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ESR spin probe and spin labelled studies of cardiolipin Yip, Louie Foon 1981

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831-UBC_1981_A6_7 Y56.pdf [ 3.18MB ]
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ESR S P I N PROBE AND S P I N L A B E L L E D STUDIES OF C A R D I O L I P I N BY L O U I E FOON JTIP B . S c . U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1977 A T H E S I S SUBMITTED IN P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF S C I E N C E IN THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA J U L Y , 1981 © L o u i e F o o n Y i p , 1981 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an advanced degree a t the U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I ag r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and s t u d y . I f u r t h e r agree t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d by t h e head o f my department o r by h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . Department o f CHEMISTRY  The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2075 Wesbrook P l a c e V ancouver, Canada V6T 1W5 Date AUG 18 1981 i i ABSTRACT T h e p h o s p h o l i p i d , d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( c a r d i o l i p i n ) f o r m s l i q u i d - c r y s t a l l i n e p h a s e s h a v i n g l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l s t r u c t u r e s d e p e n d i n g on t h e a m o u n t o f w a t e r , t h e t e m p e r a t u r e a n d t h e p r e s e n c e o f c a t i o n s . ESR s t u d i e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r a n d . t h e h e x a g o n a l p h a s e s u s i n g t h e 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e w e r e r e p e a t e d t o r e s o l v e a d i s c r e p e n c y i n t h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e s p i n p r o b e was f u r t h e r u s e d t o f o l l o w t h e l a m e l l a r t o h e x a g o n a l p h a s e t r a n s i t i o n o f c a r d i o l i p i n a s t h e Ca' 2* c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d f r o m 0.0 t o 50 m o l e % o f C a 2 * . C a r d i o l i p i n h a s b e e n s p i n l a b e l l e d a t t h e p o l a r h e a d g r o u p by r e a c t i o n w i t h ( 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 -c a r b o x y l ) - p - t o l u e n e s u l f o n a t e . T h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n ( S L C L ) was c h a r a c t e r i z e d u s i n g T L C a n d ESR. T h e S L C L was u s e d i n t h e ESR s t u d y o f c a r d i o l i p i n i n t h e v a r i o u s p h a s e s . T h e r e s u l t s f r o m t h i s work i n d i c a t e w i t h t h e u s e o f s p i n p r o b e s a n d s p i n l a b e l s , i t i s p o s s i b l e t o d i s t i n q u i s h t h e d i f f e r e n t p h a s e s o f c a r d i o l i p i n . F u r t h e r m o r e t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t n o n - b i l a y e r s t r u c t u r e s e x i s t b e t w e e n 9 t o 29 m o l e % o f C a 2 * . T h e d a t a c a n be i n t e r p r e t e d i n t e r m s o f a t e m p e r a t u r e i n d u c e d l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n o f i n v e r t e d m i c e l l e s . i i ABSTRACT T h e p h o s p h o l i p i d , d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( c a r d i o l i p i n ) f o r m s l i q u i d - c r y s t a l l i n e p h a s e s h a v i n g l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l s t r u c t u r e s d e p e n d i n g on t h e amount o f w a t e r , t h e t e m p e r a t u r e a n d t h e p r e s e n c e o f c a t i o n s . ESR s t u d i e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r a n d . t h e h e x a g o n a l p h a s e s u s i n g t h e 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e w e r e r e p e a t e d t o r e s o l v e a d i s c r e p e n c y i n t h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e s p i n p r o b e was f u r t h e r u s e d t o f o l l o w t h e l a m e l l a r t o h e x a g o n a l p h a s e t r a n s i t i o n o f c a r d i o l i p i n a s t h e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d f r o m 0.0 t o 50 m o l e % o f C a 2 + . C a r d i o l i p i n h a s b e e n s p i n l a b e l l e d a t t h e p o l a r h e a d g r o u p by r e a c t i o n w i t h ( 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 -c a r b o x y l ) - p - t o l u e n e s u l f o n a t e . T h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n ( S L C L ) was c h a r a c t e r i z e d u s i n g T L C a n d ESR. T h e S L C L was u s e d i n t h e ESR s t u d y o f c a r d i o l i p i n i n t h e v a r i o u s p h a s e s . T h e r e s u l t s f r o m t h i s work i n d i c a t e w i t h t h e u s e o f s p i n p r o b e s a n d s p i n l a b e l s , i t i s p o s s i b l e t o d i s t i n q u i s h t h e d i f f e r e n t p h a s e s o f c a r d i o l i p i n . F u r t h e r m o r e t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t n o n - b i l a y e r s t r u c t u r e s e x i s t b e t w e e n 9 t o 29 m o l e % o f C a 2 + . T h e d a t a c a n be i n t e r p r e t e d i n t e r m s o f a t e m p e r a t u r e i n d u c e d l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n o f i n v e r t e d m i c e l l e s . T A B L E OF CONTENTS P a g e ABSTRACT * - -L I S T OF T A B L E S v L I S T OF FIGURES v i ACKNOWLEDGEMENT v i i i 1. INTRODUCTION 1 2 . THEORY 10 2.1 E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e o f N i t r o x i d e R a d i c a l s 10 2.2 ESR S p e c t r a o f N i t r o x i d e s 10 2.3 A n a l y s i s o f ESR S p e c t r a 15 3. EXPERIMENTAL 22 3.1 P r e p a r a t i o n o f 2 , 2 , 5 , 5 -t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 -c a r b o x y l i c A c i d {V} 22 3.2 P r e p a r a t i o n o f S p i n L a b e l l e d C a r d i o l i p i n 24 3.3 D e t e r m i n a t i o n o f S p i n H a m i l t o n i a n P a r a m e t e r s o f {V} 27 3.4 S a m p l e P r e p a r a t i o n 29 3.5 M a n i p u l a t i o n o f S a m p l e s 30 3.6 T h e R e c o r d i n g o f ESR S p e c t r a 30 i v 4 . R E S U L TS 31 4.1 S p i n P r o b e S t u d i e s o f C a r d i o l i p i n i n t h e L a m e l l a r P h a s e . . . . i 31 4.2 S p i n P r o b e S t u d i e s o f C a r d i o l i p i n i n t h e H e x a g o n a l P h a s e 31 4.3 S p i n P r o b e S t u d i e s o f M i x e d P h a s e s 35 4.4 ESR S p i n P r o b e S t u d i e s o f t h e H e x a g o n a l P h a s e i n t h e P r e s e n c e o f E x c e s s C a 2 + 38 4.5 T h e D e t e r m i n a t i o n o f S p i n H a m i l t o n i a n P a r a m e t e r s 41 4.6 C o n t r o l S t u d i e s o f S p i n P r o b e {V} 46 4.7 S L C L i n C h l o r o f o r m 46 4.8 S L C L i n L a m e l l a r P h a s e 50 4.9 S L C L i n H e x a g o n a l P h a s e 50 4.10 S L C L i n H e x a g o n a l P h a s e w i t h E x c e s s o f C a 2 + 54 4.11 S L C L i n M i x e d P h a s e s 57 5. D I S C U S S I O N AND CONCLUSIONS 59 5.1 ESR S t u d i e s o f t h e L a m e l l a r a n d H e x a g o n a l P h a s e s o f C a r d i o l i p i n 59 5.2 ESR S t u d i e s o f C a r d i o l i p i n w i t h V a r i n g A m o u n t s a n d C o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + 63 5.3 C o n c l u s i o n s 73 BIBLIOGRAPHY 75 V L I S T OF T A B L E S T a b l e Page 4.1 C o r r e l a t i o n t i m e s ~TTQ a n d "**Cc f ° r t h e . c o n t r o l s t u d i e s o f t h e s p i n p r o b e {V} 48 5.1 O r d e r p a r a m e t e r s S f o r 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e v a r i o u s p h a s e s o f c a r d i o l i p i n 69 v i L I S T OF FIGURES F i g u r e Page 1.1 O r i g i n a l s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n p r o p o s e d by P a n g b o r n 3 1.2 G e n e r a l s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n 3 1.3 L i p i d s t r u c t u r e a n d c o r r e s p o n d i n g m o l e c u l a r s h a p e 5 1.4 H e x a g o n a l a n d l a m e l l a r p h a s e s o f c a r d i o l i p i n w i t h s t r u c t u r a l d i m e n s i o n s 8 1.5 G e n e r a l s t r u c t u r e o f s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n 8 2.1 N i t r o x i d e s p i n m o i e t y 11 2.2 ESR s p e c t r a o f s p i n p r o b e i n r i g i d m a t r i x 14 2.3 ESR s p e c t r u m o f a p o l y c r y s t a l l i n e s o l u t i o n o f a n i t r o x i d e 16 2.4 S t r u c t u r e o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e 20 4.1 ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e o f c a r d i o l i p i n a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e s 32 4.2 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f T,', o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e c a r d i o l i p i n l a m e l l a r p h a s e 33 4.3 ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e h e x a g o n a l p h a s e 34 4.4 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f T,', o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e • i n t h e c a r d i o l i p i n h e x a g o n a l p h a s e . ..' 36 4.5 ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e ' o r d e r e d l a m e l l a r p h a s e ' 37 4.6 T,', v s t e m p e r a t u r e f o r 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e w i t h v a r i o u s m o l e % o f C a 2 * 39 4.7 A r e s o l v e d ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e m i x e d p h a s e . 40 v i i 4.8 ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d - s p i n p r o b e i n t h e h e x a g o n a l p h a s e a t v a r i o u s C a 2 * c o n c e n t r a t i o n 42 4.9 T,\ v s t e m p e r a t u r e . f o r 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e h e x a g o n a l p h a s e w i t h v a r i e d C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s 43 •4.10 ESR s p e c t r u m o f s p i n p r o b e {V} i n 30% g l y c e r o l a n d DgO 44 4.11 S i m u l a t e d s p e c t r u m o f s p i n p r o b e {V} i n 30% g l y c e r o l a n d D_0 45 4.12 ESR s p e c t r u m o f s p i n p r o b e {V} i n c h l o r o f o r m s o l u t i o n 47 4.13 ESR s p e c t r u m o f s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n i n c h l o r o f o r m s o l u t i o n 49 4.14 ESR s p e c t r a o f s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r p h a s e - 51 4.15 C o r r e l a t i o n t i m e t T 6 a n d "cTc v s t e m p e r a t u r e f o r S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e , 52 4.16 ESR s p e c t r a o f s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n i n t h e h e x a g o n a l p h a s e 53 4.17 ESR s p e c t r a o f S L C L i n t h e h e x a g o n a l p h a s e a t v a r i o u s C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s 55 4.18 T,', v s t e m p e r a t u r e f o r S L C L i n t h e h e x a g o n a l p h a s e w i t h v a r i e d C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s 56 4.19 ESR s p e c t r u m o f S L C L i n m i x e d p h a s e s 58 5.1 S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e i n d i c a t i n g i t s p r e f e r r e d m o t i o n 62 5.2 M o d e l f o r t h e p h a s e t r a n s i t i o n f r o m t h e l a m e l l a r p h a s e t o t h e h e x a g o n a l p h a s e w i t h t h e a d d i t i o n o f C a 2 * 65 5.3 O r d e r p a r a m e t e r S v s m o l e % o f C a 2 * f o r t h e 5-d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e c a r d i o l i p i n a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e 69 5.4 M o d e l f o r t h e l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n o f C a 2 * -c a r d i o l i p i n ....70 v i i i ACKNOWLEDGEMENT F i r s t , I w i s h t o e x p r e s s my s i n c e r e g r a t i t u d e t o my s u p e r v i s o r , D r . F . G. H e r r i n g , f o r h i s c o n t i n u a l g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s w o r k . I w i s h t o t h a n k D r . A. S t o r r f o r t h e l o a n o f h i s l a b o r a t o r y e q u i p m e n t . I am a l s o g r a t e f u l t o P a u l P h i l l i p s f o r h i s h e l p a n d i n t e r e s t i n my w o r k . 1 CHAPTER 1  INTRODUCTION T h e p h o s p h o l i p i d , d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( c a r d i o l i p i n ) was f i r s t i s o l a t e d f r o m b e e f h e a r t a n d p a r t i a l l y p u r i f i e d by M a r y C. P a n g b o r n [ 1 ] . P a n g b o r n d e m o n s t r a t e d t h a t c a r d i o l i p i n was i d e n t i c a l t o t h e a c t i v e l i p i d a n t i g e n i n t h e s e r o d i a g n o s i s o f s y p h i l i s p r e v i o u s l y f o u n d by W a s s e r m a n n e t a l [ 2 , 3 ] . C a r d i o l i p i n w i t h l e c i t h i n a n d c h o l e s t e r o l i n a p r o p e r l y b a l a n c e d m i x t u r e ( a b o u t 1:9:60 by m o l a r r a t i o ) e x h i b i t s a s p e c i f i c c o m p l e m e n t -f i x i n g a c t i v i t y w i t h s e r a f r o m s y p h i l i t i c p a t i e n t s r e s e m b l i n g t h e a c t i v i t y o f b e e f h e a r t e x t r a c t s p r e p a r e d f o r d i a g n o s t i c u s e [ 4 ] , T h i s s p u r r e d f u r t h e r work on t h e p u r i f i c a t i o n a n d s t r u c t u r e d e t e r m i n a t i o n o f c a r d i o l i p i n . C a r d i o l i p i n ( C L ) i s f o u n d i n many d i f f e r e n t t y p e s o f t i s s u e s : mammalian t i s s u e s , f i s h a n d a v i a n m u s c l e s , p l a n t l e a v e s a n d a l g a e , i n v e r t e b r a t e s a n d p r o t o z o a , y e a s t a n d b a c t e r i a [ 5 , 6 ] . I n m ammalian t i s s u e s c a r d i o l i p i n i s f o u n d , m a i n l y w i t h u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d a c y l c h a i n s , c o n s t i t u t i n g 2-10% o f t o t a l p h o s p h o l i p i d . C a r d i o l i p i n f r o m b a c t e r i a c o n t a i n s m o s t l y s a t u r a t e d f a t t y a c i d a c y l c h a i n s a n d t h o s e f r o m p l a n t s h a v e v a r i o u s a m o u n t s o f s a t u r a t e d a n d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . I n human o r g a n s , c a r d i o l i p i n i s f o u n d t o t h e g r e a t e s t e x t e n t i n h e a r t a n d s k e l e t a l m u s c l e s . I n g e n e r a l c a r d i o l i p i n i s c h a r a c t e r i s t i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h s u b c e l l u l a r m embraneous p a r t i c l e s d i s p l a y i n g h i g h m e t a b o l i c a c t i v i t y , e s p e c i a l l y t h e m i t o c h o n d r i a o f a n i m a l t i s s u e s , p l a n t s a n d y e a s t . 2 T h e s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n h a s b e e n t h e s u b j e c t o f many i n v e s t i g a t i o n s . T h e o n e o r i g i n a l l y p r o p o s e d by P a n g b o r n f o r c a r d i o l i p i n f r o m b e e f h e a r t i s i n f i g u r e 1.1 [ 7 ] . T h i s s t r u c t u r e w i t h one. o l e i c a n d f i v e l i n o l e i c a c i d r e s i d u e s a g r e e d w i t h t h e a v a i l a b l e a n a l y t i c a l d a t a . T h e g l y c e r o l / p h o s p o r u s / f a t t y a c i d r a t i o i s 4:3:6. T h e s u g g e s t e d s t r u c t u r e c o n t a i n e d a b a c k b o n e o f GPGPGPG ( G = g l y c e r o l , P = p h o s p o r i c a c i d ) i n w h i c h t h e s i x h y d r o x y l g r o u p s a r e a c y l a t e d . W i t h more i m p r o v e d p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s o f c a r d i o l i p i n t h e g l c e r o l / p h o s p h o r u s / f a t t y a c i d r a t i o . w a s f o u n d e d t o be 3:2:4 w i t h v a r y i n g f a t t y a c y l c h a i n s . T h e p r o p o s e d g e n e r a l s t r u c t u r e f o r c a r d i o l i p i n i s shown i n f i g u r e 1.2 [ 5 , 8 ] , Th e s t r u c t u r e f o r b e e f h e a r t c a r d i o l i p i n i s a GPGPG b a c k b o n e w i t h v a r i a b l e R1, R2, R3, a n d R4. T h e same GPGPG s k e l e t o n was f o u n d f o r c a r d i o l i p i n f r o m p l a n t s . C a r d i o l i p i n f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s e x h i b i t s v a r i a b i l i t y i n t h e f a t t y a c y l c h a i n s a t t a c h e d t o t h e common g l y c e r o l a n d p h o s p h a t e g r o u p i n g . F o r e x a m p l e , t h e f a t t y a c i d c o m p o s t i o n o f c a r d i o l i p i n f r o m b e e f h e a r t i s f o u n d t o be m a i n l y o l e i c a c i d a n d l i n o l e i c a c i d , 12% a n d 8 0 % r e s p e c t i v e l y . T h e s t u d y o f d i f f e r e n t o r g a n s o f v a r i o u s mammals showed t h a t , t y p i c a l l y , c a r d i o l i p i n i n m ammalian t i s s u e s i s u n s a t u r a t e d . T h e a c y l c h a i n s f o u n d a r e c o m p o s e d o f 6 0 - 8 0 % l i n o l e i c a c i d a n d 1 0 -20% o l e i c a c i d . F o r w h o l e t i s s u e s o f p l a n t o r i g i n , t h e f a t t y a c i d h a d a c o m p o s i t i o n r a n g e o f : p a l m i t i c a c i d 10-34% s t e a r i c 1-14%, o l e i c 5-15%, l i n o l e i c 2 0 - 6 0 % a n d l i n o l e n i c f r o m 0-57%. Many r e s e a r c h s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d i n a n a t t e m p t t o c o r r e l a t e t h e e x i s t e n c e o f c a r d i o l i p i n w i t h a f u n c t i o n a l r o l e e i t h e r i n m i t o c h o n d r i a l o r p r o k a r y o t i c membranes. No c o n c l u s i o n s 3 R C O O -R C O O -o-p-o-- O C O R •O7P-O-• O C O R r - O C O R - O C O R L - C H R r O - J ' o//Xo-F i g u r e l . 1 O r i g i n a l s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n p r o p o s e d by P a n g b o r n . R C O O -R C O O -O - T R - O -o7/ V -o-p-o-- O H - O C O R " - O C O R F i g u r e 1.2 G e n e r a l s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n . 4 h a v e y e t b e e n r e a c h e d , b u t many s u g g e s t i o n s h a v e b e e n e x t r a p o l a t e d f r o m m o d e l o r i n v i t r o e x p e r i m e n t s [ 5 , 8 , 9 ] . T h e q u e s t i o n t h a t p r o v i d e d t h e i m p e t u s f o r t h i s work i s t h e r o l e o f c a r d i o l i p i n i n e r y t h r o c y t e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e [ 9 ] , T h e l i p o p r o t e i n e r y t h r o c y t e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e c a t a l y z e s a c e t y l c h o l i n e h y d r o l y s i s on t h e o u t e r s u r f a c e o f t h e c e l l membrane. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e f r o m b o v i n e e r y t h r o c y t e s g a v e a n o n - l i n e a r A r r h e n i u s p l o t ( l o g o f i t s a c t i v i t y v s 1 / T ) . The b r e a k i n t h e A r r h e n i u s p l o t d i s a p p e a r e d a n d t h e a c t i v i t y d e c r e a s e d when t h e l i p o p r o t e i n was t r e a t e d w i t h h i g h s a l t a n d C a 2 + - c h e l a t i n g r e a g e n t s . T h e l i p i d c a r d i o l i p i n was l o s t f r o m a c e t y l c h o l i n e s t e r e a s e d u r i n g t h i s p r o c e d u r e . A d d i t i o n o f c a r d i o l i p i n t o t h e enyzme i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m c h l o r i d e r e s t o r e d t h e b r e a k i n t h e A r r h e n i u s p l o t a n d i t s a c t i v i t y . T h e s t r u c t u r e o f t h e c a r d i o l i p i n s p e c i e s i n t h e l i p o p r o t e i n c o m p l e x i s unknown, a n d i t was f e l t t h a t a s p i n l a b e l s t u d y may h e l p i n e l u c i d a t i n g t h i s . P h o s p h o l i p i d s i n t h e p r e s e n c e o f w a t e r i n t h e i r h y d r a t e d s t a t e a g g r e g a t e t o f o r m l a r g e m u l t i m o l e c u l a r s t r u c t u r e s . I n t h e s e s t r u c t u r e s t h e y may f o r m p o l y m o r p h i c p h a s e s s u c h a s m i c e l l a r , b i l a y e r o r h e x a g o n a l c o n f i g u r a t i o n s [ 1 0 ] . I t h a s b e e n p o s t u l a t e d t h a t t h e p r e f e r e n c e o f a l i p i d s p e c i e s f o r a g i v e n s t r u c t u r e r e f l e c t s t h e d y n a m i c m o l e c u l a r s h a p e a s s u m e d by t h e i n d i v i d u a l p h o s p o l i p i d c o m p o n e n t s a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 1.3 [ 1 1 ] . L y s o p h o s p h o l i p i d s a n d d e t e r g e n t s f o r m a m i c e l l a r p h a s e due t o t h e i r i n v e r t e d c o n e - s h a p e s u c h t h a t t h e p o l a r h e a d g r o u p i s l a r g e r t h e n t h e t a i l s e c t i o n . L i p i d s s u c h a s p h o s p h a t i d y l c h o l i n e a n d p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l a s s u m e a c y l i n d r i c a l s h a p e w h i c h f o r m 5 BILAYER CYLINDER 1§> J c - " - ' HEXAGONAL (H M ) F i g u r e 1.3 L i p i d s t r u c t u r e s h a p e . CONE - SHAPE a n d c o r r e s p o n d i n g m o l e c u l a r 6 t h e b i l a y e r p h a s e . C a r d i o l i p i n a s t h e m o n o - v a l e n t c a t i o n s a l t f o r m a l s o p r e f e r s t h e b i l a y e r s t r u c t u r e . P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( u n s a t u r a t e d ) , p h o s p h a t i d i c a c i d - C a 2 + a n d c a r d i o l i p i n - C a 2 + w h i c h a r e a p p r o x i m a t e l y c o n e - s h a p e d f o r m t h e h e x a g o n a l p h a s e . T h e s e l i p i d s p o s s e s s a h e a d g r o u p r e g i o n s m a l l e r t h a n t h e t a i l a n d a r e b e s t s u i t e d f o r t h e h e x a g o n a l p h a s e . C a r d i o l i p i n c a n e x i s t a s a l a m e l l a r o r h e x a g o n a l s t r u c t u r e d e p e n d i n g on t e m p e r a t u r e , w a t e r c o n t e n t a n d t h e p r e s e n c e o f c a t i o n s . T h e d i s o d i u m s a l t o f c a r d i o l i p i n w i l l f o r m l i q u i d c r y s t a l l i n e p h a s e s h a v i n g l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l s t r u c t u r e d e p e n d i n g on t h e amount o f w a t e r p r e s e n t . C a r d i o l i p i n w i l l a l s o p r e c i p i t a t e a s t h e s a l t o f d i v a l e n t c a t i o n s t o g i v e t h e h e x a g o n a l s t r u c t u r e . R a n d a n d S e n g u p t a [ 1 1 ] u s i n g X - r a y d i f f r a c t i o n t e c h n i q u e s h a v e shown t h a t c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r p h a s e w i l l p r e c i p i t a t e t o f o r m t h e h e x a g o n a l p h a s e w i t h c a l c i u m . M a g n e s i u m a n d B a r i u m d i v a l e n t c a t i o n s w i l l a l s o i n d u c e t h e h e x a g o n a l p h a s e , b u t n o t a t a l l t e m p e r a t u r e s a n d c o n c e n t r a t i o n s . F r e e z e - f r a c t u r e a n d f r e e z e - e t c h i n g t e c h n i q u e s c a n a l s o be e m p l o y e d w i t h e l e c t r o n m i c r o g r a p h s t o d e m o n s t r a t e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e two p h a s e s [ 1 2 ] . A n o t h e r m e t h o d f o r d e t e r m i n i n g t h e p h a s e o f c a r d i o l i p i n i s by e m p l o y i n g 3 1 P NMR t e c h n i q u e s . C u l l i s e t a l [ 1 0 , 1 3 ] h a v e d e m o n s t r a t e d w i t h 3 1 P NMR t h a t t h e r e i s a d i f f e r e n c e i n t h e NMR s i g n a l f r o m c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r a n d t h e NMR s i g n a l f r o m t h e h e x a g o n a l p h a s e s . ESR s t u d i e s e m p l o y i n g s p i n p r o b e s h a v e a l s o b e e n p e r f o r m e d i n o r d e r t o s t u d y t h e s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f c a r d i o l i p i n i n a q u e o u s d i s p e r s i o n s . T h e r e s u l t s f r o m t h e s e two s t u d i e s a r e 7 c o n t r a d i c t o r y . T h e work o f H e g n e r e t a l [ 1 4 ] showed d i f f e r e n c e s i n t h e ESR s p e c t r a o f a s p i n p r o b e i n c o r p o r a t e d i n t h e l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e s , w h e r e a s t h e H s i a p a p e r [ 1 5 ] shows no d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e two. I n t h i s work we h a v e r e p e a t e d a n d e x t e n d e d t h e ESR s t u d y u s i n g t h e s p i n p r o b e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d i n t h e h o p e o f s o r t i n g o u t t h i s d i s c r e p e n c y . T h e r e s u l t s o f t h i s a d d i t i o n a l i n v e s t i g a t i o n a l s o p r o v i d e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n a s t o t h e f o r m a t i o n o f t h e h e x a g o n a l p h a s e . An a l t e r n a t i v e t o s p i n p r o b e s t u d i e s i n t h e v a r i o u s p h a s e s o f c a r d i o l i p i n , i s t o s p i n l a b e l t h e c a r d i o l i p i n i t s e l f . T h e r e a r e two p o s s i b l e p l a c e s t o s p i n l a b e l t h e c a r d i o l i p i n , t h e p o l a r h e a d g r o u p ( s e c o n d a r y - O H ) o r t h e h y d r o c a r b o n c h a i n . Two g r o u p s h a v e r e p o r t e d m e t h o d s f o r s p i n l a b e l l i n g a t b o t h t h e s e p o s i t i o n s [ 1 6 , 1 7 i . T h e s t r u c t u r e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e two p h a s e s , shown i n f i g u r e 1.4, s u g g e s t t h a t s p i n l a b e l l i n g t h e h e a d g r o u p w i l l be p r e f e r a b l e . F r o m X - r a y d a t a , t h e p o l a r t o p o l a r t r a n s b i l a y e r o © d i s t a n c e a r e 34.5-37.1 A, a n d 35.6-41.4 A f o r t h e l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e s r e s p e c t i v e l y [ 1 1 ] . T h u s t h e c h a n g e i n t h e h y d r o c a r b o n c h a i n r e g i o n b e t w e e n t h e two p h a s e s a p p e a r s t o be s m a l l . W h e r e a s i f t h e h e a d g r o u p i s s p i n l a b e l l e d , t h e s p i n l a b e l i n t h e p o l a r h e a d r e g i o n w o u l d go f r o m a l m o s t u n r e s t r i c t e d m o t i o n i n t h e l a m e l l a r s t r u c t u r e t o t h e v e r y r e s t r i c t e d m o t i o n i n t h e h e x a g o n a l s t r u c t u r e . I n t h e h e x a g o n a l p h a s e t h e w a t e r o c h a n n e l s h a v e d i a m e t e r s o f 14.2-16.6 A, a s shown i n f i g u r e 1.4, a n d a s a c o n s e q u e n c e d r a m a t i c c h a n g e s i n t h e ESR s p e c t r a o f l a b e l l e d c a r d i o l i p i n c a n be e x p e c t e d . As i n d i c a t e d , i t a p p e a r s t o be d e s i r a b l e t o s p i n l a b e l t h e F i g u r e 1 . 5 G e n e r a l s t r u c t u r e of s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n . 9 p o l a r h e a d g r o u p o f c a r d i o l i p i n . Many g r o u p s h a v e a t t e m p t e d t h e a c e t y l a t i o n o f t h e h y d r o x y l g r o u p o f c a r d i o l i p i n w i t h v a r y i n g d e g r e e s o f s u c c e s s [ 5 ] . A t t e m p t s s u c h a s u s i n g a c e t i c a n h y d r i d e ( r a d i o a c t i v e ) i n b e n z e n e / p y r i d i n e y i e l d 5-10% a c e t y l a t i o n a t 9 0 ° C f o r 10 m i n u t e o r a t 2 0 ° C f o r 12 h o u r [ 5 ] , A l t e r n a t i v e l y r e a c t i n g c a r d i o l i p i n w i t h e x c e s s m y r i s t o y l c h l o r i d e i n a n h y d r o u s c h l o r o f o r m a t 2 0 ° C f o r 48 h o u r u n d e r w e n t a b o u t 5% c o n v e r s i o n [ 5 ] . T h i s shows t h e r e a c t i v i t y o f t h e h y d r o x y l g r o u p i s l o w . L o n g e r r e a c t i o n t i m e s r e s u l t e d i n e x t e n s i v e d e c o m p o s i t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l i n t o l y s o - d e r i v a t i v e s o f c a r d i o l i p i n . L a n d r i s c i n a e t a l h a v e s p i n l a b e l l e d t h e f r e e h y d r o x y l g r o u p o f c a r d i o l i p i n u s i n g 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y p y r r o l i n e - n - o x i d e -3 - c a r b o x y l c h l o r i d e [ 1 7 ] , T h e r e a c t i o n was p e r f o r m e d i n a n h y d r o u s c h l o r o f o r m c o n t a i n i n g p y r i d i n e a t 6 0 ° C f o r 12-14 h o u r . T h i s m e t h o d was u s e d i n t h e b e g i n i n g o f t h e c u r r e n t s t u d y t o p r e p a r e t h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n ( S L C L ) a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 1.5. B u t t h e p r o l o n g e d h e a t i n g a t h i g h t e m p e r a t u r e s u s e d i n t h i s m e t h o d r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f l y s o c a r d i o l i p i n . A more g e n t l e m e t h o d h a s b e e n d e v e l o p e d i n t h i s work u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f K e a n a ' s [ 1 8 ] a c y l a t i n g p r o c e d u r e . T h e o b j e c t i v e o f t h i s work i s t o u s e t h e s p i n p r o b e 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d t o i n v e s t i g a t e t h e f o r m a t i o n o f t h e h e x a g o n a l p h a s e a n d t o c l a r i f y t h e p r e v i o u s l y o b t a i n e d a m b i g u o u s r e s u l t s u s i n g t h i s p r o b e . I n a d d i t i o n t h e s e s t u d i e s w i l l be s u p p l e m e n t e d by s t u d y i n g t h e • ESR s p e c t r a o f s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n i n b o t h t h e l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e s . 10 CHAPTER 2  THEORY 2.1 E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e o f N i t r o x i d e R a d i c a l s . T h e t h e o r y o f E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e (E S R ) s p e c t r o s c o p y h a s b e e n p r e s e n t e d i n d e t a i l i n a number o f t e x t s a n d a r t i c l e s ( 1 9 - 2 3 ) , s o o n l y t h e s a l i e n t f e a t u r e s w i l l be p r e s e n t e d h e r e . ESR s p e c t r o s c o p y i s a s e n s i t i v e t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o n o f s p e c i e s w i t h u n p a i r e d e l e c t r o n s i n t h e s y s t e m u n d e r s t u d y . The a p p l i c a t i o n o f ESR i n b i o l o g i c a l s y s t e m s s u c h a s membrane s t u d i e s w h i c h o f t e n do n o t c o n t a i n p a r a m a g n e t i c c e n t r e s h a v e b e e n a c h i e v e d by t h e i n t r o d u c t i o n o f m o l e c u l e s c o n t a i n i n g an u n p a i r e d e l e c t r o n . N i t r o x i d e s p i n l a b e l s a n d s p i n p r o b e s a r e w i d e l y u s e d f o r t h i s p u r p o s e [ 1 9 , 2 3 ] . T h e t e r m n i t r o x i d e s p i n p r o b e r e f e r s t o a n y s y s t e m c o n t a i n i n g a n i t r o x i d e m o i e t y n o t c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e s y s t e m a n d when t h e n i t r o x i d e i s c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o a m o l e c u l e o f i n t e r e s t i t i s t h e n r e f e r e d t o a s a n i t r o x i d e s p i n l a b e l . T h e n i t r o x i d e s p i n m o i e t y i s shown i n f i g u r e 2.1 w h i c h p o s s e s s a n u n p a i r e d e l e c t r o n l o c a l i z e d m a i n l y i n a 2P_ o r b i t a l on t h e n i t r o g e n a t o m . 2.2 ESR S p e c t r a o f N i t r o x i d e s . a ) S o l u t i o n F o r a n i t r o x i d e r a d i c a l i n s o l u t i o n i n w h i c h t h e e l e c t r o n s p i n i n t e r a c t s v i a h y p e r f i n e c o u p l i n g w i t h t h e n i t r o g e n n u c l e u s o f n u c l e a r s p i n q u a n t u m number I , t h e m a g n e t i c H a m i l t o n i a n i s N i t r o x i d e s p i n m o i e t y . 12 g i v e n by A A A A . . H = 9 o £ e H 0 » S , + a 0 S » I (2.1 ) g e = t h e g f a c t o r , a c o n s t a n t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e e l e c t r o n i n t h e r a d i c a l i n q u e s t i o n jBe = t h e B o h r m a g n e t o n = e h 2M eC M e = mass o f e l e c t r o n H_, = i s t h e a p p l i e d m a g n e t i c f i e l d S = e l e c t r o n s p i n o p e r a t o r a 0 = c o u p l i n g c o n s t a n t I = n u c l e a r s p i n o p e r a t o r I T h e f i r s t o r d e r H a m i l t i o n i a n i s H = g 0 P e H * S t + a o S z I _ . ( 2 . 2 ) T h e s o l u t i o n t o t h e f i r s t o r d e r e q u a t i o n i s E , = g . £>,_H-m_ + a^mem-f m_ = e i g e n v a l u e o f t h e e l e c t r o n s p i n a n g u l a r momentum o p e r a t o r m-j_ = e i g e n v a l u e o f t h e n u c l e a r s p i n a n g u l a r momentum o p e r a t o r I _ A l l a l l o w e d ESR t r a n s i t i o n s u s u a l l y s a t i s f y t h e s e l e c t i o n r u l e s o f A m s = 1, b.mx = 0 f o r a l l n u c l e i . T h e e n e r g y d i f f e r e n c e o f t h e l e v e l s i n v o l v e d i n t h e a l l o w e d t r a n s i t i o n i s 13 E ( m s V h ^ = E < m s , « . * V f E ( m „ m ^ ( 2 . 3 ) = 9 c A i H o + a o m x T h u s f o r a n i t r o x i d e r a d i c a l 1=1, t h e s p e c t r u m w i l l c o n s i s t s o f t h r e e l i n e s , c o r r e s p o n d i n g t o m =1, 0 a n d - 1 , w i t h e n e r g i e s r e s p e c t i v e l y . T h e s p e c t r a l l i n e s a r e e q u a l l y s p a c e d a n d t h e s e p a r a t i o n b e t w e e n a d j a c e n t l i n e s i s a D / h i n f r e q u e n c y u n i t s . I n ESR s t u d i e s , t h e f i e l d i s s c a n n e d a t a f i x e d f r e q u e n c y V , t h e r e f o r e t h e s p a c i n g b e c o m e s a 0 / g 0 & e . i n g a u s s . b) S o l i d A f e a t u r e o f ESR s p e c t r a i s t h a t t h e l i n e p o s i t i o n s a n d s p l i t t i n g s b e t w e e n t h e l i n e s d e p e n d on t h e d i r e c t i o n o f t h e m a g n e t i c f i e l d r e l a t i v e t o t h e m o l e c u l a r a x i s o r h y p e r f i n e a x i s . T h e d i r e c t i o n a l d e p e n d e n c e o f t h e h y p e r f i n e a n d g - t e n s o r s a r e i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 2.2. T h e f i g u r e shows t h e ESR s p e c t r a o f a n i t r o x i d e f r e e r a d i c a l s o r i e n t e d i n a c r y s t a l l a t t i c e w i t h t h e m a g n e t i c f i e l d p a r a l l e d t o e a c h o f t h e t h r e e p r i n c i p a l d i r e c t i o n s . T h e s p e c t r a l a n i s o t r o p y c a n be s p e c i f i e d by t h r e e g -v a l u e s a n d t h r e e h y p e r f i n e c o n s t a n t s . T h e s e a r e t h e p r i n c i p a l v a l u e s o f t h e h y p e r f i n e a n d g - t e n s o r s : a n d F i g u r e 2.2 ESR s p e c t r a o f s p i n p r o b e i n r i g i d m a t r i x . 15 9 K X / g y y - 9 r e s p e c t i v e l y . I n many c a s e s t h e m o l e c u l a r s y s t e m i s a p p r o x i m a t e l y a x i a l l y s y m m e t r i c a n d t h e p r i n c i p a l v a l u e s c a n t h e n be e x p r e s s e d a s : 9 X X = 9yY= 9 j _ T h e s p e c t r u m o b t a i n e d f r o m a s o l u t i o n o f a n i t r o x i d e c o n t a i n s t h r e e s h a r p l i n e s , b u t h e r e t h e g a n d T a n i s o t r o p i e s h a v e b e e n a v e r a g e d o u t s o t h a t t h e l i n e p o s i t i o n s a r e d e t e r m i n e d by g 0 a n d a 0 , w h e r e 9 o = ( 9 y v + 9 v v + 5 Z z ) / 3 a n d ( 2 . 5 ) a © = < T X X + T y y + T 2 X ) / 3 T o o b t a i n t h e g t e n s o r a n d h y p e r f i n e t e n s o r c o m p o n e n t s a c c u r a t e l y a s i n g l e c r y s t a l s a m p l e must be u s e d t o s t u d y t h e d e p e n d e n c e o f t h e n i t r o x i d e ESR s p e c t r u m on t h e a n g l e s b e t w e e n t h e a p p l i e d m a g n e t i c f i e l d a n d t h e s y m m e t r y a x i s o f t h e r a d i c a l . T h i s c a n a l s o be d o n e by d o p i n g a d i a m a g n e t i c h o s t c r y s t a l o f known t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e w i t h t h e n i t r o x i d e o f i n t e r e s t . U s u a l l y s i n g l e c r y s t a l s a n d n i t r o x i d e d o p e d h o s t c r y s t a l s a r e n o t a v a i l a b l e a n d t h e s o - c a l l e d p o l y c r y s t a l l i n e p o w d e r s p e c t r u m i s r e c o r d e d ( f i g u r e 2 . 3 ) . I n t h i s c a s e a c o m p u t e r s i m u l a t i o n o f t h e s p e c t r u m i s r e q u i r e d t o o b t a i n a c c u r a t e v a l u e s o f T a n d g [ 1 9 ] . 17 2.3 A n a l y s i s o f ESR S p e c t r a . A s p i n l a b e l ESR s p e c t r u m i s e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o t h e n a t u r e a n d t h e r a t e o f t h e m o t i o n t h e s p i n l a b e l u n d e r g o e s . I f t h e m o t i o n i s f a s t on t h e ESR t i m e s c a l e ( c o r r e l a t i o n t i m e 73 < 1 0 * 9 s ) , t h e s p e c t r a w i l l d i s p l a y g v a l u e s a n d h y p e r f i n e s p l i t t i n g s t h a t a r e t h e a v e r a g e s o f t h e p r i n c i p a l c o m p o n e n t s . T h e r a t e o f t h e m o t i o n d e t e r m i n e s t h e r e l a t i v e w i d t h s o f t h e v a r i o u s r e s o n a n c e s . T h e n a r r o w l i n e s f o r r a p i d m o t i o n b r o a d e n a s m o t i o n b e c o m e s s l o w e r . I n t h e e x t r e m e c a s e , when m o t i o n i s v e r y s l o w t h e s p e c t r a o b t a i n e d a r e s i m i l i a r t o t h o s e f r o m p o w d e r s a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 2.3. Th e a n a l y s i s o f s p e c t r a l l i n e s h a p e a n d l i n e w i d t h s h a s b e e n p e r f o r m e d i n t e r m s o f a r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e f o r i s o t r o p i c m o t i o n i n t h e r a p i d t u m b l i n g l i m i t [ 2 2 ] , T h e w i d t h & H m o f an i n d i v i d u a l l i n e i s g i v e n b y : Mim = A + B M + C M 2 w h e r e m i s t h e z c o m p o n e n t o f t h e n i t r o g e n n u c l e a r s p i n q u a n t u m number 1=1, f o r 1 e N , w i t h t h e l o w f i e l d , c e n t e r a n d h i g h f i e l d l i n e s c o r r e s p o n d t o m = +1, 0, a n d -1 r e s p e c t i v e l y . T h e t e r m s B a n d C a r e f u n c t i o n s o f t h e p e a k - t o - p e a k l i n e w i d t h o f t h e c e n t e r l i n e , A H 0 a n d t h e a m p l i t u d e s o f t h e m - t h l i n e s , I M . T h e s e two t e r m s a r e r e l a t e d t o t h e c o r r e l a t i o n t i m e f o r i s o t r o p i c m o t i o n a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s [ 2 2 ] : B = & H C ( / i T T l T ~ N/I 0/I-\)/2 ( 2 . 6 ) = 0 . 1 0 3 U c{£gAa + 3(SgSa)} Ze i 1 + 3(1 + <4> 2^ 2)-"/4} 18 ( 2 . 7 ) C = A H Q (JTJT, + Jle/l.x - 2 ) / 2 - 1 . B 1 X 1 0 6 {(A.a)2 + 3(Sa) 2} ? c { 1 - 3 ( 1 + U V 6 ? C 2 ) - V 8 - ( 1 + £Je2 ?c2)- V8} w h e r e Aa «= T t z - ( T x x + T y y ) / 2 Ag - g l 7 . - ( g x x + 9vY >/-§ a - ( T X x - T Y y )/2 Sg = (g** - g V Y )/2 w i t h t h e T t e r m s i n g a u s s , a n d t J v = 8 . 8 X 1 0 6 a 0 , where a Q i s t h e i s o t r o p i c h y p e r f i n e s p l i t t i n g , a n d £ J e i s t h e ESR s p e c t r o m e t e r f r e q u e n c y i n a n g u l a r u n i t s (CJ = 2 7 T V ) . ^ a n d a r e t h e c o r r e l a t i o n t i m e s c a l c u l a t e d f r o m B a n d C r e s p e c t i v e l y . I n o r d e r t o c a l c u l a t e "Z^  a n d 2^ . t h e g t e n s o r a n d h y p e r f i n e t e n s o r h a v e t o be o b t a i n e d f r o m a s p e c t r u m o f t h e n i t r o x i d e i n a p o l y c r y s t a l l i n e p h a s e e . g . p o w d e r s p e c t r u m o r l o w t e m p e r a t u r e g l a s s s p e c t r u m . I n t h e r e g i o n o f r a p i d , i s o t r o p i c m o t i o n t h e c o r r e l a t i o n t i m e s "VQ, a n d Tc s h o u l d be e q u a l . R e c e n t work h a s i n d i c a t e d t h a t t h e c o n d i t i o n o f i s o t r o p i c m o t i o n r a r e l y a p p l i e s [ 2 2 ] . So m o s t n i t r o x i d e m o l e c u l e s u n d e r g o a n i s o t r o p i c m o t i o n a n d t h e "Fg c a l c u l a t e d i s n o t e q u a l t o l T c . T h e r a t i o o f ~d/ 2# i n d i c a t e s t h e p r e f e r e n t i a l a x i s a b o u t w h i c h r o t a t i o n t a k e s p l a c e [ 2 5 ] , t h u s f o r e x a m p l e ~ZC/TP>>\, i t i s t h e y a x i s . When t h e r o t a t i o n a l m o t i o n i s s l o w e n o u g h , a s i t i s f o r 5-d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n d i s p e r s i o n s o f l i p i d s , s u c h t h a t t h e s p e c t r a a p p r o a c h t h e p o w d e r s p e c t r u m l i m i t , t h e a b o v e a n a l y s i s no l o n g e r a p p l i e s . A n o t h e r r e l a t i v e l y s i m p l e m e t h o d o f a n a l y s i s i s p o s s i b l e . T h i s i s t h e m e t h o d o f m e a s u r i n g t h e o r d e r 19 p a r a m e t e r S. T h i s r e q u i r e s t h e m e a s u r e m e n t o f 2T,\ a n d 2T_!_ ( t w i c e t h e a p p a r e n t h y p e r f i n e c o u p l i n g s o f t h e n i t r o x i d e f r e e r a d i c a l ) . T h e o r d e r p a r a m e t e r S, a s s u m i n g c y l i n d r i c a l s y m m etry a l o n g t h e l o n g a x i s o f t h e l i p i d s i s g i v e n by t h e f o l l o w i n g e x p r e s s i o n [ 1 9 ] : S = ( T ' - T ; ) / { T x _ - ( T^x + T > Y )/2 } ( 2 . 8 ) A l t e r n a t i v e l y , one c a n d e t e r m i n e Tz-__ f r o m a n ESR s p e c t r u m o f a p o l y c r y s t a l l i n e s o l u t i o n o f a n i t r o x i d e , t h e n : S = T l 3 ( T - a ' ) / 2 a = ( T J X + 2 T _ )/3 ( 2 . 9 ) T h e s e e q u a t i o n s h o l d f o r s p i n p r o b e s i n w h i c h t h e n i t r o x i d e Z a x i s i s p a r a l l e l t h e l o n g a x i s o f t h e p r o b e . A common s p i n p r o b e u s e d i n membrane r e s e a r c h i s t h e 5-d o x y l - s t e a r i c a c i d p r o b e shown i n f i g u r e 2.4 whose n i t r o x i d e Z a x i s i s p a r a l l e l t o t h e l o n g a x i s . T h e l o n g h y d r o p h o b i c t a i l a n c h o r s t h e p r o b e t o t h e h y d r o p h o b i c r e g i o n s o f a membrane s y s t e m . T h e n i t r o x i d e m o i e t y t h e n m o n i t o r s t h e e n v i r o n m e n t o f t h e b i l a y e r a r o u n d i t . T h e ESR s p e c t r a o f t h e p r o b e c a n y i e l d i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e s t r u c t u r e o f t h e l i p i d s i n t o w h i c h i t i s i n c o r p o r a t e d . T h e m e a s u r e m e n t o f 2T_ i s n o t p o s s i b l e a t a l l t e m p e r a t u r e s , a s i s o f t e n t h e c a s e f o r b i o l o g i c a l membranes, h e n c e t h e e v a l u a t i o n o f S i s t h e n . d i f f i c u l t . An a l t e r n a t i v e a p p r o a c h i s t o Y 21 m o n i t i o r t h e v a r i a t i o n o f 2T,'l ( t h e s e p a r a t i o n b e t w e e n t h e o u t e r e x t r e m a ) w h i c h i s l i n e a r l y r e l a t e d t o t h e o r d e r p a r a m e t e r [ 1 9 ] . 2T,\ = 2 a Q + ( 4 S / 3 ) { T _ x + ( T X x + T v y )/2 } ( 2 . 1 0 ) Where a Q i s t h e i s o p t r o p i c h y p e r f i n e c o u p l i n g c o n s t a n t o f t h e n i t r o x i d e f r e e r a d i c a l . F r o m e q u a t i o n 2.12 when S d e c r e a s e s s o d o e s 2T,',. T h e i n t e r p r e t a t i o n o f S a n d h e n c e 2T,'l c a n be v i e w e d a s a m e a s u r e o f m o t i o n a l o r d e r . T h e c h a n g e o f 2 T ^ w i t h t e m p e r a t u r e c a n be e v a l u a t e d a s t h e v a r i a t i o n o f membrane f l u i d i t y w i t h t e m p e r a t u r e . B e t w e e n t h e e x t r e m e s o f r a p i d m o t i o n a n d s l o w m o t i o n i s t h e . r e g i o n o f i n t e r m e d i a t e r a t e s w h i c h i s d i f f i c u l t t o a n a l y s e . I n t h i s r e g i o n n o n e o f t h e m e t h o d s i n d i c a t e d a b o v e c a n be e m p l o y e d . I n o r d e r t o o b t a i n u s e f u l i n f o r m a t i o n f r o m t h i s r e g i o n o f i n t e r m e d i a t e m o t i o n , s p e c t r a l s i m u l a t i o n s a r e n e e d e d [19]. 22 CHAPTER 3  EXPERIMENTAL 3.1 P r e p a r a t i o n o f 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 - c a r b o x y l i c A c i d {V}. T h e c a r b o x y l i c a c i d s p i n l a b e l p r e c u r s o r {V} was p r e p a r e d u s i n g t h e r o u t e i l l u s t r a t e d b e l o w [ 2 6 ] . Th e 2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l - 4 - p i p e r d o n e {1} was p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h a n d u s e d w i t h o u t p u r i f i c a t i o n . T h e c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n s i n d i c a t e d a b o v e w e r e c a r r i e d o u t a s f o l l o w s : P r e p a r a t i o n o f 3,5 d i b r o m o - 2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l - 4 - p i p e r i d o n e  h y d r o b r o m i d e { I I } . Compound {1} (4 g) was d i s s o l v e d i n g l a c i a l a c e t i c a c i d (16 m l ) . T h e n w i t h i c e - w a t e r c o o l i n g a n d v i g o r o u s s t i r r i n g , a s o l u t i o n o f b r o m i n e (10 g) i n g l a c i a l a c e t i c a c i d (16 m l ) was a d d e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e was l e f t t o s t a n d f o r a d a y . T h e 23 r e s u l t a n t p r e c i p i t a t e was p r e s s e d o u t on a B u c h n e r f u n n e l , a n d w a s h e d s u c c e s s i v e l y w i t h a c e t i c a c i d , w a t e r a n d e t h e r , a n d f i n a l l y a i r - d r i e d . T h e y i e l d o f c r u d e { I I } was 6.7 g ( 8 3 % ) . T h i s was u s e d w i t h o u t a d d i t i o n a l p u r i f i c a t i o n . P r e p a r a t i o n o f 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 3 - c a r b o x y a m i d e  { I I I } . W i t h c o n t i n o u s s t i r r i n g , c o m p o u n d { I I } (5 g) was a d d e d t o a s o l u t i o n o f 25% a q u e o u s ammonia (50 m l ) , t h e r e s u l t i n g s o l u t i o n was s u b s e q u e n t l y s a t u r a t e d w i t h KOH. T h e p r e c i p a t e d c r y s t a l s o f { I I I } w e r e c o l l e c t e d a n d a i r d r i e d . T h e y i e l d o f c r u d e { I I I } was 2.2 g ( 8 2 % ) . A n d on r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m b e n z e n e g a v e a m.p. o f 1 7 6 - 1 7 8 ° C ( L i t . 1 7 8 - 1 7 9 ° C ) was o b t a i n e d . P r e p a r a t i o n o f 3 - c a r b a m o y l - 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l l i n e - 1 - o x y l  { I V } . Compound { I I I } (2 g) was m i x e d w i t h a s o l u t i o n o f 30% h y d r o g e n p e r o x i d e (5 m l ) , EDTA (0.11 g ) , a n d s o d i u m t u n g s t a t e (0.11 g) i n d i s t i l l e d w a t e r ( 2 5 m l ) , a n d l e f t i n t h e d a r k a t room t e m p e r a t u r e f o r 20 d a y s . T h e r e s u l t i n g c r y s t a l s was f i l t e r e d a n d t h e n a i r d r i e d . T h e y i e l d o f c r u d e f r e e r a d i c a l was 1.5 g ( 7 0 % ) [N.B. T h e y i e l d o f f r e e r a d i c a l i s d e p e n d e n t on t h e f r e s h n e s s o f t h e h y d r o g e n p e r o x i d e ] . R e c r y s t a l l i z e d f r o m e t h a n o l m.p. 1 9 7 - 2 0 0 ° C decomp. ( L i t . 2 0 3 - 2 0 4 ° C d e c o m p . ) . 24 P r e p a r a t i o n o f 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 - c a r b o x y l i c  a c i d {V}. The compound {IV} (1 g) was d i s s o l v e d i n a 10% s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n (15 m l ) a n d r e f l u x e d u n t i l t h e e v o l u t i o n o f ammonia c e a s e d . A f t e r c o o l i n g t h e s o l u t i o n , i t was a c i d i f i e d w i t h h y d r o c h l o r i c a c i d . T h e p r e c i p i t a t e was f i l t e r e d a n d d r i e d . T h e y i e l d o f c r u d e y e l l o w c r y s t a l l i n e a c i d - r a d i c a l was 0.9 g (90 % ) . R e c r y s t a l l i z e d f r o m b e n z e n e , t h e m.p. was 2 0 1 - 2 0 3 ° C ( L i t . 2 1 0 - 2 1 1 ° C ) . A m i c r o a n a l y s i s ( b y Mr. P. B o r d a ) o f t h e compound {V} was d o n e f o r c a r b o n , h y d r o g e n , a n d n i t r o g e n c o n t e n t . F o r .C H N O : 9 14 1 3 C a l c u l a t e d C: 58.68 H: 7.66 N: 7.60 F o u n d C: 58.26 H: 7.76 N: 7.54 3.2 P r e p a r a t i o n o f S p i n L a b e l l e d C a r d i o l i p i n . T h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n ( S L C L ) was p r e p a r e d u s i n g t h e r o u t e i l l u s t r a t e d b e l o w . F o r e a c h S L C L p r e p a r a t i o n t h e compounds {VI} a n d { V I I } were f r e s h l y p r e p a r e d . ( I ) (Yl) 25 P r e p a r a t i o n Of 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 - c a r b o x y l c h l o r i d e {VI} [ 2 6 ] . A s u s p e n s i o n o f compound {V} ( 0 . 5 g) i n d r y b e n z e n e ( d r i e d by r e f l u x i n g o v e r p o t a s s i u m a n d d i s t i l l e d ) (6 m l ) w i t h f r e s h l y d i s t i l l e d d r y p y r i d i n e ( 0 . 3 m l ) c o o l e d i n a c o l d w a t e r b a t h was s t i r r e d u n d e r a. n i t r o g e n a t m o s p h e r e . T h e n f r e s h l y d i s t i l l e d t h i o n y l c h l o r i d e ( 0 . 3 m l ) i n d r y b e n z e n e (4 m l ) was a d d e d d r o p w i s e t o t h e r e s u l t i n g s o l u t i o n . T h e r e a c t i o n m i x t u r e was s t i r r e d a t room t e m p e r t u r e f o r 1 h o u r . T h e s a l t s w h i c h were f o r m e d w e r e a l l o w e d t o s e t t l e . T h e s u p e r n a t a n t was d e c a n t e d o f f i n t o a s u b l i m a t i o n c h a m b e r i n a g l o v e b a g u n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r e . T h e s o l u t i o n was t h e n e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n g a s . T h e r e s i d u a l c r u d e a c i d c h l o r i d e {VI} was t h e n s u b l i m e d a t 0.1 t o r r a t 8 0 ° C t o y i e l d 0.4 g ( 7 3 % ) o f d a r k - y e l l o w c r y s t a l s . T h e p u r i t y was c o n f i r m e d by m i c r o a n a l y s i s ( p e r f o r m e d by Mr. P. B o r d a ) o f c o m p o u n d { V I } . F o r C H N O C l : 9 13 1 2 C a l c u l a t e d C: 53.34 H: 6.46 N: 6 . 9 1 F o u n d C: 53.60 H: 6.74 N: 7.00 P r e p a r a t i o n o f ( 2 , 2 , 5 , 5 - t e t r a m e t h y l p y r r o l i n e - 1 - o x y l - 3 - c a r b o x y l ) - p - t o l u e n e s u l f o n a t e { V I I } [ 1 8 ] . I n a g l o v e b a g u n d e r a n i t r o g e n a t m o s p h e r e , t h e s u b l i m e d a c i d c h l o r i d e {VI} was w a s h e d i n t o a d r o p p i n g f u n n e l w i t h a n h y d r o u s d i c h l o r o m e t h a n e ( d r i e d by r e f l u x i n g w i t h p h o s p h o r u s p e n t o x i d e , f o l l o w e d by d i s t i l l a t i o n ) . T h i s was t h e n a d d e d t o a s t i r r e d s u s p e n s i o n o f s i l v e r t o s y l a t e i n d r y d i c h l o r o m e t h a n e (1 26 m l ) a t 0 ° C u n d e r a n i t r o g e n a t m o s p h e r e . T h e m i x t u r e was s t i r r e d a t 0 ° C f o r 30 m i n u t e s . The s t i r r i n g was d i s c o n t i n u e d a n d t h e p r e c i p i t a t e was a l l o w e d t o s e t t l e . T h e a n h y d r i d e i n t h e s u p e r n a t a n t was n o t i s o l a t e d b u t u s e d a s i t was. P r e p a r a t i o n o f S p i n L a b e l l e d C a r d i o l i p i n ( S L C L ) [ 1 8 ] . CL p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l o r S u p e l c o I n c . , was t e s t e d by T L C . C a r d i o l i p i n s p o t t e d on a s i l i c a g e l - H T L C p l a t e , d e v e l o p e d i n a s o l u t i o n o f c h l o r o f o r m / m e t h a n o l / w a t e r ( 6 5 , 2 5 , 4 ) s h o w e d a s i n g l e s p o t [ 2 5 ] . T h e c a r d i o l i p i n was t h e r e f o r e c o n s i d e r e d p u r e by t h i s c r i t e r i a . T o p r e p a r e t h e S L C L t h e c a r d i o l i p i n was d r i e d u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n g a s a n d was pumped on f o r 1 h o u r . T h e d r i e d l i p i d f i l m was d i s o l v e d i n d r i e d d i c h l o r o m e t h a n e . T h e c h i l l e d a n h y d r i d e s o l u t i o n ( a b o u t t e n f o l d e x c e s s ) was t h e n a d d e d t o t h e c a r d i o l i p i n s o l u t i o n . The r e s u l t i n g r e a c t i o n m i x t u r e was s t i r r e d u n d e r n i t r o g e n a n d a l l o w e d t o warm up t o 2 5 ° C o v e r a 2 h o u r p e r i o d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e was t h e n w a s h e d w i t h w a t e r . T h e o r g a n i c l a y e r was w i t h d r a w n , d r i e d a n d r e d i s s o l v e d i n c h l o r o f o r m . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e was d i v i d e d a n d a p p l i e d t o two s i l i c a g e l - H T L C p l a t e s . T h e p l a t e s w e r e t h e n c h r o m a t o g r a p h e d i n a s o l u t i o n o f e t h y l a c e t a t e / g l a c i a l a c e t i c a c i d ( 9 6 / 4 ) [ 1 6 ] . T h e c a r d i o l i p i n b a n d R f = 0 . 0 5 - 0 . 1 0 was r e m o v e d f r o m t h e two p l a t e s , c o m b i n e d , a n d e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m / m e t h a n o l ( 1 / 2 ) . T h e S L C L s o l u t i o n was d r i e d a n d r e d i s s o l v e d i n c h l o r o f o r m . A 20 m i c r o -l i t r e s a m p l e was d e g a s s e d a n d a n ESR s p e c t r u m was r e c o r d e d t o d e t e r m i n e t h e r a t i o o f t h e h e i g h t o f t h e h i g h f i e l d l i n e t o t h e 27 h e i g h t of the c e n t r a l f i e l d l i n e . T h i s r a t i o i s i n d i c a t i v e of the motion of the s p i n probe when i t i s a t t a c h e d t o the c a r d i o l i p i n . A f t e r the i n i t i a l ESR t e s t , the crude SLCL s o l u t i o n was s u b j e c t e d t o TLC a g a i n . The TLC s t e p was r e p e a t e d u n t i l the ESR l i n e r a t i o was c o n s t a n t . The y i e l d of SLCL was about 5% as i n d i c a t e d by i n t e g r a t i o n of ESR s p e c t r a . 3.3 D e t e r m i n a t i o n of S p i n H a m i l t o n i a n Parameters of {V} and  C o n t r o l E x p e r i m e n t s . The s p i n H a m i l t o n i a n parameters (T and g) of the s p i n l a b e l {VI} i n 30% g l y c e r o l and D_0 were d e t e r m i n e d i n a low te m p e r a t u r e s t u d y . In a d d i t i o n ESR s p e c t r a of the s p i n probe were r e c o r d e d i n the presence of b u f f e r e d s o l u t i o n c o n t a i n i n g N a + , C a 2 + , c a r d i o l i p i n i n the l a m e l l a r phase and c a r d i o l i p i n i n the hexagonal phase a t room temperature f o r c o n t r o l p u r p o s e s . In a d d i t i o n ESR s p e c t r a were r e c o r d e d of the s p i n probe i n c h l o r o f o r m and c h l o r o f o r m w i t h c a r d i o l i p i n . 3.4 Sample P r e p a r a t i o n . In b oth 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d s p i n probe and s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n e x p e r i m e n t s the r a t i o of s p i n l a b e l l e d m o l e c u l e t o c a r d i o l i p i n was a d j u s t e d t o 1:100. In the case of t h e s t e a r i c a c i d probe e x p e r i m e n t s , t h i s was done by ad d i n g the c o r r e c t volume of a s t o c k s o l u t i o n (5X10~ 3M) of s p i n probe. For t h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n e xperiment t h i s was done by i n t e g r a t i n g the c e n t r e f i e l d l i n e and comparing i t t o s t a n d a r d s ' and then d i l u t i n g w i t h c a r d i o l i p i n t o the d e s i r e d c o n c e n t r a t i o n . 28 F o l l o w i n g t h i s t h e s o l v e n t was r e m o v e d u s i n g a g e n t l e s t r e a m o f n i t r o g e n g a s , t h e r e s u l t i n g f i l m was pumped on f o r 1 h o u r a t 0.1 t o r r t o r e m o v e a l l t r a c e s o f s o l v e n t . P r e p a r a t i o n o f L a m e l l a r P h a s e . T h e d r i e d l i p i d ( s e e a b o v e ) was t h e n d i s p e r s e d i n 50-100 m i c r o - l i t r e o f b u f f e r ( 1 O O m M EDTA, l O O m M N a C l , 11OmM t r i s - H C l pH 7 . 3 ) . T h e l a m e l l a r p h a s e was f o r m e d by v o r t e x i n g u n t i l t h e l i p i d was d i s p e r s e d . T h e a d d i t i o n o f EDTA t o t h e b u f f e r i s t o p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f t h e h e x a g o n a l p h a s e o r a n y o t h e r p h a s e i n d u c e d by d i v a l e n t c a t i o n s t h a t may be p r e s e n t i n t h e c a r d i o l i p i n a s an i m p u r i t y . T h e v o l u m e o f b u f f e r u s e d c o n s e q u e n t l y , d e p e n d e d on t h e v a r i a b l e d i v a l e n t i o n c o n t e n t o f t h e c o m m e r c i a l l y b o u g h t l i p i d [ 1 1 ] . P r e p a r a t i o n o f H e x a g o n a l P h a s e . T h e c a r d i o l i p i n , t o g e t h e r w i t h t h e s p i n p r o b e ( 1 0 0 : 1 ) was f i r s t d i s p e r s e d a s t h e l a m e l l a r p h a s e . S u b s e q u e n t l y t h e h e x a g o n a l p h a s e was p r o d u c e d , by a d d i n g b u f f e r e d C a 2 + s o l u t i o n (lOOmM C a C l 2 , 50mM t r i s - H C l pH 7.3) u n t i l a one t o one m o l e r a t i o o f C a 2 + t o c a r d i o l i p i n was a c h i e v e d . T i t r a t i o n o f L a m e l l a r P h a s e w i t h C a 2 * b u f f e r t o y i e l d H e x a g o n a l  P h a s e . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t h e s t e a r i c a c i d p r o b e . T h e s a m p l e was f i r s t d i s p e r s e d i n t o t h e l a m e l l a r p h a s e . T h e n i n c r e m e n t a l a m o u n t s ( 1 0 - 2 0 %) o f C a 2 * b u f f e r (lOOmM C a C l ? , 29 50mM t r i s - H C l ) were a d d e d . T h e s a m p l e was v o r t e x e d f o r 20 m i n u t e s t o y i e l d an u n i f o r m m i x t u r e . T h e n ESR s p e c t r a o f t h e s a m p l e w e r e r e c o r d e d a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e f r o m 2 0 - 5 0 ° C a t 3 - 5 ° C i n t e r v a l s . T h e a b o v e p r o c e d u r e was r e p e a t e d u n t i l a one t o o n e m o l e r a t i o o f C a 2 " / c a r d i o l i p i n was r e a c h e d . S p i n P r o b e s t u d i e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s  C a 2 ^ . Two a p p r o a c h e s w e r e u s e d t o s t u d y t h e e f f e c t o f e x c e s s C a 2 * on t h e h e x a g o n a l p h a s e . I n o n e , t h e b u f f e r e d C a 2 * s o l u t i o n c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t a n d t h e c a r d i o l i p i n c o n c e n t r a t i o n was v a r i e d . I n t h e o t h e r s e t o f e x p e r i m e n t s t h e s i t u a t i o n was r e v e r s e d , t h e c a r d i o l i p i n c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t a n d t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n was v a r i e d . A c a r d i o l i p i n s a m p l e (5 mg) was f i r s t d i s p e r s e d t o t h e l a m e l l a r p h a s e a n d t h e n p r e c e p i t a t e d by a d d i t i o n o f e q u a l m o l e % o f C a 2 * [0.1M] a s i n p r e p a r a t i o n o f h e x a g o n a l p h a s e ( c a r d i o l i p i n c o n c e n t r a t i o n [ 0 . 1 M ] ) . ESR s p e c t r a were t h e n r e c o r d e d a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e f o r t h e s a m p l e a n d f o r s u b s e q u e n t s a m p l e s . A f t e r t h e ESR s t u d y t h e s a m p l e was d i l u t e d i n 5 t i m e s t h e i n i t i a l v o l u m e o f b u f f e r e d C a 2 * s o l u t i o n t o g i v e a m o l e r a t i o o f 1 t o 5 c a r d i o l i p i n / C a 2 * ( c a r d i o l i p i n [ 0 . 0 2 M ] ) . T h e n t h e s a m p l e was a g a i n d i l u t e d , t o 15 t i m e s t h e i n i t i a l v o l u m e t o g i v e a r a t i o o f 1 t o 15 c a r d i o l i p i n / C a 2 * ( c a r d i o l i p i n [ 6.7mM]). I n t h e s e c o n d s e t o f e x p e r i m e n t s t h e c a r d i o l i p i n c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t [6.7mM] by h a v i n g c a r d i o l i p i n (5 mg) d i s p e r s e d i n b u f f e r ( 0 . 5 m l ) o f d i f f e r e n t C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s . T h e c o n c e n t r a t i o n o f C a 2 * u s e d w e r e 0.1M, 0.5M, 30 1.0M, 2.5M, and 5.0M with c a r d i o l i p i n to C a 2 + ration of 1 to 15, 75, 150, 375, and 750 respectively. 3.5 Manipulation of samples. ESR samples of the lamellar phases and non-precipitated material were taken up in one to three 20 m i c r o - l i t r e disposable pipets. For the hexagonal phases and precipitated samples a 100 m i c r o - l i t r e pipet was used. To load the micro pipets the sample was taken up by suction and the other end of the pipet was thermally sealed. The sample, after cooling the tube, was then centrifuged down to the sealed end. 3.6 The Recording of ESR spectra. A l l ESR spectra were recorded on an ESR spectrometer which consisted of: a Varian 12" magnet with a Mk II f i e l d - d i a l c ontrol, an Hewlett-Packard klystron power supply and sweep unit, a home-built AFC and 100 kHz modulation unit and an Ithaco 391A phase-lock amplifier. The microwave bridge was a r e f l e c t i v e homodyne type using a TE 102 cavity, three port c i r c u l a t o r , Schottky detector diode and a microwave bucking arm. The cavity was f i t t e d with a dewar system and the temperature controlled to ±0.1°C using a Varian temperature control unit. The temperature was measured by means of a copper-constantan thermocouple inserted into the cavity. The magnetic f i e l d was cali b r a t e d with a home-built proton magnetometer. The spectra, along with c a l i b r a t i o n data, were recorded using a Hewlett-Packard X-Y recorder. 31 CHAPTER 4  R ESULTS 4.1 S p i n p r o b e s t u d i e s o f c a r d i o l i p i n i n t h e L a m e l l a r P h a s e . T h e s p i n p r o b e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d was i n c o r p o r a t e d i n t o t h e l a m e l l a r p h a s e o f c a r d i o l i p i n a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 3. ESR s p e c t r a w e r e r e c o r d e d o v e r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 5 - 5 0 ° C a t 3 - 5 ° C i n t e r v a l s . T h e ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d i n t h e l a m e l l a r p h a s e o f c a r d i o l i p i n a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e i s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 4.1. S p e c t r a o b t a i n e d w e r e t h e s l o w m o t i o n t y p e w h i c h c o u l d be a n a l y s e d i n t e r m s o f t h e o r d e r p a r a m e t e r S o r t h e a p p a r a n t h y p e r f i n e c o u p l i n g T,\. T h e t e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f T,\ i s shown i n f i g u r e 4.2. T h e t e m p e r a t u r e p r o f i l e shows a d i s c o n t i n u i t y a t 3 7 ° C w h i c h c a n be a t t r i b u t e d t o t h e t h e r m o t r o p i c p h a s e t r a n s i t i o n o f t h e d i s o d i u m c a r d i o l i p i n [ 2 8 ] . R e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h i s s t u d y a r e i n a g r e e m e n t w i t h " t h e r e s u l t s o b t a i n e d by H e g n e r e t a l . 4.2 S p i n p r o b e s t u d i e s o f c a r d i o l i p i n i n H e x a g o n a l P h a s e . ESR s p e c t r a w e r e r e c o r d e d f o r 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d i n c o r p o r a t e d i n t h e c a r d i o l i p i n h e x a g o n a l p h a s e o v e r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 3 - 5 5 ° C a t 3 - 5 ° C i n t e r v a l s . F i g u r e 4.3 shows s p e c t r a o f t h e s p i n p r o b e i n t h e C a 2 * c o m p l e x e d c a r d i o l i p i n p r e c i p i t a t e s a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e s . T h e s e s p e c t r a show an i i . c r e a s e i n t h e amount o f h y p e r f i n e s p l i t t i n g T,'( w h i c h s i g n i f i e s a d e c r e a s e i n t h e m o t i o n a l f r e e d o m o f t h e p r o b e . T h e T' were F i g u r e 4. 1 ESR s p e c t r a o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n t h e l a m e l l a r p h a s e o f c a r d i o l i p i n a t t e m p e r a t u r e s . °c 39.0 29.1 205 9.9 ro 33 I i i i — 1 ' ^ o io *° 5 0 • ^° * ° 6 0 T E M P E R A T U R E l°C) F i g u r e 4.2 T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f T,', o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e c a r d i o l i p i n l a m e l l a r p h a s e . F i g u r e 4.3 ESR s p e c t r a of 5-doxyl s t e a r i c a c i d spin probe in the hexagonal phase. 35 m e a s u r e d a n d a r e p l o t t e d a g a i n s t t e m p e r a t u r e i n f i g u r e 4.4. No d i s c o n t i n u i t y was o b s e r v e d , w h i c h was e x p e c t e d s i n c e t h e t h e r m o t r o p i c p h a s e t r a n s i t i o n o f t h e c a l c i u m c a r d i o l i p i n i s 9 0 ° C [ 2 8 ] . On t h e same p l o t i s t h e t e m p e r a t u r e p r o f i l e o f t h e s p i n p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e o f c a r d i o l i p i n t o i l l u s t r a t e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e a s m o n i t o r e d by t h e s p i n p r o b e . T h i s r e s u l t i s a g a i n i n a g r e e m e n t w i t h H e g n e r e t a l [ 1 4 ] . 4.3 S p i n P r o b e S t u d i e s o f M i x e d p h a s e s . T o f u r t h e r s t u d y t h e l a m e l l a r t o h e x a g o n a l p h a s e t r a n s i t i o n , a t i t r a t i o n e x p e r i m e n t was p e r f o r m e d . I n t h e s e e x p e r i m e n t s t h e l a m e l l a r d i s p e r s i o n s w e r e t i t r a t e d w i t h b u f f e r e d C a 2 * s o l u t i o n u n t i l o n e t o one C a 2 * t o c a r d i o l i p i n m o l e r a t i o o r 50 m o l e % o f C a 2 * was a d d e d . ESR s p e c t r a a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e s w e r e r e c o r d e d f o r e a c h s t e p o f t h e C a 2 * t i t r a t i o n e x p e r i m e n t t o y i e l d t h e h e x a g o n a l p h a s e f r o m t h e l a m e l l a r p h a s e . A t e m p e r a t u r e p r o f i l e was o b t a i n e d f o r t h e s p i n p r o b e i n t h e c a r d i o l i p i n e n v i r o n m e n t w i t h 9, 17, 29, 38, 41, 47 a n d 50 m o l e % o f b u f f e r e d C a 2 * s o l u t i o n . T h e s p e c t r a o f t h e s p i n p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e i n t h e p r e s e n c e o f 17 m o l e % o f C a 2 * a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s a r e i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 4.5. T h e s e s p e c t r a show t h e T,'( o b t a i n e d was l a r g e r t h a n t h o s e f o r t h e l a m e l l a r p h a s e i n t h e a b s e n c e o f C a 2 * i n d i c a t i n g a more o r d e r e d e n v i r o n m e n t . T h e same r e s u l t s w e r e o b t a i n e d by d i s p e r s i n g c o m m e r c i a l c a r d i o l i p i n i n b u f f e r e d Na* s o l u t i o n c o n t a i n i n g no EDTA t o c h e l a t e a n y C a 2 * p r e s e n t . T h i s i n d i c a t e s t h e s m a l l amount o f C a 2 * o r d i v a l e n t i m p u r i t y 3 6 F i g u r e 4.4 10 (.o jo 4o TEMPERATURE (°C) Temperature dependence of T,', of 5-doxyl s t e a r i c a c i d s p i n probe i n the c a r d i o l i p i n hexagonal phase. 38 p r e s e n t i n t h e c o m m e r c i a l l y b o u g h t c a r d i o l i p i n [ 1 1 ] i s e n o u g h t o o r d e r t h e l a m e l l a r p h a s e . T h e T^ was m e a s u r e d a n d p l o t t e d a g a i n s t t e m p e r a t u r e i n f i g u r e 4.6 f o r t h e d i f f e r e n t m o l e % o f C a 2 * a d d e d . T h e r e s u l t s o f t h e l a m e l l a r a n d h e x g o n a l p h a s e s a r e o u t l i n e d t o show t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t h r e e s e t s o f e x p e r i m e n t s . No p r e c i p i t a t i o n was e v i d e n t u n t i l a b o u t 38 m o l e % o f C a 2 * w e r e a d d e d t o t h e s a m p l e . B e t w e e n 9-29 m o l e % o f C a 2 + a d d e d t h e h y p e r f i n e s p l i t t i n g a t h i g h t e m p e r a t u r e a p p r o a c h e s t h o s e o f t h e h e x a g o n a l p h a s e a n d e x c e e d them a b o v e 5 0 ° C . T h i s o b s e r v a t i o n w i l l be d i s c u s s e d l a t e r . T h e t i t r a t i o n e x p e r i m e n t r e s u l t s a l s o s h o w e d t h a t b e t w e e n t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n o f 9 a n d 38 m o l e % we c a n r e s o l v e two o v e r l a p p e d s p e c t r a a b o v e 4 0 ° C . A r e s o l v e d s p e c t r u m i s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 4.7. T h e T^ o f t h e r e s o l v e d s p e c t r u m c o r r e s p o n d s t o t h e T,'4 o f t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e a t t h e same t e m p e r a t u r e . T h i s shows t h a t t h e s p i n p r o b e i s m o n i t o r i n g two d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s . 4.4 ESR S p i n P r o b e S t u d i e s o f t h e H e x a g o n a l P h a s e i n t h e  P r e s e n c e o f E x c e s s C a 2 " . I n a f u r t h e r s e t o f e x p e r i m e n t s t h e h e x a g o n a l p h a s e o f c a r d i o l i p i n i s s u b j e c t e d t o a n e x c e s s amount o f C a 2 * . Two r o u t e s w e r e u s e d f o r t h i s a s i n d i c a t e d i n s e c t i o n 3. No n o t i c a b l e d i f f e r e n c e was o b s e r v e d i n t h e T,\ m e a s u r e m e n t when t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t a t 0.1M w i t h t h e c a r d i o l i p i n c o n c e n t r a t i o n v a r i e d f r o m 0.1M t o 6.7mM. A l t e r n a t i v e l y when t h e c o n c e n t r a t i o n o f c a r d i o l i p i n was k e p t c o n s t a n t a t 6.7mM a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f C a 2 * v a r i e d f r o m 39 ior TEMPERATURE ( ° C ) F i g u r e 4.6 T,', v s t e m p e r a t u r e f o r 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e w i t h v a r i o u s m o l e % o f C a 2 * . F i g u r e 4.7 A r e s o l v e d ESR s p e c t r a of V 5-doxyl s t e a r i c a c i d s p i n probe i n the mixed phase. 41 0.1M t o 5.0M-, a l a r g e c h a n g e was o b s e r v e d i n t h e v a l u e o f . ESR s p e c t r a r e c o r d e d a t a b o u t 2 0 ° C f o r e a c h o f t h e f i v e c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + a r e i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 4.8. ESR s p e c t r a w e r e r e c o r d e d a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e a t e a c h C a 2 + c o n c e n t r a t i o n . The v a u l e s o f T,', w e r e o b t a i n e d a n d p l o t t e d a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e i n f i g u r e 4.9. T h e r e s u l t s show when C a 2 + c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d t h e TJ, a l s o i n c r e a s e d i n d i c a t i n g a n i n c r e a s e i n o r d e r . 4.5 T h e D e t e r m i n a t i o n o f S p i n H a m i l t o n i a n P a r a m e t e r s . T h e s p i n H a m i l t o n i a n p a r a m e t e r s o f {V} were d e t e r m i n e d i n a lo w t e m p e r a t u r e s t u d y . T h e s e p a r a m e t e r s a r e n e e d e d f o r t h e c a l c u l a t i o n o f c o r r e l a t i o n t i m e s a n d f o r d e t e r m i n i n g t h e r i g i d l i m i t o f t h e s p i n l a b e l . T h e t e m p e r a t u r e w h i c h g a v e t h e m o s t w e l l r e s o l v e d s p e c t r u m o f s p i n p r o b e {V} i n 30% g l y c e r o l a n d D 2 0 was - 5 7 . 5 ° C . F r o m t h e s p e c t r u m t h e a p p a r e n t T a n d g v a l u e s w e r e m e a s u r e d . T h e s e v a l u e s w e r e u s e d a s t h e s t a r t i n g p o i n t f o r s i m u l a t i n g t h e s p e c t r u m t o f i n d m ore a c c u r a t e T a n d g v a l u e s f o r s p i n p r o b e {V}. T h e e x p e r i m e n t a l a n d t h e s i m u l a t e d s p e c t r a a r e shown i n f i g u r e 4.10, a n d 4.11 r e s p e c t i v e l y . T h e s p i n H a m i l t o n i a n p a r a m e t e r s u s e d i n t h e s i m u l a t i o n shown i n f i g u r e 4.11 a r e l i s t e d b e l o w : T n = 36.8 G g „ =2.0017 T_ = 5.8 G g _ =2.0069 Th e s p e c t r a l s i m u l a t i o n s w e r e p e r f o r m e d u s i n g c o m p u t e r p r o g r a m m e s w r i t t e n by J . C. T a i t [ 3 6 ] . F i g u r e 4.8 ESR s p e c t r a of 5 - d o x y l the hexagonal pha c o n c e n t r a t i o n s . 43 X 32 Jo 2i 2* vo. at * F i g u r e 4.9 ZO 10 AO T E M P E R A T U R E ( 0 O • T,', v s t e m p e r a t u r e o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e h e x a g o n a l p h a s e a t v a r i o u s Ca 2 * c o n c e n t r a t i o n s . F i g u r e 4.10 ESR s p e c t r u m o f s p i n p r o b e {V) i n 30% g l y c e r o l a n d D_0. F i g u r e 4.11 Simulated spectrum of spin probe {V} in 30% g l y c e r o l and D 20. c n 46 4.6 C o n t r o l s t u d i e s o f s p i n p r o b e {V}. T h e ESR s p e c t r a o f s p i n p r o b e {V} i n c o n t r o l s t u d i e s were r e c o r d e d a t room t e m p e r a t u r e . T h e c o n t r o l s t u d i e s f o r s p i n p r o b e {V} a r e a s f o l l o w : i n c h l o r o f o r m , c h l o r o f o r m c o n t a i n i n g c a r d i o l i p i n , a b u f f e r e d s o l u t i o n c o n t a i n i n g Na* (0.1M pH 7 . 2 ) , a b u f f e r e d s o l u t i o n c o n t a i n i n g C a 2 * (0.1M pH 7 . 3 ) , c a r d i o l i p i n l a m e l l a r p h a s e , a n d c a r d i o l i p i n h e x a g o n a l p h a s e . T h e s i x s p e c t r a w e r e s i m l i a r a n d c o n s i s t e d o f t h r e e n a r r o w l i n e s o f a l m o s t e q u a l i n t e n s i t y . A t y p i c a l s p e c t r u m i s shown i n f i g u r e 4.12. T h e t h r e e l i n e h e i g h t s a n d t h e l i n e w i d t h o f t h e m i d f i e l d l i n e w e r e m e a s u r e d a n d t h e i r a n d c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u a t i o n ( 2 . 6 , 2.7) i n C h a p t e r 2. T h e T& a n d "Recalculated f o r t h e s i x control s t u d i e s f o r t h e s p i n p r o b e {V} a r e i n t a b l e 4.1. 4.7 S L C L i n C h l o r o f o r m . t'.SR s p e c t r a o f S L C L i n c h l o r o f o r m w e r e r e c o r d e d t o t e s t t h e p u r i t y o f t h e S L C L f o r c o n t a m i n a t i o n f r o m u n r e a c t e d s p i n l a b e l b e f o r e u s e i n ESR s t u d i e s . A s p e c t r u m o f S L C L i n c h l o r o f o r m i s shown i n f i g u r e 4.13. I n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e S L C L t h e T L C o f t h e c r u d e S L C L was r e p e a t e d u n t i l t h e r a t i o (R) o f t h e h i g h f i e l d l i n e t o t h e mid f i e l d l i n e was c o n s t a n t . T h e r a t i o o b t a i n e d for p u r i f i e d S L C L was R=0.65 a s c o m p a r e d t o R o f a l m o s t e q u a l t o one for t h e s p i n p r o b e {V} i n s o l u t i o n . T h e s m a l l e r t h e r a t i o (R) o f h i g h f i e l d l i n e t o c e n t r a l l i n e t h e less u n r e a c t e d s p i n l a b e l i s p r e s e n t . D u r i n g t h e tests t o d e t e r m i n e t h e p u r i t y ot t h e S L C L , t h e r a t i o R i n c r e a s e w i t h t h e e x p o s u r e t o h i g h t e m p e r a t u r e s and l e n g t h o f t i m e a f t e r T L C . T h i s i n d i c a t e s t h e 48 Table 4.1 Medium (s) (s) Chloroform S o l u t i o n 2.40X10- 1 1 2.79X10' 1 1 Chloroform S o l u t i o n with C a r d i o l i p i n 4.02X10" 1 1 4.04X10" 1 1 B u f f e r e d Aqueous Na* S o l u t i o n 1.52X10- 1 1 2.19X10" 1 1 B u f f e r e d Aqueous Ca 2* S o l u t i o n 1.93X10" 1 1 3.50X10" 1 1 Lamellar Phase of C a r d i o l i p i n i n B u f f e r e d Aqueous Na* S o l u t i o n 1.40X10" 1 1 2.08X10- 1 1 Hexagonal Phase of C a r d i o l i p i n i n B u f f e r e d Aqueous Ca 2* S o l u t i o n 1.59X10" 1 1 2.91X10" 1 1 50 S L C L i s n o t a v e r y s t a b l e m o l e c u l e . The s p i n m o i e t y t e n d s t o f a l l o f f t h e c a r d i o l i p i n m o l e c c u l e w i t h e x p o s u r e t o h i g h t e m p e r a t u r e a n d e x t e n d e d l e n g t h o f t i m e a f t e r i t h a d b e e n T L C . 4.8 S L C L i n L a m e l l a r P h a s e . ESR s p e c t r a o f t h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n i n t h e l a m e l l a r s t r u c t u r e (100:1 u n l a b e l l e d t o l a b e l l e d ) w e r e r e c o r d e d f o r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 3 - 3 5 ° C a t 3 - 5 ° C i n t e r v a l s . T h e s p e c t r a o b t a i n e d a s shown i n f i g u r e 4.14 c o n s i s t o f t h r e e n a r r o w l i n e s i n d i c a t i n g t h e s p i n l a b e l t o be i n r a p i d m o t i o n . T h e t h r e e l i n e h e i g h t s a n d t h e l i n e w i d t h o f t h e m i d f i e l d ' l i n e w e r e m e a s u r e d f o r e a c h s p e c t r u m a t e a c h t e m p e r a t u r e a n d t h e c o r r e l a t i o n t i m e s c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2. T h e c o r r e l a t i o n t i m e s a n d Tc) were p l o t t e d a g a i n s t t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 4.15) w h i c h s h o w e d a s m o o t h d e c r e a s e o f c o r r e l a t i o n t i m e w i t h t e m p e r a t u r e . T h i s r e s u l t was e x p e c t e d s i n c e t h e S L C L n i t r o x i d e m o i e t y i s a t t h e h e a d g r o u p a n d i s m o n i t o r i n g t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t a b o v e t h e b i l a y e r . 4.9 S L C L i n H e x a g o n a l P h a s e . T h e ESR s p e c t r a o f S L C L i n t h e h e x a g o n a l p h a s e i s d r a s t i c a l l y c h a n g e d f r o m t h e ESR l i n e s h a p e o b s e r v e d o f S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e r e f l e c t i n g much l e s s m o b i l i t y o f t h e p r o b e . ESR s p e c t r a w e r e r e c o r d e d f o r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 5 - 5 0 ° C i n 3-5 ° C i n t e r v a l . ESR s p e c t r a o f S L C L i n h e x a g o n a l p h a s e o f c a r d i o l i p i n a t s e v e r a l t e m p e r a t u r e s a r e i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 4.16. T i e l i n e s h a p e i s no l o n g e r t h e t h r e e n a r r o w l i n e s a s l a m e l l a r phase. a F i g u r e 4.15 10 J.O >o +o T e M P E R A T U M (° C") "Q a n d "Z*c y s t e m p e r a t u r e f o r S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e . So 54 r e c o r d e d b e f o r e f o r t h e l a m e l l a r p h a s e . The ESR s p e c t r a o b t a i n e d i n d i c a t e t h a t t h e m o t i o n m o n i t o r e d by t h e S L C L t o be i n t h e s l o w m o t i o n r e g i m e a t low t e m p e r a t u r e s a n d i n an i n t e r m e d i a t e m o t i o n r e g i m e a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s . T h e ESR s p e c t r a a l s o showed a v e r y s m a l l amount o f f r e e n i t r o x i d e s p i n p r o b e was p r e s e n t i n t h e s a m p l e ( i n d i c a t e d by a n a r r o w ) p o s s i b l y f r o m t h e d e g r a d a t i o n o f t h e S L C L o r f r o m u n r e a c t e d s p i n l a b e l . 4.10 S L C L i n H e x a g o n a l P h a s e w i t h E x c e s s o f C a 2 * . No l i n e s h a p e c h a n g e f o r t h e S L C L was o b s e r v e d when C a 2 * c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f c a r d i o l i p i n v a r i e d . T h i s r e s u l t i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t o b t a i n e d w i t h t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e . When t h e c o n c e n t r a t i o n o f c a r d i o l i p i n was k e p t c o n s t a n t a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f C a 2 * v a r i e d t h e l i n e s h a p e c h a n g e d d r a s t i c a l l y . I n f i g u r e 4.17 ESR s p e c t r a o f S L C L m o n i t o r i n g t h e h e x a g o n a l p h a s e o f c a r d i o l i p i n a t v a r i o u s C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s a t a b o u t 2 0 ° C a r e shown. Th e c h a n g e i n l i n e s h a p e i n d i c a t e s l e s s m o t i o n i n t h e s y s t e m a s t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d . A p l o t o f t h e low t e m p e r a t u r e r e s u l t a t v a r i o u s C a 2 * c o n c e n t r a t i o n s i s shown i n f i g u r e 4.18 f o r t h e s l o w m o t i o n l i n e s h a p e w h e r e T,'j c a n be m e a s u r e d . A g a i n a s m a l l amount o f f r e e n i t r o x i d e s p i n p r o b e i s p r e s e n t . 3i F i g u r e 4.18 T,', v s t e m p e r a t u r e f o r S L C L i n v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s . 57 4.11 S L C L i n M i x e d P h a s e s . S L C L i n t h e m i x e d p h a s e was a t t e m p t e d . An ESR s p e c t r u m o f S L C L i n t h e o r d e r e d l a m e l l a r p h a s e a t a b o u t 2 0 ° C i s shown i n f i g u r e 4.19. The s p e c t r u m c l e a r l y c o n s i s t s o f two o v e r l a p p e d s p e c t r a , one f r o m t h e p r o b e i n t h e l a m e l l a r p h a s e a n d t h e o t h e r i n a more r e s t r i c t e d r e g i o n w h e r e t h e m o t i o n i s s l o w e r . T h u s , a s i n t h e c a s e o f 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d p r o b e , we h a v e e v i d e n c e o f two p h a s e s ( o r s t r u c t u r e s ) i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 * a t l e s s t h a n 1:1 m o l e r a t i o . U n f o r t u n a t e l y i t was n o t p o s s i b l e t o q u a n t i t a t e t h e m i x t u r e o f p h a s e s d u e t o v a r i a b l e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n t r o d u c e d i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e S L C L . oo 59 CHAPTER 5  DISCUSSION 5.1 ESR S t u d i e s of The Lamellar and Hexagonal Phase of  C a r d i o l i p i n . ESR s p e c t r a from 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d s p i n probe i n c o r p o r a t e d i n the c a r d i o l i p i n l a m e l l a r phase p r o v i d e s i n f o r m a t i o n about the m o b i l i t y of the s p i n probe or i n d i r e c t l y the f l u i d i t y of the l a m e l l a r phase. The ESR data showed that T,', f o r the s p i n probe i s l i n e a r l y dependent on temperature over the temperature ranges 4~37°C and 37-60°C and with a d i s c o n t i n u i t y at 37°C. The l i n e a r dependence of T,\ of the s p i n probe on temperature can be i n t e r p r e t e d as due to an i n c r e a s e i n the f l u i d i t y (order and m o b i l i t y ) of the l i p i d as temperature i s i n c r e a s e d . The d i s c o n t i n u i t y can be i n t e r p r e t e d as the thermotropic phase t r a n s i t i o n of the disodium c a r d i o l i p i n . The phase t r a n s i t i o n of aqueous d i s p e r s i o n s of c a r d i o l i p i n s has been s t u d i e d by d i f f e r e n t i a l scanning c a l o r i m e t r y [28]. I t was found that the phase t r a n s i t i o n temperature of 16:0 c a r d i o l i p i n i s 39.5°C and the temperature i n c r e a s e s by 15°C f o r each e t h y l r e s i d u e a d d i t i o n . Thus, s i n c e c a r d i o l i p i n from beef heart i s mainly l i n o l e i c (18:1) a c y l c h a i n s , we might expect the t r a n s i t i o n temperature to be 55°C, t h i s phase t r a n s i t i o n temperature i s approximately 18°C higher than from our r e s u l t . The lower t r a n s i t i o n temperature i s a l m o s t ' c e r t a i n l y due to the presence of the double bond [14]. The g e l - t o - l i q u i d c r y s t a l l i n e thermotropic phase t r a n s i t i o n 60 i s n o t o f t h e c a r d i o l i p i n i t s e l f , s i n c e no t h e r m o t r o p i c t r a n s i t i o n was d e t e c t e d f o r t h e d r y l i p i d s a m p l e [ 2 8 ] . T h i s t r a n s i t i o n i s a c h a r a c t e r i s t i c o f t h e b i l a y e r o r g a n i z a t i o n a s s u m e d by t h e h y d r a t e d c a r d i o l i p i n . T h e a b r u p t c h a n g e o f t h e f l u i d i t y o f t h e l a m e l l a r p h a s e i s a t t r i b u t e d t o a c h a n g e i n t h e p a c k i n g o f t h e l i p i d i n t h e b i l a y e r [ 1 4 , 2 8 ] . R e s u l t s f r o m t h e s p i n p r o b e i n c o r p o r a t e d i n t h e c a r d i o l i p i n h e x a g o n a l p h a s e s h o w e d a n o n - l i n e a r r e l a t i o n s h i p o f T,', w i t h r e s p e c t t o t e m p e r a t u r e a n d no d i s c o n t i n u i t y o v e r t h e r a n g e o f 3-5 5 ° C . I n t h e p r e s e n c e o f C a 2 * t h e t r a n s i t i o n o b s e r v e d i n t h e l a m e l l a r p h a s e d o e s n o t o c c u r [ 1 4 ] . T h i s o b s e r v a t i o n i s e x p e c t e d s i n c e t h e g e l - t o - l i q u i d c r y s t a l l i n e t r a n s i t i o n f o r c a l c i u m c a r d i o l i p i n i s e x p e c t e d t o be a t 9 0 ° C [ 2 8 ] . T h e n o n l i n e a r d e p e n d e n c e o f t h e s p i n p r o b e m o t i o n t o t e m p e r a t u r e c a n be v i e w e d a s a c o m b i n a t i o n o f t h e e f f e c t o f more f l u i d l i p i d a s t e m p e r a t u r e i n c r e a s e d , t h e d e c r e a s i n g s i z e o f t h e w a t e r c h a n n e l a n d o v e r a l l c o m p a c t i n g o f t h e h e x a g o n a l p h a s e w i t h t e m p e r a t u r e [ 1 1 ] . S o a s t h e t e m p e r a t u r e i s i n c r e a s e d t h e a d d e d m o t i o n o f t h e p r o b e i s p a r t i a l l y c a n c e l l e d o u t by t h e more o r d e r e d l i p i d u n t i l t h e t e m p e r a t u r e e f f e c t d o m i n a t e s t h e l i p i d s t r u c t u r e e f f e c t . T h e r e s u l t s f r o m o u r s t u d y o f t h e c a r d i o l i p i n l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e s w i t h t h e s p i n l a b e l l e d c a r d i o l i p i n c o n f i r m t h e r e s u l t s u s i n g t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e . T h e s p e c t r a f r o m t h e S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e showed t h e s p i n l a b e l t o be i n t h e f a s t m o t i o n a l r e g i m e . T h i s i s t o be e x p e c t e d s i n c e t h e s p i n l a b e l i s m o n i t o r i n g t h e a q u e o u s p h a s e a b o v e t h e b i l a y e r . So no d i s c o n t i n u i t y i s • e x p e c t e d a s i t i s n o t m o n i t o r i n g t h e b i l a y e r . T h i s i s a n i n d i r e c t way o f i n d i c a t i n g t h a t t h e 61 n i t r o x i d e m o i e t y i s i n f a c t l o c a t e d on t h e h e a d g r o u p . T h e r a t i o o f °Z?t / > 1 f r o m t h e r e s u l t i n d i c a t e t h e p r e f e r r e d a x i s f o r r o t a t i o n i s t h e Y a x i s [ 2 5 ] . A m o d e l o f t h e p o s i t i o n o f t h e n i t r o x i d e m o i e t y i n t h e b i l a y e r a n d t h e p r e f e r r e d a x i s o f r o t a t i o n i s shown i n f i g u r e 5.1. A f u r t h e r i n d i c a t i o n o f t h e s p i n l a b e l on t h e h e a d g r o u p i s t h a t when C a 2 + i s i n t r o d u c e d t o t h e s y s t e m , t h e ESR s p e c t r a c h a n g e d d r a s t i c a l l y f r o m i n d i c a t i n g r a p i d m o t i o n t o t h a t r e f l e c t i n g a much more i m m o b i l e p r o b e . T h i s i n d i c a t e s t h e a q u e o u s p h a s e a v a i l a b l e t o t h e s p i n l a b e l i n t h e h e x a g a o n a l p h a s e i s v e r y r e s t r i c t i v e . When t h e s p i n l a b e l i s i n t h e o h e x a g o n a l p h a s e i t i s i n a c y l i n d r i c a l a q u e o u s c h a n n e l s o f 15 A d i a m e t e r , t h u s i t s m o t i o n i s more r e s t r i c t e d t h a n t h e l a m e l l a r p h a s e . As i n d i c a t e d i n c h a p t e r 4 o u r r e s u l t s f o r t h e s t u d y o f t h e l a m e l l a r p h a s e a n d t h e h e x a g o n a l p h a s e a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o f H e g n e r e t a l [ 1 4 ] a n d n o t w i t h t h e r e s u l t s o f H s i a e t a l [ 1 5 ] , T h e s p i n p r o b e u s e d f o r o u r e x p e r i m e n t s was t h e same one u s e d by H e g n e r e t a l b u t s l i g h t l y d i f f e r e n t f r o m t h e one u s e d by H s i a e t a l . T h e d i f f e r e n c e i n t h e s p i n p r o b e s a r e i n t h e l e n g t h o f t h e h y d r o c a r b o n c h a i n . T h e H s i a g r o u p u s e d t h e 5-d o x y l - p a l m i t i c a c i d p r o b e w h i c h i s two c a r b o n l e n g t h s h o r t e r t h a n t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d p r o b e . T h i s d i f f e r e n c e d o e s n o t c r e a t e a s i g n i f i c a n t p r o b l e m s i n c e b o t h o f t h e s p i n m o i e t i e s a r e on t h e f i f t h c a r b o n s a n d a r e m o n i t o r i n g t h e e n v i r o n m e n t a r o u n d t h i s r e g i o n . T h e s l i g h t d i f f e r e n c e i n t h e s p i n p r o b e s u s e d d o e s n o t a c c o u n t f o r t h e d i s c r e p e n c e s i n t h e r e s u l t s . T o c o m p a r e t h e F i g u r e 5.1 S L C L i n t h e l a m e l l a r p h a s e i n d i c a t i n g p r e f e r r e d m o t i o n . 63 r e s u l t s we h a v e a s s u m e d t h a t room t e m p e r a t u r e r e f e r r e d t o i n t h e H s i a p a p e r t o be 2 5 ° C . A t 2 5 ° C o u r r e s u l t s a n d t h a t o f H e g n e r ' s i n d i c a t e d T,* f o r l a m e l l a r p h a s e t o be 23.0 G a n d f o r t h e h e x a g o n a l p h a s e 28.5 G w h i l e H s i a ' s a r e 25.3 G a n d 25.2 G r e s p e c t i v e l y . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n c e c a n be f o u n d f r o m o u r r e s u l t s on t h e C a 2 + t i t r a t i o n e x p e r i m e n t . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t i f a s m a l l amount o f C a 2 + i s p r e s e n t , a s l i t t l e a s 9 m o l e p e r c e n t , t h e T,\ i s i n c r e a s e d f r o m 23.0 t o 25.5 G a t 2 5 ° C . A s m e n t i o n e d i n s e c t i o n 4.3, a s i m i l a r s p l i t t i n g i s a l s o o b s e r v e d when EDTA i s n o t u s e d i n f o r m i n g t h e l a m e l l a r d i s p e r s i o n i . e . C a 2 + i m p u r i t y ( f o u n d t o be up t o 3 m o l e % o f C a 2 + [11 3) i n t h e c a r d i o l i p i n c a u s e s an i n c r e a s e i n t h e s p l i t t i n g (T,',) . To e x p l a i n t h e a p p a r e n t d e c r e a s e i n T{ v f o r t h e h e x a g o n a l p h a s e , we h a v e f o u n d t h a t t h e c a r d i o l i p i n w i l l p r e c i p i t a t e o u t a t a p p r o x i m a t e l y 38 m o l e % o f C a 2 * i . e . 0.6 t o 1 m o l e r a t i o C a 2 + t o c a r d i o l i p i n . A t t h i s c o n c e n t r a t i o n t h e v a l u e o f Tv'v i s 26.0 G w h i c h i s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d by H s i a e t a l . A t a m o l e r a t i o o f 1:1 t h e s p l i t t i n g i s 28.5 G. T h u s a p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h e H s i a r e s u l t f o r t h e h e x a g o n a l p h a s e i s t h a t t h e C a 2 + t o c a r d i o l i p i n r a t i o was l e s s t h a n o n e . 5.2 ESR S t u d i e s o f c a r d i o l i p i n w i t h v a r i n g a m o u n t s a n d  c o n c e n t r a t i o n o f C a 2 * . P r i o r t o d i s s c u s s i n g o u r r e s u l t s i t i s u s e f u l t o r e v i e w t h e c u r r e n t v i e w o f t h e f o r m a t i o n o f t h e h e x a g o n a l p h a s e . X - r a y s t u d i e s h a v e shown t h a t i n t h e a b s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n s u c h 64 a s C a 2 * , c a r d i o l i p i n a s s u m e s t h e b i l a y e r s t r u c t u r e a s i n f i g u r e 1.4 [ 1 1 ] . T h e i n t r o d u c t i o n o f e q u i m o l a r o f C a 2 * c a u s e s t h e c a r d i o l i p i n t o f o r m t h e h e x a g o n a l p h a s e ( f i g u r e 1 . 4 ) . T h e s e f i n d i n g s a r e s u p p o r t e d by 3 1 P NMR [ 1 0 , 2 9 ] a n d f r e e z e - f r a c t u r e [ 1 2 , 3 0 ] e x p e r i m e n t s . T h e s e t e c h n i q u e s were a l s o u s e d t o f o l l o w t h e c a r d i o l i p i n a s i t p r o c e e d s f r o m t h e b i l a y e r t o t h e h e x a g o n a l a r r a n g e m e n t [ 2 9 , 3 1 ] . T h e s e s t u d i e s show t h a t c a r d i o l i p i n f o r m s t h e h e x a g o n a l s t r u c t u r e v i a a n i n t e r m e d i a r y p h a s e . T h e o b s e r v a t i o n o f a n i n t e r m e d i a r y p h a s e by 3 1 P NMR was c h a r a c t e r i z e d by i s o t r o p i c m o t i o n a l a v e r a g e d s i g n a l . T h e a d d i t i o n o f C a 2 * t o t h e l a m e l l a r p h a s e r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f l i p i d s t r u c t u r e s v i s u a l i z e d a s p a r t i c l e s o r p i t s on t h e f r e e z e - f r a c t u r e m i c r o g r a p h s . T h e s e p i t s w e r e i n t e r p r e t e d a s i n v e r t e d l i p i d ( s e e f i g u r e 5.2) s t r u c t u r e s s a n d w i c h e d b e t w e e n t h e t h e two m o n o l a y e r s o f t h e l i p i d b i l a y e r [ 3 2 - 3 5 ] . T h e p r e s e n c e o f t h e s e C a 2 * - i n d u c e d ' l i p i d i c p a r t i c l e s ' i s t h e s t a r t i n g p o i n t o f t h e f o r m a t i o n o f t h e t u b e s o f t h e h e x a g o n a l p h a s e . T h e m o d e l t o d e c r i b e t h e f o r m a t i o n o f t h e h e x a g o n a l p h a s e i s a s shown i n i n f i g u r e 5.2. T h e l a m e l l a r p h a s e i s f o r m e d by d i s p e r s i n g t h e c a r d i o l i p i n i n t h e a b s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n w i t h b u f f e r e d Na* s o l u t i o n . As C a 2 * i s a d d e d t o t h e s y s t e m , i t i s d i s t r i b u t e d r a n d o m l y o v e r t h e s u r f a c e o f . t h e l a m e l l a r p h a s e . When t h i s h a p p e n s some o f t h e c a r d i o l i p i n w i l l be c o n v e r t e d t o t h e c a l c i u m s a l t f o r m a n d a s s u m e s a c o n e - s h a p e . T o a c c o m m a d a t e t h i s new c o n e - s h a p e i n t h e m i d s t o f c y l i n d r i c a l s h a p e d o f U i . c r . s l a t e d c a r d i o l i p i n t h e b i l a y e r w i l l b e a l t e r e d t o f o r m d e p r e s s i o n s i n t h e s t r u c t u r e . As "more C a 2 * a r e a d d e d more p i t s +?4 Lame Mar PV\a.se ^ - 0>soA'*u»r\ Co.r oVvoli^rv - O 2> oC=o -Mm F i g u r e 5.2 phase. Model phase JSP f o r the phase t r a n s i t i o n from the l a m e l l a r t o the hexagonal phase w i t h the a d d i t i o n of 66 a r e f o r m e d a n d some w i l l s t a r t t o go i n t o t h e i n v e r t e d m i c e l l e ' c o n f i r g u r a t i o n . M o r e i n v e r t e d m i c e l l e s a r e f o r m e d a s more C a 2 * i s a d d e d . When f u r t h e r C a 2 * i s a d d e d t o t h e s y s t e m i n v e r t e d m i c e l l e s a r e f o r m e d o n t o p o f i n v e r t e d m i c e l l e s . T he i n v e r t e d m i c e l l e s may f u s e t o g e t h e r d u r i n g t h i s p r o c e s s b u t s t i l l s t a y i n t h e l a m e l l a r d i s p e r s i o n . A t a p p r o x i m a t e l y 38 m o l e % o f C a 2 * a d d e d t h e s e f u s e d i n v e r t e d m i c e l l e s f o r m t u b e s o f i n v e r t e d m i c e l l e a n d s t a r t t o p r e c i p i t a t e o u t o f s o l u t i o n . When 1:1 c a r d i o l i p i n t o C a ^ * m o l e r a t i o i s r e a c h e d a l l t h e l i p i d p r e c i p i t a t e s o u t a s h e x a g o n a l p h a s e . We s h a l l now d i s c u s s t h i s m o d e l i n t h e l i g h t o f o u r ESR s t u d i e s . T h e e f f e c t o f e x c e s s C a 2 + on t h e c a r d i o l i p i n h e x a g o n a l p h a s e was s t u d i e d i n two s e t s o f e x p e r i m e n t s . I n o n e , t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n was k e p t c o n s t a n t a n d t h e o t h e r two c o m p o n e n t i n t h e c a r d i o l i p i n - C a 2 + - w a t e r s y s t e m w e r e v a r i e d . I n t h i s e x p e r i m e n t t h e C a 2 * / w a t e r r a t i o was k e p t c o n s t a n t w h i l e c a r d i o l i p i n / C a 2 * a n d c a r d i o l i p i n / w a t e r r a t i o w e r e d e c r e a s e d . The c a r d i o l i p i n / C a 2 * r a t i o was v a r i e d f r o m 1:1 u p t o 1:15 w i t h no a p p a r e n t c h a n g e i n t h e ESR s p e c t r u m o f t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d p r o b e . T h i s s howed t h a t when t h e m o l e r a t i o o f c a r d i o l i p i n t o C a 2 * i s 1:1, t h e e x c e s s amount o f C a 2 * w i l l n o t a l t e r t h e l i p i d p a c k i n g o f t h e h e x a g o n a l p h a s e . T h e s e c o n d s e t o f e x p e r i m e n t s , t h e c a r d i o l i p i n / w a t e r r a t i o was k e p t c o n s t a n t w h i l e t h e C a 2 * / w a t e r r a t i o was i n c r e a s e d a n d c a r d i o l i p i n / C a 2 * r a t i o was d e c r e a s e d . T h e C a 2 * / w a t e r r a t i o was v a r i e d f r o m 0.1 t o 5.0 w i t h d r a s t i c c h a n g e i n t h e ESR s p e c t r a o f t h e s p i n p r o b e . T h e T| c h a n g e i n t h e ESR s p e c t r a a t room t e m p e r a t u r e went f r o m 29 G t o 32 G i n d i c a t i n g a n i n c r e a s e i n 67 o r d e r a n d l e s s m o t i o n i n t h e l i p i d s t r u c t u r e . T h i s shows t h a t t h e l i p i d i n t h e h e x a g o n a l s t r u c t u r e i s b e i n g c o m p a c t e d t o g e t h e r a s t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d . T h i s r e s u l t i s s u p p o r t e d by X - r a y d a t a [ 11 ] t h a t t h e p o l a r t o p o l a r h e a d d i s t a n c e was d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e d C a 2 * c o n c e n t r a t i o n . T h i s c a n be v i e w e d a s t h e l i p i d b e c o m i n g more a n d more d e h y d r a t e d a s t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d . T h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d r e s u l t s w e r e f u r t h e r s u p p o r t e d by t h e r e s u l t s f r o m t h e S L C L s t u d i e s . When t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d f r o m 0 .1M t o 5.0M t h e ESR s p e c t r a o f S L C L i n d i c a t e d l e s s m o t i o n ( s e e f i g u r e 4 . 1 7 ) . S i n c e t h e n i t r o x i d e m o i e t y i s on t h e h e a d g r o u p , t h i s i n d i c a t e s t h a t t h e w a t e r c h a n n e l s a r e r e s t r i c t i n g t h e m o t i o n o f t h e p r o b e a s t h e C a 2 * c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d . A g a i n i f t h e h e x a g o n a l p h a s e i s b e c o m i n g d e h y d r a t e d t h e n t h e w a t e r c h a n n e l s w i l l o b v i o u s l y g e t s m a l l e r . T o i n v e s t i g a t e t h e p h a s e t r a n s i t i o n o f c a r d i o l i p i n f r o m l a m e l l a r p h a s e t o h e x a g o n a l p h a s e , a C a 2 * t i t r a t i o n e x p e r i m e n t was p e r f o r m e d . I n t h i s e x p e r i m e n t t h e C a 2 * p r e s e n t i n t h e s y s t e m was i n c r e a s e d s y s t e m a t i c a l l y i n s t e p s u n t i l a 1:1 m o l e r a t i o o f c a r d i o l i p i n t o C a 2 * was a c h i e v e d . V a r i a b l e t e m p e r a t u r e s t u d i e s o f T' p a r a m e t e r were c a r r i e d o u t a t e a c h C a 2 * a d d i t i o n t o m o n i t o r t h e p r o g r e s s o f t h e l i p i d t r a n s i t i o n . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h e l a m e l l a r p h a s e b e c o m e s more o r d e r e d when v e r y s m a l l a m o u n t s o f C a 2 * i s p r e s e n t . T h e amount o f C a 2 * c a n be a s l i t t l e a s t h e i n h e r e n t i m p u r i t y p r e s e n t i n t h e l i p i d . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h i s o r d e r e d l a m e l l a r s t a g e p r e s i s t s u p t o a b o u t 38 m o l e % o f C a 2 * when t h e l i p i d s t a r t s t o p r e c i p i t a t e o u t . 68 T h e o r d e r e d l a m e l l a r p h a s e was i n d u c e d by t h e i n t r o d u c t i o n o f a s m a l l amount o f C a 2 * i n t o t h e s y s t e m . T h e c y l i n d r i c a l s h a p e o f c a r d i o l i p i n i s t y p i c a l o f t h e d i s o d i u m c a r d i o l i p i n a n d a c o n e - s h a p e i s t h a t o f t h e c a l c i u m c a r d i o l i p i n . T h u s when C a 2 * was i n t r o d u c e d i n t o t h e l a m e l l a r p h a s e t h e c a l c i u m c a r d i o l i p i n f o r m e d w i l l assumme a c o n e - s h a p e a n d t h u s d i s t u r b t h e l a m e l l a r b i l a y e r p a c k i n g . To a c c o m m a d a t e t h e c o n e - s h a p e t h e l i p i d s a r o u n d i t w i l l t r y t o c o n f o r m t o t h i s new s h a p e a n d d o i n g s o f o r m d i p s a n d p i t s i n t h e b i l a y e r s t r u c t u r e a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 5.2. T h e p a c k i n g o f t h e f a t t y a c y l c h a i n s w i l l t h u s c h a n g e a n d h e n c e we m i g h t e x p e c t c h a n g e s i n t h e o b s e r v e d s p e c t r u m o f a s p i n p r o b e i n c o r p o r a t e d i n t o s u c h s t r u c t u r e . T h e ESR s p e c t r a o f t h e s p i n p r o b e i n a c a r d i o l i p i n d i s p e r s i o n c o n t a i n i n g 9-29 m o l e % o f C a 2 * s h o w e d s p e c t r a u n l i k e t h a t f r o m t h e l a m e l l a r o r t h e h e x a g o n a l p h a s e . F r o m t h i s we c a n s a y t h a t t h e 5 - d o x y l - s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i s m o n i t o r i n g a p h a s e t h a t i s d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e l a m e l l a r o r t h e h e x a g o n a l p h a s e . T h e ESR s p e c t r a i n d i c a t e d a more o r d e r e d e n v i r o n m e n t t h a n t h e l a m e l l a r p h a s e . We s u g g e s t t h a t t h e s e s t r u c t u r e s a r e m u l t i l a m e l l a r s t r u c t u r e s w i t h p i t s a n d d i p s c a u s e d by t h e C a 2 * l e a d i n g t o a h i g h e r o r d e r p a r a m e t e r f o r t h e s p i n p r o b e . T h e o r d e r p a r a m e t e r s S f o r t h e 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n p r o b e i n t h e d i f f e r e n t p h a s e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g e q u a t i o n 2.9. T h e o r d e r p a r a m e t e r s S a r e l i s t e d i n t a b l e 5.1 a n d p l o t t e d a g a i n s t C a 2 * c o n c e n t r a t i o n i n f i g u r e 5.3. T h e r e s u l t s show t h a t when C a 2 * i s a d d e d t o t h e s y s t e m t h e o r d e r p a r a m e t e r S i s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e l a m e l l a r p h a s e . T h e o r d e r 69 T a b l e 5.1 mole % o f C a 2 + O r d e r P a r m e t e r S T e m p e r a t u r e (°C) 0.0 0.559 20.5 ( L a m e l l a r P h a s e ) 0.434 32.4 0.351 39.0 9 0.598 19.8 0.533 33.4 0.522 39.2 17 0.610 19.4 0.538 33.6 0.519 40. 1 29 0.609 19.3 0.527 32.8 0.511 39.7 38 0.625 19.4 0.577 29.5 0.517 39.6 41 0.704 17.8 0.602 27.9 0.552 36.7 47 0.715 18.8 0.646 28.4 0.574 38.8 50 i 0.771 18.1 ( H e x a g o n a l Pha'se) i 0.696 28.3 0.588 39.9 F i g u r e 5.3 Order parameter S vs mole % D f C a 2 * f o r 5 - d o x y l s t e a r i c a c i d s p i n probe i n the c a r d i o l i p i n a t v a r i o u s temperature o 71 p a r a m e t e r s t a y s c o n s t a n t up t o a b o u t 38 m o l e p e r c e n t o f C a 2 * a d d e d a n d t h e n t o h i g h e r o r d e r i n t h e h e x a g o n a l p h a s e . When t h e . t e m p e r a t u r e i s i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f 9-29 m o l e % o f C a 2 * t o 4 0 ° C two s p e c t r a a r e o b s e r v e d . One s p e c t r u m c o r r e s p o n d s t o t h e l a m e l l a r p h a s e a n d t h e o t h e r one i s d i s t i n c t f r o m e i t h e r t h e l a m e l l a r o r t h e h e x a g o n a l p h a s e s . T h i s c a n be e x p l a i n e d by a s s u m i n g t h a t t e m p e r a t u r e i n d u c e s t h e f o r m a t i o n o f i n v e r t e d m i c e l l e s . T h u s when t h e r e i s a s m a l l amount o f C a 2 * p r e s e n t a n d t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s y s t e m i s r a i s e d , t h e l i p i d s t r u c t u r e c h a n g e s a s shown i n f i g u r e 5.4. T h e c a l c i u m s a l t f o r m o f c a r d i o l i p i n moves t o s m a l l p o o l s o f c a l c i u m c a r d i o l i p i n t o f o r m i n v e r t e d m i c e l l e s . T h i s l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n o f t h e c a l c i u m c a r d i o l i p i n may be e x p e c t e d s i n c e t h e i n v e r t e d m i c e l l e i s more s t a b l e a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s [ 1 1 , 3 2 ] . When t h i s h a p p e n s we h a v e p o c k e t s o f i n v e r t e d m i c e l l e s a n d p o c k e t s o f l a m e l l a r s t r u c t u r e w i t h i n t h e same s y s t e m . The o r d e r a n d m o t i o n w i l l be d i f f e r e n t i n b o t h l e a d i n g t o two d i s t i n c t s p e c t r a . T h e a b o v e m o d e l i s s u p p o r t e d by X - r a y s t u d i e s [ 1 1 ] p e r f o r m e d on B a 2 * c a r d i o l i p i n w h i c h b e h a v e s t h e same way. A t low t e m p e r a t u r e s t h e B a 2 * c a r d i o l i p i n e x i s t s a s b o t h t h e l a m e l l a r a n d h e x a g o n a l p h a s e s a n d when t h e t e m p e r a t u r e i s r a i s e d o n l y t h e h e x a g o n a l p h a s e i s p r e s e n t . T h e i n v e r t e d m i c e l l e i s t h e r e f o r e t h e more s t a b l e s t r u c t u r e a s t h e t e m p e r a t u r e i s r a i s e d . F u r t h e r e v i d e n c e t o s u p p o r t t h i s t h e o r y i s t h e r e s u l t o f t h e S L C L s t u d y i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 * . O u r r e s u l t i n d i c a t e s t h a t i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 * t h e s p i n p r o b e i s m o n i t o r i n g two p h a s e s ( f i g u r e 4.19) i n w h i c h t h e p r o b e u n d e r g o e s q u i t e d i f f e r e n t m o t i o n , a s i s t o be e x p e c t e d , i f i n v e r t e d m i c e l l e s a r e p r e s e n t i n the' l a m e l l a r I f • f e l l Coxreltofipin o ^ 1—ft 0=^  ^2 F i g u r e 5.4 *Te m ^ e r- O L T U r e M o d e l f o r t h e l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n o f C a 2 + -c a r d i o l i p i n . 73 p h a s e . 5.3 C o n c l u s i o n s . T h e work d e s c r i b e d h e r e h a s p r o v i d e d v a l u a b l e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n on t h e p h a s e s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n a n d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a r d i o l i p i n a n d C a 2 + . I t h a s p r o v i d e d s u p p o r t i v e e v i d e n c e f o r t h e f o r m a t i o n o f l i p i d i c p a r t i c l e s i . e . i n v e r t e d m i c e l l e s [ 3 4 ] . T h e s p i n p r o b e s t u d y h a s i n d i c a t e d t h a t a t C a 2 * / c a r d i o l i p i n m o l e r a t i o o f l e s s t h a n 0.6:1 t h e r e i s a n i n i t i a l l a m e l l a r - l i k e s t r u c t u r e w i t h p i t s a n d d i p s on i t s s u r f a c e [ 3 1 ] . T h i s l a m e l l a r - l i k e s t r u c t u r e h a s a f l u i d i t y ( o r d e r a n d m o t i o n ) d i f f e r e n t f r o m t h a t o f l a m e l l a r o r h e x a g o n a l c a r d i o l i p i n a n d t h a t t h i s s t r u c t u r e c a n be i n d u c e d t o go o v e r t o a l a m e l l a r s t r u c t u r e w i t h i n v e r t e d m i c e l l e s i m b e d d e d i n i t . I t i s a t t h i s p o i n t two d i s t i n c t s p e c t r a a r e o b s e r v e d . T h e s t u d i e s w i t h S L C L h a v e shown t h a t t h i s i s p o t e n t i a l l y a v e r y u s e f u l t o o l i n t h e s t u d y o f t h e v a r i o u s s t r u c t u r e s a n d p h a s e s o f c a r d i o l i p i n . I t i s e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o t h e c h a n g e s i n m o t i o n b r o u g h t a b o u t by t h e f o r m a t i o n o f i n v e r t e d m i c e l l e s a n d h e x a g o n a l p h a s e . C o n s e q u e n t l y , a l t h o u g h n o t a t t e m p t e d i n t h i s w o rk, we f e e l t h a t t h e S L C L c a n be u s e f u l l y e m p l o y e d i n t h e s t u d y o f t h e f u n c t i o n o f c a r d i o l i p i n i n t h e l i p o p r o t e i n e r y t h r o c y t e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e [ 9 ] . T h e f u r t h e r s t u d i e s t h a t m i g h t be c o n t e m p l a t e d a t t h i s p o i n t a r e t h e u s e o f s p i n p r o b e s a n d s p i n l a b e l s i n t h e s t u d y o f c a r d i o l i p i n i n t h e p r e s e n c e o f o t h e r c a t i o n s ( B a 2 + , M g 2 * ) . C a r d i o l i p i n i n t h e p r e s e n c e o f t h e s e c a t i o n s w i l l f o r m l a m e l l a r a n d o r h e x a g o n a l p h a s e s d e p e n d i n g on t e m p e r a t u r e [ 1 1 ] . T h e s e 74 s t u d i e s w i l l g i v e a d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r t h e h y p o t h e s i s o f t e m p e r a t u r e i n d u c e d p h a s e s e p a r a t i o n . O t h e r e v i d e n c e may be o b t a i n e d by u s i n g a m i x t u r e o f c a r d i o l i p i n w i t h o t h e r l i p i d s t h a t do n o t f o r m t h e h e x a g o n a l p h a s e . M i x t u r e s o f c a r d i o l i p i n a n d p h o s p h a t i d y l c h o l i n e w i l l f o r m t h e m i x e d p h a s e s w i t h t h e a d d i t i o n o f C a 2 + t o t h e s y s t e m [ 3 2 - 3 5 ] . F u r t h e r m o r e t h e S L C L c o u l d be u s e d i n c l i n i c a l s t u d i e s i n t h e s e r o l o g i c a l t e s t i n g o f s y p h i l i s . 75 BIBLIOGRAPHY 1. M. C. P a n g b o r n , J . B i o l . Chem., J_43, 2 4 7 - 2 5 6 ( 1 942 ) 2 . V o n A. W a s s e r m a n n , A. N e i s s e n , C. B r u c k , D e u t . Med. Wach., 3 2 , 7 4 5 - 7 4 6 ( 1 906 ) 3 . C. H. B r o w n i n g , J . C r u i c k s h a n k , W. G i l m o u r , J . P a t h o l o g y a n d B a c t e r i o l o g y , J_5, 3 6 1 - 3 6 2 ( 1 911 ) 4 . M. G. M a c F a r l a n e , A d v a n c e s i n L i p i d R e s e a r c h , 2 , 9 1 - 1 2 5 , ( 1 9 6 4 ) 5. P. V. I o a n n o u , B. T. G o l d i n g , P r o g . L i p i d R e s . , j_7, 2 7 9 -318 ( 1 9 7 9 ) 6 . F . R a m i r e z , P. V. I o a n n o u , J . F . M a r e c e k , G. H. Do d d , B. T. G o l d i n g , T e t r a h e d r o n , 3 3 , 5 9 9 - 6 0 8 ( 1 9 7 7 ) 7 . M. C. P a n g b o r n , J . B i o l . Chem., j_68, 351 - 361 ( 1 9 4 7 ) 8 . A. J . S l o t b o o m , P. P. M. B o n s e n , Chem. P h y s . L i p i d s , 5, 3 0 1 - 3 9 8 ( 1 970 ) 9 . G. B e a u r e g a r d , B. D. R o u f o g a l i s , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5, 5 7 , 102-111 ( 1 9 7 9 ) 10 . P. R. C u l l i s , B. De K r u i j f f , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5 5 9 , 3 9 9 - 4 2 0 ( 1 979 ) 1 1 . R. P. R a n d , S. S e n g u p t a , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 2 5 5 , 4 8 4 -492 ( 1 9 7 2 ) 12 . D. W. Deamer, R. L e o n a r d , A. T a r d i e u , D. B r a n t o n , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 2J_9, 4 7 - 6 0 ( 1 970 ) 1 3 . P. R. C u l l i s , B. De K r u i j f f , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5 0 7 , 2 0 7 - 2 1 8 ( 1 9 7 8 ) 14. D. H e g n e r , U. Schummer, G. H. S c h n e p e l , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 3_0_7, 4 5 2 - 4 5 8 ( 1 9 7 3 ) 15 . J . M. B o g g s , J . C. H s i a , P r o c . N a t . A c a d . S c i . U.S.A., 7_0, 1 4 0 6 - 1 4 0 9 ( 1 973 ) 16 . M. B. C a b l e , J . J a c o b u s , G. L . P o w e l l , P r o c . N a t . A c a d . S c i . U.S.A., 75_, 1227 - 12431 ( 1978) 17 . C. L a n d r i s c i n a , F . M. M e g l i , E . Q u a g l i a r i e l l o , A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y , 7 6 , 2 9 2 - 2 9 9 ( 1 9 7 6 ) 76 18. J . F . W. K e a n a , A. R. E r t l e , Chem. And P h y s . Of L i p i d s , J_7 , 402-406 (1976) 19. L . J . B e r l i n e r ( E d ) , S p i n L a b e l l i n g , T h e o r y a n d  A p p l i c a t i o n , A c a d e m i c P r e s s ( 1976) 20. J . R. B o l t o n , D. B e r g , H. S w a r t z , B i o l o g i c a l A p p l i c a t i o n s  o f E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e , W i l e y - I n t e r s c i e n c e ( 1 9 7 2 ) 2 1 . P. F . K n o w l e s , D. M a r s h , H. W. E . R a t t l e , M a g n e t i c  R e s o n a n c e o f B i o m o l e c u l e s , W i l e y - I n t e r s c i e n c e ( 1 9 7 6 ) 22. S. S c h r e i e r , C. F . P o l n a s z e k , I . C. P. S m i t h , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5Ji5_, 395-436 ( 1 9 7 8 ) 23. G. I . L i k h t e n s h e e i n , S p i n L a b e l i n g M e t h o d s i n M o l e c u l a r  B i o l o g y , W i l e y - I n t e r s c i e n c e (1976) ~~P~. S^ S h e l n i t z ( T r a n s l a t o r ) 24. J . F . W. K e a n a , C h e m i c a l R e v i e w s , 7 8 ( 1 ) , 37-64 ( 1 9 7 8 ) 25. C. F. P o l n a s z e k , S. S c h r e i e r , K. W. B u t l e r , C. P. S m i t h , J . Of T h e A m e r i c a n Chem. S o c i e t y , 100, 8 2 2 3 - 8 2 3 2 , ( 1 9 7 8 ) 26. E . G. R o z a n t s e v , F r e e N i t r o x y l R a d i c a l s , P l e n u m P r e s s ( 1 9 7 0 ) B. J . H a z z a r d ( T r a n s l a t o r ) 27. H. Okuyama, S. N o j i m a , J . Of B i o c h e m i s t r y , 57, 529-538 ( 1 9 6 5 ) 28. S. R a i n i e r , M. K. J a i n , F . R a m i r e z , P. V. I o a n n o u , J . F . M a r e c e k , R. Wagner, B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 558, 187-198 ( 1 9 7 9 ) 29. P. R. C u l l i s , A. J . V e r k l e i j , P. H. J . T h . V e r v e r g a e r t , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 513, 11-20 (1978) 30. P. A r s l a n , M. B e l t r a m e , U. M u s c a t e l l o , M i c r o n , 115-125 ( 1 9 8 0 ) 3 1 . W. J . V a i l , J . G. S t o l l e r y , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5 5 1 , 74-84 (1979) 32. B. De. K r u i j f f , A. J . V e r k l e y , C. J . A. V a n . 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