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The study of the reaction of carbon monoxide with Pseudomonas putida cytochrome P450cam Albon, Simon Piers 1983

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STUDY OF THE REACTION OF CARBON MONOXIDE WITH Pseudomonas putida CYTOCHROME P450cam by SIMON P I E R S ALBON ( M a j o r s ) , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1979 THESIS SUBMITTED I N PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA i n SEPTEMBER 198 3 Simon A l b o n 1983 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It i s understood that copying or p u b l i c a t i o n of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. nt of C)Ke,rYM^lrY Departme The University of B r i t i s h Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 Date QcA. QO i q % 3 A b s t r a c t I n t e r e s t r e m a i n s v e r y h i g h i n t h e c l a s s o f t h i o l a t e - b o u n d h e m e - c o n t a i n i n g m o n o o x y g e n a s e enzymes c a l l e d t h e c y t o c h r o m e s P 4 50. T h e s e enzymes g e n e r a l l y a c t i v a t e m o l e c u l a r d i o x y g e n f o r s e l e c t i v e h y d r o x y l a t i o n o f o r g a n i c s u b s t r a t e s , s u c h a s s a t u r a t e d h y d r o c a r b o n s ( R H ) , i n a c c o r d a n c e w i t h R e a c t i o n ( 1 ) . RH + 0 2 + 2e" + 2 H + - ROH + H 2 0 (1) D e v e l o p m e n t o f p r o t e i n - f r e e m o d e l c a t a l y s t s t h a t m i m i c P450 r e a c t i v i t y a r e o f g r e a t i n d u s t r i a l i m p o r t a n c e a nd r e q u i r e , i n p a r t , a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e r e a c t i v i t y o f t h e n a t i v e h e m o p r o t e i n t o w a r d s s m a l l g a s m o l e c u l e s s u c h a s c a r b o n m o n o x i d e (CO) and d i o x y g e n ( 0 2 ) . The w o r k i n t h i s t h e s i s d e s c r i b e s t h e r e a c t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e w i t h t h e f e r r o u s s t a t e o f s u b s t r a t e - b o u n d , n a t i v e a n d p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d Pseudomonas putida c y t o c h r o m e P450cam ( R e a c t i o n ( 2 ) ) . k Fe ( I I ) P 4 5 0 c a m + CO Fe ( I I ) P4 50cam-CO, Kco = o n (2) k o f f k o f f A m e thod i s d e s c r i b e d f o r t h e g r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG 7 8 6 , and t h e s u b s e q u e n t i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f n a t i v e c y t o c h r o m e P450cam and a s s o c i a t e d e l e c t r o n t r a n s p o r t p r o t e i n s , p u t i d a r e d o x i n a nd p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e ; o n l y p u r i f i e d c y t o c h r o m e P450cam and p u t i d a r e d o x i n w e r e s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d by t h i s m e t h o d . The n a t i v e enzyme h a s b e e n r e c o n s t i t u t e d w i t h p r o t o h e m i n by a method g e n e r a l f o r t h e i n s e r t i o n o f h e m i n s m o d i f i e d i n t h e 2- a n d 4- p o s i t i o n s . Meso-, d e u t e r o - , d i a c e t y l d e u t e r o - , and d i b r o m o d e u t e r o h e m i n s w e r e s y n t h e s i z e d b u t w e r e n o t u s e d f o r r e c o n s t i t u t i n g t h e n a t i v e c y t o c h r o m e . S p e c t r a l a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d on t h e s u b s t i t u t e d h e m i n s , t h e n a t i v e c y t o c h r o m e and r e l a t e d e l e c t r o n t r a n s p o r t p r o t e i n s and t h e p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d enzyme; t h e d a t a a g r e e d w e l l w i t h l i t e r a t u r e v a l u e s . K i n e t i c c o n s t a n t s f o r t h e f o r w a r d C O - a s s o c i a t i o n and r e v e r s e d i s s o c i a t i o n r e a c t i o n s (k a n d k c x z , r e s p e c t i v e l y ; o n o f f * 1 s e e R e a c t i o n ( 2 ) ) w e r e d e t e r m i n e d by f l a s h p h o t o l y s i s ; e x p e r i m e n t s w e r e r u n u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e CO l i g a n d was i n s u b s t a n t i a l e x c e s s and a l l s y s t e m s showed p s e u d o f i r s t -o r d e r d e p e n d e n c e on h e m o p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . The f l a s h p h o t o l y s i s u n i t d e s c r i b e d b e l o w was t e s t e d and d e v e l o p e d w i t h t h e m y o g l o b i n - C O s y s t e m a n d t h e n u s e d t o s t u d y t h e s u b s t r a t e -bound n a t i v e a n d p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO s y s t e m s . The s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s f o r C O - b i n d i n g t o f e r r o u s m y o g l o b i n and n a t i v e s u b s t r a t e - b o u n d P450cam w e r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h p u b l i s h e d v a l u e s and r e c o n s t i t u t i o n o f t h e n a t i v e P4 50cam enzyme h a d l i t t l e e f f e c t on t h e k v a l u e f o r o n C O - b i n d i n g . The f i r s t - o r d e r r a t e c o n s t a n t s f o r t h e C0-d i s s o c i a t i o n r e a c t i o n w e r e d e t e r m i n e d a l s o f r o m t h e f l a s h p h o t o l y s i s s t u d i e s b u t w e r e c o n s i d e r e d u n r e l i a b l e when c o m p a r e d w i t h p u b l i s h e d l i t e r a t u r e d a t a . A k v a l u e f o r t h e n a t i v e c o f f P450cam s y s t e m , i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e , was c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t , K c o , d e r i v e d by s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s i s o f R e a c t i o n ( 2 ) ; Kco v a l u e s i n r e a s o n a b l e a g r e e m e n t w i t h l i t e r a t u r e d a t a w e r e o b t a i n e d b u t i n d i c a t e d an i n t e r e s t i n g d e p e n d e n c e on t h e c o n c e n t r a t i o n o f i i i the d i t h i o n i t e r e d u c i n g agent. T h i s t h e s i s b e g i n s w i t h an e x t e n s i v e l i t e r a t u r e r e v i e w on the s u b j e c t and ends w i t h some g e n e r a l c o n c l u s i o n s on t h i s work and some recommendations f o r f u t u r e work. i v TABLE OF CONTENTS Page ABSTRACT i i TABLE OF CONTENTS v L I S T OF TABLES x i i L I S T OF FIGURES x v L I S T OF ABBREVIATIONS x x i ACKNOWLEDGEMENTS x x v i i i CHAPTER I INTRODUCTION 1 CHAPTER I I LITERATURE REVIEW 12 I I . 1 H i s t o r i c a l O v e r v i e w . 13 I I . 2 B i o l o g i c a l I m p o r t a n c e o f t h e P450 C y t o c h r o m e s 21 I I . 3 S t r u c t u r e 35 I I . 4 M e c h a n i s m o f A c t i o n 45 I I . 5 The I n t e r a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h C y t o c h r o m e P450 62 CHAPTER I I I EXPERIMENTAL PROCEDURES 88 I I I . 1 S y n t h e s i s o f S u b s t i t u t e d Hemins f r o m P r o t o h e m i n C h l o r i d e 8 9 111.1.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n 89 111.1.2 M a t e r i a l s 91 111.1.3 S p e c t r o p h o t o m e t r y A n a l y s i s o f P y r i d i n e Hemochromes 93 I I I . 1.4 S y n t h e s i s o f D e u t e r o h e m i n 95 I I I . 1.5 S y n t h e s i s o f Mesohemin 101 I I I . 1.6 S y n t h e s i s o f D i a c e t y l d e u t e r o h e m i n . . 108 I I I . 1 . 7 S y n t h e s i s o f D i b r o m o d e u t e r o h e m i n . . . 112 v Page 111.2 G r o w t h o f Pseudomonas putida, s t r a i n PpG 786. 118 111.2.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n 118 111.2.2 M a t e r i a l s 1 2 0 I I I . 2.3 O r g a n i s m 1 2 1 111.2.4 M e d i a 1 2 2 I I I . 2.4.1 M i n i m a l A g a r 1 2 2 I I I . 2.4.2 S t a r t e r M e d i a 1 2 3 I I I . 2 . 4 . 3 L a r g e S c a l e M e d i a . . . . 123 111.2.5 G r o w t h P r o c e d u r e . . . . . . . . . 1 2 5 111.3 I s o l a t i o n and P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e P4 50cam and R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components . . 132 111.3.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n 132 111. 3 . 1 . 1 M a t e r i a l s 132 111.3.1.2 B u f f e r s 134 I I I . 3.1.3 Co l u m n C h r o m a t o g r a p h y . • 135 111.3.2 I s o l a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam a n d R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components 14 0 111.3.2.1 C e l l - F r e e E x t r a c t . . . . 140 111.3.2.2 I s o l a t i o n P r o c e d u r e • . . 140 I I I . 3 . 2.3 Ammonium S a l t F r a c t i o n a t i o n 142 111.3.3 P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components 144 I I I . 3 . 3 . 1 P u r i f i c a t i o n P r o c e d u r e • • 144 v i Page I I I . 3 . 4 S p e c t r a l A n a l y s i s o f C y t o c h r o m e P450cam a n d R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components 14 7 III.'»3.4.1 C o n c e n t r a t i o n D e t e r m i n a t i o n s 149 I I I . 3 . 4 . 2 P u r i t y A s s a y I 5 0 111.4 P r e p a r a t i o n o f P r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P4 50cam 1^1 I I I . 4 . 1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n 1^1 I I I . 4 . 1 . 1 M a t e r i a l s l 5 i I I I . 4.2 E x t r a c t i o n o f t h e Heme G r o u p -ICO f r o m N a t i v e C y t o c h r o m e P450cam • • • ± D / L I I I . 4 . 2 . 1 E x t r a c t i o n P r o c e d u r e . . . . 152 I I I . 4 . 2. 2 A n a l y s i s o f Heme P r o s t h e t i c G r o u p 153 111.4.3 R e c o n s t i t u t i o n o f A p o c y t o c h r o m e P450cam I 5 5 I I I . 4 . 3 . 1 R e c o n s t i t u t i o n P r o c e d u r e • • 155 111.4.4 P u r i f i c a t i o n o f P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam • • 157 I I I . 4 . 4 . 1 DE-52 A n i o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y l->7 I I I . 4.4.2 R e m o v a l o f P420 I m p u r i t i e s • 1 5 1 I I I . 4 . 4.3 P r o c e d u r e f o r R e m o v a l o f P420 I m p u r i t i e s I 6 0 I I I . 4.4.4 P r e p a r a t i o n o f A p o m y o g l o b i n • 161 111.5 K i n e t i c S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h t h e F e r r o u s C y t o c h r o m e P450cam a n d M y o g l o b i n P r o t e i n s by F l a s h P h o t o l y s i s 163 I I I . 5 . 1 The F l a s h P h o t o l y s i s A p p a r a t u s . • • 163 v i i Page 111.5.1.1 M o n i t o r i n g L i g h t S o u r c e 165 111.5.1.2 F l a s h and Sample C o m p a r t m e n t 165 I I I . 5.1.3 F l a s h i n g L i g h t S o u r c e . . 168 I I I . 5.1.4 D e t e c t o r and R e c o r d i n g S y s t e m 171 I I I . 5.1.5 O p e r a t i o n o f t h e F l a s h P h o t o l y s i s A p p a r a t u s . . . 173 111.5.2 The F l a s h P h o t o l y s i s E x p e r i m e n t . . 174 I I I . 5.2.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n . . . 174 I I I . 5 . 2 . 2 P r o c e d u r e 179 111.5.3 P r e l i m i n a r y E x p e r i m e n t s 181 I I I . 5.3.1 S e l e c t i o n o f F i l t e r i n g S y s t e m 181 I I I . 5 . 3 . 2 L i g h t P u l s e C h a r a c t e r i s t i c s 183 I I I . 5.3.3 C a l i b r a t i o n C h e c k . . . . 187 I I I . 5. 3. 4 E x t e n t o f P h o t o d e c o m p o s i t i o n 188 I I I . 5 . 3. 5 K i n e t i c S t u d y o f C O - B i n d i n g t o F e r r o u s M y o g l o b i n . . . 190 I I I . 6 S p e c t r o p h o t o m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f t h e E q u i l i b r i u m C o n s t a n t f o r t h e R e a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h F e r r o u s C y t o c h r o m e P450cam 192 111.6.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n 192 111.6.2 M a t e r i a l s 192 111.6.3 P r o c e d u r e 194 CHAPTER I V RESULTS AND DISCUSSION 196 I V . 1 G r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG 786 . . . . 197 IV . 2 P r o p e r t i e s o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d M o n o o x y g e n a s e Components 207 v i i i Page I V . 2 . 1 P u t i d a r e d o x i n R e d u c t a s e 207 I V . 2 . 1 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s 207 I V . 2 . 2 P u t i d a r e d o x i n 212 I V . 2 . 2 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s 212 I V . 2 . 2 . 2 P u r i t y 212 I V . 2 . 2 . 3 S t a b i l i t y 215 I V . 2 . 3 C y t o c h r o m e P4 50cam 216 I V . 2 . 3 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s o f S u b s t r a t e - B o u n d P450cam . . 216 I V . 2 . 3 . 2 S p e c t r a l A n a l y s i s o f S u b s t r a t e - F r e e P450cam . . . 219 I V . 2 . 3 . 3 P u r i t y 224 I V . 2 . 3 . 4 S t a b i l i t y 225 IV. 2 . 4 M y o g l o b i n 230 I V . 2 . 4 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s 230 I V . 3 R e c o n s t i t u t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam w i t h Hemin C h l o r i d e 233 I V . 3 . 1 A p o c y t o c h r o m e P450cam 233 I V . 3 . 2 P y r i d i n e Hemochrome o f E x t r a c t e d Heme 237 I V . 3 . 3 R e c o n s t i t u t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam 238 I V . 3 . 4 P u r i t y o f R e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam 246 I V . 3 . 5 S t a b i l i t y o f R e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam 246 IV.4 S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f M y o g l o b i n a nd t h e P450cam S y s t e m s b y F l a s h P h o t o l y s i s . . . 247 i x Page I V . 4.1 T r e a t m e n t o f D a t a 24 7 I V . 4 . 2 S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f M y o g l o b i n b y F l a s h P h o t o l y s i s . . . 249 I V . 4 . 3 S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e , S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P450cam b y F l a s h P h o t o l y s i s 263 I V . 4 . 4 S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f P r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d , S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P450cam b y F l a s h P h o t o l y s i s . . . . 277 I V . 5 S p e c t r o p h o t o m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f t h e E q u i l i b r i u m C o n s t a n t f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e , S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P450cam 291 I V . 5.1 T r e a t m e n t o f D a t a 291 I V . 5 . 2 C O - B i n d i n g t o N a t i v e C y t o c h r o m e P450cam 293 CHAPTER V GENERAL CONCLUSIONS AND SOME RECOMMENDATIONS FOR FUTURE WORK 3 08 REFERENCES 314 APPENDIX 326 APPENDIX I F l a s h P h o t o l y s i s U n i t O p e r a t i n g I n s t r u c t i o n s 327 APPENDIX I I D e r i v a t i o n o f t h e R a t e Law f o r t h e I n t e r a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h S i m p l e H e m o p r o t e i n s 340 APPENDIX I I I Raw D a t a f o r t h e P r e l i m i n a r y D e t e r m i n a t i o n o f t h e E x t e n t o f P h o t o d e c o m p o s i t i o n o f F u l l y C a r b o n y l a t e d M y o g l o b i n and C y t o c h r o m e P450cam 345 APPENDIX I V Raw D a t a f o r t h e F l a s h P h o t o l y s i s S t u d i e s o f t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f M y o g l o b i n a n d t h e P450cam S y s t e m s 348 x Page APPENDIX I V a K i n e t i c Run 2 f o r t h e M y o g l o b i n -CO S y s t e m 349 APPENDIX I V a K i n e t i c Run 3 f o r t h e N a t i v e P4 5 0cam-CO S y s t e m 353 APPENDIX I V c K i n e t i c Run 2 f o r t h e P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO S y s t e m . . • 357 APPENDIX V Raw D a t a f o r t h e S p e c t r o p h o t o m e t r i e D e t e r m i n a t i o n o f t h e E q u i l i b r i u m C o n s t a n t f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e C y t o c h r o m e P45 0cam 361 APPENDIX Va E q u i l i b r i u m Runs 1, 2 and 4 362 APPENDIX Vb E q u i l i b r i u m Runs 5 a n d 6 363 x i L I S T OF TABLES T a b l e Page 11.1 E q u i l i b r i u m D a t a f o r R e v e r s i b l e C O - b i n d i n g t o C y t o c h r o m e P450 VI 11.2 K i n e t i c D a t a f o r R e v e r s i b l e CO-b i n d i n g t o C y t o c h r o m e P4 50 7 2 11.3 D a t a f o r B i n d i n g o f CO and 0^ t o t h e F e r r o u s S t a t e s o f S u b s t r a t e -bound P450cam, and M y o g l o b i n 8 6 111.1 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochromes D e r i v e d f r o m P r o t o - and D e u t e r o h e m i n 99 111.2 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m M e s o h e m i n . . . . 106 111.3 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m D i a c e t y l -d e u t e r o h e m i n . . 110 111.4 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m D i b r o m o -d e u t e r o h e m i n 116 111.5 V o l u m e s o f B u f f e r s U t i l i z e d d u r i n g P r o t e i n I s o l a t i o n and P u r i f i c a t i o n 137 111.6 Q u a n t i t i e s o f R e a g e n t s f o r P r o t e i n I s o l a t i o n a n d P u r i f i c a t i o n 138 111.7 S a t u r a t i o n L e v e l s a n d Q u a n t i t i e s o f ( N H 4 ) 2 S 0 4 R e q u i r e d f o r t h e P r e c i p i t a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d P r o t e i n C omponents 14 3 111.8 Y i e l d s o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d P r o t e i n C omponents 146 111.9 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m Heme E x t r a c t e d f r o m C y t o c h r o m e P450cam 154 111.10 M o s t E f f e c t i v e F i l t e r C o m b i n a t i o n s f o r t h e F l a s h P h o t o l y s i s S t u d y o f F e r r o u s M y o g l o b i n and C y t o c h r o m e P450cam w i t h CO . 184 x i i T a b l e P a g e I V . 1 A b s o r b a n c e D a t a f o r P u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e and S u b s t r a t e - f r e e C y t o c h r o m e P450cam . 209 I V . 2 A b s o r b a n c e D a t a f o r P u t i d a r e d o x i n 214 IV.3 A b s o r b a n c e D a t a f o r S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P450cam 218 IV.4 A b s o r b a n c e D a t a f o r S u b s t r a t e - f r e e C y t o c h r o m e P450cam 223 I V . 5 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e V a r i o u s f o r m s o f M y o g l o b i n 232 IV.6 A b s o r b a n c e D a t a f o r S u b s t r a t e - b o u n d R e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam 244 I V . 6 . 1 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 2 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h F e r r o u s M y o g l o b i n a t 2 0°C. 251 IV.7 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 1 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h F e r r o u s M y o g l o b i n a t 20°C. 252 IV.8 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 3 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h F e r r o u s M y o g l o b i n a t 20°C. 2 5 3 I V . 9 K i n e t i c C o n s t a n t s o b t a i n e d f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h F e r r o u s M y o g l o b i n a t 20°C. 2 6 1 I V . 1 0 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 3 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e S u b s t r a t e - b o u n d , C y t o c h r o m e P450cam ' a t 2 0 O C . . 265 I V . 1 1 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 1 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e S u b s t r a t e - b o u n d , C y t o c h r o m e P4 5 0cam a t 20°C. 2 6 6 IV.12 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 2 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e S u b s t r a t e - b o u n d , C y t o c h r o m e P450cam a t 20°C. 2 6 7 x i i i T a b l e Page I V . 1 3 K i n e t i c C o n s t a n t s o b t a i n e d f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s S t a t e o f N a t i v e S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P450cam a t 20°C 276 I V . 1 4 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 2 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s , S u b s t r a t e - b o u n d S t a t e o f P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam a t 20°C 279 I V . 1 5 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 1 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s , S u b s t r a t e - b o u n d S t a t e o f P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam a t 20°Ct- 280 I V . 1 6 K i n e t i c D a t a f r o m K i n e t i c Run 3 f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s , S u b s t r a t e - b o u n d S t a t e o f P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam a t 20°C. 281 I V . 1 7 K i n e t i c C o n s t a n t s o b t a i n e d f o r t h e R e a c t i o n o f CO w i t h t h e F e r r o u s , S u b s t r a t e - b o u n d S t a t e o f P r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam a t 20°C. 289 x i v L I S T OF FIGURES F i g u r e Page 1.1 The s t r u c t u r e o f t h e heme u n i t 4 1.2 Some o x y g e n c h e m i s t r y g 1.3 V a r i o u s s u b s t i t u t e d h e m i n s n y 11.1 The f i r s t r e p o r t e d s p e c t r u m o f t h e c a r b o n m o n o x i d e c o m p l e x o f r e d u c e d l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P4 50 13 11.2 P h o t o c h e m i c a l a c t i o n s p e c t r u m f o r t h e l i g h t r e v e r s a l o f t h e C O - i n h i b i t e d C-21 h y d r o x y l a t i o n o f 1 7 < * - h y d r o x y - p r o g e s t e r o n e 15 11.3 The f i r s t r e p o r t e d s p e c t r a l c h a n g e s t h a t o c c u r r e d u p o n a d d i t i o n o f s u b s t r a t e t o m i c r o s o m a l P450 17 11.4 Some r e a c t i o n p a t h w a y s c a t a l y s e d by c y t o c h r o m e P4 50 23 I I . 5 . P r o p o s e d c l a s s e s o f c y t o c h r o m e P450 . . . 24 11.6 The c y t o c h r o m e P 4 5 0 - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f p h e n a n t h r e n e 30 11.7 S t r u c t u r e o f one o f t h e f o u r p o s s i b l e i s o m e r s o f N - ( 2 - o x o e t h y l ) p r o t o p o r p h y r i n I X i s o l a t e d f r o m a c e t y l e n e - t r e a t e d l i v e r m i c r o s o m e s . . . . 31 11.8 P o s t u l a t e d m e c h a n i s m o f t h e a u t o -c a t a l y t i c a l k y l a t i o n o f t h e p r o s t h e t i c heme o f c y t o c h r o m e P4 50 d u r i n g a t t e m p t e d m e t a b o l i s m o f a c e t y l e n e s 3 3 11.9 Heme e n v i r o n m e n t s o f M y o g l o b i n , H e m o g l o b i n and P e r o x i d a s e 4 3 11.10 P r o p o s e d r e a c t i o n c y c l e o f c y t o c h r o m e P450 4 6 x v F i g u r e P a ge 11.11 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e v a r i o u s s t a t e s o f c y t o c h r o m e P450cam 48 11.12 O p t i c a l s p e c t r a o f c a r b o n y l a t e d a n d o x y g e n a t e d f e r r o u s c y t o c h r o m e P450cam . . . 50 11.13 G e n e r a l f e a t u r e s o f a f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s 68 111.1 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome 100 111.2 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f p r o t o p o r p h y r i n I X i n f o r m i c a c i d 103 111.3 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f m e s o p o r p h y r i n I X i n f o r m i c a c i d 103 111.4 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e mesohemin p y r i d i n e hemochrome 107 111.5 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d i a c e t y l -d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome I l l 111.6 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d i b r o m o -d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome 117 111.7 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e L - b r o t h medium 128 111.8 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e f i r s t s e t o f 500mL s h a k e -f l a s k m e d i a . 129 111.9 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e s e c o n d s e t o f 500 mL s h a k e - f l a s k m e d i a 130 111.10 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e 14L f e r m e n t o r m e d i a 131 111.11 F l o w c h a r t f o r t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f c y t o c h r o m e P450cam and r e l a t e d b a c t e r i a l m o n o o x y g e n a s e c o m p o n e n t s f r o m P putida3 s t r a i n PpG786 133 x v i F i g u r e P a 9 ? I I I . 1 2 A s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e S e p h a d e x G-100 c o l u m n s 136 I I I . 13 The c e l l - t o n o m e t e r 138 I I I . 14 A s c h e m a t i c d r a w i n g o f t h e DE-52 c o l u m n c o n s t r u c t e d f r o m a 50mL d i s p o s a b l e s y r i n g e 158 111.15 B l o c k d i a g r a m o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s 164 111.16 S t r u c t u r a l d e t a i l s o f t h e f l a s h a nd s a m p l e c o m p a r t m e n t o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s u n i t 166 I I I . 17 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h i 6 9 111.18 C o m p l e t e w o r k i n g c i r c u i t o f t h e A n a l o g R a t e c o n v e r t e r 172 111.19 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e r e c t a n g u l a r w a t e r - b a t h 176 111.20 D a t a a c q u i s i t i o n s h e e t s u t i l i z e d f o r t h e c o l l e c t i o n o f k i n e t i c d a t a 178 111.21 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e f e r r o u s and f e r r o u s - C O s t a t e s o f m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P4 50cam a l o n g w i t h t h e b r o a d b a n d c u t o f f and n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s m o s t s u i t e d f o r t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s . . . . 182 111.22 T i m e - b a s e d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f l a s h o u t p u t f r o m a t y p i c a l p h o t o g r a p h i c f l a s h g u n 186 I I I . 23 P u l s e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f l a s h o u t p u t f r o m t h e B r a u n f l a s h g u n 186 I I I . 24 G r a p h o f o p t i c a l d e n s i t y m e a s u r e d on t h e C a r y s p e c t r o p h o t o m e t e r us v o l t a g e on t h e f l a s h u n i t 189 x v i i F i g u r e P a 9 e . 111.25 S p e c t r a o f t h e k i n e t i c i n t e r m e d i a t e s f o r m e d by t h e p h o t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x e s o f m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P450cam 191 111.26 D a t a a c q u i s i t i o n s h e e t s u t i l i z e d f o r t h e c o l l e c t i o n o f e q u i l i b r i u m d a t a . . . . 193 I V . 1 G r o w t h o f P. putida s t r a i n PpG786, a t t h e 1.0L s h a k e - f l a s k d u r i n g e a r l y g r o w t h e x p e r i m e n t s 199 I V . 2 G r o w t h o f P. put-Ida, s t r a i n PpG786, a t t h e 14L f e r m e n t o r s t a g e d u r i n g e a r l y g r o w t h e x p e r i m e n t s 199 I V . 3 G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f P. putida, s t r a i n PpG78 6, o v e r e x t e n d e d l e n g t h s o f t i m e i n s h a k e - f l a s k m e d i a 200 IV.4 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e 208 I V . 5 R e f e r e n c e s p e c t r a o f p u r i f i e d p u t i d a -r e d o x i n r e d u c t a s e 211 I V . 6 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f p u t i d a r e d o x i n 213 IV.7 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f s u b s t r a t e - b o u n d c y t o c h r o m e P450cam . . . 217 IV.8 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e f e r r i c s t a t e o f s u b s t r a t e - b o u n d and s u b s t r a t e - f r e e c y t o c h r o m e P450cam 220 IV . 9 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f s u b s t r a t e - f r e e c y t o c h r o m e P450cam . . . . 222 IV . 1 0 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f c y t o c h r o m e P450cam p u r i f i e d i n t h e p r e s e n c e o f 20-50 mM p o t a s s i u m i o n s a n d i n t h e a b s e n c e o f s u b s t r a t e 226 I V . 1 1 V a r i o u s s p e c t r a o f p a r t i a l l y d i m e r i z e d s u b s t r a t e - b o u n d c y t o c h r o m e P450cam 228 x v i i i Figure Page IV . 1 2 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f m y o g l o b i n 231 I V 13 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f a p o c y t o c h r o m e P450cam 234 IV...14 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f t h e p r o t o h e m i n - a p o c y t o c h r o m e s o l u t i o n 239 I V . 1 5 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f p r o t o h e m i n i n a q u e o u s p h o s p h a t e b u f f e r 239 I V . 1 6 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e c y s t e i n e -i n c u b a t e d p r o t o h e m i n - , a p o c y t o c h r o m e s o l u t i o n 242 IV.17 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f t h e r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P4 50cam f o l l o w i n g - D E - 5 2 a n i o n e x c h a n g e • c h r o m a t o g r a p h y 24 2 IV.18 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f t h e s u b s t r a t e - b o u n d p r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P450cam . . . . 243 I V . 1 9 R e p r e s e n t a t i v e d a t a f r o m K i n e t i c Run 2 f o r t h e r e a c t i o n o f CO w i t h t h e f e r r o u s s t a t e o f m y o g l o b i n 250 I V . 20 V a r i a t i o n i n t h e s l o p e o f t h e l n ( A - A e ) us. t i m e p l o t s w i t h c h a n g e s i n CO c o n c e n t r a t i o n f o r K i n e t i c Run 2 o f t h e m y o g l o b i n s y s t e m 256 I V . 2 1 P l o t s o f t j j y s . k o b s 1 d a t a f r o m k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e m y o g l o b i n - C O s y s t e m 258 I V . 22 P l o t s o f -kobs vs.. CO c o n c e n t r a t i o n d a t a f r o m k i n e t i c Runs 1 , 2 and 3 f o r t h e m y o g l o b i n -CO s y s t e m 259 I V . 2 3 G r a p h o f t h e f l u c t u a t i o n i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d u r i n g k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e m y o g l o b i n -CO s y s t e m . . 260 x i x F i g u r e P a ge IV.24 R e p r e s e n t a t i v e d a t a f r o m k i n e t i c Run 3 f o r t h e r e a c t i o n o f CO w i t h t h e f e r r o u s s u b s t r a t e - b o u n d s t a t e o f n a t i v e c y t o c h r o m e P450cam 264 I V . 2 5 V a r i a t i o n i n t h e s l o p e o f t h e l n ( A - A e ) vs. t i m e p l o t s w i t h c h a n g e s i n CO c o n c e n t r a t i o n f o r k i n e t i c Run 3 o f t h e n a t i v e P450cam-CO s y s t e m 269 IV . 2 6 P l o t s o f t ^ vs. t h e a n a l o g - d e r i v e d k o b s _ 1 v a l u e s f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e n a t i v e P4 50cam-CO s y s t e m . . 271 IV.27 P l o t s o f t ^ vs. t h e c o m p u t e r - d e r i v e d ^obs --*- v a l u e s f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e n a t i v e P450cam-CO s y s t e m . . 272 IV.28 P l o t s o f k o b s vs. CO c o n c e n t r a t i o n d a t a f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e s u b s t r a t e - b o u n d n a t i v e P450cam-CO . . 274 s y s t e m I V . 2 9 G r a p h o f t h e f l u c t u a t i o n s i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n t h r o u g h o u t k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e n a t i v e P450cam-CO . . 275 s y s t e m I V . 3 0 R e p r e s e n t a t i v e d a t a f r o m k i n e t i c Run 2 f o r t h e r e a c t i o n o f CO w i t h t h e f e r r o u s s u b s t r a t e - b o u n d s t a t e o f p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P450cam 278 I V . 3 1 V a r i a t i o n o f t h e s l o p e o f t h e l n ( A - A e ) vs. t i m e p l o t s w i t h CO c o n c e n t r a t i o n f o r k i n e t i c Run 2 o f t h e p r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO s y s t e m 283 I V . 32 P l o t s o f tjg vs. t h e a n a l o g - d e r i v e d k-obs~ x d a t a f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO s y s t e m 285 I V . 3 3 P l o t s o f tjg vs. t h e c o m p u t e r - d e r i v e d k o b s - 1 d a t a f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d P450cam s y s t e m 286 IV.34 P l o t s o f k o b g vs. CO c o n c e n t r a t i o n d a t a f o r k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e s u b s t r a t e - b o u n d p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO s y s t e m 287 xx F i g u r e Page I V . 3 5 G r a p h o f t h e f l u c t u a t i o n s i n p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n d u r i n g k i n e t i c Runs 1, 2 and 3 f o r t h e s u b s t r a t e - b o u n d p r o t o h e m i n -r e c o n s t i t u t e d P450cam-CO s y s t e m 288 IV.36 S p e c t r a l c h a n g e s o b s e r v e d f o r E q u i l i b r i u m Run 3 by t h e a d d i t i o n o f CO t o t h e f e r r o u s s u b s t r a t e - b o u n d s t a t e o f n a t i v e c y t o c h r o m e P450cam 294 IV.37 Raw d a t a o b t a i n e d f o r E q u i l i b r i u m Run 3 . . 296 IV.38 P l o t s o f l o g A-Ao vs. l o g [ C O ] f o r E q u i l i b r i u m Runs 1-4 ^°°":A 297 IV.39 D e c o m p o s i t i o n o f d i t h i o n i t e i n p h o s p h a t e b u f f e r 300 I V . 4 0 D e c o m p o s i t i o n o f d i t h i o n i t e i n t h e p r e s e n c e o f f e r r o u s c y t o c h r o m e P450cam 301 I V . 4 1 D e c o m p o s i t i o n o f d i t h i o n i t e i n t h e p r e s e n c e o f f u l l y c a r b o n y l a t e d f e r r o u s P450cam enzyme 302 I V . 4 2 A b s o r b a n c e c h a n g e s o b s e r v e d a t 445nm o f t h e p a r t i a l l y c a r b o n y l a t e d P450cam s y s t e m f o l l o w i n g d i s a p p e a r a n c e o f t h e d i t h i o n i t e p e a k 303 I V . 4 3 S p e c t r a l c h a n g e s o b s e r v e d f o r E q u i l i b r i u m R u n 5 305 IV.44 P l o t s o f l o g A-Ao vs. l o g [ C O ] f o r E q u i l i b r i u m Runs 5 and 6 A o < \ A ? 306 x x i L I S T OF ABBREVIATIONS The f o l l o w i n g l i s t o f a b b r e v i a t i o n s a n d common names, many o f w h i c h a r e commonly a d o p t e d i n c h e m i c a l r e s e a r c h l i t e r a t u r e , w i l l be e m p l o y e d i n t h i s t h e s i s . A a b s o r b a n c e o A a n g s t r o m ( s ) Ao o b s e r v e d a b s o r b a n c e a t t h e s t a r t o f an e x p e r i m e n t Ae o b s e r v e d a b s o r b a n c e when e q u i l i b r i u m h a s b e e n e s t a b l i s h e d Ao, o b s e r v e d a b s o r b a n c e when a r e a c t i o n h a s b e e n c o m p l e t e d amp a m p e r e ( s ) A s n a s p a r a g i n e atm a t m o s p h e r e ( s ) B r bromo, - B r b u f f e r P 50mM p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7.0 b u f f e r P-100 50mM p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7.0, 50mM KC1 b u f f e r T 50mM T r i s b u f f e r , pH 7.3 b u f f e r T-50 50mM T r i s b u f f e r , pH 7.3, 50mM KC1 b u f f e r T-100 50mM T r i s b u f f e r , pH 7.3, lOOmM KC1 b u f f e r T-600 50mM T r i s b u f f e r , pH 7.3, 6 00mM KC1 g„ME g - m e r c a p t o e t h a n o l °C d e g r e e s c e n t i g r a d e cam o r camphor D-(+)-camphor ( 2 - b o r n a n o n e ) C a t c a t a l a s e C-H c a r b o n - h y d r o g e n b o n d cm c e n t i m e t r e ( s ) x x x i CO Cys D .C. DE-52 d e u t e r o h e m i n d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n d i b r o m o d e u t e r o h e m i n DMF DNase DTT ENDOR EPR ESR g G l y h AH° AH* H 2 H 2 ° 2 Hb HC1 heme heme u n i t h e m i n h e m o p r o t e i n H i s HRP c a r b o n m o n o x i d e c y s t e i n e d i r e c t c u r r e n t a n i o n e x c h a n g e r e s i n d e u t e r o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) d i a c e t y l d e u t e r o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) d i b r o m o d e u t e r o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e d e o x y r i b o n u c l e a s e I d i t h i o t h r i e t o l e l e c t r o n n u c l e a r d o u b l e r e s o n a n c e e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e gram g l y c i n e h o u r o r P l a n c k ' s c o n s t a n t s t a n d a r d e n t h a l p y c h a n g e f o r t h e r e a c t i o n e n t h a l p y o f a c t i v a t i o n h y d r o g e n g a s h y d r o g e n p e r o x i d e h e m o g l o b i n h y d r o c h l o r i c a c i d (gas o r s o l u t i o n ) i r o n ( I I ) p o r p h y r i n ( s ) p r o t o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I ) c o m p l e x i r o n ( I I I ) p o r p h y r i n ( s ) b i o l o g i c a l h e m e - c o n t a i n i n g p r o t e i n h i s t i d i n e h o r s e - r a d i s h p e r o x i d a s e x x i i i K e q u i l i b r i u m c o n s t a n t k k i n e t i c r a t e c o n s t a n t Kco e q u i l i b r i u m c o n s t a n t f o r c a r b o n m o n o x i d e b i n d i n g Ko„ e q u i l i b r i u m c o n s t a n t f o r d i o x y g e n b i n d i n g kc:„ k i n e t i c r a t e c o n s t a n t f o r C O - a s s o c i a t i o n o n t o m y o g l o b i n o r c y t o c h r o m e P450cam k ^ k i n e t i c r a t e c o n s t a n t f o r t h e d i s s o c i a t i o n ° o f CO f r o m l i g a n d - b o u n d m y o g l o b i n o r c y t o c h r o m e P450cam k , p s e u d o f i r s t - o r d e r r a t e c o n s t a n t ob s c L l i t r e I n n a t u r a l l o g a r i t h m l o g common l o g a r i t h m L y s l y s i n e M m o l a r i t y max maximum Mb m y o g l o b i n MCD m a g n e t i c c i r c u l a r d i c h r o i s m mesohemin m e s o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) m e t h m y o g l o b i n f e r r o u s ( F e ( I I ) ) s t a t e o f m y o g l o b i n m e t m y o g l o b i n f e r r i c (Fe ( I I I ) ). s t a t e * , of m y o g l o b i n mg m i l l i g r a m ( s ) m i n m i n u t e ( s ) o r minimum mL m i l l i l i t r e ( s ) mm m i l l i m e t r e ( s ) mM m i l l i m o l a r msec m i l l i s e c o n d ( s ) m y o g l o b i n - C O c a r b o n m o n o x i d e c o m p l e x o f m e t h m y o g l o b i n x x i v NADH NAD4" NADPH NADP + nm NMR °2 OD660nm 'a P420 P450 P450cam P 4 5 0 F e ( I I ) o r F e ( I I ) P 4 5 0 P4 5 0 c a m F e ( I I ) o r F e ( I I ) P 4 5 0 c a m r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e r e d u c e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e n a n o m e t r e ( s ) n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e d i o x y g e n o p t i c a l d e n s i t y a t 660nm p r e s s u r e a t w h i c h 50% o f t h e s y s t e m i s c o n v e r t e d p r e s s u r e a t w h i c h 50% o f t h e s y s t e m i s c a r b o n y l a t e d p r e s s u r e a t w h i c h 50% o f t h e s y s t e m i s o x y g e n a t e d d e g r a d e d f o r m o f c y t o c h r o m e P450 c y t o c h r o m e P450 Pseudomonas putida c y t o c h r o m e P450cam f e r r o u s s t a t e o f c y t o c h r o m e P450 f e r r o u s s t a t e o f Pseudomonas putida c y t o c h r o m e P450cam P450-CO, P 4 5 0 F e ( I I ) - C O c a r b o n y l a t e d c y t o c h r o m e P450 o r F e ( I I ) P 4 5 0 - C O P450cam-CO o r F e ( I I ) P 4 5 0 c a m - C O PA PH P i p r o t o h e m i n c a r b o n y l a t e d Pseudomonas putida c y t o c h r o m e P450cam phosphate-ammonium - l o g [ H + ] i s o e l e c t r i c p o i n t p r o t o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) x x v RNase r i b o n u c l e a s e I rpm r e v o l u t i o n s p e r m i n u t e RR r e s o n a n c e Raman RS m e c a p t i d e o r t h i o l a t e a n i o n S o r s e c . s e c o n d (s) S s p i n s t a t e AS° s t a n d a r d e n t r o p y c h a n g e f o r t h e r e a c t i o n AS* e n t r o p y o f a c t i v a t i o n S e r s e r i n e T t e m p e r a t u r e t t i m e t , h a l f - l i f e T h r t h r e o n i n e TLC t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y T r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e T r i z m a b a s e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e f r e e b a s e T y r t y r o s i n e UV u l t r a v i o l e t V v o l t a g e W w a t t ( s ) Y f r a c t i o n o f p r o d u c t f o r m e d d u r i n g a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t e ... m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t A w a v e l e n g t h u m i c r o v f r e q u e n c y n b o n d i n g w h e r e e l e c t r o n d e n s i t y i s on e i t h e r s i d e o f t h e i n t e r n u c l e a r p l a n e x x v i o b o n d i n g w h e r e e l e c t r o n d e n s i t y i s maximum on an i n t e r n u c l e a r a x i s l O O x s a l t s s t o c k s o l u t i o n o f e s s e n t i a l s s a l t s r e q u i r e d f o r b a c t e r i a l g r o w t h [ ] s q u a r e b r a c k e t s d e n o t e m o l a r c o n c e n t r a t i o n v / v v o l u m e p e r v o l u m e v/w v o l u m e p e r w e i g h t % p e r c e n t a g e - a p p r o x i m a t e l y e q u a l s t o > g r e a t e r t h a n < l e s s t h a n x x v i i ACKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o t h a n k P r o f e s s o r s D a v i d D o l p h i n a n d B r i a n R. James f o r t h e i r g u i d a n c e a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s w o r k , p a r t i c u l a r l y f o r t h e i r many v a l u a b l e comments (and p a t i e n c e ) • d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s . I a l s o w o u l d l i k e t o a c k n o w l e d g e D i a n a C o l n e t t f o r h e r e x p e r t a r t i s t r y a n d my w i f e / , A n d r e a , whose c o n s t a n t s u p p o r t h e l p e d me k e e p my s a n i t y d u r i n g t h e w r i t i n g o f t h i s t h e s i s . F i n a l l y , I must t h a n k A n n e t t e Hiom (who d e s e r v e s t h e P u r p l e H e a r t ) and J u d y Munz f o r t h e i r e x p e r t i s e i n t y p i n g t h i s t h e s i s . x x v i i i CHAPTER I INTRODUCTION 2 I_ I n t r o d u c t i o n T h r o u g h o u t t h e e v o l u t i o n o f l i v i n g o r g a n i s m s N a t u r e h a s d e v i s e d c o m p l e x a nd i n t r i c a t e p h y s i o l o g i c a l s y s t e m s c a p a b l e o f s u s t a i n i n g l i f e . The c h e m i s t r y o f t h e s e s y s t e m s i s f r e -q u e n t l y c o n t r o l l e d b y e n z y m e s , w h i c h a r e h i g h l y s p e c i a l i z e d p r o t e i n m o l e c u l e s c a p a b l e o f c a t a l y s i n g t h e b i o c h e m i c a l r e a c t i o n s n e c e s s a r y t o s u p p o r t f u n c t i o n i n g c e l l s . The c a t a l y t i c c e n t e r , o r a c t i v e s i t e , o f many o f t h e s e enzyme s y s t e m s r e q u i r e s o n l y t h e i r t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e as p r o t e i n s f o r e n z y m a t i c a c t i v i t y ; h o w e v e r , o t h e r s u t i l i z e , i n a d d i t i o n , n o n - p r o t e i n c o f a c t o r s f o r c a t a l y t i c f u n c t i o n i n g . T h e s e c o f a c t o r s , w h i c h a r e known a s c o e n z y m e s , o f t e n t a k e t h e f o r m o f m e t a l i o n s o r c o m p l e x o r g a n i c m o l e c u l e s , and s o m e t i m e s b o t h a r e r e q u i r e d . S c i e n t i s t s f r o m a l l d i s c i p l i n e s h a v e l o n g b e e n f a s c i n a t e d b y t h e r e m a r k a b l e c h e m i s t r y p r o d u c e d a t t h e s e b i o c a t a l y t i c c e n t e r s , w h i c h f a r e x c e e d t h e i r man-made c o u n t e r p a r t s i n r e a c t i o n s p e c i f i c i t y , c a t a l y t i c e f f i c i e n c y a n d c a p a c i t y t o o p e r a t e u n d e r m i l d c o n d i t i o n s . As a r e s u l t , a g r e a t d e a l o f r e s e a r c h h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d s u n d e r s t a n d i n g t h e p a r t i c u l a r b i o l o g i c a l and s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s w h i c h a l l o w f o r e n z y m a t i c f u n c t i o n -i n g , as w e l l a s m i m i c k i n g t h e c a t a l y t i c p r o p e r t i e s f o r t h e p u r p o s e o f d e s i g n i n g e f f i c i e n t m o d e l and i n d u s t r i a l c a t a l y s t s . One c l a s s o f b i o c a t a l y s t s w h i c h h a s b e e n u n d e r i n c r e a s -i n g l y i n t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n f o r t h e p a s t two d e c a d e s i s 1-5 t h e c y t o c h r o m e s P450 ( P 4 5 0 ) . The a c t i v e s i t e o f t h i s 3 g r o u p o f enzymes i s an i r o n a t o m c e n t e r e d a t t h e c o r e o f t h e c o m p l e x o r g a n i c p r o t o p o r p h y r i n I X n u c l e u s ( F i g u r e 1 . 1 ) . T h i s n o n - p r o t e i n m o i e t y , known a s t h e heme u n i t , i s u t i l i z e d e x t e n s i v e l y i n N a t u r e w h e r e s m a l l c h a n g e s i n t h e heme e n v i r o n m e n t , a s p r o v i d e d b y t h e p r o t e i n , c a n d r a m a t i c a l l y 6 a l t e r t h e c a t a l y t i c p r o c e s s t h a t o c c u r s a t t h e i r o n c e n t e r . One p a r t i c u l a r r e a c t i o n c a t a l y s e d b y t h e c y t o c h r o m e s P4 50 c a n be g e n e r a l i z e d i n R e a c t i o n 1.1, w h e r e R i s a s a t u r a t e d h y d r o c a r b o n m o l e c u l e . RH + 0 2 + NADH + H + *• ROH + H 2 0 + NAD + (1.1) The u n i q u e e n v i r o n m e n t o f t h e heme u n i t i n t h e s e enzyme s y s t e m s a l l o w s f o r d i r e c t m e t a l - m e d i a t e d a c t i v a t i o n o f m o l e c u l a r d i o x y g e n ( 0 2 ) f o r t h e s e l e c t i v e i n s e r t i o n o f one o x y g e n a t o m i n t o s u b s t r a t e s . A s shown i n R e a c t i o n 1.1, t h e a c t i v e o x i d i z i n g a g e n t i s t y p i c a l l y c a p a b l e o f o x i d i z i n g u n a c t i v a t e d C-H b o n d s t o t h e c o r r e s p o n d i n g a l c o h o l s . F o r t h i s p a r t i c u l a r f u n c t i o n t h e c y t o c h r o m e s P450 a r e c o l l e c t i v e l y known a s o x y g e n a s e s , w h i c h a r e a c l a s s o f b i o c a t a l y s t s t h a t i n c o r p o r a t e one o r two atoms f r o m 0 2 i n t o a s u b s t r a t e ; t h e P450 c y t o c h r o m e s a r e t h e r e f o r e m o n o o x y g e n a s e s . D i o x y g e n i s a l s o a c t i v a t e d b y h e m e - c o n t a i n i n g o x i d a s e s whose c a t a l y t i c f u n c t i o n c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f t h e o x y g e n a s e s b u t b o t h atoms o f 0 2 a r e c o n v e r t e d t o w a t e r o r h y d r o g e n p e r o x i d e ( H 2 0 2 ) via w h a t a r e f r e q u e n t l y d e h y d r o g e n a t i o n r e a c t i o n s . The s t r u c t u r e o f t h e heme u n i t 5 The a c t i v a t i o n o f m o l e c u l a r d i o x y g e n b y m e t a l c o m p l e x e s f o r t h e o x i d a t i o n o f o r g a n i c compounds i s o f g r e a t i n d u s t r i a l 7 i m p o r t a n c e a nd i s u s e d e x t e n s i v e l y t o d a y . The b e s t known e x a m p l e o f a m e t a l - m e d i a t e d t r a n s f e r o f a n o x y g e n atom t o an o r g a n i c s u b s t a n c e i s t h e c o m m e r c i a l l y i m p o r t a n t g a s - p h a s e o x i d a t i o n o f e t h y l e n e t o e t h y l e n e o x i d e u s i n g a s i l v e r c a t a l y s t ( R e a c t i o n 1.2),. A g / O CH2 = CH2 + 02 ^ A ' 2 ^ 3 • CH2 —CH2 <i.2) 250°C As w e l l , t h e o x i d a t i o n o f o r g a n i c s u b s t r a t e s by t r a n s i t i o n -m e t a l s a l t s h a s b e e n u s e d w i d e l y i n t h e p e t r o c h e m i c a l i n d u s t r y 7 f o r many y e a r s . A s u b s t a n t i a l d r a w b a c k t o many o f t h e m e t a l -c a t a l y s e d o x i d a t i o n p r o c e s s e s i s t h a t t h e r e a c t i o n s a r e f r e -q u e n t l y n o n - s e l e c t i v e b e c a u s e t h e y p r o c e e d via f r e e - r a d i c a l p a t h w a y s t h a t a r e o f t e n i n i t i a t e d by t h e m e t a l i o n . T h a t i s , t h e c h e m i c a l f a t e o f 0^, a c t i v a t e d t h r o u g h m e t a l - c o o r d i n a t i o n i n t h e s e p r o c e s s e s , i s d i f f i c u l t t o c o n t r o l b e c a u s e o f t h e v a r i e t y o f p a t h w a y s o p e n f o r r e a c t i o n s a f t e r a c t i v a t i o n ( F i g u r e 1 . 2 ) . T h e r e f o r e , t h e s e a r c h f o r m e t a l c a t a l y s t s t o p r o m o t e more s e l e c t i v e o x i d a t i o n s , e s p e c i a l l y u s i n g , i s a p r i m e g o a l t h a t h a s immense p o t e n t i a l o n a n i n d u s t r i a l s c a l e 8 and i s t h u s an i m p o r t a n t r e s e a r c h a r e a . The u l t i m a t e a i m w o u l d be t o m i m i c t h e C ^ - a c t i v a t i o n a b i l i t y o f t h e c y t o c h r o m e s P 4 5 0 . 6 'o2(A) HO"*" OXONIUM ION hj/' CYTOCHROME P-450 22.4 K CAL MOLE" 1 H eV) u _ ' •• CANCER PHOTOTHERAPY H 2 ° + 2 * ° X E N E 1 •• o2 E ° - 0 . 2 7 V E ° + I.63V 6~ e~ HOj > ^ > H H + DIOXYGEN E °-0 .4V e~ H + p K 4 5 E*+0.90V e~ E ° + 2 . 2 0 V 2O2 'OH — H + H ?0 H + HYDROGEN PEROXIDE HYDROXYL RADICAL • • H 2 0 WATER E ° + I 3 5 V 2e~ 0 2 > 0 ? 4e _ 4H"1 V 2H-1-SUPEROXIDE ION 2H + H 2 0 2 j J p K , H 0 2 H Y D R 0 P E R 0 X I D E CATALASE • • H 2 0 pK '"It E ° + 0 . 8 0 V 2 H 2 0 CYTOCHROME OXIDASE II ION pK 20 O H " HYDROXIDE ION PEROXIDE ION F i g u r e 1. 2 7 The u s e o f m e t a l l o p o r p h y r i n s a s c a t a l y s t s f o r s e l e c t i v e a c t i v a t i o n i s an a t t r a c t i v e i d e a b e c a u s e o f t h e i r u s e a s s e l e c t i v e c a t a l y t i c c e n t e r s i n many b i o l o g i c a l s y s t e m s . C o m p a r i s o n o f t h e c y t o c h r o m e P4 50 m o n o o x y g e n a s e s w i t h v a r i o u s o t h e r h e m e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s s u c h a s m y o g l o b i n (Mb) and h e m o g l o b i n (Hb) ( r e v e r s i b l e 0^ b i n d i n g ) , c y t o c h r o m e c o x i d a s e ( t h e t e r m i n a l enzyme i n t h e r e s p i r a t o r y r e d o x c h a i n t h a t r e d u c e s 0^ t o H 2 0 ) , and t h e enzymes c a t a l a s e ( C a t ) and h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (HRP) ( c a t a l y t i c d e c o m p o s i t i o n o f H 2 ^ 2 ^ i n d i c a t e s t h e d i v e r s i t y o f s e l e c t i v e C ^ - r e l a t e d c h e m i s t r y t h a t c a n t a k e p l a c e a t t h e ( i r o n ) m e t a l l o p o r p h y r i n c e n t e r . 6 P e o p l e h a v e l o n g s o u g h t f o r s i m p l e r p r o t e i n - f r e e c o o r d i n a t i o n c o m p l e x e s , s u c h a s m e t a l l o p o r p h y r i n s , t h a t m i g h t m i m i c t h e p r o p e r t i e s o f t h e n a t u r a l s y s t e m s , f o r e x a m p l e , i n t e r m s o f C ^ - c a r r y i n g a b i l i t y a n d f o r a c t i v a t i o n o f f o r s u b s e q u e n t r e a c t i v i t y a s i n t h e o x y g e n a s e s a n d o x i d a s e s . W i t h r e g a r d t o m o d e l c a t a l y s t s m i m i c k i n g c y t o -chrome P4 50 o x y g e n a t i o n s , s i m p l e m e t a l l o p o r p h y r i n s h a v e b e e n shown t o c a t a l y z e t h e a u t o x i d a t i o n ( w h i c h r e f e r s t o o x i d a t i o n w i t h d i o x y g e n ) o f o l e f i n s s u c h as c y c l o h e x e n e . 9 The c a t a l y s e s h o w e v e r , a r e t h o u g h t t o p r o c e e d via o l e f i n a c t i v a t i o n r a t h e r t h a n a c t i v a t i o n . F u r t h e r m o r e , s i n c e no r e p o r t s h a v e a p p e a r e d t o d a t e on t h e o x i d a t i o n o f s u b s t r a t e s u s i n g m e t a l l o p o r p h y r i n s u n d e r c o n d i t i o n s a t w h i c h d i o x y g e n c o m p l e x e s a r e known t o e x i s t , s u b s t r a t e r a t h e r t h a n 0 2 a c t i v a t i o n i s t h o u g h t t o be a common f e a t u r e o f t h e s e r e a c t i o n s . I t i s e v i d e n t , t h e r e f o r e , t h a t 8 a l t h o u g h m e t a l l o p o r p h y r i n s r e m a i n a s a t t r a c t i v e c a t a l y s t s via s u c h s u b s t r a t e a c t i v a t i o n , t h e y a p p e a r t o h a v e l i m i t e d a b i l i t y f o r a c t i v a t i o n . 9 The a p p a r e n t d i f f e r e n c e s i n c a t a l y t i c f u n c t i o n o f t h e n a t u r a l P4 50 s y s t e m s a n d t h e m o d e l c a t a l y s t s a r e d i f f i c u l t t o a s s e s s and a r e t h e s u b j e c t o f e x t e n s i v e r e v i e w s . 7 ' 8 C l e a r l y , a more t h o r o u g h u n d e r -s t a n d i n g o f t h e f a c t o r s a f f e c t i n g t h e i n t e r a c t i o n o f 0 2 w i t h t h e n a t u r a l enzymes as w e l l as t h e m o d e l s y s t e m s i s r e q u i r e d f o r a b e t t e r a p p r e c i a t i o n o f t h e n a t u r e o f t h e m e t a l - G ^ i n t e r a c t i o n and t h e r o l e o f t h e p r o t e i n . T h e s e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s a r e v i t a l f o r t h e p r o d u c t -i o n o f m e t a l l o p o r p h y r i n c a t a l y s t s t h a t c l o s e l y m i m i c m o n o o x y g e n a s e a c t i v i t y . R e c e n t l y , r e d u c e d b a c t e r i a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 , c o n t a i n i n g p r o t o - , meso-, d e u t e r o - , d i b r o m o d e u t e r o - , and d i a c e t y l d e u t e r o -p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I ) (heme) c e n t e r s , ( F i g u r e 1.3) h a s b e e n Shown t o b i n d 0 2 r e v e r s i b l y a s w e l l a s c a r b o n m o n o x i d e ( C O ) . 1 0 The r e c o n s t i t u t e d s y s t e m s , w h i c h w e r e a l l shown t o c a t a l y z e R e a c t i o n 1.1, p r o v i d e an e x c e l l e n t o p p o r t u n i t y t o f u r t h e r a s s e s s t h e f a c t o r s a f f e c t i n g t h e c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f t h e m e t a l l o p o r p h y r i n s t h a t a c t i v a t e 0 2 . K i n e t i c and t h e r m o d y n a m i c s t u d i e s o n t h e r e a c t i o n o f s m a l l g a s m o l e c u l e s ( i . e . 0 2 and CO) w i t h t h e s e n a t u r a l p r o t e i n s y s t e m s , a l t h o u g h r e l a t i v e l y c o m p l e x , 8 may p r o v i d e some c o n c l u s i o n s r e g a r d i n g t h e n a t u r e o f t h e m e t a l - g a s i n t e r a c t i o n a s w e l l a s t h e r o l e o f t h e p r o t e i n i n c y t o c h r o m e P 4 5 0 - m e d i a t e d o x i d a t i o n s . T h i s w i l l , i n t u r n , 9 Mesoporphyrinatoiron (ill) Deuteroporphyrinatoiron (ill) Diacetyldeuteroporphyrinatoiron (ill) Dibromodeuteroporphyrinatoiron (ill) R — — C H 2~ C H 3 -H -Br F i g u r e 1.3 V a r i o u s s u b s t i t u t e d h e m i n s . 10 p r o v i d e a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s r e q u i r e d f o r more s e l e c t i v e O ^ - a c t i v a t i o n by s i m p l e ( p r o t e i n - f r e e ) m e t a l l o p o r p h y r i n c a t a l y s t s . The m a i n o b j e c t o f t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s was t h e r e f o r e , t o s e t up a f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s f o r t h e s y s t e m a t i c k i n e t i c a n a l y s i s o f c o n v e r s i o n s s u c h as 1 *• 2 a n d 1 3 f o r n a t i v e and t h e h e m e - r e c o n s t i t u t e d Pseudomonas putida P450cam (P450cam) s y s t e m s (Scheme 1 . 1 ) . P450 Scheme 1.1 O n l y t h e c o n v e r s i o n o f 1 ^ 3 ( i . e . t h e c a r b o n y l a t i o n r e a c t i o n s ) i s c o n s i d e r e d h e r e . S y n t h e s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f t h e meso-, d e u t e r o - , d i a c e t y l d e u t e r o - , a n d d i b r o m o d e u t e r o -p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) (hemin) m a c r o c y c l e s a r e o u t l i n e d . P r o c e d u r e s f o r g r o w t h o f P. putida and i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f c y t o c h r o m e P450c'am a r e d e t a i l e d a l o n g w i t h a g e n e r a l method f o r r e c o n s t i t u t i o n o f n a t i v e P4 50cam w i t h m o d i f i e d h e m i n d e r i v a t i v e s . S p e c t r a l d a t a f o r t h e s e s y s t e m s a r e d i s c u s s e d . The f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s u s e d f o r k i n e t i c a n a l y s e s w i l l be d e s c r i b e d , t o g e t h e r w i t h r e s u l t s f r o m c a r b o n y l a t i o n o f m y o g l o b i n , a nd n a t i v e a n d p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P450cam. The e q u i l i b r i u m b i n d i n g c o n s t a n t f o r t h e c a r b o n y l a t i o n o f n a t i v e P450cam, Kco ( i . e . f o r c o n v e r s i o n 1 3 ) , i s d e t e r m i n e d a nd t h e r e s u l t s d i s c u s s e d . The t h e s i s b e g i n s w i t h a l i t e r a t u r e r e v i e w e x a m i n i n g a r e a s o f i n t e r e s t i n c l u d i n g some h i s t o r i c a l , b i o c h e m i c a l , s t r u c t u r a l , and m e c h a n i s t i c d a t a f o l l o w e d b y a s u r v e y o f t h e w o r k r e p o r t e d on t h e i n t e r a c t i o n o f CO w i t h a l l c l a s s e s o f c y t o c h r o m e s P 4 5 0 . T h i s t h e s i s f i n i s h e s w i t h some g e n e r a l c o n c l u s i o n s r e g a r d i n g t h i s w o r k and r e c o m m e n d a t i o n s f o r f u t u r e s t u d i e s . CHAPTER I I LITERATURE REVIEW 13 I I . 1 H i s t o r i c a l O v e r v i e w 400 440 Wavelength (nrn) F i g u r e I I . 1 The f i r s t r e p o r t o n t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e c a r b o n m o n o x i d e c o m p l e x o f r e d u c e d l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 . The j . s o l i d l i n e c u r v e r e p r e s e n t s t h e d i f f e r e n c e s p e c t r u m o b s e r v e d a f t e r s o d i u m d i t h i o n i t e r e d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f CO ; R e f . 1 1 . The p r e s e n c e o f a c a r b o n m o n o x i d e - b i n d i n g p i g m e n t i n l i v e r m i c r o s o m e s was o r i g i n a l l y r e p o r t e d by K l i n g e n b e r g 1 1 i n 19 58, a l t h o u g h t h i s o b s e r v a t i o n was made e a r l i e r by G. R. W i l l i a m s . 1 2 I n t h e s e e x p e r i m e n t s a p r o m i n e n t a b s o r b a n c e b a n d maximum n e a r 450nm i n t h e d i f f e r e n c e a b s o r b a n c e s p e c t r u m was o b s e r v e d when t h e s u s p e n s i o n o f m i c r o s o m e s was r e d u c e d w i t h s o d i u m d i t h i o n i t e (^2820^) i n t h e p r e s e n c e o f c a r b o n m o n o x i d e ( F i g u r e I I . 1 ) . 14 S i n c e t h e CO c o m p l e x e s o f t h e h e m o p r o t e i n s known a t t h a t t i m e h a d S o r e t maxima a t c o n s i d e r a b l y s h o r t e r w a v e l e n g t h s (~420nm), a nd s i n c e t h e CO d i f f e r e n c e s p e c t r u m o f t h e r e d u c e d l i v e r m i c r o s o m e s showed o n l y t h e pe a k a t 4 50nm, t h e r e was no i m m e d i a t e c l u e a s t o t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h i s n e w l y d i s c o v e r e d p i g m e n t . I n 1964, Omura a nd S a t o 1 3 / 1 4 e s t a b l i s h e d t h e h e m o p r o t e i n n a t u r e o f t h e C O - b i n d i n g p i g m e n t . C h a r a c t e r i z a t i o n a s a h e m o p r o t e i n was a c t u a l l y d e t e r m i n e d f r o m a p u r i f i e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t e x h i b i t i n g a r e d u c e d C O - a b s o r p t i o n p e a k a t 420nm. Omura and S a t o t e r m e d t h e C O - b i n d i n g p i g m e n t s as c y t o c h r o m e s P450 and P420 a c c o r d i n g t o t h e p o s i t i o n o f t h e S o r e t a b s o r p t i o n maximum o f t h e r e d u c e d - C O c o m p l e x e s . C o n c u r r e n t w i t h t h e s e s p e c t r o s c o p i c e x p e r i m e n t s , e v i d e n c e was a c c u m u l a t i n g 1 5 f o r t h e p r e s e n c e i n l i v e r m i c r o s o m e s o f an enzyme s y s t e m t h a t c a t a l y s e d t h e g e n e r a l R e a c t i o n I I . 1 . NADPH + H + + 1 8 0 2 + RH NADP + + H 2 1 8 0 + R 1 8 O H ( I I . 1 ) T h i s t y p e o f r e a c t i o n w a s ; d e s i g n a t e d a m i x e d f u n c t i o n o x i d a t i o n by M a s o n , 1 6 a m o n o x y g e n a t i o n b y H a y a i s h i , 1 7 a n d a h y d r o x y l a t i o n by M a s s a r t a n d V e r c a u t e r e n . 1 7 a The r o l e o f c y t o c h r o m e P4 50 i n t h e g e n e r a l R e a c t i o n I I . 1 was f i r s t shown w i t h a d r e n a l c o r t e x m i c r o s o m e s i n 1963 by u t i l i z i n g e v i d e n c e i n d i c a t i n g t h a t t h e m i c r o s o m a l f r a c t i o n known t o c a t a l y s e t h e C 2 1 - h y d r o x y l a t i o n o f s t e r o i d s was i n h i b i t e d 15 by c a r b o n m o n o x i d e . 1 8 T a k i n g a d v a n t a g e o f t h e o b s e r v e d l i g h t r e v e r s i b i l i t y o f t h e c a r b o n y l a t e d f e r r o u s h e m o p r o t e i n c o m p l e x ( a t 450nm) and u s i n g a W a r b u r g a p p a r a t u s , 1 9 E s t a b r o o k and c o - w o r k e r s w e r e a b l e t o p r o d u c e t h e p h o t o c h e m i c a l a c t i o n s p e c t r u m o f t h e a c t i v e m o n o x y g e n a s e enzyme p r e s e n t i n a d r e n a l c o r t e x m i c r o s o m e s 2 0 ( F i g u r e I I . 2 ) . S i n c e t h e p h o t o c h e m i c a l a c t i o n s p e c t r u m showed t h e same i n t e n s e a b s o r p t i o n peak a t 450nm as i n d i c a t e d i n t h e r e d u c e d -CO d i f f e r e n c e s p e c t r u m o f t h e l i v e r m i c r o s o m e s , c y t o c h r o m e P450 was p r o v e n t o be t.<H 4) O C (0 a k. o (0 JQ < 0.75^ Q25H I • 1 • -r- • 1 1 1— 400 420 440 460 480 900 Wavelength (nmj F i g u r e i i . 2 P h o t o c h e m i c a l a c t i o n l i g h t r e v e r s a l o f t h e h y d r o x y l a t i o n o f 17<*-R e f . 2 0 . s p e c t r u m f o r t h e C O - i n h i b i t e d C-21 h y d r o x y - p r o g e s t e r o n e ; t h e t e r m i n a l o x y g e n a s e f u n c t i o n i n g i n t h e C 2 1 - h y d r o x y l a t i o n o f a 1 7 a - h y d r o x y p r o g e s t e r o n e ( R e a c t i o n I I . 2 ) . CH CH.-OH I c=o Jk:OH C = 0 O ( I I . 2 ) NADP*+ H20 17- hydroxy-Progesterone Cortexolone T o d a y , c y t o c h r o m e P4 50 i s e s t a b l i s h e d t o be t h e t e r m i n a l o x y g e n a s e i n v o l v e d i n t h e m o n o o x y g e n a t i o n o f a g r e a t v a r i e t y o f f o r e i g n , as w e l l a s e n d o g e n o u s , l i p i d s o l u b l e c o m p o u n d s . 2 1 / 3 6 D u r i n g t h e m i d 1 9 6 0 ' s , f o l l o w i n g r e c o g n i t i o n t h a t c y t o c h r o m e P450 f u n c t i o n e d i n a v a r i e t y o f h y d r o x y l a t i o n r e a c t i o n s , e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t t o e v a l u a t e t h e m o l e c u l a r e v e n t s a s s o c i a t e d w i t h s u b s t r a t e i n t e r a c t i o n w i t h t h i s h e m o p r o t e i n . The f i r s t s u c c e s s f u l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d by N a r a s i m h u l u et al . 2 2 who r e p o r t e d a m a j o r s p e c t r a l c h a n g e i n t h e d i f f e r e n c e s p e c t r u m when 1 7 - h y d r o x y p r o g e s t e r o n e was add e d t o a s u s p e n s i o n o f a d r e n a l c o r t e x m i c r o s o m e s c o n t a i n i n g c y t o c h r o m e P450 ( F i g u r e I I . 3 ) . S u b s e q u e n t t o t h i s o b s e r v a t i o n a w i d e v a r i e t y o f e x o g e n o u s and e n d o g e n o u s s u b s t r a t e s w e r e e x a m i n e d a n d t h e s p e c t r a l c h a n g e s c h a r a c t e r i z e d . 2 3 17 380 400 420 440 460 Wavelength (nm) F i g u r e I I . 3 The f i r s t s u b s t r a t e - i n d u c e d d i f f e r e n c e s p e c t r u m r e s u l t i n g f r o m t h e a d d i t i o n o f i n c r e a s i n g amounts o f 1 7 - h y d r o x y -p r o g e s t e r o n e (up t o lOmM) t o a d r e n a l c o r t e x m i c r o s o m e s i n t h e a b s e n c e o f r e d u c i n g a g e n t s . The s p e c t r u m i n d i c a t e s t h e m a g n i t u d e o f t h e s p e c t r a l c h a n g e a t 420nm ( t r a c e 7 r e p r e s e n t s t h e maximum d e p t h o f t h e t r o u g h ) a n d 388nm ( t r a c e 7 r e p r e s e n t s t h e maximum h e i g h t o f t h e p e a k ) w i t h i n c r e a s i n g s t e r o i d c o n c e n t r a t i o n ; R e f . 2 2 The s p e c t r a l c h a n g e s w e r e i n t e r p r e t e d a s r e p r e s e n t i n g t h e f o r m a t i o n o f a h i g h - s p i n c o m p l e x b e t w e e n t h e s u b s t r a t e and t h e f e r r i c s t a t e o f t h e e n z y m e . 2 3 A l o n g w i t h t h e s e s t u d i e s , enzyme i n d u c t i o n e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d a c o m p l e x in vivo b e h a v i o r o f t h e d r u g - m e t a b o l i z i n g c y t o c h r o m e P450 enzymes i n l i v e r m i c r o s o m e s . 2 h I t was p o s t u l a t e d t h a t a d m i n i s t r a t i o n o f v a r i o u s s u b s t r a t e s n o t o n l y i n d u c e d t h e b i o s y n t h e s i s o f t h e e n z y m e , 2 4 b u t a l s o i n d u c e d s p e c i f i c f o r m s o f t h e enzyme d e p e n d i n g on t h e p a r t i c u l a r s u b s t r a t e . 2 5 W i t h i m p r o v e d c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s , t h e i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f d i s t i n c t s p e c i e s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 2 6 h a s s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t d i f f e r e n t c l a s s e s o f i n d u c i n g a g e n t s s t i m u l a t e 18 t h e s y n t h e s i s o f d i s t i n c t f o r m s o f t h i s heme p r o t e i n . 2 7 S i n c e t h e i n i t i a l d i s c o v e r y o f t h e enzyme, d e t a i l e d in v i t r o c h a r a c t e r i z a t i o n h a s b e e n hampered b e c a u s e o f t h e d i f f i c u l t y i n o b t a i n i n g p u r i f i e d , e n z y m a t i c a l l y a c t i v e c y t o c h r o m e P4 50 s a m p l e s f r o m mammalian t i s s u e s . , A t t e m p t s t o s o l u b i l i z e a n d p u r i f y t h e m i c r o s o m a l p r o t e i n s l e d o n l y t o t h e m o d i f i e d i n a c t i v e f o r m o f t h e h e m o p r o t e i n d e s i g n a t e d a s c y t o c h r o m e P 4 2 0 . 1 3 ' 1 4 The mammalian s o u r c e s o f t h e c y t o c h r o m e w e r e f o u n d t o be c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e l i p i d m e m b r a n e , 2 8 and d e g r a d a t i o n r e a d i l y o c c u r r e d u p o n i s o l a t i o n . A m a j o r b r e a k t h r o u g h by G u n s a l u s a n d c o - w o r k e r s 2 9 o c c u r r e d i n 1968 d u r i n g a n i n t e n s i v e s e a r c h f o r t h e g e n e t i c b a s i s o f m e t a b o l i c d i v e r s i t y among t h e v a s t r a n g e o f b a c t e r i a l s t r a i n s f o u n d i n s o i l and w a t e r . The c y t o c h r o m e P450 m o n o o x y g e n a s e enzyme was i s o l a t e d f r o m Pseudomonas putida s t r a i n PpG 1, known t o be i n v o l v e d i n t h e s t e r e o s p e c i f i c o x i d a t i o n o f t h e b i c y c l i c m o n o t e r p e n e , 2 - b o r n a n o n e ( D - ( + ) -camphor) ( R e a c t i o n I I . 3 ) . 3 0 2-Bornanone 5-exo- hydroxy -2-Bornanone 19 U n l i k e i t s mammalian c o u n t e r p a r t s , t h e enzyme was s o l u b l e a n d r e a d i l y p u r i f i e d , a s w e r e t h e a s s o c i a t e d e l e c t r o n t r a n s f e r p r o t e i n s r e q u i r e d f o r camphor m o n o o x y g e n a s e a c t i v i t y ; a f l a v o p r o t e i n d e s i g n a t e d a N A D H - p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e a n d an i r o n - s u l p h u r p r o t e i n , p u t i d a r e d o x i n . 3 1 The m o n o o x y g e n a s e component was t e r m e d c y t o c h r o m e P450cam ( P 4 5 0 c a m ) 2 9 s i n c e i t was i s o l a t e d f r o m b a c t e r i a u t i l i z i n g camphor as t h e s o l e c a r b o n a n d e n e r g y s o u r c e . The d i s c o v e r y o f t h i s b a c t e r i a l m o n o o x y g e n a s e s y s t e m has g r e a t l y a d v a n c e d t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m o f c y t o c h r o m e P450 c a t a l y t i c a c t i o n , a s w e l l a s t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f t h e s e enzymes. S i n c e t h e i n i t i a l i d e n t i f i c a t i o n o f a n o x y g e n a t e d f o r m o f c y t o c h r o m e P450cam by I s h i m u r a , 3 2 t h e c h e m i c a l , p h y s i c a l , and b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e i n d i v i d u a l s t e p s o f t h e c a t a l y t i c c y c l e h a v e b e e n p r o b e d i n d e t a i l by G u n s a l u s 3 0 a n d P e t e r s o n . 3 3 The r e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s c o n f i r m e d t h e o r i g i n a l h y p o t h e s i s o f E s t a b r o o k et a 1. 3 4 c o n c e r n i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e o f m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 . T o d a y , t h e p u r i f i e d b a c t e r i a l enzyme i s a c c e p t e d a s a d e f i n i t e p r o t o t y p e o r b i o l o g i c a l m o d e l r e p r e s e n t i n g t h e e n t i r e c l a s s o f P450 c y t o c h r o m e s . F u r t h e r r e f i n e m e n t s o f e a r l i e r p r o c e d u r e s 3 3 ^ / 3 5 / 3 6 f o r l a r g e s c a l e b a c t e r i a l g r o w t h e m p l o y i n g a r e a d i l y a u t o l y t i c m u t a n t , Pseudomonas putida, s t r a i n PpG 7 8 6 , and i m p r o v e d p u r i f i c a t i o n t e c h n i q u e s , h a v e l e d t o t h e i s o l a t i o n o f c r y s t a l l i n e f o r m s o f t h e b a c t e r i a l e n z y m e . 3 7 D e t a i l e d s t u d i e s o f t h e c r y s t a l l i n e c y t o c h r o m e P450cam h a v e p r o d u c e d u n a m b i g u o u s a s s i g n m e n t o f 2 0 much o f t h e s t r u c t u r a l a nd s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f t h e heme a c t i v e s i t e t h r o u g h o u t t h e c a t a l y t i c c y c l e , as w e l l a s p r o v i d e d a homogenous s o u r c e o f t h e p r o t e i n f o r s e q u e n c e and X - r a y d i f f r a c t i o n a n a l y s i s . 3 8 T h e s e r e s u l t s h a v e b e e n p a r t i a l l y c o n f i r m e d w i t h t h e i s o l a t i o n o f h i g h l y p u r i f i e d , c a t a l y t i c a l l y a c t i v e l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 . 3 9 ' 1* 0 R e c e n t l y , w i t h t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a s y n t h e t i c c o m p l e x i n 1981 by G r o v e s et at.1*1 a n a l o g o u s t o t h e i l l u s i v e " a c t i v a t e d o x y g e n c o m p l e x " p r o d u c e d by t h e P4 50 c y t o c h r o m e s , s e v e r a l q u e s t i o n s r e g a r d i n g t h e c a t a l y t i c c y c l e h a v e b e e n a n s w e r e d . T h u s , t h e c o m b i n e d e f f o r t s o f r e s e a r c h f r o m a l l d i s c i p l i n e s h a v e p r o m o t e d a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e c a t a l y t i c a n d b i o l o g i c a l r o l e t o s u c h a n e x t e n t t h a t r e c e n t l y a c o m p e t e n t d e s c r i p t i o n o f t h e e n z y m a t i c m e c h a n i s m h a s b e e n p o s s i b l e . 4 2 T o d a y , 4 3 m a j o r r e s e a r c h e f f o r t s a r e d i r e c t e d t o e x p l a i n i n g t h e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f t h e P450 c y t o c h r o m e s and r e l a t e d r e d o x c o u p l i n g p r o t e i n s , t h e in vivo i n d u c t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e enzyme i n mammalian t i s s u e s , t h e i n v o l v e m e n t o f mammalian P4 50 c y t o c h r o m e s i n c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s , and m o d e l l i n g P450 o x i d a t i o n s 9 w i t h s i m p l e r p r o t e i n - f r e e c a t a l y s t s f o r p r o d u c t i o n o f e f f i c i e n t and s e l e c t i v e s y n t h e t i c c a t a l y s t s . C o m p l e t i o n o f a t h r e e - d i m e n s i o n a l m o d e l o f t h e b a c t e r i a l enzyme w i l l v e r i f y , a s w e l l a s c o m p l e m e n t , much o f t h e p r e s e n t k n o w l e d g e o f t h e e n t i r e c l a s s o f P450 c y t o c h r o m e s , and w i l l d i r e c t r e s e a r c h e f f o r t s i n t h e f u t u r e . 21 II.2 B i o l o g i c a l Importance of the P450 Cytochromes The role of cytochrome P450 in b i o l o g i c a l systems i s the a c t i v a t i o n of molecular dioxygen for the oxidative biotransformation of substrates. Each of these enzymes i s associated with an electron transport system as the terminal electron acceptor which catalyses the reductive cleavage of molecular dioxygen (0 2) with the concomitant transfer of one oxygen atom to the substrate; the other oxygen atom i s reduced to water. This s p e c i f i c r e a c t i v i t y has l a b e l l e d the P450 cytochromes as mixed function oxidase, 1 6 mono-oxygenase, 1 7 or hydroxylase 1 7 enzyme systems. The number of substrates that are modified by the cytochrome P450 monooxygenases include a d i v e r s i f i e d and ever-expanding number of compounds. 4 4> 4 5 These encompass such materials as steroids, 1* 6 b i l e acids, 1* 7 f a t t y acids, 1* 8 approximately 200 d i f f e r e n t drugs, 2 5 c y c l i c and s t r a i g h t -chain hydrocarbons (from saturated to acetylenic species), terpenes, amines, alcohols, phenols, thiophenes, pesticides, food preservatives and additives, and carcinogens. 4 3 - 1* 5/ 1* 9 Although the primary reaction involves incorporation of one oxygen atom into these substrates, the observable consequences of the oxygen atom transfer depends on the precise nature of the substrate. In g e n e r a l , 5 0 / 5 1 the established intermediate outcome of the catalysed oxygen atom transfer i s : (a) form-ation of a hydroxylated derivative by i n s e r t i o n into the bond between a hydrogen and a carbon atom; (b) formation 22 o f an e p o x i d e by a d d i t i o n a c r o s s a c a r b o n - c a r b o n d o u b l e b o n d ; o r (c) f o r m a t i o n o f a d i p o l a r o x i d e by c o m b i n a t i o n w i t h t h e f r e e e l e c t r o n p a i r o f t h e h e t e r o a t o m . T h e s e p r i m a r y r e a c t i o n s o f t e n y i e l d u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e s w h i c h u n d e r g o s e c o n d a r y t r a n s f o r m a t i o n s t o y i e l d t h e f i n a l e x p e r i m e n t a l l y o b s e r v e d p r o d u c t s . Some t y p i c a l e x a m p l e s o f t h e s e r e a c t i o n p a t h w a y s a r e g i v e n i n F i g u r e I I . 4 . O b s e r v a t i o n s h a v e a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e same s u b s t r a t e may f u r t h e r u n d e r g o s e v e r a l o f t h e same t r a n s f o r m a t i o n s , o r be s u b j e c t e d t o a c r o s s s e c t i o n o f t h e p o s s i b l e r e a c t i o n s . 4 7 / 5 2 The p r o p o r t i o n b e t w e e n t h e d i f f e r e n t a l t e r n a t i v e r e a c t i o n s i s a g a i n d e p e n d e n t on t h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e . The i m p o r t a n t r e s u l t o f t h e s e r e a c t i o n s , h o w e v e r , i s t h e p r o d u c t i o n o f a more p o l a r m e t a b o l i t e t h a t c a n be e f f i c i e n t l y u t i l i z e d by t h e c e l l . I n c e l l s o f l o w e r o r g a n i s m s , t h e s e p o l a r i n t e r m e d i a t e s a r e s u s c e p t i b l e t o d e g r a d a t i v e enzymes f o r r a p i d a c c e s s t o c a r b o n and e n e r g y , 3 0 w h i l e i n mammalian c e l l s t h e b y -p r o d u c t s c a n be d i r e c t e d a l o n g t h e p h y s i o l o g i c a l b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o r s o l u b i l i z e d a nd e x c r e t e d . 5 2 The s i g n i f i c a n c e o f t h e s e p a r t i c u l a r b i o c h e m i c a l m o n o o x y g e n a t i o n r e a c t i o n s t o l i v i n g o r g a n i s m s i s e x e m p l i f i e d by t h e e x i s t e n c e o f P4 50 c y t o c h r o m e s i n m o s t l i v i n g o r g a n -i s m s . T h e s e m o n o o x y g e n a s e s h a v e b e e n o b s e r v e d i n s u c h d i v e r s e s o u r c e s a s i n s e c t s , 5 6 b a c t e r i a 5 7 / 5 8 g r e e n p l a n t s , 5 9 f u n g i , 6 0 y e a s t s , 6 1 f i s h , b i r d s , a m p h i b i a n s , and m a m m a l s . 6 2 W i t h i n t h e mammalian s y s t e m s c y t o c h r o m e P450 i s l o c a l i z e d Aliphatic Oxidations8} (hydroxylation reactions) i) n-Hexane — - n-Hexanol + H tO ii) C H K C H ^ C ^ Laurie Acid iii) CH,0 ' OH Codeine C.H, O H C H , J : H , ) - C H - ( C H 1 ) ; C ^ H "hydroxy-Laurie Acid + H , 0 iv) N H T C H , MO ^ O ' OH Morphine C.H, f ^ N - N - C H , + J + NH, CH, H N MiO N- methyl-4-Aminoantipyrine 4-Aminoantipyrine Olefin Oxidations b ) (epoxidation reactions) CMf-CH-COOH CH(-CH-COOH NH, f<f\ " H , — kX "H i) r I - — l ^ ' + H'° [4-'hJ- Phenylalanine [ 3 -*h ]-T y r 0 8 i n e ii) fKCHO, OH OH CH-fCH.1 C H , = C H - C H , - C H - C O N H , C H r C H - C H , - C H - C O N H , 2-isopropyl-4-pentenamide 2-isopropyl-4,5-Dihydropentanamide Heteroatom OxidationsC) (dipolar oxide formation) 8 i) + H,0 CH, 4-methyl-Thioanisole 4-methyl-Thioanisole-S-oxide g u r e I I . 4 Some r e a c t i o n p a t h w a y s c a t a l y s e d b y c y t o c h r o m e P450 i n t h e p r e s e n c e o f NADH, 0 2 a n d H + i o n s . N o t e (a) R e f . 53; ( b ) , i ) R e f . 7 a n d i i ) R e f . 5 4 ; a n d ( c ) , R e f . 5 5 . i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , t h e m i t o c h o n d r i a o f t h e l u n g s , l i v e r , i n t e s t i n a l m u c o s a , k i d n e y , p i t u i t a r y g l a n d s a n d t h e s t e r o i d o g e n i c o r g a n s ; a d r e n a l c o r t e x , t e s t e s , p l a c e n t a , a n d t h e o v a r i e s . 6 2 As w e l l , t h e r e a r e t h r e e g e n e r a l c l a s s e s o f t h e P450 c y t o c h r o m e s r e c o g n i z e d t o c a t a l y s e t h e d i o x y g e n c l e a v a g e r e a c t i o n . 5 3 T h e s e s y s t e m s a r e c h a r a c t e r i z e d a c c o r d i n g t o s o u r c e o f t h e enzyme, t h e n a t u r e o f t h e p r i m a r y e l e c t r o n d o n o r s o f t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n , t h e s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n r e q u i r e d f o r c a t a l y t i c a c t i v i t y ( F i g u r e I I . 5) a n d a c c o r d i n g t o t h e s p e c i f i c n e e d o f t h e c e l l w h e r e i t i s f o u n d . I. Uvst Microsomes 12 membrane-bound FV50 3 membrane - bound bs 1 membrane - bound flavoprotein II. Adrenal Mitochondria 1 membrane-bound Paso 1 soluble iron-sulphur protein ? soluble flavoprotein III. Bacterial System 1 soluble Ptso 1 soluble iron-sulphur protein ? soluble flavoprotein F i g u r e I I . 5 25 The f i r s t c l a s s o f enzyme s y s t e m s ( t h e " l i v e r m i c r o s o m a l t y p e " ) i s c h a r a c t e r i z e d by c y t o c h r o m e P450 a s s o c i a t e d w i t h t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o f t h e l i v e r . The c y t o c h r o m e P450 m o n o o x y g e n a s e s i n t h i s c l a s s e x i s t i n a n o n - e q u i v a l e n t r e l a t i o n s h i p w i t h a s e c o n d h e m o p r o t e i n , c y t o c h r o m e b ^ , and a t l e a s t one f l a v o p r o t e i n d e h y d r o g e n a s e ( e i t h e r NADPH c y t o c h r o m e c r e d u c t a s e o r NADH c y t o c h r o m e bj. r e d u c t a s e ) . 6 3 The r e a c t i v i t y o f t h i s s y s t e m i s i n t r i c a t e l y i n v o l v e d w i t h t h e membrane t o w h i c h i t i s bound b u t t h e f u n c t i o n o f t h e membrane i n d i r e c t i n g t h e s p a t i a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c o m p o n e n t s i s , a s y e t , unknown. A p h o s p h o l i p i d c omponent ( p h o s p h o l i d y l c h o l i n e ) i s a l s o r e q u i r e d f o r e n z y m a t i c a c t i v i t y 6 4 and a p p e a r s t o p l a y some r o l e i n m e d i a t i n g t h e f l o w o f e l e c t r o n s t o c y t o c h r o m e P4 50 f r o m t h e f l a v o p r o t e i n s . The l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P4 50 m o n o o x y g e n a s e s d o m i n a t e t h e h e p a t i c m e t a b o l i s m o f e n d o g e n o u s a n d x e n o b i o t i c l i p o p h i l i c s u b s t a n c e s . 4 3 - 4 5 / 4 9 C h a r a c t e r i s t i c o f t h i s enzyme s y s t e m , a n d d i s t i n g u i s h i n g i t f r o m t h o s e o f t h e s t e r o i d o g e n i c a n i m a l t i s s u e s a n d o f m i c r o o r g a n i s m s t o be d e s c r i b e d b e l o w , i s i t s v i r t u a l l a c k o f s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y ; 2 5 t h e e n t i r e r a n g e o f compounds m e n t i o n e d p r e v i o u s l y c a n s e r v e as s u b s t r a t e s f o r t h e l i v e r m o n o o x y g e n a s e s y s t e m . The a b i l i t y t o u t i l i z e s u c h a w i d e r a n g e o f compounds i s m a n i f e s t e d i n t h e e x i s t e n c e o f s e v e r a l d i f f e r e n t f o r m s o f t h e enzyme i n h e p a t i c t i s s u e s , 2 6 e a c h e x h i b i t i n g s l i g h t l y d i f f e r e n t b u t o v e r l a p p i n g s u b s t r a t e s e l e c t i v i t i e s . T h e s e c y t o c h r o m e P450 i s o e n z y m e s a r e c h a r a c t e r i z e d by s m a l l b u t s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e S o r e t maximum o f t h e r e d u c e d CO c o m p l e x e s , d i s t i n c t m o l e c u l a r w e i g h t s , a n d v a r y i n g c a t a l y t i c a c t i v i t i e s . 2 7 / 6 5 T h u s , t h e h e p a t i c o r g a n s c a n p r o d u c e s e v e r a l t y p e s o f f u n c t i o n a l c y t o c h r o m e P 4 5 0 , w h i c h e x h i b i t somewhat d i f f e r e n t p r o p e r t i e s and w h i c h c o l l e c t i v e l y p r o d u c e a m e t a b o l i c a p p a r a t u s c a p a b l e o f d e a l i n g w i t h t h e g r e a t v a r i e t y o f compounds t o w h i c h t h e s e t i s s u e s a r e e x p o s e d . R a t i o n a l e f o r a m e t a b o l i c s y s t e m c o n t a i n i n g s e v e r a l i s o e n z y m e s w i t h a c e r t a i n d e g r e e o f s p e c i f i c i t y i n s t e a d o f one c o m p l e t e l y u n s p e c i f i c enzyme i s s p e c u l a t i v e ; 6 6 h o w e v e r , w i t h i n c r e a s i n g s p e c i f i c i t y t h e a f f i n i t y o f a n enzyme t o w a r d s i t s s u b s t r a t e a l s o i n c r e a s e s a n d h i g h a f f i n i t y w o u l d be r e q u i r e d t o e f f i c i e n t l y remove l o w l e v e l s o f t o x i c compounds f r o m t h e b o d y . T h e s e p r o p e r t i e s o f l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P450 s e r v e a s a f o c a l p o i n t f o r p r e s e n t d a y i n v e s t i g a t i o n s . 4 3 A n o t h e r i m p o r t a n t c h a r a c t e r i s t i c o f t h e l i v e r m i c r o s o m a l P450 c y t o c h r o m e s c o n c e r n s t h e r e g u l a t i o n o f t h e i s o e n z y m e s i n h e p a t i c t i s s u e s . The e f f e c t i v e n e s s o f t h i s m u l t i e n z y m e s y s t e m i s o p t i m i z e d t h r o u g h d i f f e r e n t i a l i n d u c t i o n o f t h e P450 i s o e n z y m e s by s p e c i f i c s u b s t r a t e s . 2 5 / 6 7 T h a t i s , p a r t i c u l a r s u b s t r a t e s c a n i n d u c e t h e p r o d u c t i o n o f f o r m s o f t h e i s o e n z y m e s s p e c i f i c f o r t h e r e m o v a l o f t h o s e p a r t i c u l a r s u b s t r a t e s . As w e l l , t h e p a r t i c u l a r i s o e n z y m e c a n be i n d u c e d t o r e p r e s e n t a s much a s 15- 2 0 % o f t h e t o t a l membrane-bound 27 p r o t e i n i n t h e s e t i s s u e s . 5 3 T h e r e f o r e , t h i s m e t a b o l i c a p p a r a t u s n o t o n l y u t i l i z e s s e v e r a l d i f f e r e n t P450 cy t o - r c h r o m e s b u t t h e i n d i v i d u a l i s o e n z y m e s a r e s e l e c t i v e l y m o b i l i z e d d e p e n d i n g on t h e s u b s t r a t e . I n t h i s way, i t i s more e c o n o m i c a l f o r t h e c e l l t o r a p i d l y b u i l d up l a r g e c o n c e n t r a t i o n s o f s e l e c t e d i s o e n z y m e s w h i c h c a n e f f e c t i v e l y m e t a b o l i z e a p a r t i c u l a r s u b s t r a t e t h a n c o n t i n u o u s l y s y n t h e s i z e l a r g e amounts o f a l e s s e f f i c i e n t enzyme. The v e r s a t i l i t y o f t h i s enzyme s y s t e m i n d i c a t e s t h a t i t s p r i m a r y f u n c t i o n i s t h e p r o t e c t i o n o f t h e h o s t . R e c e n t l y , N u b e r t 6 8 h a s s u g g e s t e d t h a t t h i s m e t a b o l i c a p p a r a t u s may i n f a c t be a n a l o g o u s t o a mammalian immune s y s t e m i n p r o d u c i n g a d i f f e r e n t i s o e n z y m e t o d e a l w i t h e a c h s u b s t r a t e . T h e s e p r o p e r t i e s o f t h e l i v e r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P4 50 s e r v e a g a i n a s a f o c a l p o i n t o f r e s e a r c h t o d a y . 4 3 The s e c o n d c l a s s o f t h e P450 c y t o c h r o m e s i s c h a r a c t e r -i z e d by a membrane-bound a s s o c i a t i o n w i t h t h e m i t o c h o n d r i a l f r a c t i o n s o f t h e s t e r o i d o g e n i c t i s s u e s 8 2 ( s e e F i g u r e I I . 5 ) . I t i s d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h e f i r s t c l a s s , by t h e p r e s e n c e o f a n F e 2 S 2 C y S 4 i r o n - s u l p h u r p r o t e i n ( a d r e n o d o x i n ) i n s t e a d o f c y t o c h r o m e b,. o r t h e p h o s p h o l i p i d , a s t h e m e d i a t o r o f e l e c t r o n t r a n s p o r t b e t w e e n t h e f l a v o p r o t e i n d e h y d r o g e n a s e ( N A D P H - a d r e n o d o x i n r e d u c t a s e ) , and c y t o c h r o m e P 4 5 0 . 6 9 G e n e r a l l y , t h e c y t o c h r o m e e x i s t s i n a 1:1 s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p w i t h t h e i r o n - s u l p h u r p r o t e i n . 7 0 I n t h e 28 s t e r o i d o g e n i c o r g a n s , c y t o c h r o m e P450 i s s p e c i f i c a l l y i n v o l v e d i n t h e b i o s y n t h e s i s o f m e s s e n g e r a n d r e g u l a t o r y h o r m o n e s , 4 6 t h e d e g r a d a t i o n o f f a t t y a c i d s , 4 ' 7 a n d t h e b i o s y n t h e s i s a n d m e t a b o l i s m o f b i l e a c i d s . 4 8 A l t h o u g h t h i s enzyme s y s t e m h a s n o t b e e n s t u d i e d a s e x t e n s i v e l y a s t h e l i v e r m i c r o s o m a l t y p e , i t i s known t o e x i s t i n s m a l l e r c o n c e n t r a t i o n s w i t h i n t h e s t e r o i d o g e n i c o r g a n s ( c o m p a r e d w i t h h e p a t i c s y s t e m s ) and e x h i b i t v e r y h i g h s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y . 4 9 R e c e n t l y , m u l t i p l e f o r m s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 - d e p e n d e n t m i x e d f u n c t i o n o x i d a s e s y s t e m s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m b o v i n e a d r e n o c o r t i c a l m i c r o s o m e s , 7 1 w h i c h s u g g e s t s t h e same k i n d o f enzyme r e g u l a t i o n may be p r e s e n t i n t h e s t e r o i d o g e n i c o r g a n s a s f o u n d i n l i v e r m i c r o s o m e s . I n t h e s t e r o i d o g e n i c o r g a n s , h i g h s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y i s r e q u i r e d f o r s t r i c t c o n t r o l o f t h e p h y s i o l o g i c a l p a t h w a y s f o u n d i n t h e s e t i s s u e s . The f i n a l c l a s s o f c y t o c h r o m e P4 50 m o n o o x y g e n a s e s o r i g i n a t e s a s a b a c t e r i a l s o u r c e f r o m Pseudomonas putida , 2 9 a l t h o u g h t h e enzyme s y s t e m h a s b e e n i s o l a t e d f r o m o t h e r s p e c i e s o f b a c t e r i a 3 0 ' 5 7 ' 5 8 ( s e e F i g u r e I I . 5 ) . L i k e t h e c y t o c h r o m e s y s t e m s i n t h e m i t o c h o n d r i a , t h e b a c t e r i a l c y t o c h r o m e P450 e x i s t s i n a 1:1 s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p w i t h a n F e 2 S 2 C y s ^ i r o n - s u l p h u r p r o t e i n ( p u t i d a r e d o x i n ) . T h i s s y s t e m a l s o u t i l i z e s a f l a v o p r o t e i n w h i c h c a n e i t h e r be o f t h e NADH o r NADPH m e d i a t e d t y p e ( p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e ) . 2 1 -The g r e a t a d v a n t a g e o f t h i s s y s t e m i s t h a t a l l c o m p o n e n t s a r e r e a d i l y s o l u b l e a n d e a s i l y p u r i f i e d p r o t e i n s w h i c h do 29 n o t r e q u i r e membrane a s s o c i a t i o n f o r c a t a l y t i c a c t i v i t y . I n t h e m i c r o b e , h i g h t u r n o v e r r a t e s w i t h r a p i d a c c e s s t o c a r b o n a n d e n e r g y r e q u i r e h i g h s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y f o r c o m p e t i t i v e a d v a n t a g e s . 3 0 C o m p a r i s o n o f t h e b r o a d p h y l o g e n e t i c s e p a r a t i o n o f t h e s e t h r e e c l a s s e s o f P450 c y t o c h r o m e s i n d i c a t e s t h a t t h e s e enzymes a r e a b a s i c m e t a b o l i c t o o l r e q u i r e d by m o s t o r g a n i s m s f o r s u r v i v a l . R e c e n t l y , h o w e v e r , i t h a s become e v i d e n t t h a t t h e a c t i o n o f t h e P450 c y t o c h r o m e s on a number o f d i f f e r e n t c l a s s e s o f s u b s t r a t e s c r e a t e s r e a c t i v e m e t a b o l i t e s t h a t e x h i b i t f a t a l e f f e c t s on t h e c e l l . 4 3 Two s p e c i f i c g r o u p s o f s u b s t r a t e s t h a t h a v e u n d e r g o n e e x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n l a t e l y a r e t h e p o l y c y c l i c a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s 7 2 a n d t h e i n s e c t i c i d e s . 7 3 E a c h o f t h e s e g r o u p s o f s u b s t r a t e s m a n i f e s t t h e i r m e t a b o l i c t o x i c i t y via d i f f e r e n t m e c h a n i s m s b u t w i l l s e r v e a s e x a m p l e s o f how t h e a c t i o n o f t h e P450 c y t o c h r o m e s c a n e x h i b i t h a r m f u l e f f e c t s t o t h e c e l l . F i g u r e I I . 6 shows t h e c y t o c h r o m e P 4 5 0 - m e d i a t e d m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f p h e n a n t h r e n e . 7 2 I n i t i a l a c t i o n o f t h e c y t o c h r o m e on t h e s u b s t r a t e p r o d u c e s an a r e n e o x i d e by a d d i t i o n o f an o x y g e n atom t o a c a r b o n - c a r b o n d o u b l e b a n d . O p e n i n g o f t h e e p o x i d e f u n c t i o n a l i t y i s c a t a l y s e d by a s p e c i f i c e p o x i d e h y d r a s e enzyme g i v i n g t h e c o r r e s p o n d i n g d i h y d r o d i o l . A t t h i s p o i n t t h e m e t a b o l i t e , w h i c h may n o t be p o l a r e n o u g h t o be e f f i c i e n t l y r e m o v e d f r o m t h e c e l l , i s f u r t h e r e p o x i d a t e d by c y t o c h r o m e P4 50 a t t h e n o n - a r o m a t i c d o u b l e b o n d f o r m i n g t h e d i o l e p o x i d e . S u b s e q u e n t c o v a l e n t i n t e r a c t i o n o f t h e 30 Phenanthrene O Phenanthrene Oxide Epoxide Hydrase Phenanthrene Phenanthrene Diolepoxide Dihydrodiol , Figure I I . 6 The cytochrome P450 - mediated.activation of phenanthrene ; Ref.72. highly reactive e l e c t r o p h i l i c d i o l epoxide with c r i t i c a l targets i n DNA i s assumed to be an esse n t i a l event i n the i n i t i a t i o n of carcinogenesis. 7 4 Therefore, the inte r a c t i o n of the P450 cytochromes with i n i t i a l l y unactivated molecules (phenanthrene) can produce highly reactive metabolites (diol epoxides) which can be detrimental to c e l l s u r v i v a l . The i n s e c t i c i d e s on the other hand, exhibit t h e i r toxic effects by d i r e c t i n t e r a c t i o n of the cytochrome P450-activated substrate with the prosthetic heme moiety of the enzyme. 7 3 During the c a t a l y t i c transfer of activated oxygen to the monosubstituted acetylene f u n c t i o n a l i t y , which characterize some classes of i n s e c t i c i d e substrates, cytochrome P4 50 i s destroyed by a l k y l a t i o n of the heme 31 g r o u p . In vivo i n a c t i v a t i o n o f t h e enzyme i n h e p a t i c t i s s u e s i s a c c o m p a n i e d by t h e a c c u m u l a t i o n o f an a b n o r m a l " g r e e n p i g m e n t " . 7 5 I s o l a t i o n and p u r i f i c a t i o n o f t h i s g r e e n p i g m e n t f r o m a n i m a l s t r e a t e d w i t h t h i r t e e n d i f f e r e n t a c e t y l e n i c i n s e c t i c i d e s h a s u n e q u i v o c a l l y c o n f i r m e d t h a t i n e a c h c a s e a 1:1 c o v a l e n t N - a l k y l a t i o n o f t h e p r o t o -p o r p h y r i n I X s k e l e t o n o f p r o s t h e t i c heme l e a d s t o i n a c t i -v a t i o n o f t h e enzyme and f o r m a t i o n o f t h e a b n o r m a l h e p a t i c p i g m e n t . 7 3 W i t h t h e r e c e n t i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f f o u r i s o m e r i c N - ( 2 - o x o e t h y l ) p r o t o p o r p h y r i n I X N - d e r i v a t i v e s ( F i g u r e I I . 7 ) f r o m r a t s t r e a t e d w i t h a c e t y l e n e g a s , t h e F i g u r e I I . 7 S t r u c t u r e o f one o f t h e f o u r p o s s i b l e i s o m e r s o f N - ( 2 - o x o e t h y l ) p r o t o p o r p h y r i n I X i s o l a t e d f r o m a c e t y l e n e - t r e a t e d l i v e r m i c r o s o m e s ; R e f . 7 6 . 32 m e c h a n i s m o f t h e c y t o c h r o m e P4 50 s e l f - d e a c t i v a t i o n h a s b e e n s p e c u l a t e d u p o n 7 6 ( F i g u r e I I . 8 ) . C a t a l y t i c o x y g e n t r a n s f e r t o t h e a c e t y l e n e ir-bond p r o d u c e s a t r a n s i e n t s p e c i e s w h i c h c a n p a r t i t i o n i n t o two p a t h w a y s , one l e a d i n g t o N - a l k y l a t i o n o f t h e p r o s t h e t i c heme m o i e t y a n d t h e o t h e r t o f o r m a t i o n o f a c e t y l e n i c g r o u p m e t a b o l i t e s . 7 7 C o m p a r i s o n o f t h e in vivo a b n o r m a l h e p a t i c p o r p h y r i n s w i t h t h o s e p r e p a r e d s y n t h e t i c a l l y 7 8 ' 7 9 n o t o n l y v e r i f i e d t h a t t h e p r o s t h e t i c heme o f t h e c y t o c h r o m e P4 50 was e x c l u s i v e l y N - a l k y l a t e d b u t h a s p e r m i t t e d t h e a s s i g n m e n t o f t h e p r e f e r r e d N - a l k y l a t e d i s o m e r f o r m e d i n t h e h e p a t i c t i s s u e s . The i m p o r t a n t p o i n t , h o w e v e r , i s t h a t N - a l k y l a t i o n o f t h e p r o s t h e t i c heme r e n d e r s t h e enzyme i n a c t i v e t o f u r t h e r e n z y m a t i c c y c l e s . T h i s , i n t u r n , c a u s e s t h e a c c u m u l a t i o n o f t o x i c c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p a r e n t m o l e c u l e a n d i t s m e t a b o l i t e s a n d e v e n t u a l n e c r o s i s o f t h e c e l l . T h u s , t h e P450 c y t o c h r o m e s c a n p a r t i c i p a t e i n t h e i r own s e l f -i n a c t i v a t i o n and a g a i n c r e a t e c o n d i t i o n s w h i c h a r e h a z a r d o u s t o c e l l s u r v i v a l . The s e l f i n a c t i v a t i o n o f c y t o c h r o m e P450 i s a l s o known t o be m e d i a t e d by s e v e r a l o t h e r g r o u p s o f s u b s t r a t e s w h i c h a r e a l l c h a r a c t e r i z e d by u n s a t u r a t e d c a r b o n -c a r b o n b o n d s . 8 0 I n summary, f o l l o w i n g t h i s e x a m i n a t i o n o f t h e c o m p l e x b i o l o g i c a l f e a t u r e s e x h i b i t e d by t h e P450 c y t o c h r o m e s , t h e r o l e t h e y p l a y seems t o be t w o - f o l d . F i r s t l y , t h e s e enzymes a r e e x t r e m e l y i m p o r t a n t i n t h e o x i d a t i v e b i o s y n t h e s i s a n d 33 N-Alkylated Heme F i g u r e I I . 8 34 m e t a b o l i s m o f a l a r g e number o f e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s s u b s t r a t e s . T h e r e f o r e , t h e y a r e c o n c e r n e d , n o t o n l y w i t h r e g u l a t i o n and c o n t r o l o f t h e c e l l b u t a l s o p r o t e c t i n g t h e h o s t f r o m t h e d e s t r u c t i v e e f f e c t s o f x e n o b i o t i c s t h r o u g h v a r i o u s d e t o x i f i c a t i o n r e a c t i o n s . I n t h i s s e n s e , c y t o c h r o m e P450 i s an e s s e n t i a l c e l l u l a r c omponent. I n c o n t r a s t , h o w e v e r , c y t o c h r o m e P4 50 c a n be t h e c a u s i t i v e a g e n t i n c e l l u l a r t r a n s f o r m a t i o n s , c a u s i n g m a l i g n a n c i e s and e v e n t u a l d e a t h t o t h e h o s t . I n t h i s s e n s e , c y t o c h r o m e P450 e x i s t s a s a d e s t r u c t i v e f o r c e w i t h i n t h e c e l l . 35 I I . 3 S t r u c t u r e The m a j o r i t y o f k n o w l e d g e c o n c e r n i n g t h e s t r u c t u r e o f t h e P4 50 c y t o c h r o m e s has b e e n d e t e r m i n e d f r o m t h e s o l u t i o n and c r y s t a l l i n e s t a t e s o f b a c t e r i a l c y t o c h r o m e P450cam. The w a t e r - s o l u b l e and m e m b r a n e - f r e e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s enzyme s y s t e m a l l o w f o r c h e m i c a l and p h y s i c a l c h a r -a c t e r i z a t i o n much more r e a d i l y t h a n w i t h t h e membrane bound s p e c i e s . The f e a t u r e s o f c y t o c h r o m e P4 50cam h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d a n d r e v i e w e d e x t e n s i v e l y 3 3 # / 3 8 / 8 1 / 8 2 and a r e u s e d i n t h i s s t r u c t u r a l o v e r v i e w a s a p o i n t o f r e f e r e n c e . The s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s t o be d e s c r i b e d a r e a p p l i c a b l e t o a l l c l a s s e s o f P450 c y t o c h r o m e s . The P4 50 c y t o c h r o m e s a r e h e m o p r o t e i n s composed o f a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n and a s i n g l e m o l e c u l e o f i r o n p r o t o p o r p h y r i n I X a s t h e p r o s t h e t i c g r o u p 1 3 ' 1 4 ( F i g u r e 1 . 1 ) . B e c a u s e o f t h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n and t h e i r f u n c t i o n i n o x i d a t i o n - r e d u c t i o n r e a c t i o n s , t h e g e n e r a l name " c y t o c h r o m e " h a s b e e n g i v e n t o t h e s e e n z y m e s . 8 3 The s u f f i x P 4 5 0 , a s m e n t i o n e d e a r l i e r , was d e r i v e d f r o m t h e u n u s u a l S o r e t a b s o r p t i o n p e a k a t 450nm o f t h e c a r b o n m o n o x i d e d e r i v a t i v e o f t h e r e d u c e d ( i . e . F e ( T I ) ) h e m o p r o t e i n . 1 3 ' 1 4 S i n c e t h e p o r p h y r i n s k e l e t o n o f t h e heme p r o s t h e t i c g r o u p i s a t t a c h e d t o t h e p r o t e i n v i a a c i d l a b i l e n o n - c o v a l e n t l i n k a g e s , t h e s e enzymes a r e c o n s i d e r e d a member o f t h e c y t o c h r o m e b g r o u p . R e c e n t l y t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e P4 50cam h a s b e e n d e d u c e d f r o m t h e s e q u e n c e o f p r o t e o l y t i c 8 4 a n d C N B r 8 5 p e p t i d e f r a g m e n t s . The p e p t i d e c h a i n c o n t a i n s 412 a m ino a c i d r e s i d u e s o f w h i c h a p p r o x i m a t e l y h a l f a r e n o n - p o l a r . The r e m a i n i n g p o l a r g r o u p s a r e d i v i d e d e q u a l l y b e t w e e n i o n i z e d and n e u t r a l f u n c t i o n s ; e i g h t c y s t e i n e r e s i d u e s 8 5 and r e l a t i v e l y few a r o m a t i c a m i n o a c i d s w e r e o b s e r v e d (i.i.-e =10 t y r o s i n e ; =4 t r y p t o p h a n ) . 8 6 T h i s i s n o t s u r p r i s i n g s i n c e a r o m a t i c m o l e c u l e s a r e r e a d i l y o x i d i z e d by t h e P450 c y t o c h r o m e s . T h e s e f i n d i n g s a r e g e n e r a l l y c o n s i s t e n t w i t h t h e o r i g i n a l a m i n o a c i d a n a l y s i s r e p o r t e d by Dus et at.87 S e q u e n c i n g o f t h e a m ino and c a r b o x y t e r m i n a l p e p t i d e s 8 8 s u g g e s t s t h a t a l l o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s a r e l o c a t e d i n t h e i n t e r i o r o f t h e p o l y p e p t i d e c h a i n . S p e c i f i c a l l y i n t h e c y t o c h r o m e P4 50cam p o l y p e p t i d e , t h e r e a r e no c y s t e i n e r e s i d u e s a t l e a s t 40 r e s i d u e s i n f r o m t h e N R ^ - t e r m i n a l e n d , a n d no c y s t e i n e r e s i d u e s a t l e a s t 38 r e s i d u e s i n f r o m t h e C O O H - t e r m i n a l p o r t i o n . T h i s h a s s i n c e b e e n c o n f i r m e d by t h e r e c e n t c o m p l e t i o n o f t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e P450cam' v. 8 5 The N E ^ - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e o f r a b b i t l i v e r c y t o c h r o m e P450 a l s o i n d i c a t e s t h a t t h e c y s t e i n e r e s i d u e s a r e l o c a t e d t o w a r d t h e c e n t r a l p o r t i o n o f t h e p e p t i d e . 8 9 The p o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e a p p a r e n t l o c a l i z a t i o n o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s a r e u n d e r i n v e s t i g a t i o n . M o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e enzymes r a n g e f r o m 47,000 D a l t o n s i n t h e b a c t e r i a l s t r a i n 8 8 t o 55,000 D a l t o n s i n membrane bound i s o l a t i o n s . 2 6 P r e d i c t i o n s o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e f o r t h e c y t o c h r o m e P450cam s y s t e m 3 8 ' 8 5 i n d i c a t e s l i g h t l y l e s s t h a n h a l f o f t h e p r o t e i n f o r m o c - h e l i c a l d o m a i n s i n c l u d i n g h a l f o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s . The r e m a i n d e r o f t h e r e s i d u e s a r e d i v i d e d b e t w e e n 3 - p l e a t e d , 3 - t u r n , a n d r a n d o m c o i l p r o t e i n s t r u c t u r e s . The t h r e e - d i m e n s i o n a l s h a p e o f t h e b a c t e r i a l enzyme h a s b e e n d e s c r i b e d a s a " d o n u t w i t h a t a i l " . 9 0 I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e u n i q u e c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f t h e P450 c y t o c h r o m e s , t h e i m m e d i a t e e n v i r o n m e n t o f t h e heme p r o s t h e t i c g r o u p m u s t be e s t a b l i s h e d t h r o u g h o u t t h e r e a c t i o n c y c l e . M ore s p e c i f i c a l l y , t h e a x i a l l i g a n d s p r o v i d e d by t h e p o l y p e p t i d e w h i c h a l l o w f o r t h e p a r t i c u l a r r e a c t i v i t y o f t h e enzyme m u s t be d e t e r m i n e d . The q u e s t i o n o f a x i a l l i g a n d s o f c y t o c h r o m e P450 h a s r e c e i v e d c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n b e c a u s e o f t h e u n u s u a l s p e c t r a l c h a n g e s t h a t o c c u r o n s u b s t r a t e b i n d i n g and o n c o m p l e x a t i o n o f t h e f e r r o u s enzyme w i t h c a r b o n m o n o x i d e . I n f o r m a t i o n g a t h e r e d t o d a t e s t r o n g l y i n d i c a t e s a c o v a l e n t l y b ound t h i o l a t e o r s u l p h y d r y l a n i o n (RS7) a s t h e a x i a l l i g a n d ( o f t h e h e m e - i r o n ) i n t h e P450 c y t o c h r o m e s t h a t i s c o n t r i b u t e d v i a one o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s o f t h e p o l y p e p t i d e . The f i r s t c l u e t o t h e n a t u r e o f t h i s a x i a l l i g a n d was d e r i v e d f r o m e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e (EPR) e x p e r i m e n t s . I n 1968 M i y a k e et aV.91 demon-s t r a t e d t h a t t h e n a t i v e " f e r r i c r e s t i n g enzyme" was predom-i n a n t l y a l o w - s p i n (S=%) h e m o p r o t e i n , w h i l e J e f c o a t e and G a y l o r / 9 2 a n d B l u m b e r g and P e i s c h 9 3 s u b s e q u e n t l y showed t h a t t h e EPR s p e c t r a o f l o w - s p i n c y t o c h r o m e P 4 5 0 w e r e s i m i l a r t o 38 t h o s e o b t a i n e d f r o m t h e a d d i t i o n o f m e r c a p t o e t h a n o l o r o t h e r a l k y l m e r c a p t i d e s t o f e r r i c h e m o g l o b i n o r f e r r i c m y o g l o b i n . F o l l o w i n g t h e s e i n i t i a l e x p e r i m e n t s , t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e u n u s u a l r e d - s h i f t e d S o r e t b a n d o f t h e c a r b o n y l a t e d c y t o c h r o m e P450 s p e c i e s was d u p l i c a t e d w i t h s i m p l e i r o n ( I I ) p o r p h y r i n s h a v i n g a m e r c a p t i d e i o n l i g a t e d trans t o t h e C O . 9 4 - 9 6 The m o d e l s t u d i e s o f Chang a n d D o l p h i n 9 4 w e r e n o t o n l y a b l e t o m i m i c t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e f e r r i c a n d f e r r o u s s t a t e s o f t h e enzyme b u t w e r e a l s o a b l e t o r e p r o d u c e t h e l o w e n e r g y S o r e t b a n d a t -4 5 0nm o f t h e r e d u c e d -CO c o m p l e x . I n a d d i t i o n , t h e s e m o d e l c o m p l e x e s showed a s e c o n d h i g h e n e r g y b a n d a t ^360nm, t h o u g h t o r i g i n a l l y t o be i n d i c a t i v e o f t h e d i t h i o n i t e r e d u c i n g a g e n t . T h i s h i g h e n e r g y band was s u b s e q u e n t l y o b s e r v e d i n t h e enzyme i t s e l f . 9 7 As w e l l , t h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f t h e f e r r i c , f e r r o u s , and f e r r o u s -O^ P450 c o m p l e x e s w e r e m o d e l l e d b u t w e r e s u b s e q u e n t l y shown t o be d e r i v e d f r o m a b i s t h i o l a t e i r o n ( I I I ) s p e c i e s w h i c h had n o t b e e n d e t e c t e d i n t h e p r e v i o u s P4 50 m o d e l s t u d i e s . 9 8 S p e c t r a w h i c h e x h i b i t s u c h s p l i t - S o r e t b a n d s a r e now known a s " h y p e r - s p e c t r a " and a r e c h a r a c t e r i s t i c o f i r o n p o r p h y r i n s c o o r d i n a t e d by l i g a n d s o f h i g h e l e c t r o n d e n s i t y . 9 7 D i r e c t e v i d e n c e f o r t h e c o o r d i n a t i o n o f t h e m e r c a p t i d e i o n h a s r e c e n t l y b e e n e l u c i d a t e d f r o m r e s o n a n c e Raman (RR) s p e c t r o s c o p y o f t h e f e r r i c enzyme s u b s t r a t e c o m p l e x l a b e l l e d w i t h h e a v y and l i g h t i s o t o p e s o f i r o n and s u l p h u r . 3 8 F u r t h e r m o r e , m e a s u r e m e n t o f t h e c h a n g e s i n p r o t o n c o n c e n t r a t i o n d u r i n g t h e b i n d i n g o f d i o x y g e n , c a r b o n m o n o x i d e , a nd f o r t h e e x c h a n g e o f d i o x y g e n by c a r b o n m o n o x i d e a t f e r r o u s c y t o c h r o m e P 4 5 0 c a m , " h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e h e m e - i r o n m e r c a p t i d e l i n k a g e i s r e t a i n e d t h r o u g h o u t t h e e n t i r e r e a c t i o n c y c l e . The e x i s t e n c e o f t h e a x i a l m e r c a p t i d e l i g a n d i s m a n i f e s t e d i n e x t r e m e l y l o w r e d u c t i o n p o t e n t i a l s e x h i b i t e d i n b o t h s u b s t r a t e - f r e e (-270mV) a n d s u b s t r a t e - b o u n d (-170mV) c y t o c h r o m e P450cam. 3° A l a r g e e l e c t r o n r i c h s u l p h u r a n i o n i s a b l e t o r e a d i l y d o n a t e d e n s i t y o n t o t h e . i r o n a t om t o p r o d u c e a n e a s i l y o x i d i z a b l e m e t a l c e n t e r . C o m p a r i s o n w i t h o t h e r h e m e - p r o t e i n s y s t e m s e x e m p l i f i e s t h i s p o i n t . Some f e r r i d o x i n s , w h i c h c o n t a i n d i r e c t i r o n - s u l p h u r l i n k a g e s , a r e c h a r a c t e r i z e d b y e x t r e m e l y l o w r e d u c t i o n p o t e n t i a l s (-400mV), w h i l e h i g h e r p o t e n t i a l s a r e f o u n d f o r t h e p e r o x i d a s e s (-.13 OmV). a n d more c o n v i n c i n g l y f o r t h e m y o g l o b i n s y s t e m (+46mV). . 1 0 - B o t h o f t h e s e s p e c i e s a r e known t o c o n t a i n a n i t r o g e n b o u n d h i s t i d i n e r e s i d u e a s an a x i a l l i g a n d . E v e n t h o u g h t h e a b o v e e v i d e n c e h a s s e e m i n g l y a s s i g n e d a m e r c a p t i d e i o n a s t h e a x i a l l i g a n d i n t h e P4 50 c y t o c h r o m e s t h i s s u g g e s t i o n h a s b e e n c h a l l e n g e d by i n f o r m a t i o n o b t a i n e d f r o m a n o t h e r h e m e - p r o t e i n s y s t e m , C h l o r o p e r o x i d a s e , w h i c h e x h i b i t s many o f t h e u n i q u e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f b a c t e r i a l a n d m i c r o s o m a l P450 c y t o c h r o m e s . 1 0 1 C h l o r o p e r o x i d a s e i s a g l y c d h e m o p r o t e i n o f M.W. 42,000 w h i c h i s f o u n d i n t h e e x t r a c e l l u l a r f l u i d o f t h e g r o w t h medium o f t h e m o u l d CaIderiomyces fumago.102 The r e a c t i o n 40 c a t a l y s e d by t h i s p r o t e i n i s t h e a c t i v a t i o n o f h a l o g e n i o n s f o r i n s e r t i o n i n t o a l k y l r e s i d u e s ( R e a c t i o n I I . 4 ) . RH + C l " + H 2 0 2 »• RC1 + H 2 0 + OH~ ( I I . 4) E x t e n s i v e p r o b i n g o f t h e a c t i v e s i t e o f c h l o r o p e r o x i d a s e h a s shown t h a t t h i s enzyme e x h i b i t s many s i m i l a r p h y s i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e P450 c y t o c h r o m e s . 3 3 The i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f t h i s s y s t e m i s , h o w e v e r , t h a t i n a l l o x i d a t i o n s t a t e s t h e p o l y p e p t i d e c o n t a i n s no f r e e s u l p h y d r y l g r o u p s ; y e t t h e r e d u c e d c a r b o n m o n o x i d e d e r i v a t i v e e x h i b i t s t h e same h y p e r s p e c t r a w i t h a l o w e n e r g y S o r e t a b s o r p t i o n a t 4 4 3 n m . 1 0 3 T h e s e f a c t s h a v e p r o d u c e d s k e p t i c i s m a b o u t t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t h i o l a t e a n i o n a s a n a x i a l l i g a n d o f t h e h e m e - i r o n i n t h e P450 c y t o c h r o m e s . The n a t u r e o f t h e s i x t h l i g a n d o f t h e h e m e - i r o n i n t h e f e r r i c s t a t e o f t h e enzyme h a s a l s o b e e n e x t e n s i v e l y i n v e s -t i g a t e d a n d , a s y e t , r e m a i n s a m b i g u o u s . 8 2 S i n c e t h e s u b s t r a t e -f r e e r e s t i n g enzyme h a s a l o w - s p i n c o n f i g u r a t i o n , c o m p a r i s o n w i t h o t h e r l o w - s p i n h e m o p r o t e i n s s u p p o r t s t h e a s s i g n m e n t o f a s e c o n d a x i a l l i g a n d . Though t h e n a t u r e o f t h i s l i g a n d r e m a i n s o b s c u r e , n i t r o g e n , s u l p h u r , and o x y g e n b a s e d l i g a n d s , i n c l u d i n g w a t e r a n d h y d r o x i d e h a v e e a c h b e e n c o n s i d e r e d ; 8 2 a w a t e r l i g a n d h a s b e e n i m p l i c a t e d i n o r d e r t o e x p l a i n t h e e f f e c t o f f e r r i c heme on t h e n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e (NMR) r e l a x a t i o n r a t e o f H 20 p r o t o n s , and t h e o b s e r v e d e x c h a n g e o f t h e l i g a n d p r o t o n s b e t w e e n t h e c o o r d i n a t i o n s p h e r e o f t h e c a t i o n and t h e b u l k s o l u t i o n . A p r o t o n e x c h a n g e m e c h a n i s m m e d i a t e d t h r o u g h a h e m e - i r o n l i g a n d h a s s i n c e b e e n p r o p o s e d and s u b s e q u e n t l y c o n f i r m e d by a n e l e c t r o n n u c l e a r d o u b l e r e s o n a n c e (ENDOR) i n v e s t i g a t i o n . 8 2 The l o s s o f t h e o b s e r v e d s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s i n t h e p r e s e n c e o f s u b s t r a t e s u g g e s t s t h a t t h e n a t i v e s u b s t r a t e - f r e e , l o w - s p i n f e r r i c enzyme h a s a r a p i d l y e x c h a n g i n g w a t e r m o l e c u l e a s t h e s i x t h a x i a l l i g a n d . A s i d e f r o m I^O, t h e a l c o h o l s o f t y r o s i n e ( T y r ) , s e r i n e ( S e r ) , o r t h r e o n i n e ( T h r ) , t h e d i s t a l a m i no o f l y s i n e ( L y s ) , t h e t h i o l o f c y s t e i n (Cys) and t h e t e r m i n a l a m i d e s o f g l u t a m i n e ( G i n ) a n d a s p a r a g i n e (Asn) h a v e b e e n c o n s i d e r e d a s p o t e n t i a l c a n d i d a t e s . 8 2 M e a s u r e m e n t s a r e n o t c o n s i s t e n t w i t h t h e N - l p r o t o n o f h i s t i d i n e ( H i s ) . The d e o x y - f e r r o u s s u b s t r a t e - f r e e a n d s u b s t r a t e - b o u n d enzyme s t a t e s c o n t a i n no s i x t h a x i a l l i g a n d . 3 8 The s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s o f t h e heme p o c k e t a r e a l s o o f i n t e r e s t s i n c e t h e a c t i v a t e d o x y g e n s p e c i e s p r o d u c e d b y c y t o c h r o m e P4 50 i s c a p a b l e o f o x i d i z i n g a n y o f t h e known amino a c i d s . A n a l y s i s o f t h e amino a c i d c o m p o s i t i o n o r i g i n a l l y p u b l i s h e d by Dus et at.87 shows t h a t 37% o f t h e p o l y p e p t i d e i s made up o f r e s i d u e s c o n t a i n i n g c o m p l e t e l y u n a c t i v a t e d a l k y l s i d e c h a i n s ( i . e . a l a n i n e , v a l i n e , l e u c i n e , i s o l e u c i n e , p r o l i n e and g l y c i n e ) , w h i l e 19% o f t h e p o l y p e p t i d e c o n t a i n s r e s i d u e s t h a t a r e more s u s c e p t i b l e t o o x i d a t i o n ( i . e . T y r , p h e n y l a l a n i n e H i s , t r y p t o p h a n e ) . S i n c e t h e enzyme p r o d u c e s an e x t r e m e l y p o w e r f u l o x i d i z i n g a g e n t i t w o u l d be l o g i c a l t o assume t h e n , t h a t t h e heme p o c k e t must be composed o f l a r g e l y t h o s e a m ino a c i d s m o s t r e s i s t a n t t o o x i d a t i o n , s u c h as t h e a l i p h a t i c s p e c i e s m e n t i o n e d a b o v e . A l s o , i t w o u l d be p l a u s i b l e t o s u g g e s t t h a t o f t h e s e r e s i s t a n t a m ino a c i d s , t h o s e w i t h t h e l e a s t b u l k y s i d e c h a i n s s h o u l d be u t i l i z e d i n t h e heme p o c k e t . I n t h i s way, any p o t e n t i a l l y h a r m f u l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e amino a c i d s and t h e a c t i v e o x i d i z i n g s p e c i e s w o u l d be m i n i m i z e d . A heme p o c k e t c o n s t r u c t e d , e s s e n t i a l l y , o f t h e a l i p h a t i c amino a c i d s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e k i n e t i c d a t a f o r s u b s t r a t e b i n d i n g i n c y t o c h r o m e P 4 5 0 . 1 0 0 T h i s i n f o r m a t i o n i n d i c a t e s a s t r o n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e enzyme and t h e s u b s t r a t e . A t 4°C, t h e f o r w a r d r a t e c o n s t a n t f o r camphor b i n d i n g i n c y t o c h r o m e P450cam i s 4.1 x 1 0 ^ M ^ S w h i l e t h e r e v e r s e r a t e c o n s t a n t i s 6.0 S . The heme p o c k e t d e s c r i b e d a b o v e i s i n g e n e r a l a g r e e m e n t w i t h t h e r a t h e r h y d r o p h o b i c heme e n v i r o n m e n t s o f t h e p e r o x i d a s e , m y o g l o b i n , and h e m o g l o b i n s y s t e m s ;('Figure I I . 9 ) . I t i s o f i n t e r e s t t o n o t e t h a t t h e g - c h a i n o f t h e h e m o g l o b i n m o l e c u l e c o n t a i n s a c y s t e i n e r e s i d u e a d j a c e n t t o t h e a x i a l l y c o - o r d i n a t e d h i s t i d i n e m o i e t y w h i c h r e a d i l y b i n d s t o t h e i r o n atom on m i l d d e n a t u r i n g o f t h e p r o t e i n . 1 0 4 T h i s t h e n , may p r o v i d e a p o s s i b l e p h y l o g e n e t i c l i n k b e t w e e n t h e s e e n z y m e s . A l t h o u g h t h e p r e c e d i n g h y p o t h e s e s c a n n o t be p r o v e n u n t i l t h e c r y s t a l l o g r a p h i c s t r u c t u r e o f c y t o c h r o m e P450 i s F i g u r e I I . 9 Heme e n v i r o n m e n t s o f m y o g l o b i n ( A ) , h e m o g l o b i n ( B ) , and p e r o x i d a s e ( G ) ; ' R e f . 1 0 4 . 44 c o m p l e t e , i t c a n be s a i d t h a t t h e heme p o c k e t m u s t be m a n i p u l a t e d i n t h e enzyme t o p r o v i d e a n e n v i r o n m e n t i n w h i c h t h e p o s s i b l e s i d e r e a c t i o n s a r e a v o i d e d . Some s u g g e s t i o n s p u t f o r t h 1 0 4 i n c l u d e t h e f o r m a t i o n o f a c a v i t y a r o u n d t h e a c t i v a t e d s p e c i e s s o t h a t c o n t a c t w i t h t h e a m i n o a c i d s i n t h e heme p o c k e t i s u n l i k e l y , a n d , p o s s i b l y s t e r i c c o m p r e s s i o n o f t h e s u b s t r a t e a g a i n s t t h e r e a c t i v e o x i d i z i n g u n i t a l l o w i n g o n l y r e a c t i o n w i t h t h e s u b s t r a t e t o t a k e p l a c e . The a c t u a l mode o f i n t e r a c t i o n , h o w e v e r , c a n o n l y be e l u c i d a t e d by e x t e n s i v e s t u d y i n t h e f u t u r e . I I . 4 M e c h a n i s m o f A c t i o n L i m i t i n g t h e d i s c u s s i o n t o t h e m e c h a n i s m o f o x i d a t i o n o f u n a c t i v a t e d C-H b o n d s , t h e o v e r a l l r e a c t i o n c a t a l y s e d by c y t o c h r o m e P450 c a n be g e n e r a l i z e d by R e a c t i o n 1.1. The p o s t u l a t e d c a t a l y t i c s e q u e n c e i s a s i x s t e p p r o c e s s i n v o l v i n g t h e t r a n s f e r o f h i g h e n e r g y e l e c t r o n s f r o m NADH/NADPH t o c y t o c h r o m e P450 w i t h t h e c o n c o m i t a n t two e l e c t r o n r e d u c t i o n o f m o l e c u l a r o x y g e n t o y i e l d t h e o x i d i z e d s u b s t r a t e a n d w a t e r ( F i g u r e 1 1 . 1 0 ) . The m e c h a n i s m by w h i c h t h i s p r o c e s s t a k e s p l a c e h a s b e e n an i n t r i g u i n g p r o b l e m a n d a l t h o u g h a l a r g e m a j o r i t y o f t h e r e a c t i o n p a t h w a y h a s b e e n e l u c i d a t e d , a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f t h e t o t a l c a t a l y t i c p a t h w a y s t i l l r e m a i n s o b s c u r e . The c a t a l y t i c c y c l e t o be d e s c r i b e d was o r i g i n a l l y p r o p o s e d by E s t a b r o o k 3 4 and . i s v a l i d f o r a l l c l a s s e s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 . Many s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s , i n c l u d i n g e l e c t r o n i c a b s o r p t i o n , EPR, M o s s b a u e r , RR, NMR, m a g n e t i c c i r c u l a r d i c h r o i s m ( M C D ) , a n d ENDOR, h a v e b e e n u t i l i z e d t o p r o b e t h e a c t i v e s i t e a t e a c h s t e p i n t h e c a t a l y t i c s e q u e n c e . 3 3 a , 3 8 , 8 1 , O n l y b r i e f r e f e r e n c e t o a few o f t h e s e t e c h n i q u e s w i l l be g i v e n h e r e . The f i r s t s t e p i n t h e c a t a l y t i c p a t h w a y ( F i g u r e 1 1.10; c o n v e r s i o n 1 2) i s t h e r e v e r s i b l e b i n d i n g o f s u b s t r a t e by t h e l o w - s p i n f e r r i c c y t o c h r o m e P450 ( r e s t i n g enzyme) w h i c h p r o d u c e s a h i g h - s p i n s u b s t r a t e c o m p l e x . 1 0 5 F o r m a t i o n o f t h e s e s u b s t r a t e c o m p l e x e s i s g e n e r a l l y m a n i f e s t e d i n 46 ( 1 ) ^Product) ROH ( , o w - s P ' n ""©sting enzyme) (6) Fe3+0] • RH H 2 0 2 H +  (5) [FeOj-RH Rate limiting e -R '0 2 H or Fe2+0,« RH (4) RH (substrate) Fe3+* RH (high-spin) (2) Fe2+» RH (high-spin) (3) F i g u r e 11.10 P r o p o s e d r e a c t i o n c y c l e o f c y t o c h r o m e P450 d r a m a t i c c h a n g e s i n t h e a b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e f e r r i c f o r m o f t h e h e m o p r o t e i n , r e g a r d l e s s o f s o u r c e . F o r e x a m p l e , t h e S o r e t r e g i o n o f P. puti'da c y t o c h r o m e P450cam h a s a n i n t e n s e b a n d a t 418nm f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e c o m p l e x w h i c h s h i f t s t o 391nm on t h e a d d i t i o n o f camphor ( F i g u r e 1 1 . 1 1 ) . D i s t i n c t s p e c t r a l c h a n g e s a r e a l s o o b s e r v e d i n t h e 500-600nm r e g i o n . The s p e c t r a l c h a n g e s o b s e r v e d d u r i n g b i n d i n g o f s u b s t r a t e t o t h e P4 50 c y t o c h r o m e s a r e p a r a l l e l e d by s p i n c h a n g e s a t t h e p a r a m a g n e t i c i r o n c e n t e r . EPR and M o s s b a u e r s i g n a l s c h a r a c t e r i s t i c o f a l o w - s p i n i r o n heme (S=h) a r e o b s e r v e d i n t h e s u b s t r a t e - f r e e c o m p l e x , w h i l e s i g n a l s i n d i c a t i n g a h i g h - s p i n i r o n s p e c i e s (S=5/2) a r e o b s e r v e d on t h e b i n d i n g o f s u b s t r a t e . 3 8 O t h e r c h a n g e s i n c l u d e an i n c r e a s e i n t h e r e d u c t i o n p o t e n t i a l o f t h e e n z y m e 1 0 0 f r o m -270 t o -170mV, a s w e l l a s an i n c r e a s e i n t h e i s o e l e c t r i c p o i n t ( p i ) o f t h e enzyme (4.55 t o 4 . 6 7 ) . 8 7 P r o t o n NMR a n d ENDOR s t u d i e s s u g g e s t t h e l o s s o f a n a x i a l l y c o o r d i n a t e d o x y g e n o r n i t r o g e n b a s e d l i g a n d (most l i k e l y a w a t e r m o l e c u l e ) , a n d a n i n c r e a s e i n t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e s o l v e n t p r o t o n s and t h e p a r a m a g n e t i c i r o n c e n t r e . 8 2 From t h e s e d a t a , t h e i n t e r a c t i o n o f t h e r e s t i n g enzyme w i t h t h e s u b s t r a t e f o r b a c t e r i a l P450cam h a s b e e n s p e c u l a t e d u p o n . 1 0 7 I n i t i a l l y , t h e t h i o l a t e and w a t e r - b o u n d i r o n a t o m i s f o u n d i n t h e p l a n e of. t h e p o r p h y r i n a s t h e l o w - s p i n s p e c i e s . The p r o s t h e t i c g r o u p i s s u r r o u n d e d by t h e heme p o c k e t e x i s t i n g a s a r a t h e r e x p o s e d h y d r o p h o b i c a r e a o f t h e 48 I -11-Wavelength (hrrij F i g u r e 11.11 enzyme. R e m o v a l o f t h e h y d r o p h o b i c h y d r o c a r b o n camphor s u b s t r a t e f r o m t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t i n t o t h e o p e n n o n -p o l a r p o c k e t p r o v i d e s t h e d r i v i n g f o r c e f o r t h e b i n d i n g o f s u b s t r a t e , w h i c h p r o d u c e s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n v o l v i n g t h e p o l y p e p t i d e . The i r o n atom i s , i n t u r n , p u l l e d o u t o f t h e p l a n e o f t h e p o r p h y r i n w i t h t h e l o s s o f t h e aquo l i g a n d c r e a t i n g t h e h i g h - s p i n f e r r i c c y t o c h r o m e P 4 5 0 . The heme p o c k e t s u b s e q u e n t l y c o n s t r i c t s a r o u n d t h e s u b s t r a t e a n d r e d u c e s e x p o s u r e t o t h e b u l k s o l v e n t . H y d r o g e n b o n d i n g , 1 0 4 s t e r i c c o m p r e s s i o n 1 0 4 and more r e c e n t l y , t h i o h e m i k e t a l b o n d f o r m a t i o n 1 0 8 h a v e b e e n t h o u g h t t o c o n s t r a i n t h e s u b s t r a t e m o l e c u l e i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e a c t i v e s i t e . S u b s t r a t e b i n d i n g i s a r e v e r s i b l e p r o c e s s and i s n o t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e c a t a l y t i c p a t h w a y . The c h a n g e i n r e d o x p o t e n t i a l on s u b s t r a t e b i n d i n g ( i . e . -27 0 t o -17 0mV) a l l o w s f o r t h e s e c o n d s t e p o f t h e c y c l e t o p r o c e e d ( F i g u r e 11.10; c o n v e r s i o n 2 »-3) . T h i s s t e p i n v o l v e s t h e r a p i d one e l e c t r o n r e d u c t i o n , v i a . an i r o n - s u l p h u r p r o t e i n (-240mV) t o t h e h i g h - s p i n f e r r o u s s t a t e , (S=2) . R e d u c t i o n o f t h e f e r r i c c o m p l e x i s a g a i n m a n i f e s t e d i n m a r k e d c h a n g e s i n b o t h t h e S o r e t and v i s i b l e r e g i o n s o f t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m ; r e d u c t i o n o f campho r -bound c y t o c h r o m e P4 50cam c a u s e s a r e d s h i f t o f t h e S o r e t b a n d a t 391nm t o 409nm and f o r m a t i o n o f a d i s t i n c t v i s i b l e b a n d a t 540nm ( F i g u r e 1 1 . 1 1 ) . The t h i r d s t e p i n t h e m e c h a n i s t i c p a t h w a y ( F i g u r e 11.10; c o n v e r s i o n 3 ^ 4 ) i s t h e r e v e r s i b l e b i n d i n g o f d i o x y g e n t o 50 t h e h i g h - s p i n f e r r o u s s u b s t r a t e c o m p l e x w i t h f o r m a t i o n o f a l o w - s p i n O x y g e n a t e d s u b s t r a t e c o m p l e x . The b i n d i n g o f d i o x y g e n i s a c c o m p a n i e d by t h e a p p e a r a n c e o f a new s p e c t r a l s p e c i e s c h a r a c t e r i z e d by a d i s t i n c t " h y p e r - s p e c t r u m " e x h i b i t i n g a S o r e t a b s o r p t i o n a t 418nm and a h i g h e r e n e r g y t r a n s i t i o n a t 350nm ( F i g u r e 1 1 . 1 1 ) . S u b s t i t u t i o n o f t h e d i o x y g e n m o l e c u l e by c a r b o n m o n o x i d e a t t h i s p o i n t g i v e s t h e c h a r a c t e r i s t i c c y t o c h r o m e P450 a b s o r p t i o n s p e c t r u m f r o m w h i c h t h e enzyme was named ( F i g u r e 1 1 . 1 1 ) . F i g u r e 11.12 shows t h e d i s t i n c t " h y p e r - s p e c t r a " o f o x y - a n d c a r b o x y -P450cam. . .EPR s t u d i e s o f o x y c y t o c h r o m e P450 i n d i c a t e t h a t € mM 60 90 30 300 400 500 600 Wavelength (hm) F i g u r e 11.12 O p t i c a l s p e c t r a o f c a r b o n y l a t e d ( ) a n d o x y g e n a t e d ( ) f e r r o u s c y t o c h r o m e P450cam; R e f . 4 2 . 51 t h e c o m p l e x i s a l o w - s p i n s p e c i e s w h i c h i s c o m p a r a b l e w i t h d i o x y g e n c o m p l e x e s o f o t h e r h e m o p r o t e i n s 1 0 9 s u c h as m y o g l o b i n and h e m o g l o b i n . However, i n c o n t r a s t t o o x y m y o g l o b i n and' o x y h e m o g l o b i n , t h e o x y g e n a t e d P450 s p e c i e s a r e c h a r a c t e r i z e d by m a r k e d i n s t a b i l i t y a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s ( e . g . a t 22°C and pH 7.0, t , - l m i n ) . The P 4 5 0 - a u t o o x i d a t i o n p r o c e s s i s t h o u g h t t o p r o c e e d via a p r o t o n - a s s i s t e d d i s p l a c e m e n t o f s u p e r o x i d e a s HC^ w i t h r e g e n e r a t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g f e r r i c ( r e s t i n g ) s t a t e . 1 0 The i n s t a b i l i t y o f o x y c y t o c h r o m e P450 i s a t t r i b u t e d t o t h e h i g h e l e c t r o n d e n s i t y o f t h e t h i o l a t e l i g a n d b e i n g t r a n s m i t t e d t o t h e c o o r d i n a t e d o x y g e n m o l e c u l e . M o s s b a u e r s p e c t r o s c o p y 1 1 0 h a s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i r o n o f t h e o v e r a l l d i a m a g n e t i c o x y - P 4 5 0 c o m p l e x c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f f e r r i c i r o n , a n d t h u s t h e o x y g e n a t e d i n t e r m e d i a t e c a n be c o n s i d e r e d t o h a v e a s u p e r o x i d e - f e r r i c i r o n c h a r g e d i s t r i b u t i o n . O x y c y t o c h r o m e P4 50 c o m p l e x e s h a v e b e e n s u b s e q u e n t l y s t a b i l i z e d a t l o w e r t e m p e r a t u r e s a nd b y r e c o n s t i t u t i n g t h e n a t i v e enzyme w i t h s e v e r a l d i f f e r e n t heme d e r i v a t i v e s 1 0 ( e . g . a t 0°c a n d pH-7.0 t h e i r o n ( I I ) d i o x y g e n f o r m o f d i a c e t y l d e u t e r . o h e m e r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P450 h a s a h a l f - l i f e o f 450 m i n u t e s ) . G e n e r a l l y up t o t h i s s t a g e o f d i o x y g e n a d d i t i o n i n t h e e n z y m a t i c c y c l e , t h e r a t e s , t h e n a t u r e o f t h e a x i a l l i g a t i o n , a n d t h e e l e c t r o n i c c o n f i g u r a t i o n s a r o u n d t h e heme a r e r e a s o n a b l y w e l l u n d e r s t o o d . The n e x t , and r a t e l i m i t i n g s t e p , i n t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n ( F i g u r e 1 1 . 1 0 ; c o n v e r s i o n 4 *• 5) i s a f u r t h e r o n e - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f o x y c y t o c h r o m e P 450. T h i s s t e p i n d u c e s t h e c l e a v a g e o f b ound d i o x y g e n t o p r o d u c e an " a c t i v a t e d o x y g e n " c o m p l e x t h a t i s t y p i c a l l y c a p a b l e o f o x i d i z i n g u n a c t i v a t e d C-H b o n d s . As y e t , l i t t l e i s known o r u n d e r s t o o d . a b o u t t h i s s e c o n d r e d u c t i o n s t e p a s w e l l a s t h e s u b s e q u e n t s t e p s l e a d i n g t o t h e o x y g e n a t i o n o f t h e s u b s t r a t e . H owever, f r o m i n f o r m a t i o n a c c u m u l a t e d t o d a t e on t h e n a t i v e P450cam s y s t e m , o t h e r h e m o p r o t e i n s , a n d c h e m i c a l m o d e l s t u d i e s , t h e c o m p l e t i o n o f t h e c a t a l y t i c c y c l e i s t h o u g h t t o o c c u r a s i n d i c a t e d i n t h e f i n a l t h r e e s t e p s o f F i g u r e 11.10. The a b i l i t y t o s h u n t t h e e n z y m a t i c c y c l e ( F i g u r e 1 1.10; c o n v e r s i o n 1 »-5) u s i n g o r g a n i c p e r o x i d e s 1 1 1 a s w e l l a s h y d r o g e n p e r o x i d e i t s e l f , 1 1 2 and s t i l l o b t a i n t h e s t e r e o s p e c i f i c o x i d a t i o n p r o d u c t s w i t h o u t an e x t e r n a l e l e c t r o n d o n o r , s u g g e s t e d t h a t t h e i n i t i a l r e d u c t i o n p r o d u c t o f t h e o x y g e n a t e d enzyme ( F i g u r e 11.10; c o n v e r s i o n 4- +• 5) was a h e m e - i r o n c o o r d i n a t e d p e r o x i d e c o m p l e x . S u b s e q u e n t m o d e l s t u d i e s 1 1 3 , 1 1 4 showed t h a t t h i s i n t e r m e d i a t e may 2 i n f a c t be t h e h i g h - s p i n f e r r i c n_ - p e r o x i d e c o m p l e x (1) shown i n Scheme I I . 1 . The m o n o n u c l e a r p e r o x o c o m p l e x (1) was p r o d u c e d b o t h s y n t h e t i c a l l y 1 1 3 and e l e c t r o c h e m i c a l l y 1 1 4 b u t u n f o r t u n a t e l y d i d n o t e x h i b i t any o f t h e o x i d i z i n g p o w e r s o f t h e n a t i v e enzyme p r e s u m a b l y due t o t h e a b s e n c e i n t h e m o d e l s y s t e m s o f t h e a x i a l t h i o l a t e l i g a n d . 1 1 4 O t h e r 53 Scheme II.1 probable s t r u c t u r e s f o r the reduced oxy-P450 complex have been proposed a l l of which invoke a s i m i l a r p e r o x i d e -l i k e i n t e r m e d i a t e . 1 1 5 Although the intermediacy of t h i s s p e c i e s i s only s p e c u l a t i v e , the proposed peroxy complex r e p r e s e n t s a p l a u s i b l e precusor t h a t has a l l the e l e c t r o n e q u i v a l e n t s needed f o r methylene carbon h y d r o x y l a t i o n , water p r o d u c t i o n , and r e g e n e r a t i o n of the f e r r i c P450 r e s t i n g enzyme. Assuming then t h a t the peroxy complex (1) r e p r e s e n t s the e l e c t r o n i c c o n f i g u r a t i o n a t the heme c e n t r e immediately a f t e r the r e d u c t i o n of oxycytochrome P450, p r o d u c t i o n o f the " a c t i v a t e d oxygen complex" (Figure 11.10; c o n v e r s i o n 5 —-6) i s s p e c u l a t e d to occur via cleavage of the peroxy 0-0 bond. P r e s e n t l y , the evidence i s i n favour of h e t e r o l y t i c 0-0 bond cleavage b e f o r e s u b s t r a t e o x i d a t i o n . The mechanism of the h e t e r o l y t i c cleavage r e a c t i o n as d e p i c t e d i n Scheme II.2 i s 54 Scheme II.2 t h o u g h t t o p r o c e e d e i t h e r by d o u b l e p r o t o n a t i o n w i t h l o s s o f w a t e r , o r by n u c l e o p h i l i c a t t a c k o f t h e bound p e r o x i d e a t a c a r b o x y l a t e r e s i d u e o f a n a mino a c i d s i d e c h a i n ( p r o d u c i n g a t r a n s i e n t a c y l p e r o x i d e ) f o l l o w e d b y 0-0 bond c l e a v a g e and e l i m i n a t i o n o f c a r b o x y l a t e . 1 1 5 I r r e g a r d l e s s o f t h e p r e c i s e m e c h a n i s m o f 0-0 bond c l e a v a g e , one o f t h e o x y g e n atoms l e a v e s a t t h e o x i d a t i o n l e v e l o f w a t e r w h i l e t h e o t h e r i s t h o u g h t t o r e m a i n c o o r d i n a t e d t o t h e h e m e - i r o n . T h i s s p e c i e s , f o r m a l l y a f e r r i c o x e n e ( o x y g e n atom) c o m p l e x ( 2 ) , i s s p e c u l a t e d a s t h e p o w e r f u l o x i d i z i n g a g e n t u t i l i z e d by t h e P450 c y t o c h r o m e s . S u p p o r t f o r s u c h a m o n o o x y - i r o n s p e c i e s was d e r i v e d f r o m t h e f a c t t h a t i o d o s y l b e n z e n e (3) , a s i n g l e o x y g e n a tom d o n o r , c a n be u s e d t o e f f e c t t h e o x y g e n a tom t r a n s f e r i n a manner s i m i l a r t o t h a t o f t h e f u l l y r e c o n s t i t u t e d enzyme s y s t e m s ( F i g u r e 1 1.10; c o n v e r s i o n 1 » - 6 ) . 1 1 6 P e r a c i d s h a v e b e e n 55 u s e d a s w e l l t o p r o d u c e t h e same r e s u l t s w i t h t h e n a t i v e e n z y m e . 1 1 1 The a b i l i t y o f i o d o s y l b e n z e n e t o r e p l a c e b o t h NADPH and d i o x y g e n i n t h e e n z y m a t i c c y c l e o f l i v e r m i c r o -s o m a l P450 was f i r s t o b s e r v e d b y U l l r i c h et at..117 and ha s s u b s e q u e n t l y b e e n m o d e l l e d b y G r o v e s et at. 4 1 , 1 1 8 u s i n g f e r r i c p o r p h y r i n s i n t h e p r e s e n c e o f i o d o s y l b e n z e n e . More r e c e n t l y , G r o v e s et at.1'1 h a v e f o l l o w e d up t h e s e f i n d i n g s s h o w i n g t h a t f e r r i c t e t r a - m e s i t y l p o r p h y r i n (4)# when t r e a t e d w i t h a p e r a c i d , y i e l d s a m o n o x y - i r o n p o r p h y r i n d e r i v a t i v e a n a l o g o u s t o t h e p o s t u l a t e d o x e n e c o m p l e x u t i l i z e d by t h e n a t i v e P450 enzymes. A m o n o x y - r u t h e n i u m a n a l o g h a s b e e n r e c e n t l y p r o d u c e d a l s o . 1 1 9 S u p p o r t f o r t h e monoxy-g e n a t e d o x i d i z i n g a g e n t o f t h e P450 c y t o c h r o m e s i s f u r t h e r s u b s t a n t i a t e d by c o m p a r i n g t h i s " a c t i v a t e d o x y g e n " s p e c i e s w i t h t h e enzymes c a t a l a s e ( C a t ) and h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (HRP) i n t h e i r h i g h e s t , e n z y m a t i c a l l y a c t i v e , o x i d a t i o n s t a t e s known as compounds I . 1 2 0 Compounds I o f b o t h c a t a l a s e ( C a t I ) and h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (HRP I ) a r e g e n e r a t e d when t h e r e s t i n g f e r r i c heme p r o t e i n s u n d e r g o a two e l e c t r o n , h y d r o g e n p e r o x i d e - m e d i a t e d , o x i d a t i o n . T h e s e enzyme s y s t e m s a l o n g w i t h t h e P4 50 c y t o c h r o m e s a r e t h o u g h t t o i n v o k e t h e same m o n o o x y - i r o n i n t e r m e d i a t e i n t h e i r r e s p e c t i v e e n z y m a t i c c y c l e s . L a b e l l e d o x y g e n 1 2 1 and more r e c e n t l y E N D O R 1 2 2 s t u d i e s o f HRPI h a v e shown t h a t t h e c o m p l e x c o n t a i n s an o x o l i g a n d b o und t o t h e h e m e - i r o n , w h i c h i s a n a l o g o u s t o t h e f e r r i c o x e n e c o m p l e x p o s t u l a t e d a s t h e a c t i v e o x i d i z i n g a g e n t o f t h e P450 c y t o c h r o m e s . A l t h o u g h f o r m u l a t e d a s a f e r r i c - o x e n e s p e c i e s , t h e e x a c t n a t u r e o f t h e o x e n o i d c o m p l e x i s n o t c l e a r . I f a n o x e n e c o m p l e x , t h e o b s e r v e d r e a c t i v i t y o f t h e s e s p e c i e s c o u l d be e x p e c t e d t o p a r a l l e l t h a t o f t h e a n a l o g o u s c a r b e n e s p e c i e s . 1 2 3 T h a t i s , t h e oxygen-atom s h o u l d i n s e r t d i r e c t l y i n t o C-H b o n d s and a c r o s s o l e f i n i c d o u b l e b o n d s w i t h o u t l o s s o f s t e r e o c h e m i s t r y . I t h a s b e e n d e t e r m i n e d , h o w e v e r , t h a t c y t o c h r o m e P 4 5 0 - m e d i a t e d o x i d a t i o n s do n o t f u n c t i o n via s u c h d i r e c t i n s e r t i o n and t h a t t h e p u r e f e r r i c - o x e n e a n a l o g y i s n o t c o r r e c t . 1 1 0 O t h e r p o s s i b l e f o r m u l a t i o n s c a n be a r r i v e d a t f r o m t h e v a r i o u s r e s o n a n c e s t r u c t u r e s o f t h e ox e n e c o m p l e x a s shown i n Scheme I I . 3 . :0: :0: 'O* '9' I I I » " n Fe(Hl)P— Fe(iv)P— Fe(iv)P+* — Fe(iv)P+* — Fe (V) P Ferric Oxene'" * Porphyrin - n - cation Radicals" P= protoporphyrin ix Scheme II.3 E x t e n s i v e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e o x o - i r o n t e t r a -m e s i t y l p o r p h y r i n c o m p l e x i s o l a t e d by G r o v e s et al,1*1 h a s shown t h a t t h e m o s t l i k e l y s t r u c t u r e f o r t h e " a c t i v a t e d o x y g e n " c o m p l e x i s t h e o x o - i r o n ( I V ) - p o r p h y r i n i r - c a t i o n r a d i c a l (Scheme I I . 3 ) ; h o w e v e r , d e p e n d i n g on t h e a x i a l l i g a n d t h e i n t e r m e d i a t e c a n a l s o e x i s t a s t h e F e ( V ) c o m p l e x . The r e c e n t c h a r a c t e r i z a t i o n o f an o x o p o r p h i n a t o c h r o m i u m (V) c o m p l e x 1 2 4 p r o v i d e s i n d i r e c t e v i d e n c e t h a t an o x o - i r o n (V) i n t e r m e d i a t e may be i n v o l v e d i n t h e P450 e n z y m a t i c c y c l e , w h i l e U l l r i c h et al.125 h a v e s u g g e s t e d t h e F e I V - 6- s t r u c t u r e f o r t h e a c t i v a t e d i n t e r m e d i a t e . A l t h o u g h t h e " a c t i v a t e d o x y g e n " c o m p l e x i s p r o b a b l y a r e s o n a n c e m i x t u r e o f t h e . 58 s t r u c t u r e s l i s t e d i n Scheme I I . 3, s u p p o r t f o r t h e F e ( I V ) -p o r p h y r i n i r - c a t i o n r a d i c a l i n t e r m e d i a t e i s p r o v i d e d by e x t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n s o f t h e a c t i v e e n z y m a t i c i n t e r -m e d i a t e s o f HRPI and C a t I . 1 2 0 / I 2 6 As w e l l , c a t a l a s e c a n c a t a l y s e t h e N - d e m e t h y l a t i o n o f s m a l l s u b s t r a t e s , 1 2 7 a r e a c t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f t h e P450 c y t o c h r o m e s , t h u s s u g g e s t i n g t h e e x i s t e n c e o f a common i r o n - o x o n - c a t i o n r a d i c a l i n t e r m e d i a t e w i t h i n t h e s e enzyme s y s t e m s . The r e a s o n t h a t C a t and HRP do n o t a c t i v e l y c a t a l y s e P 4 5 0 -l i k e o x i d a t i o n s i s t h o u g h t t o be due t o t h e e x t r e m e l y s m a l l h e m e - p o c k e t s u r r o u n d i n g t h e heme g r o u p i n t h e s e e nzymes. The r o l e o f t h e t h i o l a t e l i g a n d t h u s f a r , i n c o n v e r s i o n s 4 — ^ 6 ( F i g u r e 11.10) o f t h e c a t a l y t i c c y c l e i s a l s o u n c l e a r and s p e c u l a t i v e a t b e s t . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e t h i o l a t e a i d s i n s p l i t t i n g t h e p e r o x i d e bond by w e a k e n i n g t h e 0-0 bond t h r o u g h c h a r g e r e p u l s i o n i n t h e n e i g h b o u r h o o d o f t h e e l e c t r o n - r i c h i r o n a t o m . 1 0 6 C o m p a r i s o n o f t h e a u t o -o x i d a t i o n r a t e s o f oxy-P4 50 1°with oxy-Mb s u g g e s t s t h a t t h e i n c r e a s e i n e l e c t r o n d e n s i t y p r o v i d e d by t h e t h i o l a t e l i g a n d v e r s u s i m i d a z o l e may e n h a n c e t h e f a c i l i t y o f t h e 0-0 bond c l e a v a g e r e a c t i o n . 1 0 / 1 0 9 U l l r i c h et al.125 on t h e o t h e r h a n d , s u g g e s t s t h a t t h e t h i o l a t e l i g a n d i s o n l y r e q u i r e d f o r t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e o x e n o i d c o m p l e x f o r t h e t r a n s f e r t o o r g a n i c s u b s t r a t e s and n o t i n t h e a c t u a l p r o d u c t i o n o f t h e " a c t i v a t e d o x y g e n " c o m p l e x . I t may be n o t e d h e r e t h a t t h i o l a t e i s n o t a r e q u i r e d l i g a n d f o r t h e C a t I and HRP I s y s t e m s w h i c h i n v o l v e a x i a l p h e n o x i d e and i m i d a z o l e , r e s p e c t i v e l y . 1 2 0 S i n c e l i t t l e d e f i n i t i v e i n f o r m a t i o n i s known, t h e t h i o l a t e i s g e n e r a l l y t h o u g h t o f as p r o v i d i n g an e x t r e m e l y e l e c t r o n r i c h i o n atom w h i c h b o t h d e s t a b i l i z e s t h e p e r o x y i n t e r m e d i a t e and s t a b i l i z e s t h e e l e c t r o p h i l i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e o x e n o i d c o m p l e x . The p r e c i s e r o l e o f t h e t h i o l a t e a w a i t s f u r t h e r s t u d y . The f i n a l s t e p i n t h e c a t a l y t i c c y c l e ( F i g u r e 11.10; c o n v e r s i o n 6 — * - l ) i s t h e o x i d a t i o n o f t h e o r g a n i c s u b s t r a t e by t h e a c t i v e " o x e n o i d " o x i d i z i n g a g e n t . S t u d i e s w i t h b o t h c y t o c h r o m e s P450 and m o d e l s y s t e m s s u g g e s t t h a t h y d r o c a r b o n o x i d a t i o n p r o c e e d s v i a t h e i n t e r m e d i a c y o f a s u b s t r a t e r a d i c a l ; 4 2 / 1 1 1 ' 1 1 8 a r 1 2 8 t h e i s o t o p e e f f e c t s and r e g i o - a n d s t e r e o s e l e c t i v i t y o f P450 o x i d a t i o n s a l l a r g u e f o r t h e s u b s t r a t e r a d i c a l i n t e r m e d i a t e . The h y d r o -p h o b i c n a t u r e o f t h e b i n d i n g s i t e h a s a l s o b e e n u s e d t o a r g u e f o r a n u n c h a r g e d ( r a d i c a l ) s u b s t r a t e i n t e r m e d i a t e 4 2 ' 1 0 6 as h a s t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e m i c r o s o m a l m e t a b o l i s m o f t h e i n s e c t i c i d e D i e l d r i n . 1 2 9 The f o r m a t i o n and h y d r o x y l a t i o n o f s u c h a s u b s t r a t e f r e e r a d i c a l i s t h o u g h t t o o c c u r a s o u t l i n e d i n Scheme I I . 4. A b s t r a c t i o n o f a h y d r o g e n a tom f r o m s u b s t r a t e (R-H) by t h e a c t i v e o x i d i z i n g a g e n t o f P450 p r o d u c e s t h e s u b s t r a t e r a d i c a l and an i r o n ( I V ) p o r p h y r i n c o m p l e x e d by h y d r o x i d e . S u b s e q u e n t t r a n s f e r o f a n i r o n -b o u n d h y d r o x y l r a d i c a l t o t h e s u b s t r a t e r a d i c a l g e n e r a t e s t h e o x i d i z e d s u b s t r a t e and t h e r e s t i n g enzyme ( F e ( I I I ) ) 60 R T H V :0= Fe(iv)P+* I R ,0: Fe(iv)P H FefllOP :0= Fe (iv)p R - O H + Fe(lll)P Scheme II.4 r e a d y f o r a n o t h e r c a t a l y t i c c y c l e . E l i m i n a t i o n o f t h e p o l a r m e t a b o l i t e f r o m t h e n o n - p o l a r heme p o c k e t p r o v i d e s t h e d r i v i n g f o r c e f o r t h e r e l e a s e o f t h e o x i d i z e d s u b s t r a t e . H e r e a g a i n , t h e s e s p e c u l a t i o n s o n t h e d e t a i l s o f t h i s o x i d a t i v e s t e p i n t h e c a t a l y t i c c y c l e o f t h e P4 50 c y t o c h r o m e s r e q u i r e more e x p e r i m e n t a l s u p p o r t . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t i n many a r e a s o f o x y g e n c h e m i s t r y , N a t u r e h a s u s e d i r o n p o r p h y r i n s f o r t h e t r a n s p o r t , s t o r a g e , and u t i l i z a t i o n o f d i o x y g e n a n d i t s r e d u c e d d e r i v a t i v e s . 4 2 / 1 0 6 I n f a c t , t h e i n t e r m e d i a c y o f b o t h t h e oxe n e a n d h y d r o x y l r a d i c a l i n t h e c a t a l y t i c c y c l e o f P450 o x i d a t i o n s , w h i c h a r e s t a b i l i z e d by c o o r d i n a t i o n t o an i r o n p o r p h y r i n , h a s c o m p l e t e d t h e p i c t u r e f o r t h e o x y g e n c h e m i s t r y o u t l i n e d i n F i g u r e 1.2. E a c h o f t h e p o s s i b l e o x y g e n i n t e r m e d i a t e s shown t h e r e h a s b e e n u t i l i z e d by N a t u r e a n d i s s t a b i l i z e d i n e a c h c a s e by t h e u s e o f a heme p r o t e i n . 1 0 T h e r e f o r e , i n summary, c y t o c h r o m e P450 has b e e n c o n s i d e r e d as N a t u r e ' s e q u i v a l e n t t o F e n t o n ' s r e a g e n t 1 0 6 w h e r e t h e h i g h l y r e a c t i v e h y d r o x y l r a d i c a l s and o x e n e s a r e c o n t r o l l e b y t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h t h e h e m o p r o t e i n . I I . 5 The I n t e r a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h C y t o c h r o m e P4 50 The i n t e r a c t i o n o f s m a l l g as m o l e c u l e s , s u c h a s CO and 0 2 , w i t h m e t a l l o p o r p h y r i n s p e c i e s h a s i n t r i g u e d s c i e n t i s t s o f a l l d i s c i p l i n e s e v e r s i n c e s u c h s p e c i e s w e r e r e c o g n i z e d as b e i n g t h e c a t a l y t i c c e n t e r s i n numerous n a t u r a l l y o c c u r r i n g b i o l o g i c a l s y s t e m s . The most common e x a m p l e s o f m e t a l l o p o r p h y r i n c o n t a i n i n g p r o t e i n s a r e t h e 0^ c a r r i e r s , m y o g l o b i n a n d h e m o g l o b i n , 1 0 9 a l t h o u g h v a r i o u s o x i d a s e s ( i . e . c y t o c h r o m e o x i d a s e ) 1 3 0 and o x y g e n a s e s ( i . e . P450 c y t o c h r o m e s ) 3 3 a h a v e a l s o b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y . A l l o f t h e s e b i o s y s t e m s u t i l i z e t h e f e r r i c - i r o n p o r p h y r i n m o i e t y ( t h e heme u n i t ) a s t h e i r p r o s t h e t i c g r o u p w h i c h i n t h e f e r r o u s s t a t e c h a r a c t e r i s t i c a l l y b i n d s 0 2 and f o r m s s t a b l e c o m p l e x e s w i t h CO; i n e a c h c a s e t h e 0 2 o r CO m o l e c u l e b i n d s as a n a x i a l l i g a n d t o t h e i r o n a t o m o f t h e heme m o i e t y . An i m p o r t a n t p r o p e r t y o f t h e o x y - ( 0 2 c o m p l e x ) and t h e c a r b o n monoxy-(CO c o m p l e x ) i r o n b o n d s i s t h a t t h e y c a n be b r o k e n by i r r a d i a t i o n w i t h v i s i b l e l i g h t . The a b i l i t y o f v i s i b l e l i g h t t o d i s s o c i a t e , i n p a r t i c u l a r , t h e c a r b o n m o n o x i d e c o m p l e x e s o f t h e s e n a t u r a l h e m o p r o t e i n s h a s b e e n r e c o g n i z e d f o r y e a r s . E a r l y e x p e r i m e n t s w i t h m i x t u r e s o f o x y and c a r b o n monoxy Hb ( H a l d a n e and S m i t h , 18 96) showed t h a t e x p o s u r e t o s o l a r l i g h t o f a m i x t u r e o f o x y - and c a r b o n m o n o x y - c o m p l e x e s p r o d u c e d a m a r k e d d e c r e a s e i n t h e amount o f t h e CO- d e r i v a t i v e a n d an i n c r e a s e i n t h e 0 2 f o r m . 1 3 1 As w e l l , t h e a b i l i t y o f w h i t e l i g h t t o r e v e r s e t h e c a r b o n 63 m o n o x i d e i n h i b i t i o n o f t h e s t e r o i d C21 h y d r o x y l a t i o n o f 1 7 - h y d r o x y p r o g e s t e r o n e l e d t o t h e i n i t i a l d i s c o v e r y o f t h e f u n c t i o n o f t h e P4 50 c y t o c h r o m e s i n mammalian s y s t e m s ( S e c t i o n I I . l ) . . 2 1 a To d a t e , p h o t o d i s s o c i a t i o n w i t h a h i g h q u antum y i e l d h a s b e e n shown t o be a g e n e r a l c h a r a c t e r i s t i c o f a l l c a r b o n m o n o x y - h e m o p r o t e i n c o m p l e x e s and t h a t t h e p r o t e i n - f r e e CO-heme c o m p l e x i t s e l f i s p h o t o d i s s o c i a t e d w i t h a q uantum y i e l d o f o n e . 1 0 9 The o x y - d e r i v a t i v e s o f t h e s e h e m o p r o t e i n s a r e a l s o p h o t o d i s s o c i a b l e ; 1 0 9 h o w e v e r , t h e q uantum y i e l d i s much l o w e r by a f a c t o r o f -3 0 t h a n f o r t h e c o r r e s p o n d i n g CO c o m p l e x e s . The p h o t o l a b i l i t y o f t h e s e h e m o p r o t e i n c o m p l e x e s , p a r t i c u l a r l y i n t h e c a s e o f t h e CO c o m p l e x e s , i s o f g r e a t p r a c t i c a l i m p o r t a n c e b e c a u s e i t r e p r e s e n t s t h e b a s i s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s by t h e f l a s h p h o t o l y s i s m e t h o d . I n d e e d , t h e f i r s t s p e c i a l method f o r s t u d y i n g f a s t r e a c t i o n s b y t h e f l a s h p h o t o l y s i s method was i n t r o d u c e d by G i b s o n 1 3 2 i n t h e m i d 1 9 5 0 ' s f o r t h e s t u d y o f m y o g l o b i n and h e m o g l o b i n w i t h CO. I n f o r m a t i o n g a t h e r e d f r o m k i n e t i c e x p e r i m e n t s s u c h a s t h e s e , t o g e t h e r w i t h d a t a o b t a i n e d f r o m s t a t i c e q u i l i b r i u m s t u d i e s , a l t h o u g h d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t , c a n be u s e d t o d r a w c o n c l u s i o n s on t h e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s i n t h e s e h e m o p r o t e i n s a s w e l l as on t h e m e c h a n i s m o f t h e i n t e r a c t i o n o f g a s s e s s u c h a s CO w i t h t h e v a r i o u s h e m o p r o t e i n s . 1 0 9 T h i s s e c t i o n w i l l be c o n c e r n e d , t h e r e f o r e , w i t h t h e method o f f l a s h p h o t o l y s i s a s a p p l i e d t o t h e i n t e r a c t i o n o f t h e P450 c y t o c h r o m e s w i t h CO. A b r i e f d e s c r i p t i o n o f t h e t h e o r e t i c a l and p r a c t i c a l a s p e c t s o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s m e t h o d w i l l be g i v e n f o l l o w e d b y a c o m p i l a t i o n o f k i n e t i c i n f o r m a t i o n g a t h e r e d t o d a t e f r o m t h i s as w e l l a s o t h e r k i n e t i c m e t h o d s ( e . g . s t o p p e d f l o w ) . Some c o n c l u s i o n s a r e d r a w n . E q u i l i b r i u m b i n d i n g s t u d i e s w i l l be i n c l u d e d w h e r e n e c e s s a r y , a n d i n f o r m a t i o n g a t h e r e d o n t h e P450 s y s t e m w i l l be c o m p a r e d w i t h r e l e v a n t d a t a f r o m t h e Mb and Hb s y s t e m s , a s w e l l a s f r o m m o d e l s f o r c y t o c h r o m e P 4 5 0 . The i n t e r a c t i o n o f p r o t e i n s c o n t a i n i n g a s i n g l e heme p e r m o l e c u l e , s u c h a s t h e P450 o r Mb s y s t e m s , w i t h CO c a n be r e p r e s e n t e d by R e a c t i o n I I . 5 . Where F e ( I I ) i s t h e f e r r o u s k k Fe(II) + CO 0rV F e ( I I ) - C O , K co = J^_\ "k (II.5) o f f o f f h e m o p r o t e i n , K c o i s t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t , k Q n i s t h e a s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t , and k ^ i s t h e d i s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t . F o r t h e s e s i m p l e p r o t e i n s y s t e m s , t h e f o r m a t i o n o f t h e C O - c o m p l e x e s c o r r e s p o n d s t o a s e c o n d -o r d e r r e a c t i o n , w h i l e t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e CO f r o m t h e l i g a n d - b o u n d c o m p l e x t o a f i r s t - o r d e r p r o c e s s . 3 0 / 1 0 9 S i n c e t h e s e r e a c t i o n s a r e u s u a l l y c a r r i e d o u t u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e t h e CO l i g a n d i s i n g r e a t e x c e s s , i . e . p s e u d o f i r s t - o r d e r i n h e m o p r o t e i n , t h e c o m b i n a t i o n o f CO and h e m o p r o t e i n c a n be e x p r e s s e d by r a t e e q u a t i o n I I . 6 ( s e e A p p e n d i x I I ) . 65 o n k. u = k- [CO] + k _ (II.6) o b s on o r r The u s e o f d i f f e r e n t CO c o n c e n t r a t i o n s a l l o w s f o r t h e d i r e c t m e a s u r e m e n t o f t h e a s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t , k and t h e d i s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t , k f ^ . H owever, i n p r a c t i c e , t h e v a l u e o f k f f d e r i v e d by e x t r a p o l a t i o n , i s s u b j e c t t o g r e a t e r e r r o r t h a n t h e v a l u e o f k Q n , and s h o u l d be c h e c k e d a g a i n s t t h e v a l u e c a l c u l a t e d f r o m t h e s t a t i c e q u i l i b r i u m m e a s u r e m e n t o f Kco = k /k c c l o r ^ o n o r r o b t a i n e d d i r e c t l y via a d i f f e r e n t k i n e t i c m ethod s u c h a s s t o p p e d - f l o w . The k i n e t i c s o f t h e r e a c t i o n o f CO w i t h h e m o g l o b i n , w h i c h c o n t a i n s f o u r heme u n i t s p e r m o l e c u l e , a r e much more c o m p l e x . 1 0 9 The r e a c t i o n o f t h e s i m p l e h e m o p r o t e i n s ( e . g . P450 and Mb) w i t h CO a r e "rapid".: w i t h h a l f - l i v e s o f <1 s e c o n d a t " o r d i n a r y " t e m p e r a t u r e s and c o n c e n t r a t i o n s , and r e q u i r e t h e u s e o f s p e c i a l m o n i t o r i n g m e t h o d s . T h e s e s p e c i a l t e c h n i q u e s 1 0 9 i n c l u d e f l o w methods ( c o n t i n u o u s -o r s t o p p e d - f l o w ) , r e l a x a t i o n m ethods ( p a r t i c u l a r l y t e m p e r a t u r e - j u m p ) , o r f l a s h p h o t o l y s i s m e t h o d s . A l t h o u g h o n l y t h e f l a s h p h o t o l y s i s method w i l l be d e s c r i b e d h e r e , c o n s i s t e n t d a t a h a v e b e e n o b t a i n e d by a l l t h r e e m e t h o d s f o r t h e Mb-CO s y s t e m ; o n l y t h e f l a s h and s t o p p e d - f l o w m ethods h a v e b e e n u s e d f o r t h e c y t o c h r o m e P450-CO s y s t e m 66 F l a s h p h o t o l y s i s c a n be c o n s i d e r e d an e x t r e m e r e l a x a t i o n m ethod i n w h i c h a p e r t u r b a t i o n i s a p p l i e d s u d d e n l y t o a p r e -m i x e d s y s t e m i n e q u i l i b r i u m . The p e r t u r b a t i o n i s " v i o l e n t " so t h a t t h e e q u i l i b r i u m i s g r e a t l y d i s p l a c e d . T h i s c o n t r a s t s , w i t h o t h e r r e l a x a t i o n m e t h o d s s u c h a s t e m p e r a t u r e - j u m p 1 0 9 w h e r e t h e s y s t e m i s p e r t u r b e d f r o m e q u i l i b r i u m by o n l y a s m a l l amount. The e x t r e m e d i s t u r b a n c e u t i l i z e d i n t h e f l a s h p h o t o l y s i s m e thod i s p r o d u c e d by s u d d e n i r r a d i a t i o n o f t h e s y s t e m w i t h a v e r y i n t e n s e b u r s t o f l i g h t e n e r g y . Up t o 10"* j o u l e s o f e n e r g y may be a b s o r b e d i n a few h u n d r e d m i c r o s e c o n d s o r more t y p i c a l l y s e v e r a l h u n d r e d j o u l e s i n a few m i c r o s e c o n d s . T h i s a b s o r b e d l i g h t e n e r g y c a u s e s b o t h e l e c t r o n i c e x c i t a t i o n a n d c h e m i c a l r e a c t i o n and p r o d u c e s r e l a t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h e e x c i t e d o r r e a c t i v e s p e c i e s . T h i s makes i t p o s s i b l e t o i d e n t i f y and s t u d y t h e s e i n t e r m e d i a t e s by m e a s u r i n g t h e i r c h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o n s p e c t r a a nd by f o l l o w i n g t h e k i n e t i c s o f t h e e x c i t e d m o l e c u l e s i n t h e t i m e f o l l o w i n g t h e f l a s h . T h i s m e t hod c a n be a p p l i e d e q u a l l y w e l l i n t h e g a s p h a s e o r i n s o l u t i o n . A p p l i c a t i o n o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s m e t h o d t o t h e k i n e t i c s t u d y o f h e m o p r o t e i n s w i t h l i g a n d s a s e x e m p l i f i e d b y R e a c t i o n I I . 5 h a s become r o u t i n e s i n c e t h e p i o n e e r i n g w o r k o f G i b s o n . 1 3 2 I n p a r t i c u l a r , t h e r e a c t i o n o f t h e P4 50 c y t o c h r o m e 1 0 ' 1 3 i 2 l a > 30> 3 3 c , 9*+e, 133 a n ( j {.^ g m y o g l o b i n s y s t e m 1 0 9 ' 1 3 2 w i t h CO h a s r e c e i v e d much a t t e n t i o n . When t h e s e l i g a n d - b o u n d h e m o p r o t e i n s o l u t i o n s a r e e x p o s e d t o a n i n t e n s e l i g h t p u l s e o f a n e l e c t r o n i c f l a s h , 67 d i s s o c i a t i o n o f t h e l i g a n d o c c u r s ( t h e r e v e r s e o f R e a c t i o n I I . 5 ) : F e ( I I ) - C O ^ F e ( I I ) + CO. A t t h e end o f t h e f l a s h , t h e s y s t e m r e t u r n s t o e q u i l i b r i u m i n t h e d a r k , and t h e k r e c o m b i n a t i o n r e a c t i o n F e ( I I ) + CO - ^ U Fe ( I I ) - C O c a n be f o l l o w e d ( t h e f o r w a r d o f R e a c t i o n I I . 5 ) . As m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , t h i s a l l o w s f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t h e r a t e c o n s t a n t s i n d i c a t e d i n R e a c t i o n I I . 5 . The p h o t o d i s s o c i a t i o n and s u b s e q u e n t r e b i n d i n g c a n be o b s e r v e d o p t i c a l l y s i n c e t h e S o r e t a b s o r p t i o n maxima o f t h e CO-bound a n d f r e e f e r r o u s h e m o p r o t e i n s a r e e a s i l y d i s t i n g u i s h a b l e : P450-CO, 445 nm; P 4 5 0 , 408 nm ( s e e F i g u r e 1 1 . 1 1 ) ; Mb-CO, 423 nm; Mb, 434 nm ( s e e F i g u r e I I I . 2 0 a ) . T h e r e f o r e , u p o n p h o t o d i s s o c i a t i o n t h e a b s o r p t i o n c h a n g e s t o t h a t o f t h e C O - f r e e p r o t e i n , and a s t h e CO r e b i n d s t h e a b s o r p t i o n r e t u r n s t o t h e o r i g i n a l v a l u e (CO-bound) w i t h a t i m e d e p e n d e n c e t h a t p r o v i d e s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e b i n d i n g k i n e t i c s . The a b s o r p t i o n c a n be m o n i t o r e d w i t h a l i g h t beam c e n t e r e d a t t h e S o r e t p e a k o f e i t h e r t h e CO- o r C O - f r e e c o m p l e x , and t h u s , c h a n g e s i n c o n c e n t r a t i o n s c a n be m o n i t o r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y . Low l e v e l s o f m o n i t o r i n g l i g h t a r e u s e d t o a v o i d d i s t u r b i n g t h e r e a c t i o n k i n e t i c s . I t s h o u l d be n o t e d t h a t i n t h e s e s t u d i e s t h e o n l y e f f e c t o f t h e l i g h t p u l s e i s t o p r o m o t e t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e l i g a n d , w i t h no o t h e r d i r e c t o r i n d i r e c t p h o t o c h e m i c a l e f f e c t s . T h a t i s , t h e a x i a l l i n k a g e t o t h e heme m o i e t y , via t h e t h i o l a t e l i g a n d i n t h e P4 50 c y t o c h r o m e and t h e i m i d a z o l e i n t h e m y o g l o b i n s y s t e m , i s u n a f f e c t e d by t h e 68 f l a s h . U s i n g a f l a s h p h o t o l y s i s s e t - u p c a p a b l e o f p r e c i s e l y m o n i t o r i n g t h e a b s o r b a n c e c h a n g e o f t h e heme s o l u t i o n a t t h e v e r y moment when t h e CO i s f l a s h e d o f f , P450 m o d e l s t u d i e s 9 4 * 3 h a v e shown t h a t t h e C O - d i s s o c i a t e d s p e c t r u m i s i d e n t i c a l t o t h e u n l i g a n d e d s p e c t r u m . T h i s s u b s t a n t i a t e s t h e p o s t u l a t e t h a t t h e C O - d i s s o c i a t e d c o m p l e x o f t h e m o d e l and t h e P450 enzyme s y s t e m s i s i n d e e d p e n t a c o o r d i n a t e . As o r i g i n a l l y d e d u c e d , 1 3 2 t h e k i n e t i c s o f t h e r e a c t i o n o f h e m o p r o t e i n s w i t h CO a r e i n d e p e n d e n t o f t h e amount o f l i g h t e n e r g y a n d o f t h e f r a c t i o n o f c o m p l e x p h o t o d i s s o c i a t e d . The f l a s h p h o t o l y s i s m a c h i n e s u s e d f o r t h e s t u d y o f t h e CO r e a c t i o n s f o l l o w t h e g e n e r a l f e a t u r e s o f t h a t d e s c r i b e d by G i b s o n 1 3 2 a n d P o r t e r 1 3 4 and a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 1 . 1 3 . The s o l u t i o n t o be e x a m i n e d i s p l a c e d F i g u r e 11.13 : 69 i n c e l l (C) t h r o u g h w h i c h t h e m o n o c h r o m a t i c o b s e r v a t i o n l i g h t beam i s p a s s e d f r o m l i g h t s o u r c e (L) o n i t s way t o t h e p h o t o m u l t i p l i e r ( P ) . T h i s m o n i t o r i n g l i g h t i s r e n d e r e d a p p r o x i m a t e l y m o n o c h r o m a t i c by p a s s i n g t h r o u g h a mono-c h r o m a t o r (M), and a n a r r o w - l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r a t ( F ^ ) . The o u t p u t o f t h e p h o t o m u l t i p l i e r i s r e c o r d e d w i t h o s c i l l o s c o p e ( 0 ) . The p h o t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e compound i n t h e c e l l i s i n i t i a t e d by a b r i e f b u t b r i l l i a n t f l a s h o f l i g h t p r o d u c e d by t h e f l a s h t u b e ( F T ) , a t r i g h t a n g l e s t o t h e m o n i t o r i n g beam. The f l a s h l i g h t i s a p p r o p r i a t e l y f i l t e r e d a s w e l l , {F^), t o i n s u r e t h a t i t d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h t h e m o n i t o r i n g beam. The " d e a d t i m e " o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s , w h i c h i s t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n i n i t i a t i o n o f r e a c t i o n a nd t h e f i r s t u s e f u l o b s e r v a t i o n , d e p e n d s o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l i g h t p u l s e a n d o n t h e e f f i c i e n c y o f s c r e e n i n g o f t h e s t r a y l i g h t f r o m t h e f l a s h . O v e r a l l d e a d t i m e s f r o m a few m i l l i s e c o n d s t o f r a c t i o n s o f m i l l i s e c o n d s c a n be o b t a i n e d . H i g h e n e r g y f l a s h e s h a v e b e e n u s e d ; b u t - t h e h i g h . q u a n t u m y i e l d f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e c a r b o n m o n o x i d e d e r i v a t i v e s p e r m i t s t h e u s e o f l o w e n e r g y f l a s h e s , and e v e n c o m m e r i c a l f l a s h l a m p s u s e d f o r p h o t o g r a p h y c a n be s u c c e s s f u l l y e m p l o y e d . 1 0 9 F o r t h e homogeneous Pseudomonas putida c y t o c h r o m e P450cam enzyme, t h e e x p e r i m e n t a l f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t t h e i n t e r a c t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e c a n be e x p r e s s e d a c c o r d i n g t o R e a c t i o n I I . 5. The i n t e r a c t i o n o f CO w i t h t h e m i c r o s o m a l P4 50 s p e c i e s , on t h e o t h e r h a n d , a p p e a r s 70 t o p r e s e n t a much more c o m p l e x s i t u a t i o n . T a b l e s I I . 1 a n d I I . 2 r e p r e s e n t t h e c o m p l e t e c o l l e c t i o n o f p u b l i s h e d e q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c d a t a f o r t h e b i n d i n g o f CO t o t h e P450 c y t o c h r o m e s . D a t a a r e c o m p i l e d f o r t h e b a c t e r i a l P450cam s y s t e m ( b o t h s u b s t r a t e - f r e e and b o u n d ) , t h e m i c r o s o m a l P450 e n z y m e s , some P450 m o d e l c o m p l e x e s , a n d f o r t h e m y o g l o b i n s y s t e m . T h e s e d a t a w i l l be a n a l y s e d and c o m p a r e d t o p r e s e n t a d e s c r i p t i o n o f t h e e q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c b e h a v i o r o f t h e P4 5 0 c y t o c h r o m e s i n t h e i r r e a c t i o n w i t h CO; no d e t a i l e d i n t e r p r e t a t i o n o f t h e d a t a i n t e r m s o f s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s w i l l be a t t e m p t e d b u t , w h e n e v e r p o s s i b l e , c o r r e l a t i o n o f e q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c b e h a v i o r w i t h s t r u c t u r a l f e a t u r e s w i l l be e m p h a s i z e d . C o m p r e h e n s i v e i n t e r p r e t a t i o n s o f s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n -s h i p s c a n be f o u n d e l s e w h e r e . 8 / 1 0 9 / 1 3 5 C o m p a r i s o n o f t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s (Kco) f o r C O - b i n d i n g t o c y t o c h r o m e P450 shows t h a t w i t h i n t h e e x p e r i m e n t a l l i m i t s o f pH (7.0-7.5) and t e m p e r a t u r e (4-24°C) 5 -1 t h e v a l u e s a r e v e r y c o n s i s t e n t ; t h e y r a n g e f r o m 1.3x10 M a t 24°C f o r s u b s t r a t e - b o u n d P 4 5 0 c a m 9 9 t o 2 2 x l 0 5 M _ 1 a t 4°C f o r s u b s t r a t e - f r e e P 4 5 0 c a m , 3 3 c w i t h t h e m i c r o s o m a l s p e c i e s b e i n g o f i n t e r m e d i a t e v a l u e . 1 3 3 ^ A n a l y s i s o f t h e K c o v a l u e s f o r t h e P4 50cam enzymes i n d i c a t e s t h a t t h e i n t e r a c t i o n w i t h CO i s a f f e c t e d b y t h e camphor s u b s t r a t e . P e t e r s o n and G r i f f i n 3 3 5 r e p o r t an a l m o s t 1 0 - f o l d i n c r e a s e i n t h e e q u i l i b r i u m b i n d i n g c o n s t a n t a t 4°C i n t h e a b s e n c e o f t h e s u b s t r a t e 71 T a b l e I I . 1 E q u i l i b r i u m D a t a f o r R e v e r s i b l e C O - b i n d i n g t o C y t o c h r o m e P4 50 S o u r c e pH T(°C) K c o ( M _ 1 ) AH° ( K c a l m o l ^) AS° , ( c a l m o l -1 d e g ) R e f . P450cam 7.4 4 2 . 2 x l 0 6 33c ( s u b s t r a t e - c f r e e ) 7.0 24 1.7x10 10 P450cam 7.4 4 2 . 6 x l 0 5 33c ( s u b s t r a t e -bound) 7.5 12 2.6x10 -12 -17 10 7.0 20 6 . 6 x l 0 5 133a 7.0 24 1 . 3 x l 0 5 99 L i v e r M i c r o - 7-7.5 4 3 - 7 x l 0 5 0 1 3 , . s o m a l P4 5 0 133b,c 7.4-7.5 20 0.7-1x10 0 133,b,d P450 m o d e l s 23 l . l x l O 4 -16 -35 94c M b ( a ) 7.0 20 2 . 9 x l 0 7 -12 .6 -7.4 109 a) E n t h a l p y a nd e n t r o p y v a l u e s q u o t e d f o r m y o g l o b i n w e r e c a l c u l a t e d f r o m a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s (AH* and AS*) f o r CO-on and o f f r e a c t i o n s a s i n R e f . 10. T a b l e I I . 2 72 K i n e t i c D a t a f o r R e v e r s i b l e C O - B i n d i n g t o C y t o c h r o m e P450 S o u r c e M ethod pH T°C k on ( M _ 1 S _ 1 ) k o f f E a ( o n ) ( K c a l m o l \ R e f . P450cam SF 7.4 4 5 . 1 x l 0 6 2i3 (b) 33c ( s u b s t r a t e -f r e e ) FP 5 2.7x10 1.2(b) 8.9 30 15 4 . 7 x l 0 6 AH* = 8 . 3 25 8 . 4 x l 0 6 AS* = 1.9 P450cam SF 7.4 4 3 . 8 x l 0 4 33c ( s u b s t r a t e -bound) SF 7.0 20 3.6x10 2.8 133a SF 7.0 24 2 . 2 x l 0 5 1.7 10 FP 5 8 x l 0 4 8.9 30 15 i : ; 3x10 5 AH* = 8 . 3 25 2 . 3 x l 0 5 AS* =-6.0 FP 7.3 12 3 . 5 x l 0 4 8.0 ±0.4 133e AH* = 7 . 4 AS* = -11 Mb 7.0 20 5 x l 0 5 0.02 7.1 109 i H * = 6.5 *S* = -10 156 7.0 25 3 . 8 x l 0 5 4.7 ^H* = 4.1 \S* =-19.4 P4 50 M o d e l 23 l . l x l O 5 18 94c . M i c r o s o m a l FP 7.4 4 3 . 4 x l 0 5 0'. 068 133h ' P450 SF 7.5 4 4.5x10 0.63 8.3 133b AH* = 7 . 8 AS* =-4.2 a) SF and FP r e f e r t o t h e k i n e t i c m e t h o d s o f s t o p p e d - f l o w a n d f l a s h p h o t o l y s i s r e s p e c t i v e l y . 73 N o t e s f o r T a b l e I I . 2 c o n t i n u e d b) C a l c u l a t e d v a l u e s o f k - _ f r o m t h e e x p r e s s i o n Kco = T-— o f ± * o f f ( s e e R e a c t i o n I I . 5 ) . c) Ea (on) r e f e r s t o t h e a c t i v a t i o n e n e r g y m e a s u r e d f o r b i n d i n g o f CO t o t h e v a r i o u s h e m o p r o t e i n s y s t e m s . A c t i v a t i o n p a r a m e t e r s (AH* and AS*) f o r t h e "on" r e a c t i o n a r e shown i n b r a c k e t s u n d e r n e a t h t h e E a (on) v a l u e s . E n t h a l p y and e n t r o p y o f a c t i v a t i o n was K T ,._AE£ AS c a l c u l a t e d f r o m AH*(on) = E a ( o n ) - RT and k = — - e RT e R o n h r e s p e c t i v e l y . AH* v a l u e s h a v e u n i t s o f K c a l m o l - 1 w h i l e AS* v a l u e s a r e . i n c a l m o l - 1 d e g " 1 ; R e f . 1 6 7 . 74 (22x10 M us. 2.6x10 M ) . H o w e v e r , D o l p h i n and James et al.10 r e p o r t t h a t a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s (24°C) t h e b i n d i n g c o n s t a n t 5 -1 f o r s u b s t r a t e - f r e e P450cam (1.7x10 M ) a p p r o a c h e s t h o s e f o r t h e s u b s t r a t e - b o u n d enzyme (Kco = 1.3-6.6xlO^M -*-) . 1 0 , 9 9 , l 3 3a S i n c e o n l y two Kco v a l u e s f o r s u b s t r a t e - f r e e P4 50cam h a v e b e e n p u b l i s h e d t o d a t e , f u r t h e r s t u d i e s a r e n e e d e d . The a p p a r e n t l o w e r a f f i n i t y o f s u b s t r a t e - b o u n d P450cam f o r CO h a s b e e n r a t i o n a l i z e d i n t e r m s o f s t e r i c e f f e c t s o f t h e camphor m o l e c u l e i n t h e v i c i n i t y o f t h e heme m o i e t y ; 3 3 o b i n d i n g o f t h e camphor c l o s e t o t h e heme g r o u p i s c o n s i d e r e d t o r e s t r i c t a c c e s s o f t h e CO m o l e c u l e t o t h e h e m e - i r o n and h a v e a d e s t a b i l i z i n g e f f e c t on t h e heme-CO c o m p l e x . The e f f e c t o f t h e camphor s u b s t r a t e on t h e r a t e c o n s t a n t s , t o be d i s c u s s e d s h o r t l y , s u b s t a n t i a t e s t h i s r a t i o n a l i z a t i o n . A n a l y s i s o f t h e e q u i l i b r i u m b i n d i n g c o n s t a n t s f o r m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P450 shows a s l i g h t i n c r e a s e i n CO a f f i n i t y a s c o m p a r e d t o t h e s u b s t r a t e - b o u n d b a c t e r i a l enzyme; t h e s e v a l u e s a p p r o a c h t h o s e o f s u b s t r a t e - f r e e P450cam ( K c o ( m i c r o s o m a l P450) - 1 0 6 M _ 1 ; K c o ( s u b s t r a t e - f r e e P450cam) = 2 . 2 x l 0 6 M _ 1 ) ) , b u t W h e t h e r o r n o t t h e i n c r e a s e d C O - a f f i n i t y i s due t o a s i m i l a r s u b s t r a t e - e f f e c t f o r t h e m i c r o s o m a l s y s t e m s i s n o t known. The o b s e r v e d d i f f e r e n c e s i n C O - a f f i n i t y b e t w e e n t h e m i c r o s o m a l a n d b a c t e r i a l P450 enzymes h a v e n o t b e e n i n t e r p r e t e d b e c a u s e o f t h e c o m p l e x make-up o f t h e m i c r o s o m a l s y s t e m s ( s e e S e c t i o n I I . 2 ) . K i n e t i c s t u d i e s on t h e r e a c t i o n o f CO w i t h the microsomal enzyme exemplify these complex c h a r a c t e r i s t i c s , and this information w i l l be discussed shortly. Comparison of the P4 50 cytochromes with mercaptide-heme model complexes 9 h ,° and the myoglobin system 1 0 9 indicates the C O - a f f i n i t i e s of the cytochromes are intermediate between the model complexes and that of myoglobin. In the case of the protein-free P450 models, CO i s bound 10-100 times weaker than i n the enzyme, whereas for myoglobin, carbon monoxide i s bound up to 220 times tighter than i n cytochrome P450 (see Table II.1). Lower CO-affinity for the P450 model complexes compared to the enzyme has been attributed to loss of s t a b i l i t y provided by inte r a c t i o n of the CO-heme complex with the protein, 9 h , a for example, via hydrogen bonding with protein residues. These interactions are ca l l e d c i s - e f f e c t s 1 0 9 and are used to assess the e f f e c t of the protein on ligand binding. The higher a f f i n i t y for CO observed for the Mb system i s thought to indicate the differences i n proximal-ligand coordination i n the two hemoproteins; imidazole i n Mb, and thi o l a t e i n P4 50 cytochromes. The axial(RS ) th i o l a t e anion, coordinated to the heme moiety i n the P450 systems, i s thought to produce an electron-r i c h i r o n atom which i n turn produces a general lowering of ligand a f f i n i t y through a - r e p u l s i o n s . 1 3 3 a Since imidazole coordination i n the Mb system does not deloc a l i z e electron density onto the iron atom of the heme group so e f f e c t i v e l y , the same lowering of ligand a f f i n i t i e s i s not observed. The 76 e f f e c t s o f a x i a l c o o r d i n a t i o n on t h e r e a c t i v i t y o f hemo-p r o t e i n s w i t h l i g a n d s a r e c a l l e d t r a n s e f f e c t s , 1 0 9 a n d a g a i n c a n be u s e d t o a s s e s s t h e e f f e c t o f t h e p r o t e i n o n l i g a n d b i n d i n g . M e a s u r e m e n t o f t h e e q u i l i b r i u m C O - b i n d i n g c o n s t a n t s f o r t h e P450 c y t o c h r o m e s a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e h a s p r o v i d e d o n l y a s i n g l e s e t o f t h e s e t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s f o r s u b s t r a t e - b o u n d P450cam s y s t e m and no v a l u e s f o r t h e c o r r e s p o n d i n g s u b s t r a t e - f r e e enzyme. V e r y l i m i t e d d a t a 1 3 3 ^ h a v e b e e n c i t e d a l s o f o r t h e m i c r o s o m a l P450 s y s t e m s . C l e a r l y , more t h e r m o d y n a m i c d a t a ' a r e n e e d e d t o f u r t h e r u n d e r s t a n d t h e r e a c t i o n o f t h e P450 c y t o c h r o m e s w i t h CO, a s w e l l a s f o r c o m p a r i s o n w i t h o t h e r h e m o p r o t e i n a nd P4 50 m o d e l s y s t e m s . A n a l y s i s o f t h e t h e r m o d y n a m i c d a t a o u t l i n e d i n T a b l e I I . 1 shows t h a t t h e e n t h a l p y c h a n g e o f C O - b i n d i n g f o r t h e s u b s t r a t e -b o u n d P450cam s y s t e m 1 ° ( A H ° = -12.0 K c a l m o l i s c o m p a r a b l e t o t h a t o f t h e m y o g l o b i n s y s t e m 1 0 (AH° = -12.6 K c a l m o l and somewhat l o w e r t h a n t h a t o f t h e p r o t e i n - f r e e P4 50 m o d e l c o m p l e x 9 L F C ( A H ° = -16 K c a l m o l . The s m a l l e r e n t h a l p y c h a n g e s f o r t h e p r o t e i n c o m p l e x e s i s t h o u g h t t o be due t o a w e a k l y c o o r d i n a t e d ligand 9^° f r o m t h e b u l k s o l v e n t o r t h e p r o t e i n w h i c h c o m p e n s a t e s s l i g h t l y f o r t h e h e a t o f r e a c t i o n . C o m p a r i s o n o f t h e s e AH° v a l u e s w i t h t h e l i t e r a t u r e r e p o r t t h a t no e n t h a l p y c h a n g e was o b s e r v e d f o r t h e l i v e r m i c r o s o m a l P45Q13 3& s y s t e m i s t h e r e f o r e s u r p r i s i n g , and i m p l i e s t h a t i n t h e m i c r o s o m a l enzymes a n e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s l i g a n d 77 c o u l d be s t r o n g l y c o o r d i n a t e d a t t h e s i x t h s i t e o f t h e r e d u c e d P4 50 w h i c h c o m p e n s a t e s f u l l y f o r t h e h e a t o f r e a c t i o n . L i m i t e d e n t r o p y d a t a f o r C O - b i n d i n g ( T a b l e I I . 1 ) i n d i c a t e t h a t t h e b i n d i n g i s u n f a v o u r a b l e . The n e g a t i v e AS° v a l u e s a r e a t t r i b u t e d m a i n l y t o l o s s o f t r a n s l a t i o n a l a n d r o t a t i o n a l f r e e d o m o f t h e CO m o l e c u l e on c o o r d i n a t i o n . 8 C o m p a r i s o n o f t h e s e s y s t e m s shows t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n C O - a f f i n i t y a s d e t e r m i n e d b y Kco v a l u e s ( i . e . Mb>P450cam >P450 m o d e l s ) r e s u l t t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n t f r o m i n c r e a ^ -s i n g l y l e s s f a v o u r a b l e e n t r o p y t e r m s . E x p l a n a t i o n s 8 ' 1 0 ' 1 0 9 b a s e d on c i s and t r a n s e f f e c t s o f t h e p r o t e i n , a s w e l l a s s t e r i c e f f e c t s due t o t h e p r e s e n c e o f camphor i n t h e P450 s y s t e m , h a v e b e e n u s e d t o a s s e s s t h e d i f f e r e n t C O - a f f i n i t i e s ; h o w e v e r , t h e s e e f f e c t s a r e s u b t l e a n d d i f f i c u l t t o a s s e s s p r e c i s e l y . The k i n e t i c c o n s t a n t s a l s o r e f l e c t t h e o b s e r v e d t r e n d i n e n t r o p y c h a n g e s ( s e e b e l o w ) . E n t r o p y d a t a f o r m i c r o s o m a l P4 50 a r e n e e d e d f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e b a c t e r i a l enzyme a s w e l l a s m y o g l o b i n and P450>.model c o m p l e x e s . A n a l y s i s o f t h e k i n e t i c d a t a l i s t e d i n T a b l e I I . 2 shows t h a t much a t t e n t i o n h a s b e e n d i r e c t e d t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e C O - a s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t , k..... a s d e f i n e d i n ' on' R e a c t i o n I I . 5 . The d e t e r m i n a t i o n o f t h e C O - d i s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t , k •' ' , h a s r e c e i v e d l e s s e f f o r t . The o r r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s ( i . e . pH and t e m p e r a t u r e r a n g e s ) u t i l i z e d a r e a l m o s t i d e n t i c a l t o t h o s e q u o t e d f o r Kco 78 e v a l u a t i o n s , and r a t e c o n s t a n t d e t e r m i n a t i o n s w e r e o b t a i n e d via b o t h f l a s h p h o t o l y s i s and s t o p p e d - f l o w t e c h n i q u e s . C o m p a r i s o n o f t h e s u b s t r a t e - f r e e and s u b s t r a t e - b o u n d P450cam s y s t e m s shows t h a t t h e i n t e r a c t i o n o f CO i s a f f e c t e d by t h e s u b s t r a t e c a m p h o r . P e t e r s o n and G r i f f i n 3 3 c r e p o r t s e c o n d - o r d e r r e a c t i o n r a t e c o n s t a n t s f o r t h e r e a c t i o n o f t h e c a m p h o r - f r e e and camphor f e r r o u s c y t o c h r o m e , o f 5.1 x 1 0 6 M "*"S a n d 3.8 x 1 0 4 M "*"S 1 r e s p e c t i v e l y . C o m p a r i s o n o f t h e k v a l u e s f o r P450cam i n t h e a b s e n c e a n d t h e p r e s e n c e on o f s u b s t r a t e o v e r t h e q u o t e d e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s i n d i c a t e s a g e n e r a l r a t e e n h a n c e m e n t f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e c o m p l e x : k ( s u b s t r a t e - f r e e ) - 2.0-9.0 x 10^M "*"S ^; k ( s u b s t r a t e -on o n 4 -1 -1 bound)'- 3.0-36 x 10 M S . The d a t a a r e r e f l e c t e d xn t h e h i g h e r Kco v a l u e s f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e s y s t e m s a n d camphor b i n d i n g by t h e f e r r o u s c y t o c h r o m e i s t h o u g h t : t o r e d u c e t h e a c c e s s i b i l i t y o f t h e h e m e - i r o n t o t h e C O . 1 0 ' 3 3 c F o r t h e s u b s t r a t e - f r e e c o m p l e x , b o t h f l a s h p h o t o l y s i s 3 0 and s t o p p e d - f l o w 3 3 c t e c h n i q u e s g a v e c o n s i s t e n t k Q n v a l u e s and m e a s u r e m e n t o f k w i t h t e m p e r a t u r e 3 0 y i e l d e d a n o n a c t i v a t i o n e n e r g y , E a , o f 8.9 K c a l m o l ^. V a l u e s o f ^-Qff f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e s y s t e m h a v e n o t b e e n m e a s u r e d d i r e c t l y a l t h o u g h P e t e r s o n and G r i f f i n , 3 3 c f o r e x a m p l e , h a v e r e p o r t e d — i 6 — a c a l c u l a t e d v a l u e o f 2.3 S . U s i n g t h e Kco v a l u e (2.2 x 10 M' a t 4°C f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e c o m p l e x 3 3 c and t h e k Q n v a l u e (2.7 x 1 0 6 M _ 1 S - 1 ) o b t a i n e d by G u n s a l u s et al.30 by f l a s h p h o t o l y s i s a t 5°C, a k v a l u e o f 1.2 S _ 1 was c a l c u l a t e d . The 79 two v a l u e s o f s u c h c a l c u l a t e d k 0 £ f d a t a a r e r e a s o n a b l y c o n s i s t e n t ( T a b l e I I . 2 ) ; h o w e v e r , d i r e c t m e a s u r e m e n t o f k v a l u e s f o r s u b s t r a t e - f r e e P450cam a r e n e e d e d f o r o f f c o m p a r i s o n a s w e l l a s a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s . • The k i n e t i c d a t a f o r t h e s u b s t r a t e - b o u n d P450cam, a l t h o u g h q u i t e e x t e n s i v e , a r e n o t a s c o n s i s t e n t a s f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e enzyme. U n d e r t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s u t i l i z e d ( i . e . pH and t e m p e r a t u r e ) , t h e k Q n v a l u e s r a n g e 4 - 1 - 1 f r o m 3.5-36 x 10 M S w i t h t h e f a s t e r r a t e s o c c u r r i n g g e n e r a l l y a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s . I n c o n s i s t e n c i e s a r i s e h o w e v e r , when c o m p a r i n g s t o p p e d - f l o w m e a s u r e m e n t s o f P e t e r s o n a n d G r i f f i n 3 3 e a t 4°C (k = 3.8 x 1 0 4 M _ 1 S _ 1 ) on w i t h f l a s h p h o t o l y s i s m e a s u r e m e n t a t 5^C by G u n s a l u s et al.30 (k = 8 x 1 0 4 M S "*") . - . A l s o , c o m p a r i s o n o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s m e a s u r e m e n t s by B o n f i l s et al.l33e a t 12°C (k = 3.5 x 1 0 4 M _ 1 S _ 1 ) and G u n s a l u s et al.'i0 a t 15°C o n 4 -1 -1 (k = 13 x 10 M S ) show a f a c t o r o f 4 d i f f e r e n c e b e t w e e n on t h e two v a l u e s . T h e s e i n c o n s i s t e n c i e s , a l o n g w i t h a 1 0 - f o l d c h a n g e i n t h e C O - a s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t o v e r t h e q u o t e d t e m p e r a t u r e r a n g e ( w h i c h i s n o t o b s e r v e d - f o r t h e s u b s t r a t e -f r e e e n z y m e ) , i n d i c a t e t h a t f u r t h e r m e a s u r e m e n t o f k on v a l u e s a r e r e q u i r e d t o a s s e s s t h e s e o b s e r v a t i o n s . The a c t i v a t i o n e n e r g y f o r t h e a s s o c i a t i o n o f CO w i t h s u b s t r a t e -b o u nd P450cam h a s b e e n m e a s u r e d i n t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s o f G u n s a l u s et al.30 (Ea = 8.9 K c a l m o l "*") and B o n f i l s et al.133e (Ea = 8.0 + 0.4 K c a l m o l 1 ) . T h e s e a c t i v a t i o n 8 0 e n e r g i e s a g r e e w e l l w i t h t h a t o b t a i n e d by G u n s a l u s et at.30 (Ea = 8.9 K c a l m o l 1 ) f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e enzyme. C o m p a r i s o n o f t h e c a l c u l a t e d a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s f o r t h e a s s o c i a t i o n r e a c t i o n ( s e e T a b l e I I . 2) i n d i c a t e t h a t C O - b i n d i n g t o t h e s u b s t r a t e - f r e e enzyme i s a c c o m p a n i e d by a more f a v o u r a b l e e n t r o p y t e r m (AS* = 1.9 c a l m o l d e g "*") w h e r e a s C O - b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f s u b s t r a t e i s l e s s f a v o u r e d (AS* = -6 --11 c a l i n t h e s m a l l e r k v a l u e s w h i c h , i n t u r n , h a v e b e e n on a t t r i b u t e d t o t h e r e s t r i c t e d a c c e s s t o t h e C O - b i n d i n g s i t e i n t h e enzyme i n t h e p r e s e n c e o f s u b s t r a t e . 3 3 c The m e a s u r e d k r - j - v a l u e s f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f CO f r o m s u b s t r a t e - b o u n d o f f P450cam (2.8 and 1.7 s - 1 ) 1 0 ' 1 3 3 a a r e s i m i l a r t o t h o s e c a l c u l a t e d f o r t h e s u b s t r a t e - f r e e enzyme and i m p l y t h a t t h e o v e r a l l a f f i n i t y o f t h e P450cam s y s t e m s f o r C0> ( i . e . Kco) i s g o v e r n e d p r i m a r i l y by t h e k v a l u e s a s r e f l e c t e d by t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f t h e camphor s u b s t r a t e . The m e a s u r e d k Q f f v a l u e s a r e a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e k v a l u e s c a l c u l a t e d f r o m t h e k o n e x p r e s s x o n , K c o = r — ( s e e R e a c t i o n I I . 5 ) . The v a l u e o f -TV (- f-k Q £ £ = 1 . 7 S m e a s u r e d by s t o p p e d - f l o w t e c h n i q u e s , 1 0 a l o n g 5 — 1 w i t h t h e Kco = 1.3 x 10 M r e p o r t e d f r o m t h e same l a b o r a t o r y , 1 3 3 a p r o v i d e s a c a l c u l a t e d k = 2.2 x 1 0 5 M 1 S 1 a t 24°C, w h i c h i s on ' c o n s i s t e n t w i t h t h e C O - a s s o c i a t i o n r a t e s r e p o r t e d a t h i g h e r t e r m e r a t u r e s by G u n s a l u s et al.30 The a c t i v a t i o n e n e r g y f o r t h e d i s s o c i a t i o n o f CO f r o m s u b s t r a t e - b o u n d P450cam h a s n o t b e e n m e a s u r e d . 81 C o m p a r i s o n o f m e a s u r e d v a l u e s o f Kco w i t h t h o s e c a l c u l a t e d f r o m t h e r a t i o o f t h e "on" and " o f f " k i n e t i c c o n s t a n t s ( s e e 13 3a R e a c t i o n I I . 5) i s a f f o r d e d by o n l y a s i n g l e s e t o f d a t a . U s i n g t h e k (3.6 x 1 0 5 M _ 1 S _ 1 ) and k ^ v a l u e s (2.8 S - 1 ) ^ o n o f f v a l u e s a t 2 0 ° C , 1 3 3 a t h e c a l c u l a t e d v a l u e o f Kco = 1.3 x 10 M 1 may be c o m p a r e d w i t h t h e m e a s u r e d v a l u e o f 6.6 x 10^ M "*-.i33« To d e t e r m i n e more d e f i n i t i v e l y t h e l e v e l o f a g r e e m e n t b e t w e e n Kco v a l u e s m e a s u r e d i n s t a t i c e x p e r i m e n t s , and t h o s e c a l c u l a t e d f r o m t h e r a t i o o f k and k v a l u e s f o r t h e P450cam s y s t e m , on o f f r e q u i r e s f u r t h e r s t u d y . The k i n e t i c s o f CO b i n d i n g t o m i c r o s o m a l c y t o c h r o m e P450 a p p a r e n t l y c a n n o t be d e s c r i b e d a c c u r a t e l y by R e a c t i o n I I . 5 . K i n e t i c d a t a h a v e b e e n r e p o r t e d i n s e v e r a l s h o r t p a p e r s 1 3 3 ^ < ° if'9 a n d i n g e n e r a l t h e r a t e c o n s t a n t s do n o t a g r e e . The d i s c r e p a n c y i s n o t s u r p r i s i n g b e c a u s e o f t h e v a r i e d c o n d i t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t s and t h e d i f f e r e n t a n i m a l s p e c i e s f r o m w h i c h t h e m i c r o s o m e s w e r e i s o l a t e d . H o w e v e r , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s s t u d y o f Debey et al.,l33a t h e t i m e c o u r s e o f C O - b i n d i n g was r e p o r t e d t o c o n s i s t o f a s i n g l e k i n e t i c p r o c e s s a s d e s c r i b e d f o r t h e b a c t e r i a l enzyme. I n d e e d , t h e k i n e t i c c o n s t a n t s l i s t e d i n T a b l e I I . 2 f o r t h e m i c r o s o m a l P 4 5 0 , o b t a i n e d f r o m e a r l y e x p e r i m e n t s , l33b,h a r e c o m p a r a b l e t o t h o s e o f t h e P450cam s y s t e m s , w h i c h i s s u r p r i s i n g i n v i e w o f t h e h e t e r o g e n e i t y o f m i c r o s o m a l P450 ( s e e S e c t i o n I I . 2) . More r e c e n t l y , l i v e r m i c r o s o m a l P450 h a s b e e n shown t o r e a c t h e t e r o g e n o u s l y w i t h CO, e x h i b i t i n g a t l e a s t t h r e e s p e c i e s d i s t i n g u i s h e d by t h e i r s e c o n d - o r d e r r a t e c o n s t a n t s i f o r CO-82 b i n d i n g . 1 3 3 ^ T h i s k i n e t i c h e t e r o g e n e i t y o f m i c r o s o m a l P450 i s t h o u g h t t o l i e e i t h e r i n t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f t h e h e m o p r o t e i n i t s e l f , o r p e r h a p s i n a n a s y m m e t r i c p l a c e m e n t o f t h e c y t o c h r o m e s w i t h i n t h e m e m b r a n e s . 1 3 3 ^ The a c t i v a t i o n e n e r g y f o r t h e "on" r e a c t i o n h a s b e e n m e a s u r e d by Debey et a Z - . 1 3 3 ^ f o r m i c r o s o m a l P450 (Ea = 8.3 K c a l m o l a n d , a l o n g w i t h t h e c a l c u l a t e d a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s , a p p e a r s t o be s i m i l a r t o t h a t f o r t h e b a c t e r i a l enzyme i n t h e p r e s e n c e o f s u b s t r a t e . C o m p a r i s o n o f t h e P450cam s y s t e m s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g k i n e t i c d a t a f o r C O - b i n d i n g t o m y o g l o b i n and t h e P450 m o d e l c o m p l e x e s ( s e e T a b l e I I . 2) i n d i c a t e s t h a t t h e m a j o r d i f f e r e n c e s l i e i n t h e CO o f f - r a t e s . The CO o n - r a t e s f o r m y o g l o b i n (5.0 x 1 0 5 M _ 1 S _ 1 a t 2 0 ° C , 1 0 9 and 3.8 x 1 0 5 M - 1 S _ 1 ) a t 2 5 ° C 1 5 6 a r e i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e k v a l u e s f o r P450cam on i n t h e p r e s e n c e and a b s e n c e o f s u b s t r a t e , w h i l e t h e CO o n - r a t e f o r t h e P450 m o d e l c o m p l e x e s - ( k o n = i . i x 1 0 5 M _ 1 S - 1 a t 23°C) 5 - 1 - 1 c o m p a r e s w e l l w i t h k Q n = 1 . 3 x 10 M S r e p o r t e d by G u n s a l u s et al.30 a t 15°C f o r t h e c a m p h o r - b o u n d s y s t e m . I n c o n t r a s t , t h e CO o f f - r a t e c o n s t a n t f o r m y o g l o b i n i s up t o 140 t i m e s s m a l l e r t h a n t h e k £ _ v a l u e s f o r t h e P4 50cam s y s t e m and i s a p p r o x i m a t e l y 900 t i m e s s m a l l e r t h a n t h a t f o r t h e c o r r e s p o n d i n g P450 m o d e l c o m p l e x ; t h e o v e r a l l a f f i n i t y f o r CO i s g o v e r n e d by t h e CO o f f - r a t e s . The d i f f e r e n c e s i n t h e CO o f f - r a t e s i s t h o u g h t t o i n d i c a t e t h e e f f e c t s o f a n e l e c t r o n - r i c h heme, p r o v i d e d by t h e p r o x i m a l t h i o l a t e l i g a n d i n b o t h t h e 83 P450cam and P4 50 m o d e l s y s t e m s ( T r a n s E f f e c t s ) . 1 3 3 a I n c r e a s e d a - d e n s i t y due t o t h e t r a n s t h i o l a t e l i g a n d i s t h o u g h t t o r e s u l t i n t h e i n c r e a s e i n CO o f f - r a t e s t h r o u g h a - r e p u l s i o n , t h e CO m o l e c u l e b e i n g u n a b l e t o a c c e p t t h i s e x c e s s e l e c t r o n d e n s i t y . 8 The m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e P450cam s y s t e m s and t h e m o d e l s y s t e m a g a i n l i e s i n t h e CO o f f - r a t e . The s m a l l e r k o f CO-P450cam i s a t t r i b u t e d t o t h e p r o t e i n , o f f w h i c h i m p a r t s some s t a b i l i z i n g e f f e c t u p o n t h e CO-complex. 9 h >° The a c t i v a t i o n e n e r g y f o r b i n d i n g CO t o m y o g l o b i n (Ea = 4.7-7.1 K c a l m o l 1 ) i s somewhat l o w e r t h a n t h e e n e r g y b a r r i e r s u r m o u n t e d by t h e CO m o l e c u l e t o b i n d t o P450cam (Ea =8.5 K c a l m o l "*") b u t a n a l y s i s o f t h e a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s f o r m y o g l o b i n and s u b s t r a t e - b o u n d P450cam shows t h a t , a l t h o u g h t h e AH* v a l u e s a r e more f a v o u r a b l e f o r m y o g l o b i n / t h e AS* v a l u e s i n d i c a t e C O - b i n d i n g i s l e s s f a v o u r a b l e a nd t h a t t h e o v e r a l l t r a n s i t i o n s t a t e i s p r o b a b l y v e r y s i m i l a r i n b o t h p r o t e i n s . T h i s i s r e f l e c t e d i n t h e r e a s o n a b l y s i m i l a r k v a l u e s f o r C O - b i n d i n g on t o b o t h Mb and P4 50cam.- A c t i v a t i o n p a r a m e t e r s f o r s u b s t r a t e -f r e e P4 50cam i n d i c a t e more f a v o u r a b l e C O - b i n d i n g t h a n i n m y o g l o b i n due p r i m a r i l y t o a more f a v o u r a b l e AS* t e r m ; t h i s i s a g a i n r e f l e c t e d i n t h e k v a l u e s . ^ on The i n t e r p r e t a t i o n o f s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s , b a s e d on e q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c d a t a s u c h a s d e s c r i b e d a b o v e f o r t h e i n t e r a c t i o n o f CO w i t h c y t o c h r o m e P 4 5 0 , i s d i f f i c u l t b e c a u s e o f t h e many d i f f e r e n t f a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e i n t e r a c t i o n . 8 ' 1 0 9 A s m e n t i o n e d e a r l i e r , one s t r u c t u r a l f a c t o r , 84 w h i c h i n f l u e n c e s t h e i n t e r a c t i o n o f CO w i t h b o t h t h e P450 enzymes a n d t h e m y o g l o b i n s , i s p r o x i m a l l i g a t i o n p r o v i d e d by t h e p r o t e i n ( T r a n s E f f e c t s ) . The i m p o r t a n t g r o u p s a r e t h e i r o n - b i n d i n g t h i o l a t e l i g a n d i n t h e P450 s y s t e m s and t h e more f a m i l i a r i m i d a z o l e l i g a n d i n t h e g l o b i n s . K i n e t i c and e q u i l i b r i u m d a t a f o r t h e s e h e m o p r o t e i n s do p r o v i d e , h o w e v e r , i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s t r e n g t h o f C O - h e m o p r o t e i n i n t e r a c t i o n w h i c h d e p e n d s , i n t u r n , o n t h e n a t u r e and on • t h e b o nd s t r e n g t h o f t h i s p r o x i m a l l i g a t i o n . The n a t u r e o f t h e h e m e - i r o n - CO b o nd i n t h e s e c o m p l e x e s h a s b e e n d e s c r i b e d i n d e t a i l 8 a s a c o m b i n a t i o n o f a d o n a t i o n f r o m t h e CO m o l e c u l e and d - i T b a c k b o n d i n g f r o m t h e h e m e - i r o n t o t h e CO. The e f f e c t s o f t h e t h i o l a t e l i g a n d on s p e c t r a l as w e l l a s k i n e t i c a nd e q u i l i b r i u m b e h a v i o r o f t h e P450cam s y s t e m , b a s e d on t h e s e a a n d IT e f f e c t s , h a v e b e e n o u t l i n e d p r e v i o u s l y and r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . 1 3 3 1 2 The e f f e c t o f p o r p h y r i n a- a n d IT- e l e c t r o n d e n s i t y on t h e i n t e r a c t i o n o f CO w i t h h e m o p r o t e i n s c a n be i n v e s t i g a t e d u s i n g h e m o p r o t e i n s r e c o n s t i t u t e d w i t h hemes d i f f e r i n g i n t h e s i d e c h a i n s i n p o s i t i o n s 2 a n d 4 ( i . e . meso-, d e u t e r o - , p r o t o - , d i a c e t y l -d e u t e r o - , a n d d i b r o m o d e u t e r o p o r p h y r i n a t o i r o n s p e c i e s ; ( s e e F i g u r e 1 . 3 ) . C h a nges i n a - e l e c t r o n d e n s i t y a t t h e i r o n c e n t e r a r e r e f l e c t e d i n t h e b a s i c i t y o f t h e s e heme g r o u p s , a s m e a s u r e d by p K ^ ; 8 s t r o n g l y b a s i c p o r p h y r i n s ( l a r g e pK^ v a l u e s ) i n c r e a s e a - d e n s i t y a t t h e i r o n c e n t e r . S u c h s t u d i e s a r e t h e r e f o r e d i r e c t e d a t e x p l a i n i n g d i f f e r e n t l i g a n d a f f i n i t i e s i n v a r i o u s h e m o p r o t e i n s w i t h t h e c h a n g e s 85 i n e l e c t r o n d e n s i t y a t t h e l e v e l o f t h e i r o n atom r e s u l t i n g f r o m c h a n g e s i n e l e c t r o n i c s t r u c t u r e o f t h e heme g r o u p and p r o x i m a l l i g a t i o n t o t h e i r o n . The n e t e f f e c t i n t h e hemo6: p r o t e i n w i l l d e p e n d on t h e b a l a n c e b e t w e e n t h e s e f a c t o r s , a s w e l l a s on t h e c o n t r o l t h a t t h e p r o t e i n e x e r t s on t h e p o r p h y r i n t h r o u g h i n t e r a c t i o n w i t h t h e p r o x i m a l l i n k a g e . The e f f e c t on o - e l e c t r o n d e n s i t y on t h e i n t e r a c t i o n o f CO, a s w e l l a s , w i t h c y t o c h r o m e P450 h a s b e e n i n v e s t i g a t e d r e c e n t l y u s i n g h e m e - s u b s t i t u t e d P4 50cam s y s t e m s . 1 0 N a t i v e P450cam was r e c o n s t i t u t e d w i t h meso-, d e u t e r o - , p r o t o - , d i a c e t y l d e u t e r o - and d i b r o m o d e u - t e r o p o r p h y r i r i a t o i r o n s p e c i e s and t h e e q u i l i b r i u m b i n d i n g c o n s t a n t s f o r t h e r e a c t i o n w i t h CO a n d w e r e m e a s u r e d . T a b l e I I . 3 l i s t s CO pK^ v a l u e s f o r e a c h p o r p h y r i n as w e l l as P^ and c o r r e s p o n d i n g Kco v a l u e s f o r e a c h o f t h e r e c o n s t i t u t e d P450cam s y s t e m s . C o r r e s p o n d i n g d a t a f o r m y o g l o b i n h a v e n o t b e e n r e p o r t e d . P^ z and KQ2 v a l u e s f o r r e c o n s t i t u t e d P450cam and m y o g l o b i n s y s t e m s a r e a l s o i n c l u d e d f o r c o m p a r i s o n . E q u i l i b r i u m b i n d i n g d a t a f o r t h e P450cam s y s t e m s a r e f o r t h e s u b s t r a t e -bound enzymes o n l y . A n a l y s i s o f t h e d a t a p r e s e n t e d i n T a b l e I I . 3 i n d i c a t e s t h a t b i n d i n g o f CO t o s u b s t r a t e - b o u n d P4 50cam i s e n h a n c e d w i t h more b a s i c p o r p h y r i n s ( i . e . meso ~ d e u t e r o > p r o t o > d i a c e t y l d e u t e r o > d i b r o m o d e u t e r o ) . 1 0 T h a t i s , t h e h i g h e r pk^ v a l u e s i n d i c a t e i n c r e a s i n g o - e l e c t r o n d e n s i t y a t t h e c e n t r a l i r o n a t o m w h i c h i n t u r n s t r e n g t h e n s t h e C O - h e m o p r o t e i n i n t e r a c t i o n . 8 S u c h c o r r e l a t i o n s a r e i n d i c a t e d f o r some c o b a l t and manganese 86 T a b l e I I . 3 D a t a ( a ) f o r B i n d i n g o f CO a n d 0 2 t o t h e F e r r o u s S t a t e s o f S u b s t r a t e - b o u n d P 4 5 0 c a m 1 0 and M y o g l o b i n 1 0 9 P o r p h y r i n S y s t e m P K 3 Kco (P450cam) ( M _ 1 ) Ko 2 (P4 5 0cam) ( M _ 1 ) K o 2 (Mb) ( M _ 1 ) Meso 5.8 1 . 7 x l 0 5 (4.3) 1 . 5 x l 0 6 ( 0 . D e u t e r o 5.5 1 . 8 x l 0 5 (4.0) 2 . 7 x l 0 5 (2) 2 . 6 x l 0 6 ( 0 . P r o t o 4.8 1 . 3 x l 0 5 (5.5) 2 . 2 x l 0 5 (2.5) l . l x l O 6 ( 0 . D i a c e t y l -d e u t e r o 3.3 5 . 3 x l 04 ( 1 3 . 8 ) 2 . 4 7x10 (20) 5 . 5 x l 05 ( 1 . Di.bromo-d e u t e r o 3.0 4 . 6 x l 04 ( 1 6 . 1 ) 2 . 4 5x10 (22) 5 . 0 x l 0 5 ( 1 . a) Ph (mm Hg) v a l u e s a r e i n b r a c k e t s , -6, Kco v a l u e s c a l c u l a t e d a s s u m i n g 1 mm CO = 1.36x10 M; — 6 K Q 2 v a l u e s c a l c u l a t e d a s s u m i n g 1mm 0 2 = 1.82x10 ; R e f . 1 0 9 87 p o r p h y r i n s y s t e m s , b u t t h e e f f e c t s a r e s m a l l and t h e i n t e r -p l a y o f a and IT e f f e c t i s s u b t l e . 8 C o m p a r i s o n w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g C ^ - b i n d i n g d a t a f o r s u b s t r a t e - b o u n d P450 s y s t e m s and m y o g l o b i n shows t h e same c o r r e l a t i o n o f s t r o n g e r b i n d i n g w i t h l o w e r p o r p h y r i n b a s i c i t y . T h i s i n d i c a t e s t h a t s i m i l a r e l e c t r o n i c f a c t o r s a r e p r o b a b l y o p e r a t i v e f o r b o t h CO- a n d 0^- b i n d i n g . 1 0 I t i s w o r t h n o t i n g t h a t t h e m o s t b a s i c meso s y s t e m s b i n d s CO somewhat l e s s s t r o n g l y t h a n t h e d e u t e r o s y s t e m and t h i s t r e n d i s a l s o f o u n d w i t h 0 2 ~ b i n d i n g t o r e c o n s t i t u t e d P450cam and m y o g l o b i n s y s t e m s . A g a i n e x p l a n a t i o n s b a s e d on 0 a n d IT e f f e c t s a t t h e heme c e n t e r h a v e b e e n o f f e r e d b u t t h e t r e n d i s p o o r l y u n d e r s t o o d . 8 More d e t a i l e d i n t e r p r e t a t i o n o f t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s f o r t h e r e a c t i o n w i t h CO r e q u i r e s e v a l u a t i o n o f t h e e n t h a l p y and e n t r o p y c o n t r i b u t i o n s b y s t u d i e s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s . T h e s e d a t a , a l o n g w i t h a c o m p l e t e s e t o f k i n e t i c c o n s t a n t s and a c t i v a t i o n e n e r g i e s f o r t h e r e a c t i o n o f CO w i t h t h e r e c o n s t i t u t e d P450cam s y s t e m i n t h e p r e s e n c e and a b s e n c e o f t h e camphor s u b s t r a t e , a r e n e e d e d t o f u r t h e r e v a l u a t e t h e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s m a n i f e s t e d by c y t o c h r o m e P 4 5 0 . I n s h o r t , s i n c e no k i n e t i c d a t a h a v e b e e n p u b l i s h e d o n t h e s e r e c o n s t i t u t e d P450cam s y s t e m s t o d a t e , a n e x c e l l e n t o p p o r t u n i t y p r e s e n t s i t s e l f t o s t u d y f u r t h e r t h e i n t e r a c t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e w i t h t h i s enzyme s y s t e m . CHAPTER I I I EXPERIMENTAL PROCEDURES 89 I I I . l S y n t h e s i s o f S u b s t i t u t e d Hemins D e r i v e d f r o m P r o t o h e m i n C h l o r i d e [ ( c h l o r o ) p r o t o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) ] I I I . 1 . 1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n (1) P r o t o h e m i n (1) i s t h e p r o s t h e t i c g r o u p o f h e m o g l o b i n , m y o g l o b i n , many p e r o x i d a s e s , c a t a l a s e , c y t o c h r o m e P450 a n d many o t h e r p r o t e i n s . I t i s t h u s t h e m o s t w i d e l y o c c u r r i n g p o r p h y r i n d e r i v a t i v e f o u n d i n N a t u r e . S y n t h e s e s o f p o r p h y r i n s and h e m i n s d e r i v e d f r o m t h o s e f o u n d i n a n i m a l m a t e r i a l i n v a r i a b l y i n v o l v e p r o t o h e m i n a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l . I n d e e d , t h e s y n t h e s e s o f d e u t e r o - , meso-, d i a c e t y l d e u t e r o - , and d i b r o m o d e u t e r o h e m i n ( s e e F i g u r e 1.3) t o be d e s c r i b e d p r e s e n t l y i n v o l v e p r o t o h e m i n a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l . I n e a c h c a s e , t h e c o r r e s p o n d i n g h e m i n d e r i v a t i v e i s o b t a i n e d t h r o u g h m o d i f i c a t i o n o f t h e v i n y l g r o u p s i n t h e 2 and 4 90 p o s i t i o n s o f t h e p o r p h y r i n p e r i p h e r y o f p r o t o h e m i n (1) : f o r d e u t e r o h e m i n t h e v i n y l g r o u p s a r e r e p l a c e d by h y d r o g e n ; f o r m esohemin t h e v i n y l g r o u p s a r e c o n v e r t e d t o e t h y l g r o u p s , f o r d i a c e t y d e u t e r o h e m i n t h e v i n y l g r o u p s a r e e x c h a n g e d f o r a c e t y l g r o u p s ; and f o r d i b r o m o d e u t e r h e m i n t h e v i n y l g r o u p s a r e r e p l a c e d by b r o m o g r o u p s ( - B r ) . The p r e p a r a t i o n o f t h e s e s u b s t i t u t e d h e m i n s i n v o l v e s e i t h e r d i r e c t c o n v e r s i o n o f t h e v i n y l g r o u p s o r r e p l a c e m e n t o f them by d i r e c t s u b s t i t u t i o n on t h e p o r p h y r i n r i n g . The s y n t h e t i c m e t h o d s t o be d e s c r i b e d h a v e b e e n u s e d f o r many y e a r s a s s t a n d a r d p r o c e d u r e s f o r m o d i f i c a t i o n o f t h e p o r p h y r i n p e r i p h e r y a t t h e 2 and 4 p o s i t i o n s o f p r o t o h e m i n . As w e l l , e a c h o f t h e s u b s t i t u t e d h e m i n s h a v e b e e n f u l l y c h a r a c t e r i z e d 1 3 6 i n t e r m s o f t h e i r p h y s i c a l p r o p e r t i e s . T h e r e f o r e , a l t h o u g h t h e same s t a n d a r d p r e p a r a t i v e m e t h o d s a r e u s e d t o s y n t h e s i z e t h e f o u r m o d i f i e d h e m i n s , c h a r a c t e r i z a t i o n was l i m i t e d t o s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s i s i n t h e v i s i b l e r e g i o n (400-700nm) o f t h e p y r i d i n e hemochrome c o m p l e x o f e a c h h e m i n ( s e e S e c t i o n I I I . 1 . 3 ) . A b s o l u t e a b s o r p t i o n p e a k maxima (X ) and m i l l i -^ c max m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t ( £ m M ) d a t a o b t a i n e d e x p e r i m e n t a l l y w e r e c o m p a r e d w i t h d a t a r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h ese d a t a a r e l i s t e d f o l l o w i n g t h e p r e p a r a t i v e method o f e a c h h e m i n . I n a l l c a s e s , X and e v a l u e s o b t a i n e d max mM e x p e r i m e n t a l l y w e r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e . T h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . . (TLC) on s i l i c a g e l a n d p o l y a m i d e was a l s o u s e d t o a s s e s s t h e p . u r i t y o f e a c h h e m i n . 91 I I I . 1 . 2 M a t e r i a l s R e a g e n t s w e r e o b t a i n e d a s f o l l o w s : f r o m A l l i e d C h e m i c a l C a n a d a L t d . , g l a c i a l a c e t i c a c i d : f r o m A m e r i c a n S c i e n t i f i c a n d C h e m i c a l C o ., c o n c e n t r a t e d ammonium h y d r o x i d e (NH^OH), f e r r o u s c h l o r i d e , f e r r o u s s u l p h a t e , c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d ( H C 1 ) , p o t a s s i u m h y d r o x i d e (KOH), p y r i d i n e , a n d s o d i u m h y d r o x i d e (NaOH); f r o m C a l e d o n L a b o r a t o r i e s L t d . , b e n z e n e ; f r o m E a s t m a n Kodak Co., a c e t o n e , c h l o r o f o r m , N , N 1 - d i m e t h y l f o r m a m i d e (DMF), m e t h a n o l , a n d p r o p i o n i c a c i d ; f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c Co., a c e t i c a n h y d r i d e , b r o m i n e , h y d r o -b r o m i c a c i d ( 4 8 % ) , r e s o r c i n o l , s o d i u m d i t h i o n i t e ( N a 2 S 2 0 ^ ) a n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e and a n h y d r o u s s t a n n i c c h l o r i d e ( S n C l ^ ) ; f r o m M a l l i n c k r o d t , a n h y d r o u s d i e t h y l - e t h e r , a n d s o d i u m t a r t r a t e AR; f r o m MCB, ammonium a c e t a t e , f o r m i c a c i d (88%) a n d p a l l a d i u m o x i d e (PdO x H 2 0 ) ; a n d f r o m S i g m a C h e m i c a l Co., p r o t o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) ( p r o t o h e m i n ) . A l l s o l v e n t s w e r e u s e d d i r e c t l y w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . H y d r o g e n g a s ( H 2 ) a n d g a s e o u s h y d r o c h l o r i c a c i d w e r e o b t a i n e d f r o m M a t h e s o n o f Canada L t d . a nd w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . P u r i f i e d a r g o n , o b t a i n e d f r o m C a n a d i a n L i q u i d A i r L t d . , was f u r t h e r p u r i f i e d by p a s s i n g i t t h r o u g h a c o p p e r c a t a l y s t ( F i s h e r ) h e a t e d t o 50°C t o remove t r a c e o x y g e n a n d t h e n t h r o u g h two d r y i n g t u b e s c o n t a i n i n g f r e s h p h o s p h o r o u s p e n t o x i d e (M.C.B.), a nd s o d i u m h y d r o x i d e p e l l e t s w i t h I n d i c a t i n g D r i e r i t e ( F i s h e r ) . 92 A n a l y t i c a l t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y (TLC) was p e r f o r m e d on s i l i c a g e l ( P r e c o a t e d E a s t m a n C h r o m a t o g r a m s h e e t s ) and p o l y a m i d e ( P o l y g r a m P o l y a m i d e - 6 , 0.1 mm) a v a i l a b l e f r o m t h e E a s t m a n Kodak Co., and B r i n k m a n , r e s p e c t i v e l y . 93 I I I . 1 . 3 S p e c t r o p h o t o m e t r i e A n a l y s i s o f P y r i d i n e Hemochromes U l t r a v i o l e t and v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a w e r e r e c o r d e d on a C a r y 17D s p e c t r o p h o t o m e t e r a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C). Q u a r t z c e l l s ( H e l l m a ) o f p a t h l e n g t h 0.1 and 1 cm w e r e u s e d . As m e n t i o n e d i n S e c t i o n I I I . 1.1, t h e s u b s t i t u t e d h e m i n d e r i v a t i v e s w e r e c h a r a c t e r i z e d a s t h e p y r i d i n e hemochrome s p e c i e s . 1 3 1 a The hemochromes a r e c o m p l e x e s f o r m e d b y t h e c o o r d i n a t i o n o f two m o l e c u l e s o f a b a s e t o a f e r r o u s p o r p h y r i n (heme); t h e heme m o l e c u l e i s c o o r d i n a t e d by two p y r i d i n e m o l e c u l e s i n t h e p y r i d i n e hemochrome c o m p l e x e s . The hemochromes p r o d u c e s h a r p a n d c h a r a c t e r i s t i c t h r e e -b a n d e d v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r a c o n s i s t i n g o f a s t r o n g S o r e t a b s o r p t i o n p e a k a t =400nm and two w e a k e r a b s o r p t i o n maxima ( i . e . t h e a and 3 b a n d s ) b e t w e e n 500 and 600nm. The p o s i t i o n and i n t e n s i t y o f t h e s e b a n d s a r e e x t r e m e l y s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n t h e p o r p h y r i n s k e l e t o n , s u c h a s p e r i p h e r a l m o d i f i c a t i o n s a t t h e 2 - , 4 - v i n y l g r o u p s o f p r o t o -h e m i n , a s w e l l a s t o t h e p u r i t y o f t h e h e m i n s a m p l e . T h e r e f o r e , t h e s a m p l e s o f d e u t e r o - , meso-, d i a c e t y l d e u t e r o - , a n d d i b r o m o d e u t e r o h e m i n s y n t h e s i z e d f r o m p r o t o h e m i n w e r e i d e n t i f i e d r e a d i l y b y t h i s m e t h o d . I n p r a c t i c e , t h e p y r i d i n e hemochrome s p e c t r a w e r e m e a s u r e d i n a q u e o u s a l k a l i n e p y r i d i n e s o l u t i o n s a f t e r r e d u c t i o n w i t h s o l i d s o d i u m d i t h i o n i t e (l&a,^^^), a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f P a u l et a Z . 1 3 8 The hemochrome was p r e p a r e d by m i x i n g 2.OmL o f 0.ImM NaOH, 0.5mL p y r i d i n e a n d 2 5yL o f a p y r i d i n e - h e m e s o l u t i o n made up by d i s s o l v i n g - lmg o f he m i n i n lmL o f p y r i d i n e . The f i n a l h e m i n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e - 1 x 10 ~*M, w h e r e a s t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f NaOH a n d p y r i d i n e w e r e 0.079 N and 2.2M r e s p e c t i v e l y ; s u c h c o n d i t i o n s h a v e b e e n f o u n d s a t i s f a c t o r y f o r t h e p r o d u c t i o n o f t h e p y r i d i n e hemochrome s p e c i e s . 1 3 l a The r e a c t i o n c o m p o n e n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o a 1cm q u a r t z c e l l (maximum v o l u m e , 3mL), d e g a s s e d by p u r g i n g t h e s o l u t i o n s w i t h a r g o n , and f i n a l l y , r e d u c e d by t h e a d d i t i o n o f ? lmg o f Na2S20^. Hemochrome f o r m a t i o n was a l m o s t i n s t a n t a n e o u s a s i n d i c a t e d by t h e r a p i d c o l o r c h a n g e o f t h e s o l u t i o n ; o n r e d u c t i o n t h e s o l u t i o n c h a n g e d f r o m brown t o r e d . The c e l l was i m m e d i a t e l y s t o p p e r e d and t h e v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o b t a i n e d . A l l hemochrome s p e c t r a w e r e r u n a g a i n s t a m a t c h e d 1cm q u a r t z r e f e r e n c e c e l l c o n t a i n i n g t h e p y r i d i n e - N a O H s o l v e n t a n d ^ 2 8 2 0 ^ . C e l l s c o n t a i n i n g o n l y t h e p y r i d i n e - N a O H s o l v e n t s y s t e m a n d Na2S20^ w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e b a s e l i n e a b s o r p t i o n b e f o r e t h e hemochrome s p e c t r a w e r e o b t a i n e d . I f a p a r t i c u l a r l y c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n o f t h e hemochrome was p r e p a r e d , 0.1cm q u a r t z c e l l s w e r e u s e d t o m e a s u r e t h e s t r o n g S o r e t a b s o r p t i o n maxima. The m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e d e t e r m i n e d by d i r e c t s p e c t r o s c o p i c m e a s u r e m e n t and c o m p a r e d t o l i t e r a t u r e d a t a . 95 I I I . 1 . 4 D e u t e r o h e m i n (2) (CH 2) 2COOH H (CH 2) 2COOH H (2) C r u d e d e u t e r o h e m i n was p r e p a r e d f r o m p r o t o h e m i n by t h e r e s o r c i n o l m e l t p r o c e d u r e d e s c r i b e d by D i n e l l o and C h a n g . 1 3 6 a F i v e grams o f p r o t o h e m i n ( d a r k b l u e c r y s t a l s ) and f i f t e e n grams o f r e s o r c i n o l ( f l a k y w h i t e s o l i d ) w e r e m i x e d t o g e t h e r and p l a c e d i n a 250mL r o u n d - b o t t o m f l a s k . The f l a s k was k e p t u n d e r an a i r c o n d e n s e r i n a n o i l - b a t h a t 140° - 150°C. The m i x t u r e becomes l i q u i d a t =110°C ( i . e . t h e m e l t i n g p o i n t o f r e s o r c i n o l ) b u t t h e s o l u t i o n d o e s n o t r e f l u x a s a l i q u i d . I n s t e a d , t h e r e s o r c i n o l c r y s t a l l i z e s on t h e w a l l s o f t h e f l a s k and e v e n t u a l l y , t h e w h i t e s o l i d f a l l s b a c k i n t o t h e s o l u t i o n . The p r o g r e s s o f t h e r e a c t i o n was m o n i t o r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y by w i t h d r a w i n g an a l i q u o t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e and p r e p a r i n g t h e p y r i d i n e hemochrome s p e c i e s ( s e e S e c t i o n I I I . 1 . 3 ) . The v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m was t h e n c o m p a r e d w i t h t h a t o f t h e p r o t o h e m i n p y r i d i n e hemochrome ( T a b l e I I I . l ) . C o m p l e t i o n o f t h e r e a c t i o n was d e t e r m i n e d by t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e p r o t o h e m i n p y r i d i n e hemochrome s p e c t r u m . The r e a c t i o n was c o m p l e t e a f t e r 45 m i n . A f t e r c o o l i n g t o room t e m p e r a t u r e , t h e b l a c k t a r - l i k e mass was t r i t u r a t e d w i t h d i e t h y l - e t h e r a n d t h e s o l i d c o l l e c t e d b y s u c t i o n f i l t r a t i o n w i t h a f i n e s i n t e r e d - g l a s s f u n n e l . The s o l i d was washed f u r t h e r w i t h d i e t h y l - e t h e r u n t i l t h e f i l t r a t e was c l e a r , a nd t h e n a i r d r i e d . The y i e l d o f t h e c r u d e brown d e u t e r o h e m i n was q u a n t i t a t i v e . P r i o r t o f u r t h e r u s e i n t h e p r e p a r a t i o n o f d i a c e t y l d e u t e r o - ( S e c t i o n I I I . 1 . 6 ) and d i b r o m o d e u t e r o h e m i n s ( s e e S e c t i o n I I I . 1 . 7 ) , t h e c r u d e d e u t e r o h e m i n was s t o r e d i n t h e d a r k a t -0°C. P u r i f i e d d e u t e r o h e m i n , o n t h e o t h e r h a n d , was o b t a i n e d i n h i g h y i e l d s f o l l o w i n g t h e m e t h o d d e v e l o p e d by D i n e l l o a nd C h a n g . 1 3 6 a S i x h u n d r e d m i l l i g r a m s o f t h e c r u d e d e u t e r o h e m i n w e r e d i s s o l v e d i n m i n i m a l p y r i d i n e (- 2mL) a n d a p p l i e d t o a s i l i c a - g e l t h i c k l a y e r p l a t e ( A n a l t e c h I n c . 2mm t h i c k ) . The p l a t e was d r i e d u s i n g a s t r e a m o f warm a i r f r o m a h e a t g u n . The d r y p r e l o a d e d s i l i c a g e l was s c r a p e d o f f t h e p l a t e a n d t h o r o u g h l y p o w d e r e d . M e a n w h i l e , 90g o f p o l y a m i d e powder ( M a c h e r y a n d N a g e l , 0.07mm a v a i l a b l e f r o m B r i n k m a n ) was s l u r r i e d i n b e n z e n e - m e t h a n o l - f o r m i c a c i d (BMF) 110:30:1 ( v / v / v ) and p o u r e d i n t o a c o l u m n 2.5cm i n d i a m e t e r and 9 0cm h i g h . The c o l u m n was p a c k e d and e q u i l i b r a t e d w i t h a t l e a s t 500mL 97 s o l v e n t a t a f l o w - r a t e o f 6-9mL/min u s i n g N 2 p r e s s u r e . H i g h e r t h a n n o r m a l f l o w - r a t e s o f a b o u t l m L / m i n r e d u c e s t h e amount o f e s t e r i f i c a t i o n d u r i n g c o l u m n e l u t i o n t h a t t a k e p l a c e due t o t h e p r e s e n c e o f m e t h a n o l and a n a c i d c a t a l y s t ( i . e . f o r m i c a c i d ) . 1 5 3 a A l a y e r o f s o l v e n t 5-10cm was l e f t o v e r t h e t o p o f t h e c o l u m n . The s i l i c a g e l l o a d e d w i t h c r u d e d e u t e r o h e m i n was p o u r e d d i r e c t l y on t o p o f t h e c o l u m n u s i n g a powder f u n n e l (100mm d i a m e t e r ) e q u i p p e d w i t h an e x t e n d e d s h a f t (- 20cm). I f t h e s h a f t o f t h e f u n n e l was h e l d j u s t a b o v e t h e u p p e r s o l v e n t l e v e l on t h e c o l u m n a n d , i f a s u f f i c i e n t l a y e r o f s o l v e n t (- 10cm) was l e f t o v e r t h e c o l u m n b e d , t h e t o p o f t h e p o l y a m i d e b e d was u n d i s t u r b e d and t h e l o a d e d s i l i c a g e l s e t t l e d e v e n l y . The f u n n e l was r i n s e d t h o r o u g h l y w i t h e l u t i n g s o l v e n t . The l i q u i d l e v e l was b r o u g h t t o t h e t o p o f t h e c o l u m n and t h e c o l u m n was e l u t e d a t 6-9mL/min w i t h BMF (110:30:1) . The c r u d e d e u t e r o h e m i n s e p a r a t e d i n t o two b a n d s . The f i r s t , w h i c h was e l u t e d f r o m p o l y a m i d e b e f o r e d e u t e r o h e m i n , was p r e s e n t a s a s m a l l p i n k b a n d t h a t was c o l l e c t e d and d i s c a r d e d . The s e c o n d b a n d , w h i c h c o n t a i n e d d e u t e r o h e m i n , e l u t e d more s l o w l y a s a m a j o r d a r k brown b a n d . The f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o d e u t e r o h e m i n f r o m t h e a b o v e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w e r e t a k e n t o d r y n e s s and d i s s o l v e d i n 1.5mL p y r i d i n e . C h l o r o f o r m (3mL) was a d d e d and t h e s o l u t i o n was f i l t e r e d t h r o u g h a p i p e t t e c o n t a i n i n g g l a s s w o o l i n t o a 50mL r o u n d - b o t t o m f l a s k . The g l a s s w o o l 98 was washed w i t h two 1.35mL p o r t i o n s o f p y r i d i n e - c h l o r o f o r m 3 5 :100. The p y r i d i n e - c h l o r o f o r m s o l u t i o n o f d e u t e r o h e m i n was t h e n h e a t e d t o b o i l i n g a n d 35mL b o i l i n g a c e t i c a c i d w e r e a d d e d . C o n c e n t r a t e d HC1 (0.3 5mL) was a d d e d a n d t h e s o l u t i o n a g a i n h e a t e d t o b o i l i n g . D e u t e r o h e m i n c h l o r i d e ( ( c h l o r o ) d e u t e r o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) ) was r e c o v e r e d by s u c t i o n f i l t r a t i o n a f t e r s t a n d i n g o v e r n i g h t t o c o m p l e t e c r y s t a l l i z a t i o n . The y i e l d o f c r y s t a l l i n e d e u t e r o h e m i n ( d a r k b l u e c r y s t a l s ) f r o m 600mg o f c r u d e m a t e r i a l was 250mg o r 4 2 % f r o m p r o t o h e m i n . The c r y s t a l l i n e h e m i n showed a s i n g l e s p o t on TLC on s i l i c a g e l (BMF 110:30:1) a n d p o l y a m i d e (BMF 110:30:1 a n d m e t h a n o l -a c e t i c a c i d 1 0 0 : 2 ) . T a b l e I I I . l l i s t s a b s o r b a n c e d a t a f o r t h e p y r i d i n e hemochrome o f d e u t e r o h e m i n as w e l l a s p r o t o -h e m i n , w h i l e F i g u r e I I I . l shows t h e a b s o l u t e a b s o r p t i o n s p e c t r u m of t h e d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. 99 T a b l e I I I . l A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochromes D e r i v e d f r o m P r o t o - a n d D e u t e r o h e m i n . Heme max(nm) emM S o r e t Band 3 max a max P r o t o - ( a ) A 418 .5 526 557 e 191.4 17.5 34 .4 D e u t e r o - ^ A 405.5 514 544 £ 134 .6 18 .3 26.4 D e u t e r o - A 406 514 544 e 135 18 .8 25 a) P u b l i s h e d A and e v a l u e s f o r t h e p r o t o - a n d max mM c d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochromes; R e f . l 3 6 a . b) E x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d A and e v a l u e s f o r t h e ' r j. m a x mM d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. F i g u r e I I I . l A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. H o o 101 I I I .1.5 M e s o h e m i n (• 3 ) C r u d e mesohemin was p r e p a r e d by m e t a l i a t i o n o f meso-p o r p h y r i n f r e e a c i d by t h e method o f A d l e r et a Z . 1 3 9 M e s o p o r p h y r i n f r e e a c i d was s y n t h e s i z e d f r o m p r o t o h e m i n by t h e m e thod d e s c r i b e d by Caughey et a Z - . 1 3 6 f e The method i n v o l v e d t h e s i m u l t a n e o u s r e d u c t i o n o f t h e v i n y l s i d e c h a i n s t o e t h y l g r o u p s w i t h h y d r o g e n g a s ( I ^ ) / a nd r e m o v a l o f i r o n t h r o u g h t h e a c t i o n o f f o r m i c a c i d . P a l l a d i u m o x i d e (PdO) was u s e d a s t h e r e d u c i n g c a t a l y s t . F e r r o u s p r o t o h e m i n was i n i t i a l l y f o r m e d by t h e r e d u c t i o n o f F e ( I I I ) t o F e ( I I ) . o S i n c e F e ( I I ) h a s a l a r g e r i o n i c r a d i u s , 0.74A, c o m p a r e d o w i t h t h a t o f F e ( I I I ) , 0 . 6 4 A , £e(II) was more r e a d i l y d i s s o c i a t e d f r o m t h e p o r p h y r i n m a c r o c y c l e , and t h u s p r o t o -p o r p h y r i n I X was o b t a i n e d i n i t i a l l y . The f i n a l m e s o p o r p h y r i n I X 102 was o b t a i n e d by c a t a l y t i c h y d r o g e n a t i o n o f t h e v i n y l g r o u p s o f p r o t o p o r p h y r i n IX. P r o t o h e m i n (2.0g) was s u s p e n d e d i n f o r m i c a c i d ( 9 0 % ; 165mL) c o n t a i n i n g p a l l a d i u m o x i d e (500mg) i n a 250mL two-n e c k e d r o u n d - b o t t o m f l a s k f i t t e d w i t h a r e f l u x c o n d e n s e r a n d a f i n e g l a s s f r i t f o r p u r g i n g t h e s o l u t i o n w i t h h y d r o g e n g a s . The m i x t u r e was m a i n t a i n e d a t 94-98°C f o r l h w h i l e t h e H 2 g a s was p a s s e d t h r o u g h t h e m i x t u r e . The p r o g r e s s o f t h e r e a c t i o n was a g a i n f o l l o w e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y by w i t h d r a w i n g a n a l i q u o t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e and t h e n d i l u t i n g w i t h f o r m i c a c i d . K T h e v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m was t h e n c o m p a r e d w i t h t h a t o f p r o t o p o r p h y r i n IX ( F i g u r e s I I I . 2 and I I I . 3 ) . C o m p l e t i o n o f t h e r e a c t i o n was d e t e r m i n e d by t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e p r o t o p o r p h y r i n IX s p e c t r u m . The p a l l a d i u m o x i d e was f i l t e r e d o f f u s i n g a s i n t e r e d g l a s s f u n n e l o f f i n e p o r o s i t y , and was w a s h ed w i t h f o r m i c a c i d . The f i l t r a t e was t h e n p o u r e d i n t o 3 0% ammonium a c e t a t e s o l u t i o n (600mL) w i t h e f f i c i e n t s t i r r i n g . A f t e r b e i n g a l l o w e d t o s t a n d f o r 4 5 m i n , t h e p r e c i p i t a t e was c o l l e c t e d by c e n t r i -f u g a t i o n a t 10,000rpm u s i n g a S e r v a l l RC2 r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h an SS-34 r o t o r h e a d and w a s h ed r e p e a t e d l y w i t h d e i o n i z e d w a t e r . The p r e c i p i t a t e was t a k e n up i n 2% a q u e o u s ammonia s o l u t i o n (14 0mL) t o g i v e a b rown s o l u t i o n . The d i s o d i u m s a l t o f mesohemin was " s a l t e d o u t " w i t h 30% s o d i u m t a r t r a t e s o l u t i o n (20mL). The p r e c i p i t a t e was c o l l e c t e d by c e n t r i f u g a t i o n a n d , i f t h e s u p e r n a t a n t r e m a i n e d b r o w n , t h e a b o v e p r o c e d u r e was r e p e a t e d . Figure III.2 Absorption spectrum of protoporphryin IX i n formic a c i d . 548 Figure III.3 Absorption spectrum of mesoporphyrin IX i n formic a c i d . o 104 The s o d i u m s a l t was c o n v e r t e d t o m esohemin d i h y d r o -c h l o r i d e a s d e s c r i b e d by C o r w i n et al.lkQ by t h e a d d i t i o n o f b o i l i n g 25% h y d r o c h l o r i c a c i d (120mL) t o t h e p r e c i p i t a t e i n t h e c e n t r i f u g e t u b e s . The s o l i d d i s s o l v e d i n s t a n t l y and c r y s t a l s o f t h e d i h y d r o c h l o r i d e f o r m e d a l m o s t i m m e d i a t e l y . The c r y s t a l l i n e m e s o p o r p h y r i n d i h y d r o c h l o r i d e was c o l l e c t e d by f i l t r a t i o n , w a s h e d w i t h a l i t t l e 2.5% h y d r o c h l o r i c a c i d s o l u t i o n , and d r i e d i n a i r . The b r o w n s o l i d was s t o r e d a t -0°C. The y i e l d o f c r u d e m e s o p o r p h y r i n d i h y d r o c h l o r i d e was q u a n t i t a t i v e . The v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m i n . c h l o r o f o r m e x h i b i t e d p e a k s o f 400, 496, 530, 566 and 620nm ( L i t e r a t u r e v a l u e s : 4 0 0 , 4 9 9 , 5 3 3 , 567 and 621nm; R e f . 1 3 6 a ) . M e t a l i a t i o n o f t h e m e s o p o r p h y r i n d i h y d r o c h l o r i d e was c a r r i e d o u t i n r e f l u x i n g N , N ' - d i m e t h y l f o r m a m i d e (DMF) i n t h e p r e s e n c e o f f e r r o u s c h l o r i d e . 1 3 9 R e a g e n t g r a d e DMF (200mL) was b r o u g h t t o r e f l u x i n a 500mL r o u n d - b o t t o m f l a s k e q u i p p e d w i t h a r e f l u x c o n d e n s e r . The s o l v e n t was h e a t e d o n a s t i r r i n g h o t p l a t e . The m e s o p o r p h y r i n d i h y d r o c h l o r i d e p r e p a r e d by t h e a b o v e p r o c e d u r e was a d d e d and t h e m i x t u r e a l l o w e d t o s t i r f o r 5 m i n f o r c o m p l e t e s o l u t i o n o f t h e p o r p h y r i n . Two m o l e e q u i v a l e n t s o f f e r r o u s c h l o r i d e (760mg) w e r e p o w d e r e d and t h e n a d d e d t o t h e s o l u t i o n . A f t e r a few m i n u t e s , c o m p l e t i o n o f t h e r e a c t i o n was c h e c k e d by t h e l o s s o f t h e f r e e p o r p h y r i n ' s r e d f l u o r e s c e n c e u n d e r l o n g wave u l t r a v i o l e t l i g h t , and s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y by w i t h d r a w i n g a s m a l l a l i q u o t f o r a n a l y s i s o f t h e mesohemin p y r i d i n e hemochrome. The m e t a l a t i o n r e a c t i o n was c o m p l e t e i n 5 m i n . 105 The r e a c t i o n v e s s e l was r e m o v e d f r o m t h e h o t p l a t e a n d c o o l e d t o room t e m p e r a t u r e . Once c o o l e d , t h e r e a c t i o n m i x t u r e was a d d e d t o a n i c e w a t e r b a t h (500mL) w i t h s t i r r i n g a n d t h e r e s u l t i n g p r e c i p i t a t e f i l t e r e d o n a B u c h n e r f u n n e l u n t i l t h e f i l t r a t e was c l e a r . The f i l t e r e d m a t e r i a l was w a s h e d w i t h w a t e r a nd a i r d r i e d . The y i e l d o f c r u d e mesohemin was q u a n t i t a t i v e . C r u d e mesohemin (600mg) was p u r i f i e d by c h r o m a t o g r a p h y o n p o l y a m i d e a s d e s c r i b e d f o r d e u t e r o h e m i n i n S e c t i o n I I I . 1.4 e x c e p t t h a t t h e s o l v e n t s y s t e m u s e d was BMF 1 1 0 : 1 5 : 1 . T h r e e i m p u r i t i e s w e r e p r e s e n t i n t h e mesohemin d i h y d r o c h l o r i d e s a m p l e . The f i r s t t w o , w h i c h e l u t e d f r o m p o l y a m i d e b e f o r e m e sohemin, a p p e a r e d a s a f a s t r u n n i n g r e d and a s l o w e r r u n n i n g p i n k b a n d . T h e s e w e r e c o l l e c t e d b u t w e r e n o t i d e n t i f i e d . The t h i r d i m p u r i t y , a l i g h t b r own b a n d , e l u t e d f r o m t h e c o l u m n a f t e r t h e d a r k b r o w n mesohemin b a n d . The i m p u r i t y was d i s -c a r d e d . The m a i n p r o d u c t f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d , t a k e n t o d r y n e s s , and c r y s t a l l i z e d a s d e s c r i b e d f o r d e u t e r h e m i n (s e e S e c t i o n I I I . 1 . 4 ) . The y i e l d o f mesohemin c h l o r i d e ( c h l o r o ) m e s o p o r p h y r i n a t o i r o n ( I I I ) was 330mg o r 55% f r o m p r o t o h e m i n . TLC o n s i l i c a g e l (BMF 110:30:1) showed a s i n g l e s p o t as d i d p o l y a m i d e TLC (BMF 110:30:1 and m e t h a n o l - a c e t i c a c i d 1 0 0 : 2 ) . T a b l e I I I . 2 l i s t s a b s o r b a n c e d a t a f o r t h e p y r i d i n e hemochrome o f mesohemin w h i l e F i g u r e I I I . 4 shows t h e a b s o l u t e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e mesohemin p y r i d i n e hemochrome. 106 T a b l e I I I . 2 A b s o r b a n c e d a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m M e s o h e m i n . Heme X max £mM (nm)' S o r e t Band 3 max a max M e s o - a X 408 516 546 e 139.5 20.9 35.8 b Meso- X 408 516 546 £ 140 21 34 a) P u b l i s h e d X and e v a l u e s f o r t h e mesohemin max mM p y r i d i n e hemochrome; R e f . 1 3 6 a . b) E x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d A and e v a l u e s f o r u max mM t h e mesohemin p y r i d i n e hemochrome. 108 I I I . 1. 6 D i a c e t y l d e u t e r o h e m i n (4) M C r u d e d i a c e t y d e u t e r o h e m i n was p r e p a r e d f r o m c r u d e d e u t e r o h e m i n ( s e e S e c t i o n I I I . 1 . 4 ) u s i n g t h e o r i g i n a l m ethod o f F i s c h e r , 1 4 1 a s m o d i f i e d b y D i n e l l o a n d C h a n g . 1 3 6 a One gram c r u d e d e u t e r o h e m i n was d i s s o l v e d i n 200mL a c e t i c a n h y d r i d e i n a 5 00mL r o u n d - b o t t o m f l a s k f i t t e d w i t h a d r y i n g t u b e a n d e q u i p p e d w i t h a m a g n e t i c s t i r r i n g b a r . The f l a s k was p l a c e d i n an i c e w a t e r b a t h a n d t h e t e m p e r a t u r e b r o u g h t t o 0°C w i t h s t i r r i n g . F o u r t e e n m i l l i l i t r e s o f a n h y d r o u s S n C l ^ w e r e t h e n c a r e f u l l y a d d e d w i t h s t i r r i n g a n d t h e s o l u t i o n a l l o w e d t o s t i r i n t h e i c e w a t e r b a t h f o r 7 m i n . L o n g e r r e a c t i o n t i m e s r e s u l t ' i n s u b s t a n t i a l d e c o m p o s i t i o n and s h o r t e r t i m e s g i v e s u b s t a n t i a l amounts o f t h e m o n o - a c e t y l a t e d p r o d u c t . 1 3 6 a The r e a c t i o n m i x t u r e was t h e n c a r e f u l l y p o u r e d i n t o 4 00mL o f a m i x t u r e o f i c e a n d 1M HC1. The r e s u l t a n t m i x t u r e was a l l o w e d 109 t o s t i r f o r 2h t o d e s t r o y e x c e s s a c e t i c a n h y d r i d e . The c r u d e p r o d u c t was t h e n r e c o v e r e d b y s u c t i o n f i l t r a t i o n , w ashed w i t h w a t e r , and a i r d r i e d . The y i e l d was q u a n t i t a t i v e . C r u d e d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n (400mg) was p u r i f i e d by p o l y -a m i de c h r o m a t o g r a p h y a s d e s c r i b e d f o r d e u t e r o h e m i n ( s e e S e c t i o n I I I . 1.4) e x c e p t t h a t m e t h a n o l - a c e t i c a c i d 100:2 was u s e d a s t h e s o l v e n t s y s t e m . F i v e b a n d s w e r e d e t e c t e d o n t h e c o l u m n . D i a c e t y l d e u t e r o h e m i n was t h e l e a s t m o b i l e compound. The f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e m a i n b a n d w e r e c o l l e c t e d , e v a p o r a t e d t o a v o l u m e o f lOmL, a n d p r e c i p i t a t e d w i t h w a t e r . The h e m i n was f i l t e r e d a n d a i r d r i e d f o r 3 0 m i n , t h e n w a s h ed w i t h e t h e r and vacuum d r i e d o v e r n i g h t . The y i e l d was 12 0mg o r 30% f r o m p r o t o h e m i n . D i a c e t y l d e u t e r o h e m i n i s t o o s o l u b l e t o c r y s t a l l i z e u s i n g t h e p r o c e d u r e w i t h p y r i d i n e , c h l o r o f o r m , a c e t i c a c i d , a n d HC1, as d e s c r i b e d f o r c r y s t a l l i z a t i o n o f d e u t e r o h e m i n ( s e e S e c t i o n I I I . 1 . 4 ) . S u b s t i t u t i o n o f p r o p i o n i c a c i d f o r a c e t i c a c i d g a v e c r y s t a l l i n e d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n , b u t n e a r l y h a l f o f t h e p u r e m a t e r i a l r e m a i n e d i n s o l u t i o n . A t t e m p t s t o w o r k up t h e m o t h e r l i q u o r r e s u l t e d i n s u b s t a n t i a l d e c o m p o s i t i o n . The c r y s t a l l i n e d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n showed a s i n g l e s p o t on TLC o n s i l i c a g e l (BMF 110:30:1) a n d p o l y a m i d e (BMF 110:30:1 and m e t h a n o l - a c e t i c a c i d 1 0 0 : 2 ) . T a b l e I I I . 3 l i s t s a b s o r b a n c e d a t a f o r t h e p y r i d i n e hemochrome o f d i a c e t y l d e u t e r h e m i n , w h i l e F i g u r e I I I . 5 shows t h e a b s o l u t e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. 110 T a b l e I I I . 3 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m D i a c e t y l d e u t e r o h e m i n Heme max(nm) emM S o r e t Band 0 max a max D i a c e t y l ^ A 439 540 574 d e u t e r o (a) e 115 12.6 13 .8 D i a c e t y l -d e u t e r o (b) A 439 537 573 e 110 13.8 16.5 a) P u b l i s h e d A and e v a l u e s f o r t h e d i a c e t y l d e u t e r o -max mM J h e m i n p y r i d i n e hemochrome; R e f . 1 3 6 a . b) E x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d A a n d e ... v a l u e s f o r t h e 1 * J max :.mM d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. 300 400 500 600 700 Wavelength (nm) F i g u r e I I I . 5 A b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d i a c e t y l d e u t e r o -h e m i n p y r i d i n e hemochrome. H I l l . 1 . 7 D i b r o m o d e u t e r o h e m i n (5) 112 (5) D i b r o m o d e u t e r o h e m i n was p r e p a r e d f r o m c r u d e d e u t e r o h e m i n (s e e S e c t i o n I I I . 1 . 4 ) u s i n g a f o u r s t e p p r o c e d u r e . D e u t e r o -p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r , p r o d u c e d b y d e m a t a l l a t i o n and e s t e r i f i -c a t i o n o f c r u d e d e u t e r o h e m i n , was b r o m i n a t e d and t h e n p u r i f i e d . The h e m i n was t h e n p r e p a r e d by i n s e r t i o n o f i r o n i n t o t h e p u r i f i e d d i b r o m o d e u t e r o - p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r f o l l o w e d by h y d r o l y s i s o f t h e e s t e r g r o u p s . D e u t e r o p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r was p r e p a r e d f r o m c r u d e d e u t e r o h e m i n by t h e method o f Caughey et al.13&^ w h i c h i n v o l v e d s i m u l t a n e o u s i r o n r e m o v a l and e s t e r i f i c a t i o n w i t h m e t h a n o l . One gram o f c r u d e d e u t e r o h e m i n was s u s p e n d e d i n a m i x t u r e o f p y r i d i n e (2.5mL) a n d c h l o r o f o r m (lOmL) i n a 250mL t w o - n e c k e d r o u n d - b o t t o m f l a s k f i t t e d w i t h a b u b b l e r and a f i n e g l a s s f r i t f o r p u r g i n g t h e s o l u t i o n w i t h HC1 g a s . T h i s brown m i x t u r e was 113 s t i r r e d a t room t e m p e r a t u r e f o r 3 0 m i n t o a l l o w f o r c o m p l e t e s o l u t i o n o f t h e h e m i n . C h l o r o f o r m (4 0mL), 8gm o f f i n e l y p o w d e r e d a n h y d r o u s f e r r o u s s u l p h a t e , and 55mL o f m e t h a n o l w e r e t h e n a d d e d , and H C l g a s was r a p i d l y p a s s e d t h r o u g h t h e v i g o r o u s l y s t i r r e d s o l u t i o n u n t i l i r o n r e m o v a l and e s t e r i f i c a t i o n w e r e c o m p l e t e . I r o n r e m o v a l was f o l l o w e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y b y w i t h -d r a w i n g a s m a l l a l i q u o t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e a n d t h e n d i l u t i n g w i t h p y r i d i n e . C o m p l e t e i r o n r e m o v a l was d e t e r m i n e d by t h e a p p e a r a n c e o f t h e d e u t e r o p o r p h y r i n s p e c t r u m . The v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f d e u t e r o p o r p h y r i n i n p y r i d i n e e x h i b i t e d p e a k s a t 400, 4 9 6 , 528, 5 6 5 , and 619nm ( l i t e r a t u r e v a l u e s : 4 0 0, 4 9 7 , 529, 566 a n d 620nm; R e f . 1 3 6 a ) . A d i s t i n c t c o l o r c h a n g e o f t h e r e a c t i o n s o l u t i o n f r o m b r o w n t o r e d was a l s o a s s o c i a t e d w i t h p r o d u c t i o n o f d e u t e r o p o r p h y r i n . D e u t e r o -p o r p h y r i n f r e e a c i d and t h e d i m e t h y l e s t e r were, d i s t i n g u i s h e d by a n a l y t i c a l t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l e l u t i n g w i t h c h l o r o f o r m . D e u t e r o p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r e x h i b i t e d R^ v a l u e s o f -0.5 w h e r e a s t h e f r e e a c i d c o m p o n e n t s r e m a i n e d n e a r t h e o r i g i n o f t h e c h r o m a t o g r a m . E s t e r i f i c a t i o n was c o m p l e t e when no m a t e r i a l r e m a i n e d a t t h e o r i g i n o f t h e c h r o m a t o g r a m s . B o t h i r o n r e m o v a l a n d e s t e r i f i c a t i o n w e r e c o m p l e t e i n l h . The r e a c t i o n m i x t u r e was e x t r a c t e d w i t h w a t e r (200mL, t h r e e t i m e s ) , w i t h 10% a q u e o u s ammonia (200mL, t w i c e ) and a g a i n w i t h w a t e r (200mL, t w i c e ) . The washed c h l o r o f o r m s o l u t i o n was d r i e d o v e r a n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e (40gm) and t a k e n t o d r y n e s s . 114 The c r u d e d e u t e r o p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r was b r o m i n a t e d a c c o r d i n g t o t h e method o f Caughey et a 1.3 1 3 6 ^ u s i n g p y r i d i n i u m h y d r o b r o m i d e p e r b r o m i d e p r e p a r e d b y t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d by F i e s e r . 1 4 2 T h r e e m i l l i l i t r e s o f p y r i d i n e was a d d e d s l o w l y t o 6mL o f 48% h y d r o b r o m i c a c i d a n d t h e s o l u t i o n a l l o w e d t o c o o l t o room t e m p e r a t u r e . To t h i s s o l u t i o n was a d d e d g r a d u a l l y 5g o f b r o m i n e a n d a g a i n t h e s o l u t i o n was a l l o w e d t o c o o l . The p r o d u c t was c o l l e c t e d b y s u c t i o n f i l t r a t i o n a n d w a s h e d t h o r o u g h l y w i t h a c e t i c a c i d . The w e t s o l i d was t h e n a d d e d t o 20mL o f a c e t i c a c i d a n d l e f t o v e r n i g h t t o c r y s t a l l i z e . The y i e l d o f o r a n g e n e e d l e s was 6g. P y r i d i n i u m h y d r o b r o m i d e p e r b r o m i d e (2g) was a d d e d o v e r a 5 m i n p e r i o d t o t h e c r u d e d e u t e r o p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r p r e p a r e d a b o v e s u s p e n d e d i n c h l o r o f o r m (lOOmL) i n a 250mL r o u n d b o t t o m f l a s k . A f t e r 5 m i n a c e t o n e (35mL) was a d d e d , f o l l o w e d 5 m i n l a t e r b y t h e a d d i t i o n o f c o l d w a t e r (lOOmL). Up t o and d u r i n g t h e a d d i t i o n o f w a t e r , t h e r e a c t i o n was v i g o r o u s l y s t i r r e d a n d c o o l e d t o 0°C i n a n i c e w a t e r b a t h . The c h l o r o f o r m l a y e r was washed w i t h w a t e r , d r i e d o v e r a n h y d r o u s s o d i u m s u l p h a t e (50g) and t a k e n t o d r y n e s s . The p o r p h y r i n e s t e r was c h r o m a t o g r a p h e d on a s i l i c a g e l (Woelm, 70-150 mesh, a v a i l a b l e f r o m ICN) c o l u m n (lOOg) and e l u t e d w i t h c h l o r o f o r m c o n t a i n i n g 1.5% m e t h a n o l by v o l u m e . The e l u t e d d i b r o m o d e u t e r o p o r p h y r i n d i m e t h y l e s t e r was r e c r y s t a l l i z e d f r o m c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 1 : 1 , by v o l u m e ) . A n a l y t i c a l t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l e l u t i n g w i t h c h l o r o f o r m r e v e a l e d a s i n g l e c o m p o nent and t h e v i s i b l e a b s o r p t i o n s p e c t r u m 115 i n c h l o r o f o r m e x h i b i t e d peaks a t 499, 533, 568, and 623nm ( l i t e r a t u r e v a l u e s : 500, 534, 569, and 523nm; Ref. 136c). Dibromodeuterohemin was prepared by i n s e r t i o n of i r o n i n t o the p u r i f i e d dibromodeuteroporphyrin dimethyl e s t e r , a c c o r d i n g to the procedure o u t l i n e d f o r the i n s t a l l a t i o n of mesoporphyrin d i h y d r o c h l o r i d e (see S e c t i o n I I I . 1 . 5 ) . The e s t e r groups were hyd r o l y z e d i n a l c o h o l i c KOH as d e s c r i b e d by Smith et al.i37^ Deuterohemin dimethyl e s t e r was d i s s o l v e d i n lOOmL o f methanol c o n t a i n i n g 1% KOH by weight, the s o l u t i o n r e f l u x e d f o r 2h, and c o o l e d to room temperature. The hemin f r e e a c i d was p r e c i p i t a t e d i n an ice-water bath c o n t a i n i n g 1M HC1 s o l u t i o n (500mL), s u c t i o n f i l t e r e d , washed thoroughly with c o l d water, and a i r d r i e d . The dibromodeutero-hemin was then p u r i f i e d by column chromatography as d e s c r i b e d f o r d i a c e t y l d e u t e r o h e m i n (see S e c t i o n I I I . 1 . 6 ) . Two bands were d e t e c t e d on the column. Dibromodeuterohemin was the l e a s t mobile compound. The f r a c t i o n s c orresponding to dibromodeuterohemin were c o l l e c t e d , evaporated to a volume of lOmL, and p r e c i p i t a t e d with water. The hemin was f i l t e r e d , washed thoroughly w i t h water, and a i r d r i e d . The y i e l d of dibromodeuterohemin was 145mg or 15% from protohemin. TLC on s i l i c a g e l (BMF 110:30:1) showed as s i n g l e spot as d i d polyamide TLC (BMF 110:30:1 and methanol : a c e t i c a c i d 100:2). Table I I I . 4 l i s t s absorbance data f o r the p y r i d i n e hemochrome of dibromodeuterohemin, w h i l e F i g u r e I I I . 6 shows the a b s o l u t e a b s o r p t i o n spectrum of the dibromodeuterohemin p y r i d i n e hemochrome. T a b l e I I I . 4 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m D i b r o m o d e u t e r o h e m i n . Heme max(nm) emM S o r e t Band e max a max D i b r o m o - X 409 513 548 d e u t e r o ( a ) £ 117 16 26 D i b r o m o - X 408 517 548 d e u t e r o (b) £ 116 15 24 a) P u b l i s h e d ^ m a x and v a l u e s f o r t h e d i b r o m o d e u t e r o -h e m i n p y r i d i n e hemochrome; ( R e f . 1 4 3 ) . b) E x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d X and e v a l u e s f o r c max mM t h e d i b r o m o d e u t e r o h e m i n p y r i d i n e hemochrome. 118 I I I . 2 G r o w t h o f Pseudomonas -putida s t r a i n PpG 786 I I I . 2 .1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n P. putida,, s t r a i n PpG 786 , ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 3 ) was m a i n t a i n e d and p r o p a g a t e d u s i n g t h e c o m b i n e d m e t h o d s o f G u n s a l u s a n d W a g n e r 3 7 and P e t e r s o n . 3 3 ^ S t e r i l e t r a n s f e r s t o f r e s h m i n i m a l a g a r e n s u r e d t h e m a i n t e n a n c e o f a v i a b l e c u l t u r e w h i l e a f o u r - s t a g e g r o w t h s e q u e n c e e n s u r e d t h e m o s t r a p i d l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n o f b a c t e r i a a t t h e e x p e n s e o f camphor and l i q u i d medium. The g r o w t h s e q u e n c e ( S e c t i o n I I I . 2.5) o r i g i n a t e d w i t h a s t a r t e r c u l t u r e , p r o g r e s s e d t h r o u g h two s e t s o f 500mL s h a k e - f l a s k c u l t u r e s , and c o n c l u d e d w i t h a 14L f e r m e n t o r c u l t u r e . E x c l u d i n g t h e 14L f e r m e n t o r s , a l l i n o c u l a t i o n p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t i n a l a m i n a r - f l o w c l e a n a-ir s t a t i o n . A l l s h a k e - f l a s k c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a t 35±1°C i n a t h e r m o s t a t e d p l a t f o r m s h a k e r ( t h r o w 1 7 / 8 i n c h e s ) a t a r o t a r y s p e e d o f 200rpm. B o t h t h e l a m i n a r - f l o w u n i t and t h e r o t a r y s h a k e r w e r e c o n s t r u c t e d i n t h e m e c h a n i c a l s h o p o f t h e C h e m i s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. The 14L c u l t u r e s w e r e grown t h r e e a t a t i m e i n s t i r r e d - t a n k f e r m e n t o r s ( L a b r o f e r m : New B r u n s w i c k S c i e n t i f i c ) . W i t h i n e a c h t a n k t h e t e m p e r a t u r e was m a i n t a i n e d a t 30°C, t h e a g i t a t i o n r a t e a t 320rpm and t h e a e r a t i o n r a t e a d j u s t e d t o 4 . 0 L / m i n . G r o w t h i n l i q u i d medium was m e a s u r e d t u r b i d o m e t r i c a l l y on a B a u s c h and Lomb S p e c t r o n i c 20 c o l o r i m e t e r a t 660nm (OD660nm) u s i n g a c u v e t t e o f 1.0cm p a t h l e n g t h . C h a nges i n pH o f t h e medium d u r i n g b a c t e r i a l g r o w t h w e r e m o n i t o r e d w i t h a n I n s t r u m e n t a t i o n L a b o r a t o r i e s I n c . M o d e l 265 pH m e t e r e q u i p p e d w i t h a g l a s s pH e l e c t r o d e ( F i s h e r ) . F o r i n d i v i d u a l s h a k e - f l a s k s t a g e s , r e p r e s e n t a t i v e g r o w t h i n f o r m a t i o n was o b t a i n e d ( i . e . OD660nm and pH d a t a ) f r o m o n l y one o f t h e i n o c u l a t e d f l a s k s . The r e m a i n i n g f l a s k s w e r e l e f t u n d i s t u r b e d . The d a t a w e r e t h e n c o m p a r e d t o a c o n t r o l f l a s k c o n t a i n i n g u n i n o c u l a t e d medium. I n a d d i t i o n , r e p r e s e n t a t i v e g r o w t h d a t a w e r e o b t a i n e d f r o m one o f t h e 14L f e r m e n t o r c u l t u r e s b u t c o n t r o l medium was n o t u t i l i z e d t h i s s t a g e . The t u r b i d i t y d a t a a nd pH p r o f i l e s o b t a i n e d w e r e p l o t t e d f o r e a c h s t a g e ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) . The b a c t e r i a w e r e h a r v e s t e d u s i n g a w a t e r - c o o l e d , h i g h - s p e e d c o n t i n u o u s c e n t r i f u g e ( M o d e l L E , C a r l P a d b e r g , S c h n e l l -Z e n t r i f u g e , L a h r / R a d e n ) o p e r a t e d a t 37,000rpm. Y i e l d s w e r e e x p r e s s e d a s w e t w e i g h t s o f c e l l s o b t a i n e d . 120 I I I . 2 . 2 M a t e r i a l s A l l r e a g e n t s u t i l i z e d d u r i n g t h e g r o w t h o f P. Putida s t r a i n PpG 7 8 6 , h a v e b e e n l i s t e d p r e v i o u s l y w i t h t h e f o l l o w i n g e x c e p t i o n s : f r o m A m e r i c a n S c i e n t i f i c and C h e m i c a l Co., ammonium c h l o r i d e , ammonium s u l p h a t e , c a l c i u m c h l o r i d e , m agnesium s u l p h a t e , manganese s u l p h a t e , m o n o b a s i c and d i b a s i c p o t a s s i u m p h o s p h a t e (KH^PO^ a n d K-^HPO^ r e s p e c t i v e l y ) , a n d s o d i u m c h l o r i d e ; f r o m D i f c o L a b o r a t o r i e s , B a c t o t r y p t o n e , B a c t o y e a s t e x t r a c t , a n d B a c t o a g a r ; f r o m Dow C o r n i n g , a n t i f o r m FG-10 e m u l s i o n ; and f r o m t h e Si g m a C h e m i c a l Co., L - ( + ) - a s c o r b i c a c i d , D - ( + ) - c a m p h o r , D - g l u c o s e , and L - g l u t a m i c a c i d . The s o u r c e a n d d e s c r i p t i o n o f a l l e q u i p m e n t a r e p r o v i d e d i n t h e t e x t . 121 III.2.3 Organism Pseudomonas putida, s t r a i n PpG 786 (ATCC 29607), obtained from Dr. I. C. Gunsalus, was the source of cytochrome P450 and r e l a t e d b a c t e r i a l monooxygenase components (see S e c t i o n I I . 2) i n t h i s study. This s p e c i e s of bacterium was d e r i v e d from the parent Pseudomonad, PpGl (ATCC 17453), i s o l a t e d from s o i l by enrichment on D-(+)-camphor. 1 4 4 Stock c u l t u r e s were maintained a t 30°C on minimal agar (see S e c t i o n III.2.4.1) u s i n g D-(+)-camphor as the s o l e carbon and energy source, and were s u b c u l t u r e d every two weeks. 122 I I I .2.4 Media The media f o r a l l growth stages was prepared a c c o r d i n g to Gunsalus and Wagner 3 7 u s i n g s i n g l y d i s t i l l e d water. A l l s o l u t i o n s were s t e r i l i z e d a t 121°C i n an a u t o c l a v e (American S t e r i l i z e r Co. Model AS-DIT616GE). The time r e q u i r e d to s t e r i l i z e the medium v a r i e d a c c o r d i n g to the t o t a l volume of s o l u t i o n per f l a s k . For volumes of l e s s than 200mL, s t e r i l i z a t i o n was assured a f t e r 15 minutes, while volumes of 12L r e q u i r e d a s t e r i l i z a t i o n time of 4 5 minutes. I l l . 2 . 4 . 1 Minimal Agar For the maintenance of the bacterium, a minimal agar c o n t a i n i n g m i n e r a l s and a s i n g l e carbon source was u t i l i z e d . The medium r e q u i r e d the f o l l o w i n g i n g r e d i e n t s : K 2 H P 0 4 7.0g K H 2 P 0 4 2.0g N a C l 0.12g M g S 0 4 - 7 H 2 0 O . l g ( N H 4 ) 2 S 0 4 l . O g Camphor _ _ _ _ _ _ _ _ 1.3g B a c t o a g a r 15g W a t e r _ 1.0L .123 I n d i v i d u a l s o l u t i o n s c o n t a i n i n g t h e m i n e r a l s , t h e c a r b o n s o u r c e , a n d t h e a g a r w e r e p r e p a r e d i n s e p a r a t e 500mL E r l e n m e y e r f l a s k s t o a c o l l e c t i v e v o l u m e o f 500mL. P o u r e d a n d s o l i d i f i e d medium was w r a p p e d t i g h t l y i n S a r a n Wrap and s t o r e d a t 5°C. A s i n g l e b a t c h o f m i n i m a l a g a r p l a t e s (20-30) was consumed e v e r y 3-4 months and c o n t a m i n a t i o n d u r i n g t h e s t o r a g e p e r i o d was n e v e r o b s e r v e d . I I I . 2 . 4 . 2 S t a r t e r M e d i a F o r t h e s t a r t e r c u l t u r e s i n w h i c h r a p i d l y g r o w i n g i n o c u l a w e r e d e s i r e d , a r i c h u n d e f i n e d medium o f L - b r o t h 1 4 5 was u s e d . The L - b r o t h c o n t a i n e d t h e f o l l o w i n g i n g r e d i e n t s : B a c t o t r y p t o n e l O g B a c t o Y e a s t E x t r a c t _ _ 5.Og N a C l 5.0g G l u c o s e l . O g W a t e r 1.0L The pH r e q u i r e d adjustment to 7.0 wit h 1M NaOH. E i g h t y m i l l i l i t r e s of L-broth was d i v i d e d between four 50mL Erlenmeyer f l a s k s (see S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) . I l l . 2 . 4 . 3 Large S c a l e Media For the l a r g e s c a l e p r o d u c t i o n of the bacterium, a mi n e r a l s a l t s medium was employed. The b a s a l medium was prepared from a d e f i n e d phosphate-ammonium (PA) s o l u t i o n c o n t a i n i n g the f o l l o w i n g i n g r e d i e n t s : 124 K 2 H P 0 4 10.7g K H 2 P 0 4 3.1g NH 4C1 4.0g W a t e r 1.0L E s s e n t i a l m i n e r a l s a l t s w e r e a d d e d a s a 1 0 0 - f o l d c o n c e n t r a t e d s t o c k s o l u t i o n (100 x S a l t s ) c o n t a i n i n g t h e f o l l o w i n g i n g r e d i e n t s : M g S 0 4 - 7 H 2 0 19. 5g M n S 0 4 - H 2 0 5.0g F e S 0 4 - 7 H 2 0 5.0g C a C l 2 - 2 H 2 0 0.3g A s c o r b i c a c i d _ _ _ _ 1.Og W a t e r 1.0L The b a s a l medium was s u p p l e m e n t e d w i t h v a r i o u s c a r b o n s o u r c e s , a n t i f o a m i n g a g e n t , a nd B a c t o y e a s t e x t r a c t , when a p p l i c a b l e , d u r i n g t h e g r o w t h s e q u e n c e ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) . Camphor, t h e m a j o r c a r b o n a nd e n e r g y s o u r c e , was a d d e d as a f i n e l y g r o u n d s o l i d o r a l i q u i d s t o c k s o l u t i o n o f 3M/D- ( + ) -camphor i n DMF. The v a r i o u s s u p p l e m e n t s w e r e a d d e d t o t h e b a s a l PA s o l u t i o n b e f o r e u n d e r g o i n g s t e r i l i z a t i o n i n t h e a u t o c l a v e . The pH o f t h e f r e s h l y p r e p a r e d medium r a n g e d f r o m 7.0-7.2 125 I I I . 2 . 5 G r o w t h P r o c e d u r e The s t a r t e r c u l t u r e was p r e p a r e d f r o m 60mL ( d i v i d e d b e t w e e n t h r e e 50mL E r l e n m e y e r f l a s k s ) o f L - b r o t h medium i n o c u l a t e d w i t h P. Putida a n d i n c u b a t e d f o r a l O h p e r i o d w i t h s h a k i n g . G r o w t h i n t h e s t a r t e r medium was c h e c k e d a g a i n s t 20mL o f u n i n o c u l a t e d L - b r o t h . OD660nm and pH p r o f i l e s f o r t h e L - b r o t h c u l t u r e s a r e shown i n F i g u r e I I I . 7 . The b a c t e r i a w e r e v i s i b l e a s s m a l l b i l l o w y c l o u d s i n t h e m e d i a u pon g e n t l e s w i r l i n g o f t h e f l a s k s . S u b s e q u e n t t o t h e l O h i n c u b a t i o n p e r i o d , t h e r e s u l t i n g l a t e - l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e c u l t u r e (OD660nm = 1.5±0.2) p r o v i d e d i n o c u l a f o r t h e f i r s t s e t o f f i v e 500mL s h a k e - f l a s k s . F o u r o f t h e f i v e 500mL E r l e n m e y e r f l a s k s , c o n t a i n i n g 200mL o f PA s o l u t i o n , 2mL o f 100 x S a l t s s o l u t i o n and lOmM g l u t a m i c a c i d ( t h e c a r b o n s o u r c e ) , w e r e i n o c u l a t e d w i t h 5.OmL o f L - b r o t h c u l t u r e and i n c u b a t e d w i t h c o n t i n u o u s s h a k i n g . I n i t i a l g r o w t h r e a c h e d m i d - l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e i n 2.Oh (OD660nm = 0.4±0.1; se e F i g u r e I I I . 8 ) . I n d u c t i o n o f c y t o c h r o m e P450cam and r e l a t e d b a c t e r i a l m o n o o x y g e n a s e c o m p o n e n t s was i n i t i a t e d a t t h i s p o i n t by t h e a d d i t i o n o f 3M camphor i n DMF t o e a c h f l a s k . The f i n a l camphor c o n c e n t r a t i o n was a d j u s t e d t o 5mM. A f t e r a n OD660nm = 0.7±0.1 (=4h) was o b t a i n e d , s t o c k camphor s o l u t i o n was a g a i n a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 5mM. The i n i t i a l g r o w t h p h a s e r e a c h e d a maximum i n -6h (OD660nm = 1.0±0.1) an d was f o l l o w e d by a p e r i o d o f r a p i d l y d e c l i n i n g o p t i c a l d e n s i t y o f t h e medium ( s e e F i g u r e I I I . 8 ) . The 126 c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d t h r o u g h t h i s l a g p e r i o d (=6-12h) i n t o a s e c o n d a r y g r o w t h p h a s e i n w h i c h camphor was a c t i v e l y m e t a b o l i z e d . G r o w t h was t h e n c o n t i n u e d u n t i l l a t e -l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e was r e a c h e d (~25h). A lOmL a l i q u o t o f t h e l a t e - l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e c e l l s s e r v e d a s a n i n o c u l u m f o r t h e s e c o n d s e t o f f i v e 500mL s h a k e - f l a s k s . The f l a s k s c o n t a i n e d t h e same b a s a l medium u t i l i z e d i n t h e p r e v i o u s s h a k e - f l a s k s b u t s o l i d camphor was a d d e d as t h e o n l y c a r b o n s o u r c e i n p l a c e o f t h e g l u t a m i c a c i d . A l l m e d i a w e r e s a t u r a t e d w i t h camphor t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f =8mM. G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s f o r t h i s s t a g e a r e r e p r e s e n t e d i n F i g u r e I I I . 9. A t l a t e - l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e (~15h, OD660nm = 0.8+0.2) t h e s h a k e - f l a s k c o n t e n t s w e r e a d d e d t o t h e 14L f e r m e n t o r j a r s c o n t a i n i n g 12L o f PA s o l u t i o n , 120mL o f 100 x S a l t s s o l u t i o n , 30mL o f 10% (w/v) B a c t o y e a s t e x t r a c t , 2mL o f a n t i f o a m and 15g o f s o l i d camphor (=8mM). Once m i d - l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e was a t t a i n e d i n t h e 14L f e r m e n t o r s (=7.Oh, OD660nm = 0.4±0.1) t h e medium was k e p t s a t u r a t e d w i t h c amphor. F i g u r e I I I . 1 0 r e p r e s e n t s g r o w t h b e h a v i o r d u r i n g b a c t e r i a l p r o p a g a t i o n a t t h i s s t a g e . The camphor c a r b o n s o u r c e was a d d e d i n b o t h l i q u i d (3M camphor i n DMF) and s o l i d f o r m a t a r a t e o f 5g/h and i n c u b a t i o n was m a i n t a i n e d w i t h v i g o u r o u s a e r a t i o n and a g i t a t i o n ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 1 ) . The t o t a l q u a n t i t y o f c e l l s a c c u m u l a t e d i n t h e medium was e s t i m a t e d f r o m t h e w e i g h t o f b a c t e r i a c o l l e c t e d i n 40mL o f c u l t u r e u s i n g a S o r v a l l RC-2 r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h a n SS-34 r o t o r h e a d . A t l a t e - l o g a r i t h m i c g r o w t h 127 p h a s e (~25±2h, OD660nm = 1.2±0.1) t h e m a x i m a l q u a n t i t y o f b a c t e r i a i n s o l u t i o n was 150g p e r 36L o f c u l t u r e . A p p r o x -i m a t e l y 80% o f t h e c e l l s w e r e r e m o v e d b y c o n t i n u o u s c e n t r i f u g a t i o n a t a f l o w - r a t e o f l L / m i n . The medium was r e c y c l e d w i t h t h e a d d i t i o n o f e x c e s s camphor t o pH 6.0, b e l o w w h i c h no v i a b l e b a c t e r i a w e r e o b t a i n e d . B a c t e r i a c o u l d be grown i n t h e same medium f o r 7 2h and c o u l d be h a r v e s t e d 3-4 t i m e s w i t h o u t p r o b l e m s o f c o n t a m i n a t i o n . T h i s g r o w t h p r o c e d u r e y i e l d e d a p p r o x i m a t e l y 11Og o f b a c t e r i a p e r 10L o f medium a n d an o v e r a l l y i e l d o f 400g p e r g r o w t h c y c l e . A p p r o x i m a t e l y 1.7g o f camphor was consumed p e r gram o f b a c t e r i a o b t a i n e d . The p i n k c e l l p a s t e s w e r e s t o r e d i n d r y i c e (-78°C). The pH o f a l l m e d i a c o n t a i n i n g r a p i d l y g r o w i n g c u l t u r e s d e c r e a s e d d u r i n g a c t i v e camphor m e t a b o l i s m b u t i n c r e a s e d d u r i n g t h e m e t a b o l i s m o f o t h e r c a r b o n s o u r c e s , s u c h a s g l u c o s e a n d g l u t a m i c a c i d ( s e e F i g u r e s I I I . 7 - I I I . 1 0 ) . 128 F i g u r e i n . 7 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e L - b r o t h medium. 129 F i g u r e I I I . 8 13 0 7.3n PH -r 1 1 • 1 — — , 1 0 10 20 30 40 50 Time (h) F i g u r e I I I . 9 1.31 7.3n "T 1 - i r 15 30 45 60 Time (h) F i g u r e I I I . 1 0 OD660nm and pH p r o f i l e s f o r b a c t e r i a l g r o w t h i n t h e 14L f e r m e n t o r m e d i a . 132 I I I . 3 I s o l a t i o n a n d P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam  and R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components I I I . 3 .1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n C y t o c h r o m e P4 50cam and r e l a t e d b a c t e r i a l m o n o o x y g e n a s e c o m p o n e n t s ( p u t i d a r e d o x i n a n d p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e ; s e e S e c t i o n I I . 2) w e r e e x t r a c t e d and p u r i f i e d f r o m c e l l s o f P. P u t i d a , s t r a i n PpG 786, by t h e m e t h o d s o f G u n s a l u s and W a g n e r , 3 7 and P e t e r s o n 3 3 ^ w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . An a d a p t e d p r o c e d u r e was d e v e l o p e d t o m a x i m i z e t h e p u r i t y and n o t t h e y i e l d o f e a c h p r o t e i n c o m p o n e n t . A f l o w c h a r t o f t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n b a s e d o n 400g o f b a c t e r i a l c e l l p a s t e a s o b t a i n e d a b o v e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e I I I . 1 1 . I l l . 3 . 1 . 1 M a t e r i a l s R e a g e n t s w e r e o b t a i n e d as f o l l o w s : f r o m A m e r i c a n S c i e n t i f i c and C h e m i c a l Co., g l y c e r o l a nd p o t a s s i u m c h l o r i d e ( K C 1 ) , f r o m t h e S h w a r t z - M a n n C h e m i c a l Co., enzyme g r a d e ammonium s u l p h a t e ( ( N H ^ ^ S O ^ ) ; and f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l Co., 3 - m e r c a p t o e t h a n o l (3ME) , d e o x y r i b o n u c l e a s e I (DNase) i s o l a t e d f r o m b o v i n e p a n c r e a s , d i t h i o t h r i e t o l (DTT), r i b o n u c l e a s e - A (RNase) i s o l a t e d f r o m b o v i n e p a n c r e a s and t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e f r e e b a s e ( T r i z m a B a s e ) . C h e m i c a l s n o t m e n t i o n e d a b o v e w e r e l i s t e d p r e v i o u s l y . C.P. g r a d e c a r b o n m o n o x i d e (CO) was o b t a i n e d f r o m t h e M a t h e s o n Gas Co. T r a c e o x y g e n was r e m o v e d a s i n d i c a t e d p r e v i o u s l y f o r a r g o n ( s e e S e c t i o n I I I . 1.2) f o l l o w e d b y d r y i n g t h r o u g h p h o s p h o r u s p e n t o x i d e and I n d i c a t i n g D r i e r i t e . C a r b o n d i o x i d e was r e m o v e d w i t h s o d a l i m e ( F i s h e r ) . C o m p l e t e r e m o v a l P. putida 7B6 (wog) MomL buffer T DNaae.RNaae ao h autorysed cell suspension I l.sh 9000 rpm cell-lree extract | CotumnA DE-52 (»>15 cm] buffarT T-BOO isomL/mln toh Putidaredoxin | 0-S5R (Nrt^ SO, M m l n o-c goocrpm cell debris (discard) |CotumnB OE-52 ( « x 3 0 c m ) bufferT-30 T-100 tBOmL/mln l.5h linear gradient T-100 to T-600 isomL/mln 3.oh precipitate supernatant (discard) P-100 » 3 m L 10 mM DTT Kmln Cohimnl * v h « l M Q-100 (u.socm) buffarT 10my DTT C ° " " n n 2 S # p h 8 d " O ' 0 0 ( l „ 5 o c m ) l H l f h , p . 1 O 0 . , _ « _ * _ Dlalyaia P-loo nmal SUE Putidaredoxin (purified) Cytochrome Pasocam |o-3«%(NH4) 2S0 4 aonrln o°c eooorptn supernatant M-«0%(NH4 ) ,S0 4 aonrln o°c 9000 rpm precipitate (discard) supernatant precipitate (discard) p . 1 o 0 ~ 3 m L iomM DTT 30 mm Columnt Sephadax G-100 (1.3k50cm) buffarT nmM DTT Column 2 Sephadax G-100 (1.3,50cm) buffer P-100 8mM camphor Putidaredoxin reductase lo-ro %(NH 4) 2S0 4 aonUn 0°c, gooorpm I ' 1 , . precipitate supernatant (discard) p 100 = 3 mL Column 1 Sephadax G-100 (1.3x50cm) buffarT nmM DTT Column 2 Sephadax Q-100 (i.3»50cm) buffer P-100 a mM camphor Dlalyaia P-100 5% glycerol Putidaredoxin reductase Cytochrome Pasocam (purified) F i g u r e i n . 1 1 F l o w c h a r t f o r t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f a c a t i o f c y t o c h r o m e P450cam and r e l a t e d b a c t e r i a l m o n ooxygenase c o m p o n e n t s f r o m P putida, s t r a i n PpG786. C o n s u l t t e x t f o r d e t a i l s . 134 o f t r a c e i m p u r i t i e s was c h e c k e d w i t h mass s p e c t r o m e t r y by D r . G. E i g e n d o r f o f t h e C h e m i s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. S e a m l e s s c e l l u l o s e d i a l y s i s t u b i n g w i t h a 12,000 m o l e c u l a r w e i g h t c u t - o f f was o b t a i n e d f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c Co. P l a s t i p a k d i s p o s a b l e s y r i n g e s ( f r o m 1.0 - 50mL s i z e s ) w e r e o b t a i n e d f r o m B e c t o n , D i c k i n s o n a n d Co. I I I . 3 . 1 . 2 B u f f e r s The b u f f e r s o l u t i o n s u s e d d u r i n g t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s w e r e p r e p a r e d f r o m s i n g l y d i s t i l l e d w a t e r , p r e f i l t e r e d w i t h a Gelman f i l t r a t i o n a p p a r a t u s e q u i p p e d w i t h a 45ym M e t r i c e l membrane (Gelman S c i e n c e s I n c . ) and d e a e r a t e d b y a s p i r a t i o n . A l l b u f f e r s w e r e p r e p a r e d a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) and u s e d i m m e d i a t e l y . T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) b u f f e r s w e r e p r e p a r e d f r o m a 1.0M s t o c k s o l u t i o n o f t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) -a m i n o m e t h a n e f r e e b a s e ( T r i z m a B a s e ) , d i l u t e d t o o b t a i n a 50mM b a s a l s o l u t i o n and c a r e f u l l y a d j u s t e d t o pH 7.3 w i t h 6M HC1. The f o l l o w i n g T r i s b u f f e r s a n d s i m p l i f i e d nomen-c l a t u r e 3 7 w e r e u s e d d u r i n g t h e i s o l a t i o n and p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s : b u f f e r T = 50mM T r i s b u f f e r , pH 7.3; t h e a d d i t i o n o f 5 0 , 100 and 600mM k C l were s p e c i f i e d a s b u f f e r s T-50, T-100 and T-600 r e s p e c t i v e l y . A l l T r i s b u f f e r s w e r e made lOmM i n gME p r i o r t o u s e u n l e s s n o t e d o t h e r w i s e . O t h e r s u p p l e m e n t s i n c l u d e d t h e a d d i t i o n o f lOmM DTT and 5% ( v / v ) g l y c e r o l a s r e q u i r e d . P o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r s w e r e p r e p a r e d b y m i x i n g e q u a l v o l u m e s o f 1.0M K„HPO. and 1.0M KH„PO. s t o c k s o l u t i o n s 135 t o o b t a i n a 50mM b a s a l s o l u t i o n o f pH 7.0: b u f f e r P = 50mM k C l was s p e c i f i e d a s b u f f e r P-100 i n d i c a t i n g t h e lOOmM p o t a s s i u m i o n c o n c e n t r a t i o n . Camphor was a d d e d a s a s o l i d t o a p p r o p r i a t e b u f f e r s t o s a t u r a t i o n l e v e l s (~8mM), s t i r r e d o v e r n i g h t a n d f i l t e r e d p r i o r t o u s e . O t h e r s u p p l e m e n t s i n c l u d e d t h e a d d i t i o n o f lOmM BME a n d 5% ( v / v ) g l y c e r o l a s r e q u i r e d . A p p r o x i m a t e v o l u m e s o f b u f f e r s o l u t i o n s u t i l i z e d t h r o u g h -o u t t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e b a s e d o n 400g o f b a c t e r i a l c e l l p a s t e ( as o b t a i n e d a b o v e ) a r e g i v e n i n T a b l e I I I . 5 ; t h e a p p r o x i m a t e q u a n t i t i e s o f r e a g e n t s f o l l o w i n T a b l e I I I . 6 . I l l . 3.1.3 Column C h r o m a t o g r a p h y I n o r d e r t o o b t a i n u n c o n t a m i n a t e d and h i g h l y p u r i f i e d p r o t e i n c o m p o n e n t s , s t r i c t a d h e r e n c e t o p r e c i s i o n i n t h e p r e p a r a t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c r e s i n s and o p e r a t i o n o f t h e c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n s was e s s e n t i a l . The Whatman DE-52 p r e s w o l l e n c e l l u l o s e a n i o n e x c h a n g e (DE-52) a n d Se p h a d e x G-100 r e s i n s ( o b t a i n e d d i r e c t l y f r o m N o r t h A m e r i c a n S c i e n t i f i c a n d S i g m a C h e m i c a l C o . r e s p e c t i v e l y ) w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s r e c o m m e n d a t i o n . C h r o m a t o g r a p h y c o l u m n s a nd c o l u m n ends f o r DE-52 a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y w e r e o b t a i n e d c o m m e r c i a l l y f r o m B i o R a d L a b o r a t o r i e s ( M o d e l B i o - R e x ) . The c o l u m n s f o r Sep h a d e x G-100 c h r o m a t o g r a p h y w e r e c o n s t r u c t e d f r o m c a s t a c r y l i c ( C a d i l l a c P l a s t i c s ) i n t h e m e c h a n i c a l s h o p o f t h e C h e m i s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. ( F i g u r e I I I . 1 2 ) . The c o m m e r c i a l l y o b t a i n e d c o l u m n e n d s w e r e f i t t e d w i t h p o r o u s 136 Solvent Port Enzyme Solution Port Cast Acrylic Column (1.3 cm diameter) i i Si ". >-_ l o O-Ring Column Support 100 Mesh Nylon Insert F i g u r e I I I . 1 2 A s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e S e p h a d e x G-100 c o l u m n s . 137 T a b l e I I I . 5 V o l u m e s o f B u f f e r s u t i l i z e d d u r i n g P r o t e i n I s o l a t i o n and P u r i f i c a t i o n S t e p B u f f e r V o l u m e s C e l l - F r e e E x t r a c t 0.6L b u f f e r T DE-52 C h r o m a t o g r a p h y a) Column A e q u i l i b r a t i o n 4.0L b u f f e r T, lOmM gME b) Column B e q u i l i b r a t i o n 4.OL b u f f e r T-50, lOmM gME c) S e p a r a t i o n o f p r o t e i n 4.OL b u f f e r T-100, lOmM gME c o m p o n e n t s i n c l u d i n g l i n e a r s a l t g r a d i e n t 4.OL b u f f e r T-600, lOmM 3ME S e p h a d e x G-10 0 C h r o m a t o g r a p h y a) Column 1 e q u i l i b r a t i o n 2.0L b u f f e r T-100, lOmM DTT and e l u t i o n b) Column 2 e q u i l i b r a t i o n 2.OL b u f f e r P-100, 8mM camphor a n d e l u t i o n D i a l y s i s a) p u t i d a r e d o x i n 2.OL b u f f e r P, 5% ( v / v ) g l y c e r o l r e d u c t a s e b) p u t i d a r e d o x i n 2.0L b u f f e r P, lOmM 3ME 138 T a b l e TIT.6 Q u a n t i t i e s o f R e a g e n t s f o r P r o t e i n I s o l a t i o n a n d P u r i f i c a t i o n R e a g e n t s Q u a n t i t i e s T r i z m a B a s e , 1M 850mL K H 2 P 0 4 , 1M 60mL K 2 H P 0 4 , 1M 60mL KC1 250g ( N H 4 ) 2 S 0 4 450g NH 4OH, 14.8M 15mL G l y c e r o l 20mL 3ME 15mL DTT 0.4g D-(+)-camphor 5.0g DNase 1.Omg RNase l.Omg 139 p o l y e t h y l e n e a n d 100 mesh n y l o n i n s e r t s w h i l e t h e c o n s t r u c t e d c o l u m n s u t i l i z e d o n l y t h e 100 mesh n y l o n i n s e r t s . C o l u m n s w e r e o p e r a t e d i n t h e d e s c e n d i n g f l o w mode w i t h c o n s t a n t - f l o w r a t e s a c h i e v e d u s i n g a P o l y s t a l t i c Pump f r o m B i i c h l e r I n s t r u m e n t s o r u s i n g g r a v i t y f e e d . S m a l l e r d i a m e t e r T ygon p l a s t i c (1/16 x 1/8 x 1/32 i n c h e s ) o r I n t r a m e d i c p o l y e t h y l e n e (0.045 x 0.062 i n c h e s ) t u b i n g w e r e u s e d f o r t h e t r a n s p o r t o f s o l u t i o n . C h r o m a t o g r a p h y e l u t i o n p a t t e r n s w e r e m o n i t o r e d v i s u a l l y and c o l l e c t e d w i t h a L k B Bromma, 7000 U l t r a r a c F r a c t i o n C o l l e c t o r . C o n c e n t r a t i o n a n d c e n t r i f u g a t i o n o f p r o t e i n s o l u t i o n s was a c h i e v e d i n a n A m i c o n U l t r a f i l t r a t i o n a p p a r a t u s f i t t e d w i t h a YM-10 D i a f l o U l t r a f i l t r a t i o n membrane (>10,000 m o l e c u l a r w e i g h t c u t - o f f ) , and i n a S e r v a l l RC-2 r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h a GSA o r SS-34 r o t o r r e s p e c t i v e l y . S e p a r a t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s on t h e DE-52 a n i o n e x c h a n g e c o l u m n s ( s e e S e c t i o n I I I . 3.2.2) was e n h a n c e d by g r a d u a l l y i n c r e a s i n g t h e k C l c o n c e n t r a t i o n ( i . e . i o n i c s t r e n g t h ) o f t h e e l u t i n g b u f f e r f r o m T-100 t o T-600. T h i s l i n e a r s a l t g r a d i e n t was a c c o m p l i s h e d b y t h e c o n t i n u o u s a d d i t i o n o f b u f f e r T-600 t o t h e b u f f e r T-100 r e s e r v o i r w i t h v i g o r o u s s t i r r i n g . S i m u l t a n e o u s w i t h t h e a d d i t i o n o f b u f f e r T-600 was t h e c o n t i n u o u s r e m o v a l , via two e x i t t u b e s , o f t h e b u f f e r T-100 - T-600 m i x t u r e a s b o t h c o l u m n e l u t e n t a n d w a s t e b u f f e r . S i n c e t h e r a t e o f r e m o v a l o f t h e b u f f e r m i x t u r e was t w i c e t h a t o f t h e a d d i t i o n r a t e o f b u f f e r T-6 00 a g r a d u a l i n c r e a s e i n t h e i o n i c s t r e n g t h o f t h e b u f f e r was e n s u r e d . 14 0 I I I . 3 . 2 I s o l a t i o n o f C y t o c h r o m e P4 50cam and R e l a t e d  B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components 111.3.2.1 C e l l - F r e e E x t r a c t A s i n g l e b a t c h o f c e l l p a s t e (400g) f r o z e n a t d r y i c e t e m p e r a t u r e s f o r a t l e a s t 10 d a y s was t h a w e d , c o m b i n e d w i t h 280mL o f b u f f e r T,and h o m o g e n i z e d u s i n g a v a r i a b l e s p e e d e l e c t r i c m i x e r . The v i s c o u s p i n k s u s p e n s i o n was s t i r r e d a t 5°C f o r 8h. One mg e a c h o f DNase and RNase w e r e a d d e d t o t h e s o l u t i o n and s t i r r i n g was c o n t i n u e d a t 5°C o v e r n i g h t ( 1 2 h ) . A f u r t h e r 280mL o f b u f f e r T was t h e n a d d e d and t h e s o l u t i o n t h o r o u g h l y m i x e d . The c e l l s u s p e n s i o n was c e n t r i f u g e d a t 9,000rpm f o r 10 m i n t o r emove u n l y s e d c e l l s and c e l l d e b r i s , and t h e n c e n t r i f u g e d a t t h e same s p e e d f o r a n o t h e r 1.5h t o remove t h e c e l l membrane f r a c t i o n . The r e s u l t a n t r e d d i s h - b r o w n s u p e r n a t a n t s o l u t i o n c o n t a i n i n g t h e t h r e e m o n o o x y g e n a s e c o m p o n e n t s was k e p t on i c e a t a l l t i m e s . 111.3.2.2 I s o l a t i o n P r o c e d u r e A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d a t 5°C u n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d . C o n s t a n t - f l o w r a t e s w e r e m a i n t a i n e d w i t h a p e r i s t a l t i c pump ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 1 . 3 ) . The c e l l - f r e e e x t r a c t d e r i v e d f r o m 400g o f c e l l p a s t e was a p p l i e d a t a f l o w r a t e o f 180mL/h t o DE-52 c e l l u l o s e a n i o n e x c h a n g e c o l u m n A ( 1 5 0 g ; 5 x 15cm), p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r T ( s e e T a b l e I I I . 5 f o r v o l u m e o f b u f f e r T r e q u i r e d f o r e q u i l i b r a t i o n o f C olumn A ) . D u r i n g a p p l i c a t i o n o f t h e c e l l - f r e e e x t r a c t t h e e f f l u e n t was d i s c a r d e d . Column A was washed w i t h b u f f e r T-100 a t 180mL/h f o r 1.Oh t o p r o m o t e t h e s e p a r a t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s . D u r i n g t h i s t i m e t h e e f f l u e n t was a g a i n d i s c a r d e d . F u r t h e r e f f l u e n t f r o m Column A was a p p l i e d t o a s e c o n d DE-52 c e l l u l o s e a n i o n e x c h a n g e c o l u m n , B, ( 3 0 0 g ; 5 x 30cm) e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r T-50 ( s e e T a b l e I I I . 5 f o r v o l u m e o f b u f f e r T-50 r e q u i r e d f o r e q u i l i b r a t i o n o f Column B ) . The DE-52 c o l u m n s w e r e washed c o n t i n u a l l y w i t h b u f f e r T-100 a t 180mL/min u n t i l - t w o - t h i r d s o f t h e r e d c y t o c h r o m e band p a s s e d o n t o Column B ( = 1 . 5 h ) , l e a v i n g b e h i n d t h e t r a i l i n g y e l l o w p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e a n d t h e b r o w n p u t i d a r e d o x i n b a n d s . A l i n e a r s a l t g r a d i e n t w i t h b u f f e r T-100 t o T-600 ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 1 . 3 ) was t h e n e s t a b l i s h e d a t a f l o w r a t e o f 18 0mL/min o v e r a 3.Oh p e r i o d t o a l l o w f o r t h e e l u t i o n and s e p a r a t i o n o f t h e r e d c y t o c h r o m e P450cam and y e l l o w p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e on C olumn B. Column A, c o n t a i n i n g t h e n a r r o w d a r k brown p u t i d a r e d o x i n b a n d , was d i s c o n n e c t e d a t t h i s p o i n t and t h e l i n e a r s a l t g r a d i e n t was c o n t i n u e d f o r t h e e l u t i o n o f C olumn B. The c y t o c h r o m e P4 50cam a n d p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e p r o t e i n s w e r e e l u t e d o v e r a p e r i o d o f 3.5h a s s e p a r a t e h i g h l y v i s i b l e b a n d s . The p u t i d a r e d o x i n p r o t e i n was t h e n e l u t e d f r o m Column A w i t h b u f f e r T-600 o v e r a 1.Oh p e r i o d . The p r o t e i n e f f l u e n t f r o m e a c h c o l u m n was c o o l e d t h r o u g h 6m o f c o i l e d p o l y e t h y l e n e t u b i n g a t 0°C and k e p t on i c e a t a l l t i m e s . S o l u t i o n s o f c y t o c h r o m e P4 50cam and p u t i d a r e d o x i n w e r e made lOmM i n 3ME 14 2 w h i l e s o l u t i o n s o f p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e w e r e made 5% (v/v) g l y c e r o l i m m e d i a t e l y a f t e r c o l l e c t i o n . E a c h p r o t e i n f r a c t i o n was p r e c i p i t a t e d and p u r i f i e d d i r e c t l y ( s e e b e l o w ) . I l l . 3 . 2 . 3 Ammonium S a l t F r a c t i o n a t i o n A l l p r o t e i n c o m p o n e n t s w e r e p r e c i p i t a t e d a t 0°C w i t h t h e a d d i t i o n o f enzyme g r a d e ( N H ^ ^ S C ^ a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e . The a p p r o x i m a t e r e q u i r e m e n t s f o r p r e c i p i t a t i o n o f e a c h p r o t e i n c omponent a r e p r o v i d e d i n T a b l e I I I . 7 . C r y s t a l l i n e ammonium s u l p h a t e was a d d e d t o t h e . c o m b i n e d f r a c t i o n s o f e a c h p r o t e i n w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g o v e r a 30 m i n p e r i o d . F o r e a c h 3 0g o f ammonium s u l p h a t e a d d e d , 1=. OmL o f 14.8M NH^OH was ad d e d f o r n e u t r a l i z a t i o n . The m i x t u r e was s t i r r e d f o r a n a d d i t i o n a l 30 m i n and t h e p r e c i p i t a t e c o l l e c t e d by c e n t r i f u g a t i o n . The s u p e r n a t a n t , w h i c h o f t e n c o n t a i n e d y e l l o w f l a v i n , was d i s c a r d e d . The p r o t e i n p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n m i n i m a l b u f f e r P-100 (~3mL) and p u r i f i e d d i r e c t l y ( s e e b e l o w ) . F o r p r e c i p i t a t i o n o f c y t o c h r o m e P450cam an i n i t i a l s t e p was i n v o k e d t o remove a p o - c y t o c h r o m e P450cam ( s e e T a b l e I I I . 7 ) . The p r o t e i n c o n t a m i n a n t was c o l l e c t e d as a w h i t e s o l i d a n d d i s c a r d e d . T a b l e I I I . 7 S a t u r a t i o n L e v e l s and Q u a n t i t i e s o f ( N H ^ ) 2 S 0 4 r e q u i r e d f o r t h e P r e c i p i t a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d P r o t e i n Components r, 4. • (NH. ) o S 0 . . ( N H J „ S 0 ; P r o t e i n 4 2 4 4; 2 4 S a t u r a t i o n L e v e l (g/L) P u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e 7 0 % 500 P u t i d a r e d o x i n 8 5 % 560 A p o - c y t o c h r o m e P450cam 36% 200 C y t o c h r o m e P450cam 60% 140 . 144 I I I . 3 . 3 P u r i f i c a t i o n o f C y t o c h r o m e P450cam a nd R e l a t e d  B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components I I I . 3 . 3 . 1 P u r i f i c a t i o n P r o c e d u r e A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d a t 5°C u n l e s s s p e c i f i e d o t h e r w i s e . C o n s t a n t f l o w r a t e s w e r e m a i n t a i n e d by g r a v i t y f e e d a t n o t more t h a n 250mm h e a d p r e s s u r e . The p r o t e i n s o l u t i o n s o b t a i n e d f r o m t h e ammonium s a l t f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 2 . 3 ) w e r e c e n t r i f u g e d a t 9,000rpm and c o n c e n t r a t e d t o 1.0-2.0mL by u l t r a f i l t r a t i o n . The c o n c e n t r a t e s o f p u t i d a r e d o x i n and c y t o c h r o m e P450cam w e r e made 50mM i n DTT and i n c u b a t e d a n a e r o b i c a l l y f o r . 3 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) b e f o r e p u r i f i c a t i o n . P r o t e i n s o l u t i o n s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a s e q u e n c e o f two S e p h a d e x G-100 c o l u m n s (1.3 x 50cm) e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r T-100 made lOmM i n DTT and P-100 made 8mM i n camphor r e s p e c t i v e l y ; t h e s e a r e s p e c i f i e d a s Column 1 a n d Column 2. To a v o i d o v e r l o a d i n g o f c o l u m n s a n d t o e n s u r e maximum p u r i f i c a t i o n , e a c h p r o t e i n c o n c e n t r a t e was c h r o m a t o g r a p h e d i n two p o r t i o n s . F r a c t i o n s w e r e s e l e c t e d a n d p u r i f i e d f u r t h e r , on t h e b a s i s o f c o l o r d e n s i t y . A b o u t 7 0% o f f r a c t i o n s f r o m Column 1 w e r e p o o l e d , c o n c e n t r a t e d a n d r e -chroma t o g r a p h e d o n Column 2. I n e a c h c a s e , t h e p u r e s t p r o t e i n was c o n f i n e d t o t h e m i d d l e 3 0 - 4 0 % o f t h e f r a c t i o n s c o l l e c t e d f r o m Column 2. Th e s e f r a c t i o n s w e r e t h e n p o o l e d and c o n c e n t r a t e d t o 1.0-2.0mL a l i q u o t s . P u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e a n d p u t i d a r e d o x i n w e r e f u r t h e r d i a l y s e d f o r a n 14 5 8h p e r i o d a g a i n s t two c h a n g e s o f b u f f e r P (2 x 1.0L) made 5% ( v / v ) i n g l y c e r o l a n d lOmM i n BME r e s p e c t i v e l y . P u t i d a -r e d o x i n was d i a l y s e d u n d e r an a r g o n a t m o s p h e r e . A l l p u r i f i e d p r o t e i n c o n c e n t r a t e s ( s t o c k s o l u t i o n s ) w e r e s u b j e c t e d t o s p e c t r a l a n a l y s i s ( s e e b e l o w ) a nd s t o r e d i n 3.OmL d i s p o s a b l e p l a s t i c s y r i n g e s a t -7 8°C. T a b l e I I I . 8 s u m m a r i z e s t h e y i e l d s e a c h p r o t e i n c omponent o b t a i n e d f r o m t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i -c a t i o n p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v e . Y i e l d s a r e c a l c u l a t e d f r o m t h e m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f e a c h p r o t e i n i n t h e s t o c k s o l u t i o n s a s d e t e r m i n e d by d i r e c t s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e -ment ( s e e S e c t i o n I I I . 3.4), a s s u m i n g p r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t s f o r p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e , p u t i d a r e d o x i n a n d c y t o c h r o m e P450cam o f 4 7 , 0 0 0 , 15,000 and 45,000 r e s p e c t i v e l y . 3 0 ' 3 7 Y i e l d s a r e q u o t e d a s mg o f p r o t e i n p e r 400g o f b a c t e r i a l c e l l p a s t e . 14 6 T a b l e I I I . 8 Y i e l d s o f C y t o c h r o m e P4 50cam and R e l a t e d P r o t e i n Components P r o t e i n Y i e l d (mg/400g c e l l p a s t e ) P u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e none (a) P u t i d a r e d o x i n 91 C y t o c h r o m e P4 50cam 136 a) See R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n , S e c t i o n I V . 2 . 147 I I I . 3 . 4 S p e c t r a l A n a l y s i s o f C y t o c h r o m e P450cam a n d  R e l a t e d B a c t e r i a l M o n o o x y g e n a s e Components G e n e r a l l y , a l l l i q u i d s a n d s o l u t i o n s w e r e h a n d l e d u n d e r an a r g o n a t m o s p h e r e u s i n g S c h l e n k t e c h n i q u e s . 1 4 6 The e l e c t r o n i c a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e p r o s t h e t i c g r o u p o f t h e h o l o p r o t e i n was t h e m o s t c o n v e n i e n t m e thod o f d e t e r m i n i n g t h e c o n c e n t r a t i o n and p u r i t y o f e a c h o f t h e p u r i f i e d s t o c k p r o t e i n s o l u t i o n s . The e l e c t r o n i c s p e c t r a o f p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e a nd p u t i d a r e d o x i n i n t h e i r o x i d i z e d and r e d u c e d s t a t e s , a n d c y t o c h r o m e P4 50cam ( s u b s t r a t e - b o u n d and s u b s t r a t e -f r e e , a n d f e r r o u s - C O ) f o r m s w e r e r e c o r d e d a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) f r o m 700 t o 250nm on a C a r y s p e c t r o p h o t o m e t e r , m o d e l 17D. A l l s p e c t r o s c o p i c measurements' w e r e c a r r i e d o u t i n t h e c e l l - t o n o m e t e r shown i n F i g u r e I I I . 13 a g a i n s t a r e f e r e n c e c e l l c o n t a i n i n g o n l y b u f f e r . The c e l l - t o n o m e t e r c o n s i s t e d o f a c l e a r q u a r t z s q u a r e c e l l (1 x 1 x 5cm), a t t a c h e d t h r o u g h 20cm o f g l a s s t u b i n g t o a s i d e a r m r e s e r v o i r f i t t e d w i t h a B-14 g l a s s j o i n t . A h i g h vacuum O - r i n g j o i n t ( K o n t e s G l a s s Co.) w i t h a B-14 s i d e a r m s o c k e t w e r e u t i l i z e d f o r a t t a c h m e n t t o t h e vacuum/gas h a n d l i n g l i n e . T o t a l v o l u m e o f t h e a p p a r a t u s was 60mL. The r e f e r e n c e c e l l was c o n s t r u c t e d f r o m t h e same q u a r t z c e l l b u t was a t t a c h e d t h r o u g h 5cm o f g l a s s t u b i n g t o a s i l i c o n r u b b e r s e p t u m f i t t i n g a n d a h i g h vacuum O - r i n g j o i n t . The c e l l a r r a n g e m e n t s w e r e made i n t h e g l a s s b l o w i n g s h o p o f t h e C h e m i n s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. 14 8 B-14 sidearm socket /tovacuum^ as handling' line Fitted with a high vacuum teflon O-ring joint Fitted with a B-14 cap Sidearm reservoir Quartz cell F i g u r e I I I . 1 3 The c e l l - t o n o m e t e r 149 P r e p a r a t i o n o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n s f o r s p e c t r a l o b s e r v a t i o n s i n v o l v e d 20-100 f o l d d i l u t i o n o f t h e s t o c k s a m p l e s i n b u f f e r P-100 ( c o n t a i n i n g -8mM camphor f o r c y t o c h r o m e P450cam s o l u t i o n s ) . B u f f e r (=4.8mL) was d i s p e n s e d i n t o t h e t o n o m e t e r r e s e r v o i r and d e g a s s e d by r e p e a t e d e v a c u a t i o n and f l u s h i n g w i t h a r g o n . A b a s e l i n e s p e c t r u m was t h e n o b t a i n e d a g a i n s t t h e r e f e r e n c e c e l l c o n t a i n i n g d e g a s s e d b u f f e r P-100. S t o c k p r o t e i n s o l u t i o n (~0.2mL) was t h e n a d d e d t o a f i n a l v o l u m e o f 5.OmL (-1 x 10 p r o t e i n ; s e e S e c t i o n I I I . 5.3.3) and t h e s p e c t r u m o f t h e o x i d i z e d s t a t e o f e a c h p r o t e i n was o b t a i n e d . The s o l u t i o n was t r a n s f e r r e d b y t i l t i n g t h e l i q u i d i n t o t h e c e l l c a v i t y f r o m t h e r e s e r v o i r . R e d u c t i o n o f f e r r i c c y t o c h r o m e P450cam t o t h e f e r r o u s s t a t e was a c h i e v e d w i t h s o d i u m d i t h i o n i t e -2 d i s s o l v e d i n d e o x y g e n a t e d b u f f e r P-100 (~4mg/mL, =:1 x 10 M) . C y t o c h r o m e s o l u t i o n s w e r e s t o i c h i o m e t r i c a l l y r e d u c e d by m o n i t o r i n g t h e d i t h i o n i t e a b s o r p t i o n b a n d a t 314nm. An a b s o r p t i o n maximum i n t h e c y t o c h r o m e s p e c t r u m a t t h i s w a v e l e n g t h i n d i c a t e d e x c e s s d i t h i o n i t e , a nd h e n c e c o m p l e t i o n o f t h e r e d u c t i o n p r o c e s s . The f e r r o u s - C O c o m p l e x o f c y t o c h r o m e P450cam was f o r m e d by g e n t l y b u b b l i n g c a r b o n m o n o x i d e t h r o u g h t h e r e d u c e d c y t o c h r o m e s a m p l e s . I l l . 3 . 4 . 1 C o n c e n t r a t i o n D e t e r m i n a t i o n s The m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p u r i f i e d p r o t e i n c o m p o n e n t s w e r e d e t e r m i n e d by d i r e c t s p e c t o s c o p i c m e a s u r e -ment u s i n g p u b l i s h e d m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t d a t a ; 3 7 / 1 150 f o r o x i d i z e d p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e , A max 454, e mM = 1 0 . 0 ; f o r o x i d i z e d p u t i d a r e d o x i n , A max 4 55nm, e_ M.= 10.4; an d f o r t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x o f c y t o c h r o m e P450cam, A max 44 6nm, emM = 120. I l l . 3 . 4 . 2 P u r i t y A s s a y The p u r i t y o f t h e t h r e e m o n o x y g e n a s e c o m p o n e n t s was d e t e r m i n e d b a s e d on t h e a b s o r p t i o n r a t i o o f p r o s t h e t i c g r o u p t o t o t a l p r o t e i n i n t h e o x i d i z e d s t a t e o f e a c h p r o t e i n . T h e s e v a l u e s w e r e c o m p a r e d w i t h homogeneous p r e p a r a t i o n s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ; f o r n a t i v e p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e a n A454/A27 5 a b s o r p t i o n r a t i o o f 0.14 was o b s e r v e d w i t h s a m p l e s e s t i m a t e d by s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e (SDS) g e l e l e c t r o p h o r e s i s t o be g r e a t e r t h a n 8 0% h o m o g e n e o u s . 1 4 4 S i m i l a r l y , n a t i v e p u t i d a r e d o x i n g r e a t e r t h a n 98% homogeneous i n t o t a l p r o t e i n m o b i l i t y e x h i b i t e d a n A455/A275 o p t i c a l a b s o r p t i o n r a t i o o f 0 .44 . 3 7 F i n a l l y , s u b s t r a t e c y t o c h r o m e P450cam g r e a t e r t h a n 95% homogeneous by SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s was c h a r a c t e r i z e d by an A391/A280 a b s o r p t i o n r a t i o o f 1 . 4 5 . 1 4 4 151 I I I . 4 P r e p a r a t i o n o f R e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam I I I .4.1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n The p r e p a r a t i o n o f r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P450cam i n t h i s s t u d y i n v o l v e d t h e e x t r a c t i o n o f t h e heme p r o s t h e t i c g r o u p f r o m t h e n a t i v e o r p a r e n t enzyme f o l l o w e d b y a d d i t i o n o f p r o t o h e m i n c h l o r i d e t o t h e a p o p r o t e i n t o r e g e n e r a t e t h e enzyme. The m e t h o d t o be d e s c r i b e d c a n be u s e d t o r e c o n -s t i t u t e n a t i v e c y t o c h r o m e P450cam w i t h a n y o f t h e s u b s t i t u t e d h e m i n s s y n t h e s i z e d i n S e c t i o n I I I . l . The heme g r o u p was remov e d f r o m n a t i v e c y t o c h r o m e P4 50cam i s o l a t e d and p u r i f i e d as i n S e c t i o n I I I . 3 u s i n g a c i d i f i e d , a c e t o n e a t -20°C t o g i v e t h e a p o p r o t e i n i n a r e c o n s t i t u t a b l e f o r m w i t h t h e p r o c e d u r e o f S t r i t t m a t t e r 1 4 7 a s a d o p t e d by Yu and G u n s a l u s . 1 4 8 A p o c y t o c h r o m e P450cam was r e c o n s t i t u t e d w i t h p r o t o h e m i n c h l o r i d e a c c o r d i n g t o t h e method o f Yu a n d G u n s a l u s . 1 4 8 A l l p r o c e d u r e s w e r e p e r f o r m e d i n an a r g o n a t m o s p h e r e . I l l . 4 . 1 . 1 M a t e r i a l s A l l r e a g e n t s u t i l i z e d d u r i n g t h e r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s h a v e b e e n l i s t e d p r e v i o u s l y w i t h t h e f o l l o w i n g e x c e p t i o n s : f r o m F i s h e r ? S c i e n t i f i c C o . , 2 - b u t a n o n e , d i s o d i u m e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a -a c e t a t e ( N a 2 ( H ^ E D T A ) ) , e t h a n o l a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ; a n d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o . , c y s t e i n e ( f r e e b a s e ) and h o r s e h e a r t m y o g l o b i n ( s a l t - f r e e l y o p h i l i z e d p o w d e r ) . A l l s o l v e n t s w e r e u s e d d i r e c t l y w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . 152 111.4 . 2 E x t r a c t i o n o f t h e Heme Group f r o m N a t i v e  C y t o c h r o m e P4 50cam I I I . 4 . 2 . 1 E x t r a c t i o n P r o c e d u r e A c e t o n e (2.5mL p e r mg o f enzyme) was a c i d i f i e d by a d d i n g 0.lmL o f c o n c e n t r a t e d H C l p e r 50mL o f a c e t o n e and t h e m i x t u r e c o o l e d t o -20°C i n a d r y i c e - 3 0 % e t h a n o l s l u s h b a t h . The s o l u t i o n was a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e w i t h s t i r r i n g , and t h e n 1.0-2.0mL o f enzyme s o l u t i o n ( b u f f e r P-100, 8mM c a m p h o r , -3 =10 M c y t o c h r o m e ) was a d d e d d r o p w i s e w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g . The s o l u t i o n was s t i r r e d f o r 10 m i n a n d t h e w h i t e p r o t e i n p r e c i p i t a t e was c o l l e c t e d a t 9,000rpm i n a r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e e q u i l i b r a t e d t o -2 0°C. The p i n k s u p e r n a t a n t , c o n t a i n i n g e x t r a c t e d heme, was r e m o v e d f o r a n a l y s i s ' ( s e e S e c t i o n I I I . 4 . 2 . 2 ) and t h e w h i t e p r o t e i n p e l l e t was i m m e d i a t e l y d i s s o l v e d i n d e o x y g e n a t e d 0.06M kOH (-2 0mL) made 20% ( v / v ) i n g l y c e r o l a n d e q u i l i b r a t e d t o 0°C i n an i c e - w a t e r b a t h . The a p o p r o t e i n s o l u t i o n was d i a l y s e d a t 5°C a g a i n s t d e o x y g e n a t e d w a t e r (1.0L) f o r 6h and t h e n i n d e o x y g e n a t e d b u f f e r P-100 f o r 1 2 h . A s t e a d y f l o w o f a r g o n , p a s s e d t h r o u g h a f i n e s i n t e r e d g l a s s f r i t , was u s e d t o d i s p l a c e o x y g e n f r o m s o l u t i o n d u r i n g t h e d i a l y s i s . The d i a l y s a t e was c e n t r i f u g e d t o remove any d e n a t u r e d p r o t e i n t h a t had p r e c i p i t a t e d and c o n c e n t r a t e d by u l t r a f i l t r a t i o n t o 1.0-2.0mL. The a p o p r o t e i n was k e p t on i c e a t a l l t i m e s a n d u s e d i m m e d i a t e l y t o p r e p a r e t h e p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e . The m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f a p o c y t o c h r o m e P4 50cam was d e t e r m i n e d b a s e d o n i t s a b s o r b a n c e 153 a t 280nm u s i n g m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n -• c o e f f i c i e n t d a t a d e t e r m i n e d i n t h e p r e s e n t w o r k ; 1 4 9 E mjy[ = 91.1,- s e e S e c t i o n I V . 2 . 3 . R e s i d u a l a b s o r p t i o n i n t h e S o r e t r e g i o n (~400nm) o f t h e a p o p r o t e i n s p e c t r u m , i n d i c a t i v e o f i n t a c t c y t o c h r o m e P4 50cam, was removed by r e p e a t i n g t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e . The y i e l d o f a p o c y t o c h r o m e P4 50cam was e s t i m a t e d a s up t o 80% f r o m n a t i v e P450cam. I l l . 4 . 2 . 2 A n a l y s i s o f t h e Heme P r o s t h e t i c G r o u p The p i n k a c i d - a c e t o n e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n o b t a i n e d f r o m t h e heme e x t r a c t i o n p r o c e d u r e was e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e i n a n a l u m i n u m f o i l - w r a p p e d f l a s k t o y i e l d a b l a c k r e s i d u e . The r e s i d u e was d i s s o l v e d i n 1.OmL o f p y r i d i n e a n d s u b j e c t e d t o a n a l y s i s b y TLC on s i l i c a g e l and p o l y a m i d e , and by s p e c t r a l o b s e r v a t i o n o f t h e p y r i d i n e hemochrome c o m p l e x . C h r o m a t o g r a m s w e r e d e v e l o p e d w i t h BMF (110:30:1) a nd m e t h a n o l -a c e t i c a c i d (100:2) s o l v e n t s y s t e m s and t h e hemochrome c o m p l e x was p r e p a r e d a n d a n a l y s e d a s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 1.3. TLC o n s i l i c a g e l (BMF 110:30:1) showed a s i n g l e s p o t a s d i d p o l y a m i d e TLC (BMF 110:30:1) and m e t h a n o l - a c e t i c a c i d (100:2),. T a b l e I I I . 9 l i s t s a b s o r p t i o n d a t a f o r t h e p y r i d i n e hemochrome o f t h e e x t r a c t e d heme a l o n g w i t h a n a l o g o u s d a t a o b t a i n e d f r o m t h e l i t e r a t u r e . The amount o f heme removed f r o m t h e n a t i v e c y t o c h r o m e was d e t e r m i n e d b a s e d o n t h e heme a b s o r b a n c e a t 557nm (e = 3 4 . 4 ) . 1 3 6 a F o r c o m p a r i s o n , t h i s v a l u e was c h e c k e d a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f s t a r t i n g enzyme. The v a l u e s a g r e e d w i t h i n 2 0%. 154 T a b l e I I I . 9 A b s o r b a n c e D a t a f o r t h e P y r i d i n e Hemochrome D e r i v e d f r o m E x t r a c t e d Heme. Heme max(nm) emM S o r e t B max a max E x t r a c t e d X 418 524 556 e 181 20 32 P r o t o - ^ X 418 524 557 e 191.4 17.5 34.4 a) P u b l i s h e d l i t e r a t u r e d a t a ; ( R e f . 1 3 6 a ) . 155 I I I .4.3 R e c o n s t i t u t i o n o f A p o c y t o c h r o m e P450carti I I I . 4 . 3 . 1 R e c o n s t i t u t i o n P r o c e d u r e The a p o p r o t e i n was c o n v e r t e d t o t h e b i o l o g i c a l l y i n a c t i v e P 420 f o r m b y t h e a d d i t i o n o f a s t o c k s o l u t i o n o f p r o t o -h e m i n c h l o r i d e . T h i s s t o c k s o l u t i o n was made up i n a lOmL v o l u m e t r i c f l a s k b y d i s s o l v i n g ~2.0mg o f h e m i n c h l o r i d e i n 0.5mL o f d e o x y g e n a t e d 0.06M kOH c o n t a i n i n g 4% m e t h a n o l , t h e v o l u m e b e i n g b r o u g h t t o lOmL w i t h d e o x y g e n a t e d b u f f e r P-100. F r e s h s t o c k h e m i n s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b e f o r e e a c h r e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t t o a v o i d d e g r a d a t i o n o r a g g r e g a t i o n o f t h e h e m i n on s t a n d i n g . 1 4 8 U s i n g a 50mL p e a r - s h a p e d f l a s k , t h e h e m i n s o l u t i o n was a d d e d d r o p w i s e , w i t h g e n t l e s w i r l i n g , a t a h e m i n - r e p l a c e d t o heme-removed r a t i o o f 1.1; 10% more h e m i n was a d d e d t o t h e a p o c y t o c h r o m e t h a n was r e m o v e d f r o m t h e n a t i v e enzyme. The amount o f heme r e m o v e d f r o m t h e n a t i v e c y t o c h r o m e was c a l c u l a t e d f r o m b o t h t h e p a r e n t enzyme (s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 . 1 ) a n d t h e p y r i d i n e hemochrome s p e c t r u m ( s e e S e c t i o n I I I . 4 . 2 . 2 ) . T r e a t m e n t o f t h e r e c o n s t i t u t e d P420 s o l u t i o n w i t h a n e q u a l v o l u m e o f b u f f e r P-100 c o n t a i n i n g camphor (8mM), c y s t e i n e (lOOmg/mL) and g l y c e r o l ( 4 0 % ( v / v ) ) c o n v e r t e d t h e P420 f o r m s t o t h e P4 50 f o r m a s d e t e r m i n e d by S o r e t a b s o r p t i o n maxima o f t h e r e d u c e d - C O c o m p l e x . E q u a l v o l u m e s o f t h e b u f f e r P-100 ( c a m p h o r ) - c y s t e i n e s o l u t i o n (=5mL) w e r e a d d e d t w i c e , a t two h o u r i n t e r v a l s , d u r i n g t h e 6h i n c u b a t i o n p e r i o d a t room 156 t e m p e r a t u r e (23±2°C). F o l l o w i n g s p e c t r a l a n a l y s i s o f t h e c r u d e r e c o n s t i t u t e d enzyme s o l u t i o n ( S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) , e a c h s a m p l e was c o o l e d t o 0°C i n i c e a n d p u r i f i e d i m m e d i a t e l y . 157 I I I . 4 . 4 P u r i f i c a t i o n o f R e c o n s t i t u t e d C y t o c h r o m e P450cam 111.4.4.1 DE-52 A n i o n E x c h a n g e C h r o m a t o g r a p h y The r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e s o l u t i o n ( S e c t i o n I I I . 4 . 3 . 1 ) (~15mL) was c e n t r i f u g e d a t 9,000rpm f o r 5 m i n and t h e s u p e r -n a t a n t s o l u t i o n a b s o r b e d , a t 5°C, o n t o a DE-52 c e l l u l o s e a n i o n e x c h a n g e c o l u m n (2 x 8 c m ) , e q u i l i b r a t e d w i t h 3mM p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7.0, made 8mM i n c amphor. F l o w r a t e s w e r e m a i n t a i n e d by g r a v i t y f e e d a n d t h e DE-52 c o l u m n was c o n s t r u c t e d f r o m a 50mL P l a s t i p a k d i s p o s a b l e s y r i n g e a s shown i n F i g u r e I I I . 1 4 . A f t e r a b s o r p t i o n , t h e c o l u m n was washed w i t h a t l e a s t 5 b e d v o l u m e s o f e q u i l i b r a t i n g b u f f e r (~250mL) t o remove e x c e s s c y s t e i n e r e a g e n t a s w e l l a s g l y c e r o l . The e l u e n t was t h e n c h a n g e d t o b u f f e r P-100 made 8mM i n camphor and t h e p r o t e i n ( r e d b a n d ) , w h i c h i m m e d i a t e l y moved down t h e c o l u m n , was c o l l e c t e d . The enzyme s o l u t i o n was c o n c e n t r a t e d by u l t r a f i l t r a t i o n t o 1.0-2.0mL and s u b j e c t e d t o s p e c t r a l a n a l y s i s ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) . S a m p l e s e x h i b i t i n g an a b s o r b -a n c e a t 420nm i n t h e r e d u c e d - C O s p e c t r u m w e r e s u b j e c t e d t o a s e c o n d p r o c e d u r e d e s i g n e d t o remove t h i s i m p u r i t y ( s e e b e l o w ) . 111.4.4.2 R e m o v a l o f P420 I m p u r i t i e s The u s e o f e x c e s s h e m i n c h l o r i d e d u r i n g t h e r e c o n s t i t u t i o n p r o c e d u r e p r o m o t e d i m p u r i t y f o r m a t i o n i n t h e f o r m o f "non-s p e c i f i c a l l y " b o und o r " n o n - r e g e n e r a t e d " heme. The i m p u r i t y was m a n i f e s t e d a s a n a b s o r p t i o n a t 420nm i n t h e r e d u c e d - C O s p e c t r u m o f t h e c r u d e r e c o n s t i t u t e d e n z y m e . 1 3 3 < x P u r e s a m p l e s o f t h e r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e r e q u i r e d f o r s p e c t r o s c o p i c 158 Rubber septum Syringe needle Glass wool Syringe needle Rubber cork 50 mL plastic disposable syringe DE-52 gel Sand Tygon tubing F i g u r e I I I . 1 4 A s c h e m a t i c d r a w i n g o f t h e DE-52 c o l u m n c o n s t r u c t e d f r o m a 50mL d i s p o s a b l e s y r i n g e . Leaf 159 missed i n numbering. 160 a n d k i n e t i c s t u d i e s w e r e p r e p a r e d by a d d i n g a p o m y o g l o b i n t o t h e c r u d e c y t o c h r o m e s o l u t i o n s . S i n c e a p o m y o g l o b i n h a s a h i g h e r a f f i n i t y f o r t h e heme g r o u p t h a n d o e s a p o c y t o c h r o m e P 4 5 0 c a n y 1 5 0 t h e u n r e g e n e r a t e d heme (P420 t y p e ) was e f f i c i e n t l y s t r i p p e d f r o m t h e c y t o c h r o m e P450cam s o l u t i o n a n d d i s p o s e d o f i n a f o r m ( m y o g l o b i n - b o u n d ) t h a t was e a s i l y r emoved b y Se p h a d e x G-100 c h r o m a t o g r a p h y . I l l . 4 . 4 . 3 P r o c e d u r e f o r R e m o v a l o f P4 2 0 I m p u r i t i e s F r o m t h e s p e c t r u m o f t h e f e r r o u s - C O a d d u c t o f t h e c r u d e r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e s o l u t i o n s , t h e amount o f u n r e g e n e r a t e d 4 20 57 p r o t o h e m e was e s t i m a t e d u s i n g e m M = 1 7 9 . T h e p r e p a r a t i o n o f a p o m y o g l o b i n i s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 4 . 4 . 4 . Heme t r a n s f e r was a c c o m p l i s h e d by i n c u b a t i n g t h e c r u d e r e c o n s t i t u t e d P4 50cam p r e p a r e d a s i n S e c t i o n I I I . 4.3.2 w i t h a p o m y g l o b i n i n a 50mL p e a r - s h a p e d f l a s k a t a m o l e r a t i o o f h e m e - r e c e p t o r t o P420 o f 1.2. I n c u b a t i o n was done a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) u n d e r an a r g o n a t m o s p h e r e f o r 1.0-3.0 m i n . The p r o t e i n s w e r e t h e n s e p a r a t e d a t 5°C o n a S e p h a d e x G-100 c o l u m n (1.3 x 100cm) e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r P-100 c o n t a i n i n g 8mM camphor. F l o w r a t e s w e r e m a i n t a i n e d by g r a v i t y f e e d . C o lumn c o n s t r u c t i o n was i d e n t i c a l t o t h a t i n F i g u r e I I I . 12. The p r o t e i n s o l u t i o n was a p p l i e d t o t h e c o l u m n i n n o t more t h a n 2.OmL v o l u m e s a n d was d e v e l o p e d w i t h t h e same b u f f e r s y s t e m a t 2 50mm h e a d p r e s s u r e . The p r o t e i n s e l u t e d a s s e p a r a t e b u t d i f f u s e b a n d s (brown) w i t h t h e r e c o n s t i t u t e d m y o g l o b i n e l u t i n g f i r s t . The c y t o c h r o m e P450 b a n d was c o l l e c t e d a f t e r 4.0-5.Oh and c o n c e n t r a t e d b y u l t r a f i l t r a t i o n t o 1.0-2.0mL. F o l l o w i n g s p e c t r a l a n a l y s i s ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) t h e enzyme s o l u t i o n w e r e u s e d i m m e d i a t e l y f o r k i n e t i c e x p e r i -m e n t s . S a m p l e s w e r e s t o r e d u n d e r a r g o n a t -7 8°C i n 3.OmL d i s p o s a b l e s y r i n g e s . I l l . 4 . 4 . 4 P r e p a r a t i o n o f A p o m y o g l o b i n  P r o c e d u r e : The p r o c e d u r e was s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d by B r e s l o w . 1 5 1 A lOOmg s a m p l e o f m y o g l o b i n was d i s s o l v e d i n lOmL o f d e i o n i z e d w a t e r ( 1 % s o l u t i o n ) a t 0°C, a n d t h e pH c a r e f u l l y a d j u s t e d t o 1.5 w i t h 1M HC1. The r e m o v a l o f t h e heme f r o m m y o g l o b i n was e n s u r e d i f t h e pH o f t h e i n i t i a l f e r r i m y o g l o b i h s o l u t i o n was n e a r 1.5 w h i c h i s a c r i t i c a l v a l u e f o r t h e c l e a v a g e o f t h e p r o t e i n - h e m e l i n k . 1 5 1 The s o l u t i o n was t h e n e x t r a c t e d a t o 5 C f x r s t w i t h a n e q u a l v o l u m e o f 2 - b u t a n o n e , t h e n t w i c e more w i t h a h a l f - v o l u m e o f 2 - b u t a n o n e t o remove t h e heme. The r e s u l t i n g s l i g h t l y s t r a w - c o l o r e d s o l u t i o n was t h e n • i m m e d i a t e l y d i a l y s e d a t 5°C a g a i n s t 4 c h a n g e s (4 x 500mL) o f s o d i u m b i c a r b o n a t e s o l u t i o n (50mg/mL) a nd t h e n a g a i n s t s e v e r a l c h a n g e s (5 x 500mL) o f d e i o n i z e d w a t e r . S o l u t i o n c h a n g e s w e r e made e v e r y 6h. The a p o m y o g l o b i n s o l u t i o n was f u r t h e r d i a l y s e d a g a i n s t 2 c h a n g e s (2 x 500mL) o f 1 x 10~ 4M N a 2 ( H 2 E D T A ) s o l u t i o n , and a g a i n s t s e v e r a l c h a n g e s (5 x 500mL) o f d e i o n i z e d H 2 0 . The a p o m y o g l o b i n s o l u t i o n was c e n t r i f u g e d t o remove d e n a t u r e d p r o t e i n t h a t h a d p r e c i p i t a t e d , a n d t h e n c e n c e n t r a t e d t o =5.OmL u s i n g a n A m i c o n UM-2 U l t r a f i l t r a t o r (>1000MWt). F i n a l l y , t h e c o n c e n t r a t e d p r o t e i n s o l u t i o n was d i a l y s e d a g a i n s t 4 c h a n g e s (4 x 250mL) o f b u f f e r P-100 and c o n c e n t r a t e d t o 2.0 - 3.0mL. The m y o g l o b i n s o l u t i o n was u s e d i m m e d i a t e l y f o r t h e r e m o v a l o f u n r e g e n e r a t e d heme f r o m r e c o n s t i t u t e d c y t o c h r o m e P4 50cam. The s o l u t i o n c o u l d be s t o r e d f o r up t o 1 month a t 5°C w i t h o u t a p p r e c i a b l e d e n a t u r a t i o n . The m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f a p o m y o g l o b i n was d e t e r m i n e d b a s e d o n t h e a b s o r b a n c e a t 280nm (e „ = 1 5 . 5 ) . 1 5 1 mM 163 I I I . 5 K i n e t i c S t u d y o f t h e R e a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e w i t h  t h e F e r r o u s C y t o c h r o m e P4 50cam a n d M y o g l o b i n S y s t e m s  by F l a s h P h o t o l y s i s I I I . 5 . 1 The F l a s h P h o t o l y s i s A p p a r a t u s The f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s u t i l i z e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s was d e s i g n e d and c o n s t r u c t e d by C h a n g 1 5 2 a n d i n c l u d e d t h e g e n e r a l f e a t u r e s d e s c r i b e d by G i b s o n 1 3 2 and P o r t e r . 1 3 4 The a p p a r a t u s c o n s i s t e d o f f o u r s u b u n i t s : (1) a m o n o c h r o m a t i c l i g h t s o u r c e ( i . e . a t u n g s t e n lamp and m o n o c h r o m a t o r ) , t h e l i g h t f r o m w h i c h was c o l l i m a t e d and p a s s e d t h r o u g h t h e r e a c t i o n m i x t u r e t o m o n i t o r t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s ; (2) a t h e r m o s t a t e d r e a c t i o n chamber ( i . e . f l a s h a nd s a m p l e c o m p a r t m e n t ) , w i t h a s s o c i a t e d f i l t e r s t o s e l e c t t h e a p p r o p r i a t e m o n i t o r i n g and f l a s h i n g w a v e l e n g t h s o f UV-VIS l i g h t : (3) a p h o t o l y s i s f l a s h ( i . e . p h o t o g r a p h i c f l a s h g u n ) f o r p r o d u c i n g s h o r t p u l s e s o f i n t e n s e l i g h t a l o n g w i t h c h a r g i n g and t r i g g e r i n g e q u i p m e n t ; and ( 4 ) , a n e l e c t r o n i c d e t e c t o r and a r a p i d r e c o r d e r ( i . e . p h o t o m u l t i p l i e r c e l l and o s c i l l o s c o p e ) f o r t h e p h y s i c a l d e t e c t i o n and e s t i m a t i o n o f t r a n s i e n t i n t e r m e d i a t e s . The a r r a n g e m e n t o f t h e s e c o m p o n e n t s i s i l l u s t r a t e d i n t h e b l o c k d i a g r a m o f F i g u r e I I I . 1 5 . The e s s e n t i a l c h a r a c t e r i s t i c s o f e a c h s u b u n i t a r e d e s c r i b e d p r e s e n t l y . S i n c e t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s had n o t b e e n o p e r a t e d f o r s e v e r a l y e a r s a l l s u b u n i t s w e r e d i s m a n t l e d , e x a m i n e d t h o r o u g h l y and r e p a i r e d when n e c e s s a r y . The o r i g i n a l c i r c u i t r y was a n a l y s e d , c l e a n e d , and r e c a l i b r a t e d a s r e q u i r e d . F o r c o n v e n i e n c e , a s m a l l vacuum l i n e f i t t e d w i t h CO g a s Light source Sample compartment t Monochromator Flashing light ^ source t Oscilloscope i g u r e I I I . 1 5 B l o c k d i a g r a m o f f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s . 165 h a n d l i n g e q u i p m e n t was c o n s t r u c t e d a d j a c e n t t o t h e f l a s h u n i t . A l l e q u i p m e n t r e p a i r s w e r e p e r f o r m e d i n t h e e l e c t r i c a l and m e c h a n i c a l s h o p s o f t h e C h e m i s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. The vacuum/CO h a n d i n g l i n e was made i n t h e g l a s s b l o w i n g s h o p , a l s o , o f t h e C h e m i s t r y D e p a r t m e n t , U.B.C. 111.5.1.1 M o n i t o r i n g L i g h t S o u r c e The m o n o c h r o m a t o r o f a Beckman DU S p e c t r o p h o t o m e t e r ( M o d e l 2400) e q u i p p e d w i t h a s t a n d a r d 24 w a t t t u n g s t e n f i l a m e n t a u t o m o b i l e h e a d l a m p , p r o v i d e d t h e c o n t i n u o u s m o n o c h r o m a t i c m o n i t o r i n g s o u r c e a s w e l l a s t h e b a s i c f r a m e w o r k o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s . The lamp was o p e r a t e d f r o m a n e x t e r n a l D.C. r e g u l a t e d power s u p p l y (6V., 3.2amps) and was e n c l o s e d i n t h e o r i g i n a l lamp c o m p a r t m e n t o f t h e Beckman S p e c t r o p h o t o -m e t e r . U n d e r t h e s e o p e r a t i n g c o n d i t i o n s , t h e n o i s e l e v e l i n t h e m o n i t o r i n g beam was k e p t t o a minimum and t h e lamp was a s s u r e d a g r e a t e r l i f e t i m e . 1 3 4 The lamp was t h o r o u g h l y c l e a n e d o f a l l d e b r i s b e f o r e and a f t e r e a c h s e t o f f l a s h e x p e r i m e n t s . 111.5.1.2 F l a s h and S a m p l e C o m p a r t m e n t The o r i g i n a l s a m p l e h o l d e r o f t h e Beckman S p e c t r o -p h o t o m e t e r was r e p l a c e d w i t h a f l a s h a nd s a m p l e c o m p a r t m e n t a d a p t e d f o r c a r r y i n g o u t t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s . S t r u c t u r a l d e t a i l s o f t h e s u b u n i t a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e I I I . 1 6 . A l l p a r t s w e r e c o n s t r u c t e d f r o m b r a s s m e t a l and d a r k e n e d w i t h a b r a s s b l u i n g s o l u t i o n . 166 F i g u r e III.16 S t r u c t u r a l d e t a i l s o f t h e f l a s h a n d s a m p l e c o m p a r t m e n t o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s u n i t . 167 The f l a s h a nd s a m p l e c o m p a r t m e n t , c o n t a i n i n g t h e s a m p l e c e l l h o l d e r , was s u p p l e m e n t e d w i t h a n e x t e n s i o n t o c o n v e n i e n t l y h o u s e t h e c e l l - t o n o m e t e r s ( s e e F i g u r e I I I . 13) a s w e l l a s e f f e c t i v e l y b l o c k a l l e x t e r n a l l i g h t f r o m t h e r e a c t i o n c h a m b e r . T h r e e windows w e r e c u t i n t h e e x t e n s i o n t u b e f o r t h e f l a s h i n g and m o n i t o r i n g l i g h t ( s e e F i g u r e I I I . 1 6 ) . The p h o t o l y z i n g f l a s h l i g h t was a r r a n g e d a t 90° t o t h e m o n i t o r i n g l i g h t a nd c o m p l e t e l y i l l u m i n a t e d t h e s o l u t i o n i n t h e s a m p l e c e l l . The f l a s h i n g l i g h t s o u r c e ( s e e S e c t i o n I I I . 5.1.3) was m o u n t e d on a b r a c k e t f i x e d t o t h e e x i t s l i t f a c e o f t h e Beckman m o n o c h r o m a t o r . To p r e v e n t " b l i n d i n g " t h e p h o t o m u l t i p l i e r d e t e c t o r f r o m t h e b l a s t o f t h e l i g h t p u l s e , a c r o s s o v e r f i l t e r i n g s y s t e m was u t i l i z e d i n w h i c h e s s e n t i a l l y a l l l i g h t f r o m t h e f l a s h was b l o c k e d f r o m e n t e r i n g t h e PMT ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 1 ) . I n e x p e n s i v e b r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r s w e r e p l a c e d i n f r o n t o f t h e f l a s h i n g l i g h t s o u r c e t o s e l e c t t h e d e s i r e d waveband o u t p u t , w h i l e c o s t l y lOnm b a n d p a s s i n t e r f e r e n c e f i l t e r s w e r e p l a c e d b e t w e e n t h e f l a s h i n g chamber an d t h e PMT t o p a s s o n l y t h e m o n i t o r i n g w a v e l e n g t h s . F i l t e r s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e O r i e l G o r p o r a t i o n and E s c o P r o d u c t s , and c r i t e r i o n f o r t h e s e l e c t i o n o f t h e c r o s s o v e r f i l t e r i n g s y s t e m i s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 5.3.1. B a f f l e s w i t h l o n g r e c t a n g u l a r w i n d o w s w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e f l a s h a n d s a m p l e c o m p a r t m e n t t o a c h i e v e c o l l i m a t i o n o f t h e m o n i t o r i n g and f l a s h i n g l i g h t b e f o r e r e a c h i n g t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s . B e t w e e n t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r a n d t h e PMT t h e l i g h t beam was c o l l i m a t e d f u r t h e r by means o f a b l a c k e n e d t u b e (=10cm) 168 c o n t a i n i n g b a f f l e s w i t h s m a l l r e c t a n g u l a r w i n d o w s a t e a c h end ( s e e F i g u r e I I I . 1 6 ) . T e m p e r a t u r e c o n t r o l was p r o v i d e d by a Haake m o d e l Fk c i r c u l a t i n g t h e r m o s t a t i n g b a t h c a p a b l e o f c i r c u l a t i n g t e m p e r a t u r e - e q u i l i b r a t e d m e t h a n o l t h r o u g h t h e f l a s h a n d s a m p l e c o m p a r t m e n t a s w e l l a s a n e x t e r n a l c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h s i m u l t a n e o u s l y ( F i g u r e I I I . 1 7 ) . Hemo-p r o t e i n s o l u t i o n s f o r k i n e t i c a n a l y s i s w e r e e q u i l i b r a t e d i n t h e c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h w h i l e a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e and t h e n p l a c e d i n t h e f l a s h a n d s a m p l e c o m p a r t m e n t t o p e r f o r m t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 2 ) . I l l . 5 . 1 . 3 F l a s h i n g L i g h t S o u r c e The f l a s h p u l s e was p r o v i d e d b y a B r a u n 2000 m o d e l F027 a u t o m a t i c p h o t o g r a p h i c f l a s h g u n o p e r a t e d f r o m an e x t e r n a l r e g u l a t e d D.C. power s u p p l y (6V., 2 a m p s ) . The d e s i r e d l i g h t p u l s e c h a r a c t e r i s t i c s , s p e c i f i c a l l y i n t e n s e f l a s h e s w i t h r a p i d e x t i n g u i s h i n g , w e r e r e a d i l y o b t a i n e d w i t h t h i s s o u r c e . The s i n g l e x e n o n f l a s h lamp d i s s i p a t e d a p p r o x i m a t e l y 40 j o u l e s p e r f l a s h 9 4 0 i n a n e f f e c t i v e t i m e o f 250±20 y s e c ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 2 ) and was s u f f i c i e n t l y p o w e r f u l t o p h o t o d i s s o c i a t e up t o 30% o f t h e c a r b o n y l a t e d m y o g l o b i n a nd P450cam s y s t e m s ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 4 ) . To o b t a i n t h e c o r r e c t p u l s e t i m e , t h e f l a s h e r was e q u i p p e d w i t h a f i b r e - o p t i c s f e e d b a c k s y s t e m . T h i s s y s t e m u t i l i z e d t h e l i g h t s e n s i n g c i r c u i t o f t h e B r a u n f l a s h g u n , w h i c h m e a s u r e s r e f l e c t e d l i g h t and c u t s o f f t h e f l a s h o u t p u t . One end o f t h e f i b r e - o p t i c s t u b e (0.3 x 25cm) was f i x e d i m m e d i a t e l y a d j a c e n t t o t h e f l a s h t u b e w h i l e t h e o t h e r was a t t a c h e d t o t h e s e n s o r ( s e e F i g u r e I I I . 1 6 ) . F l a s h -1*6'9 F i g u r e I I I . 1 7 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e c y l i n d r i c a l w a t e r b a t h u s e d f o r e q u i l i b r a t i o n o f p r o t e i n s o l u t i o n s w h i l e a t t a c h e d t o t h e vacuum/ C O - h a n d l i n g l i n e . 170 l i g h t was f e d b a c k t o t h e s e n s o r via t h e l i g h t p i p e c u t t i n g o f t h e l i g h t p u l s e . The l i g h t d u r a t i o n was e a s i l y c o n t r o l l e d by a d j u s t i n g t h e p o s i t i o n o f t h e t u b e r e l a t i v e t o t h e s e n s o r . The c l o s e r t h e o p t i c s t u b e t o t h e s e n s o r , t h e s o o n e r t h e f l a s h o u t p u t was c u t o f f . A d j u s t m e n t s o f 1.0-3.0mm i n t h i s d i s t a n c e s h i f t e d t h e f l a s h d u r a t i o n f r o m =8msec t o t h e d e s i r e d r a n g e ( = 250 p s e c ; s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 2 ) . " S i n c e t h e "dead t i m e " o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s ( s e e S e c t i o n I I . 5 ) d e p e n d s on t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l i g h t p u l s e , t h e s h a r p e r t h e c u t o f f edge o f t h e p u l s e t h e l e s s e r t h e "dead t i m e " . The "dead t i m e s " o f =250 p s e c m e n t i o n e d a b o v e w e r e s u f f i c i e n t l y s h o r t t o s u c c e s s f u l l y s t u d y t h e k i n e t i c s o f c a r b o n m o n o x i d e b i n d i n g t o t h e c y t o c h r o m e P4 50cam and m y o g l o b i n s y s t e m s . The f l a s h g u n was f i r e d i n d e p e n d e n t l y o f , o r s i m u l t a n e o u s l y w i t h , a s t o r a g e o s c i l l o -s c o p e ( s e e S e c t i o n I I I . 5.1.4) t h r o u g h an e x t e r n a l t r i g g e r i n g c i r c u i t . 1 3 4 A p p r o x i m a t e l y 15 s e c o n d s w e r e r e q u i r e d f o r r e -c h a r g i n g b e t w e e n f l a s h e s b u t u n l i m i t e d numbers o f f l a s h e s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e o n - l i n e power s u p p l y . To o b t a i n p h o t o d i s s o c i a t i o n o f t h e c a r b o n y l a t e d hemo-p r o t e i n s i t was e s s e n t i a l t o remove t h e p r o t e c t i v e p l a s t i c c o n v e x f l a s h t u b e c o v e r i n o r d e r t o a l i g n t h e f l a s h t u b e a s c l o s e t o t h e s a m p l e c e l l a s p o s s i b l e . The d i s t a n c e b e t w e e n t h e f l a s h t u b e a nd s a m p l e c e l l was =1.0cm. The l i g h t p u l s e was c o l l i m a t e d u s i n g b l a c k t a p e t o e n c l o s e a l l b u t t h e f l a s h t u b e a n d r e f l e c t i n g s y s t e m . E x t r e m e c a r e was t a k e n when h a n d l i n g t h e u n p r o t e c t e d f l a s h lamp s o t h a t g r e a s e and d u s t 1.71 w o u l d n o t d u l l t h e f l a s h o u t p u t . The f l a s h t u b e was c a r e f u l l y -c l e a n e d a nd s t o r e d a f t e r e a c h u s e . I l l . 5 . 1 . 4 D e t e c t o r a nd R e c o r d i n g S y s t e m The o r i g i n a l Beckman d e t e c t o r a nd h i g h v o l t a g e power s u p p l y c o m p o n e n t s w e r e r e p l a c e d w i t h a 1P28 p h o t o m u l t i p l i e r h o u s e d i n a PMT p a c k a g e ( m a n u f a c t u r e d b y P r o d u c t s f o r R e s e a r c h I n c . , D a n v e r s , Mass.) a n d r e g u l a t e d D.C. power s u p p l y a d j u s t -a b l e f r o m 300-500 v o l t s . The t r a n s m i s s i o n o u t p u t f r o m t h e PMT was p r o c e s s e d d i r e c t l y t h r o u g h an o n - l i n e e l e c t r o n i c a n a l o g " c o m p u t e r " 1 5 3 t o a v o i d t e d i o u s d a t a a c q u i s i t i o n f o r a b s o r b a n c e c o n v e r s i o n a nd f i t t i n g o f t h e r a t e c o n s t a n t . The A n a l o g R a t e C o n v e r t e r c o n t a i n e d two l o g a m p l i f i e r c i r c u i t s w h i c h c o u l d i n d e p e n d e n t l y g i v e b o t h a n e x p o n e n t i a l d e c a y c u r v e o f t h e a b s o r b a n c e c h a n g e and a l i n e a r t r a c e whose s l o p e vs. t i m e was t h e r a t e c o n s t a n t f o r t h e r e a c t i o n . The c o m p l e t e w o r k i n g c i r c u i t 1 5 2 o f t h e A n a l o g R a t e C o n v e r t e r i s shown i n F i g u r e I I I . 1 8. The o u t p u t f r o m t h e A n a l o g R a t e C o n v e r t e r was c o n n e c t e d d i r e c t l y t o c h a n n e l 1 o f a d u a l t r a c e a m p l i f i e r ( T e k t r o n i x 5A18N) i n a T e k t r o n i x Type R5103N s t o r a g e o s c i l l o s c o p e . The sweep t i m e was c o n t r o l l e d w i t h a T e k t r o n i x 5B10N t i m e b a s e a m p l i f i e r a n d t h e s i g n a l was r e g i s t e r e d a n d s t o r e d w i t h a T e k t r o n i x D - l l s i n g l e beam s t o r a g e u n i t . The o s c i l l o s c o p e t r a c e was i n i t i a t e d i n d e p e n d -e n t l y o f , o r s i m u l t a n e o u s l y w i t h , t h e f l a s h g u n ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 1 . 3 ) t h r o u g h an e x t e r n a l t r i g g e r i n g c i r c u i t . 1 3 4 A l l e x p o n e n t i a l d e c a y c u r v e s and f i r s t o r d e r r a t e p l o t s w e r e i g u r e I I I . 1 8 C o m p l e t e w o r k i n g c i r c u i t o f t h e A n a l o g R a t e C o n v e r t e r . 173 p h o t o g r a p h e d w i t h a T e k t r o n i x C-5 o s c i l l o s c o p e c a m e r a l o a d e d w i t h P o l a r o i d 3000 L a n d F i l m , Type 107. P h o t o g r a p h s w e r e d e v e l o p e d a n d p r o t e c t e d a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s d i r e c t i o n s . I l l . 5 . 1 . 5 O p e r a t i o n o f t h e F l a s h P h o t o l y s i s A p p a r a t u s D e t a i l e d s t e p - b y - s t e p i n s t r u c t i o n s a r e g i v e n i n A p p e n d i x I . 174 I I I .5.2 The F l a s h P h o t o l y s i s E x p e r i m e n t I I I . 5 . 2 . 1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n The f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 20°C on t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x e s o f h o r s e - h e a r t m y o g l o b i n and n a t i v e and p r o t o h e m i n - r e c o n s t i t u t e d P. putida c y t o c h r o m e P450cam. H e m o p r o t e i n s o l u t i o n s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s w e r e p r e p a r e d i n t h e c e l l - t o n o m e t e r shown i n F i g u r e I I I . 1 3 b y d i l u t i o n o f s t o c k h e m o p r o t e i n s o l u t i o n s i n b u f f e r P-100 (made 8mM i n camphor f o r t h e P450cam s y s t e m s ) . The f i n a l v o l u m e o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n s w e r e 5.OmL and p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s , =1 x 10 ^M. S t o c k m y o g l o b i n s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d by d i s s o l v i n g -10mg o f m y o g l o b i n i n 2.OmL b u f f e r P—100, w h i l e m y o g l o b i n s o l u t i o n s f o r s p e c t r a l and k i n e t i c a n a l y s e s r e q u i r e d a d d i t i o n o f -0.7mL o f t h e s t o c k s o l u t i o n t o ~4.3mL o f d e g a s s e d b u f f e r P-100. S t o c k c y t o c h r o m e P450cam s o l u t i o n s , a s p r e p a r e d i n S e c t i o n s i n . 3 a nd I I I . 4, w e r e d i l u t e d b y a d d i t i o n o f = 0 . 2mL s t o c k t o ~4.8mL d e g a s s e d b u f f e r P-100, 8mM camphor. A l l hemo-p r o t e i n s o l u t i o n s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s w e r e p r e p a r e d u n d e r CO w h i l e a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e a d j a c e n t t o t h e f l a s h u n i t , a n d a l l b u f f e r s w e r e d e g a s s e d t h r e e t i m e s b y e m p l o y i n g a f r e e z e a n d thaw s t a t i c vacuum t e c h n i q u e f o l l o w e d by CO s a t u r a t i o n . C o m p l e t e k i n e t i c a n a l y s i s o f e a c h hemo-p r o t e i n r e q u i r e d t h e p r e p a r a t i o n o f d i f f e r e n t p r o t e i n s o l u t i o n s f o r e a c h o f t h r e e s e p a r a t e k i n e t i c r u n s ; t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s o l u t i o n s v a r i e d by -5%. 175 A t y p i c a l f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t i n v o l v e d a n i n i t i a l s p e c t r a l a n a l y s i s o f t h e h e m o p r o t e i n i n t h e f e r r i c , f e r r o u s and f e r r o u s - C O s t a t e s f o l l o w e d by c o m p i l a t i o n o f k i n e t i c d a t a a t s e v e r a l p a r t i a l p r e s s u r e s o f CO f r o m 180 t o 7 50mm Hg. To a v o i d p r o t e i n d e n a t u r a t i o n , s e p a r a t e h e m o p r o t e i n s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d f o r b o t h t h e s p e c t r a l a n d k i n e t i c a n a l y s e s . R e a c t i o n m i x t u r e s f o r s p e c t r a l a n a l y s i s w e r e p r e p a r e d u n d e r a r g o n a s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 3.4, w h i l e s o l u t i o n s f o r f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s w e r e p r e p a r e d u n d e r CO by a s i m i l a r m e t hod d i f f e r i n g o n l y i n t h e b u f f e r - d e g a s s i n g m e c h a n i s m . A p p r o x i m a t e d i l u t i o n s r e q u i r e d f o r t h e m y o g l o b i n and P450cam s o l u t i o n s h a v e b e e n m e n t i o n e d a b o v e . The UV-VIS s p e c t r a o f t h e hemo-p r o t e i n s w e r e o b t a i n e d a t 20°C o n a C a r y 17D s p e c t r o p h o t o -m e t e r e q u i p p e d w i t h a t h e r m o s t a t e d c e l l c o m p a r t m e n t . P r o t e i n s o l u t i o n s f o r s p e c t r o p h o t o m e t r y m e a s u r e m e n t s w e r e t h e r m a l l y e q u i l i b r a t e d f o r 10 m i n ( b e f o r e t h e s p e c t r a w e r e o b t a i n e d ) , i n a r e c t a n g u l a r w a t e r - b a t h s e t up a d j a c e n t t o t h e s p e c t r o p h o t o -m e t e r ( s e e F i g u r e I I I . 1 9 ) . P r o t e i n s o l u t i o n s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s w e r e p r e p a r e d a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) a n d t h e n t r a n s p o r t e d t o t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r f o r e q u i l i b r a t i o n a nd t o r e c o r d t h e s p e c t r a . F o r s u b s e q u e n t c h a n g e s i n t h e CO p r e s s u r e s a s r e q u i r e d d u r i n g t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i -m e n t s , t h e h e m o p r o t e i n s o l u t i o n s w e r e e q u i l i b r a t e d f o r 10 m i n a t 20°C i n a c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h ( F i g u r e I I I . 1 7 ) w h i l e a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e . The f i n a l CO p r e s s u r e was a d j u s t e d f o l l o w i n g t h i s e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . i I F i g u r e I I I . 19 S c h e m a t i c d i a g r a m o f r e c t a n g u l a r w a t e r - b a t h u s e d f o r e q u i l i b r a t i o n o f p r o t e i n s o l u t i o n s a t t h e C a r y s p e c t r o p h o t o m e t e r . CTi 177 The s o l u t i o n s w e r e g e n t l y s w i r l e d f o r -1 m i n t o a l l o w f o r g a s e q u i l i b r a t i o n a nd i m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d t o t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s . Two Haake m o d e l Fk c i r c u l a t i n g t h e r m o s t a t i n g b a t h w e r e t h e r e f o r e r e q u i r e d d u r i n g t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s ; one f o r t h e s i m u l t a n e o u s e q u i l i b r a t i o n o f t h e c e l l c o m p a r t m e n t and e x t e r n a l w a t e r - b a t h a t t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r and t h e o t h e r f o r t h e e q u i l i b r a t i o n o f t h e f l a s h a nd s a m p l e c o m p a r t m e n t o f t h e f l a s h u n i t a nd t h e c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h u t i l i z e d a t t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e . The s p e c t r o s c o p i c c e l l s w e r e l a b e l l e d t o e n s u r e t h a t t h e y w e r e p l a c e d i n t h e c e l l h o l d e r s o f t h e f l a s h u n i t a n d t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r i n t h e same d i r e c t i o n f o r e v e r y e x p e r i m e n t . I n o r d e r t o m o n i t o r t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h hemo-p r o t e i n c o m p l e x t h r o u g h o u t t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s , a s w e l l a s i m p u r i t y f o r m a t i o n i n t h e c y t o c h r o m e P4 5 0cam s a m p l e s ( i . e . P420 t y p e ) , 1 4 8 t h e s p e c t r u m o f t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x was t a k e n b e f o r e and a f t e r k i n e t i c d a t a a c q u i s i t i o n a t e a c h CO p r e s s u r e . T h e s e s p e c t r a w e r e u s e d t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e h e m o p r o t e i n t h r o u g h o u t t h e k i n e t i c e x p e r i m e n t a s w e l l a s c ompare a b s o r p t i o n d a t a ( i . e . A n m and v a l u e s ) w i t h t h e i n i t i a l s p e c t r a l a n a l y s i s o f t h e h e m o p r o t e i n . C o m p l e t e d a t a w e r e c o l l e c t e d f o r t h r e e d i f f e r -e n t s a m p l e s o f e a c h h e m o p r o t e i n and t a b u l a t e d o n t h e d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t s shown i n F i g u r e I I I . 20. F o r d a t a a n a l y s i s p a r t i a l p r e s s u r e s o f CO w e r e c o n v e r t e d t o g a s c o n c e n t r a t i o n s i n s o l u t i o n ; a t 20°C, 1.0mm Hg o f p a r t i a l p r e s s u r e c o r r e s p o n d s (a) Absorbance Data for Hemoprotein (b) WASH PHOTOLYSIS KXPERIHgNTS (C) Sample Description. Experiment Daacriptiom [Beaoprotein]i Sample Description: Tamparaturai Monitoring Wavelength: FLASH PHOTOLYSIS KXPERIHEHTS Sample Daacriptiom Temperature* Data Tabla Data Table Run Plot Porn Cary O.D. Flash Unit Volt. PT (on Hg) v Itm Hg] fco (mm Hg] ICOJxlO* (m/L> Half Life (msec) Run Plot Form Cary O.D. Plash Unit Volt. PT (ma Hg; \° (aa Bg) P C0 (ma Bg) COJxlO4 (b/L) kobs (msec"1) Absorbance Data [Baaoprotain Bpeciea Calculated caH Literature caM Photograph of Exponential Decay Trace Vertical Amplitude (volts/div) Sweep Time: (asec/div) Photograph of Linear Rate Plot. Vertical Amplitudei (volts/div) Sweep Time: (meec/div) Half Life Data Half U f a • Vertical Drop (volts) Horizontal Sweep (msec) Slope (mean) Slope (max) Slope (ain) X (asec) Y (volts) X (msec) Y (volts) X (msec) Y (volts) Laatt Squar.s An.ly.ii  y-in tarc.pt t tyi F i g u r e I I I . 2 0 D a t a a c q u i s i t i o n s h e e t s u t i l i z e d f o r t h e c o l l e c t i o n o f k i n e t i c d a t a ; (a) was u s e d f o r t h e c o l l e c t i o n o f a b s o r b a n c e d a t a , (b) f o r t h e c o l l e c t i o n o f e x p o n e n t i a l d e c a y d a t a a n d (c) f o r t h e c o l l e c t i o n o f l i n e a r p l o t d a t a (6y and 6m o f l i n e a r r a t e p l o t d a t a a r e t h e e r r o r s i n t h e y - i n t e r c e p t a n d s l o p e , r e s p e c t i v e l y , o b t a i n e d f r o m t h e l e a s t s q u a r e s a n a l y s i s o f d a t a p o i n t s ) . 00 t o 1.36 x 10 M f o r C O . 1 0 9 S i n c e t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e v e r y l o w and t h e s o l u b i l i t y o f c a r b o n m o n o x i d e was o f -3 . . . t h e o r d e r o f 1 x 10 M, t h e g a s c o n c e n t r a t i o n i n s o l u t i o n and t h e p a r t i a l p r e s s u r e o f t h e g a s o v e r t h e s o l u t i o n r e m a i n e d e s s e n t i a l l y c o n s t a n t t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t s . A l l p r e s s u r e s w e r e m e a s u r e d w i t h a m e r c u r y manometer and c o r r e c t e d f o r t h e v a p o u r p r e s s u r e o f w a t e r . The c o n c e n t r a t i o n o f t h e m y o g l o b i n s o l u t i o n s was d e t e r m i n e d f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s t o c k s o l u t i o n a n d c h e c k e d by d i r e c t s p e c t r o s c o p i c m e a s u r e m e n t o f t h e f e r r o u s - C O m y o g l o b i n c o m p l e x a t 540nm ( £ m M ~ 1 5 . 4 ) . 1 0 9 I I I .5.2.2 P r o c e d u r e A b s o r b a n c e d a t a o b t a i n e d f r o m t h e i n i t i a l s p e c t r a l a n a l y s i s w e r e r e c o r d e d on d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t F i g u r e I I I . 2 0 a and u s e d t o c a l c u l a t e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s , a s w e l l a s e s t i m a t e t h e p u r i t y o f t h e p r o t e i n p r e p a r a t i o n . T h e s e s p e c t r a w e re a l s o u s e d t o s e l e c t t h e p r o p e r f l a s h i n g and m o n i t o r i n g l i g h t f i l t e r s f o r t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 1 ) . P r o t e i n s o l u t i o n s f o r k i n e t i c m e a s u r e m e n t s w e r e t h e n p r e p a r e d u n d e r CO (1 a t m ) . P r i o r t o t h e a d d i t i o n o f s t o c k p r o t e i n s o l u t i o n d e g a s s e d b u f f e r s w e r e e q u i l i b r a t e d a t t h e C a r y s p e c t r o p h o t o m e t e r and t h e n p l a c e d i n t h e t h e r m o s t a t e d c e l l c o m p a r t m e n t t o o b t a i n a b a s e l i n e s p e c t r u m . S t o c k p r o t e i n s o l u t i o n was t h e n a d d e d and a g a i n t h e s o l u t i o n e q u i l i b r a t e d b e f o r e t h e f e r r i c hemo-p r o t e i n s p e c t r u m o b t a i n e d . S t o i c h i o m e t r i c N a 2 S 2 0 4 ~ r e d u c t i o n 180 o f t h i s s o l u t i o n p r o d u c e d t h e f u l l y c a r b o n y l a t e d h e m o p r o t e i n c o m p l e x , w h i c h was e q u i l i b r a t e d b e f o r e t h e s p e c t r u m o b t a i n e d . S p e c t r a w e r e r e c o r d e d f r o m 7 00 t o 2 5 0nm. The s a m p l e c e l l was t h e n _.emersed i n t h e c y l i n d r i c a l w a t e r b a t h , a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e and c a r e f u l l y e v a c u a t e d t h r e e t i m e s b e i n g c a r e f u l t o a v o i d b o i l i n g o f t h e s o l u t i o n . The c e l l was t h e n l e f t t o e q u i l i b r a t e f o r a f u r t h e r 10 m i n p e r i o d a f t e r w h i c h t h e CO p r e s s u r e was c a r e f u l l y a d j u s t e d o v e r t h e s o l u t i o n . F o l l o w i n g c a l i b r a t i o n o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 1 . 5 ) , t h e s a m p l e s o l u t i o n was r e m o v e d f r o m t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e and p l a c e d i n t h e s a m p l e c o m p a r t m e n t o f t h e f l a s h u n i t t o o b t a i n an e x p o n e n t i a l d e c a y c u r v e f o r t h e C O - f e r r o u s -h e m o p r o t e i n r e c o m b i n a t i o n r e a c t i o n a t t h e s p e c i f i e d CO p r e s s u r e . The t r a c e was p h o t o g r a p h e d and a l l p a r a m e t e r s r e c o r d e d a s on d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t F i g u r e I I I . 2 0 b . The f l a s h u n i t was t h e n r e c a l i b r a t e d a n d t h e p s e u d o f i r s t - o r d e r r a t e p l o t o b t a i n e d . The t r a c e was a g a i n p h o t o g r a p h e d and a l l p a r a m e t e r s r e c o r d e d as on F i g u r e I I I . 2 0 c . The s a m p l e c e l l was t h e n r e m o v e d f r o m t h e f l a s h u n i t a n d t r a n s p o r t e d t o t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r t o o b t a i n a s p e c t r u m o f t h e f e r r o u s -CO c o m p l e x . The CO p r e s s u r e was t h e n r e a d j u s t e d o v e r t h e s o l u t i o n w i t h e q u i l i b r a t i o n a n d t h e a b o v e p r o c e d u r e r e p e a t e d . E x p o n e n t i a l d e c a y c u r v e s and p s e u d o f i r s t - o r d e r r a t e p l o t s w e r e o b t a i n e d a t s e v e n d i f f e r e n t p a r t i a l p r e s s u r e s o f CO b e t w e e n 18 0 t o 750mm Hg. A p p r o x i m a t e l y 2.0 m i n w e r e r e q u i r e d t o p r o d u c e e a c h t r a c e and a n e n t i r e k i n e t i c r u n was c o m p l e t e d i n 3-4h. 181 I I I . 5 . 3 P r e l i m i n a r y E x p e r i m e n t s I I I . 5 . 3 . 1 S e l e c t i o n o f F i l t e r i n g S y s t e m The c r o s s o v e r f i l t e r i n g s y s t e m u t i l i z e d i n t h e f l a s h and s a m p l e c o m p a r t m e n t o f t h e f l a s h u n i t ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 1 . was s e l e c t e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e UV-VIS s p e c t r a o f t h e f e r r o u s a n d f e r r o u s - C O c o m p l e x e s o f m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P450cam ( i . e . f r o m t h e i n i t i a l s p e c t r a l a n a l y s i s ) . The p h o t o d i s s o c i a t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e f r o m t h e f e r r o u s - C O s p e c i e s was i n i t i a t e d ( i . e . f l a s h e d ) f r o m e i t h e r t h e V I S (450-600nm) o r n e a r - U V (350-380nm) band r e g i o n s , w h i l e t h e r e l a x a t i o n p r o c e s s was f o l l o w e d by m o n i t o r i n g t h e S o r e t a b s o r p t i o n p e a k s (420-450nm) o f t h e f e r r o u s - C O o r i n t e r m e d i a t e f i v e - c o o r d i n a t e f e r r o u s s p e c i e s . The i n p u t f l a s h i n g l i g h t a nd t h e m o n i t o r i n g w a v e l e n g t h s w e r e i s o l a t e d w i t h b r o a d b a n d c u t o f f and n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s r e s p e c t i v e l y . F i g u r e I I I . 2 1 shows t h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e f e r r o u s and f e r r o u s - C O s t a t e s o f b o t h p r o t e i n s a l o n g w i t h t h e b r o a d b a n d c u t o f f and n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r c o m b i n a t i o n s m o s t s u i t e d f o r t h e f l a s h p h o t o l y s i s o f t h e s e s y s t e m s . The b r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r s w e r e s e l e c t e d t o u t i l i z e t h e h i g h e s t e n e r g y r e g i o n s o f t h e f l a s h lamp o u t p u t ( 3 0 0 -7 0 0 n m ) 1 5 7 and t o f l a s h t h e a b s o r p t i o n p e a k s o f maximum i n t e n s i t y w i t h i n t h e V I S (450-600nm) and n e a r - U V (350-380nm) r e g i o n s . The p h o t o d i s s o c i a t i o n r e a c t i o n was p r o m o t e d u s i n g a l l o f t h e b r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r s shown i n F i g u r e I I I . 2 1 ; -5 h o w e v e r , a t p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s o f =1 x 10 M t h e 182 400 500 Wavelength (nm) 600 700 (3) <500nm Fe(ii)P450cam F»(a)P«50cam-C0 500 Wavelength (nm) 600 700 F i g u r e I I I . 2 1 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e f e r r o u s and f e r r o u s - C O s t a t e s o f m y o g l o b i n a n d c y t o c h r o m e P450cam a l o n g w i t h t h e b r o a d -b a n d c u t o f f a n d n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s m o s t s u i t e d f o r t h e f l a s h p h o t o l y s i s o f t h e s e s y s t e m s ( F i g u r e s I I I . 21a a n d I I I . 2 1 b r e s p e c t i v e l y ) . 183 p e r t u r b a t i o n s w e r e m o s t n o t e d when t h e m y o g l o b i n s y s t e m was f l a s h e d b e l o w 450nm ( c u t o f f f i l t e r #2, F i g u r e I I I . 2 1 a ; E s c o #S133870) and t h e c y t o c h r o m e P450cam s y s t e m s i n t h e 350 t o 380nm r e g i o n ( c u t o f f f i l t e r #1, F i g u r e I I I . 2 1 b ; O r i e l M o d e l G - 7 7 4 - 3 5 5 0 ) . The n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s w e r e c h o s e n t o m o n i t o r t h e S o r e t a b s o r p t i o n b a n d w h i c h f e l l w i t h i n t h e c a l i b r a t i o n l i m i t (O.D. ~ 1.0) o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s -5 a p p a r a t u s a t p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s o f -1 x 10 M ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 3 ) . F o r t h e m y o g l o b i n s y s t e m , t h e i n t e r m e d i a t e f e r r o u s S o r e t p e a k a t 432nm ( i n t e r f e r e n c e f i l t e r B, F i g u r e I I I . 2 1 a ; E s c o #S904358) was s e l e c t e d w h i l e t h e f e r r o u s - C O p e a k a t 446nm ( i n t e r f e r e n c e f i l t e r B, F i g u r e I I I . 2 1 b ; O r i e l M o d e l G-522-4416) was c h o s e n f o r t h e P450cam s p e c i e s . The i n t e r f e r e n c e f i l t e r b a n d p a s s maxima p a s s e d a s c l o s e t o t h e S o r e t maxima a s p o s s i b l e and m a x i m a l e f f i c i e n c y o f t h e c r o s s - o v e r s y s t e m was a c h i e v e d i f t h e b a n d p a s s maxima o f b o t h f i l t e r s d i d n o t o v e r l a p ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 3 . 2 ) . T a b l e I I I . 1 0 s u m m a r i z e s t h e m o s t e f f e c t i v e f i l t e r c o m b i n a t i o n s u s e d f o r t h e s t u d y o f f e r r o u s m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P450cam w i t h CO by f l a s h p h o t o l y s i s . I I I . 5 . 3 . 2 L i g h t P u l s e C h a r a c t e r i s t i c s The l i g h t p u l s e c h a r a c t e r i s t i c s w e r e o b t a i n e d on t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s as i n d i c a t e d i n S e c t i o n D o f t h e o p e r a t i n g i n s t r u c t i o n s ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 1 . 5 ) . 184 T a b l e I I I . 1 0 M o s t E f f e c t i v e F i l t e r C o m b i n a t i o n s f o r t h e F l a s h P h o t o l y s i s S t u d y o f F e r r o u s M y o g l o b i n and C y t o c h r o m e P450cam w i t h CO C u t o f f I n t e r f e r e n c e H e m o p r o t e i n S o r e t P e a k F i l t e r F i l t e r (nm) (nm) (nm) M y o g l o b i n 432 >450 432 ( f e r r o u s s p e c i e s ) C y t o c h r o m e P450cam ( f e r r o u s - C O s p e c i e s ) 446 350-380 442 18 5 The t i m e - b a s e d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l i g h t p u l s e ( i . e . r i s e t i m e , f l a s h d u r a t i o n , and d a c a y t i m e ) w e r e a d j u s t e d w i t h t h e f i b r e - o p t i c s f e e d b a c k s y s t e m d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 5 . 1 . 3 . W i t h t h e a p p r o p r i a t e b r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r i n p l a c e ( s e e T a b l e I I I . 1 0 ) , a n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r (O.D. = 3.0) was i n s e r t e d b e t w e e n t h e f l a s h and s a m p l e c o m p a r t m e n t and t h e PMT. The p o s i t i o n o f t h e l i g h t p i p e was a d j u s t e d u n t i l a r e p r o d u c i b l e f l a s h t r a c e e x h i b i t i n g a r i s e t i m e o f 30±10 y s e c , . a f l a s h d u r a t i o n t i m e o f 140±20 p s e c , and a d e c a y t i m e o f 60±10 y s e c was o b t a i n e d . The t i m e - b a s e d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f l a s h o u t p u t f r o m a t y p i c a l p h o t o g r a p h i c f l a s h g u n 1 5 4 a r e d e s c r i b e d i n F i g u r e I I I . w h i l e F i g u r e I I I . 23 shows t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e B r a u n f l a s h g u n o u t p u t . The p e a k s h a p e o f t h e f l a s h p u l s e was e x a m i n e d u s i n g a l l t h e b r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r s i n d i c a t e d i n F i g u r e I I I . 2 1 and no d i s t i n c t c h a n g e s i n p e a k s h a p e w e r e o b s e r v e d ; t h e f l a s h lamp g a v e a r e p r o d u c i b l e f l a s h o u t p u t t h a t was i n d e p e n d e n t o f w a v e l e n g t h o f t h e f l a s h i n g l i g h t . To c h e c k t h e e f f i c i e n c y o f t h e c r o s s o v e r f i l t e r i n g s y s t e m , t h e n e u t r a l d e n s i t y f i l t e r was r e p l a c e d w i t h t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s l i s t e d i n T a b l e I I I . 1 0 . L i g h t l e a k a g e t o t h e PMT was m a n i f e s t e d i n a t r a c e w i t h s i m i l a r p u l s e c h a r a c t e r i s t i c s a s o u t l i n e d a b o v e ; h o w e v e r , t h e f i l t e r i n g e f f i c i e n c y was i n c r e a s e d ( i . e . s h o r t e r t i m e - b a s e d c h a r a c t e r -i s t i c s o f t h e f l a s h t r a c e ) a s t h e b a n d p a s s maxima o f t h e c u t o f f and i n t e r f e r e n c e f i l t e r s became f u r t h e r s e p a r a t e d . R e m o v a l o f t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r c a u s e d " b l i n d i n g " o f 186 F i g u r e III.22 Time-based c h a r a c t e r i s t i c s of the f l a s h output from a t y p i c a l photographic f l a s h gun; Ref. 154. 0.0 0.4 0.8 TIME (msec) F i g u r e III.23 Pulse c h a r a c t e r i s t i c s of the f l a s h output from the Braun f l a s h g u n . 187 t h e p h o t o m u l t i p l i e r ( m a n i f e s t e d i n a s q u a r e t r a c e o f a m p t i t u d e 8V and d u r a t i o n 2 5 0 u s e c ) i n d i c a t i n g t h a t t h e m a j o r i t y o f f l a s h i n g l i g h t was b l o c k e d by t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r . I l l .5.3.3 C a l i b r a t i o n C h e c k U n d e r t h e c a l i b r a t i o n p a r a m e t e r s o f t h e A n a l o g R a t e C o n v e r t e r , 1 5 3 t h e p h o t o m u l t i p l i e r t u b e anode c u r r e n t was c o n v e r t e d i n t o a v o l t a g e l i n e a r w i t h a b s o r b a n c e , w i t h I V e q u a l t o 1 OD u n i t . I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e was a d i r e c t p r o p o r t i o n a l i t y b e t w e e n o p t i c a l d e n s i t y o f t h e t e s t s o l u t i o n s and t h e v o l t a g e s c a l e o f t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s a c a l i b r a t i o n c u r v e was c o n s t r u c t e d o v e r a w i d e r a n g e o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s . S o l u t i o n s o f r e d u c e d m y o g l o b i n and t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x o f c y t o c h r o m e P450cam w e r e p r e p a r e d (=1.2 x -4 10 M; s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) and t h e a p p r o p r i a t e f i l t e r s w e r e s e l e c t e d f o r t h e f l a s h u n i t ( T a b l e I I I . 1 0 ) . The S o r e t a b s o r b -a n c e o f e a c h s p e c i e s was o b t a i n e d on t h e C a r y S p e c t r o p h o t o -m e t e r a t t h e b a n d p a s s maxima o f t h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r ( i . e . 432nm f o r r e d u c e d m y o g l o b i n and 442nm f o r r e d u c e d - C O P450cam s p e c i e s ) and t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e f l a s h p h o t o l y s i s u n i t , w h i c h was c a l i b r a t e d a t t h e same r e s p e c t i v e w a v e l e n g t h s , t o o b t a i n t h e c o r r e s p o n d i n g v o l t a g e r e a d i n g . The c o n c e n t r a t i o n o f e a c h s o l u t i o n was d i l u t e d by r e m o v i n g one h a l f o f t h e s o l u t i o n and r e p l a c i n g t h e v o l u m e w i t h d e g a s s e d b u f f e r . The c o r r e s p o n d i n g o p t i c a l d e n s i t y and v o l t a g e r e a d i n g s w e r e 188 r e c o r d e d . S o l u t i o n s w e r e f u r t h e r d i l u t e d s e v e r a l t i m e s and t h e c o r r e s p o n d i n g r e a d i n g s o b t a i n e d . The g r a p h o f OD C a r y vs. V F l a s h U n i t ( F i g u r e I I I . 2 4 ) i n d i c a t e d t h a t t h e c a l i b r a t i o n l i m i t o f t h e f l a s h a p p a r a t u s i s OD - 1.0 a b o v e w h i c h t h e d i r e c t p r o p o r t i o n a l i t y was n o t o b e y e d . The p r o t e i n s o l u t i o n s f o r s p e c t r a l and k i n e t i c 'measurements w e r e t h e r e f o r e p r e p a r e d . a s -5 =1 x 10 M s o l u t i o n s i n o r d e r t o k e e p t h e S o r e t maxima o f t h e f e r r o u s m y o g l o b i n and f e r r o u s - C O P450 c o m p l e x e s a t an OD s 1.0. I l l . 5 . 3.4 E x t e n t o f P h o t o d e c o m p o s i t i o n I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t o f p h o t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e CO c o m p l e x e s o f f e r r o u s m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P450cam by t h e f l a s h i n g l i g h t p u l s e , t h e s p e c t r a o f t h e k i n e t i c i n t e r m e d i a t e s p r o d u c e d by t h e f l a s h w e r e o b t a i n e d . P r o t e i n s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f = 1 x 10 ~*M a s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 3 . 4 and c a r b o n m o n o x i d e was a d d e d t o a f i n a l p r e s s u r e o f 1 atm. E l e c t r o n i c a b s o r p t i o n s p e c t r a o f t h e f e r r o u s and f e r r o u s - C O c o m p l e x e s w e r e o b t a i n e d f o r b o t h h e m o p r o t e i n s . S o l u t i o n s o f t h e f u l l y c a r b o n y l a t e d s p e c i e s w e r e t h e n p l a c e d i n t h e f l a s h p h o t o l y s i s m a c h i n e and e x p o n e n t i a l d e c a y c u r v e s f o r t h e CO r e c o m b i n a t i o n r e a c t i o n w e r e o b t a i n e d a t s i x d i f f e r e n t w a v e l e n g t h s b e t w e e n 400-450nm ( t h e S o r e t r e g i o n o f b o t h t h e m y o g l o b i n and c y t o c h r o m e P450cam c o m p l e x e s ) • S e l e c t i o n o f t h e p a r t i c u l a r w a v e l e n g t h was done w i t h v a r i o u s n a r r o w l i n e i n t e r f e r e n c e f i l t e r s w i t h lOnm b a n d p a s s maxima a t 4 0 0 , Q O CO O A/ Flash Unit Voltage F i g u r e I I I . 24 G r a p h o f o p t i c a l d e n s i t y m e a s u r e d o n t h e 1 C a r y S p e c t r o p h o t o m e t e r vs. V o l t a g e on t h e , f l a s h u n i t . \ 00 190 4 0 5 , 420, 430, 4 3 5 , 4 4 2 , and 450nm ( a v a i l a b l e f r o m O r i e l a nd E s c o ) .. B r o a d b a n d c u t o f f f i l t e r s f o r s e l e c t i o n o f f l a s h i n g l i g h t w e r e t h o s e l i s t e d i n T a b l e I I I . 1 0 . The i n i t i a l a b s o r b -a n c e ( a t t i m e = 0 ) o n t h e e x p o n e n t i a l d e c a y t r a c e s was t a k e n a s t h e m a x i m a l a b s o r b a n c e c h a n g e i n s o l u t i o n a t t h e p r e c i s e moment t h e CO was f l a s h e d o f f . These a b s o r b a n c e v a l u e s w e r e t h e n p l o t t e d on t h e e l e c t r o n i c a b s o r p t i o n s p e c t r a o f f e r r o u s a n d f e r r o u s - C O m y o g l o b i n a n d c y t o c h r o m e P4 50cam ( s e e F i g u r e I I I . 2 5 a , b ) . F o r b o t h p r o t e i n s t h e r e s u l t i n g s p e c t r a o f t h e k i n e t i c i n t e r m e d i a t e s showed -30% p h o t o d e c o m p o s i t i o n , a s c a l c u l a t e d b y t h e a b s o r b a n c e c h a n g e o f t h e f e r r o u s - C O S o r e t a b s o r p t i o n . As w e l l t h e s e s p e c t r a p a s s e d d i r e c t l y t h r o u g h t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c i s o s b e s t i c p o i n t s o f t h e f e r r o u s and f e r r o u s - C O c o m p l e x e s o f m y o g l o b i n ( a t , 4 0 7 , 427, and 457nm; s e e F i g u r e I I I . 2 5 a ) and c y t o c h r o m e P4 50cam ( a t 429 and 465nm; s e e F i g u r e I I I . 2 5 b ) , i n d i c a t i n g t h a t d i s s o c i a t i o n o f t h e CO w a s - t h e ..only e f f e c t o f t h e p h o t o d e c o m p o s i t i o n p r o c e s s (raw d a t a a r e g i v e n i n - A p p e n d i x I I I ) . A l l measurements, w e r e o b t a i n e d a t 20°C. I l l . 5 . 3 . 5 K i n e t i c S t u d y o f CO B i n d i n g t h e F e r r o u s M y o g l o b i n I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e f l a s h p h o t o l y s i s a p p a r a t u s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y was o p e r a b l e , t h e u n i t was a p p l i e d t o t h e w e l l - d o c u m e n t e d and t h e o r e t i c a l l y s i m p l e r e a c t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e w i t h m e t h m y o g l o b i n . The k i n e t i c r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e o u t l i n e d i n S e c t i o n I I I . 5.2 w e r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h t h o s e r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a n d a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l l a t e r ( s e e S e c t i o n I V . 4.2) . 191 a) Fe(n)Mb Fe(n)Mb-C0 Kinetic Intermediate 500 Wavelength (nm) 700 Fe(ii)P450cam Fe(n)P4SOcam-CO Kinetic Intermediate 250 300 400 500 Wavelength (nm) 600 700 F i g u r e I I I . 2 5 S p e c t r a o f t h e k i n e t i c i n t e r m e d i a t e s f o r m e d by p h o t o d e c o m p o s i t i o n o f t h e f e r r o u s - C O c o m p l e x e s o f m y o g l o b i n (a) and c y t o c h r o m e P450cam ( b ) . 192 I I I . 6 S p e c t r o p h o t o m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f t h e E q u i l i b r i u m  C o n s t a n t f o r t h e R e a c t i o n o f C a r b o n M o n o x i d e  w i t h F e r r o u s C y t o c h r o m e P4 50cam I I I . 6 . 1 G e n e r a l I n f o r m a t i o n E q u i l i b r i u m c o n s t a n t (Kco) m e a s u r e m e n t s f o r R e a c t i o n I I . 5 were made by f o l l o w i n g VIS a n d n e a r UV ( e . g . t h e S o r e t b a n d s ) s p e c t r a l c h a n g e s w i t h c h a n g e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c a r b o n m o n o x i d e l i g a n d . The e q u i l i b r i u m e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 20°C w i t h t h e n a t i v e r e d u c e d c y t o c h r o m e P450cam c o m p l e x u s i n g s t a n d a r d s p e c t r o p h o t o m e t r i c t e c h n i q u e s . 8 F o l l o w i n g t h e i n i t i a l s p e c t r a l a n a l y s i s o f t h e enzyme, s e p a r a t e p r o t e i n s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d u n d e r a r g o n f o r t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t m e a s u r e m e n t s ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) . The e x p e r i m e n t a l f o r m a t , i n c l u d i n g e q u i p m e n t , f o l l o w e d c l o s e l y t h a t o u t l i n e d f o r t h e f l a s h p h o t o l y s i s e x p e r i m e n t s i n S e c t i o n I I I . 5.2. For d a t a a n a l y s i s , p a r t i a l p r e s s u r e s o f CO w e r e c o n v e r t e d t o g a s c o n c e n t r a t i o n s i n s o l u t i o n ( s e e S e c t i o n I I I . 5 . 2 . 1 ) . E q u i l i b r i u m d a t a was t a b u l a t e d on d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t s shown i n F i g u r e s I I I . 26 a a n d b w h i l e a b s o r b a n c e d a t a was t a b u l a t e d as i n F i g u r e I I I . 1 8 a . CO p r e s s u r e s w e r e m e a s u r e d w i t h a d i - n - b u t y l p h t h a l a t e ( o i l ) manometer and c o r r e c t e d f o r t h e v a p o u r p r e s s u r e o f w a t e r . P a r t i a l p r e s s u r e s o f CO i n mm o i l w e r e c o n v e r t e d t o mm Hg -2 f o r d a t a a n a l y s i s ( i . e . (mm o i l ) 7.73x10 = mm H g ) . I l l .6 .2 M a t e r i a l s A l l r e a g e n t s h a v e b e e n o b t a i n e d a s p r e v i o u s l y l i s t e d e x c e p t f o r t h e f o l l o w i n g ; f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c , d i - n -b u t y l p h t h a l a t e . (a) E q u i l i b r i u m Data Sample D e s c r i p t i o n : Temperature: Vapour Pressure of HjO: Data Table T h e o r e t i c a l 3 5 5 Experimental Species I Wanted Pco mm H g ( o i l ) T o t a l (mm o i l ) Pco (nun o i l ) (b) Data A n a l y s i s Wavelength Maxima : Absorbance of Pure S p e c i e s : Ao A. Data Table Pco [CO 1x10 (mm Hg) (M) Log [CO] A-Ao A.-A A-AO A.-A log F i g u r e I I I . 26 D a t a a q u i s i t i o n s h e e t s u t i l i z e d f o r t h e c o l l e c t i o n o f e q u i l i b r i u m d a t a (a) a n d d a t a a n a l y s i s (b) . , to 194 I I I . 6 . 3 P r o c e d u r e P r i o r t o a d d i t i o n o f s t o c k c y t o c h r o m e s o l u t i o n , b u f f e r s f o r t h e e q u i l i b r i u m m e a s u r e m e n t s w e r e d e g a s s e d t h r e e - t i m e s w i t h a f r e e z e - t h a w s t a t i c vacuum t e c h n i q u e f o l l o w e d by a r g o n s a t u r a t i o n . The d e g a s s e d b u f f e r was e q u i l i b r a t e d f o r 10 m i n i n t h e r e c t a n g u l a r w a t e r - b a t h a d j a c e n t t o t h e C a r y S p e c t r o -p h o t o m e t e r ( s e e F i g u r e I I I . 1 9 ) a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e t h e r m o s t a t e d c e l l c o m p a r t m e n t o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r t o o b t a i n a b a s e l i n e s p e c t r u m . S p e c t r a w e re r e c o r d e d f r o m 500 t o 250nm. The enzyme s o l u t i o n was t h e n r e d u c e d w i t h t h e a d d i t i o n o f N a ^ S , ^ s o l u t i o n ( s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 ) and e q u i l i b r a t e d f o r a n o t h e r 10 m i n i n t h e e x t e r n a l w a t e r - b a t h . The e q u i l i b r a t e d s o l u t i o n was a g a i n t r a n s f e r r e d t o t h e t h e r m o s t a t e d c e l l c o m p a r t m e n t o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r t o o b t a i n t h e i n i t i a l f e r r o u s c y t o c h r o m e P450cam s p e c t r u m . The s a m p l e c e l l was t h e n emers.ed. i n t h e c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h (se e F i g u r e I I I . 1 7 ) and a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e . F o l l o w i n g e v a c u a t i o n o f t h e s a m p l e s o l u t i o n , known p r e s s u r e s o f c a r b o n m o n o x i d e (2-20 t o r r ) w e r e a d m i t t e d t o t h e a r g o n - f r e e s y s t e m . The a r g o n a t m o s p h e r e was r e m o v e d by g r a d u a l e v a c u a t i o n o f t h e s a m p l e c e l l a n d c a r e was t a k e n t o a v o i d b o i l i n g o f t h e p r o t e i n s o l u t i o n . C o m p l e t e e v a c u a t i o n o f t h e c e l l was d e t e r m i n e d by m e a s u r i n g t h e v a p o u r p r e s s u r e o f t h e a q u e o u s b u f f e r w i t h t h e manometer; a t 2 0°C v a p o u r p r e s s u r e o f w a t e r i s 17.5 t o r r (228mm o i l ) . 1 5 5 The s y s t e m was e v a c u a t e d up t o t h r e e t i m e s t o o b t a i n a c o n s t a n t w a t e r v a p o u r 195 p r e s s u r e r e a d i n g . Once e v a c u a t e d , t h e s y s t e m was a l l o w e d t o e q u i l i b r a t e f o r 10 m i n i n t h e c y l i n d r i c a l w a t e r - b a t h w h i l e s t i l l a t t a c h e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e . C h a n g e s i n i n t e r n a l p r e s s u r e o f t h e s y s t e m (due t o l e a k a g e ) w e r e c l o s e l y m o n i t o r e d d u r i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d a nd i f t h e manometer r e a d i n g s r e m a i n e d s t a t i o n a r y t h r o u g h o u t t h i s t i m e CO p r e s s u r e s w e r e c a r e f u l l y l e t i n t o t h e s y s t e m . The s o l u t i o n s w e r e g e n t l y s w i r l e d f o r =1 m i n t o a l l o w f o r g a s e q u i l i b r a t i o n , t r a n s p o r t e d t o t h e w a t e r - b a t h s e t up n e x t t o t h e C a r y s p e c t r o p h o t o m e t e r f o r a f u r t h e r 5 m i n e q u i l i b r a t i o n p e r i o d , and t h e n i m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d t o t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r t o o b t a i n a s p e c t r u m o f t h e p a r t i a l l y c a r b o n y l a t e d s y s t e m . Once t h e s p e c t r u m was o b t a i n e d t h e c e l l was r e t u r n e d t o t h e vacuum/CO h a n d l i n g l i n e , t h e p r e s s u r e o f CO r e a d j u s t e d o v e r t h e s o l u t i o n w i t h e q u i l i b r a t i o n a n d a n o t h e r s p e c t r u m o f t h e p a r t i a l l y c a r b o n y l a t e d s y s t e m was t a k e n . A p p r o x i m a t e l y n i n e d i f f e r e n t s p e c t r a w e r e o b t a i n e d a t CO p r e s s u r e s up t o 4 5 t o r r . The f i n a l s p e c t r u m o f t h e f u l l y c a r b o n y l a t e d c y t o c h r o m e c o m p l e x was o b t a i n e d a t 1 atm CO p r e s s u r e . D a t a a n a l y s e s f o r t h e e q u i l i b r i u m s t u d i e s w e r e r e c o r d e d ^ on t h e d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t i n F i g u r e 26a and a n a l y s e d a c c o r d i n g t o d a t a a c q u i s i t i o n s h e e t i n F i g u r e 26b. CHAPTER I V RESULTS AND DISCUSSION 197 I V . 1 G r o w t h o f P. putida s t r a i n PpG 786 P. putida, s t r a i n PpG 7 8 6 , was u t i l i z e d i n t h i s s t u d y b e c a u s e i t p o s s e s s e s s e v e r a l a d v a n t a g e s o v e r t h e p a r e n t s t r a i n , PpG l . 3 7 T h e s e i n c l u d e s h o r t e r g e n e r a t i o n t i m e s o n D - ( + ) - c a m p h o r , . r e s i s t a n c e t o l y s i s by b a c t e r i o p h a g e , a n d r e l e a s e o f t h e h y d r o x y l a s e p r o t e i n s b y s i m p l e f r e e z e - t h a w a u t o l y s i s . The a d v a n t a g e s o f u s i n g t h e m u t a n t s t r a i n PpG 786 n o t o n l y a l l o w e d f o r r a p i d a n d - q u a n t i t a t i v e p r o d u c t i o n o f t h e b a c t e r i u m - but" a l s o p r o v i d e d e a s y a c c e s s t o • t h e P450cam enzyme and r e l a t e d m o nooxygenase c o m p o n e n t s . A l t h o u g h t h e g r o w t h s e q u e n c e d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 2 p r o v i d e d t h e m o s t r e l i a b l e m ethod f o r o b t a i n i n g l a r g e amounts o f t h e b a c t e r i a , a n d i n t u r n t h e m o n o o x y g e n ase c o m p o n e n t s , p r o b l e m s w e r e i n i t i a l l y e n c o u n t e r e d i n o b t a i n i n g a smooth p r o g r e s s i o n i n b a c t e r i a l g r o w t h f r o m t h e m a i n t e n a n c e s t a g e t o h a r v e s t a b l e q u a n t i t i e s i n t h e 14L f e r m e n t o r s . T h e s e p r o b l e m s e l u c i d a t e d s e v e r a l i m p o r t a n t g r o w t h a s w e l l a s g e n e r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s s t r a i n o f b a c t e r i a . E a r l y e x p e r i m e n t s i n v o k e d a s i m i l a r g r o w t h s e q u e n c e t o t h a t d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 2.5,f e x c e p t t h e b a c t e r i a w e r e m a i n t a i n e d o n m i n i m a l a g a r c o n t a i n i n g g l u c o s e , c i t r a t e ( s o d i u m s a l t ) , a n d 1 - a s p a r a g i n e a s t h e c a r b o n and e n e r g y s o u r c e s a n d i n o c u l a f o r t h e 14L f e r m e n t o r c u l t u r e s w e r e s t a r t e d i n L - b r o t h medium and d e v e l o p e d i n a s i n g l e s e t o f 1.0L s h a k e - f l a s k s , . w h i c h c o n t a i n e d PA s o l u t i o n (500mL), 100 x s a l t s (5mL) and g l u t a m i c a c i d ( l O m L ) . I n d u c t i o n o f t h e camphor monooxygenase c o m p o n e n t s 198 was i n i t i a t e d i n the 1.OL s h a k e - f l a s k s a t m i d - l o g a r i t h m i c growth phase by the a d d i t i o n of 3M camphor i n DMF, and the c u l t u r e allowed to progress to l a t e - l o g a r i t h m i c growth phase ( = 7h, see F i g u r e IV.1). The c u l t u r e , which was assumed to be m e t a b o l i z i n g camphor, was then used to i n o c u l a t e the 14L fermentor media prepared as i n S e c t i o n I I I . 2 . 5 . Rapid i n i t i a l growth i n the 14L fermentors was f o l l o w e d by a p e r i o d of r a p i d d e c l i n e i n o p t i c a l d e n s i t y a t 660nm, e i t h e r ending i n complete n e c r o s i s of the c u l t u r e or remaining s t a t i o n a r y a t an i n t e r m e d i a t e l e v e l ( i . e . a l a g phase, see F i g u r e IV.2). This drop i n o p t i c a l d e n s i t y was accompanied by accumulation of l a r g e amounts o f c e l l d e b r i s i n d i c a t i v e of c e l l l y s i s and death. Growth i n the 14L fermentors was not f o l l o w e d f o r more than 25h. S e v e r a l experiments were then performed a t the s h a k e - f l a s k stage to determine the growth c h a r a c t e r i s t i c s of the bacterium over extended lengths of time. R e s u l t s o b t a i n e d from the experiments showed t h a t the l a g phase c o u l d l a s t as l ong as 60h before the b a c t e r i a began to a c t i v e l y m etabolize the camphor s u b s t r a t e , but more commonly, the l a g times ranged from 20-40h (Figure IV.3). A l l growth curves obtained were c h a r a c t e r i z e d by the same d i s t i n c t p r o f i l e as t h a t i n d i c a t e d i n F i g u r e IV.3; an i n i t i a l r a p i d growth phase e v e n t u a l l y gave way to a l a r g e r secondary growth phase a t t r i b u t e d to the u t i l i z a t i o n of camphor. A c t i v e camphor metabolism was r e c o g n i z e d by a marked i n c r e a s e i n o p t i c a l d e n s i t y of the medium f o l l o w i n g the l a g p e r i o d , p r o d u c t i o n of a d i s t i n c t odour p e c u l i a r to the camphor-199 F i g u r e I V . 1 1.0i G r o w t h o f P. putida,- s t r a i n PpG786, a t t h e 1 OL s h a k e - f l a s k s t a g e d u r i n g e a r l y g r o w t h e x p e r i m e n t s . Death phase F i g u r e I V . 2 Time (h) G r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG786, a t t h e 14L f e r m e n t o r s t a g e d u r i n g e a r l y g r o w t h e x p e r i m e n t s . 0.0 J 1 i i i 1 1 0.0 15 30 45 60 75 ' Time (n) F i g u r e IV.3 G r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f P. putida, s t r a i n PpG786, o v e r e x t e n d e d l e n g t h s o f t i m e i n s h a k e - f l a s k m e d i a . O o 201 m e t a b o l i z i n g b a c t e r i a , and t h e a c c u m u l a t i o n o f p i n k i s h -c o l o r e d b a c t e r i a (due t o h i g h c y t o c h r o m e P450cam c o n t e n t ) . 3 7 As w e l l , d i s t i n c t t r e n d s i n pH o f t h e medium w e r e a s c r i b e d t o b a c t e r i a l m e t a b o l i s m o f camphor vs. t h e s i m p l e r o r g a n i c s u b s t r a t e s s u c h a s g l u c o s e and g l u t a m a t e . G r o w t h on g l u c o s e and g l u t a m i c a c i d , s u c h a s a t t h e L - b r o t h s t a g e and i n i t i a l g r o w t h i n t h e 1.0L s h a k e - f l a s k s ( s e e F i g u r e s I I I . 7 . a nd I V . 1 , r e s p e c t i v e l y ) , was a c c o m p a n i e d by an i n c r e a s e i n pH o f t h e medium w h i l e c a m p h o r - m e t a b o l i s m was a s s o c i a t e d w i t h a g r a d u a l d e c r e a s e i n pH ( F i g u r e I I I . 9 ) . A r a t i o n a l e f o r t h e o b s e r v e d t r e n d s i n pH i s d i f f i c u l t w i t h o u t c l o s e r e x a m i n a t i o n o f m e t a b o l i t e s and c h a n g e s i n medium c o m p o s i t i o n ; h o w e v e r , t h e d e c r e a s e i n pH o f t h e medium d u r i n g camphor m e t a b o l i s m i s known t o be d u e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f o r g a n i c a c i d m e t a b o l i t e s o f camphor d e g r a d a t i o n by P. putida.158'15^ F o l l o w i n g t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e g r o w t h s e q u e n c e was m o d i f i e d t o t h a t d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 2. A c t i v e c a m p h o r -m e t a b o l i z i n g b a c t e r i a w e r e p l a t e d on m i n i m a l a g a r c o n t a i n i n g camphor a s t h e o n l y c a r b o n and e n e r g y s o u r c e ( s e e S e c t i o n I I I . 2.4.1) and a s e c o n d s e t o f s h a k e - f l a s k s , c o n t a i n i n g o n l y PA s o l u t i o n and camphor ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) , was i n c l u d e d . The s i z e o f t h e s h a k e - f l a s k c o n t a i n e r s and t h e v o l u m e o f m e d i a w e r e r e d u c e d t o p r o m o t e b e t t e r a e r a t i o n o f t h e m e d i a ( s e e S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) . T h e s e c h a n g e s e n s u r e d t h a t t h e s h a k e - f l a s k i n o c u l u m f o r t h e 14L f e r m e n t o r medium was a c t i v e l y m e t a b o l i z i n g c a m p h o r . S u b s e q u e n t r e s u l t s showed g r o w t h i n t h e f i r s t s e t o f 500mL s h a k e - f l a s k s f o l l o w e d t h e same b i p h a s i c n a t u r e a s 202 o b s e r v e d p r e v i o u s l y i n t h e 1. OL s h a k e - f l a s k s ( F i g u r e I V . 3), e x c e p t t h e l a g t i m e was s h o r t e n e d ( 6 - 1 2 h , s e e F i g u r e I I I . 8 ) . I n o c u l u m f o r t h e s e c o n d s e t o f 500mL s h a k e - f l a s k s was o b t a i n e d t h e r e f o r e f o l l o w i n g e s t a b l i s h e d g r o w t h on camphor i n t h e f i r s t s e t o f s h a k e - f l a s k s (~25h). N e a r l o g a r i t h m i c g r o w t h on camphor was t h e n o b s e r v e d r e p r o d u c i b l y i n t h e s e c o n d s h a k e - f l a s k c u l t u r e s a s w e l l a s i n t h e 14L f e r m e n t o r m e d i a ( F i g u r e s I I I . 9 a n d I I I . 1 0 ) . T h e s e e x p e r i m e n t s f o r m e d t h e b a s i s o f t h e b a c t e r i a l g r o w t h p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 2. The b i p h a s i c n a t u r e o f t h e g r o w t h c u r v e o b s e r v e d d u r i n g t h e g r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG 786, ( F i g u r e I I I . 8) i s c a l l e d d i a u x i e 1 6 0 and i s a common phenomena e x h i b i t e d by g r o w i n g b a c t e r i a . Under c e r t a i n c i r c u m s t a n c e s , t h e a d a p t i v e r e s p o n s e o f a g r o w i n g c u l t u r e t o a n a d d e d s u b s t r a t e may be b l o c k e d by t h e p r e s e n c e o f a more f a v o u r e d s u b s t r a t e , t h a t s u p p o r t s f a s t e r g r o w t h . The m e c h a n i s m , w h i c h p r o m o t e s m e t a b o l i c economy, was f i r s t d i s c o v e r e d i n 1940 by K l u y v e r 1 6 0 b u t t h e m o s t c l a s s i c e x a m p l e was r e p o r t e d i n 1942 by Monod 1 6 0 f o r g r o w t h o f Escherichia c o l i o n g l u c o s e and s o r b i t o l . I n t h i s c a s e E. c o l i consumed t h e g l u c o s e f i r s t and t h e n , a f t e r a s h o r t l a g p e r i o d , r e s u m e d g r o w t h on s o r b i t o l . F u r t h e r a n a l y s i s showed t h a t g l u c o s e r e p r e s s e d t h e i n d u c t i o n o f t h e enzymes and membrane t r a n s p o r t s y s t e m s r e q u i r e d f o r t h e u t i l i z a t i o n o f s o r b i t o l . T h i s d i a u x i e g r o w t h b e h a v i o r e x h i b i t e d by E. c o l i was m a n i f e s t e d i n a b i p h a s i c g r o w t h c u r v e s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d f o r g r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG 786, i n t h e p r e s e n c e o f g l u t a m i c a c i d a n d camphor ( F i g u r e I I I . 8 , s e e S e c t i o n I I I . 2 . 5 ) . The i n i t i a l g r o w t h p h a s e 203 o f F i g u r e I I I . 8 c a n be a t t r i b u t e d t o u t i l i z a t i o n o f g l u t a m i c a c i d s i n c e t h i s was t h e o n l y c a r b o n s o u r c e p r e s e n t i n - t h e medium p r i o r t o i n d u c t i o n " o f t h e camphor monooxygenase c o m p o n e n t s . As w e l l , a n a l y s i s o f F i g u r e I I I . 8 and I V . 1 i n d i c a t e s t h a t t h e i n i t i a l g r o w t h r a t e ( i . e . i n i t i a l s l o p e o f t h e g r o w t h c u r v e ) was ..., u n a f f e c t e d * by t h e a d d i t i o n o f camphor and was much f a s t e r t h a n t h e g r o w t h r a t e on-camphor a l o n e ( F i g u r e I I I . 1 . 0 ) . T h i s • b e h a v i o r seems r e a s o n a b l e b y a n a l o g y t o t h e E. coH s y s t e m , s i n c e t h e s i m p l e c a r b o n s o u r c e , g l u t a m i c a c i d , w o u l d l i k e l y be u t i l i z e d b e f o r e t h e c o m p l e x camphor m o l e c u l e a s w e l l a s be f a v o u r a b l e f o r f a s t e r g r o w t h . W h e t h e r o r n o t g l u t a m i c a c i d m e t a b o l i s m r e p r e s s e s t h e u t i l i z a t i o n o f camphor w o u l d i n v o l v e a more d e t a i l e d i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f P. putida, s t r a i n PpG 786. The o b s e r v e d g r o w t h p r o f i l e i n F i g u r e I I I . 8 may be i n f a c t t h e r e s u l t a n t o f two s u p e r i m p o s e d g r o w t h c u r v e s ; one f o r i n i t i a l g r o w t h o f g l u t a m i c a c i d a n d t h e o t h e r f o r s l o w e r g r o w t h on camphor. I t s h o u l d be n o t e d t h a t d i a u x i c g r o w t h c u r v e s s u c h a s t h e s e h a v e b e e n r e p o r t e d by G u n s a l u s et al.15^ f o r g r o w t h o f P. putida, s t r a i n PpG 1, ( p a r e n t s t r a i n ) on camphor and camphor m e t a b o l i t e s ; h o w e v e r , t h e m e c h a n i s m o f t h e o b s e r v e d d i a u x i c g r o w t h was n o t p r o b e d . A n o t h e r i m p o r t a n t f e a t u r e o f t h e g r o w t h c u r v e s f o r P. putida, s t r a i n PpG 7 8 6 , i s t h e l a g p e r i o d b e t w e e n t h e i n i t i a l g r o w t h p h a s e a n d e s t a b l i s h e d g r o w t h on camphor. L a g p e r i o d s o f up t o 60h a r e p r o b a b l y n o t due e n t i r e l y t o t h e p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s r e q u i r e d f o r camphor m e t a b o l i s m b u t t o t h e s e l e c t i o n a n d p r o p a g a t i o n o f t h o s e b a c t e r i a c a p a b l e o f m e t a b o l i z i n g 204 camphor. This f e a t u r e of the growth curves f o r P. putida, s t r a i n Ppg 786, on camphor e x e m p l i f i e s some important c h a r a c t e r i s t i c s of t h i s microbe. The Pseudomonas f a m i l y of b a c t e r i a are known to have the a b i l i t y to u t i l i z e an extremely wide v a r i e t y of carbon s u b s t r a t e s as t h e i r s o l e energy source. More s p e c i f i c a l l y , P. putida, s t r a i n PpG 786, c l a s s i f i e d as Biotype A a c c o r d i n g to the n u t r i t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o u t l i n e d by S t a n i e r et al.3l<°1 has the a b i l i t y to metabolize and grow on a complex o r g a n i c s u b s t r a t e such as D-(+)-camphor as w e l l as 8 0-100 other carbon sources. Much of t h i s observed metabolic d i v e r s i t y and a d a p t a b i l i t y has been a t t r i b u t e d to the presence of p l a s m i d s , 5 ' 6 which are s m a l l c i r c u l a r molecules of e x t r a chromosomal double-stranded DNA found i n the cytoplasm of the b a c t e r i a l c e l l . These plasmids, which r e p r e s e n t only a s m a l l f r a c t i o n of the c e l l ' s genome (1-3%), code f o r important a c c e s s o r y g e n e t i c t r a i t s t h a t are not o r d i n a r i l y encoded by the b a c t e r i a l chromosomes. The t r a i t s , which are manifested as a c t i v e enzymes s y n t h e s i z e d by the c e l l ' s m e t a bolic machinery, are u s u a l l y c r u c i a l f o r the a d a p t a t i o n of the bacterium to i t s environment. In P. putida the a b i l i t y to adapt to growth on camphor as the s o l e carbon and energy source i s mediated by the "CAM-plasmid", which s p e c i f i c a l l y codes f o r the p r o d u c t i o n of the cytochrome P450cam monooxygenase system as w e l l as s e v e r a l other enzymes i n v o l v e d i n the camphor o x i d a t i o n p a t h w a y . 1 6 2 In g e n e r a l , however, the plasmids are not e s s e n t i a l to the everyday metabolism of the b a c t e r i a l host 205 and c a n be l o s t o r g a i n e d w i t h o u t harm t o t h e c e l l . F u r t h e r -m ore, u n d e r c o n d i t i o n s w h i c h do n o t i n v o l v e t h e u s e o f t h e p l a s m i d g e n e s , i t i s p o s s i b l e t o i s o l a t e a v a r i a n t b a c t e r i u m t h a t no l o n g e r h a s t h e p l a s m i d ; o n c e t h e p l a s m i d i s l o s t i t c a n n o t be r e g e n e r a t e d by t h e c e l l a n d t h e r e f o r e t h i s g e n e t i c i n f o r m a t i o n c a n be p a r t i a l l y o r t o t a l l y l o s t f r o m an i s o l a t e d b a c t e r i a l p o p u l a t i o n . 1 6 3 P a r t i a l l o s s o f t h e ' t A M - p l a s m i d " f r o m P. putida d u r i n g s t o r a g e c o u l d a c c o u n t f o r t h e e x t e n d e d l a g p e r i o d s o b s e r v e d d u r i n g t h e e a r l y g r o w t h e x p e r i m e n t s . P r o l o n g e d s t o r a g e on m i n i m a l a g a r c o n t a i n i n g o n l y s i m p l e c a r b o n s s o u r c e s s u c h a s g l u c o s e , c i t r a t e , o r £-asparigine, w o u l d p r o m o t e s e l e c t i o n o f t h o s e b a c t e r i a w i t h o u t t h e "CAM-p l a s m i d " s i n c e t h e p l a s m i d g e n e s w o u l d n o t s p e c i f i c a l l y be u t i l i z e d . B i - m o n t h l y r e p l a t i n g o f t h e b a c t e r i a w o u l d s p e e d t h e s e l e c t i o n p r o c e s s . S u b s e q u e n t g r o w t h i n m e d i a c o n t a i n i n g g l u c o s e o r g l u t a m i c a c i d w o u l d be e x p e c t e d t o be l o g a r i t h m i c , p r e d o m i n a n t l y i n t h o s e b a c t e r i a w i t h o u t t h e p l a s m i d , e v e n a f t e r t h e a d d i t i o n s o f c a m p h o r . H o w e v e r , o n c e t h e s i m p l e c a r b o n s o u r c e s w e r e e x h a u s t e d t h e i n i t i a l r a p i d g r o w t h p h a s e w o u l d be e x p e c t e d t o g i v e way t o r a p i d d e c l i n e i n c e l l number and d e a t h t o t h e b a c t e r i a w i t h o u t t h e " C A M - p l a s m i d " . The l o n g l a g t i m e s o b s e r v e d t h e n c o u l d be a t t r i b u t e d t o t h e s e l e c t i o n and p r o p a g a t i o n o f t h e p e r c e n t a g e o f t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n t h a t s t i l l c o n t a i n e d t h e g e n e t i c i n f o r m a t i o n f o r camphor m e t a b o l i s m . The f a c t t h a t g r o w t h i n some c u l t u r e s s t o p p e d c o m p l e t e l y i n d i c a t e d t h a t t h e " C A M - p l a s m i d " c o u l d h a v e b e e n a l m o s t e n t i r e l y e l i m i n a t e d f r o m t h e p o p u l a t i o n . A l t h o u g h t h i s h y p o t h e s i s 2D 6 c a n n o t be p r o v e n w i t h o u t f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c o f P. putida, s t r a i n PpG 786, i t s e r v e s t o p o i n t o u t t h a t t h e b a c t e r i a m ust be m a i n t a i n e d on m i n i m a l a g a r c o n t a i n i n g camphor as t h e o n l y c a r b o n s o u r c e . As m i g h t be e x p e c t e d , t h e b a c t e r i a do n o t grow q u i t e a s w e l l u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ; h o w e v e r , m a i n t a i n e n c e on camphor w i l l a l l o w f o r t h e m o s t r a p i d a c c e s s t o t h e b a c t e r i a and i n t u r n t o t h e c y t o c h r o m e P450 monooxygenase enzyme c o m p o n e n t s . 207 IV.2 P r o p e r t i e s o f C y t o c h r o m e P450cam and R e l a t e d  M o n o o x y g e n a s e Components I V . 2 . 1 P u t i d a r e d o x i n R e d u c t a s e  I V . 2 . 1 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s The a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s o x i d a t i o n s t a t e s o f p u t i d a r e x o d i n r e d u c t a s e , i s o l a t e d and p u r i f i e d a s i n S e c t i o n I I I . 3, a r e g i v e n i n F i g u r e I V . 4. The s p e c t r u m o f t h e o x i d i z e d , p r o t e i n e x h i b i t e d a s t r o n g p r o t e i n a b s o r p t i o n a t 272nm t o g e t h e r w i t h w e a k e r a b s o r p t i o n s a t 3 7 0 , 4 1 4 , 4 7 0 , 530 and 570nm. R e d u c t i o n o f t h e y e l l o w p r o t e i n s o l u t i o n w i t h Na 2S 2C> 4 u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s p r o d u c e d an e s s e n t i a l l y c o l o r l e s s s o l u t i o n w i t h a s m a l l a b s o r p t i o n maxima a t 411nm. A d d i t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e d i d n o t v i s i b l y a f f e c t t h e c o l o r o f t h e s o l u t i o n b u t r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f two new p e a k s a t 418 and 4 44nm. The a b s o r p t i o n p e a k a t 444nm s u g g e s t e d t h a t t h e p u r i f i e d p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e c o n t a i n e d a c y t o c h r o m e P450cam i m p u r i t y . A n a l y s i s o f t h e o x i d i z e d and r e d u c e d s p e c t r a a s w e l l i n d i c a t e d t h a t t h e i m p u r i t y was t h e s u b s t r a t e - f r e e c y t o c h r o m e . F i g u r e I V . 5 shows a r e p o r t e d a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f p u r i f i e d p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e and T a b l e I V . 1 g i v e s l i t e r a t u r e a b s o r b a n c e d a t a f o r b o t h t h e r e d u c t a s e a n d s u b s t r a t e - f r e e c y t o c h r o m e P450cam. A l t h o u g h t h e s t r o n g a b s o r p t i o n p e ak a t 272nm as w e l l a s t h e weak a b s o r p t i o n a t 470nm w e r e i n d i c a t i v e o f t h e r e d u c t a s e enzyme, t h e o t h e r more c h a r a c t e r i s t i c p e a k s ( i . e . 378 and 454nm) w e r e p r e s u m a b l y l o s t u n d e r t h e s t r o n g c y t o c h r o m e a b s o r p t i o n s i n t h e s e r e g i o n s . 1.0 n O C (0 n o < Putidaredoxin reductase Oxidized Reduced Reduced-CO 250 300 F i g u r e IV.4 400 500 Wavelength (nm) A b s o r p t i o n s p e c t r a o f p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e i s o l a t e d and p u r i f i e d a s i n S e c t i o n I I I 3. 600 700 O 00 209 Table IV.1 Absorbance Data f o r P u t i d a r e d o x i n reductase and Substrate-f r e e Cytochrome P450cam (a) (b) F o r _ Cytochrome P4 50cam P u t i d a r e d o x i n ( s u b s t r a t e - f r e e ) reductase a) Ref.37 b) Ref.30 nm mM nm mM O x i d i z e d 280 68.3 275 72 360 36.7 378 9.7 417 ..1.15 454 10.0 535 11.6 480 8.5 569 11.9 Reduced 4 08 7 6.7 540 15.1 Reduced-CO 447 121 550 14.3 210 I n c o r p o r a t i o n of the i m p u r i t y i n the p u t i d a r e d o x i n reductase p r e p a r a t i o n s was unexpected s i n c e the f l a v o p r o t e i n was i s o l a t e d as a d i s t i n c t y e l l o w s o l u t i o n a p p a r e n t l y f r e e of brown p u t i d a r e d o x i n and r e d cytochrome P450cam. As w e l l , a l l attempts to i s o l a t e the f l a v o p r o t e i n u s i n g the procedure d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 3 r e s u l t e d i n the i n c o r p o r a t i o n of the same cytochrome P450cam im p u r i t y i n each p u r i f i e d p r o t e i n sample. F u r t h e r p u r i f i c a t i o n of the reductase p r o t e i n was attempted u s i n g c a r e f u l (NH^^SO^ f r a c t i o n a t i o n and Sephadex G-100 chromatography (1.3 x 100cm); however, the s i m i l a r i t y i n molecular weights of these two p r o t e i n s ( p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e , 45,000 Daltons; cytochrome P450cam, 47,000 D a l t o n s 3 7 ) prevented removal of the cytochrome contaminant. The i n a b i l i t y to i s o l a t e contaminant-free p u t i d a r e d o x i n reductase u s i n g the d e s c r i b e d procedures (Section I I I . 3) shows t h a t complete s e p a r a t i o n on the Whatman DE-52 c e l l u l o s e anion exchange r e s i n d i d not occur. Even though the p r o t e i n appeared to e l u t e as a separate band, r e s i d u a l cytochrome P450cam enzyme t r a i l i n g behind the major cytochrome band must have been e l u t e d along w i t h the f l a v o p r o t e i n . These r e s u l t s emphasize the importance of the p r e c i s e p r e p a r a t i o n of the anion exchange r e s i n and b u f f e r s o l u t i o n s f o r the i n i t i a l s e p a r a t i o n of the p r o t e i n components. Small i n c o n -s i s t e n c i e s i n the pH of the b u f f e r s o l u t i o n s , as w e l l as improper degassing of the anion exchange r e s i n , promote the formation of d i f f u s e p r o t e i n bands r a t h e r than narrow 211 concentrated bands and make i t d i f f i c u l t t o o b t a i n d i s c r e t e s e p a r a t i o n of the p r o t e i n components. Complete s e p a r a t i o n c o u l d be enhanced presumably with the use of l a r g e r bed-volumes of the anion•exchange r e s i n ; however, m o d i f i c a t i o n of the e l u t i n g b u f f e r systems would probably be more e f f e c t i v e . The r a t e of s e p a r a t i o n of the p r o t e i n components, via i n c r e a s e d i o n i c s t r e n g t h of the b u f f e r , must be slowed down to a l l o w f o r more complete s e p a r a t i o n . Replacement of b u f f e r T-100, used to promote the i n i t i a l p r o t e i n s e p a r a t i o n on Column A, w i t h b u f f e r T or T-5 0 would p r o v i d e a much smal l e r i n c r e a s e i n i o n i c s t r e n g t h and p o s s i b l y a g r e a t e r c o n t r o l of the i n i t i a l s e p a r a t i o n of p u t i d a r e d o x i n reductase and cytochrome P4 5 0cam. The i s o l a t i o n of pure p u t i d a r e d o x i n reductase r e q u i r e s m o d i f i c a t i o n of the present procedure -.and may i n v o l v e the development of a completely d i f f e r e n t i s o l a t i o n procedure such as t h a t r e p o r t e d by Gunsalus and Wagner. 3 7 60 60 2 E " 40 20 300 400 500 600 700 Wavelength (nm) F i g u r e IV.5 A b s o r p t i o n s p e c t r a of p u r i f i e d p u t i d a r e d o x i n reductase; Ref.30. I V . 2 . 2 P u t i d a r e d o x i n I V . 2 . 2 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s The a b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s o x i d a t i o n s t a t e s o f p u t i d a r e d o x i n i s o l a t e d and p u r i f i e d a s d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I . 3 a r e g i v e n i n F i g u r e I V . 6 . The s p e c t r u m o f t h e o x i d i z e d F e 2 S 2 C y s 4 i r o n - s u l p h u r p r o t e i n ( F e ( I I I ) - F e ( I I I ) ) showed a s t r o n g p r o t e i n a b s o r p t i o n a t 276nm f o l l o w e d by t h e c h a r a c t e r -i s t i c w e a k e r p e a k s o f t h e p r o s t h e t i c g r o u p a t 324, 412 and 454nm. S o d i u m d i t h i o n i t e r e d u c t i o n o f t h e b rown p r o t e i n s o l u t i o n u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s c o n v e r t e d one o f "the i r o n atoms t o t h e f e r r o u s s t a t e ( F e ( I I ) - F e ( I I I ) ) w i t h a b l e a c h i n g o f t h e a b s o r p t i o n f a i r l y u n i f o r m l y a b o v e 5 0 0 n m . 3 0 F o r m a t i o n o f a f a i n t p i n k s o l u t i o n a c c o m p a n i e s t h e r e d u c t i o n p r o c e s s a s w e l l a s t h e f o r m a t i o n o f a r e s i d u a l m a x i m u m a t 550nm. F l u s h i n g t h e s o l u t i o n w i t h c a r b o n m o n o x i d e p r o d u c e d no o b s e r v a b l e c h a n g e s i n t h e r e d u c e d s p e c t r u m . The e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d a b s o r b a n c e d a t a a r e shown i n T a b l e I V . 2 a l o n g w i t h t h o s e r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . The e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d v a l u e s a r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e s . I V . 2.2.2 P u r i t y The i r o n - s u l p h u r p r o t e i n was a p p r o x i m a t e l y 95% homogeneous (s e e S e c t i o n I I I . 3 . 4 . 2 ) a n d c o n t a i n e d n e g l i g i b l e c o n t a m i n a t i o n by t h e c y t o c h r o m e P450cam o r p u t i d a r e d o x i n r e d u c t a s e p r o t e i n s . The a b s o r p t i o n r a t i o o f A 4 5 4 / ^ 2 7 6 = 0 , 4 2 ^ s c o m p a r a b l e t o t h e homogeneous p r e p a r a t i o n s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e : 0.3 0 , 3 5 0 . 43 , 3 0 0 . 44 . 3 7 0.0-1 1 1 1 \ 1 250 300 400 500 600 700 Wavelength (nm) H F i g u r e I V . 6 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f u> p u t i d a r e d o x i n i s o l a t e d and p u r i f i e d a s i n S e c t i o n I I I . 3 . 214 T a b l e I V . 2 A b s o r b a n c e D a t a ( a . f o r P u t i d a r e d o x i n F o rm (b) (c) (d) E x p e r i m e n t a l L i t e r a t u r e L i t e r a t u r e P r e p a r a t i o n P r e p a r a t i o n P r e p a r a t i o n Xnm emM Anm emM Anm emM O x i d i z e d ( F e 3 + - F e 3 + ) 276 24.6 280 22.5 275 23 .6 324 15.6 325 15.0 325 15.6 412 11.0 415 10. 0 415 11.1 454 10.3 455 9.6 455 10.4 545 4.0 545 5.0 R e d u c e d 2+ „ 3+, (Fe -Fe ) a) The e x p e r i m e n t a l a b s o r b a n c e d a t a l i s t e d a b o v e w e r e a v e r a g e d o v e r t h r e e s a m p l e s o f p u t i d a r e d o x i n , " ' e s t i m a t e d e r r o r 5%.-b) D e t e r m i n e d i n b u f f e r P-100, pH 7.0, a t room t e m p e r a t u r e (23±2°C) u s i n g p u b l i s h e d m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t d a t a f o r o x i d i z e d p u t i d a r e d o x i n a t 455nm, e = 10.4; R e f . 37 mM c) R e f . 30. d) R e f . 37. 215 I V . 2 . 2 . 3 S t a b i l i t y The p u r i f i e d p r o t e i n was s t a b l e f o r a b o u t 1 m o n t h when s t o r e d a t -78°C u n d e r a r g o n a nd i n t h e p r e s e n c e o f lOmM gME. The o r i g i n a l d a r k brown p r o t e i n s o l u t i o n g r a d u a l l y t u r n e d c o l o r l e s s w i t h no r e t e n t i o n o f c h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o n s p e c t r a . A t 4°C, d e c o m p o s i t i o n o f t h e p r o t e i n o c c u r r e d r a p i d l y p r o d u c i n g a c o l o r l e s s s o l u t i o n i n =1 week. 216 I V . 2 . 3 C y t o c h r o m e P4 50cam I V . 2 . 3 . 1 S p e c t r a l A n a l y s i s o f S u b s t r a t e - B o u n d P450cam The a b s o l u t e a b s o r b a n c e s p e c t r a o f v a r i o u s f o r m s o f s u b s t r a t e - b o u n d c y t o c h r o m e P450cam, i s o l a t e d and p u r i f i e d a s i n S e c t i o n I I I . 3 , a r e shown i n F i g u r e I V . 7 . The s p e c t r u m o f t h e o x i d i z e d c y t o c h r o m e e x h i b i t e d a p r o t e i n a b s o r p t i o n a t 280nm a n d a b s o r p t i o n s o f t h e h e m e - p r o s t h e t i c g r o u p a t 391 and 643nm. L e s s w e l l - d e f i n e d a b s o r p t i o n s o f t h e heme-group a r e e v i d e n t a t 510 and 540nm. T h i s f e r r i c s u b s t r a t e - b o u n d s t a t e o f t h e enzyme i s a s s o c i a t e d w i t h a h i g h - s p i n c o n f i g u r a t i o n o f t h e h e m e - i r o n . 1 0 5 S t o i c h i o m e t r i c d i t h i o n i t e a d d i t i o n t o t h e b r o w n p r o t e i n s o l u t i o n u n d e r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s r e s u l t e d i n t h e o n e - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f t h e h e m e - i r o n w i t h c o n c o m i t a n t f o r m a t i o n o f a p i n k s o l u t i o n w i t h a b s o r p t i o n maxima a t 408 and 544nm. The s m a l l a b s o r p t i o n a t 314nm was i n d i c a t i v e o f a s l i g h t e x c e s s o f d i t h i o n i t e . P u r g i n g ...Na2S20^-reduced s o l u t i o n w i t h CO i n t e n s i f i e d t h e p i n k c o l o r and r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f t h e c a r b o n m o n o x i d e c o m p l e x w i t h t h e c h a r a c t e r -i s t i c S o r e t a b s o r p t i o n maximum a t 445nm. As w e l l , t h e h i g h e n e r g y S o r e t maxima i n t h e n e a r - U V r e g i o n and w e a k e r a b s o r p t i o n p e a k s i n t h e 500-600nm r e g i o n w e r e l o c a t e d a t 365 and 550nm, r e s p e c t i v e l y . The a b s o r b a n c e d a t a o b t a i n e d e x p e r i m e n t a l l y a r e g i v e n i n T a b l e I V . 3 a l o n g w i t h a b s o r b a n c e d a t a r e p o r t e d f r o m t h e l i t e r a t u r e . C o m p a r i s o n o f t h e d a t a i n d i c a t e s t h a t t h o s e d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y a r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t , w i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r , w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e s . 3 7 ' 3 3 ^ 445 i 1 1 1 250 300 400 500 600 700 Wavelength (nm) g u r e IV.7 A b s o r p t i o n s p e c t r a o f v a r i o u s s t a t e s o f s u b s t r a t e - b o u n d c y t o c h r o m e P450cam i s o l a t e d and p u r i f i e d a s i n S e c t i o n I I I . 3 218 T a b l e I V . 3 A b s o r b a n c e D a t a ' 3 ' f o r S u b s t r a t e - b o u n d C y t o c h r o m e P45Ocam Form (b) E x p e r i m e n t a l P r e p a r a t i o n (c) L i t e r a t u r e P r e p a r a t i o n (d) L i t e r a t u r e P r e p a r a t i o n A nm emM X nm emM A nm emM O x i d i z e d 280 91.1 280 63 .3 391 101 391 101 391 102 510 13.0 510 510 13.0 540 11.3 540 540 11.2 643 4.6 645 5.0 645 5.4 R e d u c e d 408 86.3 408 . 8 3 408 86.5 544 15.9 542 15 .2 542 16.0 Reduced-CO 365 56.1 364 60.8 445 120 446 119 446 120 550 14.0 550 13 .0 550 14.0 a) A v e r a g e d o v e r t h r e e s e t s o f d a t a ; e s t i m a t e d e r r o r 5% b)