I X M o d e l F i t P a r a m e t e r s - M i t o t i c S e l e c t i o n + H U ( S ) . . 1 3 0 X M o d e l F i t P a r a m e t e r s - M i t o t i c S e l e c t i o n + A P H . . . 1 3 1 X I M o d e l F i t P a r a m e t e r s - M i t o t i c S e l e c t i o n A l o n e ( G 1 ) . 1 3 6 v i i L I S T O F F I G U R E S F i g u r e T i t l e P a g e 1 P h a s e s O f T h e C e l l C y c l e A n d M i t o s i s 1 4 2 D i a g r a m O f T a l a n d i c C e l l C y c l e A n a l y z e r 3 3 3 D i a g r a m O f I r r a d i a t i o n S e t - U p 4 0 4 P h o t o g r a p h s O f C e l l s I n M i t o s i s A n d I n t e r p h a s e . . . 5 2 5 S i n g l e D o s e ( 8 G y ) I r r a d i a t i o n P r o f i l e 5 5 6 F l o w C y t o m e t r y D i s t r i b u t i o n s A f t e r S y n c h r o n y . . . . 5 9 7 C o m p u t e d F i t T o A D N A H i s t o g r a m 6 0 8 I n i t i a l S e r i e s O f A s y n c h r o n o u s E x p e r i m e n t s - I . . . 6 4 9 I n i t i a l S e r i e s O f A s y n c h r o n o u s E x p e r i m e n t s - I I . . . 6 5 1 0 S e p a r a t e F i t s T o S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a - I . . . 6 6 11 S e p a r a t e F i t s T o S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a - I I . . 6 7 12 L o w D o s e S u r v i v a l S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a - I . . 6 8 1 3 L o w D o s e S u r v i v a l S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a - I I . . 6 9 1 4 S e c o n d S e r i e s O f A s y n c h r o n o u s C e l l E x p e r i m e n t s - I . 7 2 1 5 S e c o n d S e r i e s O f A s y n c h r o n o u s C e l l E x p e r i m e n t s - I I . 7 3 1 6 P a r t i c l e V o l u m e D i s t r i b u t i o n s 7 7 17 D N A D i s t r i b u t i o n O f A s y n c h r o n o u s C e l l P o p u l a t i o n s . . 7 8 1 8 M i t o t i c S e l e c t i o n G 1 P h a s e C e l l I r r a d i a t i o n - I . . . 8 4 1 9 M i t o t i c S e l e c t i o n G 1 P h a s e C e l l I r r a d i a t i o n - I I . . 8 5 2 0 S e p a r a t e F i t s T o M i t o t i c S e l e c t i o n G 1 D a t a I . . . . 8 6 21 S e p a r a t e F i t s T o M i t o t i c S e l e c t i o n G 1 D a t a I I . . . . 8 7 2 2 G1 P h a s e C e l l s P r e t r e a t e d W i t h T r y p s i n 8 8 2 3 M i t o t i c S e l e c t i o n S P h a s e C e l l I r r a d i a t i o n - I . . . 8 9 2 4 M i t o t i c S e l e c t i o n S P h a s e C e l l I r r a d i a t i o n - I I . . . 9 0 v i i i F i g u r e T i t l e P a g e 2 5 M i t o t i c S e l e c t i o n + H y d r o x y u r e a G 1 / S P h a s e - I . . . 9 6 2 6 M i t o t i c S e l e c t i o n + H y d r o x y u r e a G 1 / S P h a s e - I I . . . 9 7 2 7 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + H U G 1 / S P h a s e - I . . 9 8 2 8 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + H U G 1 / S P h a s e - I I 9 9 2 9 M i t o t i c S e l e c t i o n + H y d r o x y u r e a S / G 2 P h a s e - I . . . 1 0 0 3 0 M i t o t i c S e l e c t i o n + H y d r o x y u r e a S / G 2 P h a s e - I I . . . . 1 0 1 31 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + H U S / G 2 P h a s e - I . 1 0 2 3 2 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + H U S / G 2 P h a s e - I I 1 0 3 3 3 M i t o t i c S e l e c t i o n + A p h i d i c o l i n G 1 / S P h a s e - I . . . 1 0 4 3 4 M i t o t i c S e l e c t i o n + A p h i d i c o l i n G 1 / S P h a s e - I I . . . 1 0 5 3 5 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + A P H G 1 / S P h a s e - I 1 0 6 3 6 S e p a r a t e F i t s M i t o t i c S e l e c t i o n + A P H G 1 / S P h a s e - I I 1 0 7 3 7 T h r e e C o m p o n e n t F i t - S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a . 1 1 5 3 8 M o d e l F i t s T o S e r i e s 1 A s y n c h r o n o u s D a t a 1 2 4 3 9 M o d e l F i t s T o S e r i e s 2 A s y n c h r o n o u s D a t a 1 2 5 4 0 M o d e l F i t s T o M i t o t i c S e l e c t i o n + HU S P h a s e D a t a . 1 3 2 4 1 M o d e l F i t s T o M i t o t i c S e l e c t i o n G 1 P h a s e D a t a . . . 1 3 7 4 2 S h o u l d e r e d S u r v i v a l P l o t W i t h A T e r m i n a l E x p o n e n t i a l 1 4 0 i x A C K N O W L E D G E M E N T S I h a v e d i s c o v e r e d t h a t a M a s t e r ' s t h e s i s i s n o t t h e p r o d u c t o f o n l y o n e p e r s o n ' s e f f o r t s . T h e r e a r e m a n y i n d i v i d u a l s t h a t I w o u l d l i k e t o t h a n k a n d a c k n o w l e d g e f o r t h e i r i n v a l u a b l e a s s i s t a n c e w i t h t h i s p r o j e c t . I g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e f i n a n c i a l s u p p o r t I r e c e i v e d i n t h e f o r m o f a t w o y e a r N a t u r a l S c i e n c e s a n d E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C o u n c i l s c h o l a r s h i p a n d t h e s u p p o r t p r o v i d e d b y t h e D e p a r t m e n t o f P h y s i c s a n d t h e B r i t i s h C o l u m b i a C a n c e r R e s e a r c h C e n t e r . I w i s h t o e x p r e s s m y d e e p e s t g r a t i t u d e t o D r . L . D. S k a r s g a r d , m y s u p e r v i s o r , f o r h i s e n c o u r a g e m e n t , g u i d a n c e a n d f i n a n c i a l s u p p o r t t h r o u g h o u t t h i s p r o j e c t . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . R. E. D u r a n d f o r h i s m a n y h e l p f u l s u g g e s t i o n s i n t h e c o u r s e o f t h i s i n v e s t i g a t i o n . I a m g r a t e f u l t o N a n c y L e p a r d a n d D e n i s e M c D o u g a l f o r t h e i r e n d u r i n g c o o p e r a t i o n a n d t e c h n i c a l e x p e r t i s e . I t h a n k A d r i a n a V i n c z a n f o r h e r m a n y h o u r s o f l a b o r i o u s c o l o n y c o u n t i n g a s s i s t a n c e . S p e c i a l t h a n k s t o S u s a n M a c P h a i l a n d D o u g l a s W i l s o n f o r t h e i r e n c o u r a g i n g w o r d s a n d o p t i m i s m a n d f o r g e n e r a l l y j u s t " b e i n g t h e r e " . I t h a n k m y m o t h e r a n d m y s i s t e r f o r a l w a y s e n c o u r a g i n g m e i n m y e n d e a v o r s a n d f o r t h e i r w a r m w o r d s o f s u p p o r t o v e r t h e y e a r s . W i t h s p e c i a l c o n s i d e r a t i o n I t h a n k m y ( s o o n t o b e ) w i f e P a t r i c i a f o r h e r u n e n d i n g l o v e , u n d e r s t a n d i n g , p e r s e v e r a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h e p a s t 2 ^ y e a r s . W i t h o u t h e r g e n t l e a n d l o v i n g s u p p o r t I c o u l d n o t h a v e s a n e l y c o m p l e t e d t h i s w o r k . I t i s t o T r i s h t h a t I d e d i c a t e t h i s t h e s i s . X " T h e e a r t h i s t h e L o r d ' s , a n d a l l i t c o n t a i n s , T h e w o r l d , a n d t h o s e w h o d w e l l i n i t . F o r H e h a s f o u n d e d i t u p o n t h e s e a s , A n d e s t a b l i s h e d i t u p o n t h e r i v e r s . " ( P s a l m 2 4 : 1 - 2 ) 1 1. I N T R O D U C T I O N 1.1 R A D I A T I O N W i t h t h e d i s c o v e r y o f t h e X - r a y i n 1895 b y R o e n t g e n a n d t h e s u b s e q u e n t e x p l o r a t i o n s i n t o t h e h i d d e n w o r l d o f t h e a t o m a n d n u c l e u s , m a n k i n d h a s g r a p p l e d w i t h t h e p o t e n t i a l b e n e f i t a n d h a z a r d i n h e r e n t i n t h i s f o r m o f i n v i s i b l e e n e r g y . N e a r l y a c e n t u r y a f t e r i t s f o r t u i t o u s d i s c o v e r y , t h e p h y s i c a l b a s i s o f r a d i a t i o n i s w e l l u n d e r s t o o d , b u t i t s p r a c t i c a l b e n e f i t s c o n t i n u e t o b e e x p l o r e d a n d i t s p o t e n t i a l f o r h a r m r e s p e c t e d . T h e d i s c i p l i n e o f r a d i o b i o l o g y h a s e m e r g e d t o s t u d y t h e a c t i o n o f i o n i z i n g r a d i a t i o n s o n l i v i n g t h i n g s . T h e s u c c e s s f u l a p p l i c a t i o n o f r a d i a t i o n t o i m p r o v e t h e h u m a n c o n d i t i o n , p a r t i c u l a r l y i n i t s u s e f o r t h e t r e a t m e n t o f c a n c e r , h a s b e e n a s i g n i f i c a n t a c h i e v m e n t o f t h e s c i e n t i f i c p r o c e s s i n t h e t w e n t i e t h c e n t u r y . A l l h u m a n b e i n g s a r e e x p o s e d t o r a d i a t i o n o n a d a i l y b a s i s f r o m n a t u r a l a n d m a n - m a d e s o u r c e s . N a t u r a l l y o c c u r i n g r a d i a t i o n s i n c l u d e ( 1 ) c o s m i c r a y s , ( 2 ) e x t e r n a l g a m m a r a y s a r i s i n g f r o m t h e r a d i o a c t i v i t y o f c e r t a i n e l e m e n t s , p r i n c i p a l l y u r a n i u m , p o t a s s i u m a n d t h o r i u m , t h a t o c c u r n a t u r a l l y i n t h e e a r t h s c r u s t , a n d ( 3 ) i n t e r n a l r a d i a t i o n a r i s i n g f r o m r a d i o a c t i v e m a t e r i a l s , p r i n c i p a l l y p o t a s s i u m - 4 0 , c a r b o n - 1 4 a n d r a d o n , t h a t a r e n a t u r a l l y p r e s e n t i n o u r b o d i e s . I n a d d i t i o n t o t h e n a t u r a l b a c k g r o u n d r a d i a t i o n f u r t h e r e x p o s u r e s r e s u l t f r o m m a n - m a d e m a t e r i a l s a n d d e v i c e s w h i c h i n c l u d e p r i n c i p a l l y X - r a y s a n d r a d i o p h a r m a c e u t i c a l s i n m e d i c i n e , a n d t o a m u c h l e s s e r e x t e n t e x p o s u r e f r o m s m o k e d e t e c t o r s , t h e a t m o s p h e r i c t e s t i n g o f n u c l e a r w e a p o n s , a c c i d e n t s i n n u c l e a r p o w e r p l a n t s a n d v a r i o u s o t h e r s o u r c e s . T h e a b s o r b e d d o s e o f r a d i a t i o n r e c e i v e d i n a t y p i c a l 2 l i f e t i m e f r o m n a t u r a l s o u r c e s i s e s s e n t i a l l y m a t c h e d b y t h e c o n t r i b u t i o n from m a n - m a d e sources, e f f e c t i v e l y d o ubling the average exposure d o s e (Johns and Cunningham 1 9 8 3 ) . I t i s t h u s o f p e r s o n a l i m p o r t a n c e t o h a v e a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e e f f e c t s o f r a d i a t i o n o n b i o l o g i c a l s y s t e m s . R a d i a t i o n s m a y b e c l a s s i f i e d i n t o t w o c a t e g o r i e s , i o n i z i n g a n d n o n -i o n i z i n g r a d i a t i o n . N o n - i o n i z i n g r a d i a t i o n s , i n c l u d i n g u l t r a v i o l e t , v i s i b l e l i g h t , i n f r a r e d a n d r a d i o w a v e s , t r a n s f e r e n o u g h e n e r g y t o r a i s e a n e l e c t r o n o f a t a r g e t a t o m t o a h i g h e r e n e r g y s t a t e b u t w i t h o u t e j e c t i n g i t f r o m t h e a t o m . I o n i z i n g r a d i a t i o n s , i n c l u d i n g X , g a m m a , b e t a a n d a l p h a - r a y s , p r o t o n s a n d h e a v y i o n s , t r a n s f e r s u f f i c i e n t e n e r g y t o a n a t o m t o c a u s e t h e e j e c t i o n o f o n e o r m o r e o f t h e o r b i t a l e l e c t r o n s . T h e l a r g e , l o c a l i z e d r e l e a s e o f e n e r g y b y i o n i z i n g r a d i a t i o n m a y c a u s e t h e b r e a k a g e o r r e a r r a n g e m e n t o f s t r o n g c h e m i c a l b o n d s . T h e e j e c t e d e l e c t r o n s c a u s e i o n i z a t i o n a n d e x c i t a t i o n o f o t h e r e l e c t r o n s r e s u l t i n g i n f u r t h e r i o n i z a t i o n s a n d e x c i t a t i o n s u n t i l a l l o f t h e a v a i l a b l e e n e r g y i s e x p e n d e d . D a m a g e t o a t o m s a n d m o l e c u l e s b y r a d i a t i o n m a y o c c u r t h r o u g h a d i r e c t i o n i z a t i o n o f t h e a t o m o r m o l e c u l e o r t h r o u g h a n i n d i r e c t r e a c t i o n w i t h p r i m a r y r a d i c a l s p e c i e s , p r i n c i p a l l y t h o s e c r e a t e d t h r o u g h i o n i z a t i o n o f t h e w a t e r m o l e c u l e . T h e m e c h a n i s m s a n d t y p e s o f d a m a g e r e s u l t i n g f r o m n o n - i o n i z i n g a n d i o n i z i n g r a d i a t i o n a r e q u i t e d i s t i n c t . T h e e f f e c t s o f o n l y i o n i z i n g r a d i a t i o n w i l l b e c o n s i d e r e d i n t h i s t h e s i s . T h e e f f e c t s o f r a d i a t i o n o n b i o l o g i c a l s y s t e m s b e c a m e a p p a r e n t s o o n a f t e r t h e d i s c o v e r y o f t h e X - r a y , w i t h o f t e n t r a g i c c o n s e q u e n c e s f o r t h e p i o n e e r i n g s c i e n t i s t s w h o w e r e e x p o s e d t o l a r g e d o s e s o f r a d i a t i o n . M o r e r e c e n t l y , t h e r e h a s b e e n c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n t h e e f f e c t s o f l o w d o s e s o f r a d i a t i o n . C o r r e l a t i o n h a s b e e n s u g g e s t e d b e t w e e n l o w r a d i a t i o n d o s e s a n d a n i n c r e a s e d i n c i d e n c e o f s o m e t y p e s o f c a n c e r s , p a r t i c u l a r l y l e u k e m i a 3 a n d l u n g c a n c e r , f o r s o m e g r o u p s o f e x p o s e d p e r s o n s s u c h a s a t o m i c b o m b s u r v i v o r s o f J a p a n , r a d i o l o g i s t s , n o n - c a n c e r o u s p a t i e n t s t r e a t e d w i t h r a d i a t i o n a n d m i n e r s o f r a d i o a c t i v e o r e ( L e w i s 1 9 5 7 , U N S C E A R 1 9 8 2 , B E I R I I I ) . T h e r e i s a n a p p a r e n t n e e d t o u n d e r s t a n d t h e f u n d a m e n t a l m e c h a n i s m ( s ) o f r a d i a t i o n i n t e r a c t i o n w i t h b i o l o g i c a l m a t t e r a t l o w d o s e . D u e t o s t a t i s t i c a l a n d t e c h n o l o g i c a l l i m i t a t i o n s , e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a t l o w d o s e w e r e t y p i c a l l y a v a i l a b l e o n l y b y e x t r a p o l a t i o n f r o m h i g h d o s e d a t a . I t w o u l d b e v a l u a b l e t o o b t a i n s t a t i s t i c a l l y r e l e v a n t d a t a o n t h e e f f e c t s o f r a d i a t i o n o n m a m m a l i a n c e l l s u s i n g a c c u r a t e e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e a t l o w d o s e . T h e " e n d p o i n t " m a y b e d e f i n e d a s t h a t e f f e c t m e a s u r e d a t t h e e n d o f a n e x p e r i m e n t . F o r t h e p u r p o s e s o f t h i s t h e s i s t h e e n d p o i n t u s e d i s t h e r e t e n t i o n o f p r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y o f m a m m a l i a n c e l l s . F r o m t h i s p e r s p e c t i v e , a v i a b l e c e l l i s o n e t h a t h a s r e t a i n e d i t s c a p a c i t y f o r s u s t a i n e d p r o l i f e r a t i o n . T h e " l e t h a l " e f f e c t o f r a d i a t i o n i s t h e n t h a t e f f e c t w h i c h r e s u l t s i n t h e l o s s o f r e p r o d u c t i v e i n t e g r i t y . A " s u r v i v o r " i s a c e l l w h i c h , a f t e r r e c e i v i n g a d o s e o f r a d i a t i o n , r e t a i n s i t s r e p r o d u c t i v e i n t e g r i t y a n d i s a b l e t o p r o l i f e r a t e t o p r o d u c e a l a r g e c l o n e o r c o l o n y . T h e t e r m " s u r v i v i n g f r a c t i o n " ( u s u a l l y d e s i g n a t e d b y S ) r e f e r s t o t h a t f r a c t i o n o f c e l l s t h a t h a s " s u r v i v e d " a d o s e o f r a d i a t i o n a n d h a s b e e n a b l e t o g e n e r a t e a c l o n e o f l i k e c e l l s . T h e s e d e f i n i t i o n s w i l l b e u s e d t h r o u g h o u t t h i s t h e s i s ( H a l l 1 9 8 8 , B r o s i n g 1 9 8 3 ) . T h e t e r m " a b s o r b e d d o s e " o r s i m p l y " d o s e " r e f e r s t o t h e e n e r g y a b s o r b e d f r o m i o n i z i n g r a d i a t i o n p e r u n i t m a s s o f t h e m e d i u m . T h e SI u n i t f o r d o s e i s t h e g r a y ( G y ) w h i c h r e p r e s e n t s t h e a b s o r p t i o n o f 1 j o u l e o f e n e r g y p e r k i l o g r a m o f i r r a d i a t e d m a t e r i a l . A r e c e n t l y a b a n d o n e d , b u t c o m m o n l y u s e d , m e a s u r e o f a b s o r b e d d o s e i s t h e r a d , w h i c h i s s m a l l e r t h a n 4 t h e G y b y a f a c t o r o f 100 (1 G y = 100 r a d s = 1 J / k g ) (Johns and Cunningham 1 9 8 3 ) . 1.2 M O D E L S O F C E L L U L A R I N A C T I V A T I O N T h e r e t e n t i o n o f r e p r o d u c t i v e i n t e g r i t y b y m e m b e r s o f a n i r r a d i a t e d c e l l p o p u l a t i o n m a y b e a s s e s s e d b y t h e s c o r i n g o f s u r v i v i n g ( c o l o n y f o r m i n g ) c e l l s ; i t i s m u c h m o r e d i f f i c u l t t o s c o r e t h e n u m b e r o f k i l l e d c e l l s (Puck and Marcus 1 9 5 6 ) . T h e d o s e - e f f e c t r e l a t i o n s h i p m a y t h e n b e d e s c r i b e d i n t e r m s o f s u r v i v a l a s a f u n c t i o n o f d o s e . T h e g r a p h i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h i s r e l a t i o n s h i p , u s u a l l y p r e s e n t e d w i t h s u r v i v i n g f r a c t i o n p l o t t e d o n a l o g a r i t h m i c s c a l e a n d d o s e p l o t t e d o n a l i n e a r s c a l e , i s r e f e r r e d t o a s a " s u r v i v a l c u r v e " . T h e u s e o f a l o g a r i t h m i c , r a t h e r t h a n l i n e a r , s c a l e f o r t h e p l o t t i n g o f s u r v i v a l a l l o w s f o r t h e p r a c t i c a l v i s u a l e x a m i n a t i o n o f s m a l l l e v e l s o f s u r v i v a l ( l e s s t h a n 1&) t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h h i g h e r d o s e s . A s w e l l , t h e d o s e - s u r v i v a l r e l a t i o n s h i p m a y b e w e l l d e s c r i b e d o n t h e o r e t i c a l g r o u n d s b y a n e x p o n e n t i a l b a s e d m o d e l w h o s e f o r m m a y b e m o r e e a s i l y v i s u a l i z e d o n a l o g a r i t h m i c s c a l e . I t w o u l d s e e m a n u n l i k e l y p r o s p e c t t h a t t h e d o s e - s u r v i v a l r e l a t i o n s h i p f o r a b i o l o g i c a l l y h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f c e l l s c o u l d b e a d e q u a t e l y d e s c r i b e d b y a s i m p l e a l g e b r a i c e x p r e s s i o n (Alper 1 9 7 9 ) . I t i s n o n e t h e l e s s c o n v e n i e n t t o d e s c r i b e t h e s u r v i v a l r e s p o n s e b y s u c h a n e x p r e s s i o n e v e n i f i t i s o n l y r e g a r d e d a s a n a p p r o x i m a t i o n . M a n y d i f f e r e n t m o d e l s a n d t h e o r i e s h a v e b e e n p r e s e n t e d t o d e s c r i b e m a m m a l i a n c e l l s u r v i v a l . T h e s e m o d e l s a r e u s u a l l y b a s e d o n s o m e h y p o t h e s i s a s t o t h e b a s i c m e c h a n i s m b y w h i c h r a d i a t i o n p r o d u c e s b i o l o g i c a l d a m a g e o r c h a n g e a n d t h e y o f t e n a r e e x p r e s s e d i n a r e l a t i v i l y s i m p l e a l g e b r a i c f o r m . S u c h e x p r e s s i o n s a l l o w f o r t h e c o m p a r i s o n o f c u r v e s f o r c e l l s o f d i f f e r e n t l i n e s 5 o r f o r t h e s a m e c e l l l i n e i r r a d i a t e d u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s ( G o o d h e a d 1 9 8 0 ) . T a b l e I l i s t s a f e w o f t h e m o d e l s m o s t c o m m o n l y c i t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e i r u s e f o r a n a l y s i s o f d a t a i n t h i s t h e s i s r e f l e c t s t h e i r w i d e s p r e a d a p p l i c a t i o n ( b u t n o t n e c e s s a r i l y s u i t a b i l i t y ) i n d e s c r i b i n g m a m m a l i a n c e l l s u r v i v a l . 1.2.1 S i m p l e T a r g e t T h e o r y T h e s i m p l e s t f o r m o f t a r g e t t h e o r y f o l l o w s f r o m t h e c o n s i d e r a t i o n t h a t t h e i n a c t i v a t i o n o f c e l l s i s a r a n d o m p r o c e s s t h a t c a n b e d e s c r i b e d s t a t i s t i c a l l y b y t h e P o i s s o n d i s t r i b u t i o n : p a , n = ( a ° e " a ) / n ! ( 1 ) w h e r e P a n i s t h e p r o b a b i l i t y o f ' n ' e v e n t s o c c u r i n g f o r ' a ' , t h e a v e r a g e n u m b e r o f r a n d o m e v e n t s ( h i t s ) i n a c e l l o r t a r g e t . A s s u m i n g s i m p l e s i n g l e h i t , s i n g l e t a r g e t t h e o r y i n w h i c h o n l y a s i n g l e e v e n t i s s u f f i c i e n t t o c a u s e l e t h a l i t y , t h e n o n l y t h o s e c e l l s t h a t h a v e r e c e i v e d n o h i t s ( i e . n=0 ) w i l l s u r v i v e . F o r a l a r g e n u m b e r o f e v e n t s , t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n i s t h e n e q u a l t o P a > u > t n e p r o b a b l i t y t h a t a c e l l w i l l r e c e i v e n o h i t s : s = p a , 0 = a ° e _ a / 0 ! = e _ a ( 2 ) I f t h e a v e r a g e n u m b e r o f h i t s ' a ' i s p r o p o r t i o n a l t o t h e d o s e D ( i e . a = k D ) t h e n t h e e x p r e s s i o n f o r t h e s u r v i v a l b e c o m e s S = e " k D ( 3 ) 6 w h e r e V i s t h e i n a c t i v a t i o n c o n s t a n t . T h e d o s e w h i c h g i v e s o n a v e r a g e o n e h i t ( o r e v e n t ) p e r t a r g e t ( t h e i n a c t i v a t i o n d o s e ) i s c a l l e d D Q a n d m a y b e f o u n d b y e q u a t i n g e q u a t i o n s 2 a n d 3 f o r a=1 a n d D = D Q : - k D _ -1 e - e o r , k D Q - 1 t h e r f o r e , k = 1 / D Q H e n c e , e q u a t i o n 3 c a n b e w r i t t e n i n t e r m s o f D Q a s S = e - ° / D o ( 4 ) S i m p l e t a r g e t t h e o r y r e s u l t s i n a n e x p o n e n t i a l t h a t a p p e a r s a s a s t r a i g h t l i n e w h e n p l o t t e d o n s e m i - l o g a r i t h m i c g r a p h p a p e r . I t s a p p l i c a b i l i t y l i e s m a i n l y i n t h e d e s c r i p t i o n o f t h e i n a c t i v a t i o n o f e n z y m e s a n d v i r u s e s ( A l p e r 1 9 7 9 ) . T A B L E I M O D E L S O F C E L L I N A C T I V A T I O N M O D E L E Q U A T I O N S i n g l e - H i t S i n g l e T a r g e t S = e ( " D / D o ) S i n g l e - H i t M u l t i T a r g e t S = 1 - [1 - e ( - ° / D o ) ] n S i n g l e - H i t M u l t i T a r g e t w i t h i n i t i a l s l o p e S = • < - ° / D 1 ) { 1 - [1 - e ( - ° / D o ) ] n } L i n e a l — Q u a d r a t i c S = e x p ( - c t D - P D 2 ) R e p a i r - M i s R e p a i r t w o p a r a m e t e r f o r m S = e ( " 6 D ) ( 1 + 6 D / 6 ) e R e p a i r - M i s r e p a i r t h r e e p a r a m e t e r f o r m S = e ( " 6 D ) (1 + S D / e ) 6 * 7 1.2.2 S h o u l d e r e d S u r v i v a l M o d e l s S u r v i v a l c u r v e s f o r m a m m a l i a n c e l l s i r r a d i a t e d w i t h X - r a y s c o m m o n l y d i s p l a y a t l o w d o s e a r e g i o n w h e r e t h e r e i s a s m a l l e r p r o p o r t i o n o f c e l l s k i l l e d p e r u n i t d o s e t h a n a f t e r l a r g e r d o s e s . T h e i n i t i a l , l o w d o s e r e g i o n i s o f t e n r e f e r r e d t o a s t h e " s h o u l d e r " o f t h e s u r v i v a l c u r v e . M a n y s u r v i v a l m o d e l s a c c o m m o d a t e t h e a p p e a r a n c e o f a s h o u l d e r i n t h e c u r v e , o f t e n t h r o u g h u n d e r l y i n g t h e o r i e s f o r i t s c a u s e s u c h a s t h e a c c u m u l a t i o n o r r e p a i r o f d a m a g e . T h e t w o p a r a m e t e r s i n g l e h i t , m u l t i t a r g e t m o d e l a l l o w s f o r a n i n i t i a l s h o u l d e r e d r e g i o n w i t h z e r o s l o p e a n d t e r m i n a t i n g w i t h a n e x p o n e n t i a l a t h i g h e r d o s e s . T h e t h e o r y u n d e r l y i n g t h e m o d e l a s s u m e s t h a t t h e c e l l s c o n t a i n ' n ' t a r g e t s , e a c h o f w h i c h m u s t b e i n a c t i v a t e d i n o r d e r t o c a u s e c e l l l e t h a l i t y . U s i n g t h e s a m e d e f i n i t i o n s f o r t h e p a r a m e t e r s a s o u t l i n e d p r e v i o u s l y , t h e p r o b a b i l i t y t h a t a t a r g e t w i l l n o t b e i n a c t i v a t e d a s a r e s u l t o f a d o s e o f r a d i a t i o n i s e - D / D o a n d h e n c e t h e p r o b a b i l i t y t h a t a t a r g e t w i l l b e i n a c t i v a t e d i s (1 - e ~ ^ ^ ^ o ) . I n o r d e r f o r t h e c e l l t o b e k i l l e d a l l n t a r g e t s m u s t b e i n a c t i v a t e d w i t h a p r o b a b i l i t y o f (1 - e ~ D ^ D o ) n , a s s u m i n g a n e q u a l p r o b a b i l i t y f o r e a c h t a r g e t . T h e p r o b a b i l i t y o f t h e c e l l s u r v i v i n g i s t h e p r o b a b i l i t y o f n o t a l l o f t h e t a r g e t s b e i n g h i t , g i v e n b y S = 1 - (1 - e " D / D o ) n ( 5 ) F o r h i g h d o s e s e q u a t i o n 5 r e d u c e s t o S = n e " D / D o ( 6 ) w h i c h i s a s i m p l e e x p o n e n t i a l . T h i s m o d e l d e s c r i b e s t h e s u r v i v a l r e s p o n s e i n t e r m s o f t w o p a r a m e t e r s , n a n d D Q . T h e i n a c t i v a t i o n d o s e D Q i s t h e d o s e w h i c h p r o d u c e s o n a v e r a g e o n e h i t p e r t a r g e t a n d r e s u l t s i n t h e r e d u c t i o n 8 o f the s u r v i v a l b y a f a c t o r o f e ~ ^ o r 3735 i n t h e e x p o n e n t i a l r e g i o n . P l o t t e d i n s e m i - l o g a r i t h m i c f o r m , D Q m a y b e f o u n d a s t h e i n v e r s e o f t h e s l o p e o f t h e t e r m i n a l e x p o n e n t i a l r e g i o n . E x t r a p o l a t i n g t h e g r a p h t o t h e y -a x i s , t h e v a l u e o f n m a y b e f o u n d a s t h e y - a x i s i n t e r c e p t . A c c o r d i n g t o t h e t h e o r y o f t h i s m o d e l , n c o r r e s p o n d s t o t h e n u m b e r o f t a r g e t s t h a t n e e d t o b e i n a c t i v a t e d i n o r d e r t o c a u s e c e l l l e t h a l i t y a n d h e n c e n w a s o r i g i n a l l y r e f e r r r e d t o a s t h e t a r g e t n u m b e r . S i n c e i t h a s b e e n f o u n d t h a t n d e p e n d s o n t h e p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n o f t h e c e l l s , t h e i r s t a g e i n t h e c e l l c y c l e a n d u p o n i r r a d i a t i o n c o n d i t i o n s , t h e t e r m e x t r a p o l a t i o n n u m b e r w a s a d o p t e d t o r e f e r t o t h e p a r a m e t e r n ( E l k i n d a n d W h i t m o r e 1 9 6 7 ) . A c c o r d i n g t o e q u a t i o n 5, t h e i n i t i a l s l o p e o f t h e s u r v i v a l c u r v e a t z e r o d o s e s h o u l d b e z e r o , i m p l y i n g t h a t t h e f i r s t s m a l l i n c r e m e n t o f d o s e r e c e i v e d b y t h e c e l l s w o u l d n o t c a u s e l e t h a l i t y . T h e c o n c e p t o f a t h r e s h o l d d o s e b e l o w w h i c h e x p o s u r e w o u l d c a u s e n o p e r m a n e n t h a r m i s i m p l i e d b y t h i s t h e o r y . M o s t e x p e r i m e n t a l d a t a , h o w e v e r , e x h i b i t s a n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e w h i c h i s b e t t e r a c c o m o d a t e d b y a n u m b e r o f d i f f e r e n t m o d e l s . T h e a d d i t i o n o f a o n e - h i t c o m p o n e n t t o t h e s i n g l e h i t , m u l t i t a r g e t m o d e l b y B e n d e r a n d G o o c h ( 1 9 6 2 ) a l l o w s f o r a n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e . T h e t w o c o m p o n e n t s i n g l e h i t , m u l t i t a r g e t ( S H + M T ) m o d e l S = e " D / D 1 [1 - (1 - e - ° / D o ) n ] ( 7 ) c o n t a i n s t h r e e p a r a m e t e r s D-j, D 0 a n d n . T h e o n e h i t c o m p o n e n t e ^/ D 1 d e s c r i b e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t a m o r e d e n s i n g i o n i z i n g p a r t i c l e m a y a c t a s a s i n g l e h i t t o e i t h e r s i m u l t a n e o u s l y i n a c t i v a t e a l l t a r g e t s , o r t o s i m u l t a n e o u s l y p r o v i d e s e v e r a l h i t s o n a t a r g e t r e q u i r i n g m o r e t h a n o n e h i t f o r i n a c t i v a t i o n ( A l p e r 1 9 7 9 ) . T h e p r e s e n c e o f t h r e e p a r a m e t e r s m a y p r o v i d e a b e t t e r f i t t o t h e d a t a , h o w e v e r i t m a y b e v e r y d i f f i c u l t t o 9 u n i q u e l y d e t e r m i n e t h e v a l u e s o f t h e t h r e e p a r m e t e r s w i t h o u t s p e c i f y i n g o n e o f t h e m . A s u r v i v a l m o d e l t h a t h a s b e e n s u g g e s t e d b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s o n t h e b a s i s o f e m p i r i c a l a s w e l l a s t h e o r e t i c a l g r o u n d s i s t h e l i n e a r - q u a d r a t i c ( L Q ) m o d e l : S = e x p ( - a D - 3 D 2 ) ( 8 ) T h i s m o d e l a l l o w s f o r a n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e a n d a c o n t i n u o u s l y b e n d i n g f o r m a t h i g h d o s e . T h e m o d e l w a s f i r s t p r o p o s e d b y S i n c l a i r e m p i r i c a l l y w h o o b s e r v e d t h a t i t p r o v i d e d a g o o d f i t t o h i s d a t a ( S i n c l a i r 1 9 6 6 ) . T w o t h e o r e t i c a l f o r m u l a t i o n s b a s e d o n q u i t e d i f f e r e n t s e t s o f a s s u m p t i o n s h a v e f o l l o w e d r e s u l t i n g i n t h e s a m e f o r m o f t h e e q u a t i o n . K e l l e r e r a n d R o s s i b a s e d t h e i r r a t i o n a l e o n t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e r e l a t i v e b i o l o g i c a l e f f e c t i v e n e s s ( R B E ) o f n e u t r o n s c o m p a r e d t o X - r a y s v a r i e d i n v e r s e l y w i t h t h e n e u t r o n d o s e a s f o l l o w s ( K e l l e r e r a n d R o s s i 1 972 , 1 9 7 8 ) : R B E a ( n e u t r o n d o s e ) ~ 1 / / 2 ( 9 ) R B E m a y b e d e f i n e d a s D x / D n , t h e r a t i o o f d o s e s o f X - r a y s a n d n e u t r o n s r e q u i r e d t o g i v e t h e s a m e e f f e c t . S i n c e R B E = D x / D n , s u b s t i t u t i n g f o r t h e - 1 / 2 d e t e r m i n e d r e l a t i o n R B E a D n ' g i v e s D x / D n = c o n s t a n t • Dn~^^2 t h e r e f o r e , D x = k • D n 1 / 2 o r , D x 2 = k • D n ( 1 0 ) K e l l e r e r a n d R o s s i r e a s o n e d t h a t f o r r a d i a t i o n o f h i g h L E T ( L i n e a r E n e r g y T r a n s f e r - t h e a m o u n t o f e n e r g y r e l e a s e d p e r u n i t p a t h l e n g t h o f a n 1 0 i o n i z i n g p a r t i c l e ) , l e t h a l e v e n t s a c c u m u l a t e d l i n e a r l y w i t h d o s e a c c o r d i n g t o s i n g l e h i t , s i n g l e t a r g e t t h e o r y . F o r r a d i a t i o n o f l o w L E T , l e t h a l e v e n t s w e r e s u g g e s t e d t o a c c u m u l a t e a s t h e s q u a r e o f t h e d o s e , ie i n a c t i v a t i o n o f a c e l l t a r g e t r e q u i r e d e n e r g y d e p o s i t i o n b y t w o i n d e p e n d a n t e l e c t r o n s w i t h i n t h e t a r g e t v o l u m e . T h e t w o s u b l e s i o n s t h a t r e s u l t m u s t t h e n i n t e r a c t i n o r d e r t o i n a c t i v a t e t h e c e l l . T h e r f o r e , d a m a g e b y h i g h L E T p a r t i c l e s i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o d o s e a n d d a m a g e b y l o w L E T p a r t i c l e s i s p r o p o r t i o n a l t o t h e s q u a r e o f t h e d o s e . B o t h h i g h a n d l o w L E T c o m p o n e n t s a r e p r e s e n t i n t h e s p e c t r u m o f p r i m a r y e l e c t r o n s t h a t r e s u l t f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f X - r a y s w i t h m a t t e r . T h e t w o t e r m s m a y b e r e g a r d e d a s s e p a r a t e l y d e s c r i b i n g t h e i n t r a t r a c k e v e n t s , b y t h e l i n e a r t e r m , a n d t h e i n t e r t r a c k e v e n t s , b y t h e q u a d r a t i c t e r m . T h e c o n s t a n t s a a n d p t h e n d e s c r i b e c e l l k i l l b y t h e s i n g l e - h i t a n d d o u b l e - h i t m e c h a n i s m s r e s p e c t i v e l y . C h a d w i c k a n d L e e n h o u t s a r r i v e d a t t h e s a m e e q u a t i o n b a s e d o n t h e i r " M o l e c u l a r T h e o r y o f C e l l S u r v i v a l " ( C h a d w i c k and L e e n h o u t s 1 9 7 3 , 1 9 8 5 ) . T h e i r a s s u m p t i o n w a s t h a t c e l l i n a c t i v a t i o n r e s u l t e d f r o m t h e i n d u c t i o n o f u n r e p a i r a b l e d o u b l e - s t r a n d b r e a k s i n t h e D N A . T h e b r e a k s c o u l d o c c u r e i t h e r a s a r e s u l t o f a s i n g l e e v e n t o c c u r i n g i n b o t h s t r a n d s ( a n d h e n c e w o u l d b e d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o d o s e ) o r f r o m s e p a r a t e e v e n t s r e s u l t i n g i n a s i n g l e s t r a n d b r e a k i n e a c h o f t h e t w o s t r a n d s l o c a t e d i n c l o s e p r o x i m i t y t o e a c h o t h e r ( p r o p o r t i o n a l t o t h e s q u a r e o f t h e d o s e ) . T h e p a r a m e t e r s a a n d p t h e n r e p r e s e n t t h e d a m a g e r e s u l t i n g f r o m a s i n g l e e v e n t d o u b l e s t r a n d b r e a k o r f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f t w o s i n g l e s t r a n d b r e a k s i n t h e D N A , r e s p e c t i v e l y . T h e L Q m o d e l h a s b e e n s h o w n b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s t o p r o v i d e a v e r y g o o d f i t t o m a n y d i f f e r e n t t y p e s o f d a t a ( B l a k e l y 1 9 8 5 , G i l l e s p i e 1 1 e t a l 1 9 7 5 a b , H a l l 1 9 8 8 , K e l l e r e r and R o s s i 1 9 7 2 , 1 9 7 8 , C h a d w i c k and L e e n h o u t s 1 9 8 5 ) . T h e r e i s s o m e q u e s t i o n , h o w e v e r , a s t o t h e n a t u r e o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e a t h i g h d o s e . A l p e r h a s s u g g e s t e d t h a t t h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e i n s u p p o r t o f a t e r m i n a l e x p o n e n t i a l r e g i o n t o s h o u l d e r e d s u r v i v a l c u r v e s ( A l p e r 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ) . T h e L Q e q u a t i o n m a y b e r e g a r d e d t h e n a s o n l y a l o w d o s e a p p r o x i m a t i o n w h i c h c o u l d n o t a d e q u a t e l y a c c o m o d a t e a t e r m i n a l e x p o n e n t i a l . I n h e r f o r m u l a t i o n , t h e p r o p o s e d b a s i c m e c h a n i s m o f c e l l k i l l i n g b y r a d i a t i o n i s s i n g l e - h i t i n a c t i v a t i o n . T h e s h o u l d e r o f t h e s u r v i v a l c u r v e m a y b e e v i d e n c e o f a r e p a i r p r o c e s s o p e r a t i n g a t t h e o u t s e t o f t h e i r r a d i a t i o n b u t b e c o m i n g l e s s e f f e c t i v e a t h i g h e r d o s e s , u n t i l i n a c t i v a t i o n o c c u r s w i t h o u t c o n c o m i t a n t r e p a i r . A n e x a m p l e o f a r e p a i r m o d e l i s t h e R e p a i r M i s R e p a i r ( R M R ) m o d e l o f T o b i a s e t a l ( T o b i a s e t a l 1 9 8 0 , 1 9 8 5 ) . T h e m o d e l a s s u m e s t h a t t h e f a t e o f a g i v e n l e s i o n r e s u l t i n g f r o m a d o s e o f r a d i a t i o n i s i n i t i a l l y u n c e r t a i n , b u t m a y o v e r t i m e b e r e p a i r e d , m i s r e p a i r e d o r r e m a i n a s a r e m n a n t l e s i o n . T h e t w o p a r a m e t e r f o r m o f t h e R M R e q u a t i o n i s : w h e r e t h e p a r a m e t e r 6 i s t h e y i e l d o f u n c o m m i t t e d ( t o r e p a i r o r m i s r e p a i r ) l e s i o n s p e r d o s e , a n d £ i s t h e r e p a i r r a t i o o f l i n e a r s e l f - r e p a i r t o q u a d r a t i c m i s - r e p a i r . F u r t h e r , i f t h e a s s u m p t i o n s a r e m a d e t h a t t h e t o t a l t i m e a v a i l a b l e f o r r e p a i r i s f i x e d , p e r h a p s d u e t o p r o g r e s s i o n t h r o u g h t h e c e l l c y c l e , a n d t h a t l i n e a r s e l f - r e p a i r i s n o t a p e r f e c t p r o c e s s , t h e n a t h r e e p a r a m e t e r f o r m r e s u l t s : S = e " S D (1 + S D / e ) e ( 1 1 ) S = e - 6 D (1 + 5 D / £ ) e ? > ( 1 2 ) w h e r e 0 i s t h e p r o b a b i l i t y t h a t l i n e a r s e l f - r e p a i r i s e u r e p a i r ( s u c c e s s f u l ) . E q u a t i o n 11 h a s z e r o i n i t i a l s l o p e w h e r e a s e q u a t i o n 12 h a s n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e i n d i c a t i n g i n c o m p l e t e r e p a i r . B o t h f o r m s o f t h e e q u a t i o n b e n d c o n t i n u o u s l y a t h i g h d o s e . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t a n y o f t h e s u r v i v a l m o d e l s t h a t a l l o w f o r a n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e c a n b e e x p a n d e d t o g i v e a p o l y n o m i a l o f t h e f o r m l n ( S ) = - ( a + b D + c D 2 + d D 3 +...) ( 1 3 ) w h e r e a=0 s i n c e t h e d a t a i s u s u a l l y n o r m a l i z e d t o S=1 a t z e r o d o s e . A t l o w d o s e , a g o o d d e s c r i p t i o n o f t h e d a t a c a n u s u a l l y b e o b t a i n e d b y f i t t i n g t o t h e f i r s t t w o p a r a m e t e r s o f t h e e x p a n s i o n , w i t h a=0, w h i c h i s i n r e a l i t y j u s t t h e L Q e q u a t i o n . I t s h o u l d b e n o t e d a l s o t h a t t h e a b i l i t y o f a m o d e l t o p r o v i d e a g o o d f i t t o t h e d a t a d o e s n o t v e r i f y t h e u n d e r l y i n g a s s u m p t i o n s o f t h e m o d e l . I t s i m p l y s t a t e s t h a t t h e d a t a c a n b e d e s c r i b e d b y t h a t p a r t i c u l a r a l g e b r a i c e x p r e s s i o n . 13 1.3 THE CELL CYCLE O n e o f t h e f u n d a m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s o f a l i v i n g c e l l i s i t s a b i l i t y t o r e p r o d u c e . A l l n e w c e l l s a r e f o r m e d f r o m t h e r e p r o d u c t i o n o f e x i s t i n g c e l l s a n d t h e c o n t i n u e d e x i s t e n c e o f a c e l l u l a r s p e c i e s r e q u i r e s s u c h a p r o c e s s i n o r d e r t o e n s u r e i t s l o n g t e r m s u r v i v a l ( P r e s c o t t 1 9 7 8 ) . C e l l r e p r o d u c t i o n c o n s i s t s o f t h e g r o w t h o f t h e c e l l , t h e d u p l i c a t i o n o f i t s c h r o m o s o m e s a n d i t s u l t i m a t e d i v i s i o n i n t o t w o i d e n t i c a l d a u g h t e r c e l l s . G r o w t h o c c u r s a s t h e c e l l s y n t h e s i z e s a d d i t i o n a l m o l e c u l e s o f b a s i c c e l l c o n s t i t u e n t s s u c h a s p r o t e i n s , e n z y m e s , n u c l e i c a c i d s , c a r b o h y d r a t e s , l i p i d s a n d o t h e r c o m p o n e n t s e s s e n t i a l t o t h e c e l l a n d i t s p r o g e n y . C h r o m o s o m e d u p l i c a t i o n i s n e c e s s a r y i n o r d e r t o p r o v i d e e a c h d a u g h t e r c e l l w i t h a n i d e n t i c a l c o m p l e m e n t o f g e n e t i c m a t e r i a l . C e l l d i v i s i o n , t h e n , a l l o w s f o r t h e d i s t r i b u t i o n o f c y t o p l a s m i c p a r t s a n d n u c l e a r m a t e r i a l t o t h e d a u g h t e r c e l l s ( P r e s c o t t 1 9 7 8 ) . T h i s p r o c e s s o f g r o w t h , c h r o m o s o m e d u p l i c a t i o n a n d c e l l d i v i s i o n o c c u r s o v e r a t i m e c o u r s e k n o w n a s t h e " c e l l c y c l e " o r " m i t o t i c c y c l e " . I t b e g i n s w i t h t h e f o r m a t i o n o f a d a u g h t e r c e l l b y d i v i s i o n , c o n t i n u e s t h r o u g h t h e p r o c e s s e s o f c e l l g r o w t h a n d c h r o m o s o m e d u p l i c a t i o n , a n d e n d s w i t h t h e d i v i s i o n o f t h a t c e l l i n t o t w o n e w d a u g h t e r c e l l s . T h e t i m e t a k e n t o c o m p l e t e o n e c e l l c y c l e i s c a l l e d t h e " g e n e r a t i o n t i m e " , " m i t o t i c c y c l e t i m e " o r " c e l l c y c l e t i m e " . M o s t o f t h e g e n e r a t i o n t i m e i s o c c u p i e d b y t h e p e r i o d b e t w e e n d i v i s i o n s , c a l l e d " i n t e r p h a s e " , d u r i n g w h i c h t i m e t h e c e l l d o u b l e s i t s m a s s a n d d u p l i c a t e s a l l o f i t s c o n t e n t s i n p r e p a r a t i o n f o r t h e n e x t d i v i s i o n . T h e d i v i s i o n p r o c e s s i t s e l f o c c u p i e s o n l y a r e l a t i v e l y s m a l l p o r t i o n o f t h e g e n e r a t i o n t i m e . D u r i n g t h i s t i m e , h o w e v e r , t h e p r o c e s s e s o f n u c l e a r d i v i s i o n , c a l l e d " m i t o s i s " , a n d c y t o p l a s m i c d i v i s i o n , c a l l e d " c y t o k i n e s i s " , o c c u r . 14 M Late Anaphase F I G U R E 1. P H A S E S OF T H E C E L L C Y C L E AND M ITOS IS a). T h e s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e f o r a c t i v e l y g r o w i n g mammal ian ce l l s . M, mi tos i s ; S, t h e DNA s y n t h e t i c s t a g e ; G1 a n d G 2 , t h e g a p s i n DNA s y n t h e s i s b e f o r e a n d a f t e r S p h a s e , b ) . T h e p h a s e s o f m i to s i s : p r o p h a s e , m e t a p h a s e , a n a p h a s e a n d t e l o p h a s e . T h e c o n f i g u r a t i o n o f t h e c h r o m o s o m e s a t t h e v a r i o u s s t a g e s o f m i tos i s a r e s h o w n s c h e m a t i c a l l y . 1 5 1.3.1 I n t e r p h a s e H o w a r d a n d P e l c w e r e t h e f i r s t t o o b s e r v e t h a t i n t e r p h a s e w a s c o m p o s e d o f t h r e e s e p a r a t e p h a s e s ( H o w a r d a n d P e l c 1 9 5 3 ) . T h e y d e t e r m i n e d t h a t t h e p r o c e s s o f D N A s y n t h e s i s o c c u r e d d u r i n g a d i s c r e t e t i m e i n t e r v a l i n t h e m i d d l e o f i n t e r p h a s e a n d t h a t t h i s p h a s e w a s b o t h p r e c e e d e d a n d f o l l o w e d b y g a p s i n D N A s y n t h e t i c a c t i v i t y . T h e y r e f e r r e d t o t h e s e s t a g e s a s S p h a s e , t h e p e r i o d o f D N A s y n t h e s i s , G1 p h a s e , t h e f i r s t g a p p r i o r t o D N A s y n t h e s i s , a n d G 2 p h a s e , t h e s e c o n d g a p o c c u r i n g a f t e r t h e D N A h a d b e e n d o u b l e d b u t b e f o r e d i v i s i o n , w h i c h w a s r e f e r r e d t o a s M p h a s e , t h e m i t o t i c s t a g e . S i n c e c e l l r e p r o d u c t i o n i s c y c l i c a l l y r e p e a t e d f o r e a c h g e n e r a t i o n o f c e l l s , i t m a y b e r e p r e s e n t e d b y a c i r c l e a s s h o w n i n f i g u r e 1a . T h e c i r c u m f e r e n c e o f t h e c i r c l e r e p r e s e n t s t h e o v e r a l l g e n e r a t i o n t i m e . T h e p o r t i o n o f t h e c y c l e t i m e o c c u p i e d b y e a c h p h a s e o f t h e c e l l c y c l e i s l a b e l l e d a p p r o p r i a t e l y a s G 1 , S , G 2 o r M . T h e G1 p h a s e b e g i n s w i t h t h e e n d o f t h e p r e v i o u s d i v i s i o n a n d c o n t i n u e s t o t h e o n s e t o f c h r o m o s o m a l D N A s y n t h e s i s . C e l l u l a r g r o w t h b e g i n s i n G 1 , w i t h t h e s y n t h e s i s o f s t r u c t u r e s a n d m a c r o m o l e c u l e s c o n t i n u i n g t h r o u g h o u t t h e S a n d G 2 p h a s e s . N o s p e c i f i c e v e n t s o c c u r i n G1 t h a t w o u l d u n i q u e l y c h a r a c t e r i z e i t i n t h e s a m e w a y t h a t S p h a s e i s u n i q u e l y c h a r a c t e r i z e d b y D N A s y n t h e s i s . P r e p a r a t i o n s f o r i n i t i a t i n g D N A s y n t h e s i s p r o b a b l y a r e c a r r i e d o u t i n G 1 . I n a d d i t i o n t o g e n e r a l c e l l g r o w t h , G1 a l s o c o n t a i n s s t o p - s t a r t s i g n a l s t h a t d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c e l l w i l l p r o c e e d t h r o u g h S a n d G 2 t o t h e n e x t d i v i s i o n o r r e m a i n t e m p o r a r i l y o r p e r m a n e n t l y a r r e s t e d i n G1 ( P r e s c o t t 1 9 7 8 , B e c k e r 1 9 8 6 ) . T h e S p h a s e b e g i n s w i t h t h e i n i t i a t i o n o f D N A s y n t h e s i s a n d c o n t i n u e s t o t h e c o m p l e t i o n o f t h i s p r o c e s s . I t i s d u r i n g t h i s t i m e t h a t t h e g e n e t i c i n f o r m a t i o n i s d o u b l e d i n p r e p a r a t i o n f o r t h e e q u a l d i v i s i o n o f t h e c h r o m o s o m e s i n m i t o s i s . D N A s y n t h e s i s o c c u r s s e m i c o n s e r v a t i v e l y a n d i s a c c o m p a n i e d b y t h e s y n t h e s i s o f h i s t o n e p r o t e i n s t h a t i m m e d i a t e l y b i n d t o t h e D N A . T h e G 2 p h a s e b e g i n s w i t h t h e t e r m i n a t i o n o f D N A s y n t h e s i s a n d e n d s w i t h t h e i n i t i a t i o n o f m i t o s i s . I t i s a l s o a p e r i o d o f c o n t i n u e d g e n e r a l g r o w t h w i t h o u t a n y u n i q u e l y c h a r a c t e r i z i n g e v e n t s . I t i s l i k e l y t h a t G 2 p h a s e i s o c c u p i e d b y p r e p a r a t i o n s f o r m i t o s i s a n d c y t o k i n e s i s , i n p a r t i c u l a r t h e p r o d u c t i o n o f t h o s e f a c t o r s i n v o l v e d i n c o n d e n s i n g t h e i n t e r p h a s e c h r o m o s o m e s a n d r e q u i r e d f o r c o n s t r u c t i o n o f t h e m i t o t i c a p p a r a t u s . 1.3.2 Mitosis T h e b e g i n n i n g o f m i t o s i s i s v i s u a l l y e v i d e n t b y t h e p r o g r e s s i v e c o n d e n s a t i o n ( t h i c k e n i n g a n d c o i l i n g ) o f t h e d u p l i c a t e d i n t e r p h a s e c h r o m o s o m e s a n d e n d s w i t h t h e s u b s e q u e n t s e p a r a t i o n o f t h e t w o d a u g h t e r c e l l s ( c y t o k i n e s i s ) . T h e e v e n t s o f m i t o s i s m a y b e f u r t h e r s u b d i v i d e d i n t o f o u r p h a s e s : p r o p h a s e , m e t a p h a s e , a n a p h a s e a n d t e l o p h a s e , a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 1 b . P r o p h a s e i s m a r k e d b y t h e a p p e a r a n c e o f t h e c h r o m o s o m e s a s t h e y p r o g r e s s i v e l y c o n d e n s e a n d b e c o m e v i s i b l e w h e n v i e w e d u n d e r a l i g h t m i c r o s c o p e . D u r i n g S p h a s e , e a c h c h r o m o s o m e h a s d u p l i c a t e d s o t h a t t h e y c o n s i s t o f t w o s i s t e r c h r o m a t i d s j o i n e d t o g e t h e r a t a p o i n t c a l l e d t h e c e n t r o m e r e . B y l a t e p r o p h a s e , t h e n u c l e a r e n v e l o p e h a s b e g u n t o f r a g m e n t , t h e n u c l e o l i d i s a p p e a r a n d m o s t o f t h e n u c l e a r p r o t e i n s a n d a l l o f t h e R N A a r e r e l e a s e d i n t o t h e c y t o p l a s m . A s t r u c t u r e c a l l e d t h e m i t o t i c s p i n d l e b e g i n s t o a p p e a r a t t h e p o l e s o f t h e n u c l e u s . I t s f i b e r s a p p e a r t o a i d t h e c o n d e n s e d c h r o m o s o m e s t o a l i g n a l o n g t h e e q u a t o r ( m e t a p h a s e p l a t e ) o f t h e 17 n u c l e u s d u r i n g m e t a p h a s e . D u r i n g a n a p h a s e , t h e s i s t e r c h r o m a t i d s b e g i n t o s e p a r a t e a s t h e y a r e d r a w n a w a y f r o m e a c h o t h e r a n d t o w a r d o p p o s i t e s p i n d l e s , a n d h e n c e t o o p p o s i t e e n d s o f t h e c e l l . A t t h e s a m e t i m e , t h e s p i n d l e p o l e s a l s o b e g i n t o m i g r a t e i n o p p o s i t e d i r e c t i o n s a l o n g w i t h t h e s e p a r a t e d d a u g h t e r c h r o m o s o m e s w h i c h a r r i v e a t t h e p o l e s o f t h e s p i n d l e b y t h e b e g i n n i n g o f t e l o p h a s e . T h e d a u g h t e r c h r o m o s o m e s b e g i n t o u n c o i l i n t e l o p h a s e a n d r e v e r t t o t h e i r i n t e r p h a s e a p p e a r a n c e . T h e s p i n d l e f i b e r s d i s a p p e a r , t h e n u c l e a r e n v e l o p e r e f o r m s , n u c l e o l i b e g i n t o r e a p p e a r a n d t h e R N A a n d p r o t e i n s o r i g i n a l l y f r o m t h e n u c l e u s r e t u r n t o t h e t w o d a u g h t e r n u c l e i . T h e f i n a l e v e n t i n c e l l d i v i s i o n i s c y t o k i n e s i s w h e r e t h e c y t o p l a s m i s d i v i d e d b e t w e e n t h e d a u g h t e r c e l l s . T h e c e l l s a r e t h e n a b l e t o i n d e p e n d e n t l y p r o g r e s s t h r o u g h t h e i r o w n c e l l c y c l e s . I t h a s b e e n o b s e r v e d b y m a n y i n v e s t i g a t o r s t h a t s e v e r a l p r o p e r t i e s o f a c e l l a p p e a r t o r e l a t e t o i t s p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e ( M i t c h i s o n 1971, M a z i a 1961). I n p a r t i c u l a r , t h e r a d i o s e n s i t i v i t y o f a p o p u l a t i o n o f c e l l s a p p e a r s t o v a r y a s a f u n c t i o n o f c e l l c y c l e p o s i t i o n a s w a s f i r s t s h o w n b y T e r a s i m a a n d T o l m a c h i n 1961 f o r t h e h u m a n c e l l l i n e H e L a . S h o r t l y t h e r e a f t e r i n 1 9 6 3 , S i n c l a i r a n d M o r t o n s h o w e d t h a t C h i n e s e h a m s t e r c e l l s i n l a t e S p h a s e w e r e m o s t r e s i s t a n t t o t h e e f f e c t s o f r a d i a t i o n , w h i l e t h o s e a t o r c l o s e t o m i t o s i s w e r e t h e m o s t s e n s i t i v e . T h e r e a s o n f o r t h i s v a r i a t i o n i s s t i l l n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d a l t h o u g h i t m a y r e l a t e t o t h e f i x a t i o n o r r e p a i r o f d a m a g e t o t h e D N A o r t o a v a r i a t i o n i n t h e l e v e l s o f n a t u r a l l y o c c u r i n g s u l f h y d r y l c o m p o u n d s i n t h e c e l l t h a t a c t a s r a d i o p r o t e c t o r s . I n o r d e r t o m a k e s u c h m e a s u r e m e n t s , h o w e v e r , p o p u l a t i o n s o f u n i f o r m a g e s p e c i f i c i t y m u s t b e o b t a i n e d , w h i c h i s t h e t o p i c o f t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . 1 8 1.3.3 Synchronized Populations of Cells A n a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n i n e x p o n e n t i a l g r o w t h i s c o m p r i s e d o f c e l l s i n a l l o f t h e s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e . T h e y a r e u s u a l l y p r e s e n t i n q u a n t i t i e s r e l a t e d t o t h e f r a c t i o n o f t h e t o t a l g e n e r a t i o n t i m e o c c u p i e d b y t h a t s t a g e . R e s u l t s o b t a i n e d u s i n g a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n s , t h e n , r e f l e c t t h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e c o n s t i t u e n t c e l l s a n d m a y b e c o n s i d e r e d a s a n a g e - a v e r a g e d r e s p o n s e . O b s e r v a t i o n a n d i n t e r p r e t a t i o n i n m a n y s i t u a t i o n s m a y b e g r e a t l y s i m p l i f i e d b y u s i n g c e l l p o p u l a t i o n s o f u n i f o r m a g e . I t i s o f g r e a t b e n e f i t t o o b t a i n c e l l c u l t u r e s t h a t h a v e b e e n s y n c h r o n i z e d w i t h r e s p e c t t o s o m e p o i n t i n t h e c e l l c y c l e ( K l e v e c z 1 9 7 5 ) . T h e m e t h o d s u s e d t o o b t a i n s y n c h r o n o u s c u l t u r e s m a y b e d i v i d e d i n t o t w o b r o a d c l a s s e s . T h e f i r s t a r e i n d u c t i o n s y n c h r o n y t e c h n i q u e s i n w h i c h a l l o f t h e c e l l s o f a c u l t u r e a r e i n d u c e d t o d i v i d e s y c h r o n o u s l y b y s o m e t r e a t m e n t , a n d t h e s e c o n d a r e s e l e c t i o n s y n c h r o n y t e c h n i q u e s , i n w h i c h a c e r t a i n s e g m e n t o f a c e l l p o p u l a t i o n t h a t i s a t a p a r t i c u l a r s t a g e o f t h e c e l l c y c l e i s s e p a r a t e d o f f a n d g r o w n a s a s e p a r a t e s y n c h r o n o u s c u l t u r e ( M i t c h i s o n 1 9 7 1 ) . A n e x a m p l e o f a s e l e c t i o n s y n c h r o n y t e c h n i q u e i s m i t o t i c s e l e c t i o n . T h e t e c h n i q u e i s b a s e d o n t h e s t r u c t u r a l c h a n g e s t h a t a c c o m p a n y t h e p r o g r e s s o f a m a m m a l i a n c e l l f r o m i n t e r p h a s e t o m i t o s i s . I n t e r p h a s e c e l l s g r o w i n g o n t h e s u r f a c e o f a c u l t u r e v e s s e l r e m a i n s p r e a d o u t a n d a r e q u i t e f i r m l y a t t a t c h e d . D u r i n g m i t o s i s , h o w e v e r , t h e y r o u n d u p i n t h e s h a p e o f a s p h e r e a n d b e c o m e v e r y l o o s l y a t t a t c h e d t o t h e s u r f a c e b y t h i n c y t o p l a s m i c s t r a n d s , a s s h o w n i n f i g u r e 4 a . T h e c o n s t i t u e n t s o f t h e m i c r o t u b u l e s , t u b u l i n , t h a t b i n d t h e i n t e r p h a s e c e l l s f i r m l y t o t h e v e s s e l s u r f a c e a r e r e c r u i t e d i n m i t o s i s t o f o r m t h e s p i n d l e a p p a r a t u s , h e n c e c a u s i n g t h e m i t o t i c c e l l t o r o u n d u p a n d b e l e s s f i r m l y a t t a t c h e d . T h e m i t o t i c c e l l s a r e t h u s e a s i l y r e m o v e d f r o m t h e v e s s e l s u r f a c e b y s h a k i n g t h e c u l t u r e v e s s e l r e s u l t i n g i n a s h e a r f o r c e o f g r o w t h m e d i u m t h a t d i s l o d g e s t h e d i v i d i n g c e l l s w i t h m i n i m a l d i s t u r b a n c e t o i n t e r p h a s e c e l l s . T h e r e s u l t i n g p o p u l a t i o n o f m i t o t i c c e l l s m a y t h e n b e r e m o v e d a n d g r o w n a s a s y n c h r o n o u s c u l t u r e , a l t h o u g h a s l i g h t d e g r e e o f c o n t a m i n a t i o n b y i n t e r p h a s e c e l l s i s c o m m o n . T h i s t e c h n i q u e w a s f i r s t u s e d b y T e r a s i m a a n d T o l m a c h a n d i s c o n s i d e r e d t h e m e t h o d o f c h o i c e f o r p r o d u c i n g s y n c h r o n o u s c u l t u r e s f r o m c e l l s g r o w i n g o n s o l i d s u r f a c e s ( T e r a s i m a a n d T o l m a c h 1 9 6 1 ) . S i n c e t h e r e s u l t i n g p o p u l a t i o n i s s y n c h r o n i z e d i n m i t o s i s , w i t h i n a s h o r t t i m e t h e y w i l l p r o g r e s s i n t o G1 p h a s e a n d c o n t i n u e t o p r o c e e d t h r o u g h t h e c e l l c y c l e . H o w e v e r , d e c a y i n t h e s y n c h r o n y o c c u r s r a t h e r q u i c k l y d u e t o v a r i a t i o n i n t h e g e n e r a t i o n t i m e f o r i n d i v i d u a l c e l l s . T h e p r o c e s s o f m i t o t i c s e l e c t i o n m a y b e c o m b i n e d w i t h a n i n d u c t i o n s y n c h r o n y t e c h n i q u e i n o r d e r t o f u r t h e r i n c r e a s e t h e q u a l i t y o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n . A n e x a m p l e o f a n i n d u c t i o n s y n c h r o n y t e c h n i q u e i s t h e a d d i t i o n o f a c h e m i c a l i n h i b i t o r t o a p o p u l a t i o n o f c e l l s ( A s h i h a r a a n d B a s e r g a 1 9 7 9 , G r d i n a e t a l 1 9 8 4 , H a l l 1 9 8 8 , M i t c h i s o n 1 9 7 1 , N i a s a n d F o x 1 9 7 1 , S t u b b l e f i e l d 1 9 6 8 ) . A n i n h i b i t o r g e n e r a l l y a c t s a t o n e s t a g e o f t h e c e l l c y c l e c a u s i n g a n a c c u m u l a t i o n o f c e l l s a t t h i s p o i n t s o t h a t a f t e r r e l e a s e f r o m t h e i n h i b i t o r t h e p o p u l a t i o n i s a b l e t o p r o g r e s s s y n c h r o n o u s l y . T w o i n h i b i t o r s o f D N A s y n t h e s i s a r e h y d r o x y u r e a a n d a p h i d i c o l i n . A d d i t i o n o f t h e s e d r u g s t o a c e l l p o p u l a t i o n c a u s e s a c c u m u l a t i o n a t t h e G 1 / S b o r d e r . R e m o v a l o f t h e d r u g s r e s u l t s i n a p o p u l a t i o n h i g h l y s y n c h r o n i z e d a t t h e G 1 / S b o r d e r t h a t c a n t h e n b e a l l o w e d t o p r o g r e s s t o t h e d e s i r e d s t a g e i n t h e c e l l c y c l e . H y d r o x y u r e a a c t s b o t h a s a n i n h i b i t o r o f D N A s y n t h e s i s a n d a s a c y t o t o x i c a g e n t t o t h o s e c e l l s s y n t h e s i z i n g D N A a t t h e t i m e o f d r u g a d d i t i o n . H y d r o x y u r e a b l o c k s D N A s y n t h e s i s b y i n h i b i t i n g t h e r e d u c t i o n o f r i b o n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e ( N D P ) m o l e c u l e s t o d e o x y r i b o n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e ( d N D P ) m o l e c u l e s w h i c h a r e t h e p r e c u r s o r s o f D N A . T h e e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h i s r e a c t i o n , r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e , c o n t a i n s a f r e e r a d i c a l t h a t i s e s s e n t i a l f o r c a t a l y s i s o f t h e r e d u c t i o n . H y d r o x y u r e a a c t s t o q u e n c h t h e f r e e r a d i c a l a n d h e n c e b l o c k t h e a c t i o n o f t h e e n z y m e i n c a t a l y z i n g t h e r e d u c t i o n o f N D P m o l e c u l e s t o d N D P . T h e r e s u l t i s t h a t t h e p o o l o f d N D P m o l e c u l e s n e c e s s a r y f o r D N A r e p l i c a t i o n i s n o t c r e a t e d a n d p r o g r e s s i o n f r o m G1 t o S p h a s e i s t h u s b l o c k e d . A n a c c u m u l a t i o n o f c e l l s a t t h e G1/S b o r d e r r e s u l t s ( S i n c l a i r 1967, S t r y e r 1988). A p h i d i c o l i n , a f u n g a l d i t e r p e n o i d , a c t s a s a n i n h i b i t o r o f D N A s y n t h e s i s b u t a p p e a r s n o t t o h a v e t h e s a m e c y t o t o x i c e f f e c t o n S p h a s e c e l l s a s h y d r o x y u r e a w h e n l o w c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d r u g a r e p r e s e n t . A p h i d i c o l i n b l o c k s D N A s y n t h e s i s b y i n h i b i t i n g D N A p o l y m e r a s e - a w h i c h i s t h e p r i m a r y e n z y m e i n v o l v e d i n n u c l e a r D N A r e p l i c a t i o n . T h e f u n c t i o n i n g o f p o l y m e r a s e - g , i n v o l v e d i n t h e r e p a i r o f n u c l e a r D N A , a n d o f p o l y m e r a s e -T, i n v o l v e d i n t h e r e p l i c a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l D N A , a p p e a r u n a f f e c t e d b y t h e a c t i o n s o f a p h i d i c o l i n . S i m i l a r t o t h e r e s u l t o f h y d r o x y u r e a , e x p o s u r e o f m a m m a l i a n c e l l s t o a p h i d i c o l i n r e s u l t s i n a b l o c k i n t h e p r o g r e s s i o n o f c e l l s f r o m G1 i n t o S p h a s e , h e n c e t h e r e i s a s u b s e q u e n t a c c u m u l a t i o n o f c e l l s a t t h e G 1 / S b o r d e r (Ikegami e t a l 1978, I l i a k i s 1982, 1989, Pedrali-Noy and Spadari 1979). I t i s i m p o r t a n t t o n o t e , h o w e v e r , t h a t a l t h o u g h b o t h h y d r o x y u r e a a n d a p h i d i c o l i n r e s u l t i n a n a c c u m u l a t i o n o f c e l l s a t t h e G 1 / S b o r d e r , t h e 2 1 m e c h a n i s m f o r t h e i r a c t i o n i s q u i t e d i f f e r e n t . S e p a r a t e e n z y m e s i n v o l v e d i n d i f f e r e n t a s p e c t s o f D N A r e p l i c a t i o n a r e b l o c k e d b y t h e t w o d r u g s . E x p o s u r e t o t h e s e o r o n e o f t h e m a n y o t h e r i n h i b i t o r y d r u g s t h a t a l i g n a p o p u l a t i o n a t a c e r t a i n s t a g e o f t h e c e l l c y c l e i s t y p i c a l l y c a r r i e d o u t f o r a p e r i o d e q u a l t o t h e g e n e r a t i o n t i m e o f t h e c e l l . D u r i n g t h i s t i m e , o t h e r c e l l u l a r p r o c e s s e s p r o c e e d n o r m a l l y s o t h a t u n b a l a n c e d g r o w t h a n d a p e r t u r b a t i o n i n m e t a b o l i s m a f t e r r e l e a s e a r e l i k e l y c o n s e q u e n c e s o f t h i s m e t h o d . H e n c e , a s e l e c t i o n t e c h n i q u e s u c h a s m i t o t i c s e l e c t i o n w h i c h i n d u c e s m i n i m a l o r n o p e r t u r b a t i o n i n t h e r e s u l t i n g p o p u l a t i o n , i s c o n s i d e r e d t o b e a n i d e a l m e t h o d i n t h e o r y . H o w e v e r , m a n y i n v e s t i g a t o r s h a v e f o u n d t h a t p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y e x p o s u r e t o h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n s h o w l i t t l e e f f e c t o f t h e d r u g o r t h e s t a t e o f u n b a l a n c e d g r o w t h i n t h e r e s p o n s e o f t h e p o p u l a t i o n t o r a d i a t i o n ( S i n c l a i r 1 9 6 7 ) . 1.4 IMPORTANCE O F LOW D O S E S T U D I E S S t u d i e s o n t h e e f f e c t s o f l o w d o s e s o f r a d i a t i o n o n b i o l o g i c a l s y s t e m s h a v e r e c e n t l y b e e n o f i n t e r e s t t o b o t h t h e g e n e r a l p u b l i c , w h o a r e c o n c e r n e d w i t h t h e p o s s i b l e h e a l t h e f f e c t s r e s u l t i n g f r o m e x p o s u r e t o l o w l e v e l s o f r a d i a t i o n , a n d t o t h e s c i e n t i f i c c o m m u n i t y , w h i c h i s a l s o i n t e r e s t e d i n u n d e r s t a n d i n g t h e b a s i c m e c h a n i s m s o f r a d i o b i o l g y . W i t h a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f r a d i o b i o l o g i c a l m e c h a n i s m s , i m p r o v e m e n t s m a y t h e n b e a p p l i e d t o r a d i a t i o n p r o t e c t i o n , r a d i o t h e r a p y a n d t h e m o d e l l i n g o f r a d i a t i o n i n t e r a c t i o n s w i t h m a t t e r . C a n c e r i n c i d e n c e i n C a n a d a h a s b e e n e s t i m a t e d a t o v e r o n e h u n d r e d t h o u s a n d n e w c a s e s p e r y e a r ( n o t i n c l u d i n g s k i n c a n c e r ) o r a b o u t 7 n e w c a s e s p e r 1 000 p e o p l e ( N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e 1 9 8 9 ) . O f t h e s e c a s e s , a b o u t 50% h a v e b e e n c o n t r o l l e d b y t h e t h r e e m a j o r m o d a l i t i e s , s u r g e r y , r a d i o t h e r a p y a n d c h e m o t h e r a p y . R a d i o t h e r a p y a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e o t h e r m o d a l i t i e s i s , t h u s , a n i m p o r t a n t t r e a t m e n t f o r t h e c o n t r o l o f c a n c e r f o r a l a r g e s e g m e n t o f t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f a c e l l p o p u l a t i o n , a r a d i o b i o l o g i s t u s u a l l y i r r a d i a t i e s a s a m p l e i n a s e r i e s o f d o s e i n c r e m e n t s w i t h i n a v e r y s h o r t p e r i o d o f t i m e o n t h e o r d e r o f m i n u t e s . S a m p l e s f o r a n a l y s i s a r e w i t h d r a w n a f t e r e a c h d o s e i n c r e m e n t . T h e a c c u m u l a t i o n o f t h e i n c r e m e n t s u p t o e a c h d o s e p o i n t r e p r e s e n t s a n a c u t e o r s i n g l e e x p o s u r e t o r a d i a t i o n . A r a d i o t h e r a p i s t , h o w e v e r , u s u a l l y d e l i v e r s a v e r y l a r g e d o s e (50 t o 80 G y ) i n a s e r i e s o f m u c h s m a l l e r f r a c t i o n s (1.5 t o 3 G y ) a d m i n i s t e r e d d a i l y s e v e r a l d a y s a w e e k o v e r a p e r i o d o f s e v e r a l w e e k s . I t h a s b e e n s h o w n b o t h i n v i t r o a n d in vivo t h a t i f s u f f i c i e n t time f o r r e p a i r i s a l l o w e d b e t w e e n s u c c e s s i v e f r a c t i o n s a g r e a t d e a l o f t h e s u b l e t h a l r a d i a t i o n d a m a g e w i l l b e r e p a i r e d ( E l k i n d and Sutton 1958, E l k i n d and Sutton 1960, E l k i n d and Whitmore 1967, McCulloch and. T i l l 1962). A p o p u l a t i o n o f c e l l s e x p o s e d t o a s e r i e s o f d o s e f r a c t i o n s r e s p o n d s t o e a c h f r a c t i o n a s t h o u g h i t w e r e d e l i v e r e d f r o m t h e i n i t i a l r e g i o n o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e . H e n c e , f r o m t h e r a d i o t h e r a p i s t ' s p e r s p e c t i v e , s u r v i v a l r e s p o n s e s o b t a i n e d a t h i g h d o s e f r o m a s i n g l e a c u t e e x p o s u r e m a y b e o f l i t t l e p r a c t i c a l v a l u e t o t h e c l i n i c a l s i t u a t i o n w h e r e t h e r e s p o n s e t o m u c h l o w e r d o s e s (1.5 t o 3 G y ) i s m o r e r e l e v a n t . A n e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e w h i c h c o u l d a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e s u r v i v a l r e s p o n s e a n d m o d e l p a r a m e t e r s a t l o w d o s e c o u l d b e o f g r e a t b e n e f i t f o r o p t i m i z a t i o n o f t r e a t m e n t p r o t o c o l s . D u r i n g t h e p a s t f e w y e a r s w i d e s p r e a d c o n c e r n h a s b e e n e x p r e s s e d r e g a r d i n g t h e h e a l t h e f f e c t s o f l o w l e v e l s o f i o n i z i n g r a d i a t i o n . S t u d i e s o n h u m a n s a n d o n l a b o r a t o r y a n i m a l s i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e t h r e e h e a l t h e f f e c t s t h a t n e e d t o b e e x a m i n e d a t l o w l e v e l s o f e x p o s u r e : c a n c e r i n d u c t i o n , b i r t h a b n o r m a l i t i e s ( f r o m in u t e r o e x p o s u r e ) a n d g e n e t i c e f f e c t s ( H e n d e e 1984, AAPM #18 1986). D i r e c t m e a s u r e m e n t o f t h e h e a l t h e f f e c t s d u e t o l o w d o s e e x p o s u r e w o u l d b e d e s i r a b l e b u t h a v e b e e n i n c o n c l u s i v e d u e t o t h e l o n g l a t e n t p e r i o d s a s s o c i a t e d w i t h m o s t r a d i a t i o n i n d u c e d i n j u r y i n h u m a n s a n d b e c a u s e o f t h e s t a t i s t i c a l l y c o m p l i c a t e d n a t u r e o f t h e i n j u r y e x p r e s s i o n a b o v e n o r m a l i n c i d e n c e . E s t i m a t e s o f r i s k a t l o w d o s e a r e u s u a l l y , t h e n , e x t r a p o l a t e d f r o m m o r e r e l i a b l e d a t a a t h i g h d o s e a c c o r d i n g t o a l i n e a r , l i n e a r - q u a d r a t i c o r q u a d r a t i c d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p . I n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d o s e a n d i n j u r y e x p r e s s i o n ( p r e s u m i n g a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e c e l l k i l l i n g , c a r c i n o g e n i c a n d g e n e t i c e f f e c t s o f r a d i a t i o n ) i s t h u s o f i m p o r t a n c e , e s p e c i a l l y d a t a o b t a i n e d a t l o w d o s e s (BEIR III 1980, UNSCEAR 1982). A c c u r a t e s u r v i v a l d a t a a t l o w d o s e s i s a l s o i m p o r t a n t f o r t h e e x a m i n a t i o n o f t h e v a r i o u s m o d e l s o f c e l l u l a r i n a c t i v a t i o n . T h e s e m o d e l s m a k e p r e d i c t i o n s a b o u t t h e c e l l u l a r r e s p o n s e a t l o w d o s e w h i c h c a n b e t e s t e d b y a c c u r a t e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s . F o r e x a m p l e , t h e t w o - p a r a m e t e r s i n g l e h i t , m u l t i t a r g e t m o d e l h a s a n i n i t i a l z e r o s l o p e , i n d i c a t i n g t h a t a t h r e s h o l d d o s e m a y n e e d t o b e r e c e i v e d b y a c e l l p r i o r t o e x h i b i t i n g r a d i a t i o n d a m a g e . I n c o n t r a s t , t h e l i n e a r - q u a d r a t i c m o d e l h a s a n o n - z e r o i n i t i a l s l o p e i n d i c a t i n g t h a t a n y d o s e w i l l c a u s e d a m a g e , a l t h o u g h t h e d a m a g e m a y b e q u i t e s m a l l . P r e c i s e m e a s u r e m e n t o f t h e c e l l u l a r r e s p o n s e t o l o w d o s e s o f r a d i a t i o n w o u l d h e l p d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e t w o p r e d i c t i o n s . M e a s u r e m e n t s o f c e l l s u r v i v a l d a t a i n t h e l o w d o s e r e g i o n m a y a l s o b e v a l u a b l e f o r a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f c e r t a i n m o d e l p a r a m e t e r s w h i c h i n m a n y i n s t a n c e s a r e e s t i m a t e d f r o m h i g h d o s e d a t a u n d e r a s s u m p t i o n s t h a t m a y n o t b e v a l i d . O v e r t h e p a s t d e c a d e , t h e r e h a s b e e n c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e g e n e r a t e d i n d i c a t i n g t h a t t h e r e m a y b e s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h o s e p a r a m e t e r s t h a t d e s c r i b e t h e i n i t i a l r e g i o n o f t h e in vitro s u r v i v a l r e s p o n s e o f h u m a n t u m o u r c e l l l i n e s a n d t h e c l i n i c a l r a d i o r e s p o n s i v e n e s s o f t h e c o r r e s p o n d i n g t u m o u r s ( F e r t i l e t a l 1 9 8 1 , 1 9 8 5 , D e a c o n e t a l 1 9 8 4 ) . T h e p a r a m e t e r s w h i c h p r o v i d e d t h e b e s t c o r r e l a t i o n w e r e t h e i n i t i a l s l o p e , a , t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n a t 2 G y , S2, a n d t h e m e a n i n a c t i v a t i o n d o s e , D ( F e r t i l 1 9 8 4 ) . O t h e r p a r a m e t e r s u s e d e x t e n s i v e l y i n t h e p a s t a n d b a s e d o n t h e s i n g l e h i t , m u l t i t a r g e t m o d e l a r e t h e e x t r a p o l a t i o n n u m b e r n , t h e a v e r a g e d o s e f o r o n e h i t p e r t a r g e t D Q a n d t h e q u a s i t h r e s h o l d d o s e D q , w h i c h i s t h e d o s e c o r r e s p o n d i n g t o t h e i n t e r s e c t i o n o f t h e h i g h d o s e e x p o n e n t i a l w i t h t h e s u r v i v a l f r a c t i o n a t S=1. A s w e l l , t h e r a t i o a/3 d e r i v e d f r o m t h e l i n e a l — q u a d r a t i c p a r a m e t e r s a a n d 0 h a s p a r t i c u l a r s i g n i f i c a n c e i n c a l c u l a t i o n s r e l a t e d t o f r a c t i o n a t e d d o s e s u s e d i n r a d i o t h e r a p y ( D o u g l a s a n d F o w l e r 1 9 7 5 , F o w l e r 1 9 8 7 ) . I t w o u l d b e o f e n o r m o u s b e n e f i t t o o b t a i n a c c u r a t e m e a s u r e m e n t s o f s u c h p a r a m e t e r s , p a r t i c u l a r l y i n t h e c l i n i c a l l y r e l e v a n t d o s e r a n g e o f 1.5 t o 3 G y . 1.5 P U R P O S E OF T H E T H E S I S T h e i m p o r t a n c e o f o b t a i n i n g a c c u r a t e s u r v i v a l d a t a i n t h e l o w d o s e r e g i o n h a s r e c e n t l y b e e n i n d i c a t e d b y t h e r e s u l t s o f S k a r s g a r d e t a l i n m e a s u r i n g t h e r e s p o n s e o f a n a s y n c h r o n o u s c u l t u r e o f V 7 9 - 1 7 1 c e l l s ( S k a r s g a r d e t a l 1 9 9 0 a , b , c ) T h e s u r v i v a l d a t a i n d i c a t e d t h e p r e s c e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e r e s p o n s e a t l o w d o s e i n t h e f o r m o f a d i s c o n t i n u i t y i n t h e s u r v i v a l c u r v e a t 2.8 G y t h a t c o u l d n o t b e a d e q u a t e l y c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e f i t t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c o r a n y o t h e r m o d e l o f c e l l i n a c t i v a t i o n . T h e d a t a s u g g e s t e d a t w o - c o m p o n e n t c h a r a c t e r t o t h e r e s p o n s e w h i c h l e d t o t h e f i t t i n g o f t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e d a t a s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n . T h i s r e s u l t e d i n a g o o d f i t t o t h e d a t a a n d a c o n s i s t e n t d i v e r g e n c e b e t w e e n t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e f i t s . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e f i t p a r a m e t e r s a l s o r e v e a l e d t h a t t h e s t r u c t u r e w a s r e p r o d u c i b l e . T h e p u r p o s e o f t h i s t h e s i s i s : 1 ) . t o o b t a i n a n d e x a m i n e t h e r a d i a t i o n r e s p o n s e o f a n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g p o p u l a t i o n o f V 7 9 - W N R E c e l l s , 2 ) . t o d e t e r m i n e i f a s i m i l a r t y p e o f s u b s t r u c t u r e a s o b s e r v e d p r e v i o u s l y f o r V 7 9 - 1 7 1 c e l l s i s p r e s e n t i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e o f V 7 9 - W N R E c e l l s , 3 ) . t o e x a m i n e p o s s i b l e h y p o t h e s e s t o e x p l a i n t h e s u b s t r u c t u r e i f i t i s o b s e r v e d . T h i s i n c l u d e s e x a m i n i n g t h e d a t a w i t h r e s p e c t t o v a r i o u s m o d e l s o f c e l l u l a r i n a c t i v a t i o n . A s w e l l , i t i n c l u d e s t h e d e t e r m i n a t i o n a n d e x a m i n a t i o n o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f c e l l p o p u l a t i o n s o f u n i f o r m a g e s y n c h r o n i z e d a t s o m e p o i n t i n t h e c e l l c y c l e . 2 6 2 . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 2.1 C U L T U R E T E C H N I Q U E T h e c u l t u r e d c e l l l i n e u s e d f o r a l l o f t h e i n - v i t r o b i o l o g i c a l e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e w a s t h e c e l l l i n e V 7 9 - W N R E , w h i c h w a s k i n d l y p r o v i d e d b y D r . J . D. C h a p m a n . T h e V 7 9 - W N R E i s a s t r a i n o f t h e C h i n e s e h a m s t e r l u n g c e l l l i n e V 7 9 - 3 7 9 - A ( m o d a l c h r o m o s o m e n u m b e r o f 2 1 ) w h i c h h a s b e e n a d a p t e d t o s p i n n e r c u l t u r e (Chapman e t a l 1 9 7 0 , 1 9 7 2 ) . T h e V 7 9 - W N R E c e l l s w e r e r o u t i n e l y g r o w n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e i n m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m S - 1 4 ( C a + + f r e e : G i b c o 4 1 0 - 1 4 0 0 , G r a n d I s l a n d , N.Y.) s u p p l e m e n t e d w i t h f e t a l b o v i n e s e r u m ( 7 % b y v o l u m e : G i b c o ) , p e n i c i l l i n ( 8 0 u n i t s / m l ) , s t r e p t o m y c i n ( 8 0 u n i t s / m l ) , a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e (2 .2 g/1). (Chapman 1 9 7 5 ) C u l t u r e s w e r e g r o w n i n a s p i n n e r v e s s e l ( B e l l c o H a n g i n g B a r S p i n n e r F l a s k , B e l l c o G l a s s I n c . ) a n d w e r e p r e - g a s s e d w i t h 35% a i r , 5% C 0 £ p r i o r t o g r o w t h a t 37 ° C i n a n i n c u b a t o r ( B i o m e d i c ) o n a s t i r t a b l e . T h e c e l l c u l t u r e w a s m a i n t a i n e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f b e t w e e n 2 x 1 0 ^ a n d 3 x 1 0 ^ c e l l s / m l t h r o u g h d a i l y d i l u t i o n s . T h e c e l l d o u b l i n g t i m e w a s 9 - 1 0 h o u r s d u r i n g a s y n c h r o n o u s e x p o n e n t i a l g r o w t h . T h e c e l l s c o u l d b e t r a n s f e r r e d f r o m s p i n n e r c u l t u r e t o m o n o l a y e r c u l t u r e w i t h e a s e . M o n o l a y e r c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d i n m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m F - 1 5 ( c o n t a i n i n g C a + + : G i b c o 4 1 0 - 1 5 0 0 ) , s u p p l e m e n t e d w i t h f e t a l b o v i n e s e r u m ( 1 2 . 5 % b y v o l u m e : G i b c o ) , p e n i c i l l i n ( 8 0 u n i t s / m l ) , s t r e p t o m y c i n ( 8 0 u n i t s / m l ) a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 2 .2 g/1). C u l t u r e s w e r e g r o w n a t 37 ° C i n a h u m i d i f i e d a t m o s p h e r e o f 9 5 % a i r , 5% CO2. S p i n n e r c u l t u r e w a s u s e d t o g r o w c e l l s o n a d a y - t o - d a y b a s i s . C e l l s w e r e t r a n s f e r r e d t o m o n o l a y e r w h e n n e e d e d f o r a s y n c h r o n o u s r a d i a t i o n e x p e r i m e n t s a n d f o r t h e s e e d i n g o f t h e t i s s u e c u l t u r e r o l l e r b o t t l e s u s e d f o r m i t o t i c s e l e c t i o n . 2.2 S Y N C H R O N Y T E C H N I Q U E F o r t h e e x p e r i m e n t s w i t h s y n c h r o n o u s c e l l s , a v a r i a t i o n o n t h e m i t o t i c s e l e c t i o n t e c h n i q u e o f T e r a s i m a a n d T o l m a c h ( 1 9 6 3 ) w a s e m p l o y e d e i t h e r a l o n e , t o o b t a i n a p o p u l a t i o n o f m i t o t i c / e a r l y G1 p h a s e c e l l s , o r i n c o m b i n a t i o n w i t h h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n , t o o b t a i n a p o p u l a t i o n o f G 1 / S p h a s e c e l l s . 2.2.1 T a b l e - S h a k e M e t h o d T h e e a r l y s y n c h r o n y w o r k o f T e r a s i m a a n d T o l m a c h i n v o l v e d a s i m p l e p r o c e d u r e o f g e n t l y p i p e t t i n g f r e s h m e d i u m o v e r a m o n o l a y e r o f c e l l s , r e s u l t i n g i n t h e r e l e a s e o f t h o s e c e l l s i n m i t o t i s . I n a n e f f o r t t o o b t a i n a g r e a t e r n u m b e r o f r e l e a s e d c e l l s t h a t w e r e m o r e h o m o g e n e o u s l y i n m i t o s i s , t h i s t e c h n i q u e w a s m o d i f i e d t o i n v o l v e t h e s h a k i n g o f s e v e r a l f l a s k s o f c e l l s s i m u l t a n e o u s l y o n a r e c i p r o c a t i n g s h a k e r t a b l e ( B r o s i n g 1 9 8 3 , G i l l e s p i e 1 9 7 5 , P e t e r s e n e t a l 1 9 6 8 , S i n c l a i r a n d Y u 1 9 6 7 ) . T h i s a p p r o a c h w a s i n i t i a l l y f o l l o w e d t o o b t a i n s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s o f c e l l s i n t h e p r e s e n t w o r k . T h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e w a s e m p l o y e d : T h r e e d a y s p r i o r t o m i t o t i c s e l e c t i o n , 5 x 1 0 4 c e l l s w e r e s e e d e d i n t o e a c h o f 6 p l a s t i c t i s s u e c u l t u r e ( T C ) f l a s k s ( g r o w t h a r e a o f 7 5 c m 2 / f l a s k : F a l c o n T i s s u e C u l t u r e P r o d u c t s ) i n m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m ( M E M ) F - 1 5 c o n t a i n i n g 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m 2 8 ( F B S ) . ( T h e F B S c o n c e n t r a t i o n i n t h e M E M F - 1 5 w a s l a t e r i n c r e a s e d t o 12 .5% . ) T h e p l a t e d c e l l s w e r e p l a c e d i n a n i n c u b a t o r a n d f e d o n e d a y p r i o r t o m i t o t i c s e l e c t i o n w i t h 15 m l o f f r e s h M E M F - 1 5 . T h e s h a k e - o f f p r o c e d u r e w a s c o n d u c t e d i n a 37 ° C w a r m r o o m . A h o r i z o n t a l s h a k e r t a b l e w a s u s e d t o s w i r l t h e o v e r l y i n g m e d i u m o v e r t h e m o n o l a y e r o f c e l l s . S i x f l a s k s a t a t i m e w e r e s h a k e n ( c o m b i n e d s u r f a c e a r e a o f 4 5 0 c m ) f o r a 5 m i n u t e i n t e r v a l a t 124 v i b r a t i o n s / m i n u t e w i t h a s t r o k e l e n g t h o f 4 .5 c m . T h e o v e r l y i n g m e d i u m w a s c o l l e c t e d i n a c h i l l e d 4 ° C v e s s e l a n d r e p l a c e d w i t h 10 m l o f p H a n d t e m p e r a t u r e e q u i l i b r a t e d M E M S - 1 4 ( s u s p e n s i o n m e d i u m ) ( G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . T h e f l a s k s w e r e t h e n p l a c e d i n t h e w a r m r o o m f o r 10 m i n u t e s p r i o r t o t h e n e x t s h a k e - o f f . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d u p t o 14 t i m e s i n o r d e r t o e x a m i n e t h e y i e l d a n d q u a l i t y o f t h e s e l e c t e d p o p u l a t i o n s . 2.2.2 M i t o t i c S e l e c t i o n U s i n g T h e T a l a n d i c C e l l C v c l e A n a l y z e r T h e t e c h n i q u e a c t u a l l y e m p l o y e d t o o b t a i n l a r g e n u m b e r s o f m i t o t i c o r e a r l y p o s t - m i t o t i c c e l l s f o r t h e s y n c h r o n i z e d c e l l e x p e r i m e n t s i n v o l v e d u s i n g a T a l a n d i c C e l l C y c l e A n a l y z e r ( T a l a n d i c R e s e a r c h C o r p . , 2 5 0 0 E. F o o t h i l l B l v d . , P a s a d e n a , C A ) ( K l e v e c z 1 9 7 2 , 1 9 7 5 ) . T h e s y s t e m m a y a c t i n e i t h e r a f u l l y - a u t o m a t e d o r m a n u a l l y - o p e r a t e d c a p a c i t y t o p r o d u c e p o p u l a t i o n s o f t i s s u e c u l t u r e c e l l s o f u n i f o r m a g e u s i n g t h e m i t o t i c s e l e c t i o n t e c h n i q u e . T h e c e l l c y c l e a n a l y z e r r e m o v e s m i t o t i c c e l l s f r o m e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g a s y n c h r o n o u s c u l t u r e s o n t h e i n n e r s u r f a c e o f r o l l e r b o t t l e s b y t h e g e n t l e s h e a r i n g e f f e c t o f m e d i u m o v e r t h e m o n o l a y e r . T h e a d v a n t a g e o f u s i n g t h i s s y s t e m i s t h a t a h i g h y i e l d m a y b e a c h i e v e d b y u s i n g u p t o f o u r r o l l e r b o t t l e s e a c h w i t h a l a r g e n u m b e r o f c e l l s s e e d e d o n t o a c o m b i n e d s u r f a c e a r e a o f 7 0 0 0 c m . A s w e l l , t h e ' h a r v e s t ' c a n b e r e p e a t e d a t i n t e r v a l s a s b r i e f a s 2 0 m i n u t e s . T h e s y s t e m c o n f i g u r a t i o n u s e d f o r o u r r e q u i r e m e n t s c o n s i s t e d o f a s e q u e n c e c o n t r o l l e r , a c u l t u r e r o t a t o r a n d a s a m p l i n g / f e e d i n g p u m p , a s s h o w n i n f i g u r e 2 . T h e s e q u e n c e c o n t r o l l e r c o o r d i n a t e d t h e s y s t e m s ' t i m i n g f u n c t i o n s s u c h a s t h e n u m b e r o f h a r v e s t c y c l e s o f a n e x p e r i m e n t , t h e d u r a t i o n o f e a c h h a r v e s t c y c l e a n d t h e d u r a t i o n o f t h e m i t o t i c s e l e c t i o n , s a m p l i n g a n d f e e d i n g p e r i o d s w i t h i n e a c h c y c l e . T h e c u l t u r e r o t a t o r a p p a r a t u s c o n s i s t e d o f u p t o f o u r r o l l e r b o t t l e s m o u n t e d h o r i z o n t a l l y a n d d r i v e n b y T e f l o n d e r o t a t o r c a p s . S a m p l i n g a n d f e e d i n g w a s c a r r i e d o u t t h r o u g h T e f l o n - t i p p e d s t a i n l e s s s t e e l t u b i n g m o u n t e d w i t h i n t h e d e r o t a t o r c a p s . T h e o r i g i n a l a p p a r a t u s h a r v e s t e d m i t o t i c c e l l s u s p e n s i o n s b y d r a g g i n g t h e s a m p l e t u b e a l o n g t h e l o w e r s u r f a c e o f t h e r o l l e r b o t t l e . A s w e l l , f e e d i n g w i t h n e w m e d i u m w a s f r o m a t u b e e l e v a t e d 4 c m a b o v e t h e r o l l e r b o t t l e s u r f a c e . S i n c e b o t h o f t h e s e p r o c e s s e s w e r e t h o u g h t t o d i s l o d g e i n t e r p h a s e c e l l s a n d l e a v e b e h i n d t h e u n c o l l e c t e d c e l l s t o c o n t a m i n a t e l a t e r r o l l s , t h e s a m p l i n g t u b e w a s m o d i f i e d t o b o t h c o l l e c t c e l l s a n d f e e d f r e s h m e d i u m a g a i n s t t h e v e r t i c a l " e n d o f t h e r o l l e r b o t t l e s . A s i n g l e p u m p a n d l e n g t h o f t u b i n g w a s t h e n u s e d t o p e r f o r m b o t h t h e s a m p l i n g a n d f e e d i n g p r o c e d u r e s . T h e c u l t u r e r o t a t o r c o n t r o l l e r c o u l d b e u s e d t o v a r y t h e r o t a t i o n s p e e d o f t h e b o t t l e s f r o m 0.1 t o 3 0 0 r p m . T h e s y s t e m a l l o w s f o r c o m p l e t e a u t o m a t i o n o f a l l o f t h e a b o v e f e a t u r e s , b u t w a s u s e d m a n u a l l y i n o r d e r t o h a v e m o r e c o m p l e t e c o n t r o l o f i t s f u n c t i o n i n g . A l t h o u g h n o t u s e d , t h e s y s t e m d o e s a l l o w f o r t h e u s e o f a b a t c h s a m p l e c o l l e c t o r t o a u t o m a t i c a l l y d e l i v e r t h e t o t a l v o l u m e o f t h e r o l l e r b o t t l e s a f t e r e a c h s e l e c t i o n i n t o o n e o f 2 4 s t e r i l e f l a s k s . I t m a y a l s o b e n o t e d t h a t t h i s s y s t e m h a s b e e n w i d e l y u s e d b y s e v e r a l i n v e s t i g a t o r s u s i n g 3 0 m a n y d i f f e r e n t c e l l l i n e s w i t h g o o d s u c c e s s ( B l a k e l y 1 9 8 5 , K l e v e c z 1 9 7 5 , N g o e t a l 1 9 8 8 ) . A d e t a i l e d a n d l a b o u r i n t e n s i v e p r o c e s s w a s f o l l o w e d t o p r o d u c e a s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n o f c e l l s . T h e f o l l o w i n g i s a n o u t l i n e o f t h e s t e p s i n v o l v e d . 2.2.2.1 P r e p a r a t i o n o f t h e R o l l e r B o t t l e s D u r i n g t h e i n i t i a l s y n c h r o n o u s c e l l e x p e r i m e n t a l p e r i o d , l o n g g l a s s r o l l e r b o t t l e s ( 1 9 5 0 c m / b o t t l e , 10 c m d i a m e t e r , 62 c m l e n g t h ) w e r e u s e d f o r c e l l u l a r g r o w t h a n d m i t o t i c s e l e c t i o n . T h e s e b o t t l e s h a d t h e a d v a n t a g e o f b e i n g r e u s a b l e , b u t t h e d i s a d v a n t a g e o f h a v i n g t o e n s u r e a n a c c o m o d a t i n g s u r f a c e f o r c e l l a t t a t c h m e n t . B o t t l e s w e r e c l e a n e d b y h a n d u s i n g s t a n d a r d g l a s s w a r e c l e a n e r ( S p a r k l e e n ) , s c r u b b e d , r i n s e d 1 0 - 1 2 t i m e s w i t h d i s t i l l e d w a t e r , t h e n a l l o w e d t o s i t o r r o t a t e o v e r n i g h t c o n t a i n i n g a s o l u t i o n o f 0.1 M s o d i u m c a r b o n a t e . T h e b o t t l e s w e r e t h o r o u g h l y r i n s e d 1 0 - 1 2 t i m e s w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . T h e p r o p e r p r e p a r a t i o n o f t h e r o l l e r b o t t l e s u r f a c e r e p r e s e n t e d a c r i t i c a l p h a s e o f t h e s y n c h r o n i z a t i o n p r o c e d u r e ( K l e v e c z 1 9 7 5 , M o n a h a n 1 9 7 4 ) . I t w a s c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d t h a t c e l l s s e e d e d o n t o s u c h a s u r f a c e p r o d u c e d l a r g e c e l l a g g r e g a t e s a t t a t c h e d t o t h e s u r f a c e . A f t e r s o m e h o u r s i n r o l l e r c u l t u r e , t h e s e c l u m p s d e v e l o p e d ' t a i l s ' ( a n d o f t e n a p a i r o f V -s h a p e d ' c o m e t t a i l s ' ) a l o n g t h e c i r c u m f e r e n c e o f t h e r o l l e r b o t t l e s u r f a c e . T h e s e ' t a i l s ' p r e s u m a b l y d e v e l o p e d u n d e r t h e i n f l u e n c e o f t h e f l u i d c u r r e n t s a s t h e m e d i u m p a s s e d o v e r t h e c e l l c l u m p s . T h e c l u m p i n g m a y h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e n u m b e r o f n o n - m i t o t i c c e l l s p r e s e n t i n t h e h a r v e s t e d p o p u l a t i o n s , s o i n a n e f f o r t t o r e m e d y t h e p r o b l e m a s w i t c h w a s m a d e t o t h e u s e o f p l a s t i c r o l l e r b o t t l e s ( F a l c o n # 3 0 3 5 ) . T h i s s w i t c h a l o n e d i d n o t s o l v e t h e p r o b l e m , b u t t h r o u g h t h e o p t i m i z a t i o n o f c e l l a t t a t c h m e n t p a r a m e t e r s ( d i s c u s s e d l a t e r ) t h e c l u m p i n g p r o b l e m w a s e l i m i n a t e d a n d c o n s i s t e n t l y u n i f o r m m o n o l a y e r s w e r e o b s e r v e d ( w i t h o n l y t h e o c c a s i o n a l s m a l l e r c l u m p s p r e s e n t ) . P r e p a r a t i o n o f t h e p l a s t i c r o l l e r b o t t l e s i n v o l v e d r i n s i n g t h e i n n e r s u r f a c e s o f t h e b o t t l e s t w i c e w i t h 50 m l o f M E M F - 1 5 ( l a c k i n g F B S a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ) t o r e m o v e a n y p l a s t i c d e b r i s t o w h i c h c e l l s c o u l d h a v e a t t a t c h e d t o p r o d u c e c l u m p s . 2 .2 .2 .2 S e e d i n g t h e R o l l e r B o t t l e s T h e f o l l o w i n g s t e p s p e r t a i n t o t h e s e e d i n g o f t h e p l a s t i c r o l l e r b o t t l e s . A w o r d r e g a r d i n g t h e g l a s s r o l l e r b o t t l e s f o l l o w s a t t h e e n d o f t h i s s e c t i o n . T w e n t y - f o u r h o u r s p r i o r t o t h e s e e d i n g o f t h e r o l l e r b o t t l e s , 4 0 - 4 4 h o u r s p r i o r t o t h e b e g i n n i n g o f a n e x p e r i m e n t , c e l l s i n s p i n n e r c u l t u r e w e r e d i l u t e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 4 x 1 0 ^ c e l l s / m l t o r e a c h a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 . 0 - 2 . 5 x 1 0 ^ c e l l s / m l t h e n e x t d a y . A b o u t 1 l i t r e o f c e l l s a t t h i s f i n a l c o n c e n t r a t i o n w a s r e q u i r e d t o s e e d t h e f o u r r o l l e r b o t t l e s . T h e c e l l s u s p e n s i o n s w e r e c o o l e d o n i c e t o m i n i m i z e c l u m p i n g , p l a c e d i n t o t w o t o f o u r 5 0 0 m l g l a s s c e n t r i f u g e v e s s e l s , a n d c e n t r i f u g e d a t 6 0 0 r p m ( 9 0 g ' s ) f o r 8 m i n u t e s ( S o r v a l l R C - 3 g e n e r a l p u r p o s e c e n t r i f u g e ) . T h e s u p e r n a t a n t w a s a s p i r a t e d a n d t h e c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 5 0 m l o f M E M F - 1 5 u s i n g v i g o r o u s v o r t e x i n g o f t h e c e l l s u s p e n s i o n f o r 5 t o 8 s e c o n d s t o d i s p e r s e t h e c e l l s . A c e l l c o u n t w a s p e r f o r m e d a n d t h e c e l l s w e r e o b s e r v e d u n d e r a m i c r o s c o p e f o r t h e p r e s c e n c e o f c l u m p s . I n t o e a c h o f f o u r s t a n d a r d g l a s s b o t t l e s c o n t a i n i n g 2 5 0 m l o f p r e w a r m e d , p H b a l a n c e d M E M F - 1 5 w a s p l a c e d 5 x 1 0 7 c e l l s t h a t h a d b e e n p a s s e d t h r o u g h a m e s h f i l t e r t o r e m o v e l a r g e c e l l c l u m p s . T h e c e l l s u s p e n s i o n s w e r e m i x e d b y 3 2 h a n d s w i r l i n g w i t h a n y s u r f a c e b u b b l e s b e i n g a s p i r a t e d p r i o r t o s e e d i n g . T h e c o n t e n t s o f o n e o f t h e s e b o t t l e s w a s t h e n c a r e f u l l y p o u r e d i n t o o n e p l a s t i c r o l l e r b o t t l e . C a u t i o n w a s e x e r c i s e d t o m i n i m i z e t h e c r e a t i o n o f s u r f a c e b u b b l e s w h i c h w e r e o b s e r v e d t o d i s r u p t t h e d e l i c a t e c e l l a t t a t c h m e n t p r o c e s s l e a d i n g t o s t r e a k i n g o f t h e m o n o l a y e r . T h e r o l l e r b o t t l e w a s t h e n g a s s e d f o r a b o u t 4 0 s e c o n d s w i t h 9 5 % a i r , 5 % C 0 2 a n d a s t e r i l e d e r o t a t o r c a p w a s i n s e r t e d i n t o t h e o p e n e n d o f t h e r o l l e r b o t t l e . T h e r o l l e r b o t t l e w a s t h e n a t t a t c h e d t o t h e c u l t u r e r o t a t o r a p p a r a t u s a n d a l l o w e d t o r o t a t e a t 0.3 r p m i n a 37 ° C w a r m r o o m . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d u n t i l a l l f o u r b o t t l e s w e r e s e e d e d , g a s s e d a n d r o t a t i n g . T h e r o l l e r b o t t l e s w e r e a l l o w e d t o r o t a t e a t 0.3 r p m f o r o n e h o u r d u r i n g w h i c h t i m e t h e b o t t l e s w e r e g e n t l y m i x e d e v e r y 15 m i n u t e s b y r a i s i n g a n d l o w e r i n g e i t h e r e n d o f t h e r o t a t o r a p p a r a t u s b y 4 c m i n o r d e r t o e v e n l y d i s p e r s e t h e c e l l s i n s u s p e n s i o n . A f t e r t h i s c e l l a t t a t c h m e n t p e r i o d t h e m e d i u m f r o m e a c h o f t h e b o t t l e s w a s p u m p e d o u t , f r e s h p r e w a r m e d M E M F -15 w a s p u m p e d i n a n d t h e r o t a t i o n s p e e d i n c r e a s e d t o 1 r p m . I t w a s o b s e r v e d t h a t b e t w e e n 8 0 - 9 5 % o f t h e c e l l s w o u l d a t t a t c h d u r i n g t h i s t i m e . T h e p r o c e d u r e s d u r i n g t h e c e l l a t t a c h m e n t p h a s e w e r e i m p l e m e n t e d t o s t o p t h e f o r m a t i o n o f l o n g ( 3 c m ) V - s h a p e d c e l l c l u m p s t h a t w e r e o b s e r v e d o n t h e s u r f a c e o f b o t h t h e g l a s s a n d p l a s i c r o l l e r b o t t l e s p r i o r t o t h e s e m e a s u r e s . I t w a s t h o u g h t t h a t t h o s e c e l l s w h i c h n e v e r a t t a c h e d t o t h e v e s s e l s u r f a c e m a y h a v e c l u m p e d t o g e t h e r i n s u s p e n s i o n w h i l e a t s l o w r o t a t i o n s p e e d a n d a t t a c h e d a t s o m e l a t e r p o i n t , a n d g r o w n i n t o t h e o b s e r v e d c l u m p s . B y r e m o v i n g t h o s e c e l l s t h a t d i d n o t a t t a c h a n d b y i n c r e a s i n g t h e r o t a t i o n s p e e d t o 1 r p m t o a v o i d n u t r i e n t d e p r i v a t i o n , u n i f o r m m o n o l a y e r s w e r e c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d w i t h o n l y m u c h s m a l l e r c l u m p s o c c a s i o n a l l y p r e s e n t . Sequence Controller Culture Rotator Controller F I G U R E 2 : D I A G R A M OF T A L A N D I C C E L L C Y C L E A N A L Y Z E R C e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n w e r e o b t a i n e d u s i n g a T a l a n d i c C e l l C y c l e A n a l y z e r . T h e s y s t e m c o n s i s t e d o f a s e q u e n c e c o n t r o l l e r , a c u l t u r e r o t a t o r a n d a s a m p l i n g / f e e d i n g p u m p . A p o p u l a t i o n o f m i t o t i c c e l l s w a s o b t a i n e d b y i n c r e a s i n g t h e r o t a t i o n s p e e d o f t h e r o l l e r b o t t l e s t o 200 r p m f o r 5-6 m i n u t e s . H a r v e s t s c o u l d b e r e p e a t e d l y o b t a i n e d a t i n t e r v a l s a s b r i e f a s 20 m i n u t e s . T h e r o l l e r b o t t l e s w e r e a l l o w e d t o g r o w u n d i s t u r b e d f o r 1 4 - 1 8 h o u r s p r i o r t o a n y m i t o t i c s e l e c t i o n w o r k . A f t e r t h i s g r o w t h p e r i o d , t h e m o n o l a y e r h a d c o v e r e d 4 0 - 7 0 % o f t h e b o t t l e s u r f a c e a r e a . G l a s s r o l l e r b o t t l e s ( u s e d i n t h e e a r l y e x p e r i m e n t s w i t h s y n c h r o n i z e d c e l l s ) w e r e t r e a t e d s i m i l a r i l y w i t h a f e w n o t a b l e e x c e p t i o n s . T h e c e l l s u s e d t o s e e d t h e r o l l e r b o t t l e s w e r e g r o w n u s i n g m o n o l a y e r c u l t u r e i n s i x t e e n 175 c m p l a s t i c T C f l a s k s a n d w e r e r e m o v e d f r o m t h e f l a s k s u r f a c e b y i n c u b a t i n g i n a 0 . 1 % t r y p s i n s o l u t i o n a t 37 ° C f o r 6 m i n u t e s . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d , t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d , t h e c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n M E M F - 1 5 a n d 1 5 x 1 0 ^ c e l l s w e r e p l a c e d i n t o e a c h r o l l e r b o t t l e . T h e b o t t l e s r o t a t e d a t 0.3 r p m f o r t h e e n t i r e l e n g t h o f t h e g r o w t h p e r i o d p r i o r t o a n y m i t o t i c s e l e c t i o n w o r k . 2.2.2.3 O b t a i n i n g M i to t i c C e l l s T h e m i t o t i c s e l e c t i o n p r o c e s s c o n s i s t e d o f a s e r i e s o f h a r v e s t c y c l e s e a c h l a s t i n g 2 5 - 3 0 m i n u t e s . W i t h i n e a c h h a r v e s t c y c l e a h i g h e r r o t a t i o n r a t e o f 2 0 0 r p m o c c u r r e d f o r 5 - 6 m i n u t e s ; t h e n r o t a t i o n w a s d e c r e a s e d t o 1 r p m w h i l e t h e m e d i u m c o n t a i n i n g t h e s u s p e n d e d m i t o t i c c e l l s w a s a s p i r a t e d f r o m e a c h b o t t l e ( s a m p l e t i m e 2 m i n . ) ; 2 5 m l o f p r e - w a r m e d M E M S - 1 4 w a s f e d i n t o e a c h b o t t l e a n d p u m p e d o u t i n o r d e r t o f l u s h t h e l i n e s a n d t o p i c k u p a n y c e l l s l e f t o v e r f r o m t h e s a m p l i n g ( f l u s h t i m e 1 m i n . ) ; 125 m l o f M E M S - 1 4 w a s t h e n f e d t o e a c h b o t t l e ( f e e d t i m e 2 m i n . ) ; d u r i n g t h e r e m a i n d e r o f t h e h a r v e s t c y c l e ( 1 5 - 2 0 m i n . ) t h e b o t t l e s w e r e l e f t u n d i s t u r b e d r o t a t i n g a t 1 r p m . F o r e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e , t h e f i r s t t e n p o p u l a t i o n s h a r v e s t e d w e r e n o t u s e d s i n c e c e l l u l a r d e b r i s a n d s m a l l c e l l c l u m p s w e r e p r e s e n t i n t h e s e p o p u l a t i o n s . F o r e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k , t h e f i r s t t h r e e p o p u l a t i o n s h a r v e s t e d w e r e d i s c a r d e d . 2 .2 .3 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v A D r u g B l o c k E x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d o n c e l l s s y n c h r o n i z e d u s i n g t h e c o m b i n e d m e t h o d s o f m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k . M i t o t i c c e l l s , o b t a i n e d f r o m t w o h a r v e s t s p o o l e d t o g e t h e r a n d h e l d o n i c e , w e r e c e n t r i f u g e d f o r 7 m i n u t e s a t 6 0 0 r p m ( 9 0 g ' s ) , d e c a n t e d , a n d r e s u s p e n d e d i n M E M F - 1 5 c o n t a i n i n g h y d r o x y u r e a a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 m M o r 2 m M , o r a p h i d i c o l i n a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 u g / m l o r 3 u g / m l . T h e s u s p e n s i o n o f 7 7 c e l l s w a s t h e n p l a t e d i n t o t w o 175 c m ' T C f l a s k s w i t h 1 .2x10 c e l l s i n 5 0 m l 2 6 a n d o n e 7 5 c m T C f l a s k w i t h 5 x 1 0 c e l l s i n 2 0 m l . T h e f l a s k s w e r e p l a c e d i n a h u m i d i f i e d 37 ° C i n c u b a t o r f o r 12 h o u r s p r i o r t o r e l e a s e f r o m t h e d r u g . H y d r o x y u r e a ( B D H C h e m i c a l s : m o l e c u l a r w e i g h t 7 6 . 06 g / m o l ) i s r e a d i l y s o l u b l e i n w a t e r a n d a q u e o u s m e d i a . A 10 mM s o l u t i o n w a s i n i t i a l l y p r e p a r e d i n M E M F - 1 5 a n d a l l o w e d t o m i x o n a 37 ° C s t i r t a b l e f o r 10 m i n u t e s . T h e s o l u t i o n w a s s t e r i l e f i l t e r e d a n d e i t h e r a 1 mM o r 2 m M s o l u t i o n w a s m a d e a f t e r t h e a p p r o p r i a t e d i l u t i o n ( F o x e t a l 1 9 8 7 , S i n c l a i r 1 9 6 7 ) . A p h i d i c o l i n ( S i g m a C h e m i c a l s : a n h y d r o u s m o l e c u l a r w e i g h t 3 3 8 . 5 g / m o l ) w a s i n i t i a l l y d i s s o l v e d i n d i m e t h y l s u l p h o x i d e ( D M S O ) a t 1 m g / m l o f D M S O , s i n c e i t i s n o t w a t e r s o l u b l e . S i n c e s m a l l q u a n t i t i e s o f t h e a p h i d i c o l i n w e r e r e q u i r e d ( 0 . 1 - 0 . 4 m g ) a n d s i n c e t h e d r u g i s a p o s s i b l e c a r c i n o g e n a n d m u t a g e n , g r e a t c a r e w a s t a k e n n o t t o c o m e i n t o d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e d r u g b y a d d i n g t h e D M S O d i r e c t l y i n t o t h e d r u g v i a l u s i n g a s y r i n g e . T h e d r u g w a s m i x e d b y h a n d i n i t s c o n t a i n e r a n d a l l o w e d t o s i t f o r 10 m i n u t e s a t 37 ° C . A 4 u g / m l s o l u t i o n w a s t h e n p r e p a r e d i n M E M F - 1 5 , a l l o w e d t o m i x f o r 10 m i n u t e s a t 37 ° C , s t e r i l e f i l t e r e d , t h e n d i l u t e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 u g / m l . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f D M S O i n t h e M E M F - 1 5 w a s 0 . 1 % , w h i c h h a s b e e n r e p o r t e d b y o t h e r s n o t t o i n f l u e n c e c e l l g r o w t h o r r a d i a t i o n r e s p o n s e . A 3 u g / m l s o l u t i o n w a s a l s o p r e p a r e d i n a s i m i l a r m a n n e r w i t h a f i n a l D M S O c o n c e n t r a i o n o f 0 . 1 % . ( F o x e t a l 1 987 , I k e g a m i e t a l 1 9 7 8 , l l i a k i s e t a l 1 9 8 2 ) . 2.3 E X P E R I M E N T A L T E C H N I Q U E E x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n b o t h a s y n c h r o n o u s a n d s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n s o f c e l l s t o d e t e r m i n e t h e i r r e s p o n s e t o r a d i a t i o n a s a f u n c t i o n o f r a d i a t i o n d o s e . 2.3.1 E x p e r i m e n t s U s i n g A s y n c h r o n o u s C e l l s A s y n c h r o n o u s c e l l c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d b y l o a d i n g 5 x 1 0 ^ c e l l s i n 4 0 m l M E M F - 1 5 i n t o 175 c m T C f l a s k s 4 6 - 5 0 h o u r s p r i o r t o a n e x p e r i m e n t . T h r e e f l a s k s w e r e r e q u i r e d f o r e a c h s u r v i v a l r e s p o n s e a n d u s u a l l y 2 t o 5 s u c h r e s p o n s e s w e r e p e r f o r m e d i n s u c c e s s i o n o n a t y p i c a l e x p e r i m e n t d a y . T h e f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 37 ° C i n a h u m i d i f i e d a t m o s p h e r e c o n t a i n i n g 9 5 % a i r , 5 % CO2,. T h e o v e r l y i n g m e d i u m f r o m e a c h f l a s k w a s r e p l a c e d 2 4 h o u r s l a t e r w i t h a n e q u a l v o l u m e o f f r e s h p r e w a r m e d M E M F - 1 5 . A f t e r 4 6 -50 h o u r s s i n c e t h e o r i g i n a l s e e d i n g , t h e m o n o l a y e r w a s o b s e r v e d t o c o v e r 5 0 - 7 0 % o f t h e g r o w t h s u r f a c e o f t h e f l a s k s , e n s u r i n g a n e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g p o p l u l a t i o n . C e l l s w e r e h a r v e s t e d b y t r y p s i n i z a t i o n : t h e o v e r l y i n g m e d i u m w a s d e c a n t e d , 10 m l o f 0 . 1 % t r y p s i n w a s a d d e d t o e a c h f l a s k , s w i r l e d a n d p o u r e d o f f ; a n o t h e r 10 m l o f t r y p s i n w a s a d d e d , s w i r l e d 3 7 a n d p o u r e d o f f ; 2 m l o f t r y p s i n w a s t h e n a d d e d ; t h e f l a s k w a s i n c u b a t e d a t 37 ° C f o r 6 m i n u t e s f o l l o w e d b y g e n t l e a g i t a t i o n t o r e l e a s e t h e c e l l s f r o m t h e f l a s k s u r f a c e ; t h e t r y p s i n w a s n e u t r a l i z e d b y a d d i n g 8 m l o f M E M F - 1 5 ( h i g h F B S c o n t e n t ) . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d , t h e s u p e r n a t a n t d e c a n t e d a n d t h e c e l l s r e s u s p e n d e d i n M E M S - 1 4 l a c k i n g s o d i u m b i c a r b o n a t e . B e t w e e n 4 5 - 5 5 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 4 - 6 x 1 0 5 c e l l s / m l w a s t h e n l o a d e d i n t o a w a t e r - j a c k e t e d s p i n n e r f l a s k m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C . I r r a d i a t i o n s w e r e t h e n p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3 .3 . 2.3.2 E x p e r i m e n t s U s i n g S y n c h r o n i z e d C e l l s 2.3.2.1 C e l l s S y n c h r o n i z e d B y M i t o t i c S e l e c t i o n A l o n e P o p u l a t i o n s o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e w e r e o b t a i n e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2.2.2.3. O n e h a r v e s t o f c e l l s w a s p u m p e d d i r e c t l y f r o m t h e r o l l e r b o t t l e s i n t o a l a r g e s p i n n e r f l a s k ( B e l l c o ) w h i c h w a s t h e n g a s s e d w i t h 9 5 % a i r , 5 % CO2 a n d p l a c e d o n a s p i n n e r t a b l e a t 37 ° C . W h e n t h e c e l l s h a d p r o g r e s s e d t o t h e d e s i r e d s t a g e i n t h e c e l l c y c l e t h e y w e r e c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n M E M S - 1 4 l a c k i n g s o d i u m b i c a r b o n a t e . B e t w e e n 4 5 - 5 5 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 - 5 x 1 0 c e l l s / m l w a s t h e n l o a d e d i n t o a w a t e i — j a c k e t e d s p i n n e r f l a s k m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3 .3 . I t w a s o b s e r v e d t h a t s e v e r a l h o u r s a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n m a n y o f t h e d a u g h t e r c e l l d o u b l e t s w e r e s t i l l p r e s e n t i n t h e p o p u l a t i o n , a l t h o u g h t h e c e l l s t h e m s e l v e s h a d p r o g r e s s e d o v e r t i m e b e y o n d t h e i r o r i g i n a l m i t o t i c s t a g e . E x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s t h a t w e r e r e d u c e d t o a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n b y e x p o s u r e t o t r y p s i n . A f t e r a s y n c h r o n i z e d 3 8 p o p u l a t i o n h a d p r o g r e s s e d t o t h e d e s i r e d s t a g e i n t h e c e l l c y c l e i t w a s c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n 10 m l o f 0 . 1 % t r y p s i n f o r 4 m i n u t e s . A f t e r n e u t r a l i z i n g t h e t r y p s i n w i t h 3 0 m l o f M E M F - 1 5 , t h e c e l l s w e r e c e n t r i f u g e d a g a i n a n d r e s u s p e n d e d i n M E M S - 1 4 l a c k i n g s o d i u m b i c a r b o n a t e . B e t w e e n 4 5 - 5 5 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 - 5 x 1 0 c e l l s / m l w a s t h e n l o a d e d i n t o a w a t e r - j a c k e t e d s p i n n e r f l a s k m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C . I r r a d i a t i o n s w e r e t h e n p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n 2 .3 .3 . 2 .3.2.2 C e l l s S y n c h r o n i z e d B v M i t o t i c S e l e c t i o n + A D r u g B l o c k P o p u l a t i o n s o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k w e r e o b t a i n e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .2 .3 . A f t e r t h e 12 h o u r e x p o s u r e , t h e c e l l s w e r e r e l e a s e d f r o m t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f t h e d r u g b l o c k b y p o u r i n g o f f t h e d r u g - c o n t a i n i n g m e d i u m , r i n s i n g t w i c e w i t h M E M F - 1 5 ( l a c k i n g F B S a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ) , a n d f e e d i n g w i t h f r e s h M E M F -15 ( w i t h F B S a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ) . T h e f l a s k s w e r e p l a c e d i n a 37 ° C i n c u b a t o r . W h e n t h e c e l l s h a d p r o g r e s s e d t o t h e d e s i r e d s t a g e i n t h e c e l l c y c l e , t h e y w e r e h a r v e s t e d b y t r y p s i n i z a t i o n , c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n M E M S - 1 4 l a c k i n g s o d i u m b i c a r b o n a t e . B e t w e e n 4 5 - 5 5 m l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 4 - 6 x 1 0 ^ c e l l s / m l w a s t h e n l o a d e d i n t o a w a t e i — j a c k e t e d s p i n n e r f l a s k m a i n t a i n e d a t 37 ° C . I r r a d i a t i o n s w e r e t h e n p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3.3. 2 .3 .3 I r r a d i a t i o n A n d P l a t i n g P r o c e d u r e A c e l l s u s p e n s i o n p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n s 2.3.1 a n d 2.3.2 i n a w a t e r - j a c k e t e d s p i n n e r f l a s k w a s m o u n t e d n e a r t h e h e a d o f t h e X - r a y s o u r c e ( P h i l i p s , 2 5 0 k V p X - r a y s , H V L 1.5 mm C u ) a s s h o w n i n f i g u r e 3 a . A m a g n e t i c s t i r m o t o r p l a c e d b e n e a t h t h e f l a s k h o l d e r m a i n t a i n e d a s t i r r a t e o f 3 5 0 - 3 6 0 r p m . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s k e p t a t 37 ° C u s i n g a c i r c u l a t i n g 3 9 w a t e r b a t h c o n n e c t e d t o t h e w a t e r j a c k e t o f t h e s p i n n e r f l a s k . T h e c e l l s w e r e g a s s e d f o r 15 m i n u t e s p r i o r t o a n d d u r i n g i r r a d i a t i o n w i t h h u m i d i f i e d a i r a t 3 7 ° C . A d o s e r a t e o f 2 .30 G y / m i n u t e w a s d e t e r m i n e d u s i n g F r i c k e f e r r o u s s u l p h a t e d o s i m e t r y ( F r i c k e a n d H a r t 1 9 6 6 ) . T h e d o s e r a t e w a s a l s o m e a s u r e d p e r i o d i c a l l y b y s e c o n d a r y i o n i z a t i o n m e a s u r e m e n t s u s i n g a V i c t o r e e n m o d e l 5 0 0 e l e c t r o m e t e r . A f t e r c o n t r o l s a m p l e s w e r e r e m o v e d , t h e i r r a d i a t i o n p r o c e e d e d w i t h t w o s a m p l e s w i t h d r a w n a f t e r e a c h d o s e i n c r e m e n t . B e t w e e n 29 a n d 35 s a m p l e s w e r e r e m o v e d d u r i n g t h e i r r a d i a t i o n t i m e w h i c h t o o k l e s s t h a n 15 m i n u t e s t o c o m p l e t e . S a m p l e s w e r e v o r t e x m i x e d a t l o w s p e e d , p l a c e d o n i c e a n d t a k e n t o t h e c e l l s o r t e r . A c e l l s o r t e r ( B e c k t o n - D i c k i n s o n 4 4 0 ) w a s u s e d t o d e l i v e r a k n o w n n u m b e r o f c e l l s f r o m e a c h s a m p l e b y i d e n t i f y i n g t h e c e l l s o n t h e b a s i s o f l i g h t s c a t t e r i n g w i t h o u t t h e u s e o f a c e l l s t a i n . T h r e e a l i q u o t s w e r e d i s p e n s e d f r o m e a c h s a m p l e i n t o 5 m l t e s t t u b e s c o n t a i n i n g 4 m l o f M E M F -15. E a c h a l i q u o t w a s p l a t e d i n t o a 100 mm p e t r i d i s h w i t h 14 m l o f M E M F -15 t o p r o d u c e a b o u t 5 0 0 c o l o n i e s / p e t r i d i s h a f t e r 6 d a y s i n c u b a t i o n . F o r h i g h e r d o s e s a m p l e s ( 8 - 1 2 G y ) , o n l y 2 a l i q u o t s w e r e d i s p e n s e d p e r s a m p l e s i n c e t h e l a r g e r c e l l n u m b e r s n e e d e d a t s u c h h i g h d o s e s r e q u i r e d c o n s i d e r a b l y l o n g e r s o r t i n g t i m e . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e m e d i u m w a s p o u r e d o f f f r o m e a c h d i s h a n d 6 m l o f c o l d m a l a c h i t e g r e e n s t a i n w a s a d d e d . S i x m i n u t e s l a t e r , t h e s t a i n w a s p o u r e d o f f a n d t h e d i s h e s w e r e r i n s e d u n d e r c o l d r u n n i n g w a t e r . C o l o n i e s c o n t a i n i n g g r e a t e r t h a n 5 0 c e l l s w e r e t h e n c o u n t e d . 4 0 Air In Air Out Water-Jacketed Spinner Flask 37 °C Water In Cell Suspension Stir Motor Aluminium Irradiation Jig 15.8 cm K- 16.2 cm Curved Plexiglass Ice Water Hi 35.5 cm 16.2 cm - H F I G U R E 3 : D I A G R A M O F I R R A D I A T I O N S E T - U P ( a ) T h e i r r a d i a t i o n v e s s e l w a s p l a c e d o n a n a l u m i n u m r a c k a t t a c h e d t o t h e h e a d o f t h e X - r a y u n i t ( P h i l i p s 2 5 0 k V p ) . A s t i r m o t o r b e n e a t h t h e v e s s e l s t i r r e d t h e 37 ° C s u s p e n s i o n a t 3 5 0 - 3 6 0 r p m . A d o s e r a t e o f 2 .30 G y / m i n w a s o b t a i n e d a t a d i s t a n c e o f 32 c m f r o m t h e X - r a y t u b e t a r g e t . ( b ) T h e r e s p o n s e o f s y n c h r o n i z e d c e l l s t o a s i n g l e d o s e o f r a d i a t i o n w a s m e a s u r e d b y p l a c i n g a 5 m l t e s t t u b e c o n t a i n i n g t h e c e l l s u s p e n s i o n i n a p l e x i g l a s s a n d a l u m i n u m r a c k a t t a t c h e d t o t h e h e a d o f t h e X - r a y u n i t . A d o s e r a t e o f 1.27 G y / m i n w a s o b t a i n e d a t a d i s t a n c e o f 4 0 c m f r o m t h e X -r a y t u b e t a r g e t . S a m p l e s w e r e i r r a d i a t e d o n i c e w a t e r . 41 2.3.4 C a l c u l a t i o n O f S u r v i v i n g F r a c t i o n T h e e n d p o i n t c o n s i d e r e d i n t h i s t h e s i s i s t h e r e t e n t i o n o f p r o l i f e r a t i v e c a p a c i t y o f m a m m a l i a n c e l l s . T h i s m a y b e d e t e r m i n e d b y m e a s u r e m e n t o f t h e f r a c t i o n o f c e l l s t h a t h a v e s u r v i v e d a d o s e o f r a d i a t i o n i e . t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n , S , g i v e n b y : S ( D i ) = P E C D ^ / P E C D ^ ) ( 1 4 ) w h e r e P E ( D ^ ) i s t h e " p l a t i n g e f f i c i e n c y " a t a g i v e n d o s e D^. T h e p l a t i n g e f f i c i e n c y m a y b e d e f i n e d a s t h a t f r a c t i o n o f c e l l s s e e d e d t h a t g r o w i n t o c o l o n i e s : PE (D - j ) = # o f c o l o n i e s c o u n t e d / # o f c e l l s o r i g i n a l l y s e e d e d ( 1 5 ) D i v i s i o n b y P E ( D = 0 ) , t h e p l a t i n g e f f i c i e n c y o f a n u n i r r a d i a t e d s a m p l e f o r d o s e D=0 G y , n o r m a l i z e s t h e p l a t i n g e f f i c i e n c i e s a n d r e s u l t s i n a q u a n t i t y d e f i n e d a s t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n . T h e d a t a t h a t f o l l o w i n t h e R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n s e c t i o n s a r e t h e a v e r a g e d s u r v i v i n g f r a c t i o n s f o r a s t a t e d n u m b e r o f r e p e a t e d e x p e r i m e n t s o f a c e r t a i n t y p e . T h e v a l u e o f t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n a t a g i v e n d o s e i s t h u s t h e a r i t h m e t i c m e a n o f t h e i n d i v i d u a l r e s p o n s e s f o r t h a t p a r t i c u l a r d o s e , g i v e n b y : N S ( D i ) = { I S ^ ) } / N ( 1 6 ) i=1 f o r N, t h e n u m b e r o f i n d i v i d u a l r e s p o n s e s . T h e s t a n d a r d e r r o r i n t h e m e a n w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x p r e s s i o n : N S S ^ ) = {< I [ S ^ ) - S ( D i ) ] 2 > / <N (N - 1)> } * ( 1 7 ) i=1 T h e e r r o r b a r s a t t a t c h e d t o t h e d a t a p o i n t s a r e s t a n d a r d e r r o r s o f t h e m e a n . P o i n t s f o r w h i c h a n e r r o r b a r i s n o t s h o w n i n d i c a t e t h a t t h e s t a n d a r d e r r o r i s s m a l l e r t h a n t h e s i z e o f t h e d a t a p o i n t s y m b o l . 2.3.5 C a l c u l a t i o n O f T h e R M S D e v i a t i o n O f A C u r v e F i t T o T h e D a t a . T h r o u g h o u t t h i s t h e s i s t h e v a r i o u s m o d e l s o f c e l l u l a r i n a c t i v a t i o n , d i s c u s s e d i n s e c t i o n 1.2, w e r e a p p l i e d t o s u r v i v a l d a t a a s a m e a n s o f c h a r a c t e r i z i n g t h e o b s e r v e d r e s p o n s e s . In o r d e r t o t e s t a n d c o m p a r e t h e a b i l i t y o f t h e s u r v i v a l e q u a t i o n s t o a d e q u a t e l y d e s c r i b e t h e s u r v i v a l r e s p o n s e ( b u t n o t n e c e s s a r i l y t h e i r u n d e r l y i n g a s s u m p t i o n s ) a c a l c u l a t i o n w a s r o u t i n e l y p e r f o r m e d o f t h e R M S ( R o o t M e a n S q u a r e ) d e v i a t i o n o f t h e f i t t e d c u r v e t o t h e d a t a . T h e R M S d e v i a t i o n w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o l l o w i n g e x p r e s s i o n : N R M S = { I [ l n ( S f i ) - l n ( S o i ) ] 2 / N } * ( 1 8 ) i=1 w h e r e , S Q ^ = o b s e r v e d s u r v i v a l v a l u e a t a g i v e n d o s e D^ ( o b t a i n e d f r o m e x p e r i m e n t a l r e s u l t s ) S f i = f i t t e d s u r v i v a l v a l u e a t a g i v e n d o s e D-j ( o b t a i n e d f r o m a p a r t i c u l a r s u r v i v a l e q u a t i o n ) C a l c u l a t i o n o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l o g a r i t h m o f t h e o b s e r v e d a n d f i t t e d s u r v i v a l s a l l o w e d f o r a n e q u a l w e i g h t i n g o f t h e d i f f e r e n c e s a t a p a r t i c u l a r d o s e p o i n t r e g a r d l e s s o f t h e l e v e l o f s u r v i v a l . T h i s s o m e w h a t c r u d e g o o d n e s s - o f - f i t t e s t p r o v i d e d a m e a n s o f c o m p a r i n g t h e f i t o f d i f f e r e n t s u r v i v a l m o d e l s t o t h e s a m e s u r v i v a l d a t a . R o u g h l y , a l o w e r v a l u e o f t h e R M S d e v i a t i o n i n d i c a t e d a b e t t e r f i t t o t h e d a t a . 4 3 2.3.6 Statistical Analysis ; T - T e s t s V e r s u s N o n p a r a m e t r i c T e s t s T h r o u g h o u t t h i s t h e s i s , s t a t i s t i c a l m e t h o d s a r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e l e v e l o f s i g n i f i c a n c e r e p r e s e n t e d b y t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n L Q m o d e l f i t p a r a m e t e r s , a o r (3, o b t a i n e d f r o m s e p a r a t e l y f i t t i n g l o w a n d h i g h d o s e d a t a . T h e m e t h o d s u s e d i n c l u d e : 1) . S t u d e n t s ' t - t e s t ( p a i r e d a n a l y s i s ) 2 ) . S t u d e n t s ' t - t e s t ( u n p a i r e d a n a l y s i s ) 3 ) . S i g n - r a n k t e s t ( n o n p a r a m e t r i c ) 4 ) . W - t e s t ( n o n p a r a m e t r i c ) A p p e n d i x A c o n t a i n s s p e c i f i c i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g h o w t h e t e s t s a r e a p p l i e d . T h e t - t e s t s a s s u m e t h a t t h e s a m p l e s b e i n g c o m p a r e d a r e n o r m a l l y a n d i n d e p e n d e n t l y d i s t r i b u t e d . T h e v a l i d i t y o f t h i s a s s u m p t i o n c a n n o t a c c u r a t e l y b e t e s t e d w i t h t h e s a m p l e s i z e s c o n s i d e r e d i n t h i s t h e s i s ( 3 t o 8 p a i r s p e r s a m p l e ) . A s a r e s u l t , n o n p a r a m e t r i c t e s t s , t h a t d o n o t m a k e a s s u m p t i o n s r e g a r d i n g t h e s h a p e o f t h e d i s t r i b u t i o n , h a v e a l s o b e e n a p p l i e d . R e s u l t s f r o m b o t h t y p e s o f a n a l y s i s a r e s h o w n i n t h e R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n . 2.4 P R O C E D U R E S FOR DETERM IN IN G T H E D E G R E E OF SYNCHRONY T o d e t e r m i n e t h e d e g r e e o f s y n c h r o n y o f a p o p u l a t i o n s y n c h r o n i z e d b y t h e d e s c r i b e d t e c h n i q u e s t h r e e m e t h o d s w e r e r o u t i n e l y e m p l o y e d . T h e s e i n c l u d e t h e s t a i n i n g o f m i t o t i c c e l l s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f m i t o t i c i n d e x , t h e m e a s u r e m e n t o f t h e r a d i o s e n s i t i v i t y o f t h e p o p u l a t i o n t o a s i n g l e d o s e o f r a d i a t i o n a n d t h e e x a m i n a t i o n o f f l o w c y t o m e t r y h i s t o g r a m s o f D N A d i s t r i b u t i o n f o r a p o p u l a t i o n o f s y n c h r o n i z e d c e l l s . 2.4.1 D e t e r m i n a t i o n o f M i to t i c I n d e x I n t o a 2 5 m l g l a s s t e s t t u b e o n i c e w a s p l a c e d 2 - 4 x 1 0 c e l l s t h a t h a d b e e n s y n c h r o n i z e d u s i n g m i t o t i c s e l e c t i o n o n l y . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d ( 6 m i n . , 6 0 0 r p m ) , r e s u s p e n d e d i n 10 m l o f c o l d 0 . 0 2 5 M s o d i u m c i t r a t e ( h y p o t o n i c s o l u t i o n ) a n d p l a c e d o n i c e f o r 15 m i n . T o t h e c e l l s u s p e n s i o n , a n e q u a l v o l u m e o f c o l d C a r n o y f i x a t i v e ( 7 5 % e t h a n o l , 2 5 % a c e t i c a c i d ) w a s s l o w l y a d d e d . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s r e c e n t r i f u g e d ( 6 m i n . , 1200 r p m - 3 6 0 g ' s ) , r e s u s p e n d e d i n 10 m l c o l d C a r n o y a n d h e l d o n i c e f o r a t l e a s t 10 m i n u t e s . A t t h i s p o i n t s a m p l e s w e r e a c c u m u l a t e d a n d p r o c e s s e d s i m u l t a n e o u s l y a t a l a t e r t i m e . A f t e r f i x a t i o n , t h e c e l l s u s p e n s i o n w a s r e c e n t r i f u g e d (6 m i n . , 1200 r p m - 3 6 0 g ' s ) a n d r e s u s p e n d e d i n 0.5 m l c o l d C a r n o y . O n e o r t w o d r o p s o f t h e c e l l s u s p e n s i o n w e r e a p p l i e d t o a c l e a n m i c r o s c o p e s l i d e a n d a l l o w e d t o a i r d r y f o r 3 0 m i n u t e s . P r e p a r e d s l i d e s w e r e s t a i n e d i n A c e t i c - O r c e i n s t a i n f o r 2 0 m i n u t e s , r i n s e d i n 5 0 % a c e t i c a c i d a n d s e a l e d b y p l a c i n g t w o d r o p s o f d i l u t e d A c e t i c - O r c e i n s t a i n o n e a c h s l i d e , a p p l y i n g a c o v e r s l i p a n d s e a l i n g t h e o u t e r e d g e s o f t h e c o v e r s l i p t o t h e s l i d e w i t h h o t p a r a f f i n ( B r o s i n g 1 9 8 3 , F r e s h n e y 1 9 8 3 ) . T h e A c e t i c - O r c e i n s t a i n w a s p r e p a r e d b y a d d i n g 10 g p o w d e r e d o r c e i n s t a i n ( S i g m a ) t o 5 0 0 m l o f 5 0 % a c e t i c a c i d ( w i t h b o i l i n g c h i p s !) a n d r e f l u x i n g f o r 3 - 5 h o u r s . T h i s w a s f i l t e r e d p r i o r t o u s e . M i t o t i c c e l l s w e r e i d e n t i f i e d b y t h e o b v i o u s p r e s e n c e o f c o n d e n s e d c h r o m o s o m e s . I n t e r p h a s e n u c l e i w e r e n e a r l y u n i f o r m i n u p t a k e o f t h e s t a i n , b u t s h o w e d e v i d e n c e o f a d a r k e r s t a i n e d n u c l e o l u s . 4 5 2.4.2 S i n g l e D o s e R e s p o n s e o f S y n c h r o n i z e d C e l l s T h e r e s p o n s e o f c y c l i n g , s y n c h r o n i z e d c e l l s t o a s i n g l e d o s e o f X -r a d i a t i o n d e l i v e r e d a t v a r i o u s t i m e s t h r o u g h o u t t h e c e l l c y c l e g i v e s a n i n d i c a t i o n o f t h e d e g r e e o f s y n c h r o n y p r e s e n t i n t h e p o p u l a t i o n ( S i n c l a i r a n d M o r t o n 1 9 6 5 ) . T h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e s a p p l y t o c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n o n l y . I m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e m i t o t i c s e l e c t i o n p r o c e d u r e , a s i n g l e h a r v e s t o f c e l l s w a s p l a c e d i n a s p i n n e r c u l t u r e f l a s k ( B e l l c o ) . A c e l l c o u n t w a s p e r f o r m e d , t h e f l a s k w a s g a s s e d w i t h 95% a i r , 5% CO2 a n d i t w a s p l a c e d o n a s t i r t a b l e a t 37 ° C . A f t e r t h e a p p r o p r i a t e t i m e i n t e r v a l , a n a l i q u o t o f c e l l s u s p e n s i o n ( a t 1 x 1 0 ^ c e l l s / m l ) w a s r e m o v e d . P a r t o f t h e s u s p e n s i o n w a s l o a d e d i n t o a 5 m l p l a s t i c t e s t t u b e , p l a c e d i n a t e s t t u b e i r r a d i a t i o n r a c k , s h o w n i n f i g u r e 3 b , a n d i r r a d i a t e d f o r a t o t a l d o s e o f 8 G y a t a d o s e r a t e o f 1.27 G y / m i n u t e . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d a t 4 ° C . C e l l s w e r e p l a t e d f r o m t h e i r r a d i a t i o n t u b e s o t h a t a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 c o l o n i e s p e r p e t r i d i s h w o u l d h a v e g r o w n a f t e r 6 d a y s i n c u b a t i o n a t 37 ° C . T h e c e l l c o n c e n t r a t i o n i n t h e i r r a d i a t i o n t u b e s w a s d e t e r m i n e d u s i n g a C o u l t e r C o u n t e r . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e m e d i u m w a s c a r e f u l l y r e m o v e d a n d t h e p e t r i d i s h e s w e r e s t a i n e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3.3. C o l o n i e s c o n t a i n i n g g r e a t e r t h a n 5 0 c e l l s w e r e t h e n c o u n t e d . I n p r e p a r a t i o n f o r a s i n g l e d o s e r e s p o n s e o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k , t h e c e l l s w e r e h a n d l e d a s c d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2.2.3 e x c e p t t h a t 1.3-1.5 x 1 0 c e l l s i n 5 m l o f m e d i u m o ( w i t h d r u g ) w e r e s e e d e d i n t o s e v e r a l 2 5 c m p l a s t i c T C f l a s k s . O n e f l a s k w a s p r e p a r e d f o r e a c h t i m e e x a m i n e d i n t h e c e l l c y c l e r e s p o n s e . A f t e r 12 h o u r s o f e x p o s u r e , a l l f l a s k s w e r e r e l e a s e d f r o m t h e d r u g b y d i s c a r d i n g t h e o v e r l y i n g m e d i u m , r i n s i n g t w i c e w i t h 5 m l o f p r e w a r m e d M E M F - 1 5 ( l a c k i n g F B S a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ) a n d t h e n i n c u b a t i n g i n f r e s h M E M F -15 ( w i t h F B S a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ) . A t t h e d e s i r e d t i m e i n t e r v a l c e l l s w e r e r e m o v e d f r o m a f l a s k b y t r y p s i n i z i n g . A f t e r n e u t r a l i z i n g t h e t r y p s i n w i t h M E M F - 1 5 t h e c e l l s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d a t 6 0 0 r p m f o r 6 m i n u t e s , t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d a n d t h e c e l l s r e s u s p e n d e d i n 8 - 1 0 m l o f f r e s h M E M F - 1 5 ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n 2 x 1 0 5 c e l l s / m l ) . A n a l i q u o t o f c e l l s u s p e n s i o n w a s t h e n l o a d e d i n t o a 5 m l p l a s t i c t e s t t u b e , p l a c e d i n t o a t e s t t u b e i r r a d i a t i o n r a c k ( f i g u r e 3 b ) a n d i r r a d i a t e d f o r a t o t a l d o s e o f 8 G y a t 1.27 G y / m i n u t e . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d a t 4 ° C . C e l l s w e r e p l a t e d f r o m t h e i r r a d i a t i o n t u b e s o t h a t a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 c o l o n i e s p e r , p e t r i d i s h w o u l d h a v e g r o w n a f t e r 6 d a y s i n c u b a t i o n a t 37 ° C . T h e c e l l c o n c e n t r a t i o n i n t h e i r r a d i a t i o n t u b e s w a s d e t e r m i n e d u s i n g a C o u l t e r C o u n t e r . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e m e d i u m w a s c a r e f u l l y r e m o v e d a n d t h e p e t r i d i s h e s w e r e s t a i n e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3 .3 . C o l o n i e s c o n t a i n i n g g r e a t e r t h a n 5 0 c e l l s w e r e t h e n c o u n t e d . 2 .4 .3 H i s t o g r a m s o f t h e DNA D i s t r i b u t i o n F l o w c y t o m e t r y h i s t o g r a m s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k w e r e o b t a i n e d a s a m o n i t o r o f t h e p r o g r e s s i o n o f t h e s e p o p u l a t i o n s t h r o u g h t h e c e l l c y c l e . A F l u o r e s c e n c e A c t i v a t e d C e l l S o r t e r ( F A C S - B e c t o n D i c k i n s o n 4 4 0 ) w a s u t i l i z e d t o m e a s u r e D N A c o n t e n t a t v a r i o u s t i m e s a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n o r a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g b l o c k ( F o x e t a l 1 9 8 7 , F r i e d e t a l 1 9 8 0 ) . A t h o u r l y t i m e i n t e r v a l s a f t e r h a r v e s t , a n a l i q u o t o f c e l l s w a s r e m o v e d f r o m t h e p o p u l a t i o n s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e t o p r o v i d e t w o s a m p l e s c o n t a i n i n g 1 x10 c e l l s a n d 2 x 1 0 c e l l s r e s p e c t i v e l y i n s e p a r a t e t e s t t u b e s . T o t h e s m a l l e r o f t h e t w o s a m p l e s w a s a d d e d 1 x 1 0 6 ' m a r k e r ' c e l l s . T h e s e w e r e p l a t e a u - p h a s e c e l l s t h a t a c t e d a s a G 1 - m a r k e r a n d w e r e o b t a i n e d b y t r y p s i n i z i n g a t i s s u e c u l t u r e f l a s k c o n t a i n i n g a c o n f l u e n t m o n o l a y e r o f c e l l s . I n t h e c a s e o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k , a t h o u r l y t i m e i n t e r v a l s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g , a f l a s k w a s t r y p s i n i z e d t o p r o v i d e t w o c e l l s a m p l e s c o n t a i n i n g 2 x 1 0 c e l l s i n o n e t e s t t u b e a n d 1 x10 c e l l s w i t h 1 x 1 0 m a r k e r c e l l s i n a n o t h e r t e s t t u b e . T h e s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d (6 m i n . , 6 0 0 r p m ) , t h e s u p e r n a t a n t c a r e f u l l y d i s c a r d e d , t h e r e s i d u a l m e d i u m w i p e d f r o m t h e t e s t t u b e a n d t h e c e l l s r e s u s p e n d e d i n a c o l d e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n . O p t i m a l s a m p l e p r e p a r a t i o n w a s a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1-2 x 1 0 c e l l s / m l o f e t h i d i u m b r o m i d e . S a m p l e s w e r e s t o r e d o n i c e a m i n i m u m o f 10 m i n u t e s p r i o r t o a n a l y s i s w h i c h c o n s i s t e d o f f i l t e r i n g t h e s a m p l e s a n d m e a s u r i n g t h e f l u o r e s c e n c e s p e c t r a w i t h t h e f l o w c y t o m e t e r u s i n g 4 8 8 n m e x c i t a t i o n . T h e e t h i d i u m b r o m i d e s o l u t i o n w a s p r e p a r e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 7 5 u M i n a n e u t r a l s a l i n e c i t r a t e b u f f e r o f 0 . 0 0 3 4 M c i t r i c a c i d ( m o n o h y d r a t e ) a n d 0.01 M N a C l . T h e s o l u t i o n a l s o c o n t a i n e d 0 . 1 % N o n I d e t P 4 0 d e t e r g e n t w h i c h l y s e d c e l l m e m b r a n e s . 48 3. RESULTS 3.1 E V A L U A T I N G T H E D E G R E E OF SYNCHRONY 3.1.1 M i to t i c Index T h e m i t o t i c i n d e x o f a p o p u l a t i o n o f c e l l s i s d e f i n e d t o b e t h a t f r a c t i o n o f t h e p o p u l a t i o n t h a t i s i n a n y s t a g e o f m i t o s i s ( p r o p h a s e , m e t a p h a s e , a n a p h a s e o r t e l o p h a s e ) a t s o m e p a r t i c u l a r t i m e ( B e c k e r 1 9 8 6 ) . T h e m i t o t i c i n d e x h a s t r a d i t i o n a l l y b e e n u s e d a s a m e a s u r e o f t h e q u a l i t y o f s y n c h r o n y ( i e . h o m o g e n e i t y i n m i t o s i s ) o f a p o p u l a t i o n o f c e l l s t h a t h a s b e e n s y n c h r o n i z e d j u s t p r i o r t o o r d u r i n g m i t o s i s . C e l l s s y n c h r o n i z e d b y t h e m i t o t i c s e l e c t i o n t e c h n i q u e a r e p a r t i c u l a r i l y s u i t e d , t h e n , t o a n a l y s i s b y t h i s m e t h o d . H o w e v e r , c e l l s s y n c h r o n i z e d a t t h e G1 /S b o r d e r b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k a r e l e s s s u i t e d t o s u c h a n a n a l y s i s s i n c e t h e h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y c h a r a c t e r i s t i c o f t h i s t e c h n i q u e i s u s u a l l y n o t m a i n t a i n e d s e v e r a l h o u r s l a t e r w h e n t h e p o p u l a t i o n r e a c h e s m i t o s i s . O t h e r t e c h n i q u e s a r e e m p l o y e d f o r t h e i r a n a l y s i s . A p o p u l a t i o n o f c e l l s w a s s y n c h r o n i z e d b y t h e m i t o t i c s e l e c t i o n t e c h n i q u e a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2.2.2. M i c r o s c o p e s l i d e s o f f i x e d a n d s t a i n e d c e l l s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2.4.1. T h e s l i d e s w e r e t h e n o b s e r v e d u s i n g a m i c r o s c o p e f o r t h e p r e s c e n c e o f c e l l s i n m i t o s i s . C e l l s i n p r o p h a s e t o e a r l y - t e l o p h a s e w e r e e a s i l y i d e n t i f i e d b y t h e o b v i o u s p r e s c e n c e o f d a r k l y - s t a i n e d c o n d e n s e d c h r o m o s o m e s . C e l l s t h a t d i d n o t c l e a r l y e x h i b i t c h r o m o s o m e s w e r e m o r e d i f f i c u l t t o c l a s s i f y . C e l l s t h a t f a l l i n t o t h i s c a t e g o r y c o u l d i n c l u d e t h o s e f r o m m i d - t e l o p h a s e , G1, S a n d G2 4 9 p h a s e s . M a n y s u c h c e l l s w e r e t y p i c a l l y o b s e r v e d a n d w e r e c l a s s i f i e d b a s e d u p o n s e v e r a l c r i t e r i a d i s c u s s e d i n t h e f o l l o w i n g p a r a g r a p h s . I n p r o p h a s e a s t h e c h r o m o s o m e s c o n d e n s e a n d t h e n u c l e a r e n v e l o p e b e g i n s t o d i s s i p a t e , t h e n u c l e o l i b e c o m e p r o g r e s s i v e l y m o r e d i s p e r s e d s o t h a t b y l a t e - p r o p h a s e n u c l e o l i a r e n o l o n g e r v i s i b l e ( B e c k e r 1 9 8 6 , P r e s c o t t 1 9 7 8 , W h e a t l e y 1 9 8 2 , Willmer 1 9 6 4 ) . T h e r e v e r s e p r o c e s s o c c u r s i n t e l o p h a s e w h e n t h e c h r o m o s o m e s d e c o n d e n s e a n d b o t h t h e n u c l e a r e n v e l o p e a n d t h e n u c l e o l i r e a p p e a r . O n e n u c l e o l u s i s p r e s e n t p e r c h r o m o s o m e (21 f o r W N R E c e l l s ) . A s t h e y e n l a r g e , t h e n u c l e o l i q u i c k l y f u s e i n t o a s i n g l e l a r g e n u c l e o l u s t h a t i s c h a r a c t e r i s t i c o f a n i n t e r p h a s e n u c l e u s . T h e n u c l e o l u s i s t h e o n l y c l e a r l y v i s i b l e f e a t u r e i n t h e n u c l e u s o f i n t e r p h a s e c e l l s s t a i n e d b y t h e d e s c r i b e d t e c h n i q u e . H e n c e , t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a n u c l e o l u s ( o r t h e l a c k t h e r e o f ) i n a s t a i n e d n u c l e u s i s o n e b a s i s f o r c l a s s i f y i n g t h o s e c e l l s t h a t d o n o t e x h i b i t c h r o m o s o m e s a s b e i n g t e l o p h a s e / e a r l y G1 o r i n t e r p h a s e . A s w e l l , t h e m o r p h o l o g i c a l t e x t u r e o f a t e l o p h a s e o r e a r l y p o s t - m i t o t i c n u c l e u s i s m o r e g r a n u l a r i n i t s a p p e a r a n c e c o m p a r e d t o i n t e r p h a s e n u c l e i " d u e t o t h e l o n g t i m e t a k e n b y c h r o m o s o m e s t o f a d e i n t o i n t e r - m i t o t i c c h r o m a t i n " ( W i l l m e r 1 9 6 4 ) . F u r t h e r , i t w a s o b s e r v e d t h a t t h e n u c l e a r a r e a o f t h e m a n y c e l l s t h a t d i d n o t e x h i b i t c h r o m o s o m e s w a s u s u a l l y e q u i v a l e n t i n s i z e t o t h e n u c l e u s o f t h e m o r e c l e a r l y d i s t i n g u i s h a b l e e a r l y - t e l o p h a s e c e l l s a n d s m a l l e r t h a n t h e n u c l e u s o f a d i s t i n c t i v e i n t e r p h a s e c e l l . T h i s m a y h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e c e l l s t h a t d i d n o t e x h i b i t n u c l e a r d e t a i l m a y h a v e r e c e n t l y p r o g r e s s e d f r o m e a r l y t o l a t e - t e l o p h a s e . F i n a l l y , i t w a s o b s e r v e d t h a t m a n y o f t h e c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n w e r e p r e s e n t a s d o u b l e t s . S t a i n e d p r e p a r a t i o n s o f t e n c o n t a i n e d m a n y o f t h e s e d o u b l e t s , t h o u g h t t o b e m i t o t i c d a u g h t e r p a i r s , n e i t h e r o f w h i c h c l e a r l y e x h i b i t e d c h r o m o s o m e s . 5 0 H e n c e , f o u r c r i t e r i a w e r e e s t a b l i s h e d f o r t h e c l a s s i f i c a t i o n o f c e l l s n o t e x h i b i t i n g c h r o m o s o m e s a s b e i n g e i t h e r l a t e - t e l o p h a s e / e a r l y G1 o r i n t e r p h a s e : 1) . t h e p r e s c e n c e o f a d a r k l y s t a i n e d n u c l e o l u s i n t h e n u c l e u s o f a n i n t e r p h a s e c e l l 2 ) . t h e g r a n u l a r t e x t u r e o f t h e t e l o p h a s e n u c l e u s 3 ) . t h e s i m i l a r i t y i n n u c l e a r a r e a o f t h e c e l l t o t h a t o f a n e a r l y t e l o p h a s e c e l l 4 ) . t h e p r e s c e n c e o f t h e c e l l a s a m e m b e r o f a d o u b l e t A l t h o u g h n o n e o f t h e s e c r i t e r i a s i n g u l a r l y d e f i n e d t h e c e l l s i n q u e s t i o n , u s u a l l y m o s t w e r e s a t i s f i e d s i m u l t a n e o u s l y g i v i n g c o n f i d e n c e t o t h e i r p r o p e r c l a s s i f i c a t i o n . T h i s w a s p a r t i c u l a r l y t h e c a s e w i t h t h e l a r g e n u m b e r o f l a t e - t e l o p h a s e / e a r l y G1 c e l l s a n d w i t h t h e f e w c e l l s w i t h a l a r g e v i s i b l e n u c l e o l u s w h i c h w e r e f a i r l y e a s y t o c l a s s i f y . C e l l s w i t h p r o p e r t i e s i n t e r m e d i a t e t o b o t h c l a s s i f i c a t i o n s w e r e m o r e t r o u b l e s o m e a n d h a v e b e e n c l a s s i f i e d s e p a r a t e l y a s " p r o b a b l y m i t o t i c " o r " p r o b a b l y i n t e r p h a s e " . T a b l e 11 s h o w s r e s u l t s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e m i t o t i c i n d e x o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e . F o r e a c h s a m p l e a t l e a s t o n e t h o u s a n d c e l l s w e r e s c o r e d . N o t e t h a t a l t h o u g h t h e m i t o t i c i n d e x i t s e l f i s q u i t e l o w ( 8 . 6 - 4 1 . 3 % ) , w h e n c o m b i n e d w i t h t h o s e c e l l s d e t e r m i n e d a s c l e a r l y o r p r o b a b l y i n l a t e - t e l o p h a s e / e a r l y G1 ( 5 4 . 9 - 8 7 . 9 % ) t h e i n d e x o f s y n c h r o n y b e c o m e s 9 6 . 2 - 9 7 . 7 % . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t a l l o f t h e c l e a r l y m i t o t i c c e l l s w e r e s c o r e d a s a s i n g l e c e l l r a t h e r t h a n a s t w o c e l l s , a s i s s o m e t i m e s c a r r i e d o u t i n t h e l i t e r a t u r e . W i t h i n a s h o r t t i m e , w h e n a l l o f t h e m i t o t i c c e l l s a n d d a u g h t e r c e l l d o u b l e t s w o u l d h a v e c o m p l e t e d d i v i s i o n a n d p r o g r e s s e d b e y o n d m i t o s i s , t h e i n d e x o f s y n c h r o n y b y t h e f o u r c r i t e r i a a b o v e w o u l d t h e n h a v e i n c r e a s e d t o 9 6 . 8 - 9 8 . 3 % i n e a r l y G 1 . S t a i n e d c e l l p r e p a r a t i o n s i n d i c a t e d t h a t w i t h i n 3 0 t o 4 5 m i n u t e s a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n t h e m i t o t i c i n d e x d r o p s t o a b o u t 1 % . T h e r e i s a p a r t i c u l a r t e n d e n c y f o r t h e V 7 9 c e l l l i n e s , w h e n s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n , t o d e t a t c h a s a d a u g h t e r c e l l d o u b l e t i n a n a p h a s e , t e l o p h a s e o r j u s t p a s t m i t o s i s a n d t o r e m a i n a s a d o u b l e t f o r s e v e r a l h o u r s a f t e r h a r v e s t ( G i l l e s p i e 1 9 7 5 , S i n c l a i r a n d Y u 1 9 6 7 , K l e v e c z 1 9 7 5 ) . T h e m i t o t i c i n d e x m a y m i s r e p r e s e n t t h e t r u e s y n c h r o n y o f t h e p o p u l a t i o n s i n c e t h e c e l l s s e l e c t e d b y t h i s p r o c e d u r e p r o b a b l y r e p r e s e n t a s p r e a d i n t i m e o f n o g r e a t e r t h a n t h e l e n g t h o f m i t o s i s ( d e t e r m i n e d b y G i l l e s p i e e t a l t o b e a b o u t 3 0 m i n u t e s ) w i t h i n t h e c e l l c y c l e ( G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . T h e i n d e x o f s y n c h r o n y i n c l u d i n g t h o s e c e l l s i n l a t e -t e l o p h a s e / e a r l y G1 p r o v i d e s a m o r e r e a l i s t i c d e s c r i p t i o n o f t h e q u a l i t y o f s y n c h r o n y . A s w e l l , s i n c e c l e a r l y m i t o t i c c e l l s w e r e s c o r e d a s a s i n g l e , r a t h e r t h a n d o u b l e , c e l l t h e v a l u e f o r t h e m i t o t i c i n d e x a n d i n d e x o f s y n c h r o n y i s r a t h e r c o n s e r v a t i v e c o m p a r e d t o o t h e r a n a l y s i s i n t h e l i t e r a t u r e . T A B L E II V a l u e s o f M i t o t i c I n d e x a n d I n d e x o f S y n c h r o n y ( p e r c e n t a g e i n e a c h c a t e g o r y ) S a m p l e M i t o t i s T e l o p h a s e / P r o b a b l y I n t e r p h a s e P r o b a b l y I n d e x o f N u m b e r e a r l y G1 T e l o p h a s e / I n t e r . S y n c h . e a r l y G1 1 4 1 . 3 51 . 9 3.0 2.1 1.7 96 .2 2 34.1 61 .6 2.0 1.6 0.7 97 .7 3 8.6 8 6 . 5 1.4 1.8 1.7 96 .5 5 2 F I G U R E 4 : P H O T O G R A P H S O F C E L L S IN M I T O S I S A N D I N T E R P H A S E I n t e r p h a s e c e l l s a r e s p r e a d o u t a n d a r e f i r m l y a t t a t c h e d t o t h e s u r f a c e o f t h e c u l t u r e v e s s e l . I n m i t o s i s , t h e c e l l s b e c o m e s p h e r i c a l i n s h a p e a n d a r e l o o s e l y a t t a t c h e d t o t h e v e s s e l s u r f a c e b y t h i n s t r a n d s o f t u b u l i n , ( s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h , r e p r i n t e d w i t h t h e p e r m i s s i o n o f D r . D.M. P r e s c o t t ) 5 3 3.1.2 S i n g l e Dose R e s p o n s e o f S y n c h r o n i z e d C e l l s T h e v a r i a t i o n i n c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y a s a f u n c t i o n o f p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e ( t h e " a g e r e s p o n s e " ) w a s n o t e d b y S i n c l a i r a n d M o r t o n i n 1 9 6 3 u s i n g a V 7 9 s u b l i n e . T h e i r r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e c e l l s w e r e m o s t s e n s i t i v e w h e n i r r a d i a t e d a t o r n e a r t h e m i t o t i c p h a s e o f t h e c e l l c y c l e a n d w e r e m o s t r e s i s t a n t w h e n i r r a d i a t e d d u r i n g l a t e S p h a s e ( S i n c l a i r and Morton 1 9 6 3 , 1 9 6 5 ) . A n a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n , b e i n g a m i x t u r e o f c e l l s a t a l l s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e , s h o u l d e x h i b i t a c o n s t a n t r a d i o s e n s i t i v i t y a s a f u n c t i o n o f t i m e . T h e r e s p o n s e o f s y n c h r o n i z e d c e l l s t o a c o n s t a n t d o s e o f r a d i a t i o n o v e r t h e c e l l c y c l e m a y q u a l i t a t i v e l y p r o v i d e a n i n d i c a t i o n o f t h e q u a l i t y o f s y n c h r o n y o f t h e p o p u l a t i o n . C e l l s w e r e s y n c h r o n i z e d a n d p r e p a r e d f o r s i n g l e d o s e i r r a d i a t i o n s t u d i e s a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2.4.2. T h e r e s p o n s e o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s t o a c o n s t a n t d o s e , 8 G y , o f 2 5 0 K V p X - r a d i a t i o n i s s h o w n i n f i g u r e 5 f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r f o l l o w e d w i t h 1 m i l h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n . T h e e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e u s e d t o o b t a i n t h e r e s p o n s e s i n v o l v i n g h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n e n s u r e d t h a t a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n w a s i r r a d i a t e d a n d p l a t e d . H o w e v e r , s u s p e n s i o n s o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o f t e n c o n t a i n e d b e t w e e n 40 - 8 0 % v i s i b l e d o u b l e t s t h a t r e m a i n e d d o u b l e t s u p t o s e v e r a l h o u r s a f t e r s e l e c t i o n . I t w a s n e c e s s a r y , t h e n , t o c o r r e c t t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n f o r t h e a v e r a g e n u m b e r o f c e l l s p e r c o l o n y f o r m i n g u n i t ( C F U ) p l a t e d i n o r d e r t o o b t a i n t h e s i n g l e c e l l r e s p o n s e . T h e a v e r a g e s i n g l e c e l l s u r v i v a l , s , i s r e l a t e d t o t h e s u r v i v a l , f , f o r a m i x e d p o p u l a t i o n o f m u l t i p l e c e l l C F U ' s b y t h e e x p r e s s i o n ( S i n c l a i r and Morton 1 9 6 5 ) f = I 0 i < 1 - ( 1 - s ) i > ( 1 9 ) i w h e r e 0-j i s t h e f r a c t i o n o f t h e C F U ' s h a v i n g i c e l l s . A n a p p r o x i m a t i o n t o e q u a t i o n 19 m a y b e m a d e : f = 1 - ( 1 - s ) N ( 2 0 ) o r , s = 1 - ( 1 - f ) 1 / N ( 2 1 ) w h e r e N i s t h e a v e r a g e v i a b l e c e l l m u l t i p l i c i t y = I 0yi. T h e a b o v e a s s u m e s t h a t e a c h c e l l o f a C F U s u r v i v e s i n d e p e n d a n t l y o f o t h e r c e l l s . E q u a t i o n 21 w a s a p p l i e d t o t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e a s s u m i n g a n a v e r a g e o f 6 0 % d o u b l e t s ( i e . N=1.6) i n t h e p o p u l a t i o n ( b e t w e e n 4 0 - 8 0 % d o u b l e t s w e r e t y p i c a l l y o b s e r v e d ) t o o b t a i n t h e s i n g l e c e l l s u r v i v a l s h o w n i n f i g u r e 5. 55 i ' 1 1 1 1 1 1 1 1 r Single Dose (8 Gy) Response Synchronous V79-WNRE Cells O Mitotic Selection Alone A Mitotic Selection + HU • Mitotic Selection + APH 0.1 0.01 -0.001 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 4 6 8 10 12 14 TIME (Hours) F I G U R E 5 : S I N G L E D O S E (8 GY ) IRRADIATION P R O F I L E T h e r e s p o n s e o f s y n c h r o n i z e d c e l l s t o a c o n s t a n t d o s e (8 G y ) o f r a d i a t i o n a s a f u n c t i o n o f t ime a f t e r mi to t i c s e l e c t i o n a l one ( O ), o r a f t e r r e l e a s e f r o m 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 mM h y d r o x y u r e a ( A ) o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n ( • ) p r o c e e d e d b y mi to t i c s e l e c t i o n . T h e r e s p o n s e o f ce l l s s y n c h r o n i z e d b y mi to t i c s e l e c t i o n a l one has b e e n c o r r e c t e d f o r t h e l a r g e n u m b e r o f d o u b l e t s p r e s e n t i n t h e p o p u l a t i o n u s i n g e q u a t i o n 16 f o r N=1.6. T h e l i ne s r e p r e s e n t t h e 10 o r d e r r e g r e s s i o n f i t t o t h e r e s p o n s e o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y mi to t i c s e l e c t i o n a l one ( ), o r f o l l o w e d b y h y d r o x y u r e a ( ) o r a p h i d i c o l i n (- ). 5 6 3.1.3 F l u o r e s c e n c e A n a l y s i s o f DNA D i s t r i b u t i o n s T h e v a r i a t i o n i n D N A c o n t e n t o f a c e l l a s i t t r a v e r s e s t h e c e l l c y c l e m a y b e e x p l o i t e d t o p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e q u a l i t y a n d p o s i t i o n o f a s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n . S i n c e t h e V 7 9 - W N R E i s a d i p l o i d c e l l t y p e t h e D N A c o n t e n t g r a d u a l l y i n c r e a s e s f r o m 2 n ( w h e r e n=21 f o r V 7 9 - W N R E ) a t t h e b e g i n n i n g t o 4 n a t t h e c o n c l u s i o n o f t h e s y n t h e s i s ( S ) p h a s e o f t h e c e l l c y c l e a n d r e m a i n s a t 4 n d u r i n g G 2 p h a s e . U p o n d i v i s i o n a t m i t o s i s , h a l f o f t h e 4 n c h r o m o s o m e s a r e e q u a l l y d i s t r i b u t e d t o e a c h o f t h e d a u g h t e r c e l l s , r e t u r n i n g t h e c e l l s t o t h e 2 n s t a t e f o r t h e e n t i r e t y o f G1 p h a s e . T h e D N A c o n t e n t o f a p o p u l a t i o n o f c e l l s m a y b e d e t e r m i n e d u s i n g a f l u o r o c h r o m e t h a t b i n d s s t o i c h i o m e t r i c a l l y t o t h e D N A o f t h e c e l l s . W h e n t h e p r o b e m o l e c u l e s a r e e x c i t e d a t a s p e c i f i c f r e q u e n c y b y a l a s e r , f l u o r e s c e n c e i s e m i t t e d t h a t i s p r o p o r t i o n a l i n i n t e n s i t y t o t h e D N A c o n t e n t ( F r i e d e t a l 1 9 8 0 ) . U s i n g a F l u o r e s c e n c e A c t i v a t e d C e l l S o r t e r ( F A C S ) c e l l p r e p a r a t i o n s s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e w e r e e x c i t e d b y a 4 8 8 n m l a s e r t o f l u o r e s c e a t > 5 8 0 n m . H i s t o g r a m s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r f o l l o w e d b y e i t h e r h y d r o x y u r e a (1 o r 2 m f i ) o r a p h i d i c o l i n (1 o r 3 u g / m l ) a r e s h o w n i n f i g u r e 6. T h e t w o v e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t p o s i t i o n s o f t h e 2 n a n d 4 n p e a k s r e s p e c t i v e l y . A l l p o p u l a t i o n s a p p e a r t o b e h i g h l y s y n c h r o n i z e d i n i t i a l l y . C e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e m a i n t a i n a h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y e s p e c i a l l y d u r i n g t h e f i r s t t w o h o u r s . T h e p o p u l a t i o n l o s e s s o m e d e g r e e o f s y n c h r o n y a s i t p a s s e s t h r o u g h t h e c e l l c y c l e a s e v i d e n c e d b y t h e e n l a r g e d S p h a s e t a i l a t 11 h o u r s . P o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y h y d r o x y u r e a a p p e a r t o b e e q u a l l y w e l l s y n c h r o n i z e d 5 7 f o l l o w i n g r e l e a s e f r o m e i t h e r 1 o r 2 mM h y d r o x y u r e a , a l t h o u g h t h e p o p u l a t i o n r e c e i v i n g 2 mM i s d e l a y e d s l i g h t l y i n i t s p r o g r e s s i o n t h r o u g h S p h a s e t o G 2 . B l o c k i n g w i t h 1 o r 3 u g / m l a p h i d i c o l i n a p p e a r s t o p r o d u c e e q u a l l y s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s a l t h o u g h t h e p o p u l a t i o n r e c e i v i n g 3 u g / m l i s a l s o d e l a y e d s l i g h t l y i n i t s p r o g r e s s i o n t h r o u g h S p h a s e t o G 2 . B o t h 1 mM h y d r o x y u r e a a n d 1 u g / m l a p h i d i c o l i n w o r k w e l l i n s y n c h r o n i z i n g c e l l s a t t h e G 1 / S b o r d e r a l t h o u g h t h e s y n c h r o n y a p p e a r s t o b e b e t t e r m a i n t a i n e d b y 1 u g / m l a p h i d i c o l i n a f t e r o n e c o m p l e t e c e l l c y c l e a s i n d i c a t e d b y t h e T=10 h o u r h i s t o g r a m s . A t T=0 f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d a t t h e G 1 / S b o r d e r o n e m i g h t e x p e c t t h e d i s t r i b u t i o n s t o l i e o n t h e G1 p e a k . T h e h i s t o g r a m s f o r h y d r o x y u r e a a n d a p h i d i c o l i n a t T=0, h o w e v e r , a p p e a r s h i f t e d t o t h e r i g h t o f t h e G1 p e a k a s i f t h e p o p u l a t i o n s w e r e s y n c h r o n i z e d i n e a r l y S p h a s e r a t h e r t h a n a t t h e G 1 / S b o r d e r . T h i s i s n o t a n u n c o m m o n o c c u r r e n c e f o r p o p u l a t i o n s p r e - t r e a t e d w i t h a d r u g p r i o r t o s t a i n i n g w i t h a f l u o r o c h r o m e . T h e o b s e r v e d s h i f t i s m o r e l i k e l y d u e t o a g r e a t e r u p t a k e o f e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n t h e D N A d o u b l e h e l i x o f t h e c e l l s p o s s i b l y r e s u l t i n g f r o m t h e o p e n i n g u p o f m o r e p o t e n t i a l b i n d i n g s i t e s o n t h e D N A b y t h e h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n p r e t r e a t m e n t ( c o n v e r s a t i o n w i t h D r . R . E . D u r a n d ) . In e i t h e r c a s e , t h e i n i t i a l p o p u l a t i o n s a p p e a r w e l l s y n c h r o n i z e d a t t h e i r p a r t i c u l a r p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e w h e t h e r i t i s c l a s s i f i e d a s t h e G 1 / S b o r d e r o r e a r l y S. I n a n e f f o r t t o q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e t h e p e r c e n t a g e s o f c e l l s i n G 1 , S o r G 2 / M p h a s e s a t a p a r t i c u l a r t i m e , a c o m p u t e r p r o g r a m ( w r i t t e n b y D r . R. E. D u r a n d ) w a s u s e d t o a n a l y z e t h e h i s t o g r a m s . T h e G1 p o p u l a t i o n w a s c h a r a c t e r i z e d b y f i t t i n g a g a u s s i a n d i s t r i b u t i o n t o t h e a s c e n d i n g h a l f o f t h e m a x i m u m p e a k o f t h e h i s t o g r a m a n d c a l c u l a t i n g t h e a r e a u n d e r t h e 5 8 g a u s s i a n b o u n d e d o n e i t h e r s i d e o f t h e p e a k b y t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s . T o e l i m i n a t e f i t t i n g t h e g a u s s i a n t o t a i l n o i s e , a l l d a t a t o t h e l e f t o f t h e p o i n t r e p r e s e n t i n g 5 % o f t h e p e a k m a x i m u m w a s i g n o r e d . T h e G 2 / M p o p u l a t i o n w a s s i m i l a r l y c h a r a c t e r i z e d b y f i t t i n g a g a u s s i a n d i s t r i b u t i o n t o t h e d e s c e n d i n g h a l f o f t h e d a t a c e n t e r e d a t t h e c h a n n e l n u m b e r c o r r e s p o n d i n g t o a s p e c i f i e d G 2 / G 1 c h a n n e l n u m b e r r a t i o . T h e S p h a s e p o p u l a t i o n i n c l u d e d a l l c e l l s n o t f a l l i n g u n d e r e i t h e r o f t h e f i t t e d g u a s s i a n d i s t r i b u t i o n s . A n e x a m p l e o f a c o m p u t e d f i t t o a h i s t o g r a m i s s h o w n i n f i g u r e 7. T h e G 1 , S a n d G 2 / M r e g i o n s a r e b o u n d e d b y a d a s h e d , s o l i d a n d d o t t e d l i n e r e s p e c t i v e l y . T h e p e r c e n t a g e o f t h e p o p u l a t i o n i n e a c h o f t h e t h r e e p h a s e s w a s c o m p u t e d f r o m t h e a r e a u n d e r t h e t h r e e c u r v e s . T h e h i s t o g r a m s f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r f o l l o w e d b y 1mM h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n w e r e a n a l y z e d f o r p h a s e p e r c e n t a g e i n G 1 , S o r G 2 / M . T h e p r o g r a m i s b e s t s u i t e d f o r a n a l y z i n g a s y n c h r o n o u s h i s t o g r a m s c o n t a i n i n g a m a x i m u m a t t h e G1 p e a k , a l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e c e l l s i n S p h a s e a n d a s m a l l e r G 2 / M p e a k . M o s t o f t h e h i s t o g r a m s o f s y n c h r o n i z e d c e l l s c o n t a i n o n l y o n e p r o m i n e n t p e a k l o c a t e d o n o r b e t w e e n t h e G1 a n d G2 p o s i t i o n m a r k e r s w h i c h t h e p r o g r a m w o u l d w r o n g l y i n t e r p r e t a s t h e G1 p e a k r e g a r d l e s s o f c h a n n e l n u m b e r . A t b e s t t h e p r o g r a m c a n b e u s e d t o p r o v i d e a r o u g h e s t i m a t i o n o f t h e p e r c e n t n u m b e r o f c e l l s r e p r e s e n t e d b y t h e p r o m i n e n t p e a k . A t t i m e T=0 t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s d e t e r m i n e d t o l i e u n d e r t h e p r o m i n e n t p e a k f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r f o l l o w e d b y 1 mM h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n w a s a n a l y z e d t o b e 9 2 . 8 8 % , 9 5 . 3 6 % a n d 9 3 . 4 7 % r e s p e c t i v e l y . A l t h o u g h n o t d e f i n i t i v e , t h e s e f i g u r e s d o s u g g e s t a h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y f o r t h e i n i t i a l p o p u l a t i o n s . 5 9 A* 10 11 Hours MS (no drug) F I G U R E 6 : F L O W C Y T O M E T R Y D I S T R I B U T I O N S A F T E R S Y N C H R O N Y T h e d i s t r i b u t i o n o f D N A c o n t e n t a t v a r i o u s t i m e s a f t e r s y n c h r o n y p r o c e d u r e s . A : P o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e . B t o E : M i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h e x p o s u r e t o a d r u g b l o c k , w i t h r e l e a s e a t 0 h . B : 1 m M h y d r o x y u r e a . C : 2 m M h y d r o x y u r e a . D : 1 u g / m l a p h i d i c o l i n . E : 3 ug/ml a p h i d i c o l i n . T h e v e r t i c a l l i n e s s h o w t h e p o s i t i o n s o f t h e 2 n ( G 1 ) a n d 4 n ( G 2 ) p e a k s . T h e t i m e a f t e r s y n c h r o n i z a t i o n i s s h o w n a b o v e e a c h o f t h e h i s t o g r a m s . 6 0 F I G U R E 7 : C O M P U T E D F I T T O A D N A H I S T O G R A M A D N A h i s t o g r a m o f a p r e v i o u s l y s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n o f c e l l s w a s c o m p u t e r f i t t e d t o t h e e x p e r i m e n t a l d a t a p o i n t s ( c i r c l e s ) i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e a p p r o x i m a t e p e r c e n t a g e o f c e l l s i n G1, S o r G2/M. 61 3.2 A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S P r e v i o u s s t u d i e s o n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - 1 7 1 c e l l s i n d i c a t e d t h e p r e s c e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e a t l o w d o s e ( l e s s t h a n 4 G y i n a i r ) ( S k a r s g a r d e t a l 1 9 9 0 b , c ) . I n a n e f f o r t t o f u r t h e r e x p l o r e t h e c a u s e o f t h e s u b s t r u c t u r e , s i m i l a r s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t o n V 7 9 - W N R E c e l l s . T h e V 7 9 - W N R E c e l l l i n e w a s c h o s e n f o r i t s a d a p t a b i l i t y t o b o t h s p i n n e r a n d m o n o l a y e r c u l t u r e m a k i n g i t w e l l s u i t e d f o r b o t h a s y n c h r o n o u s s t u d i e s a n d s y n c h r o n o u s s t u d i e s u s i n g m i t o t i c s e l e c t i o n w h e r e i t w a s k n o w n t o p r o v i d e a g o o d s h a k e - o f f y i e l d a t h a r v e s t . U s i n g t h e c e l l s o r t e r a s s a y , r a d i a t i o n s u r v i v a l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g p o p u l a t i o n s o f V 7 9 - W N R E c e l l s . T w o s e r i e s o f s u c h e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 12 G y . T h e i n i t i a l s e r i e s ( o r " s e r i e s 1 " ) i n c l u d e d 5 e x p e r i m e n t s u s i n g a d o s e i n c r e m e n t o f 0.5 G y f o r s a m p l e s b e t w e e n 0 a n d 4 G y . I n a n e f f o r t t o m o r e a c c u r a t e l y d e f i n e t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e , a s e c o n d s e r i e s o f 8 e x p e r i m e n t s ( " s e r i e s 2 " ) w a s c o n d u c t e d e i g h t m o n t h s a f t e r t h e t e r m i n a t i o n o f t h e f i r s t s e r i e s u s i n g a d o s e i n c r e m e n t o f 0.4 G y f o r s a m p l e s b e t w e e n 0 a n d 4 G y . T h i s a l l o w e d f o r t h e a d d i t i o n o f f o u r m o r e e x p e r i m e m t a l s a m p l e s r e p r e s e n t i n g t w o d o s e p o i n t s o v e r t h e l o w d o s e r a n g e . 3.2.1 I n i t i a l S e r i e s o f A s y n c h r o n o u s E x p e r i m e n t s D a t a f r o m 5 e x p e r i m e n t s o f t h e i n i t i a l a s y n c h r o n o u s s e r i e s w e r e a v e r a g e d a n d f i t t e d t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c ( L Q ) e q u a t i o n S = e x p ( - a D -3 D 2 ) o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 12 G y a s s e e n i n f i g u r e 8. T h e s a m e d a t a m a y a l t e r n a t i v e l y b e r e p l o t t e d a s - l n ( S ) / D v s . D, t h e l i n e a r f o r m o f t h e L Q e q u a t i o n , - l n ( S ) / D = a + (3D, w h e r e S i s e q u a l t o t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n a n d D i s e q u a l t o t h e d o s e , a s s e e n i n f i g u r e 9 ( S k a r s g a r d 1990 b , c ) . I t i s c l e a r , p a r t i c u l a r l y i n f i g u r e 9, t h a t t h e q u a l i t y o f t h e L Q f i t o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e i s p o o r w i t h m o s t o f t h e l o w d o s e p o i n t s l y i n g o f f t h e f i t t e d c u r v e . T h i s r e s u l t s u g g e s t e d t h a t t h e d a t a m a y b e b e t t e r c h a r a c t e r i z e d b y f i t t i n g t h e l o w d o s e ( 0 - 3 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 - 1 2 G y ) d a t a s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n a s s e e n i n f i g u r e s 10 a n d 11 . T h e s e s a m e d a t a a n d L Q f i t s a r e s h o w n i n f i g u r e s 12 a n d 13 p l o t t e d o n a n e x p a n d e d s c a l e u p t o 4 G y . I t c a n b e s e e n t h a t t h e r e i s a c o n s i s t e n t d i v e r g e n c e b e t w e e n t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e f i t s , e v i d e n c e o f a 2 - c o m p o n e n t c h a r a c t e r i n t h e r e s p o n s e . C o m p a r i n g f i g u r e s 9 a n d 11 i t i s c l e a r t h a t a s i n g l e , f u l l d o s e L Q f i t t o t h e d a t a i s n o t a d e q u a t e t o d e s c r i b e t h e a s y n c h r o n o u s s u r v i v a l r e s p o n s e o f V 7 9 - W N R E c e l l s . I f t h e d a t a w e r e t r u l y r e p r e s e n t a t i v e o f a s i n g l e L Q f u n c t i o n , t h e n i t s h o u l d f o l l o w a s i n g l e s t r a i g h t l i n e o f s l o p e b e t a a n d y -a x i s i n t e r c e p t a l p h a , w h e n p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s D. T h e s t r a i g h t l i n e f i t t o t h e d a t a s h o w n i n t h e - l n ( S ) / D v s D p l o t s i s t h e s a m e f i t a s i n t h e S v s D p l o t s , i e . , t h e d a t a i n b o t h c a s e s h a v e b e e n f i t b y t h e m e t h o d o f l e a s t s q u a r e s t o t h e e q u a t i o n l n ( S ) = - a D - 3 D . F u r t h e r e v i d e n c e o f a t w o c o m p o n e n t c h a r a c t e r i n t h e s u r v i v a l r e s p o n s e i s f o u n d f r o m s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e s o f a l p h a a n d b e t a f o r t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e f i t s o f t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s . A S t u d e n t ' s t - t e s t a n d t w o n o n p a r a m e t r i c t e s t s ( s e e a p p e n d i x A ) w e r e a p p l i e d t o t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a l p h a a n d b e t a t o d e t e r m i n e w h e t h e r d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e l o w d o s e d i s t r i b u t i o n s o f a l p h a o r b e t a a n d h i g h d o s e d i s t r i b u t i o n s o f a l p h a o r b e t a a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . R e s u l t s f r o m t h e a n a l y s i s a r e s h o w n i n t a b l e I I I . F o r t h e i n i t i a l s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a l p h a w e r e d e t e r m i n e d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e P = 0 . 0 6 7 5 ( t - t e s t p a i r e d 6 3 a n a l y s i s ) , P = 0 . 0 3 6 9 ( t - t e s t u n p a i r e d a n a l y s i s ) , P<0.001 ( r a n k - s u m t e s t ) a n d P=0 . 056 ( W - t e s t ) l e v e l s . F o r b e t a , t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s w e r e f o u n d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e P =0.0596 ( t - t e s t p a i r e d a n a l y s i s ) , P=0 .0421 ( t - t e s t u n p a i r e d a n a l y s i s ) , P<0.001 ( r a n k - s u m t e s t ) a n d P=0 .008 ( W -t e s t ) l e v e l s . T h e s e P v a l u e s r e f l e c t a h i g h d e g r e e ( a b o u t 9 3 - 9 9 % ) o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w o r h i g h d o s e v a l u e s o f a l p h a o r b e t a a r e n o t s u b s e t s o f a l a r g e r d i s t r i b u t i o n o f a l p h a ' s o r b e t a ' s b u t r e p r e s e n t d i s t r i b u t i o n s s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . A g o o d n e s s o f f i t t e s t w a s a p p l i e d t o t h e L Q f i t o f t h e d a t a o v e r t h e f u l l d o s e ( 0 - 1 2 G y ) , l o w d o s e ( 0 - 3 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 - 1 2 G y ) r a n g e s . T h e t e s t c o n s i s t e d o f a s i m p l e c a l c u l a t i o n o f t h e R M S d e v i a t i o n o f t h e l o g a r i t h m o f t h e a c t u a l d a t a f r o m t h e l o g a r i t h m o f t h e f i t t e d p o i n t s o f t h e L Q s u r v i v a l c u r v e a t t h e d o s e v a l u e s o f t h e d a t a . F o r t h e f u l l d o s e f i t , t h e R M S d e v i a t i o n w a s f o u n d t o b e 0 . 0346 ( u n i t l e s s ) . T h e d e v i a t i o n d e c r e a s e d t o 0 . 0 0 9 5 2 b y f i t t i n g t o t h e l o w d o s e d a t a a n d t o 0 .0331 b y f i t t i n g t o t h e h i g h d o s e d a t a s e p a r a t e l y . T h e s e f i g u r e s , s h o w n i n t a b l e V I , r e a s s e r t t h a t t h e r e s p o n s e i s b e s t c h a r a c t e r i z e d b y s e p a r a t e f i t s t o t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e d a t a . T h e d i v i s i o n b e t w e e n l o w a n d h i g h d o s e w a s c h o s e n a s 3 G y b a s e d u p o n a n a n a l y s i s o f t h e R M S d e v i a t i o n s o f t h e v a r i o u s p o s s i b l e f i t s t o t h e d a t a i n d i c a t i n g , f o r a t w o - c o m p o n e n t f i t , t h a t t h e l o w e s t R M S d e v i a t i o n s w e r e o b t a i n e d f o r f i t s b e t w e e n 0 t o 3 G y a n d 3 t o 12 G y . L a r g e r R M S d e v i a t i o n s w e r e o b t a i n e d w h e n t h e d i v i s i o n b e t w e e n l o w a n d h i g h d o s e w a s t e s t e d a t 2 , 2 .5 , 3.5 o r 4 G y . 6 4 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ' 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 8 : I N I T I A L S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S E X P E R I M E N T S - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m a s y n c h r o n o u s l y g r o w i n g V 7 9 - W N R E c e l l s i r r a d i a t e d a t 3 7 ° C i n s u s p e n s i o n c u l t u r e u n d e r a e r o b i c c o n d i t i o n s ( 3 - 6 x 1 0 ^ c e l l s / m l i n M E M S - 1 4 ; X - r a y s o u r c e : P h i l i p s 2 5 0 k V p , H V L 1.5 mm C u , d o s e r a t e 2 . 295 G y / m i n . ) . C e l l s o r t i n g w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e n u m b e r o f c e l l s f o r p l a t i n g i n t o p e t r i d i s h e s . A f t e r a 6 d a y i n c u b a t i o n p e r i o d , c o l o n i e s w e r e s t a i n e d a n d c o u n t e d , t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n S w a s t h e n d e t e r m i n e d . D a t a a r e t h e a v e r a g e o f f i v e e x p e r i m e n t s f r o m t h e i n i t i a l a s y n c h r o n o u s s e r i e s . E r r o r b a r s a r e t h e s t a n d a r d e r r o r i n t h e m e a n . S o l i d l i n e s r e p r e s e n t t h e l e a s t - s q u a r e s f i t o f t h e d a t a o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e (0 t o 12 G y ) t o t h e L Q e q u a t i o n . D a t a a n d b e s t f i t s a r e p l o t t e d i n " t h e f o r m S = e x p ( - a D - | 3 D 2 ) . N o t e t h a t a l l f i t s t o t h e L Q m o d e l i n t h i s t h e s i s h a v e b e e n m a d e t o t h e e q u a t i o n l n ( S ) = - a D - p D f o r c u r v e s p l o t t e d e i t h e r a s S v s . D o r - l n ( S ) / D v s . D. 6 5 0.8 0.7 0.6 0.5 C O I 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Asynchronous V79-WNRE Cells Series 1 Results Full Dose LQ Fit 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 9 : I N I T I A L S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S E X P E R I M E N T S - II T h e s a m e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 8 f o r t h e a v e r a g e o f f i v e e x p e r i m e n t s f r o m t h e i n i t i a l a s y n c h r o n o u s s e r i e s a r e r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + 0 D. W h e n p l o t t e d i n t h i s f o r m t h e p a r a m e t e r s a a n d 3 o f t h e L Q f i t a r e c l e a r l y v i s u a l i z e d a s t h e y - a x i s i n t e r c e p t a n d s l o p e , r e s p e c t i v e l y . T h e s o l i d l i n e r e p r e s e n t s t h e l e a s t - s q u a r e s f i t o f t h e d a t a o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e ( 0 t o 12 G y ) t o t h e L Q e q u a t i o n . 66 o j Z 0.1 o < o > 0.01 > en Z ) (/) 0.001 0.0001 Asynchronous V79-WNRE Cells Series 1 Results Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit - i i i_ 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 10 S E P A R A T E F I T S T O S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A - I T h e s a m e d a t a a s s h o w n i n f i g u r e 8 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e ( 3 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - ( 3 D ). 6 7 0.0 *• 1 1 1 1 1 1 1 1 ' 1 1 I 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 11 : S E P A R A T E F I T S T O S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A - II T h e s a m e d a t a a s s h o w n i n f i g u r e 8 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e ( 3 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + (3 D. 6 8 < > > o . i Asynchronous V79-WNRE Cells Series 1 Results Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit DOSE (Gray) F I G U R E 12 : L O W D O S E S U R V I V A L S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A - I T h e d a t a a n d s e p a r a t e l o w d o s e (0 t o 3 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 t o 12 G y ) f i t s t o t h e L Q e q u a t i o n a s s h o w n i n f i g u r e 8 f o r t h e a v e r a g e o f f i v e e x p e r i m e n t s o f t h e i n i t i a l a s y n c h r o n o u s s e r i e s a r e r e p l o t t e d o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 4 G y i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - B D ). 6 9 0.5 i i r i i r Asynchronous V79-WNRE Cells Series 1 Results 0.4 h Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit I 0.3 /-I 0.2 h 1 0.1 2 3 DOSE (Gray) F I G U R E 13 : L O W D O S E S U R V I V A L S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A - II T h e d a t a a n d s e p a r a t e l o w d o s e (0 t o 3 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 t o 12 G y ) f i t s t o t h e L Q e q u a t i o n a s s h o w n i n f i g u r e 8 f o r t h e a v e r a g e o f f i v e e x p e r i m e n t s o f t h e i n i t i a l a s y n c h r o n o u s s e r i e s a r e r e p l o t t e d o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 4 G y i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + (3 D. 7 0 3.2.2 S e c o n d S e r i e s o f A s y n c h r o n o u s E x p e r i m e n t s D a t a f r o m 8 e x p e r i m e n t s o f t h e s e c o n d a s y n c h r o n o u s s e r i e s w e r e a v e r a g e d a n d f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 - 2 G y ) a n d h i g h d o s e ( 2 - 1 2 G y ) r a n g e s a s s e e n i n f i g u r e 14. T h e s a m e d a t a a n d L Q f i t s a r e r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s . D i n f i g u r e 15. T h e d i f f e r e n c e s i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e s o f t h e i n i t i a l a n d s e c o n d s e r i e s o f e x p e r i m e n t s a r e m o s t e v i d e n t b y c o m p a r i n g f i g u r e s . 11 a n d 15. T h e l o w d o s e r e g i o n a p p e a r s t o b e m o r e s e n s i t i v e a n d t h e h i g h d o s e r e g i o n m o r e r e s i s t a n t i n t h e s e c o n d s e r i e s c o m p a r e d t o t h e i n i t i a l s e r i e s . I n s p i t e o f t h e o b v i o u s d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o s e t s o f d a t a i t i s s t i l l c l e a r t h a t t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e d a t a a r e b e s t r e p r e s e n t e d b y f i t t i n g t h e d a t a s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n . A s i m i l a r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t o n t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r £• T h e r e s u l t s , s h o w n i n t a b l e I I I , i n d i c a t e t h a t f o r t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a w e r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t a t t h e P=0 .042 ( t - t e s t p a i r e d a n a l y s i s ) , P =0 . 087 ( t - t e s t u n p a i r e d a n a l y s i s ) , P=0 .078 ( r a n k - s u m t e s t ) a n d P=0 .115 ( W - t e s t ) l e v e l s . F o r (3, t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s w e r e f o u n d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e P=0 . 013 ( t - t e s t p a i r e d a n a l y s i s ) , P=0 .0091 ( t - t e s t u n p a i r e d a n a l y s i s ) , P < 0.001 ( r a n k - s u m t e s t ) a n d P < 0.001 ( W - t e s t ) l e v e l s . T h e s e P v a l u e s i n d i c a t e , f o r a , a c o n f i d e n c e o f b e t w e e n 88 . 5 % a n d 95 .8 % t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a r e p r e s e n t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s . F o r 0 , t h e r e i s b e t w e e n 98 .7 % a n d 99 .9 % c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f |3 r e p r e s e n t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s . 71 T A B L E II! S T A T I S T I C A L S I G N I F I C A N C E O F T H E D I F F E R E N C E S B E T W E E N T H E L O W D O S E A N D H I G H D O S E V A L U E S O F a A N D 3 A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S F u l l L o w H i g h P p a i r P r u n p p s r Pw D o s e D o s e D o s e M e a n M e a n M e a n S e r i e s 1 ( 5 E x p t s ) a ( x 1 0 _ 1 G y " 1 ) 2 . 447 1.893 2 .498 0 .067 0 .037 <0.001 0 .056 3 ( x 1 0 ~ 2 G y " 2 ) 2 .607 4 . 5 0 8 2 .599 0 . 059 0 . 042 <0.001 0 . 008 S e r i e s 2 ( 8 E x p t s ) a ( x 1 0 " 1 G y " 1 ) 2 .457 2 .179 2.451 0 . 042 0 . 087 0 . 078 0 . 115 3 ( x 1 0 ~ 2 G y " 2 ) 2 . 294 4 . 9 0 2 2 .299 0 . 0 1 3 0 .0091 <0.001 <0.001 ( N o t e : P v a l u e s s t a t e d w e r e d e t e r m i n e d f r o m S t u d e n t s ' t - t e s t p a i r e d a n a l y s i s ( P p a i r ) > S t u d e n t s ' t - t e s t u n p a i r e d a n a l y s i s ( P u p p ) ' t n e s i g n e d - r a n k t e s t ( P s r ) a n d t h e W - t e s t ( P ^ ) , a s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A ) . 7 2 i i 1 1 i i | i 1 1 | 1 r 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 14 : S E C O N D S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S - I A s y n c h r o n o u s c e l l s w e r e h a n d l e d a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a r e t h e a v e r a g e o f e i g h t e x p e r i m e n t s o b t a i n e d d u r i n g t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . D a t a h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ) D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - o t D - p D ). 7 3 0.8 0.7 0.6 O 0.5 00 I 0.4 0.3 0.2 0.1 -- i 1 r- ~i 1 r Asynchronous V79-WNRE Cells Series 2 Results Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit 0.0 1 • •- _ l I L_ 8 12 DOSE (Gray) 16 F I G U R E 15 : S E C O N D S E R I E S O F A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S -II A s y n c h r o n o u s c e l l s w e r e h a n d l e d a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a r e t h e a v e r a g e o f e i g h t e x p e r i m e n t s o b t a i n e d d u r i n g t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i e m n t s . D a t a h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e ( 2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ) D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a +B D. 7 4 T h e r e a s o n f o r t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e i n i t i a l a n d s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s s u r v i v a l r e s p o n s e s i s n o t i m m e d i a t e l y a p p a r e n t . A p e r i o d o f a b o u t e i g h t m o n t h s l a p s e d b e t w e e n t h e l a s t e x p e r i m e n t o f t h e i n i t i a l s e r i e s a n d f i r s t e x p e r i m e n t o f t h e s e c o n d s e r i e s , d u r i n g w h i c h t i m e m o s t o f t h e e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g s y n c h r o n i z e d c e l l s w e r e p e r f o r m e d . N a t u r a l " b i o l o g i c a l d r i f t " w o u l d t e n d t o s h i f t t h e r e s p o n s e u n i f o r m l y a c r o s s t h e e n t i r e d o s e r a n g e r a t h e r t h a n t h e s k e w e d d i s p l a c e m e n t o b s e r v e d . A m o r e l i k e l y e x p l a n a t i o n m a y b e f o u n d b y e x a m i n i n g t h e F A C S p r o d u c e d m e a s u r e m e n t s o f c e l l u l a r l i g h t s c a t t e r i n g s h o w n i n f i g u r e 16 f o r a t y p i c a l e x p e r i m e n t f r o m e a c h o f t h e i n i t i a l a n d s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . T h e h i s t o g r a m s s h o w l i g h t s c a t t e r i n g i n t e n s i t y a s a f u n c t i o n o f c h a n n e l n u m b e r ( p a r t i c l e v o l u m e ) . T h e y a r e u s e d t o e s t a b l i s h " g a t e s " f o r t h e m i n i m u m a n d m a x i m u m p a r t i c l e v o l u m e s t h a t t h e F A C S w i l l s o r t i n t o t h e p l a t i n g s a m p l e s . T h e d i s t r i b u t i o n o f p a r t i c l e v o l u m e s p r i o r t o g a t i n g i s s h o w n i n f i g u r e s 1 6 a a n d 1 6 c . I n o r d e r t o e l i m i n a t e c e l l u l a r a n d o t h e r d e b r i s , c h a r a c t e r i z e d b y t h e t a i l s o f t h e p a r t i c l e v o l u m e d i s t r i b u t i o n , t h e g a t e s s h o w n i n f i g u r e s 16b a n d 1 6 d w e r e e s t a b l i s h e d . A l l p a r t i c l e s h a v i n g v o l u m e s l y i n g b e t w e e n t h e g a t e s w e r e c l a s s i f i e d a s s i n g l e c e l l s a n d b e c a m e c a n d i d a t e s f o r s o r t i n g i n t o t h e p l a t i n g s a m p l e t e s t t u b e . F i g u r e 1 6 d f r o m t h e s e c o n d s e r i e s s h o w s a n i n c r e a s e i n t h e w i d t h o f t h e g a t e c o m p a r e d t o f i g u r e 1 6 b f r o m t h e i n i t i a l s e r i e s . T h e i n c r e a s e i n g a t e w i d t h a p p e a r s m a i n l y t o i n c l u d e t h o s e p a r t i c l e s f r o m t h e f o r w a r d t a i l o f t h e d i s t r i b u t i o n . I f t h e a d d i t i o n a l p a r t i c l e s b e i n g i n c l u d e d b y t h i s e n l a r g e d g a t i n g a r e n o n - v i a b l e d e b r i s , t h e c e l l s o r t e r w o u l d i n t e r p r e t e a c h p a r t i c l e o f d e b r i s a s a v i a b l e s i n g l e c e l l r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n t h e p l a t i n g e f f i c i e n c y . T h e z e r o d o s e p l a t i n g e f f i c i e n c y ( a n d s t a n d a r d e r r o r ) f o r t h e i n i t i a l s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s w a s 8 1 . 4 7 5 ± 1.3 % , a n d f o r t h e s e c o n d s e r i e s w a s 75 .5 ± 0.9 % , i n d i c a t i n g t h a t t h e a b o v e h y p o t h e s i s m a y b e t r u e , a l t h o u g h o t h e r f a c t o r s a r e l i k e l y i n v o l v e d . T h e - l n ( S ) / D v s D p l o t i s p a r t i c u l a r l y s e n s i t i v e t o s l i g h t v a r i a t i o n s i n t h e z e r o d o s e p l a t i n g e f f i c i e n c y , e s p e c i a l l y i n t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e p l o t . A s m a l l d e c r e a s e i n t h e z e r o d o s e p l a t i n g e f f i c i e n c y a l o n e w o u l d p r o d u c e a n o v e r a l l i n c r e a s e i n t h e s u r v i v a l r e s p o n s e , w h i c h w o u l d b e o b s e r v e d a s a d o w n w a r d s h i f t i n t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e - l n ( S ) / D v s D p l o t . T h i s i s q u i t e o p p o s i t e t o t h e u p w a r d s h i f t i n t h e l o w d o s e r e g i o n o b s e r v e d f o r t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . T h e o b s e r v e d s h i f t w o u l d b e m o r e e a s i l y e x p l a i n e d b y a n i n c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n o f s e n s i t i v e c e l l s i n t h e a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n , l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e - l n ( S ) / D v s D p l o t , b u t w o u l d n o t a c c o u n t f o r t h e s l i g h t d o w n w a r d s h i f t i n t h e h i g h d o s e r e g i o n . A n i n c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n o f s e n s i t i v e c e l l s c o u l d o c c u r i f s o m e o f t h e c e l l s g r o w n a s m o n o l a y e r o n t h e t i s s u e c u l t u r e f l a s k s w e r e o v e r c r o w d e d a n d r e s t r i c t e d f r o m n o r m a l c e l l c y c l i n g . T h i s w o u l d l e a d t o c e l l s m a i n t a i n e d a t G Q w h i c h a r e v e r y s e n s i t i v e i n t h e i r r a d i a t i o n r e s p o n s e . G r e a t e f f o r t w a s t a k e n t o e n s u r e t h a t t h e t i s s u e c u l t u r e f l a s k s u s e d f o r a s y n c h r o n o u s r a d i a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e b e t w e e n 4 0 - 7 0 % c o n f l u e n t i n o r d e r t o e l i m i n a t e i n d u c i n g t h e c e l l s i n t o G Q . T h e r e w e r e n o o b v i o u s d i f f e r e n c e s i n t h i s r e g a r d b e t w e e n t h e f l a s k s u s e d f o r t h e i n i t i a l o r s e c o n d s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , a l t h o u g h l a r g e r 175 c m T C f l a s k s w e r e u s e d f o r t h e s e c o n d s e r i e s w h i l e 7 5 c m T C f l a s k s w e r e u s e d f o r t h e i n i t i a l s e r i e s . A s p a r t o f t h e n o r m a l e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e , p r e p a r a t i o n s o f e t h i d i u m - b r o m i d e s t a i n e d c e l l s f r o m t h e i r r a d i a t e d a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n w e r e o b t a i n e d f o r e a c h e x p e r i m e n t . T h e p r e p a r a t i o n s w e r e a n a l y z e d t o d e t e r m i n e t h e d i s t r i b u t i o n o f D N A c o n t e n t f o r t h e p o p u l a t i o n o f a s y n c h r o n o u s c e l l s . H i s t o g r a m s o f r e l a t i v e n u m b e r o f c e l l s v s . c h a n n e l n u m b e r ( D N A c o n t e n t ) f o r s o m e o f t h e i n i t i a l a n d s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s a r e s h o w n i n f i g u r e 17. A n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f s e n s i t i v e G l o r G Q c e l l s w o u l d b e r e f l e c t e d i n a n i n c r e a s e i n t h e p r o m i n e n t G1 p e a k . T h e h i s t o g r a m s f o r b o t h s e r i e s o f e x p e r i m e n t s s h o w r o u g h l y t h e s a m e d i s t r i b u t i o n o f c e l l s t h r o u g h o u t t h e c e l l c y c l e i n d i c a t i n g n o o b v i o u s d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p o p u l a t i o n s u s e d f o r a n y o f t h e e x p e r i m e n t s . 77 1 B 2 3 4 A Channel Number (Particle Volume) ell Number 1 c 2 A 1 D 2 A tive C 3 i 4 3 4 Rela /V A A A Channel Number (Particle Volume) F I G U R E 16 : P A R T I C L E V O L U M E D I S T R I B U T I O N S H i s t o g r a m s o f t h e l i g h t s c a t t e r i n g i n t e n s i t y a s a f u n c t i o n o f c h a n n e l n u m b e r ( p a r t i c l e v o l u m e ) f o r c e l l u l a r p o p u l a t i o n s w e r e r o u t i n e l y m e a s u r e d f o r e a c h e x p e r e m e n t a s p a r t o f t h e c e l l s o r t i n g p r o c e d u r e . T h e s e w e r e u s e d t o e s t a b l i s h ' g a t e s ' o f m i n i m u m a n d m a x i m u m p a r t i c l e v o l u m e s f o r t h e s o r t e d c e l l s a m p l e s . T h e d i s t r i b u t i o n o f p a r t i c l e v o l u m e s p r i o r t o g a t i n g i s s h o w n f o r a ) , t h e i n i t i a l s e r i e s a n d c ) . t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . T h e p o s i t i o n o f t h e e s t a b l i s h e d g a t e s i s s h o w n f o r t h e s a m e p a r t i c l e v o l u m e d i s t r i b u t i o n f o r b ) . t h e i n i t i a l s e r i e s a n d d ) . t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . 7 8 i t Relative Cell Number Channel Number (DNA Content) it Relative Cell Number Channel Number (DNA Content) F I G U R E 17 : D N A D I S T R I B U T I O N O F A S Y N C H R O N O U S C E L L P O P U L A T I O N S T h e d i s t r i b u t i o n o f D N A c o n t e n t f o r t h e i r r a d i a t e d a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n s o f c e l l s w a s d e t e r m i n e d a s p a r t o f t h e r o u t i n e p r o c e d u r e o f a n a s y n c h r o n o u s e x p e r i e m n t . H i s t o g r a m s o f r e l a t i v e c e l l n u m b e r v s . c h a n n e l n u m b e r ( D N A c o n t e n t ) f r o m s o m e o f t h e a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s a r e s h o w n f o r a ) , t h e i n i t i a l s e r i e s , a n d b ) . t h e s e c o n d s e r i e s . T h e s a m p l e s i n d i c a t e n o o b v i o u s d i f f e r e n c e s i n t h e p o p u l a t i o n s u s e d f o r e i t h e r s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . T h e v e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t t h e a p p r o x i m a t e p o s i t i o n s o f t h e 2 n ( G 1 ) a n d 4 n ( G 2 ) p e a k s . 7 9 3.3 S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S In o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e w a s t h e r e s u l t o f d i f f e r e n t i a l k i l l i n g o f s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h d i f f e r e n t r a d i o s e n s i t i v i t i e s ( h y p o t h e s i s 3, s e c t i o n 4 .3 o f t h e D i s c u s s i o n ) , t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e o f h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n s o f s y n c h r o n i z e d c e l l s w a s m e a s u r e d u s i n g t h e s a m e k i n d o f e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e u t i l i z e d w i t h t h e a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n s . I t w a s d e s i r a b l e t o o b t a i n p o p u l a t i o n s t h a t w e r e h o m o g e n e o u s b o t h i n t h e i r r a d i a t i o n s e n s i t i v i t y a n d i n p o p u l a t i o n s i z e w i t h i n t h e c e l l c y c l e . H e t e r o g e n e i t i e s i n e i t h e r r e s p e c t c o u l d r e s u l t i n a r e s p o n s e i n f l u e n c e d b y t h e c o n s t i t u e n t s u b p o p u l a t i o n s . T h e h y p o t h e s i s m a y b e t e s t e d b y a p p l y i n g s t a t i s t i c a l a n a l y s i s ( s e e a p p e n d i x A ) t o t h e l o w a n d h i g h d o s e p a r a m e t e r s a a n d |3 d e r i v e d f r o m t h e r e p o n s e s o f s y n c h r o n i z e d c e l l s . F o r t h e h y p o t h e s i s t o b e v a l i d , d i f f e r e n c e s i n t h e p a r a m e t e r s s h o u l d n o t b e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t , a s s u m i n g t h a t t h e L Q m o d e l a d e q u a t e l y c h a r a c t e r i z e s t h e r e s p o n s e o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s b e i n g e x a m i n e d . 3.3.1 C e l l s S y n c h r o n i z e d B v M i t o t i c S e l e c t i o n A l o n e 3.3.1.1 R e s p o n s e O f G1 P h a s e C e l l s U s i n g t h e c e l l s o r t e r a s s a y , r a d i a t i o n s u r v i v a l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e . T w o s e r i e s o f s u c h e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t . T h e f i r s t s e r i e s i n c l u d e d 4 e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d o n c e l l s i n i t i a l l y g r o w n o n t h e i n n e r s u r f a c e o f g l a s s r o l l e r b o t t l e s p r i o r t o m i t o t i c s e l e c t i o n . I r r a d i a t i o n s f o r 3 o f t h e e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n e h o u r a f t e r r o l l o f f , w h i c h i n c l u d e s a b o u t 30 m i n u t e s o f c e l l h a n d l i n g ( c e n t r i f u g a t i o n , r e s u s p e n s i o n , p r e p a r a t i o n o f 8 0 i r r a d i a t i o n f l a s k ) , a n d 3 0 m i n u t e s o f u n p e r t u r b e d c e l l u l a r g r o w t h a t 3 7 ° C i n s p i n n e r c u l t u r e . T h e f o u r t h e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d t w o h o u r s a f t e r r o l l o f f w h i c h i n c l u d e s 3 0 m i n u t e s o f c e l l h a n d l i n g a n d 90 m i n u t e s o f u n p e r t u r b e d g r o w t h a t 3 7 ° C . I t w a s c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d t h a t l a r g e c e l l u l a r c l u m p s f o r m e d o n t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e g l a s s r o l l e r b o t t l e s . I n a n a t t e m p t t o e l i m i n a t e t h e c l u m p i n g , w h i c h w a s s u s p e c t e d o f c o n t r i b u t i n g i n t e r p h a s e c e l l c o n t a m i n a n t s , c e l l s w e r e g r o w n o n t h e i n n e r s u r f a c e o f p l a s t i c r o l l e r b o t t l e s . A s e c o n d s e r i e s i n c l u d i n g f o u r e x p e r i m e n t s w a s c o n d u c t e d o n c e l l s c u l t u r e d i n t h e s e b o t t l e s p r i o r t o m i t o t i c s e l e c t i o n . I r r a d i a t i o n s f o r 2 o f t h e e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n e h o u r a n d f o r t h e o t h e r 2 e x p e r i m e n t s t w o h o u r s a f t e r r o l l o f f u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d f o r t h e f i r s t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . E x a m i n a t i o n o f t h e s i n g l e d o s e i r r a d i a t i o n p r o f i l e , f i g u r e 5, i n d i c a t e s t h a t t h e p o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d i n G1 p h a s e a n d t h a t t h e r e s p o n s e t o 8 G y w a s r e l a t i v e l y u n i f o r m u p t o 2 h o u r s a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n . T h e r e s p o n s e s f o r b o t h s e r i e s o f e x p e r i m e n t s a n d t i m e s w e r e r o u g h l y e q u i v a l e n t a n d h a v e b e e n a v e r a g e d t o g e t h e r a n d f i t t e d t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 12 G y a s s e e n i n f i g u r e s 18 a n d 19. T h e q u a l i t y o f a s i n g l e f i t o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e i s p o o r , w i t h m o s t o f t h e l o w d o s e p o i n t s l y i n g a b o v e a n d t h e h i g h d o s e p o i n t s l y i n g b e l o w t h e b e s t f i t c u r v e . T h i s r e s u l t s u g g e s t e d t h a t t h e d a t a m a y b e b e t t e r c h a r a c t e r i z e d b y f i t t i n g t h e l o w d o s e ( 0 - 3 . 2 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 . 2 - 1 2 G y ) d a t a s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n a s s e e n i n f i g u r e 2 0 . T h e s a m e k i n d o f d i v e r g e n c e s e e n i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e i s a l s o s e e n i n f i g u r e 20 f o r a h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f c e l l s i n G 1 . T h e s a m e d a t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s . D i s s h o w n i n f i g u r e 2 1 . C o m p a r i n g f i g u r e s 21 t o f i g u r e 19 , f o r t h e 0 t o 12 G y f i t , i t i s c l e a r t h a t a s i n g l e L Q f i t i s n o t a d e q u a t e t o d e s c r i b e t h e 81 s u r v i v a l r e s p o n s e o f V 7 9 - W N R E c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e a n d a l l o w e d t o p r o g r e s s t o G 1 . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e s f o r a o r 0 f r o m l o w o r h i g h d o s e f i t s t o t h e L Q m o d e l c l e a r l y i n d i c a t e t h a t t h e l o w d o s e v a l u e s o f a o r (J a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h i g h d o s e v a l u e s . R e s u l t s f r o m t h e a n a l y s i s a r e s h o w n i n t a b l e IV. T h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a w e r e d e t e r m i n e d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e P<0.001 l e v e l f o r b o t h t h e p a i r e d a n d u n p a i r e d t - t e s t s a s w e l l a s f o r b o t h n o n p a r a m e t r i c t e s t s . F o r 0, t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s w e r e a l s o f o u n d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e P<0.001 l e v e l f o r b o t h t h e p a i r e d a n d u n p a i r e d t - t e s t s a s w e l l a s f o r b o t h n o n p a r a m e t r i c t e s t s . T h e s e P v a l u e s r e f l e c t a n e x t r e m e l y h i g h d e g r e e ( >99 .9% ) o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r 0 r e p r e s e n t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t d i s t r i b u t i o n s f r o m e a c h o t h e r . A g o o d n e s s o f f i t t e s t c o n s i s t i n g o f a c a l c u l a t i o n o f t h e R M S d e v i a t i o n o f t h e a c t u a l d a t a f r o m t h e f i t t e d p o i n t s o f t h e L Q s u r v i v a l c u r v e w a s c a r r i e d o u t f o r t h e l o w d o s e , h i g h d o s e a n d f u l l d o s e L Q b e s t f i t s . F o r t h e f u l l d o s e f i t , t h e R M S d e v i a t i o n w a s f o u n d t o b e 0 . 157 ( u n i t l e s s ) . T h e d e v i a t i o n d e c r e a s e d t o 0 . 0 2 1 7 b y f i t t i n g t o t h e l o w d o s e d a t a a n d t o 0 . 1 1 5 b y f i t t i n g t o t h e h i g h d o s e d a t a s e p a r a t e l y . T h e s e f i g u r e s r e a s s e r t t h a t t h e r e s p o n s e i s b e s t c h a r a c t e r i z e d b y s e p a r a t e f i t s t o t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e d a t a . 3 .3.1.2 R e s p o n s e o f G1 P h a s e C e l l s E x p o s e d t o T r y p s i n T h e c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e c o n t a i n e d a l a r g e n u m b e r ( 4 0 - 8 0 % ) o f v i s i b l e c e l l d o u b l e t s t h a t r e m a i n e d e v e n s e v e r a l h o u r s a f t e r h a r v e s t . T h e c e l l s o r t i n g p r o c e d u r e u s e d f o r a l l o f t h e i r r a d i a t i o n e x p e r i m e n t s e n s u r e d t h a t o n l y s i n g l e c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r t h e 8 2 p l a t i n g s a m p l e s . I n o r d e r t o i n c r e a s e t h e e f f i c i e n c y o f t h e s o r t i n g p r o c e d u r e , w h i c h w a s r e d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e h i g h n u m b e r o f d o u b l e t s , a n d i n o r d e r t o e n s u r e t h a t n o d o u b l e t s a c t u a l l y w e r e s o r t e d i n t o t h e p l a t i n g s a m p l e s , s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h t r y p s i n t o b r e a k u p d o u b l e t s a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 .3 .2 .1 . F i g u r e 2 2 s h o w s t h e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s o n c e l l s t h a t w e r e s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e , a l l o w e d t o p r o g r e s s t o G1 p h a s e i n s p i n n e r c u l t u r e f o r 1 h o u r , t r e a t e d w i t h t r y p s i n a n d i r r a d i a t e d 2 h o u r s a f t e r h a r v e s t . S e p a r a t e f i t s t o t h e l o w d o s e ( 0 - 3 . 2 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 . 2 -12 G y ) d a t a i n d i c a t e t h a t s u b s t r u c t u r e i s s t i l l p r e s e n t i n t h e r e s p o n s e a t l o w d o s e . T h e s u b s t r u c t u r e o b s e r v e d i n f i g u r e s 20 a n d 21 f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e i r r a d i a t e d 1 t o 2 h o u r s a f t e r h a r v e s t w a s n o t e l i m i n a t e d b y r e d u c i n g t h e p o p u l a t i o n t o a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n . 3.3.1.3 Response of S - P h a s e Cells E x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e a n d a l l o w e d t o p r o g r e s s t o S p h a s e i n s p i n n e r c u l t u r e . F i g u r e 2 3 s h o w s t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e f o r t h e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s o f p o p u l a t i o n s i r r a d i a t e d 6.5 h o u r s a f t e r h a r v e s t , w h i c h i n c l u d e s 30 m i n u t e s o f c e l l h a n d l i n g t i m e . T h e d a t a , r e p l o t t e d i n f i g u r e 2 4 a s - l n ( S ) / D v s . D, e x h i b i t s v e r y l i t t l e o f t h e s t r u c t u r e s e e n i n t h e r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s c e l l s , a l t h o u g h w i t h o n l y 2 e x p e r i m e n t s n o c o n c l u s i o n s c a n b e d r a w n . 8 3 T A B L E IV S T A T I S T I C A L S I G N I F I C A N C E O F T H E D I F F E R E N C E S B E T W E E N T H E L O W D O S E A N D H I G H D O S E V A L U E S O F a A N D |3 S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E F u l l L o w H i g h p p a i r p u n p p s r P W D o s e D o s e D o s e M e a n M e a n M e a n G1 P h a s e C e l l s ( 8 E x p t s ) a ( x 1 0 _ 1 G y " 1 ) 4 . 5 1 4 2 . 055 4 . 6 4 2 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 3 ( x 1 0 " 2 G y " 2 ) 2 . 168 9.221 2 . 234 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 S P h a s e C e l l s ( 2 E x p t s ) a ( x 1 0 " 1 G y - 1 ) 0 . 347 0 . 518 0 . 3 0 3 (3 ( x 1 0 ~ 2 G y " 2 ) 2 . 946 2 .632 2 .990 8 4 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection Alone G1 Phase Full Dose LQ Fit 0.0001 1 ' 1 1 1 1 1 1 1 ' 1 1 1 1 1 1 1 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 18 : M I T O T I C S E L E C T I O N G1 P H A S E C E L L I R R A D I A T I O N - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f e i g h t e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a n d i r r a d i a t e d i n G1 p h a s e o n e t o t w o h o u r s a f t e r h a r v e s t . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d the f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - c t D - 0 D ) 85 CO I 0.8 0 . 7 0.6 0.5 0 . 4 0.3 0.2 0.1 0.0 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection Alone G1 Phase Full Dose LQ Fit 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 19 M I T O T I C S E L E C T I O N G1 P H A S E C E L L I R R A D I A T I O N II S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f e i g h t e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a n d i r r a d i a t e d i n G1 p h a s e o n e t o t w o h o u r s a f t e r h a r v e s t . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d t h e f u l l d o s e (0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + B D. 8 6 0.0001 1 1 1 1 1 ' 1 1 I i . i I . . i I 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 0 : S E P A R A T E F I T S T O M I T O T I C S E L E C T I O N G1 D A T A - I T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 18 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e ( 3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - c t D - 0 D z ) . 8 7 0.8 0.7 0.6 Q 0.5 \ tn, 0.4 I 0.3 0.2 0.1 0.0 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection Alone G1 Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit - i ' 8 12 DOSE (Gray) 16 F I G U R E 21 S E P A R A T E F I T S T O M I T O T I C S E L E C T I O N G1 D A T A - II T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 18 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( r ) . D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + SD . 8 8 4 8 12 DOSE (Gray) F I G U R E 2 2 : G1 P H A S E C E L L S P R E T R E A T E D W I T H T R Y P S I N S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a n d t r e a t e d w i t h t r y p s i n p r i o r t o i r r a d i a t i o n i n G1 p h a s e . T h e m i t o t i c s e l e c t i o n p r o c e d u r e r e s u l t s i n a l a r g e n u m b e r ( 4 0 t o 8 0 % ) o f d a u g h t e r c e l l d o u b l e t s b e i n g p r e s e n t i n t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n . A f t e r p r o g r e s s i n g t o G1 p h a s e , t h e p o p u l a t i o n w a s r e d u c e d t o a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n b y t h e a d d i t i o n o f t r y p s i n p r i o r t o i r r a d i a t i o n . D a t a a n d s e p a r a t e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) a n d h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + 3D 8 9 < > > en ZD CO 0.1 0.01 0.001 0.0001 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection Alone S Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 3 : M I T O T I C S E L E C T I O N S P H A S E C E L L I R R A D I A T I O N - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a n d i r r a d i a t i e d i n S p h a s e 6.5 h o u r s a f t e r h a r v e s t . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d s e p a r a t e L Q f i t s t o t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) a n d h i g h d o s e ( 3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ) a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - c t D - 3 D 2 ) . 9 0 0.7 -i 1 r 0.6 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection Alone S Phase 0.5 -Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit -0.1 • • • _ i i i _ 8 12 DOSE (Gray) 16 F I G U R E 2 4 : M I T O T I C S E L E C T I O N S P H A S E C E L L I R R A D I A T I O N - II S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t w o e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a n d i r r a d i a t i e d i n S p h a s e 6.5 h o u r s a f t e r h a r v e s t . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d s e p a r a t e L Q f i t s t o t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) a n d h i g h d o s e ( 3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ) a r e p l o t t e d i n t h e f o r m -I n S / D = a + 0 D . 91 3.3.2 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v A D r u g B l o c k P o p u l a t i o n s t h a t w e r e s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e w e r e i n i t i a l l y c o m p o s e d o f c e l l s f r o m e a r l y m e t a p h a s e t o l a t e t e l o p h a s e , r e p r e s e n t i n g a s p r e a d i n t i m e n o g r e a t e r t h a n t h e l e n g t h o f m i t o s i s ( a b o u t 3 0 m i n u t e s , G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . I n a n e f f o r t t o s h a r p e n t h e " w i n d o w " o f s y n c h r o n y , p o p u l a t i o n s w e r e s y n c h r o n i z e d u s i n g t h e c o m b i n e d t e c h n i q u e s o f m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a d r u g b l o c k . T h e r e s u l t i n g p o p u l a t i o n s r e s y n c h r o n i z e d a g a i n a t t h e G 1 / S b o r d e r w e r e h i g h l y u n i f o r m i n t h e i r a g e s p e c i f i c i t y a s i n d i c a t e d b y t h e r e s u l t s i n s e c t i o n s 3.1.2 a n d 3.1.3. 3.3.2.1 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v H y d r o x y u r e a R a d i a t i o n s u r v i v a l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s i n i t i a l l y s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a . A 12 h o u r e x p o s u r e t o H U ( o r o t h e r i n h i b i t o r y d r u g s ) , w h i c h c o r r e s p o n d s r o u g h l y t o t h e c e l l c y c l e t i m e o f t h e c e l l s w h e n g r o w n o n m o n o l a y e r , w a s f o u n d s u i t a b l e b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s i n p r o d u c i n g a h o m o g e n e o u s c o h o r t o f c e l l s a t t h e G 1 / S b o r d e r w i t h a r e l a t i v e l y m i n o r e f f e c t o n t h e p l a t i n g e f f i c i e n c y o r t h e s u b s e q u e n t r a d i a t i o n r e s p o n s e ( F o x e t a l 1 9 8 7 ) . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d 6 5 t o 7 0 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g w h i c h i n c l u d e d a b o u t 35 m i n u t e s o f c e l l h a n d l i n g d u r i n g w h i c h t i m e i t w a s a s s u m e d t h a t l i t t l e p r o g r e s s i o n t h r o u g h t h e c e l l c y c l e h a d o c c u r r e d . T h e s a m p l e r e p r e s e n t e d a p o p u l a t i o n o f h i g h l y u n i f o r m a g e a t t h e G 1 / S b o r d e r o r e a r l y S a s c a n b e s e e n f r o m f i g u r e 5 f o r t h e s i n g l e d o s e r e s p o n s e o f c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 m M h y d r o x y u r e a . D a t a f r o m 7 s u c h e x p e r i m e n t s h a v e b e e n a v e r a g e d a n d f i t t e d t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e 0 t o 12 G y a s s h o w n i n f i g u r e s 2 5 a n d 2 6 . T h e d a t a , f i t t e d s e p a r a t e l y o v e r t h e l o w d o s e ( 0 - 3 . 2 G y ) a n d 9 2 h i g h d o s e ( 3 . 2 - 1 2 G y ) r e g i o n s a s s h o w n i n f i g u r e s 27 a n d 2 8 , e x h i b i t v e r y l i t t l e o f t h e s t r u c t u r e o b s e r v e d i n t h e r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s c e l l s . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e s f o r a o r (3 f r o m h i g h a n d l o w d o s e f i t s t o t h e L Q m o d e l c l e a r l y i n d i c a t e t h a t t h e l o w d o s e v a l u e s o f a o r p a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h i g h d o s e v a l u e s . R e s u l t s f r o m t h e a n a l y s i s a r e s h o w n i n t a b l e V . D i f f e r e n c e s i n t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a w e r e d e t e r m i n e d t o b e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t t h e P>0.5 l e v e l f o r b o t h t h e p a i r e d a n d u n p a i r e d t - t e s t s a n d a t t h e P=0 .95 l e v e l f o r t h e W -t e s t . F o r (3, d i f f e r e n c e s i n t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s w e r e a l s o f o u n d t o b e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t t h e P>0.5 l e v e l f o r t h e t - t e s t s b u t o n l y a t t h e P=0 . 208 l e v e l f o r t h e W - t e s t . T h e s e P v a l u e s r e f l e c t a n e x t r e m e l y l o w d e g r e e (< 5 0 % ) o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r S r e p r e s e n t d i s t r i b u t i o n s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . A g o o d n e s s o f f i t t e s t c o n s i s t i n g o f a c a l c u l a t i o n o f t h e R M S d e v i a t i o n o f t h e l o g a r i t h m o f t h e a c t u a l d a t a f r o m t h e f i t t e d p o i n t s o f t h e L Q s u r v i v a l c u r v e w a s c a r r i e d o u t f o r t h e l o w , h i g h a n d f u l l d o s e f i t s . F o r t h e f u l l d o s e f i t , t h e R M S d e v i a t i o n w a s f o u n d t o b e 0 . 0 0 3 2 5 . T h e d e v i a t i o n d i f f e r e d b y o n l y 6.1 % f r o m t h e v a l u e o f 0 . 0 0 3 4 5 o b t a i n e d b y f i t t i n g t h e l o w d o s e d a t a b u t b y 3 6 % w i t h t h e v a l u e o f 0 . 0 0 2 0 6 o b t a i n e d b y f i t t i n g t h e h i g h d o s e d a t a . T h e s e v a l u e s f o r t h e R M S d e v i a t i o n a r e c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a n t h e v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e ( 0 . 0 1 2 t o 0 . 0 6 4 ) . S i m i l a r r a d i a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s t h a t h a d b e e n i n i t i a l l y s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o h y d r o x y u r e a a n d i r r a d i a t e d b e t w e e n 2.5 a n d 3.5 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g , w h i c h i n c l u d e s a b o u t 3 5 m i n u t e s o f n o n - c y c l i n g c e l l 9 3 h a n d l i n g t i m e . A c c o r d i n g t o t h e s i n g l e d o s e i r r a d i a t i o n r e s p o n s e a s a f u n c t i o n o f c e l l c y c l e t i m e f o r a p o p u l a t i o n s y n c h r o n i z e d b y t h i s m e t h o d ( f i g u r e 5 ) , t h e c e l l s w e r e j u s t p a s t t h e m o s t r a d i o r e s i s t a n t p o i n t i n t h e c e l l c y c l e i e . l a t e S / e a r l y G 2 p h a s e . D a t a f r o m 3 e x p e r i m e n t s , o n e e a c h a t 2 .5 , 3.0 a n d 3.5 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e h y d r o x y u r e a r e p r e s e n t i n g a n u n p e r t u r b e d c y c l i n g t i m e o f 2 .0 , 2.5 a n d 3.0 h o u r s r e s p e c t i v e l y , h a v e b e e n a v e r a g e d a n d f i t t e d t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e s h o w n i n f i g u r e s 2 9 a n d 30 . T h e d a t a , f i t t e d s e p a r a t e l y o v e r t h e l o w d o s e ( 0 - 3 . 2 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 . 2 - 1 2 G y ) r e g i o n s a s s h o w n i n f i g u r e s 31 a n d 3 2 , c l e a r l y e x h i b i t s s u b s t r u c t u r e i n t h e l o w d o s e r e g i o n . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e s f o r a a n d 3 f r o m h i g h a n d l o w d o s e f i t s t o t h e L Q m o d e l c l e a r l y i n d i c a t e t h e l o w d o s e v a l u e s o f a o r 3 a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h i g h d o s e v a l u e s , a s s h o w n i n t a b l e V . T h e P v a l u e s r e f l e c t a v e r y h i g h d e g r e e o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r 3 r e p r e s e n t d i s t r i b u t i o n s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . 3.3.2.2 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v A p h i d i c o l i n R a d i a t i o n s u r v i v a l e x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s i n i t i a l l y s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 u g / m l a p h i d i c o l i n . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d 65 t o 70 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g w h i c h i n c l u d e d a b o u t 3 5 m i n u t e s o f n o n - c y c l i n g t i m e d u r i n g c e l l h a n d l i n g . A c c o r d i n g t o t h e s i n g l e d o s e i r r a d i a t i o n r e s p o n s e a s a f u n c t i o n o f c e l l c y c l e f o r a p o p u l a t i o n s y n c h r o n i z e d b y t h i s m e t h o d ( f i g u r e 5 ) t h e c e l l s w e r e i r r a d i a t e d j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r i n e a r l y S p h a s e . D a t a f r o m 3 i d e n t i c a l e x p e r i m e n t s h a v e b e e n a v e r a g e d a n d f i t t e d t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e s h o w n i n f i g u r e s 3 3 a n d 34 . T h e s a m e d a t a h a s b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y o v e r t h e l o w d o s e ( 0 - 3 . 2 G y ) a n d h i g h d o s e ( 3 . 2 - 1 2 G y ) r e g i o n s a s s h o w n i n f i g u r e s 3 5 a n d 3 6 . T h e r e s p o n s e i s v e r y s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d u s i n g h y d r o x y u r e a ( f i g u r e s 28 a n d 2 9 ) e x h i b i t i n g v e r y l i t t l e o f t h e s t r u c t u r e o b s e r v e d i n t h e r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s c e l l s . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e v a l u e s f o r a l p h a o r b e t a f r o m h i g h a n d l o w d o s e f i t s t o t h e L Q m o d e l c l e a r l y i n d i c a t e t h a t t h e l o w d o s e v a l u e s o f a l p h a o r b e t a a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h i g h d o s e v a l u e s . R e s u l t s a r e s h o w n i n t a b l e V . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r 3 w e r e d e t e r m i n e d t o b e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t t h e P>0.5 l e v e l f o r b o t h t h e p a i r e d a n d u n p a i r e d t - t e s t s a n d a t t h e P=0 .70 l e v e l f o r t h e W -t e s t . T h e s e P v a l u e s r e f l e c t a n e x t r e m e l y l o w d e g r e e (<50 % ) o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r B r e p r e s e n t d i s t r i b u t i o n s w h i c h a r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . G o o d n e s s o f f i t c a l c u l a t i o n s i n d i c a t e d f o r t h e f u l l d o s e f i t a n R M S d e v i a t i o n o f 0 . 0 0 7 1 6 a n d f o r t h e l o w a n d h i g h d o s e f i t s v a l u e s o f 0 . 0 0 9 0 7 a n d 0 . 0 0 3 3 4 r e s p e c t i v e l y . T h e s e v a l u e s d o n o t d i f f e r g r e a t l y f r o m e a c h o t h e r a n d a r e c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a n t h e v a l u e s f o r t h e a s y n c h r o n o u s f i t s . 9 5 T A B L E V S T A T I S T I C A L S I G N I F I C A N C E O F T H E D I F F E R E N C E S B E T W E E N T H E L O W D O S E A N D H I G H D O S E V A L U E S O F a A N D 3 S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y A D R U G B L O C K F u l l L o w H i g h P r p a i r p u n p ' p s r P W D o s e D o s e D o s e M e a n M e a n M e a n H y d r o x y u r e a G 1 / S P h a s e C e l l s (7 E x p t s ) a ( x 1 C f 1 G y " 1 ) 2 . 168 2.131 2 .157 > 0.5 > 0.5 0 .95 3 ( x 1 0 - 2 G y " 2 ) 3 .502 3 .757 3.531 > 0.5 > 0.5 0 . 208 H y d r o x y u r e a S / G 2 P h a s e C e l l s ( 3 E x p t s ) a ( x 1 0 " 1 G y - 1 ) 2 .826 1.716 2 .969 0 . 0 0 1 6 0 . 055 0 .05 3 ( x 1 0 - 2 G y " 2 ) 2 . 238 5 .616 2 . 094 0 . 0 0 6 9 <0.001 0 .05 A p h i d i c o l i n G 1 / S P h a s e C e l l s ( 3 E x p t s ) a ( x 1 0 1 G y " 1 ) 2 . 378 2 .359 2 .367 > 0.5 > 0.5 0 .70 3 ( x 1 0 " 2 G y " 2 ) 3.071 3 .224 3.081 > 0.5 > 0.5 0 .70 9 6 0.0001 ' ' 1 1 ' 1 1 1 ' 1 1 1 ' 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 5 : M I T O T I C S E L E C T I O N + H Y D R O X Y U R E A G 1 / S P H A S E - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f s e v e n e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 3 0 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g , j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d t h e f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - 3D ). 9 7 0 . 8 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU G1/S Phase Full Dose LQ Fit -I I L 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 6 : M I T O T I C S E L E C T I O N + H Y D R O X Y U R E A G 1 / S P H A S E - II S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f s e v e n e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 3 0 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d t h e f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + BD. DOSE (Gray) F I G U R E 27 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + H U G 1 / S P H A S E - I T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 2 5 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - c t D - 8 D Z ) . Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU G1/S Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit 0.0 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 8 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + H U G 1 / S P H A S E - II T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 2 5 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n (---• ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + P D . 1 0 0 0.1 -< > 0.01 r > Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU S/G2 Phase Full Dose LQ Fit o.ooi 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 2 9 : M I T O T I C S E L E C T I O N + H Y D R O X Y U R E A S / G 2 P H A S E - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t h r e e e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 2 t o 3 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g w h e n t h e y w e r e i n l a t e S / e a r l y G 2 p h a s e . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - 3 D 2 ) 1 0 1 0.8 0.7 0.6 0.5 CO I 0.4 0.3 -0.2 -0.1 0.0 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU S/G2 Phase Full Dose LQ Fit _ i • 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 3 0 : M I T O T I C S E L E C T I O N + H Y D R O X Y U R E A S / G 2 P H A S E - II S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t h r e e e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 2 t o 3 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g w h e n t h e y w e r e i n l a t e S / e a r l y G 2 p h a s e . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + BD 1 0 2 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU S/G2 Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit 0.O0O1 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 31 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + H U S / G 2 P H A S E - I T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 2 9 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a n d p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - SD ). 1 0 3 0.8 0.7 0.6 h Q 0.5 CO 0.4 0.1 0.0 - i r - - i 1 r - - i 1 I Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + HU S/G2 Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit • • !_ 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 32 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + H U S / G 2 P H A S E - II T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 2 9 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a n d p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + SD . 104 • i r- - i 1 r 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 3 3 : M I T O T I C S E L E C T I O N + A P H I D I C O L I N G 1 / S P H A S E - I S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t h r e e e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 u g / m l a p h i d i c o l i n . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 3 0 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d t h e f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - SD ). 105 0.8 0.7 0.6 Q 0.5 0.4 0.3 -0.2 0.1 -0.0 Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + APH G1/S Phase Full Dose LQ Fit 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 3 4 : M I T O T I C S E L E C T I O N + A P H I D I C O L I N G 1 / S P H A S E - II S u r v i v a l d a t a o b t a i n e d f r o m t h e a v e r a g e o f t h r e e e x p e r i m e n t s o f c e l l p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 u g / m l a p h i d i c o l i n . P o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 3 0 m i n u t e s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n f i g u r e 8. D a t a a n d t h e f u l l d o s e ( 0 t o 12 G y ) L Q f i t a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + (3D. 1 0 6 I 1 • | 1 1 1 1 i i 1 1 1 t 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 3 5 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + A P H G 1 / S P H A S E - I T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 3 3 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 to 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a n d p l o t t e d i n t h e f o r m S = e x p ( - a D - 3D ). 1 0 7 0.8 - i 1 r-0.7 h ).2 0.1 r-Synchronous V79-WNRE Cells Mitotic Selection + APH G1/S Phase Low Dose LQ Fit High Dose LQ Fit 0.0 - i • • 8 12 DOSE (Gray) 16 F I G U R E 3 6 : S E P A R A T E F I T S M I T O T I C S E L E C T I O N + A P H G 1 / S P H A S E - II T h e s a m e d a t a s h o w n i n f i g u r e 3 3 h a v e b e e n f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e l o w d o s e ( 0 t o 3.2 G y ) r e g i o n ( ) o r t h e h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y ) r e g i o n ( ). D a t a a n d s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e L Q f i t s a n d p l o t t e d i n t h e f o r m - I n S / D = a + (3D. 1 0 8 4. DISCUSSION 4.1 DEGREE OF SYNCHRONY I n o r d e r f o r r e s u l t s f r o m e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g s y n c h r o n i z e d c e l l s t o b e m e a n i n g f u l , b o t h t h e q u a l i t y ( i e . h o m o g e n e i t y a t a p a r t i c u l a r p o i n t i n t h e c e l l c y c l e ) a n d t h e p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e o f t h e p o p u l a t i o n m u s t b e p r e c i s e l y d e t e r m i n e d . S e c t i o n 3.1 o u l i n e s r e s u l t s o n t h e q u a l i t y o f s y n c h r o n y o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e o r f o l l o w e d b y a 12 h o u r e x p o s u r e t o h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n . T e c h n i q u e s e m p l o y e d t o d e t e r m i n e t h e q u a l i t y a n d p o s i t i o n o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s i n c l u d e e v a l u a t i o n o f t h e m i t o t i c i n d e x , m e a s u r m e n t o f t h e r e s p o n s e o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n t o a s i n g l e d o s e o f r a d i a t i o n a s a f u n c t i o n o f p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e ( i e . t h e " a g e r e s p o n s e " ) a n d t h e e x a m i n a t i o n o f F A C S a n a l y z e d h i s t o g r a m s o f D N A d i s t r i b u t i o n o v e r t h e c e l l c y c l e . 4.1.1 Populat ions S y n c h r o n i z e d Bv Mitotic Selection Alone I t h a s b e e n r e c o g n i z e d b y o t h e r s ( M i t c h i s o n 1 9 7 1 , G r d i n a e t a l 1 9 8 4 , N i a s a n d F o x 1 9 7 1 ) t h a t p e r h a p s t h e m e t h o d o f c h o i c e f o r o b t a i n i n g a s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n i n G1 i s m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e . I m p r o v e m e n t s o n t h e o r i g i n a l t e c h n i q u e o f T e r a s i m a a n d T o l m a c h ( 1 9 6 3 , 1 9 6 5 ) b y K l e v e c z ( 1 9 7 2 , 1 9 7 5 ) h a v e r e s u l t e d i n t h e a b i l i t y t o o b t a i n l a r g e n u m b e r s o f m i t o t i c o r e a r l y p o s t - m i t o t i c c e l l s o f v e r y h i g h q u a l i t y . S u c h c a p a b i l i t i e s a r e e s s e n t i a l i n o r d e r t o p e r f o r m r a d i a t i o n s u r v i v a l e x p e r m e n t s t h a t r e q u i r e a l a r g e y i e l d ( 3 x 1 0 7 ) o f c e l l s o f h i g h l y u n i f o r m a g e s p e c i f i c i t y . 1 0 9 P o p u l a t i o n s o b t a i n e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e w e r e d e t e r m i n e d t o b e w e l l s y n c h r o n i z e d i n i t i a l l y a s s h o w n b y i n d i c e s o f s y n c h r o n y f o r t h e i n i t i a l p o p u l a t i o n o f b e t w e e n 96 . 2 % a n d 97 .7 % . A l t h o u g h t h e n u m b e r o f c e l l s v i s i b l y i n m i t o s i s i s r e l a t i v e l y s m a l l ( 8 .6 t o 4 1 . 3 % ) , t h e o v e r a l l p o p u l a t i o n i s w e l l s y n c h r o n i z e d i n c l u d i n g c e l l s f r o m e a r l y m e t a p h a s e t o l a t e t e l o p h a s e / e a r l y G1 w i t h i n a " w i n d o w " o f t i m e n o l o n g e r t h a n t h e l e n g t h o f m i t o s i s ( a b o u t 3 0 m i n u t e , G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . W i t h i n a s h o r t t i m e t h e p o p u l a t i o n h a s m o v e d b e y o n d m i t o s i s a n d i n t o G 1 . T h e u n i f o r m i t y o f t h e p o p u l a t i o n i n G1 i s o b s e r v e d i n t w o w a y s . T h e a g e r e s p o n s e o v e r t h e c e l l c y c l e i n d i c a t e s t h a t d u r i n g t h e f i r s t 2 h o u r s a f t e r s y n c h r o n i z a t i o n b y m i t o t i c s e l e c t i o n t h e p o p u l a t i o n m a i n t a i n e d a u n i f o r m r a d i a t i o n r e s p o n s e . I t i s d u r i n g t h i s t i m e ( p r i o r t o 2 h o u r s ) t h a t t h e G1 i r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d . T h e s l i g h t d e c r e a s e i n s u r v i v a l a t T = 1 a n d 2 h o u r s f r o m t h e v a l u e a t T = 0 m a y h a v e b e e n a n a r t e f a c t a r i s i n g f r o m a n i m p r e c i s e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n t r o l p l a t i n g e f f i c i e n c y a t t h e T = 0 p o i n t . T h e p l a t i n g e f f i c i e n c i e s ( u n c o r r e c t e d f o r t h e z e r o d o s e p l a t i n g e f f i c i e n c y ) f o r t h e T = 0 , 1, a n d 2 h o u r p o i n t s a r e i n r e a l i t y e q u i v a l e n t . T h e u n i f o r m i t y o f t h e G1 p o p u l a t i o n ( w i t h i n t h e s y n c h r o n y " w i n d o w " ) m a y a l s o b e o b s e r v e d b y t h e n a r r o w w i d t h o f t h e G1 p e a k i n t h e T=0 h i s t o g r a m o f t h e D N A d i s t r i b u t i o n . A n a l y s i s o f t h e h i s t o g r a m s r e v e a l e d t h a t a p p r o x i m a t e l y 9 2 . 8 8 % o f t h e c e l l s w e r e c o n t a i n e d b e n e a t h t h e G1 p e a k , a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3 .1 .3 , a n d t h a t t h e d i s t r i b u t i o n h a d a c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n ( C V ) o f 4 . 3 3 % i n d i c a t i n g a r e l a t i v e l y n a r r o w d i s t r i b u t i o n o f D N A c o n t e n t f o r t h e p o p u l a t i o n . F u r t h e r e v i d e n c e f o r t h e q u a l i t y o f t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n m a y b e f o u n d b y a n a l y s i s o f t h e c e l l c y c l e v a r i a t i o n i n r a d i a t o n r e s p o n s e . F i g u r e 5 i n d i c a t e s a d i f f e r e n c e o f j u s t u n d e r o n e f u l l l o g o f s u r v i v a l b e t w e e n t h e m o s t s e n s i t i v e ( G 1 ) a n d r e s i s t a n t ( l a t e S ) p o i n t s i n t h e c e l l 110 c y c l e w h e n i r r a d i a t e d a t 8 G y . T h i s l a r g e d i f f e r e n c e c o m p a r e s f a v o r a b l y w i t h r e s u l t s o f S i n c l a i r a n d M o r t o n ( 1 9 6 5 ) f o r V 7 9 c e l l s i n d i c a t i n g a s i m i l a r d i f f e r e n c e i n r e s p o n s e b e t w e e n t h e m o s t s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t p o i n t s . T h e q u a l i t y o f s y n c h r o n y a p p e a r s t o d e c r e a s e a s t h e p o p u l a t i o n m o v e s t h r o u g h S a n d i n t o G 2 a n d t h e n G1 a s i n d i c a t e d b y a n i n c r e a s e i n s u r v i v a l b e t w e e n 10 a n d 12 h o u r s f o r t h e s e n s i t i v e p o r t i o n o f t h e r e s p o n s e c o m p a r e d t o t h e i n i t i a l s e n s i t i v e r e g i o n a t 0 t o 2 h o u r s . T h e p o p u l a t i o n i s m o s t h i g h l y s y n c h r o n i z e d , t h e n , d u r i n g t h e i n i t i a l h o u r s a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n . T h e r e s p o n s e a t T=6 t o 7 h o u r s , p r e s u m a b l y a t l a t e S p h a s e , i s e q u i v a l e n t i n r e s i s t a n c e t o s i m i l a r p o p u l a t i o n s r e l e a s e d f r o m h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n , i n d i c a t i n g t h a t t h e s y n c h r o n y h a s n o t y e t d e c a y e d t o o m u c h b y t h a t t i m e . A n a l y s i s o f t h e h i s t o g r a m s o f D N A c o n t e n t s u g g e s t a h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y , e s p e c i a l l y f o r t h e i n i t i a l p o p u l a t i o n . A t T = 0 , 1 o r 2 h o u r s t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s p r e s e n t i n G 1 / S / G 2 + M ( a n d t h e c o r r e s p o n d i n g C V ) a s d e t e r m i n e d b y c o m p u t e r a n a l y s i s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 3.1.3 w a s 9 2 . 8 8 / 6 . 6 7 / 0 . 4 6 ( 0 . 0 4 3 3 ) , 9 3 . 33/6 . 16/0 . 51 ( 0 . 0 4 6 5 ) a n d 8 7 . 5 2 / 1 1 . 7 7 / 0 . 7 1 ( 0 . 0 8 9 7 ) . A n i n c r e a s e i n t h e t a i l o f t h e h i s t o g r a m , b e g i n n i n g a t T=2 h o u r s i n d i c a t e s t h e p r o g r e s s i o n o f s o m e o f t h e c e l l s t h r o u g h G1 a n d i n t o S p h a s e . T h e s e f i g u r e s , a l t h o u g h o n l y a p p r o x i m a t e , g i v e n t h e l i m i t a t i o n s o f s u c h a n a n a l y s i s , i n d i c a t e a h i g h d e g r e e o f i n i t i a l s y n c h r o n y e s p e c i a l l y d u r i n g t h e f i r s t 2 h o u r s w h e n t h e G1 i r r a d i a t i o n s w o u l d h a v e o c c u r e d . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e s e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f r o m p o p u l a t i o n s i n i t i a l l y c u l t u r e d i n g l a s s r o l l e r b o t t l e s w h i c h e x h i b i t e d m a n y l a r g e c l u m p s o f c e l l s o n t h e g r o w t h s u r f a c e w h i c h w e r e s u s p e c t e d o f c o n t r i b u t i n g n o n - m i t o t i c c o n t a m i n a n t s . I m p r o v e m e n t s i n t h e g r o w t h c o n d i t i o n s a n d a s w i t c h t o p l a s t i c b o t t l e s r e s u l t e d i n t h e e l i m a t i o n o f t h e c l u m p i n g , b u t p o p u l a t i o n s I l l o b t a i n e d f r o m t h e s e b o t t l e s s h o w e d n o o b v i o u s d i f f e r e n c e i n t h e i r r a d i a t i o n r e s p o n s e s c o m p a r e d t o t h o s e f r o m t h e g l a s s b o t t l e s . 4 .1 .2 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v A D r u g B l o c k In a n e f f o r t t o s h a r p e n t h e s o m e w h a t w i d e r t h a n d e s i r a b l e " w i n d o w " o f c e l l s o b t a i n e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e , p o p u l a t i o n s w e r e r e s y n c h r o n i z e d a t t h e G 1 / S b o r d e r b y e x p o s u r e t o h y d r o x y u r e a o r a p h i d i c o l i n , w h i c h a c t b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s t o i n h i b i t t h e s y n t h e s i s o f D N A . T h i s c o m b i n a t i o n o f t e c h n i q u e s h a s b e e n u s e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s e s p e c i a l l y t o o b t a i n h i g h l y s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s i n G 1 / S , S a n d G 2 p h a s e ( F o x e t a l 1 9 8 7 ) . T h e q u a l i t y o f t h e r e s u l t i n g p o p u l a t i o n s w a s v e r y h i g h , a s i n d i c a t e d b y t h e a g e r e s p o n s e o v e r t h e c e l l c y c l e ( f i g u r e 5 ) , a n d b y t h e F A C S a n a l y z e d h i s t o g r a m s o f D N A d i s t r i b u t i o n , ( f i g u r e 6 ) . T h e p o p u l a t i o n s r e s y n c h r o n i z e d b y 1 m M h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n e x h i b i t v e r y s i m i l a r r e s p o n s e s t o a s i n g l e d o s e (8 G y ) o f r a d i a t i o n w i t h b o t h d i s p l a y i n g j u s t u n d e r o n e f u l l l o g s u r v i v a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m o s t s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t p o i n t s . T h e r e s p o n s e s a r e v e r y s i m i l a r a l s o t o t h a t o b t a i n e d f o r m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e s h o w i n g t h e s a m e l e v e l s o f s u r v i v a l a t t h e p o i n t s o f g r e a t e s t a n d l e a s t r e s i s t a n c e , b u t s h i f t e d b y a f e w h o u r s i n t h e p o s i t i o n o f t h e p e a k s . T h e a g e r e s p o n s e q u a l i t a t i v e l y i n d i c a t e s t h a t t h e p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 m M h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n a r e w e l l s y n c h r o n i z e d . T h e s e r e s u l t s a r e v e r y s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d b y H a l l f o r a s y n c h r o n o u s C h i n e s e h a m s t e r c e l l s s y n c h r o n i z e d b y a 6 h o u r t r e a t m e n t w i t h 1.24 m M h y d r o x y u r e a a n d i r r a d i a t e d a t 8 G y f o l l o w i n g r e l e a s e f r o m t h e d r u g . B o t h r e s u l t s i n d i c a t e j u s t u n d e r o n e f u l l l o g s u r v i v a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m o s t s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t p o i n t s . A s 1 1 2 w e l l , b o t h e x h i b i t a s u r v i v a l a t t h e T = 0 p o i n t , j u s t f o l l o w i n g r e l e a s e f r o m t h e d r u g a t t h e G 1 / S b o r d e r , t h a t i s h i g h e r t h a n t h e m o s t s e n s i t i v e p o i n t i n t h e r e s p o n s e ( H a l l 1 9 7 2 , L e g r y s and H a l l 1 9 6 9 ) . T h e h i s t o g r a m s o f D N A c o n t e n t o v e r t h e c e l l c y c l e a l s o i n d i c a t e t h a t t h e s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s a r e h i g h l y u n i f o r m i n t h e i r a g e s p e c i f i c i t y w h e n i n i t i a l l y r e l e a s e d f r o m t h e d r u g b l o c k , b u t s h o w b r o a d e n i n g o f t h e d i s t r i b u t i o n w i h i n a s h o r t t i m e a s i n d i c a t e d b y t h e C V ' s f o r t h e a n a l y z e d h i s t o g r a m s . T h e p e r c e n t a g e o f c e l l s r e p r e s e n t e d b y t h e p r o m i n e n t p e a k a t t i m e T = 0 , 1, 2 , 3 h o u r s ( a n d t h e c o r r e s p o n d i n g C V ) f o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 mM h y d r o x y u r e a w a s 9 5 . 3 6 % ( 6 . 6 1 ) , 8 6 . 8 8 % ( 6 . 7 2 ) , 9 6 . 4 3 % ( 8 . 6 1 ) a n d 9 8 . 2 7 % ( 7 . 8 9 ) . F o r p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 u g / m l a p h i d i c o l i n t h e r e s u l t s w e r e 9 3 . 4 7 % ( 5 . 8 7 ) , 9 3 . 2 2 % ( 6 . 6 1 ) , 9 6 . 3 7 % ( 7 . 7 2 ) a n d 9 8 . 9 1 % ( 8 . 8 8 ) . T h e i n c r e a s i n g v a l u e o f t h e p e r c e n t a g e n u m b e r o f c e l l s b e n e a t h t h e p r o m i n e n t p e a k w o u l d i n c o r r e c t l y a p p e a r t o i n d i c a t e a p o p u l a t i o n t h a t h a s b e c o m e m o r e u n i f o r m l y d i s t r i b u t e d a s i t p a s s e d t h r o u g h S p h a s e . T h e g e n e r a l i n c r e a s e i n t h e C V w o u l d i n d i c a t e , h o w e v e r , t h a t t h e p o p u l a t i o n h a s e x p e r i e n c e d a b r o a d e n i n g o f t h e d i s t r i b u t i o n o f c e l l s c o n t a i n i n g b e t w e e n 2 n a n d 4 n n u m b e r o f c h r o n o s o m e s . T h e i n c r e a s e i n p e r c e n t a g e u n d e r t h e p e a k m a y a l s o r e s u l t f r o m i n c l u s i o n o f t h o s e n o n - v i a b l e c e l l s i n S p h a s e k i l l e d b y t h e d r u g p r e - t r e a t m e n t . I r r a d i a t i o n s w e r e p e r f o r m e d 3 0 m i n u t e s ( n o t i n c l u d i n g a 3 0 t o 3 5 m i n u t e n o n - c y c l i n g c e l l h a n d l i n g t i m e ) a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g b l o c k . T h e p o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d a t t h e i r m o s t h i g h l y s y n c h r o n i z e d p o i n t a s e v i d e n c e d b y t h e l o w v a l u e o f t h e C V f o r T = 0 a n d 1 h o u r s . 1 1 3 4.2 A s y n c h r o n o u s E x p e r i m e n t s T h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s t o 2 5 0 k V p X - r a y s s t r o n g l y s u g g e s t s t h e p r e s c e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e l o w d o s e r e g i o n t h a t c a n b e r e s o l v e d b y s e p a r a t e l y f i t t i n g t h e l o w d o s e (0 t o 3.2 G y f o r s e r i e s 1, o r 0 t o 2 G y f o r s e r i e s 2 e x p e r i m e n t s ) a n d h i g h d o s e (3 .2 t o 12 G y f o r s e r i e s 1, o r 2 t o 12 G y f o r s e r i e s 2 e x p e r i m e n t s ) d a t a t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c ( L Q ) m o d e l . F i g u r e s 10 a n d 14 s h o w t h e s u b s t r u c t u r e i n t h e f o r m o f a " k i n k " i n t h e s u r v i v a l c u r v e a t b e t w e e n 2 a n d 3.2 G y . A n e v e n c l e a r e r p i c t u r e i s s e e n w h e n r e p l o t t i n g t h e s a m e d a t a i n t h e l i n e a r f o r m o f t h e L Q e q u a t i o n - I n S / D v s . D a s s e e n i n f i g u r e s 11 a n d 15. A p a r t f r o m b e i n g a b l e t o r e s o l v e t h e s u b s t r u c t u r e i n a v i s u a l m a n n e r , i t h a s a l s o b e e n r e s o l v e d i n a s t a t i s t i c a l m a n n e r . A n a l y s i s o f t h e L Q p a r a m e t e r s a a n d 0 f o r t h e s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e f i t s i n d i c a t e s t h a t d i f f e r e n c e s i n t h e l o w a n d h i g h d o s e d i s t r i b u t i o n s o f a o r 0 a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t t h e P=0.001 t o P=0 .067 l e v e l f o r t h e i n i t i a l s e r i e s a n d a t t h e P=0.001 t o 0.11 l e v e l f o r t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s , ( s e e t a b l e I I I ) . T h e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s r e s u l t i s t h a t t h e r e i s a h i g h d e g r e e o f c o n f i d e n c e t h a t t h e l o w a n d h i g h d o s e v a l u e s o f a o r 0 r e p r e s e n t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t d i s t r i b u t i o n s a n d t h a t t h e y a r e n o t s u b s e t s o f t h e s a m e , l a r g e r d i s t r i b u t i o n o f a o r 0 v a l u e s . A s w e l l , a g o o d n e s s o f f i t t e s t o n t h e v a r i o u s L Q f i t s t o t h e d a t a i n d i c a t e s t h a t t h e d a t a a r e b e t t e r c h a r a c t e r i z e d b y s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e f i t s t h a n b y a s i n g l e f u l l d o s e f i t . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f f i g u r e s 11 a n d 15 m a y i n d i c a t e t h a t t h e d a t a i s b e s t c h a r a c t e r i z e d n o t b y t w o , b u t b y t h r e e s e p a r a t e f i t s t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e d o s e r a n g e s 0 t o 2 G y , 2 t o 4 G y a n d 4 t o 12 G y . 114 F i g u r e 37 s h o w s t h e s e r i e s 1 a s y n c h r o n o u s d a t a f i t t e d s e p a r a t e l y t o t h e L Q e q u a t i o n o v e r t h e s e d o s e r a n g e s . A 2 t o 12 G y f i t i s a l s o s h o w n t o i n d i c a t e t h a t a t w o - c o m p o n e n t f i t f r o m 0 t o 2 G y a n d 2 t o 12 G y p r o v i d e s p o o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e d a t a , p a r t i c u l a r l y i n t h e 2 t o 4 G y r a n g e , a s s h o w n b y a n R M S d e v i a t i o n o f 0 . 0 2 8 1 . T h e t h r e e - c o m p o n e n t f i t p r o v i d e s t h e b e s t f i t t o t h e d a t a , a s a n y m u l t i - c o m p o n e n t f i t s h o u l d a s t h e n u m b e r o f c o m p o n e n t s i s i n c r e a s e d , w i t h a n R M S d e v i a t i o n o f 0 . 0 2 5 9 . T h i s i s s m a l l e r t h a n t h e R M S d e v i a t i o n f o r t h e t w o - c o m p o n e n t ( 0 t o 3 G y , 3 t o 12 G y ) f i t o f 0 . 0 2 7 0 o r t h e f u l l d o s e f i t ( 0 t o 12 G y ) o f 0 . 0 3 4 6 . T h e b e t t e r f i t p r o v i d e d b y t h e t h r e e - c o m p o n e n t a n a l y s i s m a y i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f m o r e t h a n 2 s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h i n t h e a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n , o r i t m a y s i m p l y b e s h o w i n g h o w , i n g e n e r a l , a n y f i t t o d a t a c a n b e i m p r o v e d b y d e c r e a s i n g t h e n u m b e r o f p o i n t s f i t t e d p e r c u r v e ( t h e b e s t f i t , o f c o u r s e , b e i n g p r o v i d e d b y a f i t t o 2 d a t a p o i n t s ) . T h e a p p e a r a n c e o f t h e m i d - d o s e c o m p o n e n t i s l i k e l y t h e r e s u l t o f a m i x e d p o p u l a t i o n o f c e l l s t h a t i s i n f l u e n c e d m a i n l y b y t w o d o m i n a n t s u b p o p u l a t i o n s : a s e n s i t i v e s u b p o p u l a t i o n , w h i c h w o u l d p r i m a r i l y i n f l u e n c e t h e l o w d o s e ( 0 t o 2 G y ) r e g i o n o f t h e r e s p o n s e , a n d a r e s i s t a n t s u b p o p u l a t i o n w h i c h w o u l d p r i m a r i l y i n f l u e n c e t h e h i g h d o s e (> 4 G y ) r e g i o n o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e . T h e m i d - d o s e r e g i o n (2 t o 4 G y ) m a y t h e n b e r e f l e c t i n g c o n t r i b u t i o n s f r o m b o t h s u b p o p u l a t i o n s r a t h e r t h a n f r o m a t h i r d s u b p o p u l a t i o n o f i n t e r m e d i a t e s e n s i t i v i t y . P e r h a p s t h e i n f l u e n c e o f a G1 s u b p o p u l a t i o n t h a t i s b e s t c h a r a c t e r i z e d b y t h e t h r e e c o m p o n e n t S H + M T m o d e l ( s e c t i o n 4 .3 .3 .2 ) c o u l d r e s u l t i n t h e a p p e a r a n c e o f t h r e e - c o m p o n e n t s u b s t r u c t u r e a t l o w d o s e . T h e e x a c t n a t u r e o f t h i s t h r e e - c o m p o n e n t s u b s t r u c t u r e i s l e f t t o c o n j e c t u r e . D i s c u s s i o n i n t h i s t h e s i s , h o w e v e r , w i l l b e l i m i t e d t o a t w o - c o m p o n e n t a n a l y s i s o f t h e d a t a . 115 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Asynchronous V79-WNRE Cells Series 1 Results Low Dose LQ Fit ( 0 -2 Gy) Mid Dose LQ Fit ( 2 - 4 Gy) High Dose LQ Fit (4 -12 Gy) High Dose LQ Fit (2 -12 Gy) 0.0 4 8 12 DOSE (Gray) 16 F I G U R E 37 : T H R E E C O M P O N E N T F I T - S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A T h e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 8 f o r t h e i n i t i a l s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s a r e s h o w n h e r e f i t t e d o v e r t h e d o s e r a n g e 0 t o 2 G y , ( ), 2 t o 4 G y ( — ), 4 t o 12 G y ( ) a n d 2 t o 12 G y (• ) t o t h e L Q m o d e l a n d p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D = a + BD . 116 4.3 P O S S I B L E C A U S E S O F T H E S U B S T R U C T U R E T h r e e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e a p p a r e n t s u b s t r u c t u r e i n t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E m a y b e o f f e r e d : 1) . T h e a p p a r e n t s u b s t r u c t u r e m a y b e a n e x p e r i m e n t a l a r t e f a c t . 2 ) . T h e l i n e a r - q u a d r a t i c m o d e l m a y n o t b e a p p r o p r i a t e f o r c h a r a c t e r i z i n g t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e o f V 7 9 - W N R E c e l l s , a n d t h e L Q m o d e l m a y , i n f a c t , h a v e a r t i f i c i a l l y c r e a t e d t h e a p p e a r a n c e o f s u b s t r u c t u r e . 3 ) . T h e s u b s t r u c t u r e m a y b e t h e r e s u l t o f d i f f e r e n t i a l k i l l i n g o f s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h d i f f e r e n t r a d i o s e n s i t i v i t i e s . A n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g c u l t u r e c o n t a i n s p o p u l a t i o n s o f c e l l s d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e c e l l c y c l e w h i c h , a s s e e n i n f i g u r e 5, e x h i b i t a n e x t e n s i v e v a r i a t i o n i n r a d i o s e n s i t i v i t y . A n a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e i s , i n r e a l i t y , a c o m p o s i t e o f t h e r e s p o n s e s o f t h e s e s u b p o p u l a t i o n s . T h e e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e a n d t h e s u b s e q u e n t r e s u l t s m a y h a v e b e e n o f h i g h e n o u g h p r e c i s i o n t o a c c u r a t e l y r e s o l v e t h e e f f e c t s o f t h e s u b p o p u l a t i o n s o n t h e a s y n c h r o n o u s s u r v i v a l . 117 4.3.1 H y p o t h e s i s 1 I f t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e w e r e s i m p l y a n a r t e f a c t o f t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e u s e d t o o b t a i n o r a n a l y z e t h e r e s u l t s t h e n w e w o u l d e x p e c t s o m e o b v i o u s ( o r n o t s o o b v i o u s ) d i f f e r e n c e s t o b e p r e s e n t i n p r o c e d u r e s u s e d f o r t h e l o w a n d h i g h d o s e d a t a . T h e f a c t t h a t t h e s u b s t r u c t u r e c a n b e d e s c r i b e d i n t e r m s o f t h e p a r a m e t e r s a a n d 3 i n a n e x p e r i m e n t a l l y c o n s i s t e n t m a n n e r f o r i n d i v i d u a l r e s u l t s ( i e . t h e s t r u c t u r e i s p r e s e n t a n d c a n b e d e s c r i b e d i n t e r m s o f t h e L Q p a r a m e t e r s f r o m e x p e r i m e n t t o e x p e r i m e n t ) a n d i n a s t a t i s t i c a l l y r e p r o d u c i b l e m a n n e r f o r t h e o v e r a l l r e s u l t s , w o u l d s u g g e s t t h a t a n y e x p e r i m e n t a l a r t e f a c t w o u l d h a v e t o b e s y s t e m a t i c i n n a t u r e ( i e . r e p e a t e d f r o m e x p e r i m e n t t o e x p e r i m e n t ) . V a r i a t i o n s i n t h e s u r v i v a l a s s a y b e t w e e n t h e l o w a n d h i g h d o s e s a m p l e s c o u l d p r o d u c e t h e o b s e r v e d r e s u l t s . H o w e v e r , t h e c e l l s o r t i n g a s s a y w a s u s e d t h r o u g h o u t t h e e n t i r e d o s e r a n g e a n d g r e a t c a r e w a s t a k e n t o e n s u r e i d e n t i c a l t r e a t m e n t f o r a l l o f t h e e x p e r i m e n t a l s a m p l e s . O n e o b v i o u s d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e p r o c e d u r e s w o u l d r e l a t e t o t h e d o s e i n c r e m e n t s u s e d t o o b t a i n t h e r e s p e c t i v e s a m p l e s . F o r s a m p l e s u p t o 4 G y , d o s e i n c r e m e n t s o f 0.5 G y , f o r t h e i n i t i a l s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s , o r o f 0.4 G y , f o r a l l o t h e r e x p e r i m e n t s , w e r e u s e d . B e t w e e n 4 G y a n d 8 G y , i n c r e m e n t s o f 1 G y w e r e u s e d , w i t h 2 G y i n c r e m e n t s u s e d t h e r e a f t e r t o o b t a i n t h e 10 G y a n d 12 G y s a m p l e s . T h u s o n e s h o u l d c o n s i d e r t h e p o s s i b i l i t y o f s o m e d o s e - f r a c t i o n a t i o n e f f e c t w h i c h w o u l d t e n d t o p r o d u c e m o r e c e l l k i l l i n g a t l a r g e r d o s e s w h e r e t h e r e w o u l d b e a h i g h e r e f f e c t i v e d o s e r a t e ( i e . a l a r g e r d o s e p e r f r a c t i o n ) . S u c h a n e f f e c t , w h i c h w o u l d r e s u l t i n a d e c r e a s e i n s u r v i v a l a t l a r g e r d o s e s , w o u l d a c t u a l l y d i l u t e t h e a p p e a r a n c e o f s u b s t r u c t u r e a t l o w d o s e , r a t h e r t h a n c r e a t i n g i t s a p p e a r a n c e . H o w e v e r , t h e o v e r a l l i r r a d i a t i o n t i m e d i d n o t e x c e e d 15 118 m i n u t e s f o r a n y o f t h e e x p e r i m e n t s , m a k i n g i t u n l i k e l y t h a t f r a c t i o n a t i o n e f f e c t s w o u l d b e s i g n i f i c a n t i n s u c h a n o v e r a l l t i m e . S o m e d i f f e r e n c e s a l s o d i d e x i s t i n r e l a t i o n t o t h e n u m b e r s o f c e l l s p l a t e d i n t o e a c h p e t r i d i s h f o r t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e s a m p l e s . T y p i c a l l y , f o r a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s , u n d e r 2 5 0 0 c e l l s ( o r e n o u g h t o p r o d u c e 5 0 0 c o l o n i e s a f t e r 6 d a y s o f g r o w t h ) w e r e p l a t e d p e r p e t r i d i s h i n t h e d o s e r a n g e 0 t o 4 G y , b e t w e e n 4 0 0 0 a n d 2 0 0 0 0 c e l l s f o r s a m p l e s b e t w e e n 5 G y a n d 8 G y , a n d 8 0 0 0 0 c e l l s f o r t h e 10 G y a n d 12 G y s a m p l e s . T h e i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f c e l l s p l a t e d a t h i g h e r d o s e s c o u l d h a v e r e s u l t e d i n a " f e e d e r e f f e c t " t h a t m a y h a v e a c t e d t o p r o v i d e a m o r e s u i t a b l e g r o w t h e n v i r o n m e n t d u e t o m e d i u m c o n d i t i o n i n g a t i n t e r m e d i a t e l e v e l s o f p l a t i n g , o r a l e s s s u i t a b l e g r o w t h e n v i r o n m e n t d u e t o n u t r i e n t d e p l e t i o n a t v e r y h i g h l e v e l s o f p l a t i n g . S t u d i e s o n V 7 9 - W N R E c e l l s d e s i g n e d t o d e t e c t i f t h e c e l l s w e r e s e n s i t i v e t o a f e e d e r e f f e c t ( r e s u l t s n o t s h o w n ) s h o w e d n o c o n s i s t e n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n f e e d e r a n d n o n - f e e d e r t r e a t e d s a m p l e s . I t t h u s s e e m s u n l i k e l y t h a t t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e c o u l d b e a t t r i b u t e d t o e x p e r i m e n t a l a r t e f a c t . 4.3.2 Hypothesis 2 T h e r e s u l t s o f s u r v i v a l s t u d i e s o n a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s i n d i c a t e s u b s t r u c t u r e i n t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e s u r v i v a l i n t h e f o r m o f a ' k i n k ' i n t h e s u r v i v a l d a t a a t a b o u t 3 G y , a s r e v e a l e d b y t h e s e r i e s 1 a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s , o r a t a b o u t 2 G y , a s r e v e a l e d b y t h e s e r i e s 2 a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s . T h e ' k i n k ' i s a p p a r e n t b y d i r e c t v i s u a l i n s p e c t i o n o f t h e d a t a p r e s e n t e d i n t h e f o r m o f s u r v i v i n g f r a c t i o n v s . d o s e . I n a n a t t e m p t t o c h a r a c t e r i z e t h e r e s u l t s o f a s y n c h r o n o u s c e l l s , t h e d a t a w e r e f i r s t f i t t o t h e L Q m o d e l o v e r t h e e n t i r e e x p e r i m e n t a l d o s e r a n g e ( 0 t o 119 12 G y ) b u t t h e f i t w a s d e e m e d u n s u i t a b l e i n d e s c r i b i n g t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e a s i n d i c a t e d b y t h e o b v i o u s v i s u a l a n d l a r g e n u m e r i c a l d e v i a t i o n o f t h e f i t f r o m t h e d a t a . I n s t e a d o f a b a n d o n i n g t h e L Q m o d e l , h o w e v e r , i t w a s a p p l i e d a g a i n s e p a r a t e l y t o t h e d a t a o n e i t h e r s i d e o f t h e o b s e r v e d ' k i n k ' , f r o m 0 t o 2 o r 3 G y a n d f r o m 2 o r 3 G y t o 12 G y . T h e s e p a r a t e f i t s t o t h e l o w a n d h i g h d o s e r e g i o n o f t h e d a t a d i s p l a y e d a n i m p r o v e m e n t i n b o t h t h e v i s u a l a n d n u m e r i c a l d e v i a t i o n o f t h e f i t f r o m t h e d a t a , e s p e c i a l l y f o r t h e l o w d o s e d a t a w h i c h a r e o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t . T h e i m p r o v e m e n t i s v i s u a l l y m o r e o b v i o u s w h e n t h e d a t a a r e r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s D w i t h s e p a r a t e L Q f i t s t o e q u a t i o n 8 a s e v i d e n c e d b y a c l e a r d e p a r t u r e o f t h e l o w d o s e d a t a f r o m t h e h i g h d o s e f i t s . T h e p o s s i b i l i t y d o e s r e m a i n , h o w e v e r , t h a t t h e L Q m o d e l m a y s i m p l y b e i n a d e q u a t e i n d e s c r i b i n g p r e c i s e l y t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s . T h e a p p r o p r i a t e n e s s o f t h e L Q f i t s m a y b e c o m p a r e d w i t h t h o s e p r o v i d e d b y o t h e r s u r v i v a l c u r v e m o d e l s ( A l p e r 1 9 8 0 , C h a p m a n 1 9 8 0 ) . T h e m u l t i - t a r g e t m o d e l S = 1 - ( 1 - e " D / D o ) n ( 5 ) h a s a n i n i t i a l s l o p e o f z e r o w h i c h w o u l d c l e a r l y n o t p r o v i d e a n a d e q u a t e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e d a t a . T h e t h r e e p a r a m e t e r , t w o c o m p o n e n t m u l t i -t a r g e t p l u s s i n g l e h i t m o d e l S = e " 0 ^ [ 1 - ( 1 - e " D / D o ) n ] ( 7 ) a c c o m m o d a t e s a n o n z e r o s l o p e a t z e r o d o s e b y t h e i n t r o d u c t i o n o f a o n e - h i t t e r m . T h e r e i s , h o w e v e r , u s u a l l y n o t e n o u g h i n f o r m a t i o n i n m o s t e x p e r i m e n t s t o d e f i n e w i t h a n y p r e c i s i o n a l l t h r e e p a r a m e t e r s o f t h e 1 2 0 e q u a t i o n (D-|, D Q , n ) , r e s u l t i n g i n t h e n e e d t o s p e c i f y o n e o f t h e p a r a m e t e r s i n o r d e r t o r e d u c e t h e n u m b e r o f i n d e p e n d a n t p a r a m e t e r s t o t w o . B o t h e x p r e s s i o n s a p p r o x i m a t e t o a n e x p o n e n t i a l e q u a t i o n o f t h e f o r m S = n e " k D ( 2 1 ) a t h i g h d o s e . T h e R e p a i r - M i s R e p a i r ( R M R ) m o d e l ( T o b i a s e t a l 1 9 8 0 , 1 9 8 5 ) S = e - 6 D ( 1 + 5 D / e f ( 1 1 ) i n i t s t w o p a r a m e t e r f o r m m a y a l s o b e c o n s i d e r e d . T h e d a t a f r o m b o t h s e r i e s o f e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s w e r e f i t t e d t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c ( e q u a t i o n 8 ) , s i n g l e h i t m u l t i t a r g e t ( e q u a t i o n 7 ) a n d t h e r e p a i r - m i s r e p a i r ( e q u a t i o n 11 ) m o d e l s i n o r d e r t o e x a m i n e t h e i r a p p r o p r i a t e n e s s t o t h e d a t a . R e s u l t s f r o m t h e f i t s , s h o w n i n t a b l e V I , i n c l u d e t h e b e s t f i t p a r a m e t e r s f o r e a c h m o d e l a s w e l l a s t h e R M S d e v i a t i o n s o f t h e f i t t e d f u n c t i o n f r o m t h e d a t a p o i n t s . T h e i n a d e q u a c y o f t h e R M R a n d S H + M T m o d e l s i n f i t t i n g t h e d a t a i s e v i d e n t i n f i g u r e s 3 8 a n d 3 9 w h e r e t h e y c a n b e s e e n t o c o n s i s t e n t l y u n d e r e s t i m a t e t h e a m o u n t o f c e l l i n a c t i v a t i o n a t l o w d o s e . T h e v a l u e s o f t h e R M S d e v i a t i o n o f t h e f i t t e d p o i n t s f r o m t h e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e w h o l e d a t a s e t i s b e s t c h a r a c t e r i z e d b y ( i n o r d e r f r o m b e s t t o w o r s t ) : c o m p o s i t e L Q , f u l l d o s e L Q , R M R a n d S H + M T . ( T h e c o m p o s i t e L Q i s t h a t c u r v e w h i c h w o u l d r e s u l t i f t h e l o w d o s e d a t a w e r e f i t t e d w i t h t h e l o w d o s e a a n d P p a r a m e t e r s a n d t h e h i g h d o s e d a t a b y t h e h i g h d o s e p a r a m e t e r s . ) T h e c o n t i n u o u s l y b e n d i n g n a t u r e o f t h e s u r v i v a l c u r v e o b s e r v e d f o r u p t o t h e f o u r d e c a d e s o f t h e r e s p o n s e i s b e t t e r a c c o m o d a t e d b y t h e L Q e x p r e s s i o n t h a n b y e i t h e r o f t h e R M R o r S H + M T m o d e l s i n d i c a t i n g t h a t a t l e a s t t h e m o s t r e s i s t a n t s u b p o p u l a t i o n m a y b e b e s t d e s c r i b e d b y t h e L Q m o d e l a f t e r t h e f i r s t d e c a d e o f c e l l k i l l . I t m a y b e , h o w e v e r , t h a t o t h e r s u b p o p u l a t i o n s m i g h t b e b e t t e r d e s c r i b e d b y m o d e l s o t h e r t h a n t h e L Q m o d e l , a s w o u l d a p p e a r t o b e t h e c a s e f o r G l p h a s e c e l l s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e ( s e e s e c t i o n 4 . 3 . 3 ) . I t w o u l d a p p e a r u n l i k e l y t h a t a n y s i n g l e m o d e l c o u l d e x p l a i n t h e s u b s t r u c t u r e o b s e r v e d i n t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g V 7 9 - W N R E c e l l s . T h e b e s t d e s c r i p t i o n i s f o u n d b y f i t t i n g t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e d a t a s e p a r a t e l y t o t h e L Q e x p r e s s i o n . 122 T A B L E VI S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S S E R I E S 1 R E S U L T S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n S = e x p ( - c t D - B D 2 ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) a = 0 . 2 447 Gy~l B = 0 . 0 2 6 0 7 G y 2 0 . 0 3 4 6 L o w D o s e F i t ( 0 - 3 G y ) a = 0 . 1 8 9 6 Gy"",I B = 0 . 0 4 4 4 7 G y " 2 0 . 0 0 9 5 2 H i g h D o s e F i t ( 3 - 1 2 G y ) a = 0 . 2 4 9 4 G y " , ! 0 = 0 . 0 2 5 5 9 G y " 2 0.0331 T w o - C o m p o n e n t C o m p o s i t e F i t 0 . 0 2 7 0 T h r e e - C o m p o n e n t C o m p o s i t e F i t 0 . 0 2 5 9 S = e C - D / V o - [1 - e ( " D / D 0 ) ] n > F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) D-! = 4 . 3 8 6 G y D Q = 2 . 320 G y n = 4 . 6 3 0 . 119 S = e ( _ 6 D ) ( 1 + 6 D / e ) 6 F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 6 = 0 . 8 7 0 7 G y " 1 e = 2 . 2 9 1 6 0 . 108 123 T A B L E V I I S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S A S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S S E R I E S 2 R E S U L T S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n s = e x p ( - c t D - Q D 2 ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) a = 3 = 0 .2491 G y I 0 .02251 G y " 2 0 . 0 5 4 4 L o w D o s e F i t ( 0 - 2 G y ) a = 3 = 0 . 2 3 5 0 Gy'l 0 . 0 4 1 7 5 G y " 2 0 .00471 H i g h D o s e F i t ( 2 - 1 2 G y ) a = 3 = 0 . 2 4 8 2 G y " 1 0 . 0 2 2 6 0 G y " 2 0 . 0 6 2 2 T w o - C o m p o n e n t C o m p o s i t e F i t 0 . 0 5 2 4 s ( - D / D o ) ] n } F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) II II II oc 1 1 .65 G y 2.01 G y 2 . 934 0 . 178 s = e ( " 6 D ) ( 1 + 6 D / e ) e F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 6 = € = 0 . 7 3 6 9 G y " 1 1.4179 0 . 1 5 5 DOSE (Gray) F I G U R E 38 : MODEL F I T S T O S E R I E S 1 A S Y N C H R O N O U S D A T A T h e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 8 f o r t h e i n i t i a l s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s a r e s h o w n h e r e f i t t e d o v e r t h e f u l l d o s e (0 t o 12 G y ) r e g i o n t o t h e t w o - p a r a m e t e r RMR e q u a t i o n ( ) a n d t o t h e t h r e e - p a r a m e t e r SH+MT e q u a t i o n ( ). 125 0.0001 ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ' 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 39 : MODEL F I T S T O S E R I E S 2 A S Y N C H R O N O U S D A T A T h e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 14 f o r t h e s e c o n d s e r i e s o f a s y n c h r o n o u s e x p e r i m e n t s a r e s h o w n h e r e f i t t e d o v e r t h e f u l l d o s e (0 t o 12 G y ) r e g i o n t o t h e t w o - p a r a m e t e r RMR e q u a t i o n ( ) a n d t o t h e t h r e e -p a r a m e t e r SH+MT e q u a t i o n (• -)• 4.3.3 H y p o t h e s i s 3 1 2 6 In o r d e r t o t e s t h y p o t h e s i s 3, t h a t t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e w a s d u e t o d i f f e r e n t i a l k i l l i n g o f s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h d i f f e r e n t r a d i o s e n s i t i v i t i e s , s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t o n m o r e h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n s o f s y n c h r o n i z e d c e l l s . A n a t t e m p t c o u l d h a v e b e e n m a d e t o r e p r o d u c e t h e s u b s t r u c t u r e b y m e a s u r i n g t h e s u r v i v a l r e s p o n s e a t s e v e r a l s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e a n d t h e n s y n t h e s i z i n g f r o m t h o s e r e s p o n s e s t h e e x p e c t e d a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e , a s h a s b e e n d o n e b y G i l l e s p i e e t a l u s i n g t h e r e s p o n s e o f s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n s o f V 7 9 - 3 7 9 A c e l l s ( G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , t h e i r r e s u l t s i n d i c a t e d l a r g e d e v i a t i o n s b e t w e e n t h e s y n t h e s i z e d c u r v e a n d t h e a c t u a l a s y n c h r o n o u s d a t a . I t i s p e r h a p s u n r e a l i s t i c t o e x p e c t t o b e a b l e t o e x a c t l y r e p r o d u c e t h e s u b s t r u c t u r e o b s e r v e d i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e t h r o u g h s u c h a n a n a l y s i s . A m o r e d i r e c t t e s t o f t h e h y p o t h e s i s w o u l d b e t o d e t e r m i n e i f t h e s u b s t r u c t u r e i s a b s e n t i n t h e r a d i a t i o n r e p o n s e o f s y n c h r o n i z e d c e l l s . I f t h e r e s p o n s e o f a t i g h t l y s y n c h r o n i z e d p o p u l a t i o n a t s o m e p h a s e o f t h e c e l l c y c l e f a i l e d t o e x h i b i t t h e s a m e k i n d o f s u b s t r u c t u r e t h e n t h e h y p o t h e s i s w o u l d b e s u p p o r t e d . T h e a b s e n c e o f s u b s t r u c t u r e c o u l d b e i n d i c a t e d b y t h e a b i l i t y o f t h e d a t a t o b e c h a r a c t e r i z e d a d e q u a t e l y b y a s i n g l e L Q e x p r e s s i o n , a n d h e n c e a p p e a r t o f i t a s i n g l e s t r a i g h t l i n e w h e n p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s D. I t c o u l d a l s o b e i n d i c a t e d b y t h e a b i l i t y o f t h e d a t a t o b e c h a r a c t e r i z e d a d e q u a t e l y b y a n y o t h e r s i n g l e m o d e l o f c e l l i n a c t i v a t i o n , s u c h a s t h o s e d i s c u s s e d i n s e c t i o n 4 . 3 . 2 , i n w h i c h c a s e t h e d a t a m a y n o t a p p e a r t o f i t a s i n g l e s t r a i g h t l i n e w h e n p l o t t e d i n t h e f o r m -l n ( S ) / D v s D s i n c e t h i s t y p e o f p l o t t e s t s t h e d a t a o n l y i n t e r m s o f t h e L Q e q u a t i o n . 1 2 7 4.3.3.1 M i t o t i c S e l e c t i o n F o l l o w e d B v A D r u g B l o c k E x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y a 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 mM h y d r o x y u r e a a n d i r r a d i a t e d a f t e r 3 0 m i n u t e s o f f r e e c y c l i n g t i m e f r o m r e l e a s e o f t h e d r u g , j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r . T h e r e s u l t s , s h o w n i n f i g u r e s 27 a n d 2 8 , s h o w a c l e a r a b s e n c e o f t h e s u b s t r u c t u r e t h a t w a s p r e s e n t i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e . T h i s i s i n d i c a t e d b y t h e a b i l i t y o f a s i n g l e L Q e x p r e s s i o n t o a d e q u a t e l y c h a r a c t e r i z e t h e r e s p o n s e a s i s m o s t e v i d e n t i n f i g u r e 2 6 . I t i s a l s o a p p a r e n t f r o m s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e a a n d 3 v a l u e s f o r t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t a l f i t s t h a t t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e p a r a m e t e r v a l u e s a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( P>0 .5 ) . T h e s e r e s u l t s , t h e n , a r e i n c l e a r s u p p o r t o f h y p o t h e s i s 3. A l m o s t i d e n t i c a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f o r c e l l s t r e a t e d s i m i l a r i l y t o t h e s a m p l e s d e s c r i b e d a b o v e e x c e p t t h a t m i t o t i c s e l e c t i o n w a s f o l l o w e d b y a 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 u g / m l a p h i d i c o l i n i n s t e a d o f h y d r o x y u r e a . F i g u r e s 3 3 a n d 3 4 f o r s u c h p o p u l a t i o n s a g a i n s h o w a c l e a r a b s e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n d i c a t e d b y t h e a b i l i t y o f a s i n g l e L Q e x p r e s s i o n t o a d e q u a t e l y c h a r a c t e r i z e t h e r e s p o n s e . A s w e l l , a s i m i l a r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s r e v e a l e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l o w d o s e a n d h i g h d o s e v a l u e s o f t h e L Q p a r a m e t e r s a o r 3 ( P >0 . 5 ) . T h e s e r e s u l t s a l s o s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e s u b s t r u c t u r e i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e i s d u e t o s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h d i f f e r e n t c e l l - c y c l e d e p e n d e n t r a d i o s e n s i t i v i t i e s . R e s u l t s f r o m p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 mM h y d r o x y u r e a a n d i r r a d i a t e d a f t e r 2 t o 3 h o u r s f r e e c y c l i n g t i m e u p o n r e l e a s e f r o m t h e d r u g , a s s h o w n i n f i g u r e s 31 a n d 3 2 , i n d i c a t e t h e p r e s c e n c e o f s u b s t r u c t u r e . T h e d a t a m a y b e f i t t e d t o t h e R M R a n d S H + M T 1 2 8 e q u a t i o n s , a s s h o w n i n f i g u r e 4 0 , b u t a n e v e n p o o r e r f i t t o t h e d a t a i s o b t a i n e d a s i n d i c a t e d b y R M S d e v i a t i o n s o f 0 . 0 6 4 3 f o r t h e R M R f i t , 0 . 0 9 3 3 f o r t h e S H + M T f i t , 0 . 0 6 0 7 f o r t h e g l o b a l L Q f i t , a n d 0 . 0 3 2 8 f o r t h e c o m p o s i t e L Q f i t . T h e p r e s e n c e o f t h e s u b s t r u c t u r e i s s o m e w h a t p u z z l i n g . A s n o t e d e a r l i e r , h o w e v e r , t h e p o p u l a t i o n s i r r a d i a t e d f o l l o w i n g 2 t o 3 h o u r s o f f r e e c y c l i n g t i m e a f t e r r e l e a s e f r o m h y d r o x y u r e a m a y h a v e b e e n p a r t i a l l y c o m p o s e d o f c e l l s t h a t h a d r u s h e d t h r o u g h S a n d i n t o G 2 p h a s e , a s e v i d e n c e d b y t h e o b v i o u s d r o p i n r a d i a t i o n r e s p o n s e b e t w e e n 1 1/2 t o 2 h o u r s i n f i g u r e 5 a n d b y a n i n c r e a s e i n t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n o f t h e D N A h i s t o g r a m s f o r t h e T = 2 a n d 3 h o u r d i s t r i b u t i o n s . T h e s u b s t r u c t u r e m a y b e r e f l e c t i n g t h e p r e s e n c e o f a s e n s i t i v e G 2 p o p u l a t i o n m i x e d i n w i t h t h e d o m i n a n t S p h a s e p o p u l a t i o n . 129 T A B L E V I I I S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y H Y D R O X Y U R E A G 1 / S P H A S E C E L L S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n s = e x p ( - c t D - 0 D ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) a = 3 = 0 . 2 1 8 6 Gy~l 0 . 0 3 4 7 3 G y - 2 0 . 0 3 9 6 L o w D o s e F i t ( 0 - 3 . 2 G y ) ii it 0 . 2 1 2 6 Gy~l 0 . 0 3 7 4 4 G y - 2 0 . 0 0 6 4 9 H i g h D o s e F i t ( 3 . 2 - 1 2 G y ) a -3 = 0 . 2 1 8 2 G y - ] 0 . 0 3 4 7 6 G y - 2 0 . 0 5 2 3 C o m p o s i t e F i t 0 . 0 3 9 4 s = et-WJV - [1 - e ( - D / D o ) ] n } F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) n o c o n v e r g e n c e i n t h e p a r a m e t e r s s = e ( _ 6 D ) ( 1 + 6 D / 6 ) 6 F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 6 = € = 1.1953 G y 1 5 . 2225 0 . 136 130 T A B L E IX S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y H Y D R O X Y U R E A S / G 2 P H A S E C E L L S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n s = e x p ( - o c D - S D ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) a -3 = 0 . 2 8 0 0 G y " 1 0 . 0 2 2 4 9 G y " 2 0 . 0607 L o w D o s e F i t ( 0 - 3 . 2 G y ) a -3 = 0 . 1 7 2 9 G y " 1 0 . 0 5 4 8 0 G y " 2 0 . 0 1 8 5 H i g h D o s e F i t ( 3 . 2 - 1 2 G y ) a -3 = 0 . 2 9 4 2 G y " 1 0 . 0 2 1 0 6 G y " 2 0.0401 C o m p o s i t e F i t 0 . 0 2 8 5 s = e ^ V o - [1 - e ( - D / D o ) ] n } F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) D1 = D2 = n = 16 .077 G y 1.805 G y 2 . 934 0 . 0 9 3 3 s = e ( " 5 D ) ( 1 + 6 D / e ) e F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 6 = e = 0 . 7 5 8 2 G y " 1 1.2841 0 . 0 6 4 4 131 T A B L E X S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N F O L L O W E D B Y A P H I D I C O L I N G 1 / S P H A S E C E L L S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n s = e x p ( - a D - 3 D 2 ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) II II 0 . 2 3 8 5 G y " 1 0 . 0 3 0 4 8 G y 2 0 . 0 1 5 8 L o w D o s e F i t ( 0 - 3 . 2 G y ) Ot = 3 = 0 .2351 G y " 1 0 . 0 3 2 3 7 G y " 2 0 . 0 1 4 5 H i g h D o s e F i t ( 3 . 2 - 1 2 G y ) a -3 = 0 . 2 377 G y " 1 0 . 0 3 0 5 6 G y " 2 0 . 0 1 5 6 C o m p o s i t e F i t 0 . 0 1 5 5 s = BI-MJV - [1 - e ( - D / D o ) ] n } F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) n o c o n v e r g a n c e i n t h e p a r a m e t e r s s = e ( ~ 6 D ) ( 1 + 6 D / e ) e F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 6 = 6 = 1.0115 G y " 1 3 . 2764 0 . 1 2 3 1 3 2 0.0001 1 ' ' ' 1 ' ' ' 1 • « « 1 ' ' 1 1 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 4 0 : M O D E L F I T S T O M I T O T I C S E L E C T I O N + H U S / G 2 P H A S E D A T A T h e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 2 9 , f o r t h e a v e r a g e r e s p o n s e o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 12 h o u r e x p o s u r e t o 1 m M h y d r o x y u r e a a n d i r r a d i a t e d 2 t o 3 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g , a r e s h o w n h e r e f i t t e d t o t h e t w o - p a r a m e t e r R M R ( ) a n d t h r e e -p a r a m e t e r S H + M T (- ) m o d e l s o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e ( 0 t o 12 G y ) . 133 4.3 .3 .2 M i t o t i c S e l e c t i o n A l o n e P o p u l a t i o n s i r r a d i a t e d 3 0 t o 9 0 m i n u t e s o f f r e e c y c l i n g t i m e a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e ( j g G1 p h a s e c e l l s ) a p p e a r t o i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e l o w d o s e r e g i o n o f t h e r e s p o n s e a s i n d i c a t e d b y t h e s e p a r a t e L Q f i t s i n f i g u r e s 2 0 a n d 2 1 . B e f o r e a c c e p t i n g t h i s c o n c l u s i o n i t i s i m p o r t a n t t o a n a l y z e t h e d a t a i n t e r m s o f o t h e r m o d e l s o f c e l l i n a c t i v a t i o n . T h e s a m e d a t a f i t t e d t o t h e r e p a i r - m i s r e p a i r a n d t h e t w o c o m p o n e n t , t h r e e p a r a m e t e r s i n g l e h i t m u l t i - t a r g e t m o d e l s s h o w a s u b s t a n t i a l l y b e t t e r f i t t h a n t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c e q u a t i o n a s s h o w n i n f i g u r e 4 1 . T a b l e XI l i s t s t h e R M S d e v i a t i o n s a n d p a r a m e t e r v a l u e s o f t h e f u n c t i o n s f i t t e d t o t h e d a t a . S i m p l e o b s e r v a t i o n o f t h e G1 p h a s e d a t a c l e a r l y i n d i c a t e s a t e r m i n a l e x p o n e n t i a l r e g i o n b e y o n d a b o u t 4 G y . T h e d a t a , i n c l u d i n g t h e t e r m i n a l e x p o n e n t i a l , a r e f i t v e r y w e l l b y a s i n g l e S H + M T e q u a t i o n o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e o f t h e d a t a a s i n d i c a t e d b y a v e r y l o w R M S d e v i a t i o n o f 0 . 0 294 . T h e R M R m o d e l f i t s t h e d a t a w e l l w i t h a n R M S d e v i a t i o n o f 0 . 0 3 6 3 , b u t d o e s n o t a c c o m o d a t e t h e t e r m i n a l e x p o n e n t i a l q u i t e a s w e l l a s t h e S H + M T e q u a t i o n . T h e g l o b a l L Q e q u a t i o n p r o v i d e s t h e p o o r e s t f i t w i t h a n R M S d e v i a t i o n o f 0 . 157 . T h e s u b s t r u c t u r e t h a t i s a p p a r e n t i n f i g u r e s 2 0 a n d 21 i s t h u s m o s t l i k e l y a n a r t e f a c t o f i m p o s i n g t h e L Q e x p r e s s i o n t o d a t a t h a t a r e b e s t d e s c r i b e d b y a n o t h e r m o d e l , i n t h i s c a s e t h e t w o c o m p o n e n t S H + M T . T h i s i s a n e x a m p l e o f a h y p o t h e s i s 2 ( s e c t i o n 4 . 3 ) t y p e o f e x p l a n a t i o n t o d e s c r i b e t h e p r e s e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n a r e s p o n s e j g . t h a t t h e L Q m o d e l h a s , i n f a c t , a r t i f i c i a l l y c r e a t e d t h e a p p e a r a n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e r e s p o n s e o f G1 p h a s e c e l l s . I f o n e t r i e s t o r e c o n c i l e t h e s u b s t r u c t u r e i n t h e G1 r e s p o n s e ( f i g u r e s 20 a n d 2 1 ) u s i n g t h e s a m e a p p r o a c h t a k e n t o r e c o n c i l e t h e s u b s t r u c t u r e i n 1 3 4 t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e , t h e n t h e t h r e e h y p o t h e s e s ( s e c t i o n 4 .3 ) m u s t b e c o n s i d e r e d . H y p o t h e s i s 1 ( t h e a r t e f a c t e x p l a n a t i o n ) m a y b e e l i m i n a t e d a s a p o s s i b i l i t y b a s e d o n t h e a r g u e m e n t s i n s e c t i o n 4 . 3 . 1 . H y p o t h e s i s 3 ( t h e s u b p o p u l a t i o n e x p l a n a t i o n ) a p p l i e s o n l y i f i t i s s u s p e c t e d t h a t t h e G1 p o p u l a t i o n w a s n o t o f u n i f o r m a g e . S e c t i o n s 3.1 a n d 4.1 i n d i c a t e a h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y i n t h e p o p u l a t i o n s , a l t h o u g h a s m a l l d e g r e e o f c o n t a m i n a t i o n b y n o n - m i t o t i c c e l l s a t h a r v e s t w a s a l w a y s a s s u m e d . T h e p o s s i b i l i t y d o e s e x i s t t h a t t h e c o n t a m i n a n t s u b p o p u l a t i o n , i f i t w e r e m o r e r a d i o r e s i s t a n t t h a n t h e G1 p o p u l a t i o n , c o u l d h a v e i n c r e a s e d t h e o v e r a l l s u r v i v a l o f t h e p o p u l a t i o n . T h i s w o u l d b e p a r t i c u l a r l y n o t i c e a b l e a t h i g h e r d o s e w h e n m o s t o f t h e s e n s i t i v e G1 c e l l s w o u l d b e k i l l e d . I f t h e r e s p o n s e o f a p u r e l y h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f G1 c e l l s d i d , i n r e a l i t y , f o l l o w a s i n g l e c o n t i n u o u s l y b e n d i n g L Q f u n c t i o n , o n e c o u l d p o s s i b l y i m a g i n e h o w a s m a l l r e s i s t a n t s u b p o p u l a t i o n c o u l d s t r a i g h t e n o u t t h e t a i l o f t h e r e s p o n s e s o t h a t i t a p p e a r e d t o f o l l o w a n e x p o n e n t i a l a t h i g h d o s e . T h i s d o e s n o t , h o w e v e r , a p p e a r t o b e a p l a u s i b l e e x p l a n a t i o n g i v e n t h e u n i f o r m a g e o f t h e G1 p o p u l a t i o n . I t m u s t a l s o b e m e n t i o n e d t h a t t h e G1 p o p u l a t i o n w a s c o m p r i s e d o f c e l l s w i t h i n a 30 m i n u t e w i n d o w o f t i m e , a p p r o x i m a t e l y , i n t h e c e l l c y c l e , a s e x p l a i n e d i n s e c t i o n s 3.1.1 a n d 4 . 1 . 1 . I t i s u n l i k e l y t h a t w i t h i n t h i s a g e d i s t r i b u t i o n t h a t s u b p o p u l a t i o n s a t s l i g h t l y d i f f e r e n t t i m e s i n G1 c o u l d h a v e p r o d u c e d t h e o b s e r v e d s u b s t r u c t u r e ; t h e a g e r e s p o n s e o f t h e c e l l s ( f i g u r e 5 ) s h o w s v e r y l i t t l e v a r i a t i o n i n r a d i o s e n s i t i v i t y w i t h i n t h e 1 t o 2 h o u r p e r i o d a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n d u r i n g w h i c h t i m e i r r a d i a t i o n s o c c u r e d . T h e r e m a i n i n g h y p o t h e s i s , t h a t t h e s u b s t r u c t u r e i s a n a r t e f a c t o f a n i m p r o p e r l y a p p l i e d L Q f i t , h a s b e e n s h o w n t o h a v e s o m e v a l i d i t y i n f i g u r e 41 w h e r e t h e d a t a a r e s h o w n t o b e w e l l c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e S H + M T o r R M R f i t . T h i s d o e s l e a v e a p u z z l i n g r e s u l t , h o w e v e r , i n t h a t i t a p p e a r s a s t h o u g h t h e f u n d a m e n t a l s h a p e o f t h e s u r v i v a l c u r v e h a s c h a n g e d a s t h e p o p u l a t i o n o f c e l l s t r a v e r s e d t h e c e l l c y c l e f r o m G 1 , w h e r e t h e r e s p o n s e m a y b e d e s c r i b e d b y a S H + M T o r R M R m o d e l f i t , t o G 1 / S p h a s e , w h e r e t h e r e s p o n s e i s d e s c r i b e d b y a L Q m o d e l f i t . T h e r e s u l t s a r e c o m p l i c a t e d f u r t h e r i f t h i s i s i n t e r p r e t e d a s a c h a n g e i n t h e m e c h a n i s m s o f c e l l l e t h a l i t y t h a t u n d e r l y t h e d i f f e r e n t m o d e l s d e p e n d i n g o n t h e p o s i t i o n o f t h e p o p u l a t i o n i n t h e c e l l c y c l e . S u c h a n i n t e r p r e t a t i o n w o u l d c o n t r a d i c t o t h e r s t u d i e s a n d w o u l d , a t t h e v e r y l e a s t , r e q u i r e f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n ( G i l l e s p i e 1 9 7 5 ) . 136 T A B L E XI S U R V I V A L M O D E L F I T P A R A M E T E R S S Y N C H R O N O U S C E L L E X P E R I M E N T S M I T O T I C S E L E C T I O N A L O N E G1 P H A S E C E L L S E q u a t i o n P a r a m e t e r s R M S D e v i a t i o n S - e x p ( - a D - 3 D 2 ) F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) ti ii 0 . 4 5 1 4 G y " J 0 . 0 2 1 6 8 G y 2 0 . 157 L o w D o s e F i t ( 0 - 3 . 2 G y ) a = B = 0 . 2 0 4 3 G y ' l 0 . 09231 G y 2 0 . 0217 H i g h D o s e F i t ( 3 . 2 - 1 2 G y ) n II 0 . 4 8 9 6 G y - 1 0 . 0 1 7 8 6 G y - 2 0 . 115 C o m p o s i t e F i t 0 . 0 7 6 6 s = e C - D A V ^ - [1 -e ( - D / D o ) 3 n } F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) D1 = D o = n = 5 .882 G y 1.636 G y 2 .886 0 . 0 2 9 4 s = e ( - 6 D ) ( 1 + 6 D / e ) € F u l l D o s e F i t ( 0 - 1 2 G y ) 5 = e -0 . 8 7 2 3 G y " 1 0 . 7 9 6 5 0 . 0 3 6 3 137 — 1 r 0.0001 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 4 8 12 16 DOSE (Gray) F I G U R E 41 : MODEL F I T S T O M ITOT IC S E L E C T I O N G1 P H A S E D A T A T h e s u r v i v a l d a t a s h o w n i n f i g u r e 18, f o r t h e a v e r a g e d r e s p o n s e o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y mi to t i c s e l e c t i o n a l one a n d i r r a d i a t e d i n G1 p h a s e , a r e s h o w n h e r e f i t t e d t o t h e t w o - p a r a m e t e r RMR ( -) a n d t h r e e -p a r a m e t e r SH+MT ( ) mode l s o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e (0 t o 12 G y ) . 1 3 8 E x p e r i m e n t s c o n d u c t e d o n S p h a s e c e l l s i r r a d i a t e d 6 h o u r s o f f r e e c y c l i n g t i m e a f t e r m i t o t i c s e l e c t i o n a r e s u g g e s t i v e t h a t t h e s u b s t r u c t u r e m a y n o t b e p r e s e n t i n s u c h a p o p u l a t i o n . A l t h o u g h , s i n c e o n l y t w o e x p e r i m e n t s w e r e a v e r a g e d t o o b t a i n t h e r e s u l t s s e e n i n f i g u r e s 2 3 a n d 2 4 n o c o n f i d e n t s t a t e m e n t c a n b e m a d e r e g a r d i n g t h e s u b s t r u c t u r e . T h e r e s u l t s d o a p p e a r t o i n d i c a t e a s l i g h t l y r e v e r s e d s h a p e t o t h e s u b s t r u c t u r e t h a n p r e v i o u s l y o b s e r v e d f o r o t h e r c e l l p o p u l a t i o n s a s s h o w n b y a l a r g e r v a l u e o f a i n t h e - l n ( S ) / D v s D p l o t f o r t h e l o w d o s e f i t c o m p a r e d t o t h e a f o r t h e h i g h d o s e f i t . T h e r e a s o n f o r s u c h a r e v e r s a l i n t h e s u b s t r u c t u r e a p p e a r a n c e m a y s i m p l y b e t h a t t h e d a t a c o l l e c t e d f r o m t h e t w o e x p e r i m e n t s i s n o t p r e c i s e e n o u g h t o i n d i c a t e t h e t r u e n a t u r e o f t h e s u r v i v a l r e s p o n s e . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e r e v e r s e n a t u r e o f t h e s u b s t r u c t u r e m a y b e t h e r e s u l t o f f o r c i n g t h e L Q e q u a t i o n o n t o d a t a t h a t i s a c t u a l l y b e s t r e p r e s e n t e d b y a n L Q f i t i n t h e l o w t o m i d d o s e s a n d t h e n b y a n e x p o n e n t i a l t h e r e a f t e r . T h e d a t a u p t o 8 G y a p p e a r s t o b e b e s t f i t t e d b y a s i n g l e L Q e x p r e s s i o n . T h e d i v e r g e n c e o f t h e 10 G y a n d 12 G y p o i n t s c o u l d b e i n d i c a t i v e o f t h e b e g i n n i n g o f a t e r m i n a l e x p o n e n t i a l r e g i o n i n t h e s u r v i v a l c u r v e a t h i g h d o s e . S u c h a s i t u a t i o n i s d e s c r i b e d b y A l p e r w h e r e s h e p r o d u c e s a - l n ( S ) / D v s D p l o t f o r a h y p o t h e t i c a l p o p u l a t i o n d e s c r i b e d a t l o w d o s e b y t h e L Q e q u a t i o n a n d t e r m i n a t i n g w i t h a n e x p o n e n t i a l a t h i g h d o s e , a s s e e n i n f i g u r e 42 (Alper 1 9 7 9 ) . A l p e r r a i s e s t h i s d i s c u s s i o n i n o r d e r t o i l l u s t r a t e t h e d i f f i c u l t y i n e x a m i n g t h e v a l i d i t y o f t h e L Q e x p r e s s i o n o v e r t h e f u l l d o s e r a n g e o f t h e d a t a u s i n g t h e - l n ( S ) / D v s D p l o t . S h e m a k e s t h e p o i n t t h a t w h e n d a t a o f t h i s t y p e a r e p l o t t e d i n t h e f o r m - l n ( S ) / D v s D t h e c u r v e A B C D E w o u l d r e s u l t w i t h a n i n f l e c t i o n a t B ( s e e f i g u r e 4 2 ) . S h e t h e n s t a t e s t h a t " t h e a c c u r a c y w i t h w h i c h t h e f r a c t i o n a l s u r v i v a l c a n b e d e t e r m i n e d i s u n l i k e l y t o a l l o w t h a t c u r v e t o b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e s t r a i g h t l i n e A B D , a n d t h i s m e t h o d o f p l o t t i n g m i g h t t h e r e f o r e g i v e t h e i m p r e s s i o n t h a t t h e L Q e x p r e s s i o n w a s a g o o d d e s c r i p t i o n o v e r a d o s e r a n g e a l m o s t t w i c e a s g r e a t a s w a s a c t u a l l y t h e c a s e " ( A l p e r 1 9 7 9 ) . A l p e r s t a t e s t h i s i n s u p p o r t o f h e r i d e a t h a t t h e L Q m o d e l i s s i m p l y a l o w d o s e a p p r o x i m a t i o n t o s h o u l d e r e d s u r v i v a l c u r v e s ( A l p e r 1 9 8 0 ) . F u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n o v e r a n e x t e n d e d d o s e r a n g e w o u l d h a v e t o b e p e r f o r m e d i n o r d e r t o v e r i f y t h i s p o s s i b i l i t y . T h e c o n t i n u o u s l y b e n d i n g n a t u r e o f t h e h i g h d o s e r e g i o n o f t h e a s y n c h r o n o u s s u r v i v a l c u r v e , h o w e v e r , w o u l d a p p e a r t o i n d i c a t e t h a t a t l e a s t t h e m o s t r a d i o r e s i s t a n t s u b p o p u l a t i o n ( i e . l a t e S p h a s e ) o f t h e a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n w o u l d f o l l o w t h e L Q e x p r e s s i o n . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s l i g h t l y r e v e r s e d n a t u r e o f t h e s u b s t r u c t u r e m a y b e d u e t o e x p e r i m e n t a l i m p r e c i s i o n t h a t c o u l d o n l y b e r e s o l v e d b y i n c r e a s i n g t h e n u m b e r o f l i k e e x p e r i m e n t s c o n s i d e r e d . 1 4 0 4 6 Units of dose F I G U R E 42 : S H O U L D E R E D S U R V I V A L P L O T WITH A T E R M I N A L E X P O N E N T I A L A h y p o t h e t i c a l - I n S /D v s D p l o t o f d a t a t h a t may b e wel l d e s c r i b e d b y t h e L Q e q u a t i o n a t low d o s e , b u t b y a n e x p o n e n t i a l a t h i g h e r d o s e s ( t he c u r v e ABODE ) . A c c o r d i n g t o A l p e r , d e p a r t u r e o f t h e d a t a f r o m t h e L Q e q u a t i o n InS = - a D - BD ( ) u s e d t o d e s c r i b e t h e i n i t i a l r e g i o n o f a s h o u l d e r e d s u r v i v a l c u r v e may b e d i f f i c u l t t o d e t e c t i n t h e r e g i o n BCD g i v e n t h e u s u a l l im i ta t i on o f e x p e r i m e n t a l u n c e r t a i n t y . 141 5. CONCLUSION T h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g p o p u l a t i o n s o f t h e c e l l l i n e V 7 9 - W N R E i n d i c a t e s u b s t r u c t u r e i n t h e l o w d o s e r e g i o n t h a t c a n b e b e s t c h a r a c t e r i z e d b y s e p a r a t e l y f i t t i n g t h e d a t a w i t h i n t h e l o w a n d h i g h d o s e r e g i o n s t o t h e l i n e a r - q u a d r a t i c o e q u a t i o n , S = exp(-ctD-(3D ). T h e s t r u c t u r e h a s b e e n r e s o l v e d v i s u a l l y b y p l o t t i n g t h e d a t a i n t h e l i n e a r f o r m o f t h e LQ e q u a t i o n a s - l n ( S ) / D v s D. F u r t h e r e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f t h e s u b s t r u c t u r e h a s c o m e f r o m s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e l i n e a r - q u a d r a t i c f i t p a r a m e t e r s a a n d 3 o b t a i n e d b y s e p a r a t e l o w a n d h i g h d o s e f i t s t o t h e LQ e q u a t i o n w h i c h h a s s h o w n t h a t t h e l o w d o s e f i t v a l u e s o f a a n d 3 a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e h i g h d o s e f i t v a l u e s . T h e p r e s e n c e o f t h e s u b s t r u c t u r e i n t h e a s y n c h r o n o u s r e s p o n s e h a s b e e n s h o w n t o r e s u l t f r o m d i f f e r e n t i a l k i l l i n g o f s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s w i t h d i f f e r e n t c y c l e - d e p e n d e n t r a d i o s e n s i t i v i t i e s . I n p a r t i c u l a r , t h e s u b s t r u c t u r e a p p e a r s t o b e d u e t o t h e r a d i o s e n s i t i v e c e l l c o m p o n e n t (G1 a n d p e r h a p s G 2 ) a n d t h e d e g r e e t o w h i c h i t i s p r e s e n t i n t h e c e l l p o p u l a t i o n . T h i s w a s d e m o n s t r a t e d b y t h e l a c k o f s u b s t r u c t u r e i n t h e s u r v i v a l r e s p o n s e o f p o p u l a t i o n s t h a t w e r e d o u b l e - s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n f o l l o w e d b y 1 m M h y d r o x y u r e a o r 1 u g / m l a p h i d i c o l i n a n d i r r a d i a t e d w h i l e t i g h t l y s y n c h r o n i z e d s o o n a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g b l o c k . S u c h p o p u l a t i o n s w e r e u n i f o r m l y c o m p o s e d o f c e l l s j u s t p a s t t h e G 1 / S b o r d e r i n e a r l y S p h a s e . ^ W h e n s i m i l a r p o p u l a t i o n s w e r e i r r a d i a t e d 2 t o 3 h o u r s a f t e r r e l e a s e f r o m t h e d r u g b l o c k , a t w h i c h t i m e t h e h i g h d e g r e e o f s y n c h r o n y i n i t i a l l y p r e s e n t h a d d e c a y e d s o t h a t t h e p o p u l a t i o n w a s c o m p r i s e d o f r e s i s t a n t S p h a s e a n d s e n s i t i v e G 2 p h a s e c e l l s , t h e p r e s e n c e o f s u b s t r u c t u r e w a s a g a i n a p p a r e n t i n t h e s u r v i v a l r e s p o n s e . 1 4 2 T h e r e s p o n s e o f p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y m i t o t i c s e l e c t i o n a l o n e a n d i r r a d i a t e d i n G1 s h o w e d v e r y c l e a r e v i d e n c e o f s u b s t r u c t u r e w h e n f i t t e d w i t h t h e L Q e q u a t i o n , b u t c o u l d b e a c c u r a t e l y c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e f i t t o t h e S H + M T o r R M R e q u a t i o n s . O n c e s i m i l a r p o p u l a t i o n s h a d s u f f i c i e n t l y p r o g r e s s e d b e y o n d G1 a n d i n t o S p h a s e ( b u t n o t t o G 2 ) t o e l i m i n a t e t h e p r e s e n c e o f s e n s i t i v e c e l l s , t h e r e s p o n s e s o f s u c h p o p u l a t i o n s a p p e a r e d t o o n c e a g a i n s h o w a l a c k o f s u b s t r u c t u r e a n d a r e w e l l d e s c r i b e d b y a s i n g l e L Q e q u a t i o n . T h e r e s u l t s , a l t h o u g h s o m e w h a t p e r p l e x i n g , a p p e a r t o i n d i c a t e a f u n d a m e n t a l c h a n g e i n t h e f o r m o f t h e r a d i a t i o n r e s p o n s e o r i n t h e m a k e u p o f t h e p o p u l a t i o n a s t h e c e l l s p r o g r e s s f r o m G 1 , w h e r e t h e r e s p o n s e i s w e l l c h a r a c t e r i z e d b y a s i n g l e f i t t o t h e S H + M T o r R M R e q u a t i o n s , t o S p h a s e , w h e r e a s i n g l e f i t t o t h e L Q e q u a t i o n h a s b e e n s h o w n t o d e s c r i b e b o t h e a r l y S a n d m i d - l a t e S p h a s e p o p u l a t i o n s s y n c h r o n i z e d b y t w o d i f f e r e n t t e c h n i q u e s . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n i s r e q u i r e d t o a c c u r a t e l y d e t e r m i n e t h e n a t u r e o f t h e s e n s i t i v e G 2 p h a s e r e s p o n s e . H e n c e , t h e s u b s t r u c t u r e a t l o w d o s e i n t h e r a d i a t i o n s u r v i v a l r e s p o n s e o f a s y c h r o n o u s l y d i v i d i n g p o p u l a t i o n s o f V 7 9 - W N R E c e l l s a p p e a r s t o r e s u l t f r o m r a d i o - s e n s i t i v e s u b p o p u l a t i o n s o f c e l l s t h a t a r e n o t o n l y n a t u r a l l y p r e s e n t i n t h e a s y n c h r o n o u s p o p u l a t i o n , b u t m a y a l s o ( i n t h e c a s e o f G1 c e l l s ) b e b e t t e r d e s c r i b e d b y d i f f e r e n t e q u a t i o n s f o r c e l l i n a c t i v a t i o n t h a n t h a t u s e d t o d e s c r i b e t h e r e s p o n s e o f t h e r a d i o - r e s i s t a n t s u b p o p u l a t i o n s . 143 A P P E N D I X A - S T A T I S T I C A L M E T H O D S S t a t i s t i c a l m e t h o d s u s e d i n t h i s t h e s i s t o e x a m i n e t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f s u b s t r u c t u r e i n t h e a v e r a g e d s u r v i v a l r e s p o n s e o f a p a r t i c u l a r p o p u l a t i o n o f c e l l s i n c l u d e : 1) . S t u d e n t ' s t - t e s t , a n d 2 ) . n o n p a r a m e t r i c t e s t s . T h e s e t e s t s w e r e a p p l i e d t o t h e s e t s o f b e s t - f i t p a r a m e t e r v a l u e s a a n d 3 o f t h e l i n e a r - q u a d r a t i c ( L Q ) m o d e l , S = e x p ( -ctD - 3 D ), o b t a i n e d b y f i t t i n g t h e L Q m o d e l t o e a c h o f t h e i n d i v i d u a l r e s p o n s e s t h a t w e r e p a r t o f a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . F i t s w e r e p e r f o r m e d s e p a r a t e l y t o t h e d a t a p o i n t s i n c l u d e d w i t h i n t h e l o w d o s e r a n g e (0 t o 2, 3 o r 3.2 G y ) , h i g h d o s e r a n g e ( 2 , 3 o r 3.2 t o 12 G y ) o r f u l l d o s e r a n g e ( 0 t o 12 G y ) . T h e s e t o f p a r a m e t e r v a l u e s , a o r 3, o b t a i n e d f r o m t h e l o w d o s e f i t s w e r e t h e n c o m p a r e d t o t h e p a r a m e t e r v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h e h i g h d o s e f i t s i n o r d e r t o d i s c o v e r a n d e v a l u a t e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p a r a m e t e r v a l u e s f o r t h e s e p a r a t e f i t s . S t a t i s t i c a l m e t h o d s w e r e e m p l o y e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e l e v e l a t w h i c h d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e l o w a n d h i g h d o s e p a r a m e t e r s a m p l e s w e r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . A J Students T - T e s t S t u d e n t ' s t - t e s t m a y b e u s e d t o e v a l u a t e t h e l e v e l o f s i g n i f i c a n c e r e p r e s e n t e d b y t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t w o s a m p l e s . T h e t - t e s t m a y b e a p p l i e d i n t w o f o r m s f o r t w o s a m p l e s t h a t a r e e i t h e r p a i r e d o r i n d e p e n d a n t ( u n p a i r e d ) . I n b o t h c a s e s i t i s a s s u m e d t h a t e a c h m e m b e r o f t h e t w o s a m p l e s i s n o r m a l l y a n d i n d e p e n d a n t l y d i s t r i b u t e d . A. 1,1 P a i r e d A n a l y s i s 144 F o r t w o s a m p l e s t h a t a r e c l o s e l y r e l a t e d t o e a c h o t h e r b y a v a r i a b l e r e l e v a n t t o t h e e f f e c t b e i n g c o n s i d e r e d , a p a i r e d t - t e s t m a y b e u s e d t o i n c r e a s e t h e a c c u r a c y o f t h e c o m p a r i s o n . T h e c o n d i t i o n s f o r w h i c h a p a i r e d a n a l y s i s i s u s e d , h o w e v e r , a r e n o t a l w a y s c l e a r l y o u t l i n e d o r o b v i o u s . O n e m a y c o n s i d e r a s a m p l e c o n s i s t i n g o f i p a i r s o f n o r m a l , i n d e p e n d e n t d e v i a t e s . T h e f i r s t m e m b e r o f e a c h p a i r , X ^ , m a y r e p r e s e n t t h e r e s u l t p r o d u c e d b y a p r o c e d u r e t h a t i s d i f f e r e n t f r o m t h a t u s e d t o p r o d u c e t h e s e c o n d m e m b e r , X2-j. T h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m e m b e r s o f e a c h p a i r m a y b e d e s i g n a t e d a n d a r e a s s u m e d t o b e d i s t r i b u t e d a b o u t a m e a n MQ w h i c h r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e d i f f e r e n c e i n t h e e f f e c t s o f t h e t w o p r o c e d u r e s o v e r t h e p o p u l a t o n o f w h i c h t h e s e p a i r s a r e a r a n d o m s a m p l e . D e v i a t i o n s o f t h e d i f f e r e n c e s f r o m t h e m e a n , D-j - u p , a r e a s s u m e d t o b e n o r m a l l y a n d i n d e p e n d a n t l y d i s t r i b u t e d w i t h a p o p u l a t i o n m e a n o f z e r o . W i t h t h e s e a s s u m p t i o n s , t h e s a m p l e m e a n d i f f e r e n c e D m a y b e c o n s i d e r e d n o r m a l l y d i s t r i b u t e d a b o u t u D w i t h s t a n d a r d d e v i a t i o n o n o f t h e p o p u l a t i o n o f d i f f e r e n c e s . T h e p o p u l a t i o n s t a n d a r d d e v i a t i o n i s u s u a l l y n o t k n o w n , b u t i t m a y b e a p p r o x i m a t e d b y t h e s a m p l e s t a n d a r d d e v i a t i o n , g i v e n b y n o 1 SQ = [ I (D-j - D ) / ( n - 1 ) ] 2 i=1 T h e s t a n d a r d e r r o r 05 = oD/fr\ m a y b e a p p r o x i m a t e d b y S-Q- = SQ/IH. T h e t - s t a t i s t i c m a y t h e n b e d e f i n e d a s a n a p p r o x i m a t i o n t o t h e s t a n d a r d n o r m a l d e v i a t e a s , t = (D - U 0 ) /SD 1 4 5 T h i s q u a n t i t y f o l l o w s S t u d e n t ' s t - d i s t r i b u t i o n w i t h ( n - 1 ) d e g r e e s o f f r e e d o m , w h e r e n e q u a l s t h e n u m b e r o f p a i r s . T h e t - d i s t r i b u t i o n m a y b e u s e d t o t e s t t h e n u l l h y p o t h e s i s o r t o d e t e r m i n e c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r u n . A t e s t o f s i g n i f i c a n c e m a y b e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e c o n f i d e n c e l e v e l a t w h i c h t h e n u l l h y p o t h e s i s i s v a l i d i e . t h a t UQ = 0 , i m p l y i n g t h a t t h e m e a n d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o s a m p l e s i s z e r o . I n t h i s c a s e t m a y b e c o m p u t e d f r o m t = D/S5 F o r n - 1 d e g r e e s o f f r e e d o m , t h e p r o b a b i l i t y ( o r P v a l u e ) t h a t t h e n u l l h y p o t h e s i s i s v a l i d m a y b e d e t e r m i n e d f r o m t h e t - d i s t r i b u t i o n w h i c h i s u s u a l l y p r e s e n t e d i n t a b u l a r f o r m . S m a l l P v a l u e s ( P < 0 . 0 5 ) i n d i c a t e r e j e c t i o n o f t h e n u l l h y p o t h e s i s w h e r e a s l a r g e v a l u e s ( P > 0 . 5 0 ) i n d i c a t e a h i g h d e g r e e o f a c c e p t a n c e . A n o t h e r w a y o f s t a t i n g t h i s i s t h a t t h e p r o b a b i l i t y P c o r r e s p o n d s t o t h e r i s k a s s o c i a t e d w i t h t h e r e j e c t i o n o f t h e n u l l h y p o t h e s i s . A l l P v a l u e s i n t h i s t h e s i s a r e q u o t e d u s i n g a t w o - t a i l e d t e s t o f t h e m e a n i e . t h a t d e v i a t i o n s f r o m t h e n u l l h y p o t h e s i s c o u l d o c c u r i n e i t h e r d i r e c t i o n . A.1 .2 Unpaired Analysis W h e n n o p a i r i n g h a s b e e n u s e d , t h e t w o s a m p l e s a r e c o n s i d e r e d t o b e i n d e p e n d e n t w i t h m e a n s a n d X2 t h a t a r e e s t i m a t e s o f t h e r e s p e c t i v e p o p u l a t i o n m e a n s u-| a n d ^2' T n e t - d i s t r i b u t i o n i s a g a i n t h e b a s i s o f s i g n i f i c a n c e t e s t s a n d c o n f i d e n c e i n t e r v a l s c o n c e r n i n g t h e p o p u l a t i o n d i f f e r e n c e u-| - U2- I n t h i s c a s e , h o w e v e r , t h e t - s t a t i s t i c n o w h a s t h e v a l u e f = [ ( X , - X g H M ! - M 2 ) ] / S X 1 _ X 2 I t i s a s s u m e d t h a t X-| a n d X 2 a r e n o r m a l l y d i s t r i b u t e d a n d i n d e p e n d e n t a n d h e n c e X - | - X 2 i s a l s o n o r m a l l y d i s t r i b u t e d . T h e d e n o m i n a t o r o f t ' , SYJ-X2> i s a s a m p l e e s t i m a t e o f t h e p o p u l a t i o n s t a n d a r d e r r o r o f X - | - X2 g i v e n b y S X 1 " S X 2 = C s 2 X l / n 1 + s 2 X 2 / n 2 3 * 2 2 w h e r e S X 1 a n d S X 2 a r e s a m p l e e s t i m a t e s o f t h e p o p u l a t i o n s t a n d a r d 2 2 d e v i a t i o n s o X 1 a n c ' ° X2» w n e r e i t i s a s s u m e d t h a t o x - | d o e s n o t e q u a l o x 2 « In c o m p a r i n g t h e m e a n s o f t w o i n d e p e n d e n t s a m p l e s h a v i n g d e g r e e s o f f r e e d o m g i v e n b y v-\ - n- j -1 a n d v2 - " 2 - 1 , t h e a p p r o x i m a t e n u m b e r o f d e g r e e s o f f r e e d o m i n t ' i s g i v e n b y V = (v-, + v 2 ) 2 / ( v 2 - , / + v 2 2 / v2) 2 2 w h e r e v-| = S x 1 / n 1 a n c ' v 2 = ^ X 2 " ^ n e v a l u e ° f v' w a s r o u n d e d d o w n t o t h e n e a r e s t i n t e g e r w h e n r e f e r r i n g t o t h e t - d i s t r i b u t i o n t a b l e . T h e n u l l h y p o t h e s i s ( i e . u-| - u 2 = 0 ) w a s t e s t e d b y c a l c u l a t i n g f o r t ' f = ( X r X 2 ) / [ ( S 2 1 / n 1 + S 2 2 / n 2 ) ] * F o r V' d e g r e e s o f f r e e d o m t h e p r o b a b i l i t y ( P v a l u e ) t h a t t h e n u l l h y p o t h e s i s i s v a l i d w a s t h e n d e t e r m i n e d f r o m a t - d i s t r i b u t i o n t a b l e . 147 A*2 Hon parametric Tests T h e t - t e s t d e a l s w i t h t h e c o m p a r i s o n o f t h e m e a n s o f t h e t w o s a m p l e s , p a i r e d o r i n d e p e n d e n t , f r o m p o p u l a t i o n s t h a t a r e a s s u m e d t o f o l l o w n o r m a l d i s t r i b u t i o n s . I f t h i s a s s u m p t i o n i s s e r i o u s l y v i o l a t e d , a " n o n p a r a m e t r i c " t e c h n i q u e t h a t i s f r e e f r o m a n y d i s t r i b u t i o n r e q u i r e m e n t s m a y b e a p p l i e d . T w o n o n p a r a m e t r i c t e s t s a r e c o n s i d e r e d i s t h i s a n a l y s i s : t h e s i g n e d - r a n k t e s t , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e p a i r e d t - t e s t , a n d t h e W -t e s t , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e u n p a i r e d t - t e s t . A.2.1 T h e S i q n e d - R a n k T e s t T h e s i g n e d - r a n k t e s t ( o r i g i n a t e d b y W i l c o x i n ) m a y b e a p p l i e d a s a s u b s t i t u t e f o r t h e t - t e s t i n p a i r e d s a m p l e s . T o c a r r y o u t t h i s t e s t , o n e f i r s t r a n k s t h e a b s o l u t e v a l u e s o f t h e d i f f e r e n c e s , t h e s m a l l e s t d i f f e r e n c e b e i n g a s s i g n e d r a n k 1. T h e s i g n c o r r e s p o n d i n g t o t h e d i f f e r e n c e i s t h e n r e s t o r e d t o t h e r a n k i n g . T h e r a n k s w i t h n e g a t i v e o r p o s i t i v e s i g n s a r e t o t a l l e d s e p a r a t e l y . T h e t e s t c r i t e r i o n i s t h e s m a l l e r o f t h e s e t w o t o t a l s . T h i s n u m b e r , s i g n i g n o r e d , m a y b e r e f e r r e d t o a t a b l e o f P v a l u e s f o r t h e s i g n e d - r a n k t e s t ( S n e d e c o r , W o n n a c o t t ) . T h e n u l l h y p o t h e s i s b e i n g t e s t e d i n t h i s c a s e i s t h a t t h e f r e q u e n c y d i s t r i b u t i o n o f t h e o r i g i n a l m e a s u r e m e n t s i s t h e s a m e f o r b o t h m e m b e r s o f a p a i r , b u t t h e s h a p e o f t h e d i s t r i b u t i o n d o e s n o t n e e d t o b e s p e c i f i e d . C o n s e q u e n t l y , t h e n u l l h y p o t h e s i s i m p l i e s t h a t e a c h r a n k i s e q u a l l y l i k e l y t o b e + o r - . A n o t h e r w a y o f s t a t i n g t h e n u l l h y p o t h e s i s i s t h a t t h e t w o u n d e r l y i n g p o p u l a t i o n s a r e i d e n t i c a l a n d h e n c e t h e o b j e c t i v e o f t h e t e s t i s t o d e t e c t w h e t h e r t h e t w o u n d e r l y i n g p o p u l a t i o n s a r e c e n t e r e d d i f f e r e n t l y ( W o n n a c o t t ) . 148 A .2 . 2 T h e R a n k - S u m (W) T e s t T h e W - t e s t m a y b e a p p l i e d a s a s u b s t i t u t e f o r t h e t - t e s t o f t w o i n d e p e n d a n t s a m p l e s . T h e n u l l h y p o t h e s i s b e i n g t e s t e d i s t h e s a m e a s d e s c r i b e d f o r t h e s i g n e d - r a n k t e s t . T o c a r r y o u t t h e t e s t , a l l o f t h e o b s e r v a t i o n s ( n o t d i f f e r e n c e s ) f r o m b o t h s a m p l e s a r e c o m b i n e d a n d r a n k e d w i t h t h e s m a l l e s t o b s e r v a t i o n b e i n g a s s i g n e d r a n k 1. ( T h e a c t u a l v a l u e s , n o t a b s o l u t e , a r e r e f e r e n c e d . ) C a r e m u s t b e t a k e n t o d i s t i n g u i s h t h e r a n k s a s s i g n e d t o m e m b e r s o f e a c h o f t h e s a m p l e s . T h e r a n k s f r o m e a c h s a m p l e a r e s u m m e d a n d t h e s m a l l e r o f t h e t w o s u m m e d r a n k s , W, i s r e f e r r e d t o a t a b l e o f P v a l u e s f o r t h e r a n k - s u m t e s t t o d e t e r m i n e t h e l e v e l o f s i g n i f i c a n c e . S m a l l v a l u e s o f W i n d i c a t e r e j e c t i o n o f t h e n u l l h y p o t h e s i s , w h i c h i m p l i e s t h a t o n e p o p u l a t i o n h a s a h i g h e r m e d i a n ( S n e d e c o r ) . 149 6, B I B L I O G R A P H Y A A P M R e p o r t N o . 18 ( 1 9 8 6 ) A P r i m e r O n L o w - L e v e l I o n i z i n g R a d i a t i o n A n d I t s B i o l o g i c a l E f f e c t s . A m e r i c a n A s s o c i a t i o n O f P h y s i c i s t s I n M e d i c i n e , A m e r i c a n I n s t i t u t e O f P h y s i c s , N e w Y o r k . A l p e r , T . ( 1 9 7 9 ) C e l l u l a r R a d i o b i o l o g v . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , C a m b r i d g e . A l p e r , T . ( 1 9 8 0 ) K e y n o t e A d d r e s s : S u r v i v a l C u r v e M o d e l s . I n : R a d i a t i o n B i o l o g y i n  C a n c e r R e s e a r c h . R.E. M e y n a n d H.R. W i t h e r s , e d s . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . 3 - 1 8 . A s h i h a r a , T . a n d B a s e r g a , R. ( 1 9 7 9 ) C e l l S y n c h r o n i z a t i o n . M e t h o d s In E n z v m o l o g v . 58_, 2 4 8 - 2 6 2 . B e c k e r , W.M. ( 1 9 8 6 ) T h e W o r l d O f T h e C e l l . B e n j a m i n / C u m m i n g s , M e n l o P a r k . B e n d e r , M.A. a n d G o o c h , P .C . ( 1 9 6 2 ) T h e K i n e t i c s O f X - R a y S u r v i v a l O f M a m m a l i a n C e l l s in v i t r o . I n t . J . Radiat, Biol,, 5, 1 3 3 - 1 4 5 . T h e B E I R R e p o r t . ( 1 9 7 2 ) T h e E f f e c t s O n P o p u l a t i o n s O f E x p o s u r e T o L o w L e v e l s O f I o n i z i n g R a d i a t i o n . N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l . B E I R III R e p o r t . N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s . C o m m i t t e e o n t h e B i o l o g i c a l E f f e c t s o f I o n i z i n g R a d i a t i o n s . ( 1 9 8 0 ) T h e E f f e c t s O n P o p u l a t i o n s O f E x p o s u r e T o L o w L e v e l s O f I o n i z i n g R a d i a t i o n : 1980 . N a t i o n a l A c a d e m y P r e s s , W a s h i n g t o n , D. C . B l a k e l y , E.A., C h a n g , P .Y . a n d L o m m e l , L. ( 1 9 8 5 ) C e l l - C y c l e - D e p e n d e n t R e c o v e r y F r o m H e a v y - I o n D a m a g e In G - | - P h a s e C e l l s . R a d i a t . R e s . . J f l 4 , S 1 4 5 - S 1 5 7 . B r o s i n g , J .W. ( 1 9 8 3 ) M e a s u r e m e n t s O f C e l l S u r v i v a l A t L o w D o s e s O f R a d i a t i o n . P h . D . T h e s i s , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . C h a d w i c k , K .H . a n d L e e n h o u t s , H .P . ( 1 9 7 3 ) A M o l e c u l a r T h e o r y O f C e l l S u r v i v a l . P h v s i c s M e d . B i o l . . I S , 7 8 - 8 7 . C h a d w i c k , K .H . a n d L e e n h o u t s , H .P . ( 1 9 8 1 ) T h e M o l e c u l a r T h e o r y O f R a d i a t i o n B i o l o g y . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n . C h a p m a n , J . D . , T o d d , P. a n d S t u r r o c k , J . ( 1 9 7 0 ) X - R a y S u r v i v a l O f C u l t u r e d C h i n e s e H a m s t e r C e l l s R e s u m i n g G r o w t h A f t e r P l a t e a u P h a s e . R a d i a t . R e s . f 4 2 , 5 9 0 - 6 0 0 . 1 5 0 C h a p m a n , J . D . , R e u v e r s , A . P . , B o r s a , J . , P e t k a u , A . a n d M c C a l l a , D.R. ( 1 9 7 2 ) N i t r o f u r a n s A s R a d i o s e n s i t i z e r s O f H y p o x i c M a m m a l i a n C e l l s . C a n c e r  R e s . . 21, 2 6 3 0 - 2 6 3 2 . C h a p m a n , J . D . , G i l l e s p i e , C . J . , R e u v e r s , A . P . a n d D u g l e , D.L. ( 1 9 7 5 ) T h e I n a c t i v a t i o n O f C h i n e s e H a m s t e r C e l l s B y X - R a y s : T h e E f f e c t s O f C h e m i c a l M o d i f i e r s O n S i n g l e - a n d D o u b l e - E v e n t s . R a d i a t . R e s . f 6 4 , 3 6 5 - 3 7 5 . C h a p m a n , J . D . ( 1 9 8 0 ) B i o p h y s i c a l M o d e l s O f M a m m a l i a n C e l l I n a c t i v a t i o n B y R a d i a t i o n . I n : R a d i a t i o n B i o l o g y i n C a n c e r R e s e a r c h . R.E. M e y n a n d H.R. W i t h e r s , e d s . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . 2 1 - 3 2 . D e a c o n , J . , P e c k h a m , M . J . a n d S t e e l , G . G . ( 1 9 8 4 ) T h e R a d i o r e s p o n s i v e n e s s O f H u m a n T u m o r s A n d T h e I n i t i a l S l o p e O f T h e C e l l S u r v i v a l C u r v e . R a d i o t h e r . O n c o l . P 2, 3 1 7 - 3 2 3 . D o u g l a s , B .G . a n d F o w l e r , J . F . ( 1 9 7 5 ) F r a c t i o n a t i o n S c h e d u l e s A n d A Q u a d r a t i c D o s e - E f f e c t R e l a t i o n s h i p . B r . J . R a d i o l . . 4 S , 5 0 2 - 5 0 4 . D u r a n d , R .E . ( 1 9 8 6 ) U s e O f A C e l l S o r t e r F o r A s s a y s O f C e l l C l o n o g e n i c i t y . C a n c e r R e s . f 4_£, 2 7 7 5 - 2 7 7 8 . E l k i n d , M . M . a n d S u t t o n , H. ( 1 9 5 9 ) X - R a y D a m a g e A n d R e c o v e r y I n M a m m a l i a n C e l l s I n C u l t u r e . N a t u r e , 184 . 1 2 9 3 - 1 2 9 5 . E l k i n d , M . M . a n d S u t t o n , H. ( 1 9 6 0 ) R a d i a t i o n R e s p o n s e O f M a m m a l i a n C e l l s G r o w n I n C u l t u r e . 1. R e p a i r O f X - R a y D a m a g e O f S u r v i v i n g C h i n e s e H a m s t e r C e l l s . R a d i a t . R e s . r 1 3 f 5 5 6 - 5 9 3 . E l k i n d , M . M . a n d W h i t m o r e , G . F . ( 1 9 6 7 ) T h e R a d i o b i o l o g v O f C u l t u r e d M a m m a l i a n C e l l s . G o r d o n a n d B r e a c h , N e w Y o r k . F e r t i l , B., M a l a i s e , E . P . ( 1 9 8 1 ) I n h e r e n t C e l l u l a r R a d i o s e n s i t i v i t y A s a B a s i c C o n c e p t F o r H u m a n T u m o r R a d i o t h e r a p y . I n t . J . R a d i a t . O n c o l . B i o l . P h v s . . I, 6 2 1 - 6 2 9 . F e r t i l , B., D e r t i n g e r , H., C o u r d i , A . a n d M a l a i s e , E . P . ( 1 9 8 4 ) M e a n I n a c t i v a t i o n D o s e : A U s e f u l C o n c e p t F o r I n t e r c o m p a r i s o n O f H u m a n C e l l S u r v i v a l C u r v e s . R a d i a t . R e s . . 9_9_, 7 3 - 8 4 . F e r t i l , B., M a l a i s e , E . P . ( 1 9 8 5 ) I n t r i n s i c R a d i o s e n s i t i v i t y O f H u m a n C e l l L i n e s I s C o r r e l a t e d W i t h R a d i o r e s p o n s i v e n e s s O f H u m a n T u m o r s : A n a l y s i s O f 101 P u b l i s h e d S u r v i v a l C u r v e s . I n t . J . R a d i a t . O n c o l . B i o l . P h v s . . J l , 1 6 9 9 - 1 7 0 7 . F r e s h n e y , R.I. ( 1 9 8 3 ) c u l t u r e o f A n i m a l C e l l s : A Manual Of Basic Technique. A l a n R. L i s s I n c . , N e w Y o r k . 151 F r i c k e , H. a n d H a r t , E . J . ( 1 9 6 6 ) C h e m i c a l D o s i m e t r y . I n : R a d i a t i o n Dosimetry. Volume LU I n s t r u m e n t a t i o n . F . H . A t t i x a n d W.C. R o e s c h e d s . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , 126 . F r i e d , J . , P e r e z , A . G . a n d C l a r k s o n , B. ( 1 9 8 0 ) Q u a n t i t a t i v e A n a l y s i s O f C e l l C y c l e P r o g r e s s i o n O f S y n c h r o n o u s C e l l s B y F l o w C y t o m e t r y . E X P . C e l l R e s . . 126 , 6 3 - 7 4 . F o w l e r , J . F . ( 1 9 8 7 ) P r i n c i p l e s O f F r a c t i o n a t i o n I n R a d i o t h e r a p y . I n : R a d i o b i o l o g v I n  R a d i o t h e r a p y . N.M. B l e e h e n , e d . S p r i n g e r - V e r l a g , L o n d o n . 5 3 - 5 8 . F o x , M .H . , R e a d , R.A. a n d B e d f o r d , J . S . ( 1 9 8 7 ) C o m p a r i s o n O f S y n c h r o n i z e d C h i n e s e H a m s t e r O v a r y C e l l s O b t a i n e d B y M i t o t i c S h a k e - O f f , H y d r o x y u r e a , A p h i d i c o l i n o r M e t h o t r e x a t e . C y t o m e t r y , g , 3 1 5 - 3 2 0 . G i l l e s p i e , C . J . , C h a p m a n , J . D . , R e u v e r s , A . P . a n d D u g l e , D.L. ( 1 9 7 5 a ) T h e I n a c t i v a t i o n O f C h i n e s e H a m s t e r C e l l s B y X - R a y s : S y n c h r o n i z e d a n d E x p o n e n t i a l C e l l P o p u l a t i o n s . R a d i a t . R e s . . £ 4 , 3 5 3 - 3 6 4 . G i l l e s p i e , C . J . , C h a p m a n , J . D . , R e u v e r s , A . P . a n d D u g l e , D.L. ( 1 9 7 5 b ) S u r v i v a l O f X - I r r a d i a t e d H a m s t e r C e l l s : A n a l y s i s I n T e r m s O f t h e C h a d w i c k - L e e n h o u t s M o d e l . I n : C e l l S u r v i v a l A f t e r L o w D o s e s O f Radiation : T h e o r e t i c a l a n d C l i n i c a l I m p l i c a t i o n s . T . A l p e r , e d . T h e I n s t i t u t e o f P h y s i c s a n d J o h n W i l e y a n d S o n s , L o n d o n . 2 5 - 3 3 . G o o d h e a d , D.T. ( 1 9 8 0 ) M o d e l s O f R a d i a t i o n I n a c t i v a t i o n A n d M u t a g e n e s i s . I n : R a d i a t i o n  B i o l o g y i n C a n c e r R e s e a r c h . R.E. M e y n a n d H.R. W i t h e r s , e d s . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . 2 3 1 - 2 4 7 . G r d i n a , D . J . , M e i s t r i c h , M . L . , M e y n , R.E., J o h n s o n , T . S . a n d W h i t e , R.A. ( 1 9 8 4 ) C e l l S y n c h r o n y T e c h n i q u e s . I. A C o m p a r i s o n O f M e t h o d s . C e l l T i s s u e K i n e t i c s . H , 2 2 3 - 2 3 6 . H a l l , E . J . ( 1 9 7 2 ) T h e E f f e c t O f H y p o x i a O n T h e R e p a i r O f S u b l e t h a l R a d i a t i o n D a m a g e I n C u l t u r e d M a m m a l i a n C e l l s . R a d i a t . R e s . , 4 9 , 4 0 5 - 4 1 5 . H a l l , E . J . ( 1 9 8 8 ) R a d i o b i o l o g v F o r T h e R a d i o l o g i s t . J . B . L i p p i n c o t t C o m p a n y , P h i l a d e l p h i a . H o w a r d , A . a n d P e l c , S.R. ( 1 9 5 3 ) S y n t h e s i s O f D e o x y r i b o n u c l e i c A c i d I n N o r m a l A n d I r r a d i a t e d C e l l s A n d I t s R e l a t i o n T o C h r o m o s o m e B r e a k a g e . H e r e d i t y , £ , 2 6 1 - 2 7 3 . I k e g a m i , S., T a g u c h i , T . , O h a s h i , M . , O g u r o , M . , N a g a n o , H., M a n o , Y . , ( 1 9 7 8 ) A p h i d i c o l i n P r e v e n t s M i t o t i c C e l l D i v i s i o n B y I n t e r f e r i n g W i t h T h e A c t i v i t y O f D N A P o l y m e r a s e - a . N a t u r e , 2 7 5 . 4 5 8 - 4 5 9 . 152 l l i a k i s , G . , N u s s e , M . a n d B r y a n t . P . ( 1 9 8 2 ) E f f e c t s O f A p h i d i c o l i n O n C e l l P r o l i f e r a t i o n , R e p a i r O f P o t e n t i a l l y L e t h a l D a m a g e A n d R e p a i r O f D N A S t r a n d B r e a k s I n E h r l i c h A s c i t e s T u m o u r C e l l s E x p o s e d T o X - R a y s . I n t . J . R a d i a t . B i o l . . 4 2 , 4 1 7 - 4 3 4 . l l i a k i s , G . , P a n t e l i a s , G . , O k a y a s u , R. a n d S e a n e r , R. ( 1 9 8 9 ) C o m p a r a t i v e S t u d i e s O n R e p a i r I n h i b i t i o n B y A r a A , A r a C A n d A p h i d i c o l i n O f R a d i a t i o n I n d u c e d D N A A n d C h r o m o s o m e D a m a g e I n R o d e n t C e l l s : C o m p a r i s o n W i t h F i x a t i o n O f P L D . I n t . J . R a d . O n c o l . B i o l . P h v s . . J £ , 1 2 6 1 - 1 2 6 5 . J o h n s , H .E . & C u n n i n g h a m , J . R . ( 1 9 8 3 ) T h e P h v s i c s o f R a d i o l o g y . C h a r l e s C . T h o m a s , S p r i n g f i e l d . K e l l e r e r , A . M . a n d R o s s i , H .H. ( 1 9 7 2 ) T h e T h e o r y O f D u a l R a d i a t i o n A c t i o n . C u r r e n t T o p i c s R a d i a t . R e s . , fi, 8 5 - 1 5 8 . K e l l e r e r , A . M . a n d R o s s i , H.H. ( 1 9 7 8 ) A G e n e r a l F o r m u l a t i o n O f D u a l R a d i a t i o n A c t i o n . R a d i a t . R e s . r J_5_, 4 7 1 -4 8 8 . K l e v e c z , R.R. ( 1 9 7 2 ) A n A u t o m a t e d S y s t e m F o r C e l l C y c l e A n a l y s i s . A n a l . B i o c h e m . , 4 2 , 4 0 7 -4 1 5 . K l e v e c z , R.R. ( 1 9 7 5 ) T e m p o r a r y S t r u c t u r e O f S P h a s e A n a l y z e d U s i n g A n A u t o m a t e d S y n c h r o n y S y s t e m . B i o t e c h , a n d B i o e n g . . J J , 6 7 5 - 6 9 4 . L e g r y s , G .A . a n d H a l l , E . J . ( 1 9 6 9 ) T h e O x y g e n E f f e c t A n d X - R a y S e n s i t i v i t y I n S y n c h r o n o u s l y D i v i d i n g C u l t u r e s O f C h i n e s e H a m s t e r C e l l s . R a d i a t . R e s . . 2 1 , 1 6 1 - 1 7 2 . L e w i s , E .B . ( 1 9 5 7 ) L e u k e m i a a n d I o n i z i n g R a d i a t i o n . S c i e n c e . 1 25 ( 3255 ' ) . 9 6 5 - 9 7 2 . M a l a i s e , E .P . , F e r t i l , B., D e s c h a v a n n e , P . J . , C h a v a u d r a , N., a n d B r o c k , W.A. ( 1 9 8 7 ) I n i t i a l S l o p e O f R a d i a t i o n S u r v i v a l C u r v e s I s C h a r a c t e r i s t i c O f T h e O r i g i n O f P r i m a r y A n d E s t a b l i s h e d C u l t u r e s O f H u m a n T u m o r C e l l s A n d F i b r o b l a s t s . R a d i a t . R e s . . 1 11 , 3 1 9 - 3 3 3 . M a z i a , D. ( 1 9 6 1 ) T h e C e l l C y c l e . S c i e n c e , x x , 5 5 - 6 4 . M i t c h i s o n , J . M . ( 1 9 7 1 ) B i o l o g y O f T h e C e l l C v c l e . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , C a m b r i d g e . M c C u l l o c h , E .A. a n d T i l l , J . E . ( 1 9 6 2 ) T h e S e n s i t i v i t y O f C e l l s F r o m N o r m a l M o u s e B o n e M a r r o w T o G a m m a R a d i a t i o n i n v i t r o a n d in vivo. R a d i a t . R e s . . 1g, 8 2 2 - 8 3 2 . 153 M o n a h a n , J . J . a n d H a l l , R .H. ( 1 9 7 4 ) M a g n e s i u m A c e t a t e T r e a t m e n t O f R o l l e r B o t t l e s F o r T h e P r e p a r a t i o n O f U n i f o r m C e l l M o n o l a y e r s . P r e p . B i o c h e m . . 4 , 3 5 3 - 3 5 8 . N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e O f C a n a d a ( 1 9 8 9 ) N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e O f C a n a d a : C a n a d i a n C a n c e r S t a t i s t i c s 1 989 , T o r o n t o . N i a s , A .H .W. a n d F o x , M . ( 1 9 7 1 ) S y n c h r o n z i a t i o n O f M a m m a l i a n C e l l s W i t h R e s p e c t T o T h e M i t o t i c C y c l e . C e l l T i s s u e K i n e t . . 4 , 3 7 5 - 3 9 8 . N g o , F .Q .H . , B l a k e l y , E.A., T o b i a s , C .A . , C h a n g , P .Y . a n d L o m m e l , L . ( 1 9 8 8 ) S e q u e n t i a l E x p o s u r e s O f M a m m a l i a n C e l l s T o L o w - a n d H i g h - L E T R a d i a t i o n s : I I. A s A F u n c t i o n O f C e l l - C y c l e S t a g e s . R a d i a t . R e s . P 1 1 5 . 5 4 - 6 9 . P e d r a l i - N o y , G . a n d S p a d a r i , S. ( 1 9 7 9 ) E f f e c t O f A p h i d i c o l i n O n V i r a l A n d H u m a n D N A P o l y m e r a s e s . B i o c h e m . B i o p h v s . R e s . C o m m . . £ £ , 1 1 9 4 - 1 2 0 2 . P e d r a l i - N o y , G . a n d S p a d a r i , S. ( 1 9 8 0 ) A p h i d i c o l i n A l l o w s A R a p i d a n d S i m p l e E v a l u a t i o n O f D N A - R e p a i r S y n t h e s i s I n D a m a g e d H u m a n C e l l s . M u t a t i o n R e s e a r c h . 7 0 , 3 8 9 - 3 9 4 . P e t e r s e n , D.F., A n d e r s o n , E .C . a n d T o b e y , R.A. ( 1 9 6 8 ) M i t o t i c C e l l s A s A S o u r c e O f S y n c h r o n i z e d C u l t u r e s . M e t h . C e l l  P h v s i o l . . X 3 4 7 - 3 7 0 . P r e s c o t t , D.M. ( 1 9 7 8 ) Ihs Reproduction O f E u k a r v o t i c C e l l s . C a r o l i n a B i o l o g i c a l S u p p l y C o m p a n y , B u r l i n g t o n , N.C. P u c k , T . T . a n d M a r c u s , P. I. ( 1 9 5 6 ) A c t i o n O f X - R a y s O n M a m m a l i a n C e l l s . J . E X P . M e d . . 1 03 . 6 5 3 - 6 6 6 . R i t e n o u r , E.R. ( 1 9 8 4 ) O v e r v i e w O f T h e H a z a r d s O f L o w - L e v e l E x p o s u r e T o R a d i a t i o n I n : H e a l t h E f f e c t s O f L o w - L e v e l R a d i a t i o n . W.R. H e n d e e e d . A p p l e t o n -C e n t u r y - C r o f t s , E a s t N o r w a l k , C o n n . 1 3 - 2 2 . S i n c l a i r , W.K. ( 1 9 6 6 ) T h e S h a p e O f R a d i a t i o n S u r v i v a l C u r v e s O f M a m m a l i a n C e l l s C u l t u r e d in vitro. I n ; B i o p h y s i c a l A s p e c t s o f R a d i a t i o n Q u a l i t y . I .A.E.A.. V i e n n a . 2 1 - 4 8 . S i n c l a i r , W.K. ( 1 9 6 7 ) H y d r o x y u r e a : E f f e c t s O n C h i n e s e H a m s t e r C e l l s G r o w n I n C u l t u r e . Cancer Research, 21, 2 9 7 - 3 0 8 . S i n c l a i r , W.K. a n d M o r t o n , R.A. ( 1 9 6 3 ) V a r i a t i o n s I n X - R a y R e s p o n s e D u r i n g T h e D i v i s i o n C y c l e O f P a r t i a l l y S y n c h r o n i z e d C h i n e s e H a m s t e r C e l l s I n C u l t u r e . N a t u r e . 199 . 1 1 5 8 -1160 . 154 S i n c l a i r , W.K. a n d M o r t o n , R.A. ( 1 9 6 5 ) X - R a y a n d U l t r a v i o l e t S e n s i t i v i t y O f S y n c h r o n i z e d C h i n e s e H a m s t e r C e l l s A t V a r i o u s S t a g e s O f T h e C e l l C y c l e . B i o p h v s . J . . 5_, 1 - 25 . S k a r s g a r d , L .D . a n d H a r r i s o n , I. ( 1 9 9 0 a ) D o s e D e p e n d a n c e O f T h e O x y g e n E n h a n c e m e n t R a t i o ( O E R ) I n R a d i a t i o n I n a c t i v a t i o n O f V 7 9 C e l l s . R a d i a t . R e s , ( s u b m i t t e d ) . S k a r s g a r d , L .D. , H a r r i s o n , I. a n d D u r a n d , R .E . ( 1 9 9 0 b ) T h e R a d i a t i o n R e s p o n s e O f A s y n c h r o n o u s C e l l s A t L o w D o s e : E v i d e n c e O f S u b s t r u c t u r e . R a d i a t . R e s , ( s u b m i t t e d ) . S k a r s g a r d , L .D . a n d W i l s o n , D . J . ( 1 9 9 0 c ) S u r v i v a l A t L o w D o s e I n A s y n c h r o n o u s A n d P a r t i a l l y S y n c h r o n i z e d V 7 9 - 1 7 1 C e l l s . R a d i a t . R e s , ( s u b m i t t e d ) . S n e d e c o r , G.W. ( 1 9 8 0 ) S t a t i s t i c a l M e t h o d s . I o w a S t a t e U n i v e r s i t y P r e s s , A m e s I o w a . S t e e l , G . G . , M c M i l l a n , T . J . a n d P e a c o c k , J . H . ( 1 9 8 9 ) T h e P i c t u r e H a s C h a n g e d I n T h e 1 9 8 0 s . I n t . J . R a d i a t . B i o l . . 5J5, 5 2 5 -5 3 7 . S t u b b l e f i e l d , E. ( 1 9 6 8 ) S y n c h r o n i z a t i o n M e t h o d s F o r M a m m a l i a n C e l l C u l t u r e s . M e t h . C e l l P h Y S , , 2, 2 5 - 4 3 . S t r y e r , L . ( 1 9 8 8 ) B i o c h e m i s t r y . W. H. F r e e m a n a n d C o m p a n y , N e w Y o r k . T e r a s i m a , T . a n d T o l m a c h , L . J . ( 1 9 6 1 ) C h a n g e s I n X - R a y S e n s i t i v i t y O f H e L a C e l l s D u r i n g T h e D i v i s i o n C y c l e . N a t u r e . J3Q_, 1 2 1 0 - 1 2 1 1 . T e r a s i m a , T . a n d T o l m a c h , L . J . ( 1 9 6 3 ) G r o w t h a n d N u c l e i c A c i d S y n t h e s i s I n S y n c h r o n o u s l y D i v i d i n g P o p u l a t i o n s O f H e L a C e l l s . E x p . C e l l R e s . P 3_Q, 3 4 4 - 3 6 2 . T o b i a s , C .A . , B l a k e l y , E.A., N g o , F . Q . H . a n d Y a n g , T . C . H . ( 1 9 8 0 ) T h e R e p a i r - M i s r e p a i r M o d e l O f C e l l S u r v i v a l . I n : R a d i a t i o n B i o l o g y i n  C a n c e r R e s e a r c h . R .E . M e y n a n d H.R. W i t h e r s , e d s . R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . 1 9 5 - 2 3 0 . T o b i a s , C . A . ( 1 9 8 5 ) T h e R e p a i r - M i s r e p a i r M o d e l I n R a d i o b i o l o g y : C o m p a r i s o n T o O t h e r M o d e l s . R a d i a t , R e s , , JJ24, S 7 7 - S 9 5 . U N S C E A R ( 1 9 8 2 ) R e p o r t o f t h e U n i t e d N a t i o n s S c i e n t i f i c C o m m i t t e e o n t h e E f f e c t s o f A t o m i c R a d i a t i o n , G e n e r a l A s s e m b l y d o c u m e n t , 3 7 t h S e s s i o n , S u p p l e m e n t No . 4 5 ( A / 3 7 / 4 5 ) . U n i t e d N a t i o n s , N e w Y o r k . W h e a t l e y , D. ( 1 9 8 2 ) C e l l G r o w t h a n d D i v i s i o n . E. A r n o l d , L o n d o n 155 W i l l m e r , E .N . ( 1 9 6 4 ) C e l l s a n d T i s s u e s I n C u l t u r e : M e t h o d s . B i o l o g y a n d P h y s i o l o g y . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n . W o n n a c o t t , T . H . a n d W o n n a c o t t , R . J . ( 1 9 7 7 ) I n t r o d u c t o r y S t a t i s t i c s . J o h n W i l e y a n d S o n s , N e w Y o r k . Y u , C . K . a n d S i n c l a i r , W.K. ( 1 9 6 7 ) M i t o t i c D e l a y a n d C h r o m o s o m a l A b e r r a t i o n s I n d u c e d B y X - R a y s I n S y n c h r o n i z e d C h i n e s e H a m s t e r C e l l s I n V i t r o . J . N a t . C a n e . I n s t . . 22, 6 1 9 - 6 2 2 . 

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