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Constitution of the hemicelluloses of corn leaves and corn stalks. Kabir, Mohammad Shahjahan 1970

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THE CONSTITUTION OF THE HEMICELLULOSES OF CORN LEAVES AND CORN STALKS BY MOHAMMAD SHAKJAHAN KABIR A T H E S I S SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE i n t h e D e p a r t m e n t o f CHEMISTRY We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA January, 1970 In p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d by t h e Head o f my D e p a r t m e n t o r by h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a V a n c o u v e r 8 , C a n a d a D a t e Z\ S\ Jcx^ry 0 - i i -ABSTRACT C h a i r m a n : P r o f e s s o r G . G . S . D u t t o n The C o n s t i t u t i o n o f t h e H e m i c e l l u l o s e s o f C o r n L e a v e s a n d C o r n S t a l k s F r a c t i o n a t i o n o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m c o r n l e a v e s b y e x t r a c t i o n w i t h d i l u t e a l k a l i f u r n i s h e s a b r a n c h e d c h a i n a r a b i n o x y l a n c o n t a i n i n g D - g l u c u r o n i c a c i d , s m a l l a m o u n t s o f 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c a c i d a n d D - g l u c o s e . C o m p l e t e a c i d h y d r o l y s i s o f t h e p e r i o d a t e o x i d i s e d p o l y -s a c c h a r i d e g i v e s e t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l a n d D - x y l o s e i n a m o l a r r a t i o o f 1 : 3 4 : 8 : 1 8 . H y d r o l y s i s o f t h e m e t h y l a t e d h e m i c e l l u l o s e h a s y i e l d e d a m i x t u r e o f 2 - 0 - a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 - d i - O - m e t h y l -D - x y l o s e ; 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L - a r a b i n o s e a n d 2 - 0 - ( 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - m e t h y l - « ( - D - g l u c o p y r a n o s y l u r o n i c a c i d ) - 3 - 0 - m e t h y l -D - x y l o s e i n a m o l a r r a t i o o f 4 . 6 : 3 : 4 0 : 1 : 4 . 5 : 6 . The s i d e c h a i n s o f t h e p o l y s a c c h a r i d e c o n s i s t o f s i n g l e u n i t s o f u r o n i c a c i d a n d s i n g l e u n i t s o f L - a r a b o f u r a n o s e j o i n e d t o p o s i t i o n s 2 a n d 3 , r e s p e c t i v e l y , o f D - x y l o -p y r a n o s e u n i t s o f t h e x y l a n m o l e c u l a r f r a m e w o r k . A s i m i l a r p o l y s a c c h a r i d e i s p r e s e n t i n c o r n s t a l k s . T h e v a r i e t y u s e d was G o l d e n B a n t a m . - i i i -TABLE OF CONTENTS P a g e INTRODUCTION 1 CORN LEAF HEMICELLULOSE 3 DISCUSSION 4 E x t r a c t i o n a n d H y d r o l y s i s 4 P e r i o d a t e O x i d a t i o n 5 M e t h y l a t i o n S t u d i e s 9 M a s s S p e c t r o m e t r y 17 C o n c l u s i o n 37 EXPERIMENTAL 40 A . E x t r a c t i o n o f H e m i c e l l u l o s e 40 B . H y d r o l y s i s o f C o r n L e a f H e m i c e l l u l o s e 41 C . I d e n t i f i c a t i o n o f N e u t r a l S u g a r s 43 D. I d e n t i f i c a t i o n o f A c i d i c S u g a r s 4 3 E. P e r i o d a t e O x i d a t i o n 46 1 . D e t e r m i n a t i o n o f P e r i o d a t e C o n s u m p t i o n 46 2 . R e d u c t i o n w i t h S o d i u m B o r o h y d r i d e 46 3 . A c i d H y d r o l y s i s o f P o l y o l 47 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f N e u t r a l F r a c t i o n 47 F. M e t h y l a t i o n o f C o r n L e a f 50 1 . P r e p a r a t i o n o f M e t h y l s u l p h i n y l A n i o n 50 2 . G e n e r a t i o n o f t h e P o l y s a c c h a r i d e A l k o x i d e 50 3 . M e t h y l a t i o n R e a c t i o n 51 4 . F r a c t i o n a t i o n o f t h e M e t h y l a t e d C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e 52 - i v -P a g e G . H y d r o l y s i s o f t h e M e t h y l a t e d C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e 53 H . S e p a r a t i o n o f N e u t r a l a n d A c i d i c C o m p o n e n t s 53 I . S e p a r a t i o n o f t h e N e u t r a l C o m p o n e n t s b y C e l l u l o s e - C o l u m n C h r o m a t o g r a p h y 54 J . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e N e u t r a l M e t h y l a t e d S u g a r s 55 K. G a s - L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y o f M e t h y l a t e d N e u t r a l S u g a r s 1 . P a r t i a l l y M e t h y l a t e d A l d i t o l A c e t a t e s 58 2 . T r i m e t h y l s i l y l (TMS) D e r i v a t i v e s o f M e t h y l a t e d A l d o p e n t o s e s 59 L . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e M e t h y l a t e d A l d o b i o u r o n i c A c i d 61 CORN STALK HEMICELLULOSE 64 DISCUSSION 65 EXPERIMENTAL - 67 P R E C I P I T A T I O N OF THE HEMICELLULOSES OF CORN LEAVES AND CORN STALKS IN ETHANOL-WATER MIXTURES 78 DISCUSSION 79 EXPERIMENTAL 81 P r e c i p i t a t i o n o f t h e H e m i c e l l u l o s e s o f C o r n L e a v e s 81 P r e c i p i t a t i o n o f t h e H e m i c e l l u l o s e s o f C o r n S t a l k s 83 REFERENCES 86 - V -L I S T OF FIGURES F i g u r e P a g e 1 P e r i o d a t e o x i d a t i o n o f t h e x y l a n f r a m e w o r k o f a p o l y s a c c h a r i d e 8 2 S t e r i c h i n d r a n c e o f s u b s t i t u e n t a t C - 3 t o b o r o h y d r i d e r e d u c t i o n 15 3 M a s s s p e c t r u m o f l , 4 , 5 - t r i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y l -D - x y l i t o l 20 4 S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f l , 4 , 5 - t r i - 0 -a c e t y l - 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y l - D - x y l i t o l 21 5 M a s s s p e c t r u m o f l , 5 - d i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 , 4 - t r i - 0 -m e t h y l - D - x y l i t o l 22 6 S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f l , 5 - d i - 0 - a c e t y l -2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l i t o l 23 7 M a s s s p e c t r u m o f l , 4 - d i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l -L - a r a b i n i t o l 24 8 S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f 1 , 4 - d i - O -a c e t y l - 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L - a r a b i n i t o l 25 9 M a s s s p e c t r u m o f TMS 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y l - 4 - 0 - T M S - D -x y l o p y r a n o s i d e 27 10 S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f TMS 2 , 3 - d i - O -m e t h y l - 4 - 0 - T M S - D - x y l o p y r a n o s i d e 28 11 M a s s s p e c t r u m o f TMS 2 - 0 - m e t h y l - 3 , 4 - d i - 0 - T M S - D -x y l o p y r a n o s i d e 29 12 O r i g i n o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f TMS 2 - 0 -m e t h y l - 3 , 4 - d i - 0 - T M S - D - x y l o p y r a n o s i d e 30 - v i -F i g u r e P a g e 13 M a s s s p e c t r u m o f TMS 3 - 0 - m e t h y l - 2 , 4 - d i - 0 - T M S - D -x y l o p y r a n o s i d e 31 14 S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f TMS 3 - 0 -m e t h y l - 2 , 4 - d i - 0 - T M S - D - x y l o p y r a n o s i d e 32 15 M a s s s p e c t r u m o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - g - D - g l u c o s i d e 33 16 S o u r c e o f t h e i o n s o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - 3 - D - g l u c o s i d e 34 17 M a s s s p e c t r u m o f m e t h y l 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L -a r a b i n o f u r a n o s i d e 35 18 S o u r c e o f t h e i o n s o f m e t h y l 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L -a r a b i n o f u r a n o s i d e 36 19 P e r i o d a t e o x i d a t i o n o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e 48 20 S e p a r a t i o n o f p r o d u c t s o f p e r i o d a t e o x i d i z e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e 49 21 S e p a r a t i o n o f m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s b y g a s -l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( c o r n l e a f ) 60 22 S e p a r a t i o n o f TMS d e r i v a t i v e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s ( c o r n l e a f ) 62 23 P e r i o d a t e o x i d a t i o n o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e 71 24 S e p a r a t i o n o f p r o d u c t s o f p e r i o d a t e o x i d i z e d c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e 73 25 S e p a r a t i o n o f m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e - 74 26 S e p a r a t i o n o f TMS d e r i v a t i v e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s 76 ( c o r n s t a l k ) F r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n c u r v e f o r t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n l e a v e s F r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n c u r v e f o r t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n s t a l k s - v i i i -L I S T OF TABLES T a b l e p a g e 1 Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f m e t h y l a t e d s u g a r s i s o l a t e d f r o m t h e h y d r o l y s a t e s o f m e t h y l a t e d c o r n l e a f h e m i c e l l u l o s e 38 2 F r a c t i o n s o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m c o r n l e a f 42 3 G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f c o r n l e a f n e u t r a l s u g a r s 44 4 P e r i o d a t e u p t a k e o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e 47 5 F r a c t i o n a t i o n o f m e t h y l a t e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e 52 6 C h r o m a t o g r a p h i c e x a m i n a t i o n o f n e u t r a l m e t h y l a t e d s u g a r s ( c o r n l e a f ) 54 7 S e p a r a t i o n o f n e u t r a l s u g a r s o f m e t h y l a t e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e 57 8 F r a c t i o n s o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m c o r n s t a l k 68 9 G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f c o r n s t a l k n e u t r a l s u g a r s 70 10 P e r i o d a t e u p t a k e o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e 70 11 F r a c t i o n a t i o n o f m e t h y l a t e d c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e 72 12 F r a c t i o n a t i o n o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e s i n e t h a n o l - w a t e r m i x t u r e s 82 13 F r a c t i o n a t i o n o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s i n e t h a n o l - w a t e r m i x t u r e s 84 - i x -ACKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o e x p r e s s my g r a t i t u d e t o P r o f e s s o r G . G . S . D u t t o n f o r h i s i n v a l u a b l e g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h e p e r i o d o f t h i s w o r k . H e l p f u l s u g g e s t i o n s o f f e r e d b y r e s e a r c h w o r k e r s o f t h i s l a b o r a t o r y a r e a l s o g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . INTRODUCTION P u r p o s e : H e m i c e l l u l o s e s may b e c o n s i d e r e d a s o n e o f t h e m a j o r c o n s t i t u e n t s o f p l a n t m a t e r i a l s . The t e r m h e m i c e l l u l o s e i s a p p l i e d t o t h o s e p l a n t c e l l - w a l l p o l y s a c c h a r i d e s a s s o c i a t e d w i t h c e l l u l o s e w h i c h a r e u n e x t r a c t e d b y w a t e r o r ammonium o x a l a t e b u t w h i c h a r e e x t r a c t e d b y a q u e o u s a l k a l i . H e m i c e l l u l o s e s a r e p o l y m e r i c m a t e r i a l s b u i l t u p o f a r e l a t i v e l y l i m i t e d n u m b e r o f s u g a r r e s i d u e s , t h e p r i n c i p a l o n e s b e i n g D - x y l o s e , D - m a n n o s e , D - g l u c o s e , D - g a l a c t o s e , L - a r a b i n o s e , 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c a c i d , D - g a l a c t u r o n i c a c i d , D - g l u c u r o n i c a c i d , a n d t o a l e s s e r e x t e n t , L - r h a m n o s e , L - f u c o s e a n d v a r i o u s O - m e t h y l a t e d s u g a r s . The s t r u c t u r a l c h e m i s t r y o f t h e h e m i c e l l u l o s e s h a s b e e n r e p o r t e d i n many p u b l i c a t i o n s ( 1 , 2 ) , a n d h e n c e , d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f i t s h i s t o r i c a l b a c k g r o u n d h a s b e e n o m i t t e d f r o m t h i s c h a p t e r . A l t h o u g h t h e s t r u c t u r e o f t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n c o b s ( 3 , 4 ) , c o r n f i b e r ( 5 , 6 ) , a n d c o r n h u l l s ( 7 , 8 ) h a v e b e e n w e l l i n v e s t i g a t e d , no s t r u c t u r a l i n v e s t i g a t i o n o f c o r n l e a f h e m i c e l l u l o s e s h a s y e t b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . A l s o h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n s t a l k h a v e n o t b e e n s t u d i e d t o a g r e a t e x t e n t . A p r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n o f c o r n s t a l k h e m i c e l l u l o s e (9) h a s i n d i c a t e d t h a t i t c o n s i s t s m a i n l y o f D - x y l o s e , L - a r a b i n o s e , a n d D - g l u c u r -o n i c a c i d . I n a n o t h e r r e p o r t ( 1 0 ) , c o r n s t a l k h e m i c e l l u l o s e s w e r e e x t r a c t e d f r o m t h e p l a n t t i s s u e w i t h d i f f e r e n t s o l v e n t s a n d e a c h e x t r a c t - 2 -was a n a l y s e d b y p e r i o d a t e o x i d a t i o n i n o r d e r t o i d e n t i f y t h e m a j o r g l y c o s i d i c l i n k a g e s o f t h e a n h y d r o p e n t o s e s c o n t a i n e d t h e r e i n . G r a m e r a a n d W h i s t l e r (11) h a v e s e p a r a t e d t h e c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s i n t o t h r e e f r a c t i o n s , e a c h o f w h i c h was h o m o g e n e o u s i n c o m p o s i t i o n . O n e , a g l u c a n , o b t a i n e d i n s m a l l a m o u n t , r e s e m b l e d c e l l u l o s e ; a s e c o n d was a n a c i d i c t e t r a h e t e r o g l y c a n , a n d a t h i r d , e x a m i n e d i n g r e a t e s t d e t a i l was a n e u t r a l a r a b i n o x y l a n b e i n g c o m p o s e d o f D - x y l o s e a n d L - a r a b i n o s e u n i t s . T h e g e n e r a l a i m o f t h e p r e s e n t w o r k i s t o s t u d y t h e s t r u c t u r e o f t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n s t a l k a n d c o r n l e a f i n d e t a i l . T h e r e h a s b e e n a v e r y c o n s i d e r a b l e d e v e l o p m e n t o f m e t h o d s i n s t r u c t u r a l p o l y -s a c c h a r i d e c h e m i s t r y i n r e c e n t y e a r s . M e t h y l a t i o n , a c o n v e n t i o n a l m e t h o d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f p o l y s a c c h a r i d e s , h a s b e e n made m o r e c o n v e n -i e n t d u e t o i m p r o v e m e n t s i n p r o c e d u r e ( 1 2 ) a n d g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a s become a r o u t i n e o p e r a t i o n f o r s e p a r a t i n g p a r t i a l l y m e t h y l a t e d m o n o s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s . M a s s s p e c t r o m e t r y h a s b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d m o n o s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s ( 1 3 , 1 4 , 1 5 , 1 6 ) . I n a s i m i l a r w a y , g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n a p p l i e d t o e s t i m a t e s i m u l t a n e o u s l y p o l y h y d r i c a l c o h o l s a n d s u g a r s o b t a i n e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f t h e p e r i o d a t e o x i d a t i o n t o p o l y s a c c h a r i d e s ( 1 7 ) . H e n c e , t h e p u r p o s e o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n i s t o a n a l y s e t h e s t r u c t u r e s o f c o r n l e a f a n d c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s a p p l y i n g t h e s e r e c e n t c h e m i c a l m e t h o d s a n d e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e s . CORN LEAF HEMICELLULOSE DISCUSSION E x t r a c t i o n a n d H y d r o l y s i s : C o r n l e a v e s w e r e e x t r a c t e d s u c c e s s i v e l y w i t h b o i l i n g e t h a n o l - b e n z e n e ( 1 : 2 ) t o i n a c t i v a t e e n z y m e s , w i t h c o l d w a t e r w h i c h r e m o v e d t h e w a t e r s o l u b l e p e c t i n t o g e t h e r w i t h much p r o t e i n , a n d w i t h e t h y l e n e - d i a m i n e t e t r a -a c e t i c a c i d d i s o d i u m s a l t w h i c h r e m o v e d t h e l e s s s o l u b l e p e c t i c m a t e r i a l . D e l i g n i f i c a t i o n a n d s u b s e q u e n t e x t a c t i o n o f t h e p l a n t m a t e r i a l w i t h a l k a l i a f f o r d e d h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n s w h i c h i n m o s t c a s e s w e r e f r e e f r o m p r o t e i n . O n l y o n e f r a c t i o n ( T a b l e 2 , f r a c t i o n A ) w h i c h r e p r e s e n t e d c a . 1% o f t h e t o t a l h e m i c e l l u l o s e e x t r a c t e d , c o n t a i n e d 2 5 . 6 2 % o f p r o t e i n . H e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n s , a f t e r a c i d h y d r o l y s i s , w e r e s e p a r a t e d i n t o n e u t r a l a n d a c i d i c s u g a r s b y i o n - e x c h a n g e r e s i n s . N e u t r a l s u g a r s o n c h r o m a t o g r a p h i c e x a m i n a t i o n w e r e f o u n d t o c o n t a i n x y l o s e a s t h e m a i n p r o d u c t t o g e t h e r w i t h a r a b i n o s e a n d t r a c e s o f g l u c o s e . A l l h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n s h a d h i g h n e g a t i v e s p e c i f i c r o t a t i o n . T h i s p r o n o u n c e d n e g a t i v e r o t a t i o n i s c h a r a c t e r i s t i c o f x y l a n s w h e r e x y l o s e r e s i d u e s a r e l i n k e d i n t h e 8-D c o n f i g u r a t i o n . Q u a n t i t a t i v e i n v e s t i g a t i o n o f n e u t r a l s u g a r s was c a r r i e d o u t o n a g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h w i t h a t h e r m a l c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r . D i f f e r e n t s u g a r s c a u s e t h e d e t e c t o r t o r e s p o n d t o a v a r y i n g d e g r e e , t h u s f o r i d e n t i c a l m o l a r a m o u n t s o f d i f f e r e n t compounds t h e p e a k a r e a s a r e n o t t h e s a m e . M o l a r r e s p o n s e f a c t o r s ( m . r . f . ) o f p o l y o l s a n d s u g a r s h a v e b e e n w o r k e d o u t i n t h i s l a b o r a t o r y b y D u t t o n a n d c o w o r k e r s ( 1 7 ) . W i t h t h e h e l p o f t h o s e f i g u r e s ( a l s o v e r i f i e d b y t h e p r e s e n t - 5 -a u t h o r w h e r e n e c e s s a r y ) t h e c o m p o s i t i o n o f d i f f e r e n t p e a k s t o g e t h e r w i t h t h e i r m o l a r r a t i o s w e r e w o r k e d o u t a n d a r e q u o t e d i n T a b l e 3 . T h e a c i d i c s u g a r s f o r m e d o n a c i d h y d r o l y s i s o f t h e p o l y s a c c h a r i d e w e r e d e s o r b e d f r o m D u o l i t e A - 4 r e s i n b y e l u t i o n w i t h w a t e r c o n t a i n i n g f o r m i c a c i d . H e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n s c o n t a i n e d c a . 10% o f h e x u r o n i c a c i d r e s i d u e s a n d a v e r y s m a l l amount o f m e t h o x y l g r o u p s ( c a . 0 . 5 % ) . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f u r o n i c a c i d f r a g m e n t s g a v e r i s e t o s p o t s c o r r e s p o n d i n g t o g l u c u r o n i c , 4 - O - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c , a l d o b i o u r o n i c a n d a l d o t r i o u r o n i c a c i d s . The m a j o r p o r t i o n was a l d o b i o u r o n i c a c i d . The m e t h y l e s t e r m e t h y l g l y c o s i d e s o f t h e u r o n i c a c i d s w e r e r e d u c e d w i t h l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e a n d h y d r o l y s e d t o g i v e 4 - 0 - m e t h y l - D -g l u c o s e ( t r a c e s o n l y ) , D - x y l o s e a n d D - g l u c o s e . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e o r i g i n a l p o l y s a c c h a r i d e c o n t a i n e d g l u c u r o n i c a c i d a s t h e m a j o r a c i d i c c o n s t i t u e n t t o g e t h e r w i t h t r a c e s o f 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c a c i d . The p r e s e n c e o f b o t h D - g l u c u r o n i c a n d 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c a c i d h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n t h e p o l y s a c c h a r i d e s o f s a p o t e gum ( 1 8 ) . P e r i o d a t e O x i d a t i o n : I n 1 9 2 8 , M a l a p r a d e f o u n d t h a t p e r i o d i c a c i d a n d i t s s a l t s q u a n t i t a t i v e l y c l e a v e d t h e c a r b o n - c a r b o n b o n d o f 1 , 2 d i o l s ( 1 9 ) : R 2 C ( O H ) C R 2 O H + H 5 I 0 4 — 2R 2 C=0 + H I 0 3 + 2 ^ 0 L a t e r F l e u r y ( 2 0 ) s h o w e d t h a t t h e h y d r o x y l g r o u p s h a d t o b e o n - 6 -a d j a c e n t c a r b o n a t o m s , a n d e s t a b l i s h e d p e r i o d i c a c i d a n d i t s s a l t s a s u s e f u l a n a l y t i c a l r e a g e n t s . - C - O H - CHO I + lO > + 4 - l0" -hH 0 0 - C - O H ^ CHO 3 ^ 1 I P e r i o d a t e o x i d a t i o n s a r e q u a n t i t a t i v e a n d r e a s o n a b l y f a s t a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e y c o u l d b e c a r r i e d o u t o v e r a w i d e r a n g e o f p H . P e r i o d a t e i o n c o u l d b e e s t i m a t e d i n t h e p r e s e n c e o f i o d a t e i o n s a n d o t h e r r e a c t i o n p r o d u c t s , b e c a u s e i t o x i d i z e d i o d i d e i o n t o i o d i n e i n n e u t r a l o r m i l d l y a l k a l i n e s o l u t i o n . P e r i o d a t e o x i d a t i o n i s a t w o -e l e c t r o n o x i d a t i o n r e a c t i o n , r e q u i r i n g o n e m o l e c u l e o f p e r i o d a t e i n w h i c h t h e i o d i n e a t o m i s r e d u c e d f r o m t h e +7 t o t h e +5 v a l e n c y s t a t e w i t h t h e f o r m a t i o n o f i o d a t e i o n s . As e a r l y a s 1 9 3 3 , a m e c h a n i s m f o r p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f g l y c o l s s u g g e s t e d b y C r i e g e e (21) i n v o l v e d t h e f o r m a t i o n o f a c y c l i c p e r i o d a t e c o m p l e x . The e v i d e n c e c o n s i s t s o f d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c o b s e r v a t i o n s ( 2 2 , 2 3 ) o n t h e c o m p l e x e s a n d m o r e e x t e n s i v e l y , o f k i n e t i c e v i d e n c e ( 2 4 , 2 5 , 2 6 ) . A l s o a s t u d y o f t h e s t e r e o c h e m i c a l r e q u i r e m e n t s f o r d i o l c l e a v a g e b y p e r i o d a t e h a s g i v e n p o w e r f u l s u p p o r t t o t h i s h y p o t h e s i s ( 2 7 ) . T h e r a t e o f p e r i o d a t e o x i d a t i o n i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e d i h e d r a l a n g l e b e t w e e n t h e two h y d r o x y l g r o u p s . A c c o r d i n g l y , compounds w i t h v i c i n a l c i s - h y d r o x y l g r o u p s a r e o x i d i z e d more r a p i d l y t h a n t h o s e w i t h t r a n s - h y d r o x y l g r o u p s ( 2 7 ) . - 7 -H-C-OH H C - Q H-C=0 1 0 - _ > + H - C=0 H-C-OH + , 0 4 -> H C - O P e r i o d a t e o x i d a t i o n h a s b e e n e m p l o y e d t o a g r e a t e x t e n t i n t h e s t r u c t u r a l d e t e r m i n a t i o n s o f p o l y s a c c h a r i d e s . The p r o c e d u r e i n v o l v e s p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f t h e p o l y m e r , r e d u c t i o n o f t h e n e w l y f o r m e d a l d e h y d e g r o u p s t o a l c o h o l s w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e , a c i d h y d r o l y s i s o f t h e r e s u l t i n g p o l y o l , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r o d u c t s . T h i s a p p r o a c h h a s b e e n d e v e l o p e d b y S m i t h a n d c o w o r k e r s ( 2 8 ) . T h e p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f a l i n e a r x y l a n i s shown i n F i g . 1 . E t h y l e n e g l y c o l i s o b t a i n e d f r o m t h e n o n - r e d u c i n g e n d g r o u p s a n d g l y c e r o l f r o m t h e r e d u c i n g a n d t h e i n t e r n a l x y l o s e r e s i d u e s . The p r o p o r t i o n o f e t h y l e n e g l y c o l p r o d u c e d i s t h e r e f o r e a d i r e c t m e a s u r e o f t h e number o f n o n - r e d u c i n g e n d g r o u p s p r e s e n t . When a n y i n t e r i o r r e s i d u e i s s u b s t i t u -t e d a t C - 2 o r C - 3 i n t h e (1 - 4 ) l i n k e d x y l a n b a c k b o n e , t h i s u n i t i s immune t o p e r i o d a t e a t t a c k . T h i s a c c o u n t s f o r t h e i s o l a t i o n o f x y l o s e i n t h e p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f a x y l a n . E r y t h r i t o l i s o b t a i n e d f r o m t h e g l u c a n a c c o m p a n y i n g t h e p o l y s a c c h a r i d e . C o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e was s u b j e c t e d t o p e r i o d a t e o x i d a t i o n . A f t e r 4 d a y s 0 . 7 7 m o l e o f p e r i o d a t e h a d b e e n c o n s u m e d p e r s u g a r r e s i d u e . T h i s s l o w r a t e o f t h e p e r i o d a t e o x i d a t i o n i s p r o b a b l y d u e t o t h e s t e r i c - 8 -HO 1. io; 2. NaBH H OH H O H 2 C i CH OH HOH C L 2 CH (OH CH 2 OH CH 0OH I 2 CH^OH CHO I CH2OH CH 2 OH CHOH CHOH 2 CHO I CH2OH CH 2 OH CHOH I CHOH 2 n F i g u r e 1 . P e r i o d a t e o x i d a t i o n o f t h e x y l a n f r a m e w o r k o f a p o l y s a c c h a r i d e - 9 -r e q u i r e m e n t s o f t h e v i c i n a l t r a n s - h y d r o x y l g r o u p s o x i d i z e d , a s t h e p o l y s a c c h a r i d e u n d e r i n v e s t i g a t i o n c o n t a i n e d D - x y l o s e r e s i d u e s a s t h e m a i n c o n s t i t u e n t . A f t e r c o m p l e t e o x i d a t i o n o f t h e u n r e d u c e d p o l y -s a c c h a r i d e w i t h p e r i o d a t e t h e r e s u l t i n g p o l y a l d e h y d e was r e d u c e d w i t h b o r o h y d r i d e a n d s u b s e q u e n t l y h y d r o l y s e d c o m p l e t e l y w i t h a c i d . The c o m p o n e n t s w e r e s e p a r a t e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a s t h e i r t r i m e t h y l -s i l y l d e r i v a t i v e s o n a c o l u m n o f SF 9 6 . One o f t h e s e p a r a t i o n c u r v e s i s s h o w n i n F i g . 2 0 . The a v e r a g e m o l a r r a t i o b e t w e e n e t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l , a n d D - x y l o s e was 1 : 3 4 : 8 : 1 8 . M o l a r r a t i o s w e r e c a l c u l a t e d w i t h t h e h e l p o f f i g u r e s o f m o l a r r e s p o n s e f a c t o r s o f p o l y o l s a n d s u g a r s a s c a l c u l a t e d b y D u t t o n a n d c o w o r k e r s ( 1 7 ) . I t i s s e e n f r o m F i g . 1 t h a t g l y c o l a l d e h y d e i s p r o d u c e d f r o m t h e S m i t h d e g r a d a t i o n o f a l i n e a r (1 - 4) l i n k e d x y l a n . T h e f a t e o f g l y c o l a l d e h y d e i n S m i t h d e g r a d a t i o n h a s n o t b e e n q u a n t i t a t i v e l y e s t a b l i s h e d . H o w e v e r , D u t t o n e t a l ( l o c . c i t . ) h a v e c o n c l u d e d t h a t g l y c o l a l d e h y d e was a l m o s t e n t i r e l y d e s t r o y e d i n t h e h y d r o l y s i s o f t h e p o l y a l c o h o l a n d h e n c e d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n s o f p o l y h y d r i c a l c o h o l s b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . T h e p r e s e n t w o r k i s a l s o i n a g r e e m e n t w i t h t h e f a c t t h a t g l y c o l a l d e h y d e i s n o t a s e r i o u s f a c t o r i n s u c h a n a l y s e s . M e t h y l a t i o n S t u d i e s : T h e p u r p o s e o f t h e m e t h y l a t i o n i s t o a c h i e v e a n e t h e r i f i c a t i o n o f a l l o f t h e f r e e h y d r o x y l g r o u p s i n t h e p o l y s a c c h a r i d e . T h e p r o c e d u r e s f o r m e t h y l e t h e r f o r m a t i o n a r e l i m i t e d i n s c o p e . T h e m e t h y l a t i n g - 10 -a g e n t s u s e d a r e e i t h e r d i m e t h y l s u l p h a t e o r m e t h y l i o d i d e ; t h e f o r m e r u s u a l l y i n c o n j u n c t i o n w i t h a s t r o n g a l k a l i , w h i c h s e r v e s t o p r o m o t e i o n i z a t i o n o f t h e p e r t i n e n t h y d r o x y l f u n c t i o n , a n d t h e l a t t e r w i t h a n a g e n t s u c h a s s i l v e r o x i d e . H o w e v e r , t h e s e m e t h y l a t i n g a g e n t s a r e n o t a l w a y s v e r y e f f e c t i v e , b e c a u s e t h e o p e r a t i o n h a s t o b e r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s b e f o r e a c o m p l e t e m e t h y l a t i o n i s a c c o m p l i s h e d . A n e f f e c t i v e a n d r a p i d m e t h y l a t i o n t e c h n i q u e h a s b e e n d e v e l o p e d b y H a k o m o r i ( 1 2 ) , w h e r e i n t h e m e t h y l s u l p h i n y l a n i o n ( 2 9 , 3 0 ) i s u s e d t o g e n e r a t e t h e p o l y s a c c h a r i d e a l k o x i d e p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f m e t h y l i o d i d e . D i m e t h y l s u l p h o x i d e i s u s e d a s t h e s o l v e n t w h e r e i n m e t h y l a t i o n r e a c t i o n s p r o c e e d w i t h f a v o u r a b l e k i n e t i c r a t e s u n d e r r e l a t i v e l y m i l d c o n d i t i o n s . A h i g h d e g r e e o f m e t h y l a t i o n i s a c h i e v e d i n one t r e a t m e n t . R e a c t i o n s e q u e n c e s c a n b e shown a s f o l l o w s ; o o 3 RO N c i + C H J — > ROCH.+- Na I 3 3 - 11 -M e t h y l a t i o n o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e was c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y H a k o m o r i (12) . R e a c t i o n was f o u n d t o b e c o m p l e t e i n one t r e a t m e n t . M e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e was f r a c t i o n a t e d b y e x t r a c t i o n w i t h a m i x t u r e o f p e t : . e t h e r - c h l o r o f o r m , t h e p r o p o r t i o n o f t h e l a t t e r b e i n g i n c r e a s e d i n s t a g e s . A s e r i e s o f f r a c t i o n s was o b t a i n e d w h i c h v a r i e d n o t o n l y i n q u a n t i t i e s b u t a l s o i n m e t h o x y l c o n t e n t s ( T a b l e 5 ) . F r a c t i o n 5 w h o s e m e t h o x y l c o n t e n t was i n c l o s e a g r e e m e n t w i t h t h e t h e o r e t i c a l m e t h o x y l c o n t e n t o f a f u l l y m e t h y l a t e d p e n t o s a n , was u s e d f o r q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s . M e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e was h y d r o l y s e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f L i n d b e r g e t a l ( 3 1 ) , w h e r e i n t h e p o l y m e r was h y d r o l y s e d w i t h 72% s u l p h u r i c a c i d a t 0 ° f o r 30 m i n u t e s , f o l l o w e d b y d i l u t i o n ( t e n t i m e s ) a n d h y d r o l y s i s a t 1 0 0 ° f o r 4 h o u r s . T h i s p r o c e d u r e h a s b e e n r e p o r t e d t o p r o d u c e no a p p a r e n t d e m e t h y l a t i o n w h i c h i s a p r o b l e m e n c o u n t e r e d w i t h m o s t o t h e r m e t h o d s s u c h a s m e t h a n o l y s i s , f o r m o l y s i s e t c . M i x t u r e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s w e r e s e p a r a t e d i n t o t h e a c i d i c a n d n e u t r a l c o m p o n e n t s b y p a s s a g e t h r o u g h i o n - e x c h a n g e r e s i n s . The a c i d i c c o m p o n e n t was c o n v e r t e d i n t o i t s m e t h y l e s t e r m e t h y l g l y c o s i d e b y r e f l u x i n g w i t h m e t h a n o l i c h y d r o g e n c h l o r i d e (3%) w h i c h o n r e d u c t i o n w i t h l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e g a v e r i s e t o a n e u t r a l d i s a c c h a r i d e g l y c o s i d e . When t h e d i s a c c h a r i d e was h y d r o l y s e d t w o c o m p o n e n t s w e r e o b s e r v e d o n a p a p e r c h r o m a t o g r a m . T h e s e w e r e i s o l a t e d f r o m p a p e r b y e l u t i o n w i t h w a t e r . One o f t h e c o m p o n e n t s was 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e , i d e n t i f i e d a s c r y s t a l l i n e s u g a r a n d t h e o t h e r was 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D -g l u c o s e , c h a r a c t e r i z e d b y i t s c r y s t a l l i n e B - m e t h y l g l y c o s i d e . The - 12 -c r y s t a l l i n e 3 - m e t h y l g l y c o s i d e was f u r t h e r c h a r a c t e r i s e d b y t h e f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f mass s p e c t r a ( F i g . 1 6 ) . T h e i s o l a t i o n o f 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e f r o m t h e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d o b i o u r o n i c a c i d s u g g e s t e d t h a t t h e u r o n i c a c i d m o i e t y o f t h e p o l y -s a c c h a r i d e was l i n k e d w i t h t h e x y l o s e b a c k b o n e t h r o u g h C - 2 o f x y l o s e a n d C - l o f t h e u r o n i c a c i d . A l s o , t h e h i g h p o s i t i v e r o t a t i o n o f t h e m e t h y l a t e d a l d o b i o u r o n i c a c i d ( + 8 6 . 5 ° ) i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a n a - D - l i n k a g e . P r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n o f t h e m e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s o n a p a p e r c h r o m a t o g r a m r e v e a l e d 5 c o m p o n e n t s ( T a b l e 6 ) . T h e m i x t u r e o f m e t h y l a t e d s u g a r s was s e p a r a t e d o n a c o l u m n o f h y d r o c e l l u l o s e : c e l l u l o s e ( 1 : 1 ) u s i n g m e t h y l e t h y l k e t o n e - w a t e r a z e o t r o p e a s e l u e n t . Some o f t h e e a r l y f r a c t i o n s w e r e r e s e p a r a t e d a n d t h e s e r e s u l t s a r e t a b u l a t e d i n T a b l e 7 . T h e m i x t u r e was f o u n d t o c o n t a i n 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e ; 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e a n d m o n o - O -m e t h y l x y l o s e s . 2 . 3 . 4 - T r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e was i d e n t i f i e d a s i t s c r y s t a l l i n e g - m e t h y l g l y c o s i d e . 2 . 3 . 5 - T r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e was i d e n t i f i e d b y q u a l i t a t i v e c h r o m a -t o g r a p h y a n d a l s o b y t h e f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f t h e mass s p e c t r u m o f i t s m e t h y l g l y c o s i d e . 2 , 3 - D i - O - m e t h y l - D - x y l o s e was i d e n t i f i e d b y i t s o p t i c a l r o t a t i o n a n d a l s o b y c o n v e r s i o n i n t o i t s c h a r a c t e r i s t i c c r y s t a l l i n e a n i l i d e d e r i v a t i v e . - 13 -M o n o - m e t h y l x y l o s e s w e r e i d e n t i f i e d b y q u a l i t a t i v e p a p e r c h r o m a t o -g r a p h y . I d e n t i f i c a t i o n a n d q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s o b t a i n e d f r o m h y d r o l y s i s o f t h e m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e , w e r e a l s o c a r r i e d o u t b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A c c o r d i n g t o L i n d b e r g ( 1 5 ) , i n m e t h y l a t i o n a n a l y s i s o f p o l y s a c c h a r i d e s , t h e mass s p e c t r u m o f a p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e o b t a i n e d f r o m a m e t h y l a t e d s u g a r , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e s u g a r c o m p o s i t i o n o f t h e o r i g i n a l p o l y s a c c h a r i d e a n d T - v a l u e s w o u l d , i n m o s t c a s e s , g i v e s u f f i c i e n t e v i d e n c e f o r a n u n a m b i g u o u s c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e t h y l a t e d s u g a r . P a r t i a l l y m e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s w e r e c o n v e r t e d i n t o c o r r e s -p o n d i n g a l d i t o l a c e t a t e s a n d s u b s e q u e n t l y a n a l y s e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A l d i t o l a c e t a t e s o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d m o n o s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s o n g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y g i v e s i n g l e p e a k s f o r e a c h c o m p o n e n t . T h i s i s b e c a u s e o f t h e f a c t t h a t r e d u c t i o n o f s u g a r s t o a l d i t o l s w i t h b o r o h y d r i d e r e m o v e s t h e p o s s i b i l i t y o f a n o m e r i z a t i o n a n d a c e t y l a t i o n o f f r e e h y d r o x y l g r o u p s g i v e s a v o l a t i l e d e r i v a t i v e c a p a b l e o f b e i n g r e s o l v e d . The s e p a r a t i o n was c a r r i e d o u t o n a c o l u m n c o n s i s t i n g o f a 3% l i q u i d p h a s e o f a n o r g a n o s i l i c o n e p o l y e s t e r o f e t h y l e n e g l y c o l s u c c i n a t e c h e m i c a l l y c o m b i n e d w i t h a s i l i c o n e o f t h e c y a n o e t h y l t y p e . I t was f o u n d t h a t s e p a r a t i o n s o f d i f f e r e n t c o m p o n e n t s w e r e b e t t e r a c h i e v e d a n d s o l v e n t t a i l i n g e f f e c t was g r e a t l y r e d u c e d i f t h e c o l u m n s w e r e h e l d i s o t h e r m a l l y a t 1 6 0 ° f o r 3 m i n u t e s a n d t h e n p r o g r a m m e d a t 2 ° p e r m i n u t e t o h o l d a t 1 8 0 ° , r a t h e r t h a n i s o t h e r m a l l y a t 1 8 0 ° . The s e p a r a t i o n c u r v e s w e r e f o u n d t o b e q u i t e r e p r o d u c i b l e . - 14 -The m i x t u r e o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s was f o u n d t o c o n t a i n 4 c o m p o n e n t s : 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l a r a b i n i t o l ; 2 , 3 , 4 - t r i - 0 -m e t h y l x y l i t o l ; 2 , 3 - d i - O - m e t h y l x y l i t o l a n d m o n o - O - m e t h y l x y l i t o l s . T h e a s s i g n m e n t o f e a c h o f t h e 4 p e a k s was v e r i f i e d b y c o m p a r i s o n o f r e t e n t i o n t i m e s u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s a n d a l s o b y t h e f a c t t h a t e a c h p e a k was s u p e r i m p o s e d u p o n t h a t o b t a i n e d f r o m t h e a u t h e n t i c s a m p l e s o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s , when t h e y w e r e i n d i v i d u a l l y i n j e c t e d t o g e t h e r w i t h t h e u n k n o w n m i x t u r e i n t o t h e g a s - l i q u i d c h r o m a t o -g r a p h . A l t h o u g h a l d i t o l a c e t a t e s o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 2 , 3 , 5 -t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e a n d 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e a r e w e l l s e p a r a t e d f r o m o n e a n o t h e r , a l d i t o l a c e t a t e s o f 2 - 0 - m e t h y l , a n d 3 - 0 - m e t h y l - D -x y l o s e s c o u l d n o t b e s e p a r a t e d s i n c e t h e y h a v e i d e n t i c a l r e t e n t i o n t i m e o n g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h s . I d e n t i c a l r e t e n t i o n t i m e s o f t h e s e c o m p o u n d s h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d b y J o n e s e t a l ( 3 2 ) . The t i m e r e q u i r e d f o r r e d u c t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e r e q u i r e s b r i e f c o m m e n t . A l t h o u g h L i n d b e r g e t a l ( 3 3 ) h a v e r e p o r t e d a r e d u c t i o n p e r i o d o f 2 h o u r s f o r b o r o h y d r i d e r e d u c t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s , i t was f o u n d i n o u r p r e s e n t w o r k t h a t a s h o r t e r r e d u c t i o n t i m e g a v e r i s e t o many p e a k s o n t h e c h r o m a t o g r a m w h i c h was p r o b a b l y d u e t o i n c o m p l e t e r e d u c t i o n . H e n c e a l o n g e r r e d u c t i o n t i m e ( c a . 12 h o u r s ) was e m p l o y e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s . T h i s o b s e r v a t i o n i s i n a g r e e m e n t w i t h a r e p o r t o f B r a g g a n d Hough ( 3 4 ) o n q u a n t i t a t i v e a s p e c t s o f b o r o h y d r i d e r e d u c t i o n o f c a r b o h y d r a t e s . The r e d u c t i o n o f - 15 - ! an aldose to a glycitol would be preceded by ring opening of the cyclic modification to the aldose of the aldehydo-form in the acyclic staggered zig-zag conformation. A bulky substituent at C-3 of this conformation causes the approach of borohydride ion to the aldehyde group to be sterically hindered. Fig. 2. Steric hindrance by substituent at C-3 in borohydride reduction - 16 -S e p h t o n ( 3 5 ) h a s r p e o r t e d a s e p a r a t i o n o f t h e h y d r o l y s e d p r o d u c t s o f a m e t h y l a t e d x y l a n a s t h e i r t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s b y g a s -l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A l t h o u g h t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i z a t i o n i s s i m p l e a n d r a p i d , i t s u f f e r s f r o m c e r t a i n s h o r t c o m i n g s . I n s o l u t i o n a s u g a r may e x i s t a s a n e q u i l i b r i u m m i x t u r e o f t h e a n o m e r s o f t h e f u r a n o s e a n d p y r a n o s e f o r m s . H e n c e e a c h m o n o s a c c h a r i d e c a n g i v e r i s e t o a s many a s f o u r d e r i v a t i v e s d u r i n g i t s c o n v e r s i o n t o t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s . T h e s e d e r i v a t i v e s , w h i c h a r e f o r m e d t h r o u g h a n o m e r i c a n d r i n g i s o m e r i z a t i o n , e a c h p r o d u c e a p e a k o n t h e c h r o m a t o g r a m . Thus a c o m p l e x m i x t u r e o f c a r b o h y d r a t e s c o u l d g i v e a m u l t i p l i c i t y o f b a n d s w h i c h w o u l d make t o t a l r e s o l u t i o n q u i t e c o m p l i c a t e d . H o w e v e r , i n c e r t a i n c a s e s , t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s h a v e o n e a d v a n t a g e o v e r c o r r e s p o n d i n g p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s . The a n o m e r i c p a i r s o f 2 - 0 - m e t h y l a n d 3 - 0 - m e t h y l - t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f x y l o s e s a r e w e l l s e p a r a b l e f r o m o n e a n o t h e r when e x a m i n e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . H e n c e a q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f m o n o - O - m e t h y l x y l o s e s i n a m i x t u r e c a n b e a c c o m p l i s h e d b y t h i s p r o c e d u r e . A n o m e r i c p e a k s o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l -D - x y l o s e ; 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - l - a r a b i n o s e a n d 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e w e r e n o t w e l l s e p a r a t e d o n a c o l u m n o f SE 5 2 . T h i s o b s e r v a t i o n i s a l s o i n a g r e e m e n t w i t h t h a t r e p o r t e d b y S e p h t o n ( 3 5 ) . - 17 -M a s s S p e c t r o m e t r y : M a s s s p e c t r o m e t r y h a s now become a n i m p o r t a n t t e c h n i q u e f o r t h e s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f c a r b o h y d r a t e d e r i v a t i v e s . I m p r o v e d m e t h y l a t i o n p r o c e d u r e s a n d s u b s e q u e n t s e p a r a t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d m o n o -s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h a v e made m a s s -s p e c t r a l t e c h n i q u e a u s e f u l s u p p l e m e n t t o c h e m i c a l m e t h o d s f o r t h e a n a l y s i s o f p o l y s a c c h a r i d e s . C a r b o h y d r a t e s b e i n g p r a c t i c a l l y n o n v o l a t i l e , m a s s - s p e c t r a l s t u d i e s o n t h e m h a v e b e e n c a r r i e d o u t o n t h e i r more v o l a t i l e d e r i v a t i v e s , s u c h a s , m e t h y l e t h e r s ( 1 3 ) , a c e t a t e s ( 1 4 ) , a l d i t o l a c e t a t e s ( 1 5 ) , t r i m e t h y l s i l y l e t h e r s ( 1 6 , 3 6 ) , t r i f l u o r o a c e t a t e s ( 3 7 ) . A l t h o u g h mass s p e c t r o m e t r y h a s b e e n u s e d i n o r g a n i c c h e m i s t r y f o r m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n , u n f o r t u n a t e l y , o w i n g t o t h e e x t r e m e i n s t a b i l i t y o f t h e c a r b o h y d r a t e m o l e c u l e , t h e m o l e c u l a r i o n ( M + ) c a n h a r d l y b e t r a c e d i n t h e mass s p e c t r a o f m o s t o f t h e c a r b o h y d r a t e d e r i v a -t i v e s . O n l y r e c e n t l y K o c h e t k o v e t a l (37) h a v e f o u n d a m o l e c u l a r p e a k i n t e n s e e n o u g h f o r d i r e c t m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n i n t h e mass s p e c t r a o f t r i f l u o r o a c e t y l d e r i v a t i v e s o f some m o n o s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s . I n t h i s c h a p t e r , f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s o f some p a r t i a l l y m e t h y l a t e d m o n o s a c c h a r i d e d e r i v a t i v e s e n c o u n t e r e d i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , w i l l b e b r i e f l y d i s c u s s e d . 1 . P a r t i a l l y M e t h y l a t e d A l d i t o l A c e t a t e s : From mass s p e c t r a o n e c a n d i s t i n g u i s h b e t w e e n p r i m a r y a n d s e c o n d a r y f r a g m e n t s o f a l d i t o l a c e t a t e s . P r i m a r y f r a g m e n t s a r i s e b y f i s s i o n b e t w e e n t w o - 18 -c a r b o n a t o m s i n t h e a l d i t o l c h a i n ; e i t h e r o f t h e two f r a g m e n t s c o u l d c a r r y t h e p o s i t i v e c h a r g e . The s e c o n d a r y f r a g m e n t s a r e o b s e r v e d f r o m t h e p r i m a r y f r a g m e n t s b y s i n g l e o r c o n s e c u t i v e e l i m i n a t i o n o f a c e t i c a c i d ( 6 0 ) , k e t e n e ( 4 2 ) , m e t h a n o l ( 3 2 ) o r f o r m a l d e h y d e ( 3 0 ) . The i n t e n s i t y o f p r i m a r y f r a g m e n t s i n c r e a s e s w i t h d e c r e a s i n g mass n u m b e r . F r a g m e n t a t i o n p r o c e s s e s t a k e p l a c e b e t w e e n c a r b o n a t o m s i n t h e p a r t i a l s t r u c t u r e s 1 a n d 2 i n p r e f e r e n c e t o 3 , a n d t h e p o s i t i v e i o n i s s t a b i l i z e d b y a m e t h o x y l g r o u p i n g . A g a i n , s t r u c t u r e 1 i s c l e a v e d i n p r e f e r e n c e t o s t r u c t u r e 2 ( 1 5 ) . HC-OCH H C - O C H . H C - O C O C H , I I I 3 HC-OCH HC-OCOCH^ HC-OCOCH^ I I 3 | 3 1 2 3 T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n i n c l u d e s a n a l y s e s o f mass s p e c t r a o f t h e a l d i t o l a c e t a t e s o f 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y l x y l o s e ; 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - m e t h y l x y l o s e ; a n d 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l a r a b i n o s e . M o l e c u l a r i o n ( M + ) c o u l d n o t b e t r a c e d i n a n y o f t h e t h r e e c a s e s . T h e b a s e p e a k i n a l l c a s e s was a t m/e 4 3 w h i c h i s d u e t o a c e t y l i u m i o n . P e a k s o f l o w i n t e n s i t i e s (< 5% o f t h e b a s e p e a k ) w e r e n o t c o n s i d e r e d i n i n t e r p r e t i n g m a s s s p e c t r a . Some r e s u l t s a r e e v i d e n t o n i n s p e c t i o n o f t h e f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s shown i n F i g s . 4 , 6 , a n d 8 . P r i m a r y f r a g m e n t s , m/e 117 a n d m/e 161 a r e common t o a l l c o m p o u n d s . H o w e v e r t h e y d i f f e r i n t h e i r - 19 -r e l a t i v e i n t e n s i t i e s . I n t h e s p e c t r u m shown i n F i g . 3 , p r i m a r y f r a g m e n t s a r i s e p r e f e r e n t i a l l y f r o m t h e c l e a v a g e o f C - 2 , C - 3 b o n d . I n t h e s p e c t r a o f F i g s . 5 a n d 7 , p r i m a r y f r a g m e n t a t i o n t a k e s p l a c e a t C - 2 , C - 3 , C - 4 b o n d s . T h e p r o m i n a n c e o f p e a k a t m/e 45 i n F i g . 7 i n c o m p a r i s o n t o o t h e r compounds c a n b e a c c o u n t e d f o r b y t h e p r e s e n c e o f a m e t h o x y l g r o u p a t t h e t e r m i n a l c a r b o n a t o m . A p e a k o f l o w i n t e n s i t y ( « » 5 % ) a t m/e 4 5 c a n a l s o b e f o u n d i n mass s p e c t r a o f o t h e r c o m p o u n d s a n d i s p r o b a b l y a s e c o n d a r y f r a g m e n t . A p e a k o f v e r y h i g h i n t e n s i t y i s o b s e r v e d a t m/e 145 i n F i g . 5 . T h i s i s a s e c o n d a r y f r a g m e n t a r i s i n g f r o m t h e p r i m a r y f r a g m e n t a t m/e 2 0 5 . T h e p r i m a r y f r a g m e n t a t m/e 205 w h i c h i s n o t v e r y s t a b l e , i s e x p e c t e d t o a r i s e f r o m a l d i t o l s m e t h y l a t e d a t p o s i t i o n 2 , 3 , a n d 4 . T h i s p r i m a r y f r a g m e n t b y l o s s o f a c e t i c a c i d ( 6 0 ) , g i v e s r i s e t o a s h a r p p e a k a t 1 4 5 . H e n c e p r o m i n e n c e o f s e c o n d a r y f r a g m e n t a t m/e 145 i s c h a r a c t e r -i s t i c o f o n l y 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - m e t h y l p e n t o s e d e r i v a t i v e s . The p r i m a r y f r a g m e n t a t m/e 189 ( F i g . 3) i s c h a r a c t e r i s t i c o f a l d i t o l s m e t h y l a t e d a t p o s i t i o n 3 b u t n o t a t 1 a n d 2 . H e n c e t h i s s h o u l d b e a p r o m i n e n t p e a k o n l y o f 2 , 3 - d i - O - m e t h y l x y l i t o l t r i a c e t a t e s a s f o u n d i n F i g . 3 , a b s e n t i n F i g s . 5 a n d 7 . The p r i m a r y f r a g m e n t a t m/e 189 o n l o s s o f a c e t i c a c i d ( 6 0 ) g i v e s r i s e t o a s e c o n d a r y f r a g m e n t a t m/e 1 2 9 , w h i c h u n d e r g o e s f u r t h e r f i s s i o n as i l l u s t r a t e d i n F i g . 4 . H e n c e i t i s e v i d e n t f r o m t h e a b o v e d i s c u s s i o n t h a t a s s i g n m e n t s a n d i n t e r p r e t a t i o n s o f mass s p e c t r a o f d i f f e r e n t p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s p e r m i t t h e i r i d e n t i f i c a t i o n . 43 20 -117 87 129 101 71 189 50 100 150 m/e 200 F i g u r e 3 . M a s s s p e c t r u m o f l , 4 , 5 - t r i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y i - D - x y l i t 6 1 C H O ^ H CH OCOCH » 2 3 HCOCH 3 H C - - O C H H C OCOCH 2 3 m/e 117 H C = O C H . CH ^_ C H O H " C H 2 C O m/e 87 H C O C O C H 3 C H 2 O C O C H 3 HC=OCH 3 H COCOCH H COCOCH d 3 m/e 189 ^rCH rOOH T 3 H C - 6 C H c f H • HCO COCH^ i -m/e 129 H 9=OCH H C OCH 3 C H 2 OCOCH 3 m/e 161 - C H COOH C O C H . II 3 H C-H m/e 101 H C H I C H II H C O C O C H 3 m/e 99 F i g u r e 4 . S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f l , 4 , 5 - t r i - 0 - a c e t y l -2 , 3 - d i - O - m e t h y l - p - x y l i t o l 1001 - 22 43 c > a 99 101 145 1117 I87 1161 Ol 50 100 150 200 m/e F i g u r e 5 . M a s s s p e c t r u m o f l , 5 - d i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - m e t h y l - D - x y l i t o l - 23 -CHOCOChL | 2 3 H C = O C H 0 m/e117 H 2 O C O C H 3 H C O C H 3 CH3OCH H 9 O C H 3 C H O C O C H 0 H C=OCH 3 H 9 O C H 3 H 2 COCOCH 3 . m/e161 H p O C H 3 CH O C H - C H 3 O H H COCH3 H 2 C O C O C H 3 - C H 2 = C O HC=OCI-U " l 3 H < l f C O C O C H 3 m/e 129 •CH.XOH 3 n O V m/e205 H C O C H 1 ^ C hUOCH 3 I HC=OCH. H i C O C h U II J C H 2 m/e 145 II H C O H m/e 87 F i g u r e 6 . S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f 1 , 5 - d i - 0 - a c e t y l -2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l i t o l 100 5 0 0. 43 45 50 F i g u r e 7. 24 noi 71 100 117 129 161 1 5 0 2 0 0 M a s s s p e c t r u m o f l , 4 - d i - 0 - a c e t y l - 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L -a r a b i n i t o l - 25 -C H 0 O C O C H _ H C=OCH H 2C OCOCH. m/e 117 H C O C H C H 3 O C H C H 3 0 C O C H C H O C H 3 •I H C = 6CH 3 _ r H ^ n u HC=OCH 3 O I J -CH^COH I H C O C O C H 3 - ^ - > HC H C O C H 3 H C O C H -CH 3OH m/e 161 H p 3 m/e 101 H C = O C H 3 COH < f _CH CO H C H H 2 L ' U m/e 8 7 H C=OCH, I 3 C O C O C H . II H C H m/e 129 H ? O C H 3 H CH m/c 7t F i g u r e 8 . S o u r c e o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f l , 4 - d i - 0 - a c e t y l -2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n i t o l - 26 -2 . M a s s S p e c t r o m e t r y o f M e t h y l a t e d M e t h y l G l y c o s i d e s : F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s o f m e t h y l g l y c o s i d e s o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l -D - g l u c o s e a n d 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e h a v e b e e n w o r k e d o u t a c c o r d -i n g t o t h e scheme p u t f o r w a r d b y K o c h e t k o v a n d C h i z h o v ( 1 3 ) . T h e s e a u t h o r s d e s i g n a t e a s e r i e s o f i o n s a s A , B , C , D , F , J , H , K e t c . A c c o r d i n g t o t h a t s c h e m e , ' A ' s e r i e s o f i o n s a r e p r o d u c e d b y t h e l o s s o f s u b s t i t u e n t s f r o m C - l , w i t h s u b s e q u e n t e l i m i n a t i o n o f o t h e r s u b s t i t u e n t s . ' B ' s e r i e s o f i o n s a r e p r o d u c e d b y e l i m i n a t i o n o f C - 5 a n d o x y g e n a s f o r m a l d e h y d e . I o n s o f t h e C , D , F , a n d J . s e r i e s a r e i n i t i a t e d b y c l e a v a g e o f t h e C - l t o C - 2 b o n d a n d s u b s e q u e n t f r a g m e n t a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f c h a r g e s o n t h e f r a g m e n t s . A c o n j u g a t e d e l e c t r o n i c s h i f t g i v e s r i s e t o i o n s o f t h e H a n d K s e r i e s , d e p e n d i n g o n t h e c h a r g e l o c a l i s a t i o n . T h e o r i g i n o f m o s t o f t h e s e i o n s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g . 16 a n d 1 8 . 3 . M a s s S p e c t r o m e t r y o f T r i m e t h y l s i l y l D e r i v a t i v e s o f M e t h y l a t e d A l d o p e n t o s e s : F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s o f m o s t o f t h e p e a k s c a n b e e x p l a i n e d b y a n a l o g y w i t h t h e f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f a m e t h y l a t e d m e t h y l g l y c o s i d e . S e v e r a l p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o f r a g m e n t i o n s t y p i c a l f o r t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s a r e i n t h e l o w mass r a n g e . The p e a k s a t m/e 4 5 , 5 9 , 7 3 , 7 5 , a n d 89 h a v e s h o w n t o b e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e t r i m e t h y l s i l y l f u n c t i o n ( 3 8 ) . T h e p e a k a t m/e 7 3 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e t r i m e t h y l s i l y l i o n , was i n t e n s e i n a l l s p e c t r a . F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n s o f t r i m e t h y l -s i l y l d e r i v a t i v e s o f 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e a r e s h o w n i n F i g . 9 - 1 4 , r e s p e c t i v e l y . I o n s o f t h e 100 45 5 0 O 50 73 jdi 88 101 116 133 11 146 159 I L L 100 150 m/e 191 1 _ L 217 233 i II 200 250 F i g u r e 9 . M a s s s p e c t r u m o f TMS 2 , 3 - d i - 0 - m e t h y l - 4 - 0 - T M S - D - x y l o p y r a n o s i d e f CH O-CH=CH-OCHJ 3 • 3J H. m/e 8 8 A 1 (CH3)3SiO CH=OCH3 J , m/e133 ( C H 3 ) 3 S i Q ^ O C H 3 ^ O S f ( C H 3 ) 3 OCH^ C C H 3 ) 3 S i O ^ ° x : B -OSKCHO. '3'3 OCH. •o i \ ( C H 3 ) 3 S i O \ •OSi(CH3)3 CHrOCH^ + 3 M OSi(CH 3 ) 3 F^  m/e 159 Source of the most important ions of TMS 2,3-di-0-methyl-4-0-TMS-D-xylopyrano side - 29 -1 0 0 c 73 146 > ft: 5 0 4 5 7 5 101 191 5 8 nil H33 159 8 8 21 0 5 0 100 150 2 0 0 \| m/e ,7 - Figure 11. Mass spectrum of TMS 2-0-methyl-3,4-di-0-TMS-D-xylopyranoside 4 5 . 1 C H — C ( C H 3 ) 3 S f ° — C H ^ O S K C H3> OSi(CH 3) 3 yi J , m/e 191 K m/e 116 4 / x -OSi(CH 3 ) 3 ( C H 3 J 3 S i O \ g S i ( C H 3 > 3 2 * z 4 3 2 ? H — C H - C H — C H (CH 3 ) 3 SfO + O C H 3 (CH 3 ) 3 SiO *AfcH3 H, m/e 146 F 1 m/e 159 F i g u r e 1 2 . O r i g i n o f t h e m o s t i m p o r t a n t i o n s o f TMS 2 - 0 - m e t h y l - 3 , 4 - d i - 0 - T M S - D - x y l o p y r a n o s i d e c -31- -100 73 o c aj +-> c 5 0 > or 0 45 58 75 101 Figure 13. Mass spectrum of TMS-3-0-methyl-2,4-di-O-TMS-D-xylopyranoside 131 146 159 191 217 50 100 1 5 0 m/e 2 0 0 (CH3)3Sf 0-CH=OS KCH 3 ) 3 j m/e 191 1 CH CH. OSi (CH 3 ) 3 K- m/e 116 CC H 3) 3S i 6 * \ ^ C H 3 f - ° S i ( C H ^ OSf(CH 3). S c H , ; - o s i < c H 3 > 3 ( C H j S i O ^ ' 3 3 3 I ro (CH 3 ) Si O OSi(CH 3 ) 3 •OCH_ CH=OSi(CH3)3 4 CH=CH-CH (CH 3 ) 3 SiO + OSi (CH 3 ) 3 F, m/e 2,17 C H — C H I II ' ( C H 3 } 3 S I ° + O C H s H, m/e 146 CH=CH-CH I (CH 3 ) 3 Si 0 +OCH, F 2 m/e 159" Figure 14. Source of the most important ions of TMS 3-0-methyl-2,4-di-0-TMS-D-xylopyranoside 1 0 0 r - 33 88 r i - > x 1 0 5 0 • 101 1 7 6 4 5 75 131 1 4 5 0 5 0 1 0 0 . 1 5 0 m/e F i g u r e 1 5 . M a s s s p e c t r u m o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - g - D - g l u c o s i d e 2 0 0 CH 3 Q C Hp=C H C=C H OCH. B 2 m/e 131 CH3O CH=CH OCH 3]* C H 3 G k O C H 3 ( / = O C H 3 H,,m/e 88 t CH2OH °\OCH. OCH. CH 0OH C H 3 0 CH 3 0-CH=CH-CHrOCH. F, m/e 101 1 CH. C 2 m/e 145 > [ C H 3 ° CH=CH CH 2 OH] + K, m/e 8 8 4* Frg.16. Source of the ions of methyl 2 3 4 - t r i - o - p - D -glucosicle. - 35 75 |45 8 8 1 0 1 115 H29 143 161 175 5 0 100 150 F i g u r e 17. m/e M a s s s p e c t r u m o f m e t h y l 2 , 3 , 5 - t r i - 0 - m e t h y l - L - a r a b i n o -f u r a n o s i d e . 20( Figure 18. Source of the ions of methyl 2,3,5-tri-O-methyl-L-arabinofuranoside I C\J - 37 -s e r i e s A , C , a n d F t e n d t o e l i m i n a t e t h e s u b s t i t u e n t s f r o m C - 3 ( 1 3 ) . T h e r e f o r e , a c h a r a c t e r i s t i c d i f f e r e n c e b e t w e e n 2 - 0 - m e t h y l a n d 3 - 0 -m e t h y l - D - x y l o s e s ( t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s ) c a n b e n o t i c e d . T h u s t h e p e a k a t m/e 159 i s more i n t e n s e f o r 2 - 0 - m e t h y l compound ( F i g . 11) t h a n t h a t f o r 3 - 0 - m e t h y l compound ( F i g . 1 3 ) . C o n c l u s i o n : From t h e a b o v e e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e , c e r t a i n s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e c a n b e i n f e r r e d . I t i s e v i d e n t t h e 2 , 3 , 4 -t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e i s d e r i v e d f r o m t e r m i n a l D - x y l o p y r a n o s e r e s i d u e s i n t h e p o l y s a c c h a r i d e . The l a r g e amount o f 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e t o g e t h e r w i t h t h e h i g h n e g a t i v e r o t a t i o n o f b o t h u n m e t h y l a t e d a n d m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e m a i n b o d y o f t h e h e m i c e l l u l o s e c o n s i s t e d o f D - x y l o s e u n i t s o f t h e p y r a n o s e t y p e 3 - l i n k e d t h r o u g h p o s i t i o n s 1 a n d 4 . T h e 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e i s d e r i v e d f r o m u n i t s o f x y l o s e w h i c h f o r m b r a n c h p o i n t s i n t h e m o l e c u l e ; t h e s e u n i t s a r e j o i n e d t h r o u g h p o s i t i o n 3 i n a d d i t i o n t o p o s i t i o n 1 a n d 4 . I n a s i m i l a r m a n n e r , t h e 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e r e p r e s e n t s a b r a n c h p o i n t w i t h l i n k a g e s a t p o s i t i o n s 1 , 2 a n d 4 . I t i s a p p a r e n t t h a t 1 m o l e o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e i s o b t a i n e d p e r 4 0 m o l e s o f 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e . T h i s r a t i o i s i n c l o s e a g r e e m e n t w i t h t h e r a t i o o f e t h y l e n e g l y c o l a n d g l y c e r o l ( 1 : 3 4 ) o b t a i n e d f r o m t h e p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e ( T a b l e 1 ) . C o n s i d e r i n g t h e m o l e r a t i o s , i t i s f o u n d t h a t 1 m o l e o f t h e m e t h y l a t e d a l d o b i o u r o n i c a c i d i s o b t a i n e d p e r 9 m o l e s o f m e t h y l a t e d - 38 -TABLE 1 QUANTITATIVE A N A L Y S I S OF METHYLATED SUGARS ISOLATED FROM THE HYDROLYSATE OF THE METHYLATED CORN LEAF HEMICELLULOSE S u g a r D e r i v a t i v e W t . , m g . M o l e r a t i o a M o l e r a t i o * 5 2 , 3 , 5 - T r i - O - m e t h y l - L -a r a b i n o s e 5 9 . 9 4 . 5 4 2 , 3 , 4 - T r i - O - m e t h y l - D - . x y l o s e 1 3 . 2 1 1 2 , 3 - D i - O - m e t h y l - D -x y l o s e 4 9 1 . 9 40 38 3 - O - M e t h y l - D - x y l o s e 3 4 . 7 3 3 . 6 2 - O - M e t h y l - D - x y l o s e 4 8 . 3 4 . 6 4 . 4 2 - 0 - ( 2 , 3 , 4 - T r i - 0 - m e t h y l -D - g l u c u r o n o s y l ) - 3 - 0 -m e t h y l - D - x y l o s e 1 0 9 . 0 6 -M o l e r a t i o f r o m w e i g h t y i e l d s . M o l e r a t i o f r o m g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . - 39 -p e n t o s e s . T h i s a g r e e s r e a s o n a b l y w e l l w i t h t h e v a l u e s f o u n d e a r l i e r f o r t h e number o f a n h y d r o x y l o s e u n i t s p e r a c i d g r o u p . T h e h i g h p o s i t i v e r o t a t i o n o f t h e m e t h y l a t e d a l d o b i o u r o n i c a c i d i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f a n a - D - l i n k a g e . The c h a r a c t e r i s a t i o n o f t h e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d d i s a c c h a r i d e i n d i c a t e s t h a t u r o n i c a c i d r e s i d u e s a r e l i n k e d a s s i n g l e u n i t s i d e c h a i n s t o p o s i t i o n 2 o f D - x y l o s e u n i t s o f t h e m a i n c h a i n . I t i s a l s o a p p a r e n t t h a t 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e r e s i d u e s a r e l i n k e d t o t h e D - x y l o s e b a c k b o n e a t p o s i t i o n 3 s i n c e t h e m o l e s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O -m e t h y l - L - a r a b i n o s e o b t a i n e d a r e a l m o s t e q u a l t o t h e number o f m o l e s o f 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e ( T a b l e 1 ) . A l t h o u g h D - x y l o s e o b t a i n e d f r o m t h e h y d r o l y z a t e o f t h e m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e i s i n t r a c e a m o u n t s , i t may h a v e a r i s e n o u t o f d e m e t h y l a t i o n , o r i n c o m p l e t e m e t h y l a t i o n o r d u e t o m u l t i p l e b r a n c h i n g i n a m o l e c u l e . From a b o v e f a c t s , a s i m p l i f i e d s t r u c t u r e may b e p r o p o s e d a s f o l l o w s : P-D-Xylp 1— 40-D-Xylp 1 --4p-D-Xyl p 1 ^ 4 p -D Xyl p l j — 3 4 0 1 <*-D-G A o 1 A r a f EXPERIMENTAL P a p e r c h r o m a t o g r a p h y was c a r r i e d o u t o n Whatman N o s . 1 a n d 3MM p a p e r s w i t h t h e f o l l o w i n g s o l v e n t s y s t e m s ( v / v ) : A . M e t h y l e t h y l k e t o n e - w a t e r a z e o t r o p e B . E t h y l a c e t a t e - a c e t i c a c i d - f o r m i c a c i d - w a t e r , 1 8 : 3 : 1 : 4 C . 1 - B u t a n o l - p y r i d i n e - w a t e r , 6 : 4 : 3 T h e d e s c e n d i n g t e c h n i q u e was u s e d f o r p a p e r c h r o m a t o g r a p h y . S u g a r s w e r e d e t e c t e d w i t h p - a n i s i d i n e t r i c h l o r o a c e t a t e . F r a c t i o n D ( T a b l e 2) a n d F r a c t i o n D ( T a b l e 8) w e r e u s e d f o r s t r u c t u r a l a n a l y s e s t h r o u g h o u t t h i s i n v e s t i g a t i o n . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , a l l e v a p o r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t u n d e r p r e s s u r e a t a b a t h t e m p e r a t u r e o f 4 0 ° C . T h e m e l t i n g p o i n t s r e p o r t e d a r e u n c o r r e c t e d a n d t h e s p e c i f i c r o t a t i o n s q u o t e d a r e e q u i l i b r i u m v a l u e s . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y was c a r r i e d o u t o n a n F a n d M 720 d u a l c o l u m n i n s t r u m e n t f i t t e d w i t h a t h e r m a l c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r . H e l i u m was u s e d a s t h e c a r r i e r g a s . P e a k a r e a s w e r e o b t a i n e d w i t h t h e h e l p o f a n a u t o m a t i c d i g i t a l i n t e g r a t o r . The m a s s s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o n a n A . E . I . M . S . 7 m a s s s p e c t r o m e t e r a t a n i o n i z i n g p o t e n t i a l o f 70 e . v . A . E x t r a c t i o n o f H e m i c e l l u l o s e S a m p l e s o f p o w d e r e d c o r n l e a v e s w e r e e x t r a c t e d e x h a u s t i v e l y w i t h h o t e t h a n o l - b e n z e n e ( 1 : 2 , v / v ) . D r i e d l e a v e s ( 3 9 6 g m . ) w e r e e x t r a c t e d w i t h w a t e r a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 96 h o u r s . The p l a n t m a t e r i a l was - 41 -n e x t e x t r a c t e d w i t h 2% e t h y l e n e d i a r a i n e t e t r a - a c e t i c a c i d ( E D T A ) , a d j u s t e d t o pH 6 . 8 , a t 7 0 ° C f o r 2 h o u r s . The p r o c e s s was r e p e a t e d t h r i c e , e a c h t i m e t h e m a t e r i a l b e i n g e x t r a c t e d w i t h 1 . 5 l i t r e s o f 2% EDTA s o l u t i o n . The f i l t r a t e was c o n c e n t r a t e d t o a v o l u m e o f 2 . 3 l i t r e s a n d a n e q u a l v o l u m e o f e t h a n o l was a d d e d t o i t . The p r e c i p i t a t e d m a t e r i a l was c e n t r i f u g e d , r i n s e d w i t h a c e t o n e a n d e t h e r , s e v e r a l t i m e s . Amount o f EDTA e x t r a c t was f o u n d t o b e 1 . 0 9 gm. I n o r d e r t o d e l i g n i f y , p l a n t m a t e r i a l was d i g e s t e d w i t h a n a q u e o u s s o l u t i o n (3 l i t r e s ) o f s o d i u m c h l o r i t e (30 g m . ) a n d a c e t i c a c i d (10 m l . ) a t 7 5 ° C f o r a p e r i o d o f 3 h o u r s . F r e s h r e a g e n t s w e r e a d d e d a f t e r e v e r y 1 h o u r . T h e d e l i g n i f i e d m a t e r i a l was e x t r a c t e d s u c c e s s i v e l y w i t h 0 . 2 N ( 3 . 2 l i t r e s ) , 1 . 0 N ( 2 . 0 l i t r e s ) a n d 2 . 5 N ( 1 . 0 l i t r e ) o f p o t a s s i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n s . I n e a c h c a s e a c i d i f i c a t i o n o f t h e a l k a l i n e e x t r a c t s t o pH 4 - 5 a f f o r d e d p r e c i p i t a t e s a n d f u r t h e r p r e c i p i t a t e s w e r e o b t a i n e d b y a d d i t i o n o f e t h a n o l (1 v o l . ) . P r e c i p i t a t e d p o l y s a c c h a r i d e s o f d i f f e r e n t f r a c t i o n s w e r e d r i e d b y r i n s i n g s e v e r a l t i m e s w i t h a c e t o n e a n d p e t r o l e u m e t h e r ( 3 0 - 6 0 ° ) . T a b l e 2 i n d i c a t e s t h e y i e l d s o f p r o t e i n , m e t h o x y l , u r o n i c a c i d , a s h c o n t e n t a n d s p e c i f i c r o t a t i o n s o f d i f f e r e n t f r a c t i o n s . B . H y d r o l y s i s o f C o r n L e a f H e m i c e l l u l o s e : S a m p l e s o f d i f f e r e n t f r a c t i o n s ( c a . 0 . 5 0 g . ) w e r e h y d r o l y s e d w i t h s u l p h u r i c a c i d ( I N , 20 m l . ) i n s e a l e d t u b e s f o r 8 h r s . a t 1 0 0 ° C . R e s i d u e s w e r e r e m o v e d b y f i l t r a t i o n a n d t h e f i l t r a t e s w e r e n e u t r a l i z e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e . T h e f i l t r a t e s w e r e p a s s e d t h r o u g h A m b e r l i t e I R -120 ( H + ) a n d D u o l i t e A - 4 r e s i n . The n e u t r a l e l u a t e s w e r e e v a p o r a t e d t o TABLE 2 FRACTIONS OF POLYSACCHARIDES FROM CORN LEAF F r a c t i o n M e t h o d o f E x t r a c t i o n Y i e l d , g m . U r o n i c S p e c i f i c M e t h o x y l P r o t e i n a c i d r o t a t i o n % MS2 % % A 0 . 2 N KOH ( a c i d ) E x t . 0 . 2 9 . 1 1 . 7 2 - 5 1 . 2 1 ° 0 . 6 5 2 5 . 6 2 B 0 . 2 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 0 . 5 4 . . 1 6 . 5 6 - 4 7 . 9 3 ° 0 , . 8 5 -C l . O N KOH ( a c i d ) E x t . 7 . 8 1 1 0 . 4 8 - 4 9 . 9 1 ° 0 , . 4 7 -D l . O N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 10, . 8 9 . 1 1 . 4 2 - 6 4 . 0 6 ° 0 , . 8 9 -E 2 . 5 N KOH ( a c i d ) E x t . 0. . 9 4 6 . 7 2 - 4 5 . 7 1 ° 0 , . 4 2 -F 2 . 5 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 9 . 5 4 8 . 8 0 - 5 7 . 6 9 ° 0 , . 5 4 -* A l l f i g u r e s a r e b a s e d o n a s h f r e e s o l i d . - 4 3 -s y r u p . A c i d i c s u g a r s w e r e e l u t e d f r o m t h e a n i o n e x c h a n g e r e s i n w i t h 10% f o r m i c a c i d a n d e v a p o r a t e d t o s y r u p . P a p e r c h r o m a t o g r a p h i c e x a m i n a t i o n o f n e u t r a l s u g a r s i n s o l v e n t s y s t e m s A , B , a n d C s h o w e d s p o t s c o r r e s p o n d i n g t o a r a b i n o s e , x y l o s e a n d t r a c e s o f g l u c o s e . C . I d e n t i f i c a t i o n o f N e u t r a l S u g a r s : R o u t i n e l y 10 m g . s a m p l e s o f n e u t r a l s u g a r s w e r e s i l y l a t e d . The p r o c e d u r e d e s c r i b e d i s f o r t h i s amount b u t t h e s i z e o f t h e r e a c t i o n c o u l d b e a l t e r e d r e a d i l y . N e u t r a l s u g a r s (10 m g . ) w e r e d i s s o l v e d i n a n h y d r o u s p y r i d i n e k e p t o v e r p o t a s s i u m h y d r o x i d e p e l l e t s (1 m l . ) . H e x a m e t h y l d i s i l a z a n e ( 0 . 2 m l . ) a n d t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ( 0 . 1 m l . ) w e r e a d d e d t o t h e s u g a r s o l u t i o n . The m i x t u r e was s h a k e n v i g o r o u s l y a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 30 s e c o n d s a n d t h e n a l l o w e d t o s t a n d f o r 5 m i n u t e s . The m i x t u r e was e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n t i l t h e r e was a f a i n t s m e l l o f p y r i d i n e . C y c l o h e x a n e (4 m l . ) was a d d e d t o t h e e v a p o r a t e d s a m p l e a n d i t was a g i t a t e d t o d i s s o l v e t r i m e t h y l s i l y l e t h e r s . S m a l l a m o u n t s o f s a m p l e w e r e i n j e c t e d i n t o g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h . S e p a r a t i o n s o f s u g a r s w e r e c a r r i e d o u t o n a c o p p e r c o l u m n ( 8 1 x 1 / 4 " ) , p a c k e d w i t h 20% SF 96 o n 6 0 - 8 0 mesh D i a t o p o r t S . E x p e r i m e n t was c a r r i e d o u t i s o t h e r m a l l y a t 1 9 0 ° C f o r 3 m i n u t e s a n d t h e n p r o g r a m m e d a t 3 ° p e r m i n . t o h o l d a t 2 3 0 ° C . T h e i n j e c t i o n p o r t was 2 7 0 ° C , t h e d e t e c t o r b l o c k 2 9 5 ° a n d t h e h e l i u m f l o w 88 m l p e r m i n . D. I d e n t i f i c a t i o n o f A c i d i c S u g a r s : The a c i d i c f r a c t i o n i s o l a t e d f r o m t h e h y d r o l y s a t e o f t h e h e m i c e l l u -l o s e was e x a m i n e d c h r o m a t o g r a p h i c a l l y o n p a p e r i n s o l v e n t s y s t e m B f o r - 44 -TABLE 3 G A S - L I Q U I D CHROMATOGRAPHIC A N A L Y S I S OF CORN LEAF NEUTRAL SUGARS F r a c t i o n M e t h o d o f E x t r a c t i o n A r a b i n o s e X y l o s e G l u c o s e % B 0 . 2 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 2 5 . 0 7 2 . 5 2 . 5 C l . O N KOH ( a c i d ) E x t . 1 5 . 3 8 4 . 7 D l . O N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 1 7 . 6 7 5 . 7 6 . 7 E 2 . 5 N KOH ( a c i d ) E x t . 1 9 . 6 8 0 . 4 F 2 . 5 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 1 3 . 8 7 9 . 5 6 . 7 - 45 -16 h o u r s . S p o t s c o r r e s p o n d i n g t o a m i x t u r e o f a l d o b i o u r o n i c a c i d s (R 1 . 0 0 , 0 . 5 6 ) , t r a c e s o f f r e e m o n o u r o n i c a c i d s (R 1 . 2 0 , 0 . 6 5 ) a n d X X h i g h e r o l i g o u r o n i c a c i d (R^ 0 . 1 9 ) w e r e o b s e r v e d . The s p o t c o r r e s p o n d i n g t o t h e c o m p o n e n t w i t h R x 0 . 5 6 was t h e m o s t p r o m i n e n t among a l l . A p o r t i o n o f t h e s y r u p y a c i d i c c o n s t i t u e n t (20 m g . ) was d i s s o l v e d i n 4% m e t h a n o l i c h y d r o g e n c h l o r i d e (4 m l . ) a n d t h e s o l u t i o n was r e f l u x e d o v e r a s t e a m b a t h f o r 6 h o u r s . N e u t r a l i z a t i o n w i t h s i l v e r c a r b o n a t e a n d s u b s e q u e n t r e m o v a l o f s i l v e r i o n s b y r ^ S g a v e r i s e t o s y r u p (24 m g . ) w h i c h d i d n o t r e d u c e F e h l i n g s s o l u t i o n . T h e e s t e r was d i s s o l v e d i n t e t r a h y d r o f u r a n (2 m l . , d r i e d b y d i s t i l l a t i o n f r o m l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e ) . A s o l u t i o n o f l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e ( 2 0 0 m g . ) was p r e p a r e d b y a d d i n g t h e f i n e l y c r u s h e d h y d r i d e t o d r y e t h e r (10 m l . ) a n d r e f l u x i n g f o r 1 h o u r , b y w h i c h t i m e t h e m a j o r i t y o f t h e s o l i d h a d d i s s o l v e d . The s o l u t i o n o f t h e e s t e r was a d d e d g r a d u a l l y w i t h s w i r l i n g t o t h e h y d r i d e s o l u t i o n a t r o o m t e m p e r a -t u r e . T h e s o l u t i o n was r e f l u x e d f o r 4 h o u r s . E x c e s s h y d r i d e was d e s t r o y e d b y a d d i t i o n o f e t h e r e a l e t h y l a c e t a t e f o l l o w e d b y d i l u t e a q u e o u s a c e t i c a c i d u n t i l t h e s o l u t i o n was a c i d i c . The r e a c t i o n m i x t u r e was e v a p o r a t e d t o d r y n e s s a n d t h e r e d u c e d m a t e r i a l was h e a t e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d (6 m l . ) f o r 12 h o u r s . The s o l u t i o n was n e u t r a l i z e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e a n d s u b s e q u e n t l y d e i o n i s e d b y p a s s a g e t h r o u g h A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) r e s i n . E v a p o r a t i o n o f t h e e f f l u e n t y i e l d e d a s y r u p (12 m g . ) w h i c h u p o n c h r o m a t o g r a p h i c e x a m i n a t i o n o n p a p e r i n s o l v e n t s y s t e m B s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t h r e e p l o t s c o r r e s p o n d -i n g t o D - x y l o s e , D - g l u c o s e a n d 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c o s e , t h e l a s t one b e i n g p r e s e n t i n t r a c e s . - 46 -E. P e r i o d a t e O x i d a t i o n o f C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e : C o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e ( 2 . 7 4 g . ) was d i s s o l v e d i n . 1 N s o d i u m h y d r o x i d e (50 m l . ) . T h e s o l u t i o n was made s l i g h t l y a c i d i c b y n e u t r a l i s -i n g e x c e s s a l k a l i w i t h d i l u t e a c e t i c a c i d . The s o l u t i o n was k e p t a t 4 ° C f o r 1 h o u r . P e r i o d i c a c i d ( 0 . 5 M , 5 0 m l . ) was a d d e d t o t h e p o l y -s a c c h a r i d e s o l u t i o n a n d f i n a l v o l u m e was a d j u s t e d t o 250 m l . The o x i d a t i o n was a l l o w e d t o p r o c e e d i n t h e d a r k a t 4 ° C u n t i l t h e p e r i o d a t e c o n s u m p t i o n became c o n s t a n t . 1 . D e t e r m i n a t i o n o f P e r i o d a t e C o n s u m p t i o n : To a n a l i q u o t o f p e r i o d a t e o x i d i z e d m a t e r i a l (2 m l . ) , s o d i u m b i c a r b o n a t e (1 g . ) was a d d e d . The s o l u t i o n was s h a k e n s o t h a t s o d i u m b i c a r b o n a t e d i s s o l v e d q u i c k l y . S o d i u m a r s e n i t e ( 0 . 1 N , 5 m l . ) a n d p o t a s s i u m i o d i d e ( 2 0 % , 1 m l . ) , p r e p a r e d i n s a t u r a t e d s o d i u m b i c a r b o n a t e s o l u t i o n , w e r e a d d e d t o t h e a b o v e m i x t u r e . A f t e r s t a n d i n g 15 m i n . , e x c e s s s o d i u m a r s e n i t e was t i t r a t e d w i t h 0 . 1 N i o d i n e s o l u t i o n u s i n g s t a r c h a s i n d i c a t o r . T h e t i t r a t i o n was c a r r i e d o u t u n t i l t h e p e r i o d a t e u p t a k e was c o n s t a n t . 2 . R e d u c t i o n w i t h S o d i u m B o r o h y d r i d e : To t h e p e r i o d a t e o x i d i z e d s o l u t i o n , a s l u r r y o f b a r i u m c a r b o n a t e was a d d e d t o p r e c i p i t a t e p e r i o d a t e a n d i o d a t e . T o t h e c l e a r f i l t r a t e was a d d e d s o d i u m b o r o h y d r i d e (1 g . ) a n d t h e s o l u t i o n l e f t o v e r n i g h t . The s o l u t i o n was n e u t r a l i z e d , d e i o n i s e d b y p a s s a g e t h r o u g h I R - 1 2 0 ( H + ) r e s i n a n d e v a p o r a t e d t o d r y n e s s . B o r a t e was r e m o v e d f r o m t h e p o l y o l b y s e v e r a l t r e a t m e n t s w i t h m e t h a n o l c o n t a i n i n g 1% h y d r o g e n c h l o r i d e . - 47 -TABLE 4 PERIODATE UPTAKE OF CORN LEAF POLYSACCHARIDE T i m e ( h o u r ) M o l e s o f p e r i o d a t e / M o l e s o f s u g a r 1 0 . 0 4 4 0 . 1 4 8 0 . 2 7 12 0 . 4 6 18 0 . 5 6 42 0 . 6 7 66 0 . 7 3 96 0 . 7 7 3 . A c i d H y d r o l y s i s o f P o l y o l : A p o r t i o n o f t h e p e r i o d a t e o x i d i z e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e (110 m g . ) was h y d r o l y s e d w i t h s u l p h u r i c a c i d ( I N , 5 m l . ) a t 1 0 0 ° C , f o r 8 h o u r s . A f t e r n e u t r a l i z a t i o n w i t h b a r i u m c a r b o n a t e , t h e h y d r o l y s a t e was r e s o l v e d i n t o a n e u t r a l a n d a n a c i d i c f r a c t i o n b y p a s s a g e t h r o u g h c a t i o n a n d a n i o n e x c h a n g e r e s i n c o l u m n s . 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e N e u t r a l F r a c t i o n O b t a i n e d o n P e r i o d a t e  O x i d a t i o n b y G a s - L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y : A p o r t i o n o f t h e n e u t r a l h y d r o l y s a t e (10 m g . ) was d i s s o l v e d i n d r y p y r i d i n e (2 m l . ) a n d c o n v e r t e d t o t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s b y - 49 -G l y c e r o l -t// // 1 // 1 -™ 30 40 F i g u r e 2 0 . S e p a r a t i o n o f p r o d u c t s a s t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s f r o m c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e s . - 50 -a d d i n g h e x a m e t h y l d i s i l a z a n e (1 m l . ) a n d t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ( 0 . 5 m l . ) . T h e s o l u t i o n was u s e d f o r g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . S e p a r a t i o n s o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f p o l y h y d r i c a l c o h o l s a n d s u g a r s w e r e c a r r i e d o u t o n a p a i r o f s t a i n l e s s s t e e l c o l u m n s (8 f t . x 0 . 2 5 i n . ) p a c k e d w i t h e q u a l w e i g h t s o f 20% SF 96 o n 6 0 - 8 0 mesh D i a t o p o r t S . The c o l u m n s w e r e h e l d i s o t h e r m a l l y a t 9 0 ° C f o r 3 m i n u t e s a n d t h e n p r o g r a m m e d a t 3 ° C p e r m i n . t o h o l d a t 2 2 0 ° C . A v e r a g e m o l a r r a t i o o f e t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l a n d x y l o s e was 1 : 3 4 : 8 : 1 8 . F. M e t h y l a t i o n o f C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e s : 1 . P r e p a r a t i o n o f M e t h y l s u l p h i n y l A n i o n : I n t o a d r y , 2 5 0 - m l . t h r e e - n e c k e d r o u n d - b o t t o m f l a s k f i t t e d w i t h s e r u m c a p s a n d c o n t a i n i n g a m a g n e t i c s t i r r i n g b a r was w e i g h e d 2 . 5 g . o f sodium h y d r i d e ,50% o i l d i s p e r s i o n . The s o d i u m h y d r i d e was w a s h e d t h r e e t i m e s b y s t i r r i n g w i t h d r y p e t r o l e u m e t h e r ( 3 0 ° - 6 0 ° C ) a n d d e c a n t i n g t h e w a s h . A f t e r t h e t h i r d w a s h , t h e r e s i d u a l d r y p e t r o l e u m e t h e r was e v a c u a t e d w i t h a v a c u u m pump t h r o u g h a n 1 8 - g a u g e n e e d l e i n s e r t e d i n t o t h e s e r u m c a p . D i m e t h y l s u l p h o x i d e (20 m l . ) , d i s t i l l e d f r o m c a l c i u m h y d r i d e u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d s t o r e d o v e r d r i e d m o l e c u l a r s i e v e s , was t r a n s f e r r e d i n t o t h e f l a s k . The m i x t u r e was s t i r r e d a t 5 0 ° C u n t i l t h e s o l u t i o n b e c a m e c l e a r , g r e e n a n d e v o l u t i o n o f h y d r o g e n g a s c e a s e d ( c a . 2 h o u r s ) . 2 . G e n e r a t i o n o f t h e P o l y s a c c h a r i d e A l k o x i d e : C o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e was f i r s t p a s s e d t h r o u g h a 2 0 0 - m e s h s i e v e a n d d r i e d f o r a p e r i o d o f 6 h o u r s a t 6 0 ° C u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . - 51 -D r i e d m a t e r i a l ( 1 . 3 2 g . ) was a d d e d t o 6 5 m l . o f d r y d i m e t h y l s u l p h o x i d e i n a 2 5 0 - m l . t h r e e - n e c k e d r o u n d - b o t t o m f l a s k c o n t a i n i n g a m a g n e t i c s t i r r i n g b a r a n d f i t t e d w i t h s e r u m c a p s t h r o u g h w h i c h r e a g e n t s w e r e i n t r o d u c e d a n d n i t r o g e n g a s was p a s s e d c o n t i n u o u s l y . T h e s u s p e n s i o n was h e a t e d a t 6 0 ° C a n d s t i r r e d w i t h a m a g n e t i c b a r u n t i l a l l o f t h e p o l y s a c c h a r i d e d i s s o l v e d t o f o r m a p a l e b r o w n c o l o u r e d s o l u t i o n . A f t e r c o o l i n g t h e s o l u t i o n t o r o o m t e m p e r a t u r e , m e t h y l s u l p h i n y l a n i o n (15 m l . ) was a d d e d t o t h e p o l y s a c c h a r i d e s o l u t i o n . T h e r e s u l t i n g s o l u t i o n b e c a m e t h i c k a n d was s t i r r e d f o r 6 h o u r s when t h e m i x t u r e a p p e a r e d h o m o g e n e o u s . 3 . M e t h y l a t i o n R e a c t i o n : The p o l y s a c c h a r i d e a l k o x i d e s o l u t i o n was c o o l e d t o 2 0 ° C i n a n i c e - w a t e r b a t h a n d f r e s h l y d i s t i l l e d m e t h y l i o d i d e (5 m l . ) was a d d e d t o t h e s t i r r e d s o l u t i o n a t a v e r y s l o w r a t e s u c h t h a t t h e t e m p e r a t u r e d i d n o t r i s e a b o v e 2 0 ° C (30 m i n . ) . W i t h i n a f e w m i n u t e s a f t e r a d d i t i o n o f m e t h y l i o d i d e , t h e s o l u t i o n became c l e a r a n d t h e v i s c o s i t y was m a r k e d l y r e d u c e d . T h e m i x t u r e was s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r a n a d d i t i o n a l p e r i o d o f 6 h o u r s . W a t e r ( 6 0 m l . ) was a d d e d t o t h e b r o w n c o l o u r e d s o l u t i o n . I m m e d i a t e p r e c i p i t a t i o n t o o k p l a c e . The r e a c t i o n m i x t u r e was d i a l y z e d o v e r n i g h t v s . r u n n i n g t a p w a t e r a n d e x t r a c t e d c o n t i n u o u s l y w i t h c h l o r o f o r m . T h e c h l o r o f o r m e x t r a c t was d r i e d o v e r a n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e a n d was f i n a l l y e v a p o r a t e d t o d r y n e s s a t 4 0 ° C u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e . T h e m e t h y l a t i o n r e a c t i o n was c o m p l e t e a s no OH b a n d was f o u n d i n t h e i n f r a r e d s p e c t r u m . The y i e l d o f t h e c r u d e m e t h y l a t e d p r o d u c t was 1 . 4 8 g . - 52 -4 . F r a c t i o n a t i o n o f t h e M e t h y l a t e d C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e : M e t h y l a t e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e was t r e a t e d w i t h a m i x t u r e o f l i g h t p e t r o l e u m e t h e r ( 3 0 - 6 0 ° C ) - c h l o r o f o r m , t h e amount o f t h e l a t t e r s o l v e n t b e i n g i n c r e a s e d i n s t a g e s . The m i x t u r e was r e f l u x e d o n a s t e a m b a t h f o r 2 h o u r s f o r e a c h e x t r a c t i o n ; t h e i n s o l u b l e m a t e r i a l b e i n g a l l o w e d t o s e t t l e a n d t h e c l e a r l i q u i d was d e c a n t e d . The s o l v e n t was r e m o v e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e s i d u e was d r i e d a t 6 0 ° C i n v a c u o o v e r p h o s p h o r u s p e n t o x i d e t o c o n s t a n t w e i g h t . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 5 . TABLE 5 FRACTIONATION OF METHYLATED CORN LEAF POLYSACCHARIDE F r a c t i o n C h l o r o f o r m : W e i g h t MD M e t h o x y l P e t . E t h e r gm. ( C H C l j ) % 1 0 : 1 0 0 0 . 0 0 5 2 2 1 0 : 9 0 0 . 0 2 8 5 3 1 5 : 8 5 0 . 0 5 0 3 - 5 2 . 6 1 5 . 8 4 2 0 : 8 0 0 . 1 2 4 9 - 5 1 . 2 3 1 . 4 5 2 5 : 7 5 1 . 0 3 3 4 - 4 7 . 7 3 7 . 8 6 3 0 : 7 0 0 . 0 3 3 6 - 4 1 . 8 3 7 . 3 - 53 -G . H y d r o l y s i s o f t h e M e t h y l a t e d C o r n L e a f P o l y s a c c h a r i d e : F r a c t i o n 5 ( 1 . 0 1 g . ) was d i s s o l v e d i n s u l p h u r i c a c i d (72%, 10 m l . ) i n a r o u n d - b o t t o m e d f l a s k e x t e r n a l l y c o o l e d w i t h i c e - w a t e r . The s o l u t i o n was k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h o u r t o s o l u b i l i z e t h e p o l y s a c c h a r i d e . W a t e r was t h e n a d d e d t o b r i n g t h e a c i d c o n c e n t r a t i o n t o 8% a n d t h e h y d r o l y s i s m i x t u r e was h e a t e d a t 1 0 0 ° C f o r 4 h o u r s , t h e n c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , a n d n e u t r a l i s e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e . T h e p r e c i p i t a t e d b a r i u m s u l p h a t e was s e p a r a t e d b y f i l t r a t i o n , s o l i d s b e i n g w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t h w a t e r a n d e t h a n o l . T h e f i l t r a t e a n d t h e e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d a n d e v a p o r a t e d t o a s y r u p a t 3 5 ° C i n v a c u o . H . S e p a r a t i o n o f N e u t r a l a n d A c i d i c O - M e t h y l S u g a r s : The m i x t u r e o f m e t h y l a t e d s u g a r s ( 1 . 0 0 g . ) was d i s s o l v e d i n w a t e r , p a s s e d t h r o u g h a c o l u m n o f A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) r e s i n , a n d t h e r e s i n w a s h e d w i t h w a t e r u n t i l i t g a v e a n e g a t i v e M o l i s c h t e s t . The e f f l u e n t f r o m t h e c a t i o n e x c h a n g e r e s i n was p a s s e d t h r o u g h a c o l u m n o f D u o l i t e A - 4 r e s i n w h i c h s e l e c t i v e l y r e m o v e d t h e a c i d i c c o m p o n e n t . The c o l u n n was w a s h e d w i t h w a t e r u n t i l i t g a v e a n e g a t i v e M o l i s c h t e s t . T h e w a s h i n g s w e r e e v a p o r a t e d t o a s y r u p o f c o n s t a n t w e i g h t ( 7 4 0 . 6 m g . ) . T h e a c i d i c c o m p o n e n t was i s o l a t e d f r o m t h e c o l u m n b y e l u t i n g w i t h f o r m i c a c i d (10%, 5 m l . ) . E v a p o r a t i o n o f t h e e f f l u e n t f u r n i s h e d t h e a c i d i c c o m p o n e n t . The m i x t u r e o f m e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s was e x a m i n e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y u s i n g s o l v e n t s y s t e m A . The r e s u l t s a r e t a b u l a t e d i n T a b l e 6 . - 54 -TABLE 6 CHROMATOGRAPHIC EXAMINATION OF NEUTRAL METHYLATED SUGARS Component number A p p e a r a n c e R f v a l u e 1 mauve 0 . . 8 0 2 p i n k 0 . .78 3 d a r k b r o w n 0 . . 5 3 4 r e d d i s h b r o w n 0 , . 2 3 5 f a i n t b r o w n 0 . . 1 2 I . S e p a r a t i o n o f t h e N e u t r a l C o m p o n e n t s o f M e t h y l a t e d C o r n L e a f P o l y - s a c c h a r i d e b y C e l l u l o s e - C o l u m n C h r o m a t o g r a p h y : A m i x t u r e o f m e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s ( 7 4 0 m g . ) was d i s s o l v e d i n a s m a l l amount o f m e t h y l e t h y l k e t o n e - w a t e r a z e o t r o p e ( 1 . 5 m l . ) a n d p l a c e d o n a c o l u m n (40 x 3 c m . ) p a c k e d w i t h a m i x t u r e o f h y d r o c e l l u l o s e a n d c e l l u l o s e ( 1 : 1 ) . The same s o l v e n t was u s e d f o r e l u t i o n a n d t h e e f f l u e n t was c o l l e c t e d a t 15 m i n . i n t e r v a l s f o r 115 t u b e s a n d t h e n a t 30 m i n . i n t e r v a l s f o r t h e r e s t o f t h e t u b e s . T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e s u g a r s was d e t e r m i n e d b y p l a c i n g 5 d r o p s o f t h e s o l u t i o n o f e a c h t u b e o n p a p e r a n d s p r a y i n g w i t h p - a n i s i d i n e t r i c h l o r o a c e t a t e . C e r t a i n t u b e s w e r e c o n c e n t r a t e d a n d e x a m i n e d c h r o m a t o g r a p h i c a l l y b e f o r e t h e c o n t e n t s o f t h e t u b e s w e r e c o l l e c t e d t o g e t h e r . The s y r u p s w e r e r e d i s s o l v e d i n m e t h a n o l a n d e v a p o r a t e d t o c o n s t a n t w e i g h t . The r e c o v e r y was 9 4 . 1 % . T h e f r a c t i o n s w e r e r e e x a m i n e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y . F r a c t i o n A - 55 -( T a b l e 7) was f o u n d t o c o n t a i n more t h a n o n e c o m p o n e n t a n d was p u t b a c k o n t h e c e l l u l o s e - h y d r o c e l l u l o s e c o l u m n f o r r e s e p a r a t i o n . The e f f l u e n t was c o l l e c t e d a t 10 m i n . i n t e r v a l s f o r 130 t u b e s . J . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e C o m p o n e n t s : ( a ) Component 1 22 The s y r u p ( 7 3 . 1 m g . ) , [oC]D - 2 8 . 2 4 ° ( c , 1 . 5 i n w a t e r ) when e x a m i n e d o n a p a p e r c h r o m a t o g r a m u s i n g m e t h y l e t h y l k e t o n e - w a t e r a z e o t r o p e , s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t w o o v e r l a p p i n g s p o t s , b o t h h a v i n g a n R j . v a l u e c l o s e t o 0 . 8 0 . C o m p a r i s o n w i t h a u t h e n t i c s a m p l e s i n d i c a t e d t h a t t h i s was c o n s i s t e n t w i t h t h e b e h a v i o u r o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L -a r a b i n o s e a n d 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e . T h e r o t a t i o n s o f t h e s e compounds a r e , r e s p e c t i v e l y , - 3 8 . 5 ° a n d + 1 8 . 5 ° ( 3 9 ) , w h i c h s h o w s c o m p o n e n t 1 t o b e a m i x t u r e o f 18% t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ( 1 3 . 2 m g . ) a n d 82% t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e ( 5 9 . 9 m g . ) . A p o r t i o n o f t h e s y r u p ( 3 0 . 1 m g . ) was r e f l u x e d w i t h m e t h a n o l i c h y d r o g e n c h l o r i d e ( 3 % , 1 m l . ) f o r 6 h o u r s . The a c i d was n e u t r a l i s e d w i t h s i l v e r c a r b o n a t e , a n d t h e f i l t r a t e a n d m e t h a n o l w a s h i n g s w e r e e v a p o r a t e d t o a s y r u p w h i c h was e x a m i n e d o n a g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h u s i n g a c o l u m n p a c k e d 5% b y w e i g h t o f b u t a n e - 1 , 4 - d i o l s u c c i n a t e p o l y e s t e r o n 8 0 - 1 0 0 mesh D i a t o p o r t S , a n d t h e c o l u m n ( 4 ' x 1 / 4 " ) was r u n i s o t h e r m a l l y a t 1 2 0 ° . T h r e e p e a k s w e r e o b s e r v e d a n d s a m p l e s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h p e a k w e r e c o l l e c t e d i n c a p i l l a r y g l a s s t u b e s . C o n t e n t s o f t h e t u b e c o r r e s p o n d i n g t o t h e f i r s t p e a k a n d w e r e f o u n d t o h a v e m . p . 4 8 - 5 0 ° , w h i c h a g r e e d t o t h a t o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - B - D -x y l o p y r a n o s i d e . T h e r e p o r t e d v a l u e i s 4 9 - 5 0 ° ( 4 0 ) . - 56 -C o m p a r i s o n o f r e t e n t i o n t i m e s o f a u t h e n t i c m e t h y l g l y c o s i d e s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e a n d 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e w i t h m e t h y l g l y c o s i d e s o f c o m p o n e n t 1 i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d p e a k was a m i x t u r e o f a n o m e r s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s i d e s a n d 2 , 3 , 4 - t r i - 0 -m e t h y l - D - x y l o s i d e s . The t h i r d p e a k c o r r e s p o n d e d t o o n e o f t h e a n o m e r s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s i d e . A p a r t o f t h e m a t e r i a l c o r r e s p o n d -i n g t o t h e t h i r d p e a k was s u b j e c t e d t o m a s s s p e c t r o m e t r i c i n v e s t i g a t i o n , t h e f r a g m e n t a t i o n o f w h i c h was i d e n t i c a l w i t h t h a t o f m e t h y l g l y c o s i d e o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e . A p o r t i o n o f t h e m a t e r i a l c o r r e s -p o n d i n g t o t h e t h i r d p e a k was h y d r o l y s e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d t o g e n e r a t e f r e e r e d u c i n g s u g a r w h i c h o n p a p e r was c h r o m a t o g r a p h i c a l l y i d e n t i c a l w i t h 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e . (b) C o m p o n e n t 2 : T h i s c o m p o n e n t was s h o w n t o b e c h r o m a t o g r a p h i c a l l y p u r e a n d t o 22 c o r r e s p o n d w i t h 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , [a]^ + 2 1 . 4 ° ( c , 1 . 0 0 i n w a t e r ) . A p o r t i o n o f t h e m a t e r i a l ( 4 7 . 9 m g . ) was d i s s o l v e d i n a b s o l u t e e t h a n o l ( 1 . 5 m l . ) a n d f r e s h l y d i s t i l l e d a n i l i n e ( 0 . 3 m l . ) a d d e d . T h e s o l u t i o n was r e f l u x e d f o r 3 1/2 h o u r s . E v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e g a v e a p r o d u c t w h i c h c r y s t a l l i z e d o n s t a n d i n g . On r e c r y s t a l l i z a t i o n , t h e p r o d u c t h a d m . p . 1 2 4 - 1 2 6 ° . T h e l i t e r a t u r e q u o t e s 1 2 5 - 1 2 6 ° ( 4 1 ) . E t h y l a c e t a t e - p e t . e t h e r was u s e d f o r r e c r y s t a l l i z a t i o n . ( c ) Component 3 : T h i s c o m p o n e n t o b t a i n e d i n v e r y s m a l l q u a n t i t y ( 1 5 . 5 m g . ) g a v e a s p o t , o n p a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s o l v e n t s y s t e m A , w i t h Rp v a l u e 0 . 4 0 . - 57 -TABLE 7 SEPARATION OF NEUTRAL SUGARS OF METHYLATED CORN LEAF POLYSACCHARIDE T u b e C o m p o n e n t W e i g h t , m g , Number Number I d e n t i t y 2 6 - 9 0 9 1 - 1 1 0 1 1 1 - 1 2 5 1 2 6 - 1 4 0 1 4 1 - 1 8 0 1 8 1 - 2 0 0 1 , 2 (+ t r a c e s o f 3) 3 4 5 3 8 2 . 0 2 0 3 . 0 1 7 . 8 1 5 . 5 8 3 . 0 1 2 . 1 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l a r a b i n o s e , 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , a n d 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e Unknown M o n o - O - m e t h y l - D - x y l o s e s D - x y l o s e RESEPARATION OF THE CONTENTS OF TUBES NUMBERING 2 6 - 9 0 3 0 - 6 0 1 7 3 . 1 6 1 - 7 9 8 0 - 1 3 0 2 2 9 8 . 1 1 9 0 . 8 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e a n d 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D -x y l o s e 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e - 58 -No f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n was c a r r i e d o u t . (d) Component 4 : T h i s c o m p o n e n t a p p e a r e d t o b e h o m o g e n e o u s o n p a p e r c h r o m a t o g r a p h y w i t h a Rp v a l u e o f 0 . 2 2 i d e n t i c a l t o t h a t o f m o n o - O - m e t h y l x y l o s e s . 22 From t h e r o t a t i o n o f t h e m i x t u r e [ a ] p + 2 7 . 5 ° ( c , 1 . 5 i n w a t e r ) , i t was j u d g e d t o c o n t a i n c a . 56% 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e a n d 44% 3 - 0 - m e t h y l - D -x y l o s e . T h e r o t a t i o n o f t h e s e p u r e c o m p o u n d s a r e , r e s p e c t i v e l y , + 3 5 . 9 ° a n d + 1 7 ° ( 4 2 , 4 3 , 4 4 ) . ( e ) C o m p o n e n t 5 : C o n c e n t r a t i o n o f t h e e l u a t e s c o n t a i n i n g t h i s c o m p o n e n t y i e l d e d a s m a l l amount o f s y r u p ( 1 2 . 1 m g . ) w h i c h d i d n o t c r y s t a l l i z e . T h i s was s h o w n c h r o m a t o g r a p h i c a l l y t o c o n t a i n o n l y x y l o s e (R^ 0 . 0 6 ) . K. G a s - L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y o f M e t h y l a t e d N e u t r a l S u g a r s o f C o r n  L e a f P o l y s a c c h a r i d e : 1 . P a r t i a l l y M e t h y l a t e d A l d i t o l A c e t a t e s : M e t h y l a t e d n e u t r a l m o n o s a c c h a r i d e s (20 m g . ) , o b t a i n e d f r o m t h e a c i d h y d r o l y s i s o f m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e , w e r e r e d u c e d i n w a t e r ( 1 0 0 m l . ) w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e ( 4 0 0 m g . ) f o r a p e r i o d o f 12 h o u r s . The s o l u t i o n was n e x t t r e a t e d w i t h A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) r e s i n a n d e v a p o r a t e d t o d r y n e s s . B o r i c a c i d was r e m o v e d b y c o n d e n s a t i o n w i t h m e t h a n o l a n d t h e p r o d u c t was t r e a t e d w i t h a c e t i c a n h y d r i d e - p y r i d i n e ( 1 : 1 , 40 m l . ) . T h e a c e t y l a t i o n r e a c t i o n was c o n t i n u e d f o r 1 h o u r . The p r o d u c t was d i l u t e d w i t h w a t e r , e v a p o r a t e d t o d r y n e s s a n d d i s s o l v e d i n c h l o r o f o r m . T h e s o l u t i o n was u s e d f o r g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . - 59 -S e p a r a t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s was c a r r i e d o u t o n a c o l u m n (8 f t . x 0 . 2 5 i n . ) c o n t a i n i n g 3% (w/w) o f ECNSS-M o n Gas C h r o m Q ( 1 0 0 - 1 2 0 m e s h ) u s i n g a t e m p e r a t u r e p r o g r a m m e 1 6 0 - 1 8 0 ° C . The c o l u m n s w e r e h e l d i s o t h e r m a l l y a t 1 6 0 ° C f o r 3 m i n u t e s a n d t h e n p r o g r a m m e d a t 2 ° C p e r m i n . t o h o l d a t 1 8 0 ° C . One o f t h e s e p a r a t i o n c u r v e s i s shown i n F i g . 2 1 . To a s s i g n i d e n t i t i e s t o t h e p e a k s , a u t h e n t i c s a m p l e s o f 2 , 3 , 5 - t r i -O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e , 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D -x y l o s e a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e w e r e c o n v e r t e d s e p a r a t e l y i n t o c o r r e s p o n d i n g a c e t y l a t e d a l d i t o l s b y r e d u c t i o n w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e a n d s u b s e q u e n t a c e t y l a t i o n w i t h a c e t i c a n h y d r i d e - p y r i d i n e . The p r o d u c t s w e r e i n j e c t e d i n t o t h e g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h u s i n g 3% (w/w) o f ECNSS-M c o l u m n w i t h t h e i d e n t i c a l p r o g r a m m e a s u s e d f o r t h e s e p a r a t i o n o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s o f n e u t r a l s u g a r s o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e . By c o m p a r i n g r e t e n t i o n t i m e s w i t h a u t h e n t i c s a m p l e s , i t was p o s s i b l e t o c o n c l u d e t h a t p e a k s 1 , 2 , 3 , a n d 4 o f F i g . 2 1 , r e p r e s e n t a l d i t o l a c e t a t e s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L -a r a b i n o s e , 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e a n d m o n o m e t h y l x y l o s e s r e s p e c t i v e l y . 2 . T r i m e t h y l s i l y l D e r i v a t i v e s o f M e t h y l a t e d A l d o p e n t o s e s : M e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s (20 m g . ) , o b t a i n e d f r o m t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s o f t h e f u l l y m e t h y l a t e d c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e , w e r e c o n v e r t e d i n t o t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s , a s b e f o r e , u s i n g h e x a m e t h y l -d i s i l a z a n e ( 0 . 5 m l . ) a n d t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ( 0 . 2 5 m l . ) . T r i m e t h y l s i l y l 1. 2 ,3 ,5 - t r i -O -methy l - L -a rab in i to l , acetate 2. 2 ,3 ,4 - t r i -O -methy l -D - xy l i to ! acetate 3. 2,3 - d i -O -methy l -D -xy l i to l acetate 4 Mono-O-methyl -D-xy l i to I • acetates i o i 3 Time min 21. Separation of methylated alditol a c e t a t e s - 61 -d e r i v a t i v e s o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s w e r e s e p a r a t e d b y g a s -l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o n a c o i l e d c o p p e r c o l u m n packed w i t h 8% b y w e i g h t o f SE 52 o n 6 0 - 8 0 mesh D i a t o p o r t S . The c o l u m n (8 f t . x 0 . 2 5 i n . ) was h e l d i s o t h e r m a l l y a t 1 1 0 ° C f o r 3 m i n a n d t h e n p r o g r a m m e d a t 3 ° p e r m i n t o h o l d a t 1 4 0 ° . T h e f l o w r a t e was 75 m l . o f h e l i u m p e r m i n . One o f t h e s e p a r a t i o n c u r v e s i s s h o w n i n F i g . 2 2 . T h e a s s i g n m e n t o f d i f f e r e n t p e a k s was v e r i f i e d b y i n j e c t i n g a u t h e n t i c i n d i v i d u a l s p e c i m e n s o n t o t h e c o l u m n w i t h t h e u n k n o w n m i x t u r e a n d f i n d i n g t h a t t h e y c o - c h r o m a t o g r a p h e d w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g i n d i v i d u a l s u g a r s o b t a i n e d f r o m t h e h y d r o l y s e d p r o d u c t s o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e . T r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s c o r r e s p o n d i n g t o d i f f e r e n t p e a k s w e r e c o l l e c t e d a n d s u b j e c t e d t o m a s s s p e c t r o m e t r i c s t u d i e s . L . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e M e t h y l a t e d A l d o b i o u r o n i c A c i d T h e a c i d i c f r a c t i o n (109 m g . ) f r o m t h e h y d r o l y s i s o f m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e was r e f l u x e d w i t h m e t h a n o l i c h y d r o g e n c h l o r i d e ( 3 % , 10 m l . ) f o r 5 h o u r s . T h e r e s u l t i n g s y r u p , a f t e r n e u t r a l i z a t i o n w i t h s i l v e r c a r b o n a t e a n d s u b s e q u e n t r e m o v a l o f e x c e s s s i l v e r i o n s b y H 2 S , was r e d u c e d w i t h l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e ( 2 0 0 m g . ) i n t e t r a h y d r o f u r a n (7 m l . ) ; t h e s o l u t i o n b e i n g r e f l u x e d f o r 1 h o u r . A f t e r d e s t r u c t i o n o f e x c e s s o f h y d r i d e b y a d d i n g d i l u t e a q u e o u s a c e t i c a c i d , t h e r e a c t i o n m i x t u r e was e v a p o r a t e d t o d r y n e s s . T h e r e d u c e d m a t e r i a l was h e a t e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d a t 1 0 0 ° f o r 8 h o u r s . T h e s o l u t i o n was n e u t r a l i z e d - 62 -F i g . 2 2 . S e p a r a t i o n o f TMS d e r i v a t i v e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s . 1 . 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e , 2 . 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D -x y l o s e , 3 . 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 4 . 3 - 0 - m e t h y l - D -x y l o s e , 5 . 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e . - 6 3 -w i t h b a r i u m c a r b o n a t e , d e i o n i s e d w i t h A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) r e s i n a n d c o n c e n t r a t e d t o a s y r u p (95 m g . ) - H y d r o l y s e d p r o d u c t s , o n c h r o m a t o -g r a p h i c e x a m i n a t i o n o n p a p e r i n s o l v e n t s y s t e m A , w e r e f o u n d t o h a v e i d e n t i c a l v a l u e s w i t h t h o s e o f 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e a n d 2 , 3 , 4 - t r i - 0 -m e t h y l - D - g l u c o s e . The m i x t u r e o f s u g a r s was r e s o l v e d i n t o two m a i n f r a c t i o n s b y p r e p a r a t i v e p a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s o l v e n t s y s t e m A o v e r a p e r i o d o f 4 h o u r s . T h e c o m p o n e n t s w e r e l o c a t e d b y s p r a y i n g h a l f - i n c h s t r i p s o u t f r o m e d g e s o f t h e s h e e t w i t h p - a n i s i d i n e t r i c h l o r o a c e t a t e r e a g e n t . B a n d s c o r r e s p o n d i n g t o R ( w h e r e g = 2 , 3 , 4 , 6 - t e t r a - O - m e t h y l -D - g l u c o s e ) 0 . 6 4 a n d 0 . 2 4 w e r e c u t o u t a n d e l u t e d w i t h w a t e r . 1 . I d e n t i f i c a t i o n o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - g l u c o s e C o n c e n t r a t i o n o f t h e e l u a t e s c o r r e s p o n d i n g t o R 0 . 6 4 g a v e r i s e 23 t o a s y r u p (38 m g . ) , [ a ] ^ + 7 8 . 5 ( c , 1 . 0 i n w a t e r ) . I t was c o n v e r t e d i n t o i t s m e t h y l g l y c o s i d e a s u s u a l ( P . 55 ) a n d e x a m i n e d o n g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y u s i n g a c o l u m n (4 f t . x 0 . 2 5 i n . ) p a c k e d w i t h 5% b y w e i g h t o f b u t a n e - 1 , 4 - d i o l s u c c i n a t e p o l y e s t e r o n 8 0 - 1 0 0 mesh D i a t o p o r t S , a t 1 2 0 ° C . 3 - M e t h y l g l y c o s i d e o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l glucose c r y s t a l l i z e d s p o n t a n e o u s l y , m . p . 9 2 - 9 4 ° C . The l i t e r a t u r e q u o t e s 9 3 - 9 4 ° C ( 4 5 ) . T h e B - m e t h y l g l y c o s i d e was f u r t h e r s u b j e c t e d t o m a s s s p e c t r o m e t r i c i n v e s t i g a -t i o n . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e C o n c e n t r a t i o n o f t h e e l u a t e s c o r r e s p o n d i n g t o R^ 0 . 2 4 g a v e r i s e t o a s y r u p (29 m g . ) w h i c h c r y s t a l l i s e d o n s t a n d i n g , m . p . 9 1 - 9 3 ° . The l i t e r a t u r e q u o t e s 9 5 - 9 6 ° ( 4 6 ) . CORN STALK HEMICELLULOSE - 65 -DISCUSSION A s i m i l a r s e r i e s o f e x t r a c t i o n s was c a r r i e d o u t o n c o r n s t a l k s . B u t n o h e m i c e l l u l o s e f r a c t i o n s w e r e p r e c i p i t a t e d when a l k a l i n e e x t r a c t s ( 0 . 2 N a n d 1 N KOH) w e r e a c i d i f i e d . L i k e c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e s , D - x y l o s e was f o u n d t o b e t h e m a i n c o n s t i t u e n t o f n e u t r a l s u g a r s . A l l f r a c t i o n s o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s c o n t a i n e d v e r y s m a l l a m o u n t s o f m e t h o x y l g r o u p s . T h u s a c i d i c s u g a r s o n b e i n g e s t e r i f i e d , r e d u c e d a n d h y d r o l y s e d g a v e D - x y l o s e , D - g l u c o s e a n d s m a l l a m o u n t s o f 4 - 0 - m e t h y l - D -g l u c o s e . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e o r i g i n a l p o l y s a c c h a r i d e c o n t a i n e d m a i n l y D - g l u c u r o n i c a c i d w i t h t r a c e s o f 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c u r o n i c a c i d . P e r i o d a t e o x i d a t i o n , s u b s e q u e n t r e d u c t i o n o f t h e p o l y a l d e h y d e a n d c o m p l e t e a c i d h y d r o l y s i s g a v e e t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l , a n d x y l o s e i n t h e m o l a r r a t i o 1 : 4 8 . 3 : 5 . 4 : 1 6 . 8 . T h u s t h e r a t i o o f t h e n o n - r e d u c i n g e n d g r o u p s t o t h e i n t e r n a l x y l o s e r e s i d u e s i s h i g h e r i n c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s t h a n t h a t o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e ( 1 : 3 4 ) . M e t h y l a t i o n o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e g a v e a m e t h y l a t e d p o l y -s a c c h a r i d e w h i c h was s i m i l a r t o t h e m e t h y l a t e d c o r n p o l y s a c c h a r i d e . B o t h t h e m e t h y l a t e d a n d u n m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e h a d h i g h n e g a t i v e r o t a t i o n i n d i c a t i n g t h a t D - x y l o s e r e s i d u e s w e r e l i n k e d i n 3-D c o n f i g u r -a t i o n . The m e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f 2 , 3 , 5 -t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e ; 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 - d i - O - m e t h y l -D - x y l o s e ; 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e i n t h e m o l e r a t i o 4 : 1 : 5 5 : 3 . 5 : 4 . 5 . - 66 -L i k e c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e , t h e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d o -b i o u r o n i c a c i d h a d a h i g h p o s i t i v e r o t a t i o n ( + 9 2 . 1 ° ) c h a r a c t e r i s t i c o f a n a - D - l i n k a g e . T h e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d o b i o u r o n i c a c i d o n b e i n g e s t e r i f i e d , r e d u c e d a n d h y d r o l y s e d g a v e 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - g l u c o s e a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e . T h e s e r e s u l t s , t h e r e f o r e , i n d i c a t e no c h a r a c t e r i s t i c d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m t h e l e a v e s a n d s t a l k s . - 67 -EXPERIMENTAL M e t h o d s a p p l i e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s t r u c t u r e o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s w e r e s i m i l a r t o t h o s e a p p l i e d f o r c o r n l e a f p o l y -s a c c h a r i d e s . H e n c e a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s h a s b e e n o m i t t e d f r o m t h i s c h a p t e r . S a m p l e s o f d r i e d c o r n s t a l k s ( 4 6 0 g m . ) , w e r e e x t r a c t e d i n a s i m i l a r way a s d e s c r i b e d f o r c o r n l e a v e s , a n d a f f o r d e d 4 d i f f e r e n t f r a c t i o n s . Amount o f e a c h f r a c t i o n e x t r a c t e d t o g e t h e r w i t h f i g u r e s o f s p e c i f i c r o t a t i o n , u r o n i c a c i d a n d m e t h o x y l c o n t e n t a r e t a b u l a t e d i n T a b l e 8 . D i f f e r e n t f r a c t i o n s w e r e h y d r o l y s e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d a t 1 0 0 ° f o r 8 h o u r s , n e u t r a l i s e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e a n d s e p a r a t e d i n t o t h e n e u t r a l a n d a c i d i c f r a c t i o n s b y i o n - e x c h a n g e r e s i n s . I d e n t i f i c a t i o n o f d i f f e r e n t s u g a r r e s i d u e s a n d t h e i r c o m p o s i t i o n w e r e d e t e r m i n e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o n a c o l u m n o f SF 96 a s t h e i r t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s ( T a b l e 9 ) . A c i d i c s u g a r s w e r e i s o l a t e d f r o m i o n - e x c h a n g e r e s i n ( D u o l i t e A - 4 ) b y e l u t i n g w i t h f o r m i c a c i d ( 1 0 % , 5 m l . ) . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s o l v e n t s y s t e m B i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a l d o b i o u r o n i c a c i d a s t h e m a i n c o m p o n e n t w i t h t r a c e s o f mono a n d a l d o t r i o u r o n i c a c i d . A c i d i c s u g a r s (20 m g . ) w e r e c o n v e r t e d i n t o t h e m e t h y l e s t e r m e t h y l g l y c o s i d e s , r e d u c e d w i t h l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e i n b o i l i n g t e t r a h y d r o f u r a n a n d h y d r o l y s e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d . C h r o m a t o g r a p h y o f t h e r e s u l t i n g s y r u p (16 m g . ) i n s o l v e n t s y s t e m B g a v e r i s e t o D - x y l o s e , D - g l u c o s e a n d t r a c e s o f 4 - 0 - m e t h y l - D - g l u c o s e . TABLE 8 FRACTIONS OF POLYSACCHARIDES FROM CORN STALK F r a c t i o n M e t h o d o f E x t r a c t i o n Y i e l d , gm. U r o n i c S p e c i f i c M e t h o x y l P r o t e i n a c i d r o t a t i o n % . [o]22 % % A 0 . 2 N KOH ( a c i d ) E x t . - -B 0 , 2 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 30 . 5 15 . 0 1 - 5 8 . 4 8 ° 1 . 1 2 C 1 .ON KOH ( a c i d ) E x t . - -D 1 .ON KOK ( e t h a n o l ) E x t . 32 . 0 13 . 7 8 - 5 9 . 7 0 ° 0 . 4 2 E 2 . 5 N KOH ( a c i d ) E x t . 1 . 5 8 .11 - 7 0 . 2 0 ° 0 . 5 2 F 2 . 5 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 21 . 0 10 . 9 4 - 6 4 . 3 5 ° 0 . 9 2 - 69 -A q u a n t i t y o f c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e ( 2 . 2 2 g m . ) was d i s s o l v e d i n a l k a l i ( 0 . 2 N s o d i u m h y d r o x i d e ) , a c i d i f i e d w i t h a c e t i c a c i d a n d t h e v o l u m e a d j u s t e d t o 200 m l . To t h e c o o l e d ( 5 ° ) s o l u t i o n was a d d e d 0 . 5 M p e r i o d i c a c i d (50 m l . ) a n d t h e o x i d a t i o n was a l l o w e d t o p r o c e e d a t 5 ° i n t h e d a r k . P e r i o d a t e c o n s u m p t i o n was d e t e r m i n e d p e r i o d i c a l l y a s b e f o r e ( T a b l e 1 0 ) , a n d a f t e r 7 d a y s 0 . 6 5 m o l e s o f p e r i o d a t e h a d b e e n c o n s u m e d p e r m o l e o f s u g a r w i t h no f u r t h e r c h a n g e u p o n l o n g e r s t a n d i n g . Upon r e m o v a l o f t h e p e r i o d a t e a n d i o d a t e i o n s b y p r e c i p i t a t i o n ( b a r i u m c a r b o n a t e ) t h e p o l y a l d e h y d e was r e d u c e d w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e ( 1 . 2 g . ) o v e r n i g h t . T h e s o l u t i o n was n e u t r a l i s e d , e v a p o r a t e d a n d b o r a t e r e m o v e d f r o m t h e p o l y o l b y s e v e r a l t r e a t m e n t s w i t h m e t h a n o l i c h y d r o g e n c h l o r i d e ( 3 % ) . The r e s i d u e was h y d r o l y s e d w i t h 1 N s u l p h u r i c a c i d a t 1 0 0 ° f o r 8 h o u r s . T h e r a t i o o f p o l y h y d r i c a l c o h o l s a n d s u g a r s w e r e d e t e r m i n e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a s t h e i r t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a -t i v e s . T h e m o l a r r a t i o o f e t h y l e n e g l y c o l , g l y c e r o l , e r y t h r i t o l , a n d x y l o s e ( c a l c u l a t e d a s b e f o r e ) was f o u n d t o b e 1 : 4 8 . 5 : 5 . 4 : 1 6 . 8 . C o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e ( 1 . 0 0 g m . ) was m e t h y l a t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y H a k o m o r i ( 1 2 ) . D i f f e r e n t r e a g e n t s , r e q u i r e d f o r t h e r e a c t i o n , w e r e a p p l i e d i n t h e same r a t i o s a s d e s c r i b e d f o r t h e m e t h y l a t i o n o f c o r n l e a f p o l y s a c c h a r i d e . The r e a c t i o n was f o u n d t o b e c o m p l e t e b y one s t e p m e t h y l a t i o n , a s no h y d r o x y l b a n d was o b s e r v e d i n i n f r a r e d s p e c t r u m . C r u d e m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e ( 1 . 2 3 g m . ) was f r a c t i o n a t e d b y g r a d u a l a d d i t i o n o f v a r i o u s m i x t u r e s o f c h l o r o f o r m : p e t r o l e u m e t h e r . R e s u l t s o f f r a c t i o n a t i o n a r e t a b u l a t e d i n T a b l e 1 1 . - 70 -TABLE 9 G A S - L I Q U I D CHROMATOGRAPHIC A N A L Y S I S OF CORN STALK NEUTRAL SUGARS F r a c t i o n M e t h o d o f E x t r a c t i o n A r a b i n o s e X y l o s e % G l u c o s e B 0 . 2 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 1 4 . 1 8 1 . 9 4 . 0 D l . O N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 1 6 . 4 7 8 . 6 5 . 2 E 2 . 5 N KOH ( a c i d ) E x t . 1 2 . 8 8 2 . 6 4 . 6 F 2 . 5 N KOH ( e t h a n o l ) E x t . 1 5 . 7 8 0 . 2 4 . 1 TABLE 10 PERIODATE UPTAKE OF CORN STALK POLYSACCHARIDE T i m e ( h o u r ) M o l e s o f P e r i o d a t e / M o l e s o f S u g a r 1 0 . 0 5 2 0 . 0 8 4 0 . 1 3 5 0 . 1 5 12 0 . 2 3 24 0 . 4 0 48 0 . 5 0 72 0 . 5 6 96 0 . 5 9 144 0 . 6 6 168 0 . 6 5 - 72 -TABLE 11 FRACTIONATION OF METHYLATED CORN STALK POLYSACCHARIDE F r a c t i o n C h l o r o f o r m : W e i g h t [ a ] n M e t h o x y l 1 0 : 1 0 0 0 . 0 0 2 4 2 1 0 : 9 0 0 . 0 3 8 1 3 1 5 . 8 5 0 . 0 5 9 5 - 3 6 . 6 6 2 4 . 0 2 4 2 0 : 8 0 0 . 0 5 1 0 - 5 3 . 9 2 3 2 . 4 6 5 2 5 : 7 5 0 . 8 9 2 5 - 5 7 . 7 6 3 9 . 4 9 6 3 0 : 7 0 0 . 0 9 1 3 - 6 8 . 7 5 3 7 . 6 2 1 F i g u r e 2 4 . S e p a r a t i o n o f p r o d u c t s a s t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s f r o m c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e 1 2 3 5 - t r i - 0 - methyM- -arabinitol , acetate 9 2 3 4 - t n - 0 - m e t h y ! - D - x y l i t o ! ^' ' ' acetate Q 2 3-c l i -0 -methyl-D-xy l i to l J - acetate 4. Mono -O -methy l -D -xy l r td Time, Mm Figure 25. 'Separation of methylated alditol acetates of 45 com stalk polysaccharide - 75 -F r a c t i o n 5 ( T a b l e 11) was s u b s e q u e n t l y u s e d f o r s t r u c t u r a l i n v e s t i g a t i o n . The m e t h y l a t e d p o l y s a c c h a r i d e ( 0 . 8 5 g . ) was h y d r o l y s e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y L i n d b e r g ( 3 0 ) . The a q u e o u s p h a s e was n e u t r a l i s e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e a n d p a s s e d t h r o u g h A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) t o r e m o v e b a r i u m i o n s a n d a c i d i c s u g a r s w e r e a b s o r b e d o n D u o l i t e A - 4 r e s i n s . A m i x t u r e o f n e u t r a l s u g a r s (32 m g . ) was c o n v e r t e d i n t o a l d i t o l a c e t a t e s b y r e d u c t i o n w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e (12 h o u r s ) a n d s u b s e q u e n t a c e t y l a t i o n w i t h a c e t i c a n h y d r i d e . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f p a r t i a l l y m e t h y l a t e d a l d i t o l a c e t a t e s s h o w e d t h e p r e s e n c e o f c o m p o n e n t s w i t h r e t e n t i o n t i m e s i d e n t i c a l t o t h o s e o f a l d i t o l a c e t a t e s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e ; 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 - d i -O - m e t h y l - D - x y l o s e a n d m o n o - O - m e t h y l - D - x y l o s e s . E a c h c o m p o n e n t was c o l l e c t e d a n d s u b j e c t e d t o m a s s s p e c t r o m e t r i c i n v e s t i g a t i o n s . M e t h y l a t e d n e u t r a l s u g a r s f r o m c o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e s (28 m g . ) w e r e c o n v e r t e d i n t o t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s . G a s - l i q u i d c h r o m a t o -g r a p h i c e x a m i n a t i o n o n a c o l u m n o f SE 52 i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f 2 , 3 , 5 - t r i - O - m e t h y l - L - a r a b i n o s e , 2 , 3 , 4 -t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e ; a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e . A n o m e r i c p e a k s o f m o n o - O - m e t h y l s u g a r s w e r e w e l l s e p a r a t e d a n d a n a l y s e d b y mass s p e c t r o m e t r y . P a r t i a l l y m e t h y l a t e d a c i d i c s u g a r s (100 m g . ) w e r e e l u t e d w i t h f o r m i c a c i d ( 1 0 % , 5 m l . ) f r o m D u o l i t e A - 4 r e s i n s . The a c i d i c p a r t i a l l y m e t h y l a t e d s u g a r s (100 m g . ) w e r e e s t e r i f i e d b y r e f l u x i n g w i t h m e t h a n o l i c 20 30 F i g u r e 2 6 . S e p a r a t i o n o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f m e t h y l a t e d s u g a r s ( c o r n s t a l k ) m e t h y l - L - a r a b i n o s e ; 2 . 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l - D - x y l o s e ; 3 x y l o s e , 5 . 2 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e . AO 1 . 2 , 3 , 5 - t r i - 0 -2 , 3 - d i - O - m e t h y l - D - x y l o s e , 4 . 3 - 0 - m e t h y l - D -m i n - 77 -h y d r o g e n c h l o r i d e (3%) a n d t h e e s t e r was r e d u c e d w i t h l i t h i u m a l u m i n i u m h y d r i d e i n t e t r a h y d r o f u r a n . H y d r o l y s i s o f t h e p a r t i a l l y m e t h y l a t e d d i s s a c c h a r i d e (94 m g . ) a n d e x a m i n a t i o n o f t h e p r o d u c t s o n p a p e r c h r o m a t o g r a m u s i n g s o l v e n t s y s t e m A i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t w o c o m p o n e n t s h a v i n g i d e n t i c a l v a l u e s a s t h o s e o f 2 , 3 , 4 - t r i - O - m e t h y l -D - g l u c o s e a n d 3 - 0 - m e t h y l - D - x y l o s e . APPENDIX P R E C I P I T A T I O N OF THE HEMICELLULOSES OF CORN LEAVES AND CORN STALKS I N ETHANOL-WATER MIXTURES - 79 -B i o l o g i c a l p o l y s a c c h a r i d e s o f t e n o c c u r i n m i x t u r e s . I n o r d e r t o s t u d y t h e s e c o m p o u n d s , i t i s o f t e n d e s i r a b l e t o s e p a r a t e t h e m i x t u r e s i n t o c h e m i c a l l y h o m o g e n e o u s p o l y s a c c h a r i d e s . F r a c t i o n a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l h a s b e e n o n e o f t h e common m e t h o d s f o r t h e s e p a r a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s . The s u c c e s s o f t h i s m e t h o d d e p e n d s o n t h e t y p e o f t h e p o l y s a c c h a r i d e a n d a l s o o n t h e r e l a t i v e s o l u b i l i t y o f t h e d i f f e r e n t c o m p o n e n t s p r e s e n t i n t h e m i x t u r e . By u s i n g t h i s m e t h o d , G r a m e r a a n d W h i s t l e r (11) h a v e c l a i m e d t o i s o l a t e a n a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e f r e e f r o m g l u c a n f r o m t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n s t a l k . I n some c a s e s , f r a c t i o n a t i o n h a s a l s o b e e n a c h i e v e d b y p r e c i p i t a t i o n w i t h e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f i n o r g a n i c s a l t s s u c h a s p o t a s s i u m ( 4 7 ) , manganous ( 4 8 ) a n d c a l c i u m ( 4 9 ) . T h i s m e t h o d u s e d i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l f o r t h e i s o l a t i o n o f a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e s ( 4 9 ) . T h e p r e s e n c e o f c a t i o n s , p r o b a b l y , a f f e c t s t h e s o l u b i l i t y o f t h e p o l y -s a c c h a r i d e s c o n t a i n i n g a n i o n i c g r o u p s ( e . g . , COO") i n a q u e o u s e t h a n o l d u e t o t h e f o r m a t i o n o f i o n p a i r s . The d e g r e e o f f o r m a t i o n o f i o n p a i r s i s n e a r l y i n d e p e n d e n t o f t h e p o l y m e r a n d s a l t c o n c e n t r a t i o n a n d i s o n l y d e t e r m i n e d b y t h e p r o p e r t i e s o f t h e p o l y m e r a n d t h e t y p e o f t h e c o u n t e r i o n ( 5 0 , 5 1 ) . H o w e v e r , i n many c a s e s , a d d i t i o n o f i n o r g a n i c i o n s e i t h e r d o e s n o t l e a d t o p r e c i p i t a t i o n o r c a u s e s t h e f o r m a t i o n o f g e l s o c c u p y i n g m o s t o f t h e v o l u m e , t h u s p r e v e n t i n g f r a c t i o n a t i o n . I n t h e p r e s e n t w o r k a t t e m p t s w e r e made t o i s o l a t e a n a c i d i c p o l y m e r f r e e f r o m g l u c a n b y f r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n o f t h e h e m i c e l l u l o s e s o f c o r n l e a v e s a n d c o r n s t a l k s i n e t h a n o l - w a t e r m i x t u r e s . T h e f r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n was a l s o c a r r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s . H o w e v e r , i t was n o t p o s s i b l e t o i s o l a t e a n a c i d i c p o l y m e r f r e e f r o m g l u c a n . No p o s i t i v e e f f e c t o f c a l c i u m i o n s o n t h e p r e c i p i t a t i o n o f - 80 -t h e p o l y s a c c h a r i d e was o b s e r v e d i n t h i s p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n . - 81 -EXPERIMENTAL P r e c i p i t a t i o n o f t h e H e m i c e l l u l o s e s o f C o r n L e a v e s : C o r n l e a f h e m i c e l l u l o s e ( 0 . 5 0 g . ) was d i s s o l v e d i n s o d i u m h y d r o x i d e (1 N , 20 m l . ) , e x c e s s a l k a l i b e i n g n e u t r a l i s e d b y a d d i n g a c e t i c a c i d (1 N , 20 m l . ) . The f i n a l p H was a d j u s t e d t o 7 . 0 a n d t h e f i n a l v o l u m e o f t h e s o l u t i o n was a d j u s t e d t o 50 m l . T h e h e m i c e l l u l o s e s o l u t i o n (50 m l . ) was d i v i d e d i n t o t w o e q u a l p o r t i o n s . To o n e h a l f i n o r g a n i c _2 i o n (1 x 10 gm. e q u i v a l e n t o f C a C ^ / l i t r e ) was a d d e d . No s a l t was a d d e d t o t h e o t h e r h a l f o f t h e h e m i c e l l u l o s e s o l u t i o n . T h e h e m i c e l l u l o s e s o l u t i o n s w e r e f r a c t i o n a l l y p r e c i p i t a t e d a t p H 7 . 0 b y g r a d u a l a d d i t i o n o f e t h a n o l ( 9 5 % ) , t h e m i x t u r e s b e i n g s t i r r e d c o n t i n u o u s l y a t t h e t i m e o f e a c h a d d i t i o n . The f r a c t i o n s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n when d i s t i n c t p r e c i p i t a t e s w e r e f o r m e d , w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t h a c e t o n e a n d p e t . e t h e r ( 3 0 - 6 0 ° C ) . S a l t s w e r e r e m o v e d b y d i s s o l v i n g t h e f r a c t i o n s i n w a t e r ( c a . 50 m l . ) w h i c h w e r e s u b s e q u e n t l y d e i o n i s e d b y p a s s a g e t h r o u g h c a t i o n - e x c h a n g e r e s i n A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) a n d r e c o v e r e d b y f r e e z e d r y i n g t h e a q u e o u s s o l u t i o n . A p o r t i o n o f e a c h f r a c t i o n (10 m g . ) was h y d r o l y s e d w i t h s u l p h u r i c a c i d (1 N , 5 m l . ) f o r a p e r i o d o f 8 h r s . a t 1 0 0 ° C . The h y d r o l y s a t e was n e u t r a l i z e d w i t h b a r i u m c a r b o n a t e , d e i o n i s e d b y p a s s a g e t h r o u g h a c a t i o n e x c h a n g e r e s i n A m b e r l i t e I R - 1 2 0 ( H + ) a n d e x a m i n e d o n a p a p e r c h r o m a t o g r a m u s i n g s o l v e n t s y s t e m B f o r 18 h r s . S p o t s c o r r e s -p o n d i n g t o x y l o s e , a r a b i n o s e a n d g l u c o s e ( i n t r a c e s ) w e r e o b s e r v e d i n t h e p a p e r c h r o m a t o g r a m o f e a c h f r a c t i o n . The u r o n i c a c i d c o n t e n t o f t h e m a j o r f r a c t i o n ( F r a c t i o n 2 , T a b l e 12) was f o u n d t o b e 1 2 . 2 % w h i c h i s - 82 -TABLE 12 FRACTIONATION OF CORN LEAF POLYSACCHARIDES I N ETHANOL-WATER MIXTURES F r a c t i o n E t h a n o l A d d e d (%) Amount o f t h e H e m i c e l l u l o s e P r e c i p i t a t e d % W i t h C a + + W i t h o u t C a + + 1 28 12 16 2 37 50 36 3 45 5 4 4 50 16 18 5 55 6 12 6 65 6 4 A t y p i c a l p r e c i p i t a t i o n c u r v e s i s shown i n F i g . 2 7 . a l m o s t t h e same a s t h a t o f t h e o r i g i n a l p o l y s a c c h a r i d e ( T a b l e 2 ) . T h e r a t i o among x y l o s e , a r a b i n o s e a n d g l u c o s e o f F r a c t i o n 2 ( T a b l e 12) d e t e r m i n e d b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a s b e f o r e ( p . 43 ) , was 22 f o u n d t o b e 8 0 : 1 5 : 5 . T h e f r a c t i o n h a d [ a ] D - 5 8 . 0 ° . P r e c i p i t a t i o n o f t h e H e m i c e l l u l o s e s o f C o r n S t a l k s C o r n s t a l k p o l y s a c c h a r i d e ( 5 . 0 g . ) was d i s s o l v e d i n s o d i u m h y d r o x i d e (1 N , 50 m l . ) . E x c e s s a l k a l i was n e u t r a l i s e d b y t h e a d d i t i o n o f a c e t i c a c i d . T h e f i n a l v o l u m e was a d j u s t e d t o 150 m l . , t h e f i n a l p H b e i n g 7 . 0 . T h e h e m i c e l l u l o s e s o l u t i o n was d i v i d e d i n t o two e q u a l Pig. 27 1 6 2 0 4 0 6 0 ETHANOL, (%) - 84 -h a l v e s (75 m l . e a c h ) . To o n e h a l f o n l y c a l c i u m i o n ( 0 . 0 1 gm. e q u i v . / l i t r e ) was a d d e d . The h e m i c e l l u l o s e s o l u t i o n s w e r e f r a c t i o n a t e d b y t h e g r a d u a l a d d i t i o n o f 95% e t h a n o l , a n d e a c h f r a c t i o n was r e m o v e d a n d d r i e d i n t h e u s u a l w a y . A s m a l l q u a n t i t y o f e a c h f r a c t i o n ( c a . 10 m g . ) was h y d r o l y z e d w i t h s u l p h u r i c a c i d (1 N , 5 m l . ) a t 1 0 0 ° C f o r 8 h r s . T h e h y d r o l y s a t e a f t e r b e i n g n e u t r a l i s e d a n d d e i o n i s e d , a s b e f o r e , was e x a m i n e d o n a p a p e r c h r o m a t o g r a m u s i n g s o l v e n t S y s t e m B f o r 18 h r s . E a c h f r a c t i o n c o n t a i n e d m a i n l y x y l o s e ^ a r a b i n o s e a n d t r a c e s o f g l u c o s e . The u r o n i c a c i d c o n t e n t o f t h e m a j o r f r a c t i o n ( F r a c t i o n 2 , T a b l e 14) was f o u n d t o b e 1 4 . 0 % w h i c h i s c l o s e t o t h a t o f t h e o r i g i n a l p o l y s a c c h a r i d e ( T a b l e 8 ) . TABLE 13 FRACTIONAL P R E C I P I T A T I O N OF CORN STALK POLYSACCHARIDES IN ETHANOL-WATER MIXTURES F r a c t i o n E t h a n o l Amount o f t h e H e m i c e l l u l o s e P r e c i p i t a t e d A d d e d (%) % W i t h C a + + W i t h o u t C a + + 1 30 3 4 2 37 49 50 3 4 2 7 7 4 46 16 13 5 50 4 8 6 53 13 9 7 60 3 1 A t y p i c a l p r e c i p i t a t i o n c u r v e s h o w n i n F i g . 2 8 . - 86 -REFERENCES 1 . G . O . A s p i n a l l , A d v a n . C a r b o h y d r a t e C h e m . , 14_, 4 2 9 ( 1 9 5 9 ) . 2 . T . E . T i m e l l , A d v a n . C a r b o h y d r a t e C h e m . , 19_, 247 ( 1 9 6 4 ) . 3 . R . L . W h i s t l e r a n d C . C . T u , J . Am. Chem. S o c , 74_, 3 6 0 9 ( 1 9 5 2 ) ; 7 5 , 6 4 5 ( 1 9 5 3 ) . 4 . R . L . W h i s t l e r a n d G . E . L a u t e r b a c h , J . Am. Chem. S o c , 8 0 , 1987 ( 1 9 5 8 ) . 5 . R . L . W h i s t l e r a n d W . M . C o r b e t t , J . Am. C h e m . S o c , 77_, 6328 ( 1 9 5 5 ) . 6 . R . L . W h i s t l e r a n d J . N . B e M i l l e r , J . Am. C h e m . S o c , 78_, 1163 ( 1 9 5 6 ) 7 . R. M o n g o m e r y , F . S m i t h a n d H . C . S r i v a s t a v a , J . Am. Chem. S o c , 79_, 698 ( 1 9 5 7 ) . 8 . H . C . S r i v a s t a v a a n d F , S m i t h , J . Am. Chem. S o c , 79_, 9 8 2 ( 1 9 5 7 ) . 9 . H . D . W e i h e a n d M . P h i l i p s , J . A g r . R e s . 6 4 , 4 0 1 ( 1 9 4 2 ) . 1 0 . E . B e n n e t t , . A r c h . B i o c h e m . 27_, 99 ( 1 9 5 0 ) . 1 1 . R . E . G r a m e r a a n d R . L . W h i s t l e r , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 0 1 , 75 ( 1 9 6 3 ) . 1 2 . S . H a k o m o r i , J . B i o c h e m . , 55_, 205 ( 1 9 6 4 ) . 1 3 . N . K . K o c h e t k o v a n d O . S . C h i z h o v , A d v a n . C a r b o h y d r a t e C h e m . , 21_, 39 ( 1 9 6 6 ) . 1 4 . Don C . De J o n g h a n d K. B i e m a n n , J . Am. Chem. S o c , 85_, 2289 ( 1 9 6 3 ) . 1 5 . H . B j o r n d a l , B . L i n d b e r g , a n d S . S v e n s s o n , C a r b o h y d . R e s . , 5_, 4 3 3 ( 1 9 6 7 ) . 1 6 . G. P e t e r s s o n a n d 0 . S a m u e l s o n , S v e n s k P a p p e r s t i n d n i n g a r g . 71_, 77 ( 1 9 6 8 ) . 1 7 . G . G . S . D u t t o n , K . B . G i b n e y , G . D . J e n s e n a n d P . E . R e i d , J . C h r o m a t o g . , 3 6 , 152 ( 1 9 6 8 ) . - 87 -1 8 . R . D . L a m b e r t . P h . D . T h e s i s , The I n s t i t u t e o f P a p e r C h e m i s t r y , L a w r e n c e U n i v e r s i t y . 1 9 . L. M a l a p r a d e , B u l l . S o c . C h i m . , ( F r a n c e ) , 683 ( 1 9 2 8 ) . 2 0 . P . F l e u r y a n d J . L a n g e , C o m p t . r e n d . , 1 9 5 , 1395 ( 1 9 3 2 ) . 2 1 . R. C r i e g e e , S i t z b e r . G e s . B e f o r d e r . G e s . N a t u r w . M a r b u r g , 6 9 , 25 ( 1 9 3 4 ) ; Chem. A b s t . , 2 9 , 6 8 2 0 ( 1 9 3 5 ) . 2 2 . G . J . B u i s t , C A . B u n t o n , a n d J . H . M i l e s , J . Chem. S o c , 4 5 7 5 ( 1 9 5 7 ) . 2 3 . J . K l a n i n g a n d M . C . R . S y m o n s , J . Chem. S o c , 977 ( 1 9 6 0 ) . 2 4 . G . J . B u i s t a n d C A . B u n t o n , J . C h e m . S o c , 1406 ( 1 9 5 4 ) . 2 5 . C . C . P r i c e a n d H . K r o l l , J . Am. Chem. S o c , 7 6 , 3 8 0 3 ( 1 9 5 4 ) . 2 6 . C . E . C r o u t h a m e l , A . M . H a y e s , a n d D . S . M a r t i n , J . Am. Chem. S o c , 73_, 82 ( 1 9 5 1 ) . 2 7 . S . J . A n g y a l a n d J . E . K l a v i n s , A u s t r a l , J . C h e m . , 14_, 577 ( 1 9 6 1 ) . 2 8 . I . J . G o l d s t e i n , G . W . H a y , B . A . L e w i s a n d F . S m i t h , A m e r . C h e m . S o c . M e e t i n g , B o s t o n , A p r i l 1 9 5 9 , A b s . P a p e r s , 3 D . 2 9 . E . J . C o r e y a n d M . C h a y k o v s k y , J . Am. Chem. S o c , 84_, 866 ( 1 9 6 2 ) . 3 0 . M . C h a y k o v s k y a n d E . J . C o r e y , J . O r g . C h e m . , 2 8 , 254 ( 1 9 6 2 ) . 3 1 . I . C r o o n , G . H e r r s t r o m , G . K u l l , a n d B . L i n d b e r g , A c t a . C h e m . S c a n d . 1_4, 1338 ( 1 9 6 0 ) . 3 2 . D . G . L a n c e a n d J . K . N . J o n e s , C a n . J . C h e m . , 45_, 1995 ( 1 9 6 7 ) . 3 3 . H . B j o r n d a l , B . L i n d b e r g , a n d S . S v e n s s o n , A c t a Chem. S c a n d . , 21_, 1801 ( 1 9 6 7 ) . 3 4 . P . D . B r a g g a n d L. H o u g h , J . Chem. S o c , 4347 ( 1 9 5 7 ) . 3 5 . H . H . S e p h t o n , J . O r g . C h e m . , 2 9 , 3 4 1 5 ( 1 9 6 4 ) . 3 6 . O . S . C h i z h o v , N . V . M o l o d t s o v a n d N . K . K o c h e t k o v . C a r b o h y d . R e s . 4 , 273 ( 1 9 6 7 ) . - 88 -3 7 . O . S . C h i z h o v , B . A . D m i t r i e v , B . M . Z o l o t a r e v , A . Y a . C h e r n y a k , a n d N . K . K o c h e t k o v , O r g . M a s s . S p e c . 2, 947 ( 1 9 6 9 ) . 3 8 . A . G . S h a r k e y , R . A . F r i e d e l , a n d S . H . L a n g e r , A n a l . Chem. 29_, 770 ( 1 9 5 7 ) . 3 9 . R. M o n t g o m e r y a n d F . S m i t h , J . Am. Chem. S o c , 77_, 3 3 2 5 ( 1 9 5 5 ) . 4 0 . 0 . W i n t e r s t e i n e r a n d A . K l i n s b e r g , J . Am. Chem. S o c , 7 1 , 9 3 9 ( 1 9 4 9 ) . 4 1 . C . P . J . G l a u d e m a n s a n d T . E . T i m e l l , J . Am. C h e m . S o c , 80_, 1209 ( 1 9 5 8 ) . 4 2 . G . J . R o b e r t s o n a n d T . H . S p e e d i e , J . Chem. S o c , 824 ( 1 9 3 4 ) . 4 3 . R . J . M c l l r o y , J . Chem. S o c , 100 ( 1 9 4 6 ) . 4 4 . P . A . L e v e n e a n d A . L . R y a m o n d , J . B i o l . C h e m . , 1 0 2 , 331 ( 1 9 3 3 ) . 4 5 . J . C . I r v i n e a n d J . W . H . O l d h a m , J . Chem. S o c , 1 1 9 , 1744 ( 1 9 2 1 ) . 4 6 . R . A . L a i d l a w , J . Chem. S o c , 752 ( 1 9 5 4 ) . 4 7 . B . S m i t h a n d W . H . C o o k . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 4 5 , 232 ( 1 9 5 3 ) . 4 8 . R . H . M c D o w e l l , Chem. I n d . ( L o n d o n ) , 1 9 5 8 , 1 4 0 1 . 4 9 . 0 . S m i d s r ^ d a n d A . H a u g , J . P o l y m e r . S c i . P a r t C . 1 6 , 1587 ( 1 9 6 7 ) 5 0 . M . N a g a o a w a , M . I z u m i , a n d I . K a g a w a , J . P o l y m e r S c i . , 3 7 , 375 ( 1 9 5 9 ) . 5 1 . Z . A l e x a n d r o w i c z , J . P o l y m e r S c i . , 5 6 , 97 ( 1 9 6 2 ) . 

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