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The role of magnetic field gradients in nuclear magnetic resonance Luck, Stanley David 1986

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THE ROLE OF MAGNETIC FIELD GRADIENTS IN NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE by STANLEY DAVID LUCK A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY in THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES Department of Chemistry We accept t h i s t h e s i s as conforming to the r e q u i r e d standard THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA November 17, 1986 © Sta n l e y David Luck, 1986 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l m a k e i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s m a y b e g r a n t e d b y t h e H e a d o f my D e p a r t m e n t o r b y h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f C h e m i s t r y T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2 0 7 5 W e s b r o o k P l a c e V a n c o u v e r , C a n a d a V 6 T 1W5 D a t e : N o v e m b e r 1 7 , 1 9 8 6 A B S T R A C T A h i g h r e s o l u t i o n NMR p r o b e w a s m o d i f i e d w i t h g r a d i e n t c o i l s ( 3 1 mm d i a m e t e r ) f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n a n d f o r m i c r o s c o p i c i m a g i n g , a n d a l a r g e r s e t o f g r a d i e n t c o i l s ( 1 5 c m d i a m e t e r ) w a s c o n s t r u c t e d f o r s u r f a c e c o i l d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s . T h e m a g n i t u d e s o f t h e g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e s e c o i l s w e r e d e t e r m i n e d f r o m t h e l i n e w i d t h s a n d l i n e s h a p e s o f g r a d i e n t s p e c t r a . I n d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s u s i n g t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d o f S t e j s k a l a n d T a n n e r , i n d u c e d e d d y c u r r e n t s a n d s l o w v a r i a t i o n o f t h e m a g n e t i c f i e l d a t t h e s a m p l e i n t e r f e r e d w i t h m e a s u r e m e n t s a t s h o r t e c h o t i m e s . F o r t h e s e e x p e r i m e n t s t h e k n o w n d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t i v e g r a d i e n t i n e a c h e x p e r i m e n t . T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e w a s m e a s u r e d f r o m t h e d e c a y o f s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m e c h o e s u s i n g a m o d i f i e d p u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p i n e c h o p u l s e s e q u e n c e . I n t h e s e c o n d p a r t o f t h i s t h e s i s , t h r e e e x a m p l e s o f l i v i n g s y s t e m s w e r e s t u d i e d . T h e f i r s t i n v o l v e d t h e a p p l i c a t i o n o f p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s t o c h a r a c t e r i z e t h e m o t i o n o f w a t e r a n d l i p i d , in-vivo, i n h u m a n f o r e a r m . S p i n e c h o s p e c t r a f r o m h u m a n f o r e a r m g a v e a w a t e r s i g n a l t h a t w a s a t t r i b u t e d t o e x t r a c e l l u l a r w a t e r b e c a u s e o f r e l a t i v e l y l o n g s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e ( 0 . 8 s ) c o m p a r e d t o t h a t o f i n t r a c e l l u l a r w a t e r ( 2 0 - 3 0 m s ) . C o m p a r i s o n o f t h e d i f f u s i v i t y o f w a t e r , f r o m e x p e r i m e n t s a t t w o d i f f e r e n t e c h o t i m e s s u g g e s t t h a t t h e m a j o r p a r t o f t h e i i m o t i o n o f w a t e r , in-vivo, w a s d u e t o d i r e c t i o n a l l y r a n d o m i z e d b u l k f l o w r a t h e r t h a n m o l e c u l a r d i f f u s i o n . T h e s e c o n d a p p l i c a t i o n i n v o l v e d t h e c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d m a p p i n g o f t h e p r o t o n d i s t r i b u t i o n , i n o n e - d i m e n s i o n , a l o n g t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n , o f p u p a e o f t h e D o u g l a s - f i r c o n e m o t h Barbara colf axi ana. P r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s s h o w e d t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e a q u e o u s f l u i d d e p e n d e d u p o n t h e v e r t i c a l o r i e n t a t i o n , h e a d p o i n t i n g u p w a r d o r d o w n w a r d , o f t h e p u p a e . F i n a l l y , t w o d i m e n s i o n a l i m a g e s o f m a t u r e c a p s o f t h e m a r i n e a l g a Acetabularia med'i t erranea w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e n o r m a l s p i n e c h o s e q u e n c e a s w e l l a s w i t h T 1 # T 2 a n d d i f f u s i o n c o n t r a s t i n g . D 2 G — c o n t r a s t i n g w a s o b t a i n e d b y b r i e f l y s u b m e r g i n g t h e c a p s i n D 2 0 . A l l o f t h e s e i m a g e s s h o w e d f e a t u r e s r e s e m b l i n g t h e r a d i a l s t r u c t u r e o f t h e c a p s . T h e r e s o l u t i o n w a s e s t i m a t e d b y c o m p a r i s o n w i t h m i c r o s c o p i c v i e w s o f t h e c a p s a n d w a s f o u n d t o b e 0 . 1 mm, d e t e r m i n e d a s t h e s m a l l e s t d i s t i n g u i s h a b l e f e a t u r e i n t h e i m a g e . i i i T a b l e o f C o n t e n t s I. I N T R O D U C T I O N 1 1 . O V E R V I E W . . 1 2 . H I S T O R I C A L S U R V E Y : D I F F U S I O N AND F L O W 8 3 . H I S T O R I C A L S U R V E Y : I M A G I N G 10 4 . O R G A N I Z A T I O N OF T H E T H E S I S 13 I I . M A G N E T I C F I E L D G R A D I E N T S I N NMR 14 A . T H E O R Y O F N U C L E A R M A G N E T I C R E S O N A N C E 17 1 . G E N E R A L 17 2 . L I N E S H A P E : R E L A T I O N T O G R A D I E N T A N D S A M P L E S H A P E 30 3 . T W O - D I M E N S I O N A L NMR I M A G I N G 38 4 . I M A G E C O N T R A S T 4 5 5 . S P A T I A L R E S O L U T I O N I N NMR I M A G I N G 48 6 . S P I N E C H O : P U L S E D - F I E L D G R A D I E N T T E C H N I Q U E F O R D I F F U S I O N 51 7 . M E A S U R E M E N T O F D I F F U S I O N BY M U L T I P L E Q U A N T U M S P I N E C H O E S 5 9 8 . S P I N E C H O : T H E E F F E C T O F R A N D O M I Z E D F L O W 62 B . E X P E R I M E N T A L 64 1 . A P P A R A T U S F O R D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T A N D M I C R O S C O P I C I M A G I N G 64 2 . A P P A R A T U S F O R S U R F A C E C O I L , P U L S E D G R A D I E N T S P I N E C H O M E A S U R E M E N T S 76 3 . P A R A M E T E R S F O R NMR E X P E R I M E N T S 7 9 C . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 81 1 . G R A D I E N T M A G N I T U D E S 81 2 . E F F E C T O F R E C E I V E R D E A D T I M E 8 5 3 . E F F E C T O F R A D I O F R E Q U E N C Y I N H O M O G E N E I T Y 88 4 . S T A T I C G R A D I E N T D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T 92 iv 5 . P U L S E D G R A D I E N T D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T S 9 5 6 . D I F F U S I O N O F A C R Y L O N I T R I L E BY MQ E C H O E S 104 7 . I M A G I N G O F G L A S S C A P I L L A R I E S C O N T A I N I N G W A T E R A N D A C E T O N E 1 1 0 I I I . D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T 1 1 5 A . I N T R O D U C T I O N 1 1 5 B . D I F F U S I O N I N L I Q U I D S 1 1 6 1 . E X P E R I M E N T A L 118 2 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 118 C . I N - V I V O P R O T O N S P E C T R O S C O P Y O F HUMAN F O R E A R M . . 1 2 3 1 . I N T R O D U C T I O N 1 23 2 . E X P E R I M E N T A L 131 3 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 131 I V . NMR I M A G I N G 1 4 3 A . I N T R O D U C T I O N 143 B . Barbara colfaxi ana 144 1 . I N T R O D U C T I O N 144 2 . E X P E R I M E N T A L 1 4 5 3 . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N 146 C . Acetabularia mediterranea 1 5 6 1 . I N T R O D U C T I O N 1 5 6 2 . E X P E R I M E N T A L 158 3 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 1 5 9 C O N C L U S I O N S 168 S U G G E S T I O N S F O R F U T U R E WORK 1 6 9 1 . I N - V I V O P U L S E D G R A D I E N T S P I N E C H O M E A S U R E M E N T S 1 6 9 2 . I M A G I N G 1 7 0 v G L O S S A R Y O F T E R M S B I B L I O G R A P H Y L I S T O F T A B L E S T a b l e 2 . 1 M a g n i t u d e s o f t h e g r a d i e n t s p r o d u c e d b y x , y a n d z c o i l s . 72 T a b l e 2 . 2 M a g n i t u d e s o f g r a d i e n t s d e t e r m i n e d b y l i n e s h a p e a n a l y s i s , l i n e w i d t h s a n d c a l i b r a t i o n b y d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t . 8 4 T a b l e 2 . 3 D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e f r o m s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s . 1 0 9 T a b l e 3 . 1 D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e a a n d 0 a n o m e r s o f D - g l u c o s e a n d m e t h y l g l y c o s i d e . 1 2 0 T a b l e 3 . 2 C r o s s - s e c t i o n a l a r e a s o f b l o o d v e s s e l s . 130 T a b l e 3 . 3 C h e m i c a l s h i f t s , d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s a n d s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s f o r w a t e r a n d 1 i p i d /n-vi vo . 1 3 6 T a b l e 3 . 4 N o r m a l t i s s u e w a t e r c o n t e n t i n a d u l t h u m a n s . 140 vii L I S T O F F I G U R E S F i g . 2 . 1 T h e p r o j e c t e d s p i n d i s t r i b u t i o n f o r a c y l i n d r i c a l o b j e c t . 3 5 F i g . 2 . 2 G e n e r a l s c h e m e f o r a t w o d i m e n s i o n a l NMR e x p e r i m e n t . 3 9 F i g . 2 . 3 T i m i n g d i a g r a m f o r a t w o d i m e n s i o n a l NMR i m a g i n g e x p e r i m e n t . 41 F i g . 2 . 4 T h e e f f e c t o f a 1 8 0 ° p u l s e . 4 2 F i g . 2 . 5 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e o n e - d i m e n s i o n a l , c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d m a p p i n g o f s p i n d i s t r i b u t i o n . 4 5 F i g . 2 . 6 T h e i n v e r s i o n - r e c o v e r y p u l s e s e q u e n c e . 4 7 F i g . 2 . 7 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e p u l s e d f i e l d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t . 5 5 F i g . 2 . 8 P u l s e s e q u e n c e f o r d i f f u s i o n c o n t r a s t e d t w o - d i m e n s i o n a l i m a g i n g . 58 F i g . 2 . 9 T h e p u l s e s e q u e n c e f o r t h e p r e p a r a t i o n a n d s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f m u l t i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s . 61 F i g . 2 . 1 0 P o s i t i o n v e c t o r s f o r c u r r e n t e l e m e n t d l a n d p o i n t P . 6 7 F i g . 2 . 1 1 C r o s s - s e c t i o n a l v i e w o f t h e s a m p l e c h a m b e r a n d t h e c o n f i g u r a t i o n s o f t h e M a x w e l l a n d G o l a y c o i l s . 6 9 F i g . 2 . 1 2 C i r c u i t d i a g r a m s f o r t h e h i g h f r e q u e n c y f i l t e r s a n d s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e g r a d i e n t c o n t r o l u n i t . 7 3 viii F i g . 2 . 1 3 G r a p h o f a m p l i f i e r o u t p u t a s a f u n c t i o n o f D A C i n p u t . 7 5 F i g . 2 . 1 4 C r o s s - s e c t i o n a l v i e w o f t h e s u r f a c e c o i l . 78 F i g . 2 . 1 5 S p e c t r a a n d g r a p h s o f L a r m o r f r e q u e n c y vs p o s i t i o n f o r t h e s h i m c o i l s a n d t h e a t t e n u a t i o n o f t h e s p i n e c h o i n a p u l s e d f i e l d g r a d i e n t e x p e r i m e n t . 82 F i g . 2 . 1 6 S p i n e c h o s i g n a l a c q u i r e d i n t h e p r e s e n c e o f a y - g r a d i e n t . 8 6 F i g . 2 . 1 7 N o r m a l g r a d i e n t p u l s e s p e c t r a a n d s p i n e c h o g r a d i e n t s p e c t r a m e a s u r e d w i t h d w e l l t i m e s o f 50 us a n d 1 0 0 us. 8 8 F i g . 2 . 1 8 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e o n e d i m e n s i o n a l m a p p i n g o f t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e r a d i o f r e q u e n c y f i e l d a c r o s s t h e s a m p l e . 90 F i g . 2 . 1 9 O n e - d i m e n s i o n a l m a p s o f t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e r f f i e l d f r o m t h e s a d d l e - s h a p e d t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l . 91 F i g . 2 . 2 0 S p i n e c h o g r a d i e n t s p e c t r a f o r NMR t u b e w i t h g r a d i e n t s o f 7 5 a n d 151 m T m " 1 a p p l i e d . 93 F i g . 2 . 2 1 D e t e r m i n a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r u s i n g t h e s t a t i c g r a d i e n t m e t h o d . 9 4 F i g . 2 . 2 2 P u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a . 9 6 F i g . 2 . 2 3 D e c a y o f t h e s p i n e c h o i n a p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t w i t h t h e h i g h r e s o l u t i o n NMR p r o b e . 97 F i g . 2 . 2 4 D e c a y o f t h e s p i n e c h o i n a p u l s e d g r a d i e n t I X d i f f u s i o n e x p e r i m e n t w i t h t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s . 9 9 F i g . 2 . 2 5 S p i n e c h o F I D s i g n a l s f r o m a p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t u s i n g t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s . 101 F i g . 2 . 2 6 D e c a y o f t h e s p i n e c h o i n p u l s e d g r a d i e n t e x p e r i m e n t s u s i n g t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s f o r t h e x a n d z g r a d i e n t s . 1 0 2 F i g . 2 . 2 7 G r a p h s o f s i g n a l a m p l i t u d e f o r t h e d i f f u s i o n o f a m i x t u r e o f w a t e r a n d e t h a n o l , 4 : 1 ( v / v ) , u s i n g t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s . 104 F i g . 2 . 2 8 T h e v a r i a t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f t h e s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s w i t h t h e p r e p a r a t i o n t i m e . 1 0 6 F i g . 2 . 2 9 S p e c t r a a n d d e c a y o f t h e s p i n e c h o e s f o r s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e s o f a c r y l o n i t r i l e . 1 0 7 F i g . 2 . 3 0 S c h e m a t i c d i a g r a m s h o w i n g t h e e n e r g y l e v e l s f o r a n AMX s p i n s y s t e m . 108 F i g . 2 . 3 1 T w o - d i m e n s i o n a l i m a g e s o f g l a s s c a p i l l a r y t u b e s c o n t a i n i n g w a t e r . 111 F i g . 2 . 3 2 N o r m a l a n d t w o - d i m e n s i o n a l i m a g e s o f c a p i l l a r i e s c o n t i a n i n g w a t e r a n d a c e t o n e . 1 1 3 F i g . 2 . 3 3 P u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n s p e c t r a f o r w a t e r a n d a c e t o n e i n c a p i l l a r i e s . 1 1 4 F i g . 3 . 1 S t a c k e d p l o t o f p u l s e d g r a d i e n t s p e c t r a f o r D - g l u c o s e 1 . 0 M i n w a t e r . 1 1 9 F i g . 3 . 2 S t a c k e d p l o t o f p u l s e d g r a d i e n t s p e c t r a f o r D e x t r a n - T 1 0 , 4 . 3 %(w/v) i n D 2 0 . 1 2 2 F i g . 3 . 3 T h e v a r i a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f g l u c o s e w i t h c o n c e n t r a t i o n i n a q u e o u s s o l u t i o n . 1 2 3 F i g . 3 . 4 C r o s s - s e c t i o n a l v i e w t h r o u g h t h e m i d d l e o f t h e f o r e a r m . 1 2 6 F i g . 3 . 5 I n - v i v o p r o t o n s p e c t r a o f h u m a n f o r e a r m . 1 3 2 F i g . 3 . 6 H a h n e c h o a n d p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a o f h u m a n f o r e a r m . 1 3 4 F i g . 3 . 7 D e c a y o f t h e p r o t o n s i g n a l s f o r w a t e r a n d l i p i d f r o m i n - v i v o , H a h n e c h o s p e c t r a . 1 3 5 F i g . 3 . 8 D e c a y o f t h e p r o t o n s i g n a l s f o r w a t e r a n d l i p i d f r o m i n - v i v o p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a . 1 3 8 F i g . 4 . 1 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a o f Barbara colfaxi ana p u p a e . 1 4 7 F i g . 4 . 2 P r o t o n s p e c t r a a n d g r a p h s o f p e a k h e i g h t a s a f u n c t i o n o f r e c o v e r y t i m e f o r w a t e r a n d l i p i d s i g n a l s f r o m i n v e r s i o n - r e c o v e r y s p e c t r a o f Barbara colfaxiana. 148 F i g . 4 . 3 P r o t o n s p e c t r a a n d g r a p h s o f p e a k h e i g h t a s a f u n c t i o n o f e c h o t i m e f o r w a t e r a n d l i p i d s i g n a l s f r o m H a h n e c h o s p e c t r a o f Barbara colfaxiana. 1 4 9 F i g . 4 . 4 N o r m a l p r o t o n s p e c t r u m o f h a e m o l y m p h . 151 F i g . 4 . 5 P r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s f o r a l i v e , Barbara xi colfaxiana p u p a . 1 5 2 F i g . 4 . 6 P r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s f o r a Barbara colfaxiana p u p a s e v e r a l w e e k s a f t e r a f t e r r e m o v a l f r o m a c o n e . 154 F i g . 4 . 7 P r o t o n s p e c t r a o f Barbara colfaxiana p u p a e . 1 5 5 F i g . 4 . 8 P r o t o n s p e c t r a o f m a t u r e Acetabularia mediterranea c a p s . 1 6 0 F i g . 4 . 9 I n v e r s i o n - r e c o v e r y a n d H a h n e c h o s p e c t r a f o r m a t u r e Acetabularia mediterranea c a p s . 161 F i g . 4 . 1 0 A p h o t o m i c r o g r a p h a n d a d e u t e r i u m - c o n t r a s t e d i m a g e o f a m a t u r e Acetabularia mediterranea c a p . 1 6 3 F i g . 4 . 1 1 I m a g e s o f m a t u r e Acetabularia mediterranea c a p s w i t h T , a n d T 2 c o n t r a s t . 1 6 4 F i g . 4 . 1 2 A d i f f u s i o n - c o n t r a s t e d i m a g e o f a n Acetabularia mediterranea c a p . 1 6 5 F i g . 4 . 1 3 A n o r m a l i m a g e o f a n Acetabularia mediterranea c a p . 1 6 6 xii A C K N O W L E D G E M E N T S I t i s a p l e a s u r e t o a c k n o w l e d g e m a n y i n t e r e s t i n g a n d s t i m u l a t i n g d i s c u s s i o n s w i t h D r . L a u r i e H a l l . S p e c i a l t h a n k s a r e g i v e n t o D r . L i o n e l H a r r i s o n w i t h o u t w h o s e i d e a s a n d e f f o r t s t h i s t h e s i s w o u l d n o t h a v e c o m e t o f r u i t i o n , t o D r . R o b e r t S n i d e r f o r m a n y i n t e r e s t i n g d i s c u s s i o n s a n d f o r h i s c r i t i c a l c o m m e n t s , a n d t o T o m M a r k u s , E m i l M a t t e r a n d C e d r i c N e a l e f o r t h e i r b e a u t i f u l w o r k w i t h o u t w h i c h t h e s e e x p e r i m e n t s w o u l d n o t h a v e b e e n p o s s i b l e . I w i s h t o t h a n k V . R a j a n a y a g a m f o r h i s i n s t r u c t i o n i n t h e a r t o f i m a g i n g a n d a s s i s t a n c e i n r u n n i n g n u m e r o u s b i o l o g i c a l s a m p l e s , S . T a l a g a l a f o r d i s c u s s i o n s a b o u t how NMR i m a g i n g r e a l l y w o r k s , a n d f i n a l l y a l l o f t h e o t h e r m e m b e r s o f t h e l a b who s h a r e d i n t h e j o y s a n d s o r r o w s o f g r a d u a t e s c h o o l . F i n a l l y , s p e c i a l t h a n k s t o my w i f e , A d a , f o r h e r i n v a l u a b l e a s s i s t a n c e i n p r e p a r i n g t h i s t h e s i s . xiii I. I N T R O D U C T I O N 1 . O V E R V I E W I n t h e d e v e l o p i n g t e c h n o l o g i e s f o r n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e (NMR) i m a g i n g a n d l o c a l i z e d s p e c t r o s c o p y w h i c h h a v e a p p l i c a t i o n s i n m e d i c i n e a n d b i o l o g y , r a d i o f r e q u e n c y ( r f ) e x c i t a t i o n a n d m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s p l a y k e y r o l e s (1-4). T h e i m p o r t a n c e o f t h e r a d i o f r e q u e n c y e x c i t a t i o n i s i n t h e g e n e r a t i o n o f NMR s i g n a l s w h e r e a s m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s a r e a p p l i e d t o c h a r a c t e r i z e t h e s p a t i a l l o c a t i o n o f t h e s p i n s . I n p u l s e d NMR m e t h o d s , p u l s e d g r a d i e n t s a n d r f p u l s e s a r e o f t e n c o m b i n e d t o p r o d u c e v a r i o u s k i n d s o f s p i n e c h o e s . S p i n e c h o e s a r e i m p o r t a n t b e c a u s e t h e y o f f e r a c o n v e n i e n t m e a n s f o r t h e o b s e r v a t i o n o f t h e t i m e d e p e n d e n c e a s s o c i a t e d w i t h t h e m o t i o n o f t h e s p i n s i n c l u d i n g t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n a n d b u l k f l o w (5-9), a n d f o r s o - c a l l e d p h a s e - e n c o d i n g i n m u l t i d i m e n s i o n a l F o u r i e r t r a n s f o r m NMR (10). T h e f i r s t p a r t o f t h i s t h e s i s d e s c r i b e s t h e m o d i f i c a t i o n o f a h i g h r e s o l u t i o n NMR p r o b e w i t h g r a d i e n t c o i l s ( 3 1 mm d i a m e t e r ) f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n a n d f o r m i c r o s c o p i c i m a g i n g , a n d t h e c o n s t r u c t i o n o f a l a r g e r s e t o f g r a d i e n t c o i l s ( 1 5 c m d i a m e t e r ) t o b e u s e d i n a w i d e b o r e m a g n e t f o r s u r f a c e c o i l d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s . T h e s m a l l e r s i z e o f t h e s e g r a d i e n t c o i l s c o m p a r e d t o t h o s e b u i l t i n t o t h e r e s p e c t i v e s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t s a l l o w s t h e g e n e r a t i o n o f l a r g e r g r a d i e n t s w i t h 1 2 s h o r t e r r i s e t i m e s . T h e m a g n i t u d e s o f t h e g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e s e c o i l s w e r e d e t e r m i n e d f r o m t h e l i n e w i d t h s a n d t h e l i n e s h a p e s o f g r a d i e n t s p e c t r a . T h e s e a r e NMR s p e c t r a o b t a i n e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e g r a d i e n t a p p l i e d t o g i v e a o n e - d i m e n s i o n a l p r o j e c t i o n o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n . F r o m t h e s e v a l u e s a n d u s i n g t h e h i g h r e s o l u t i o n a p p a r a t u s , a n a b s o l u t e v a l u e f o r t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r , 2 . 2 3 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 a t 2 3 ° C , w a s o b t a i n e d i n a s t a t i c g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t . T h i s v a l u e i s i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e o f 2 . 1 9 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 f r o m t r a c e r d i f f u s i o n (11). T h e s t a t i c g r a d i e n t m e t h o d f o r d e t e r m i n i n g d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s i n v o l v e s t h e a p p l i c a t i o n o f a m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a n d g i v e s r i s e t o i n h o m o g e n e o u s l y b r o a d e n e d l i n e s , p r o h i b i t i n g m e a s u r e m e n t s o n m u l t i c o m p o n e n t s y s t e m s s u c h a s w o u l d b e f o u n d i n b i o l o g i c a l s y s t e m s c o n t a i n i n g w a t e r a n d l i p i d . C o n s e q u e n t l y , t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d o f S t e j s k a l a n d T a n n e r (12), i n w h i c h g r a d i e n t p u l s e s a r e a p p l i e d a t s p e c i a l l y t i m e d i n t e r v a l s a l l o w i n g t h e m e a s u r e m e n t o f h i g h r e s o l u t i o n s p e c t r a , w a s i m p l e m e n t e d . I t i s t h e n p o s s i b l e t o s i m u l t a n e o u s l y d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e d i f f e r e n t c h e m i c a l c o m p o n e n t s i n t h e s a m p l e . U n l i k e t h e s t a t i c g r a d i e n t m e t h o d , t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d i s s u b j e c t t o t h e s l o w e r r e s p o n s e o f t h e m a g n e t i c f i e l d a t t h e s a m p l e c o m p a r e d t o t h e t i m e f o r s w i t c h i n g o f t h e c u r r e n t p a s s i n g t h r o u g h t h e g r a d i e n t c o i l s . B y m a k i n g m e a s u r e m e n t s 3 f o r i n c r e a s i n g t i m e i n t e r v a l s a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f g r a d i e n t p u l s e s , s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s p r o v i d e d a s i m p l e m e a n s f o r d e t e r m i n i n g t h e s e t t l i n g t i m e s o f t h e m a g n e t i c f i e l d a t t h e s a m p l e . T h e c a u s e o f t h e s l o w r e s p o n s e o f t h e m a g n e t i c f i e l d w a s n o t i n v e s t i g a t e d b u t i n t e r a c t i o n s w i t h e i t h e r t h e l a r g e s t a t i c f i e l d f r o m t h e s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t , t h e s h i m c o i l s a n d t h e i r p o w e r s u p p l i e s , o r t h e s u r r o u n d i n g m e t a l i n t h e b o r e o f t h e m a g n e t m a y b e r e s p o n s i b l e . I t w a s f o u n d t h a t b y u s i n g s u f f i c i e n t l y l o n g d e l a y s a f t e r t h e g r a d i e n t p u l s e s , a c c u r a t e d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s c o u l d b e o b t a i n e d u s i n g t h e p u l s e d g r a d i e n t t e c h n i q u e . U s i n g t h e h i g h r e s o l u t i o n a p p a r a t u s , t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f D - g l u c o s e , 6 . 7 0 x 1 0 ~ 1 0 m 2 s " 1 ( a t i n f i n i t e d i l u t i o n ) a n d d e x t r a n ( T - 1 0 , MW 9 0 0 0 , 4 . 3 % W/V i n D 2 0 ) , 6 . 2 4 x 1 0 " 1 1 m 2 s " 1 , a n d t h e s e w e r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e s o f 6 . 7 5 x 1 0 " 1 0 (117,118) a n d 6 . 3 x 1 0 " 1 1 m 2 s _ 1 (102) r e s p e c t i v e l y . A l s o , a m o d i f i e d p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e f r o m t h e d e c a y o f s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m e c h o e s . A s e x p e c t e d t h e h i g h e r o r d e r c o h e r e n c e s a r e m o r e s e n s i t i v e t o t h e a p p l i e d g r a d i e n t . F o r t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s w i t h t h e l a r g e r g r a d i e n t c o i l s , t h e e d d y c u r r e n t e f f e c t s w e r e m o r e s e v e r e a n d p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s c o u l d b e p e r f o r m e d w i t h l e s s a c c u r a c y a n d p r e c i s i o n . U s i n g e c h o t i m e s o f 2 2 0 m s , 4 d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s f o r - a 4 : 1 m i x t u r e o f w a t e r a n d e t h a n o l g a v e v a l u e s w h i c h a g r e e d w i t h i n o n l y 10 % o f t h e v a l u e s d e t e r m i n e d u s i n g t h e h i g h r e s o l u t i o n a p p a r a t u s . I n i m a g i n g e x p e r i m e n t s , t h e i m a g i n g g r a d i e n t s e r v e s t o s t a b i l i z e t h e f o r m a t i o n o f t h e e c h o ; a s t r a t e g y w h i c h h a s b e e n u s e d p r e v i o u s l y f o r d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s b y H r o v a t a n d W a d e (13). T h u s i m a g i n g e x p e r i m e n t s w i t h e c h o t i m e s a s s h o r t a s 7 ms c o u l d b e p e r f o r m e d . U s i n g a m o d e l s y s t e m o f w a t e r a n d a c e t o n e i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t a c c u r a t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s c o u l d b e o b t a i n e d f r o m d i f f u s i o n c o n t r a s t i n g e x p e r i m e n t s . B e c a u s e NMR i s a n o n - i n v a s i v e t e c h n i q u e w i t h o u t k n o w n s e r i o u s e f f e c t s o n b i o l o g i c a l s y s t e m s ( 1 - 4 ) , t h e r e i s c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n s t u d y i n g t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n a n d m o v e m e n t s o f s u b s t a n c e s i n - v i v o . S u c h s y s t e m s c a n e x h i b i t c o m p l e x i t i e s o f p h y s i c o c h e m i c a l b e h a v i o u r q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h e p r o p e r t i e s o f i n a n i m a t e c h e m i c a l s y s t e m s . T h e b a s i c q u e s t i o n a d d r e s s e d i n t h e s e c o n d p a r t o f t h i s w o r k i s t h e r e f o r e : w h e n o n e l o o k s w i t h f i e l d g r a d i e n t NMR a t l i v i n g s y s t e m s , w h a t d o e s o n e s e e ? T h r e e e x a m p l e s o f l i v i n g s y s t e m s h a v e b e e n s t u d i e d i n t h i s w o r k , e a c h w i t h a d i f f e r e n t k i n d o f f i e l d g r a d i e n t m e t h o d a n d g i v i n g d i f f e r e n t k i n d s o f i n f o r m a t i o n . M o t i o n , b o t h o f w a t e r a n d o f l i p i d s , h a s b e e n s t u d i e d i n a s m a l l r e g i o n o f t h e h u m a n f o r e a r m . I f s u c h m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e o n a s i m p l e c h e m i c a l s o l u t i o n o n e w o u l d e x p e c t t o a c h i e v e a c l e a r s e p a r a t i o n b e t w e e n b u l k f l o w o f t h e s o l u t i o n a n d 5 m o l e c u l a r d i f f u s i o n . In-vivo, h o w e v e r , t h e r e c a n b e m a n y k i n d s o f l i q u i d s w h i c h u n d e r g o b u l k f l o w s t h a t a r e n o t r a n d o m o n t h e m o l e c u l a r s c a l e , b u t i n w h i c h n u m e r o u s f l o w p a t h s a r e r a n d o m i z e d i n d i r e c t i o n o n a s p a t i a l s c a l e s m a l l c o m p a r e d t o t h e t o t a l s a m p l e o b s e r v e d . T w o e x a m p l e s a r e b l o o d f l o w i n s m a l l c a p i l l a r i e s ( a s w e l l a s t h e p o o l i n g s a n d b a c k e d d i e s w h i c h c a n r a n d o m i z e f l o w - r a t e a n d f l o w d i r e c t i o n i n s o m e w h a t l a r g e r v e i n s ) a n d i n t r a c e l l u l a r l y , c y t o p l a s m i c s t r e a m i n g . D o e s in-vivo f i e l d g r a d i e n t NMR m e a s u r e m a i n l y t h e s e p r o c e s s e s o r t r u e m o l e c u l a r d i f f u s i o n ? F o r t h e h u m a n f o r e a r m s t u d y r e p o r t e d h e r e , t h e a n s w e r i s t h a t n e i t h e r f o r a q u e o u s m a t e r i a l n o r f o r l i p i d s w a s t h e r e v e r y m u c h c o n t r i b u t i o n f r o m t r u e d i f f u s i o n . U n d e r t h e c o n d i t i o n s r e q u i r e d f o r a c c u r a t e d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s , t h e s i g n a l d u e t o i n t r a c e l l u l a r w a t e r h a d d e c a y e d b e c a u s e o f s h o r t T 2 r e l a x a t i o n t i m e s a n d t h e r e s u l t i n g s p e c t r a s h o w e d s i g n a l s a t t r i b u t e d t o e x t r a c e l l u l a r w a t e r a n d i n t r a c e l l u l a r l i p i d . C o n s e q u e n t l y , t h e b u l k f l o w o f r a n d o m i z e d d i r e c t i o n m e a s u r e d f o r w a t e r p r o t o n s i s m o s t p r o b a b l y b l o o d f l o w . L i p i d s , o n t h e o t h e r h a n d , m o v e 1 0 0 t i m e s f a s t e r t h a n e x p e c t e d f r o m m o l e c u l a r d i f f u s i o n i n t h e t i m e - s c a l e o f t h e e x p e r i m e n t , a n d i t i s n o t c l e a r w h a t t y p e o f m o t i o n i s i n v o l v e d . T h e o t h e r t w o b i o l o g i c a l a p p l i c a t i o n s b o t h u s e t w o - d i m e n s i o n a l NMR m e t h o d s . I n t h i s , t h e s i g n a l i n t e n s i t y i s a f u n c t i o n o f t w o v a r i a b l e s . I n t h e f i r s t i n s t a n c e , t h e s e a r e t w o i n d e p e n d e n t t i m e i n t e r v a l s u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e 6 e x p e r i m e n t e r . B y F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n , t h e y c a n b e c o n v e r t e d i n t o t w o f r e q u e n c i e s a n d t h e r e s u l t i n g a r r a y o f d a t a c o n s t i t u t e s a t w o d i m e n s i o n a l s p e c t r u m . B u t u l t i m a t e l y , o n e o f t h e m i s c o n v e r t e d i n t o a p o s i t i o n a l o n g s o m e f i x e d d i r e c t i o n , a n d t h e o t h e r e i t h e r i n t o a c h e m i c a l s h i f t o r i n t o p o s i t i o n i n a n o r t h o g o n a l d i r e c t i o n . I n t h e f i r s t c a s e , o n e c a n o b t a i n s i m u l t a n e o u s i n f o r m a t i o n o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t w o o r m o r e s u b s t a n c e s a l o n g o n e d i m e n s i o n o f a o r g a n i s m . I n t h e s e c o n d c a s e , o n e c a n o b t a i n a t w o - d i m e n s i o n a l p r o j e c t i o n o f i t s s h a p e . T h i s t h e s i s d e s c r i b e s o n e in-vivo e x a m p l e o f e a c h k i n d o f a p p l i c a t i o n o f t w o - d i m e n s i o n a l N M R . C h e m i c a l s h i f t i m a g i n g w a s u s e d t o d i s t i n g u i s h d i s t r i b u t i o n s o f t h e a q u e o u s f l u i d a n d l i p i d a l o n g t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n o f p u p a e o f . t h e D o u g l a s F i r C o n e M o t h , Barbara colfaxiana. T h e a q u e o u s f l u i d i s t h e h a e m o l y m p h , w h i c h s e r v e s t h e i n s e c t f o r t h e p u r p o s e s o f b o t h t h e b l o o d a n d t h e l y m p h a t i c s y s t e m o f h i g h e r a n i m a l s . T h e s i m p l e e x p e r i m e n t o f t u r n i n g p u p a e u p s i d e - d o w n p r o d u c e d c h a n g e s i n d i c a t i n g a s h i f t i n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e h a e m o l y m p h . T h e v e r y l a r g e s i n g l e - c e l l e d m a r i n e a l g a Acetabular'! a medi t erranea, a t t h e c u l m i n a t i o n o f i t s l i f e c y c l e , p r o d u c e s a d i s c o i d r e p r o d u c t i v e c a p w h i c h i s a v e r y s u i t a b l e o b j e c t f o r s t u d y w i t h a g o o d m a g n i f y i n g g l a s s o r t h e l o w e s t p o w e r s o f t h e o p t i c a l m i c r o s c o p e . I t h a s f e a t u r e s r a d i a l l y t a p e r i n g i n s i z e f r o m 0 . 3 mm n e a r t h e r i m t o t e n s o f m i c r o n s n e a r t h e c e n t e r . T h i s i s a v e r y s u i t a b l e o b j e c t f o r i m a g i n g 7 i n two s p a t i a l d i m e n s i o n s t o d e t e r m i n e t h e s p a t i a l r e s o l u t i o n a c t u a l l y a c h i e v e d i n t h e i m a g e . The s i z e of i t s f e a t u r e s c h a l l e n g e s t h e p r e s e n t s t a t e - o f - t h e - a r t l i m i t s of s p a t i a l r e s o l u t i o n . S i n c e t h e r e i s no t o m o g r a p h y , s l i c e s e l e c t i o n , o r s e c t i o n i n g i n v o l v e d , NMR images and o r d i n a r y o p t i c a l p h o t o g r a p h s can be compared i n d e t a i l . P r o t o n NMR i m a g i n g , however , makes v i s i b l e the r o u g h l y 95 % of such an o r g a n i s m w h i c h i s w a t e r , w h i l e o p t i c a l o b s e r v a t i o n and p h o t o g r a p h y sees t h e o t h e r 5%. I t i s p e r h a p s r e m a r k a b l e t h a t t h e NMR image and t h e p h o t o g r a p h have any r e s e m b l a n c e whatever t o e a c h o t h e r , beyond g i v i n g t h e shape of t h e o u t e r m a r g i n of t h e o b j e c t . In f a c t , t h e y show a w e a l t h of p r e c i s e l y c o r r e s p o n d i n g d e t a i l s down t o 0 .1 mm d i m e n s i o n s . An o b j e c t s u c h as t h e Acetabularia c a p , w h i c h i s wet t h r o u g h o u t , p r o v i d e s a good t e s t of means of c o n t r a s t i n g d i f f e r e n t t y p e s of w a t e r i n t h e s a m p l e , i n t h e NMR i m a g i n g , by r e l a x a t i o n t i m e s , d i f f u s i o n r a t e s , o r r a t e s of exchange w i t h D 2 0 . The c o n t r a s t s w h i c h e x i s t a r e a n o t h e r p r o p e r t y of l i v i n g s y s t e m s w h i c h have no c l o s e a n a l o g u e i n most s i m p l e c h e m i c a l s y s t e m s . What does one see in-vivo? The c u r r e n t v i s i b i l i t i e s , i n p r o t o n f i e l d - g r a d i e n t NMR, seem t o b e : -(1) A g r e a t e r v a r i e t y of d i r e c t i o n a l l y - r a n d o m i z e d f l o w s of water t h a n t h e c h e m i s t e n v i s a g e s . (2) Some r a t h e r g e n e r a l i z e d i n d i c a t i o n s of d i f f e r i n g p h y s i o l o g i c a l i n t e r a c t i o n s of w a t e r , s p a t i a l l y r e s o l v e d a l o n g one d i m e n s i o n ; and a c l e a r s e p a r a t i o n of aqueous and 8 l i p i d p h a s e s . ( 3 ) S p a t i a l f e a t u r e s o n t h e s c a l e o f o b s e r v a t i o n s w i t h a g o o d m a g n i f y i n g g l a s s , e v e n i n a n o b j e c t w h i c h s e e m s a l m o s t u n i f o r m l y f u l l o f w a t e r . 2 . H I S T O R I C A L S U R V E Y : D I F F U S I O N A N D F L O W T h e s t u d y o f m o l e c u l a r m o t i o n i n l i q u i d s a n d o f b u l k f l o w b e g a n s o o n a f t e r t h e f i r s t o b s e r v a t i o n s o f n u c l e a r i n d u c t i o n b y t h e r e s e a r c h g r o u p s o f F . B l o c h (14) a n d E . M . P u r c e l l (15). T h e c a p a b i l i t y o f NMR t o d i r e c t l y m e a s u r e t h e t r a n s l a t i o n a l m o t i o n o f m o l e c u l e s a r o s e f r o m t h e d i s c o v e r y b y E . H a h n o f s p i n e c h o e s (16). S p i n e c h o e s a r e s e c o n d a r y s i g n a l s p r o d u c e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f t w o o r m o r e r f p u l s e s i n a n NMR e x p e r i m e n t . H a h n f o u n d t h a t t h e d e c a y o f t h e s p i n e c h o w a s g o v e r n e d n o t o n l y b y s p i n - s p i n r e l a x a t i o n b u t a l s o b y t h e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f t h e s p i n s i n t h e i n e v i t a b l y i n h o m o g e n e o u s f i e l d o f t h e m a g n e t . M o t i o n o f t h e s p i n s o r m o r e p r e c i s e l y o f t h e m o l e c u l e s c o n t a i n i n g t h e s p i n s , i n s u c h a f i e l d i s a c c o m p a n i e d b y t h e v a r i a t i o n o f t h e L a r m o r f r e q u e n c y o f t h e s p i n s . T h e r a n d o m v a r i a t i o n o f f r e q u e n c y w h i c h i s o b t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f B r o w n i a n m o t i o n l e a d s t o a n u n c e r t a i n t y i n t h e p h a s e o f t h e s p i n s a n d e v e n t u a l l y t o a d e c r e a s e i n t h e i n t e n s i t y o f t h e s p i n e c h o . S h o r t l y t h e r e a f t e r , C a r r a n d P u r c e l l (17) a p p l i e d s t a t i c g r a d i e n t s t o d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r . F o l l o w i n g a s u g g e s t i o n b y M c C a l l et al . (18), S t e j s k a l a n d T a n n e r d e v e l o p e d a n a l t e r n a t e m e t h o d u s i n g p u l s e d f i e l d 9 g r a d i e n t s ( P F G s ) (12). F u r t h e r m o d i f i c a t i o n s i n v o l v i n g m u l t i p l e g r a d i e n t p u l s e s (19) a n d a l t e r n a t i n g g r a d i e n t p u l s e s (20) h a v e a l s o b e e n d e s c r i b e d . M o r e r e c e n t l y t e c h n i q u e s u s i n g m u l t i q u a n t u m (MQ) s p i n e c h o e s h a v e b e e n u s e d t o m e a s u r e d i f f u s i o n i n l i q u i d c r y s t a l s (21,22). T h e g e n e r a l t h e o r y o f t h e m e a s u r e m e n t o f d i f f u s i o n b y NMR w a s r e v i e w e d b y R e e v e s (23) w h i l s t t h e a p p l i c a t i o n t o t h e s t u d y o f r e s t r i c t e d d i f f u s i o n w a s r e v i e w e d b y T a n n e r (24). A l l o f t h e s e t e c h n i q u e s r e q u i r e s o m e m e a n s f o r d e t e r m i n i n g t h e g r a d i e n t m a g n i t u d e t o a l l o w c a l c u l a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t f r o m t h e v a r i a t i o n i n e c h o a m p l i t u d e . M e t h o d s w h i c h h a v e b e e n u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f g r a d i e n t m a g n i t u d e s i n c l u d e t h e o r e t i c a l c a l c u l a t i o n s . f r o m c o i l g e o m e t r y w i t h o u t m e a s u r e m e n t (25), m e a s u r e m e n t s o f r e s o n a n t f r e q u e n c y a s a f u n c t i o n o f p o s i t i o n i n t h e f i e l d w i t h a s a m p l e o f s m a l l d i m e n s i o n s (26,27), a n d f r o m t h e s h a p e o f t h e f r e e i n d u c t i o n d e c a y ( F I D ) o r s p i n e c h o s i g n a l (17,28). B u t b e c a u s e o f t h e e x p e r i m e n t a l d i f f i c u l t i e s i n o b t a i n i n g a c c u r a t e v a l u e s o f g r a d i e n t m a g n i t u d e s , e s p e c i a l l y f r o m t h e s h a p e o f t h e F I D o r s p i n - e c h o , c a l i b r a t i o n u s i n g t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r o b t a i n e d f r o m t r a c e r d i f f u s i o n d a t a i s s t i l l p r e f e r r e d (29, 30) . M o t i o n d u e t o b u l k f l o w a n d B r o w n i a n m o t i o n , b y t h e i r n a t u r e , h a v e d i f f e r e n t e f f e c t s u p o n t h e s p i n d y n a m i c s . T r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n c a u s e s t h e s p i n e c h o t o d e c a y w h e r e a s f l o w a f f e c t s i t s p h a s e (5-9). T h e f i r s t e x p e r i m e n t s 10 w i t h f l o w i n g l i q u i d s w e r e r e p o r t e d b y S u r y a n i n 1 9 5 0 (31). T h e e x p e r i m e n t s i n v o l v e d m e a s u r e m e n t s o f t h e v a r i a t i o n o f t h e s t e a d y s t a t e s i g n a l w i t h f l o w - r a t e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e , T , . T h e f i r s t m e a s u r e m e n t s o f b l o o d f l o w in-vivo w e r e p e r f o r m e d b y V . K u d r a v c e v a n d R . L . B o w m a n (32) i n h u m a n f o r e a r m u s i n g a t w o - m a g n e t , t i m e o f f l i g h t t e c h n i q u e a n d b y J . R . S i n g e r (33) i n t a i l s o f m i c e u s i n g a t e c h n i q u e s i m i l a r t o t h a t o f S u r y a n . L a t e r , J . R . S i n g e r a n d T . G r o v e r (34) e x p l o i t e d t h e p r o p e r t i e s o f s p i n e c h o e s t o d e t e r m i n e t h e v e l o c i t y d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n f o r b l o o d - f l o w i n r a t t a i l s a n d h u m a n f i n g e r s . S p i n e c h o e s h a v e a l s o b e e n a p p l i e d t o t h e m e a s u r e m e n t o f f l o w i n g w a t e r i n p l a n t s (35). B y o b s e r v i n g t h e v a r i a t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f t h e s t e a d y - s t a t e s i g n a l , v a r i o u s e x p e r i m e n t a l a r r a n g e m e n t s h a v e b e e n d e v e l o p e d b y B a t t o c l e t t i et al. t o m e a s u r e p u l s a t i l e a r t e r i a l b l o o d f l o w i n m a n y p a r t s o f t h e h u m a n b o d y i n r e a l - t i m e (36). A s d e s c r i b e d i n t h e r e v i e w s b y v a n A s a n d S c h a a f s m a (37) a n d S t e p i s n i k (38) t h e r e i s now i n t e r e s t i n c o m b i n i n g f l o w m e a s u r e m e n t w i t h i m a g i n g . 3 . H I S T O R I C A L S U R V E Y : I M A G I N G T h e c o n c e p t t h a t NMR d a t a c a n r e f l e c t t h e s h a p e o f t h e s a m p l e w a s f i r s t d i s c u s s e d b y G a b i l l a r d (39) who w e n t o n t o s t u d y t h e NMR r e s p o n s e f r o m g l a s s o b j e c t s , f i l l e d w i t h w a t e r , i n t h e p r e s e n c e o f g r a d i e n t s . T h e f u l l r e a l i z a t i o n o f 11 t h e m a p p i n g o f a s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f s p i n s r e q u i r e d t h r e e d i m e n s i o n s , a n d NMR i m a g i n g h a d t o w a i t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f c o m p u t e r s w i t h t h e c a p a b i l i t y o f h a n d l i n g l a r g e a r r a y s o f d a t a . I n 1 9 7 3 L a u t e r b u r p u b l i s h e d w o r k d e a l i n g w i t h t h e t w o d i m e n s i o n a l i m a g i n g , u s i n g a c o n t i n u o u s w a v e m e t h o d , o f a s e t o f c a p i l l a r i e s (40). T h e s p e c t r u m w a s s c a n n e d i n t h e p r e s e n c e o f a g r a d i e n t w i t h v a r y i n g d i r e c t i o n a n d t h e i m a g e w a s o b t a i n e d b y a p r o j e c t i o n r e c o n s t r u c t i o n a l g o r i t h m . L a t e r , a n o t h e r m e t h o d f o r i m a g i n g w a s d e v e l o p e d b y K u m a r et al. (41) who s h o w e d how t h e p r o p e r t i e s o f F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n , a p p l i e d t o t h e m e a s u r e d t i m e r e s p o n s e NMR s i g n a l , c o u l d b e u s e d t o m a p s p a t i a l d i s t r i b u t i o n . T h e s t r a t e g y w a s t o c a u s e t h e t i m e e v o l u t i o n o f t h e s p i n s y s t e m t o v a r y a s a f u n c t i o n o f t w o o r m o r e i n d e p e n d e n t t i m e i n t e r v a l s . T h e c o r r e s p o n d i n g F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n s w o u l d e a c h y i e l d o n e d i m e n s i o n o f a m u l t i d i m e n s i o n a l s p e c t r u m . T h i s p r o v e d t o b e a v e r y v e r s a t i l e s c h e m e a n d h a s f o u n d m u c h a p p l i c a t i o n i n s p e c t r o s c o p i c e x p e r i m e n t s w h e r e m a p s s h o w c o r r e l a t i o n s o f t h e c o u p l i n g s b e t w e e n s p i n s a n d w i t h a p p l i e d f i e l d s (10,42). A t t h e s a m e t i m e , M a n s f i e l d a p p l i e d g r a d i e n t s f o r i n v e s t i g a t i n g p e r i o d i c s t r u c t u r e s b y t h e NMR d i f f r a c t i o n m e t h o d (43). F u r t h e r w o r k h a s l e d t o m a n y v a r i a t i o n s o f t h e NMR i m a g i n g p r o c e s s , a n d w h i l e s o m e e f f o r t w a s m a d e t o d e v e l o p m e t h o d s f o r s c a n n i n g t h r o u g h a n o b j e c t (44,45), t e c h n i q u e s u s i n g t r a n s i e n t m e t h o d s o f d e t e c t i o n a n d F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n h a v e p r o v e n t o b e v e r y v e r s a t i l e a n d 12 a r e f a v o r e d (1-4). T h e r a n g e o f a p p l i c a t i o n o f NMR i m a g i n g i s d e t e r m i n e d b y s e v e r a l f a c t o r s w h i c h a f f e c t i m a g e q u a l i t y . T h e s e i n c l u d e s i g n a l t o n o i s e r a t i o a n d s p a t i a l r e s o l u t i o n . T o d a t e , m o s t o f t h e w o r k h a s d e a l t w i t h b i o l o g i c a l s y s t e m s b e c a u s e o f t h e h i g h a b u n d a n c e o f m o b i l e p r o t o n s w h i c h a l s o h a v e h i g h s e n s i t i v i t y (1-4). I m a g e s o f p a r t s o f t h e h u m a n b o d y s h o w d e t a i l t h a t e q u a l s o r e v e n s u r p a s s e s t h a t o f o t h e r t e c h n i q u e s s u c h a s C o m p u t e r A s s i s t e d T o m o g r a p h y ( C A T ) w h i c h i n v o l v e s s c a n n i n g w i t h X - r a y s . I n C A T s c a n s t h e r a d i a t i o n t h a t p a s s e s t h r o u g h t h e o b j e c t u n a b s o r b e d i s d e t e c t e d . T h e s c a n s s h o w s t r u c t u r e w h i c h r e f l e c t s d i f f e r i n g d e g r e e s o f e l e c t r o n d e n s i t y . I n NMR t h e s i g n a l t h a t i s m e a s u r e d a r i s e s f r o m r a d i a t i o n t h a t i s f i r s t a b s o r b e d a n d t h e n e m i t t e d b y t h e n u c l e a r s p i n s . P r o t o n NMR i m a g i n g m a p s t h e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r a n d f a t , a n d t h e i m a g e s l a r g e l y d e p i c t t h e t i s s u e s t r u c t u r e . T h e r e s o l u t i o n i n s u c h i m a g e s i s s l i g h t l y l e s s t h a n o n e m i l l i m e t e r f o r s l i c e t h i c k n e s s e s o f 2 - 3 mm. A p r i m a r y a d v a n t a g e o f t h e NMR m e t h o d i s t h e a b i l i t y t o p e r f o r m t h e s e m e a s u r e m e n t s n o n i n v a s i v e l y o n o b j e c t s w h i c h a r e o p a q u e . F u r t h e r m o r e , t h e r e s p o n s e v a r i e s d e p e n d i n g u p o n t h e p r o p e r t i e s o f t h e s p i n s a n d s o c h e m i c a l e n v i r o n m e n t i s i m p o r t a n t . T h u s NMR i m a g i n g p r o v i d e s a m e a n s f o r s t u d y i n g t h e i n t e r n a l s t r u c t u r e a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f o b j e c t s . 13 4 . O R G A N I Z A T I O N O F T H E T H E S I S T h e r e m a i n d e r o f t h e t h e s i s i s o r g a n i z e d i n t o t h r e e p a r t s . I n c h a p t e r I I , t h e b a s i c t h e o r y o f NMR t a k i n g a c c o u n t o f t h e e f f e c t o f m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s i s r e v i e w e d . A m e t h o d b a s e d u p o n t h e a n a l y s i s o f l i n e s h a p e s f o r d e t e r m i n i n g g r a d i e n t m a g n i t u d e s a n d l i n e a r i t y , a n d m e t h o d s f o r i m a g i n g a n d d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t a r e d e s c r i b e d . T h e m o d i f i c a t i o n o f a h i g h r e s o l u t i o n NMR p r o b e w i t h g r a d i e n t c o i l s f o r i m a g i n g a n d d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t , a p p a r a t u s f o r s u r f a c e c o i l d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s a n d m e a s u r e m e n t s o n m o d e l s y s t e m s u s i n g b o t h i n s t r u m e n t s w i l l a l s o b e d e s c r i b e d . C h a p t e r I I I d e a l s w i t h t h e m e a s u r e m e n t o f p r o t o n t r a n s l a t i o n a l m o t i o n b y N M R . F i r s t t o d e m o n s t r a t e t h e r a n g e o f q u a n t i t a t i o n a n d p o s s i b l e a p p l i c a t i o n s f o r c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d m e a s u r e m e n t s , t h e d i f f u s i o n o f g l u c o s e a n d d e x t r a n w a s s t u d i e d . S e c o n d l y , t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d i s u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e m o t i o n o f w a t e r a n d f a t in-vivo i n h u m a n f o r e a r m ( m u s c l e a n d c o n n e c t i v e t i s s u e ) . C h a p t e r I V d e s c r i b e s t h e a p p l i c a t i o n o f t w o - d i m e n s i o n a l NMR i m a g i n g m e t h o d s t o m a p p r o t o n d i s t r i b u t i o n i n t w o b i o l o g i c a l s y s t e m s : p u p a e o f Barbara col faxi ana a n d m a t u r e c a p s o f Acetabularia mediterranea. I I . M A G N E T I C F I E L D G R A D I E N T S I N NMR I n t h i s c h a p t e r , t h e p r i n c i p l e s a n d t h e a p p a r a t u s f o r d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t a n d i m a g i n g b y N M R , a n d e x p e r i m e n t a l r e s u l t s f o r m o d e l s y s t e m s w i l l b e d e s c r i b e d . T h e d i s c u s s i o n b e g i n s w i t h a r e v i e w o f s t a n d a r d NMR t h e o r y i n s e c t i o n A . 1 . I n s e c t i o n A . 2 , i t i s s h o w n t h a t t h e NMR s p e c t r u m , b r o a d e n e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f a g r a d i e n t , i s d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e s p i n d i s t r i b u t i o n p r o v i d e d t h e n a t u r a l l i n e w i d t h i s s m a l l c o m p a r e d t o t h e o v e r a l l l i n e w i d t h . T h i s r e l a t i o n s h i p c a n t h e n b e u s e d t o d e t e r m i n e g r a d i e n t m a g n i t u d e a n d l i n e a r i t y . I n s e c t i o n A . 3 , NMR m e t h o d s f o r o b t a i n i n g t w o - d i m e n s i o n a l s p e c t r a w i t h t w o s p a t i a l c o o r d i n a t e s a n d w i t h o n e c o o r d i n a t e r e p l a c e d b y c h e m i c a l s h i f t a r e t h e n d e s c r i b e d . T h e f a c t o r s w h i c h a f f e c t t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o r c o n t r a s t , a n d t h e s p a t i a l r e s o l u t i o n b e t w e e n f e a t u r e s i n NMR i m a g e s a r e a l s o d i s c u s s e d . I n s e c t i o n s A . 4 a n d A . 5 , t h e a p p l i c a t i o n o f m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s f o r s t u d y i n g t r a n s l a t i o n a l m o t i o n d u e t o d i f f u s i o n a n d b u l k f l o w o f t h e s p i n s i s d i s c u s s e d . T h e d e s c r i p t i o n o f t h e e f f e c t s o f d i f f u s i o n a n d f l o w b y t h e m o d i f i c a t i o n o f t h e B l o c h e q u a t i o n s , f o l l o w s t h e d i s c u s s i o n o f S t e j s k a l ( 5 ) . I n s e c t i o n A . 4 , t h e p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o p u l s e s e q u e n c e o f S t e j s k a l a n d T a n n e r (12) i s i n t r o d u c e d , w h e r e i n g r a d i e n t p u l s e s a r e a p p l i e d e q u a l l y b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e . F o r m u l t i - c o m p o n e n t s y s t e m s , s i n c e t h e s p i n e c h o s i g n a l i s m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f g r a d i e n t s , h i g h r e s o l u t i o n s p e c t r a c a n b e 14 15 o b t a i n e d a n d t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s c a n b e d e t e r m i n e d f o r e a c h c h e m i c a l s h i f t . I n s e c t i o n A . 5 , t h e e f f e c t o f r a n d o m i z e d f l o w i s o b t a i n e d b y f i r s t s o l v i n g f o r u n i f o r m m o t i o n a n d t h e n a v e r a g i n g o v e r a G a u s s i a n d i s t r i b u t i o n o f v e l o c i t i e s . I t i s s h o w n t h a t t h e s p i n e c h o d e c a y s w i t h a n e f f e c t i v e d i f f u s i v i t y t h a t i n c r e a s e s w i t h t h e e c h o t i m e . T h u s i t i s p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t r u e d i f f u s i o n a n d r a n d o m i z e d f l o w b o t h o f w h i c h m a y o c c u r i n a l i v i n g b i o l o g i c a l s y s t e m . I n t h e e x p e r i m e n t a l s e c t i o n , t h e a p p a r a t u s u s e d f o r d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s a n d m i c r o s c o p i c i m a g i n g ( s e c t i o n B . 1 ) a n d t h e a p p a r a t u s u s e d f o r s u r f a c e c o i l , p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s ( s e c t i o n B . 2 ) a r e d e s c r i b e d . G r a d i e n t c o i l s w e r e c o n s t r u c t e d f o r b o t h s y s t e m s , u s i n g s t a n d a r d d e s i g n s s u i t a b l e f o r t h e c y l i n d r i c a l b o r e o f s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t s . T h e s m a l l e r s i z e o f t h e s e g r a d i e n t c o i l s c o m p a r e d t o t h o s e b u i l t i n t o t h e r e s p e c t i v e s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t s a l l o w s t h e g e n e r a t i o n o f l a r g e r g r a d i e n t s w i t h s h o r t e r r i s e t i m e s . T o m a x i m i z e t h e w o r k i n g a r e a f o r s a m p l e s , t h e c u r r e n t w i n d i n g s w e r e o n l y a p p r o x i m a t e l y p l a c e d . H o w e v e r , t h e d i a m e t e r s o f t h e c o i l s w e r e l a r g e e n o u g h s o t h a t t h e v a r i a t i o n o f t h e m a g n e t i c f i e l d o v e r t h e s a m p l e w a s l i n e a r . F o r m i c r o s c o p i c i m a g i n g , t h e g r a d i e n t c o i l s w e r e w o u n d o n a P e r s p e x f o r m e r w h i c h w a s t h e n m o u n t e d o n a h i g h r e s o l u t i o n NMR p r o b e . F o r m e a s u r e m e n t s w i t h s u r f a c e c o i l s , t h e g r a d i e n t c o i l s w e r e w o u n d o n a P V C f o r m e r w h i c h w a s t h e n p l a c e d i n 16 t h e b o r e o f t h e m a g n e t . I n s e c t i o n B . 3 r t h e NMR m e t h o d s i n c l u d i n g d a t a a c q u i s i t i o n p r o c e d u r e s , a p o d i z a t i o n a n d t h e e q u a l i z a t i o n o f t h e f i e l d o f v i e w f o r i m a g i n g a r e d e s c r i b e d . I n t h e f i r s t p a r t o f t h e r e s u l t s a n d d i s c u s s i o n s e c t i o n , C . 1 - C . 4 , t h e d e t e r m i n a t i o n o f g r a d i e n t m a g n i t u d e s f r o m l i n e s h a p e s w i l l b e d e s c r i b e d . A f t e r e n s u r i n g t h a t t h e r f d i s t r i b u t i o n i s u n i f o r m a n d t h a t t h e e f f e c t s o f r e c e i v e r d e a d t i m e w e r e m i n i m i z e d , g r a d i e n t s p e c t r a w e r e o b t a i n e d w i t h l i n e s h a p e s t h a t a g r e e q u i t e w e l l w i t h t h e e x p e c t e d l i n e s h a p e . I n p a r t i c u l a r , w i t h t h e g r a d i e n t a p p l i e d a c r o s s a c a p i l l a r y c o n t a i n i n g w a t e r , t h e g r a d i e n t m a g n i t u d e w a s o b t a i n e d a l l o w i n g t h e a b s o l u t e d e t e r m i n a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r u s i n g t h e s t a t i c g r a d i e n t t e c h n i q u e . T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r u s i n g t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d i s d e s c r i b e d i n s e c t i o n C . 5 . M e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h b o t h t h e m o d i f i e d h i g h r e s o l u t i o n a p p a r a t u s ( B . 1 ) a n d t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s ( B . 2 ) . E d d y c u r r e n t e f f e c t s , c a u s i n g u n e q u a l d e p h a s i n g a n d r e p h a s i n g o f t h e s p i n s a n d r e s u l t i n g i n a r e d u c t i o n o f t h e e c h o a m p l i t u d e , w e r e o b s e r v e d o n b o t h s y s t e m s . T h e s e e f f e c t s w e r e m i n i m i z e d b y v a r y i n g t h e e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s i n c l u d i n g t h e g r a d i e n t m a g n i t u d e , d u r a t i o n o f t h e g r a d i e n t p u l s e a n d t h e e c h o t i m e . I n s e c t i o n C . 6 , t h e m e a s u r e m e n t o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e f r o m s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m e c h o e s i s d e s c r i b e d . T h e s i n g l e q u a n t u m m e a s u r e m e n t w a s p e r f o r m e d u s i n g t h e s t a n d a r d p u l s e d 17 g r a d i e n t m e t h o d . F o r t h e d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m m e a s u r e m e n t s a m o d i f i e d p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s e q u e n c e w a s u s e d t o s e l e c t d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m e c h o e s . I n s e c t i o n C.l, t h e t w o d i m e n s i o n a l i m a g i n g o f t h e p r o t o n d i s t r i b u t i o n i n c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g w a t e r a n d a c e t o n e w i l l b e d e s c r i b e d . A . T H E O R Y O F N U C L E A R M A G N E T I C R E S O N A N C E I n t h i s r e v i e w , t h e r o t a t i n g f r a m e i s i n t r o d u c e d f o r d e s c r i b i n g t h e e f f e c t o f r a d i o f r e q u e n c y m a g n e t i c f i e l d s o n t h e s p i n s y s t e m (46,47). T h e B l o c h e q u a t i o n s a r e a d o p t e d t o g i v e a d e s c r i p t i o n o f t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f e x t e r n a l f i e l d s a n d r e l a x a t i o n o f t h e s p i n s y s t e m . F o r l i q u i d s , t h e B l o c h e q u a t i o n s p r e d i c t t h a t t h e f r e q u e n c y s p e c t r u m o f t h e r e s p o n s e , a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a 9 0 ° p u l s e , c o n s i s t s o f a s e r i e s o f L o r e n t z i a n l i n e s c o r r e s p o n d i n g t o s p i n s w i t h d i f f e r e n t c h e m i c a l s h i f t s . 1 . G E N E R A L M a n y a t o m i c n u c l e i h a v e a n o n - z e r o s p i n a n g u l a r m o m e n t u m , I f i , a n d a d i p o l a r m a g n e t i c m o m e n t , = yfil, c o l l i n e a r w i t h i t . T h e c o n s t a n t o f p r o p o r t i o n a l i t y , y, i s c a l l e d t h e g y r o m a g n e t i c r a t i o . I n a s t a t i c m a g n e t i c f i e l d , B 0 , d i f f e r e n t o r i e n t a t i o n s o f t h e n u c l e a r s p i n o r m o r e b r i e f l y , s p i n , w i t h r e s p e c t t o t h e f i e l d a r e d e s c r i b e d b y d i f f e r e n t v a l u e s o f t h e q u a n t u m n u m b e r , I = m , o f t h e s p i n q u a n t i z e d a l o n g t h e f i e l d a n d c o r r e s p o n d t o d i f f e r e n t 18 m a g n e t i c e n e r g i e s , E ^ . T h e i n t e r a c t i o n e n e r g i e s a r e g i v e n b y t h e h a m i l t o n i a n = -y-hB0i2. [2-1] T h e l a t t e r e x p r e s s i o n h o l d s i f t h e f i e l d i s c h o s e n t o l i e a l o n g t h e z - d i r e c t i o n , B = B 0 z . A t e q u i l i b r i u m , a p r e f e r e n t i a l a l i g n m e n t o f t h e n u c l e a r s p i n s a l o n g t h e d i r e c t i o n o f t h e f i e l d g i v e s r i s e t o a n e t m a g n e t i z a t i o n , M , a n d i s d e s c r i b e d b y a M a x w e l l - B o l t z m a n n d i s t r i b u t i o n o f p o p u l a t i o n s o f t h e e n e r g y l e v e l s v ^ m B o / k T N*fi —^ T me p^ _ Q J L J [2-2] * i XfimB0/kT e I m = -I N u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e i s a t e c h n i q u e f o r m e a s u r i n g t h e m a g n e t i s m b y t h e a p p l i c a t i o n o f a n o s c i l l a t i n g m a g n e t i c f i e l d , p e r p e n d i c u l a r t o t h e s t a t i c f i e l d , i n t h e f o r m o f r a d i o f r e q u e n c y r a d i a t i o n . R e s o n a n c e i s t h e c o n d i t i o n w h e r e t h e a n g u l a r f r e q u e n c y o f t h e a p p l i e d r a d i a t i o n m u s t m a t c h e n e r g y d i f f e r e n c e s b e t w e e n l e v e l s i n o r d e r t h a t e n e r g y b e a b s o r b e d , i . e . , -ftw = A E . F o r a s y s t e m s u c h a s t h i s , a c o n v e n i e n t d e s c r i p t i o n i n t e r m s o f a s t a t i s t i c a l e n s e m b l e o f q u a n t u m m e c h a n i c a l s y s t e m s ( t h e s p i n s ) , i n v o l v e s t h e d e n s i t y o p e r a t o r p w h i c h i s d e f i n e d s o t h a t f o r a n y o b s e r v a b l e Q , t h e e x p r e s s i o n f o r 19 t h e e x p e c t a t i o n v a l u e i s g i v e n b y (48,49) <Q> = Tr(Qp). E-3 T h e d e n s i t y o p e r a t o r p m u s t s a t i s f y t h e t h r e e c o n d i t i o n s : ( i i i ) p i s p o s i t i v e d e f i n i t e . T h e p h y s i c a l i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e c o n d i t i o n s i s t h a t t h e d i a g o n a l e l e m e n t s o f p c o n s t i t u t e t h e p r o b a b i l i t i e s o f f i n d i n g t h e s y s t e m i n t h e c o r r e s p o n d i n g p u r e s t a t e . T h e s u m o f t h e p r o b a b i l i t i e s e q u a l s u n i t y , a n d e x p e c t a t i o n v a l u e s o f o p e r a t o r s c o r r e s p o n d i n g t o a n y p h y s i c a l o b s e r v a b l e a r e r e a l . A t e q u i l i b r i u m , t h e d e n s i t y o p e r a t o r t a k e s t h e f o r m ( i ) T r p = 1 ( i i ) p m u s t b e H e r m i t i a n a n d w h e r e V k T , Z = Tr (e T h e e q u i l i b r i u m m a g n e t i z a t i o n i s g i v e n b y I n t h e h i g h t e m p e r a t u r e a p p r o x i m a t i o n , / k T << 1, a n d 20 e x p a n d i n g t h e e x p o n e n t i a l t e r m s g i v e s C u r i e ' s l a w f o r t h e m a g n e t i z a t i o n T h e e q u i l i b r i u m m a g n e t i z a t i o n i s a l i g n e d w i t h t h e f i e l d a n d i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e m a g n i t u d e o f t h e f i e l d . T h e t i m e e v o l u t i o n o f t h e s y s t e m i n t h e S c h r o d i n g e r p i c t u r e i s g i v e n b y t h e v o n N e u m a n n e q u a t i o n w h i c h may a l s o b e w r i t t e n a s dt "Hh^e [2-9] u s i n g t h e n o t a t i o n X f o r [W, ] , a s u p e r o p e r a t o r . F o r s p i n 1 / 2 , t h e d e n s i t y o p e r a t o r c a n b e e x p r e s s e d a s (48) p4o-p-<n [ 2. 1 0 ] w h e r e P i s t h e p o l a r i z a t i o n v e c t o r a n d t h e c o m p o n e n t s o f £ a r e t h e P a u l i s p i n m a t r i c e s . T h e t i m e e v o l u t i o n o f t h e x a n d y c o m p o n e n t s o f t h e p o l a r i z a t i o n a r e t h e n g i v e n b y t h e e x p r e s s i o n s 21 dt 3 d? Q [2-11] dt w h i c h h a s t h e s o l u t i o n Rj = Py(0cos c J 0 i Fx =Rj,osin u)0t f o r t h e i n i t i a l v a l u e , P y Q o f P . T h e m o t i o n g i v e n b y e q u a t i o n [ 2 . 1 2 ] c a n b e r e p r e s e n t e d i n a p r e c e s s i o n d i a g r a m 1 a s f o l l o w s [212] T h i s r e s u l t i s d i r e c t l y a n a l o g o u s t o t h a t o f t h e c l a s s i c a l d e s c r i p t i o n w h e r e a m a g n e t i c m o m e n t M e x p e r i e n c e s i n a f i e l d d l B , a t o r q u e M x B e q u a l t o t h e r a t e o f c h a n g e ft o f i t s dt a n g u l a r m o m e n t u m . S i n c e M = 7fil t h e m o t i o n o f t h e m a g n e t i c m o m e n t i s d e s c r i b e d b y t h e e q u a t i o n J f = *M*B. . [2-13] 1 M . B L O O M , L e c t u r e s , U B C , 1 9 8 1 . 22 I f now a n o s c i l l a t i n g f i e l d w i t h f r e q u e n c y u)2 i s a p p l i e d , Br=2B.cos<^t x [2-1 A] t o d e s c r i b e t h e m o t i o n i t i s u s e f u l t o t r a n s f o r m t o a c o o r d i n a t e s y s t e m r o t a t i n g a r o u n d t h e z - d i r e c t i o n a t f r e q u e n c y - w . T h e o s c i l l a t i n g f i e l d may b e w r i t t e n a s t h e s u m o f t w o c o u n t e r r o t a t i n g c o m p o n e n t s a n d t h e h a m i l t o n i a n b e c o m e s 2 [2-151 = -f i<j 0 I z - Mcj.lle i i(w-u)t -i(cj*cj)t r i(cj.+u)t -i(cj-u)t \ ^cj,[[e 2 + e z ]I++[e +e 2 w h e r e CJ, = 7 B , . I f u 2 = u t h e n WR=-f>o)0Iz-^(j,(I++IJ ••^cj I(e"2 ," tI+ +e2,6)tU. [2-16] I n t h e r o t a t i n g f r a m e a p p r o x i m a t i o n , t h e e f f e c t o f t h e r a p i d l y o s c i l l a t i n g t e r m s i s s m a l l g i v i n g !HR = - f ^ 2 - f ^ , i x . [2-17] 2 N o t e : $ i s t h e r o t a t i o n g e n e r a t o r f o r o p e r a t o r s . 2 3 N o w , a p p l y i n g t h e s a m e t r a n s f o r m a t i o n t o t h e d e n s i t y o p e r a t o r -i«4t t h e t i m e d e r i v a t i v e i s dp(t) . -\o$zt dp = I-l".-u)4-u,jl<lp(t) = -<•>.*-iff (>R(tK [2-19] T h e e f f e c t i v e f i e l d i n t h e r o t a t i n g f r a m e i s i n t h e d i r e c t i o n o f J ^ ^ a n d c a u s e s a p r e c e s s i o n w i t h f r e q u e n c y 0)^=1 (a-of* of]* [2.20] A t r e s o n a n c e , u>0 = w a n d 6 J e f f 4 f f = ° . ^ - [2-21] T h e n t h e a p p l i c a t i o n o f t h e B , f i e l d f o r a t i m e t ' c a u s e s p o l a r i z a t i o n a l o n g t h e z - a x i s t o r o t a t e t h r o u g h a n a n g l e a 2 4 = c o , t ' a r o u n d t h e x - a x i s : a n d i s s a i d t o c o n s t i t u t e a n a ° p u l s e ; t h e s u b s c r i p t X i n d i c a t e s t h e d i r e c t i o n o f t h e a p p l i e d B , f i e l d . I n t h e a b s e n c e o f r a d i o f r e q u e n c y r a d i a t i o n , t h e p r e c e s s i o n a r o u n d t h e z - d i r e c t i o n o c c u r s a t a f r e q u e n c y u>' = CJ0 - u> i n t h e r o t a t i n g f r a m e . I n a s a m p l e , t h e r e i s l i k e l y t o b e a d i s t r i b u t i o n o f L a r m o r f r e q u e n c i e s a n d t h e r e s o n a n c e c o n d i t i o n w i l l n o t b e e x a c t l y f u l f i l l e d f o r a l l o f t h e s p i n s s i m u l t a n e o u s l y . H o w e v e r , i n p u l s e d NMR s u f f i c i e n t l y i n t e n s e r f r a d i a t i o n i s a p p l i e d t h a t t h e r e l a t i o n s h i p i n E q . [ 2 . 2 1 ] i s a p p r o x i m a t e l y t r u e , i . e . u , » (CJ 0 ~ w) f o r a 1 1 w o i n t h e s a m p l e . T h u s i n a t y p i c a l e x p e r i m e n t , a 9 0 ° p u l s e r o t a t e s m a g n e t i z a t i o n w h i c h i s i n i t i a l l y a l o n g z a t e q u i l i b r i u m t o t h e y - a x i s . T h e a c t i o n o f t h e s t a t i c f i e l d c a u s e s t h e t r a n s v e r s e c o m p o n e n t s o f m a g n e t i z a t i o n t o p r e c e s s a r o u n d t h e z - d i r e c t i o n , i n d u c i n g a v o l t a g e i n a c o i l w h i c h i s m e a s u r e d . F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n o f t h i s t i m e d o m a i n s i g n a l y i e l d s t h e 2 5 f r e q u e n c y s p e c t r u m o f t h e r e s p o n s e (50) S M =J f(t)e dt. [2-22] -to W i t h a p h a s e s e n s i t i v e d e t e c t o r , i n f o r m a t i o n a b o u t p r o j e c t i o n s o f t h e r o t a t i n g m a g n e t i z a t i o n a l o n g a n y a x i s i n t h e x y p l a n e c a n b e o b t a i n e d (51). U n t i l now o n l y t h e a c t i o n o f e x t e r n a l f i e l d s o n t h e s y s t e m h a s b e e n d i s c u s s e d . T h e r e a r e s e v e r a l m e c h a n i s m s b y w h i c h t h e s y s t e m may r e t u r n t o e q u i l i b r i u m b u t a l l r e q u i r e a r a n d o m l y f l u c t u a t i n g f i e l d t o b e e x p e r i e n c e d b y t h e s p i n s . V a r i o u s p r o p e r t i e s o f n u c l e a r m a g n e t i s m t h e r e f o r e u n d e r g o s u b s t a n t i a l c h a n g e s w h e n l i q u i d ( o r g a s e o u s ) s a m p l e s a r e u s e d . T h e s e c h a n g e s a r e b r o u g h t a b o u t b y t h e e x i s t e n c e o f r a p i d m o l e c u l a r m o t i o n s o f l a r g e a m p l i t u d e a n d r a n d o m c h a r a c t e r , i n s i d e t h e s e s a m p l e s , w h i c h g e n e r a t e t h e f l u c t u a t i n g f i e l d s f o r r e l a x a t i o n . T h e s e m o t i o n s i n c l u d e r o t a t i o n a l t u m b l i n g o f i n d i v i d u a l m o l e c u l e s , r e l a t i v e t r a n s l a t i o n a l m o t i o n o f m o l e c u l e s a n d e v e n , b e c a u s e o f c h e m i c a l e x c h a n g e , m i g r a t i o n s o f a t o m s o r g r o u p s o f a t o m s f r o m o n e m o l e c u l e t o a n o t h e r . M e c h a n i s m s f o r r e l a x a t i o n i n c l u d e d i p o l e - d i p o l e c o u p l i n g , q u a d r u p o l e r e l a x a t i o n , c h e m i c a l s h i f t a n i s o t r o p y , s p i n - r o t a t i o n a n d s c a l a r c o u p l i n g (46,47). T h e c a l c u l a t i o n s r e q u i r e d f o r a q u a n t u m m e c h a n i c a l d e s c r i p t i o n o f s p i n r e l a x a t i o n p r o c e s s e s a r e n o t n e e d e d a n d t o o b u l k y t o b e g i v e n h e r e . 2 6 F r o m p h e n o m e n o l o g i c a l a r g u m e n t s , B l o c h p r o p o s e d a s e t o f s i m p l e e q u a t i o n s t h a t p r o v i d e i n m o s t c a s e s a c o r r e c t q u a n t i t a t i v e d e s c r i p t i o n , s u f f i c i e n t f o r t h e p u r p o s e h e r e , o f t h e m a g n e t i c p r o p e r t i e s o f e n s e m b l e s o f n u c l e i i n e x t e r n a l m a g n e t i c f i e l d s (52). T h e s e c o n s i s t o f t h e f o l l o w i n g w h e r e i ' , j ' , k ' a r e t h e u n i t v e c t o r s o f t h e r o t a t i n g f r a m e , T , a n d T 2 a r e t h e l o n g i t u d i n a l a n d t r a n s v e r s e r e l a x a t i o n t i m e s r e s p e c t i v e l y . L o n g i t u d i n a l r e l a x a t i o n i n v o l v e s t h e r e t u r n o f t h e m a g n e t i z a t i o n t o w a r d s t h e r m a l e q u i l i b r i u m w i t h l o s s o f e n e r g y t o t h e l a t t i c e . T h e l a t t e r c o n s i s t s o f t h e t r a n s l a t i o n a l a n d r o t a t i o n a l d e g r e e s o f f r e e d o m . T r a n s v e r s e r e l a x a t i o n i n v o l v e s t h e d e p h a s i n g o f c o m p o n e n t s o f t h e m a g n e t i z a t i o n d u e t o v a r i o u s l o c a l f i e l d s a r i s i n g f r o m i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s p i n s a n d w i t h t h e s u r r o u n d i n g s . T h e r a t e o f d e c a y i s d e p e n d e n t u p o n d e t a i l s o f t h e m o t i o n o f t h e m o l e c u l e s c o n t a i n i n g t h e s p i n s a n d t h e s e a r e o f t e n d e s c r i b e d i n t e r m s o f c o r r e l a t i o n f u n c t i o n s (53). F o r e x a m p l e , t h e c o r r e l a t i o n f u n c t i o n , G ( r ) , f o r a f l u c t u a t i n g l o c a l f i e l d , b ( t ) , c o u l d b e e x p r e s s e d a s d M dT L2-23] GCr) = <b.(t)-bL(t* r)> 27 w h e r e t h e a n g u l a r b r a c k e t s i m p l y a n e n s e m b l e a v e r a g e a n d t h e s e c o n d e q u a l i t y i s a n o f t e n m a d e a s s u m p t i o n a s t o t h e f o r m o f G ( t ) . T h e c o r r e l a t i o n t i m e T c h a r a c t e r i z e s t h e t i m e c s c a l e o f t h e f l u c t u a t i o n s . N u c l e a r r e l a x a t i o n r a t e s a r e r e l a t e d t o t h e t i m e c o r r e l a t i o n f u n c t i o n s o f t h e f l u c t u a t i n g l o c a l i n t e r a t i o n s b y F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n . T h i s g i v e s r i s e t o t h e s o - c a l l e d s p e c t r a l d e n s i t y o r p o w e r s p e c t r u m , J(CJ) , o f t h e f l u c t u a t i o n s . F o r t h e G ( T ) g i v e n a b o v e t h i s h a s t h e f o r m J ( « ) = <b,2> , 2 ? ' [2-25] F o r m a g n e t i c d i p o l e - d i p o l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n l i k e s p i n s t h e g e n e r a l f o r m s o f t h e r e l a x a t i o n r a t e s a r e (Ti)"d =2/3 ^  [ j ( u 0 ) + 4 j ( 2 o ) 0 ) ] and [2-26] ( T 2 } d = 2 / 3 A ^ [ 3 / 2 j ( 0 ) * 5 / 2 j ( u o ) * j ( 2 ^ o ) ] w h e r e J (CJ ) i s a ' r e d u c e d ' s p e c t r a l d e n s i t y w h i c h f o r t h e f o r m g i v e n i n e q u a t i o n [ 2 . 2 5 ] w o u l d b e J ( c o ) / 2 < b ^ > , a n d ^ = 7 2 < b 2 > i s a m e a s u r e o f t h e a p p r o p r i a t e m e a n - s q u a r e d d i p o l a r c o u p l i n g s t r e n g t h . T h e f r e q u e n c i e s 0 , u>0 a n d 2CJ 0 r e s u l t f r o m a q u a n t u m m e c h a n i c a l d e s c r i p t i o n o f t h e s p i n s a n d i n d i c a t e t h a t e n e r g y c a n o n l y b e e x c h a n g e d i n d i s c r e t e q u a n t a . 2 8 N e g l e c t i n g t h e e f f e c t o f B , t h e B l o c h e q u a t i o n s g i v e M z =M 0 (1 -e~ t / T . ) M = M e '2 T h e s i g n a l o b t a i n e d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a 9 0 ° p u l s e i s r e f e r r e d t o a s a f r e e i n d u c t i o n d e c a y ( F I D ) , a n d t a k e s t h e f o r m o f a d a m p e d o s c i l l a t i n g f u n c t i o n o f t i m e M y = M y j 0 e" t / T 2cosco e t . [2-28] T h e f r e q u e n c y s p e c t r u m , o b t a i n e d a f t e r F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n , i s t h e s u m o f r e a l ( a b s o r p t i o n ) a n d i m a g i n a r y ( d i s p e r s i o n ) c o m p o n e n t s 2 S M = - ° ( 2 - 3 - ; * — h) [2-29] 2 1*[u-ujT2 1 + (6J - ( J 0 )T 2 T h e c o u n t e r r o t a t i n g c o m p o n e n t s w e r e n e g l e c t e d a n d t h e r e a l c o m p o n e n t h a s t h e f o r m o f a L o r e n t z i a n f u n c t i o n w i t h a l i n e w i d t h a t h a l f m a x i m u m o f 2 / T 2 . I n l i q u i d s , t h e r a p i d t u m b l i n g o f m o l e c u l e s w i t h r e o r i e n t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e s o f 1 0 " 1 2 t o 1 0 " 1 1 s l e a d s t o m o t i o n a l a v e r a g i n g o f t h e d i p o l e - d i p o l e a n d q u a d r u p o l e i n t e r a c t i o n s , a n d c h e m i c a l s h i f t a n i s o t r o p i e s (46,47). T h e s p e c t r a t h a t a r e o b t a i n e d [2.27] 2 9 c o n s i s t o f n a r r o w l i n e s . T h e l i n e w i d t h s a r e t y p i c a l l y o f t h e o r d e r o f a h e r t z a n d a r e d e t e r m i n e d l a r g e l y b y m a g n e t i c f i e l d i n h o m o g e n e i t y . F u r t h e r s t r u c t u r e i n t h e s e s p e c t r a a r i s e s f r o m t h e m a g n e t i c s h i e l d i n g o f t h e n u c l e i b y e l e c t r o n s a n d t h e i n d i r e c t c o u p l i n g o f o n e n u c l e u s w i t h a n o t h e r v i a t h e e l e c t r o n s . T h e m o t i o n o f t h e o r b i t a l e l e c t r o n s p r o d u c e s a f i e l d a t t h e n u c l e u s w h i c h i s p r o p o r t i o n a l a n d i n o p p o s i t i o n t o t h e a p p l i e d f i e l d , B 0 . T h e l o c a l m a g n e t i c f i e l d a t t h e n u c l e u s w i l l b e g i v e n b y B i o c a i = E * > ( 1 - < 5 ) t2-30] w h e r e a i s t h e c h e m i c a l s h i f t . T h e i n d i r e c t c o u p l i n g via t h e e l e c t r o n s c a u s e s o n e n u c l e a r s p i n t o e x p e r i e n c e a f i e l d w h i c h v a r i e s d e p e n d i n g u p o n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e o t h e r . T h i s i n t e r a c t i o n c a u s e s c h a r a c t e r i s t i c s p l i t t i n g s o f t h e l i n e s i n h i g h r e s o l u t i o n s p e c t r a a n d i s d e s c r i b e d b y t h e e x p r e s s i o n (54) Vj - J f • T. [231] T h e c o n s t a n t J i s u s u a l l y o f t h e o r d e r o f s e v e r a l h e r t z f o r p r o t o n s . W h i l e t h e s e e f f e c t s w i l l b e o b s e r v e d i n s o m e s p e c t r a , t h e y a r e n o t o f c o n c e r n h e r e a n d w i l l n o t b e d i s c u s s e d a n y f u r t h e r . 30 2 . L I N E S H A P E : R E L A T I O N T O G R A D I E N T A N D S A M P L E S H A P E W h i l e t h e e f f e c t o f i n h o m o g e n e i t y o f m a g n e t i c f i e l d s h a s o f t e n b e e n d i s c u s s e d , p a r t i c u l a r l y i n t e r m s o f a * s h o r t e n e d t r a n s v e r s e r e l a x a t i o n t i m e , T 2 (55), n o e x p l i c i t e v a l u a t i o n o f t h e e f f e c t o f l i n e a r g r a d i e n t s o n l i n e s h a p e s , i n t h e f r e q u e n c y d o m a i n h a s a p p e a r e d . I n t h i s s e c t i o n , t h e NMR l i n e s h a p e f o r a c y l i n d r i c a l o b j e c t m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f a m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t w i l l b e d i s c u s s e d . F o l l o w i n g t h e a n a l y s i s o f K u m a r et al.(41), t h e f r e q u e n c y s p e c t r u m i s s h o w n t o b e t h e c o n v o l u t i o n o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n w i t h a L o r e n t z i a n l i n e s h a p e f u n c t i o n f o r l i q u i d s . W h e n t h e n a t u r a l l i n e w i d t h i s s m a l l c o m p a r e d t o t h e o v e r a l l l i n e w i d t h w i t h t h e g r a d i e n t a p p l i e d , t h e L o r e n t z i a n l i n e s h a p e c a n b e a p p r o x i m a t e d b y a d e l t a f u n c t i o n a n d t h e f r e q u e n c y s p e c t r u m i s t h e n g i v e n b y t h e s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n d i r e c t l y . T h e r e l a t i o n i s a l s o o n l y v a l i d w h e n t h e v a r i a t i o n o f t h e m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t i s s m a l l . O t h e r w i s e , s p i n s a t d i f f e r e n t p a r t s o f t h e s a m p l e may r e s o n a t e a t t h e s a m e f r e q u e n c y a n d t h e c o r r e s p o n d e n c e b e t w e e n f r e q u e n c y a n d p o s i t i o n w o u l d n o t b e u n i q u e . T h e m a g n i t u d e o f t h e g r a d i e n t c a n b e d e t e r m i n e d f r o m t h e l i n e w i d t h o r , f o r a c y l i n d r i c a l s a m p l e , b y i n v e r t i n g t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l i n e s h a p e a n d s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n . T h e NMR s i g n a l i n t h e f r e q u e n c y d o m a i n , S ( a > ) , i s a c o m p o s i t e o f t h e c o n t r i b u t i o n s f r o m t h e v a r i o u s v o l u m e 31 e l e m e n t s o f t h e s a m p l e a n d c a n b e e x p r e s s e d i n t h e f o r m w h e r e c ( r ) i s t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l n u c l e a r s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n a n d S ( r , a > ) i s t h e NMR s i g n a l f r o m a v o l u m e e l e m e n t . F o r a s i n g l e g r a d i e n t a p p l i e d a l o n g t h e x a x i s S (CJ ) i s g i v e n b y w h e r e c ( x ) r e p r e s e n t s t h e p r o j e c t i o n o f t h e n u c l e a r s p i n d e n s i t y o n t o t h e x a x i s . T h e NMR s i g n a l , S ( C J ) , a f t e r a c h a n g e o f c o o r d i n a t e s a n d n e g l e c t o f t h e c o u n t e r - r o t a t i n g c o m p o n e n t , i s t h e s u m o f a b s o r p t i o n , A ( C J ) , a n d d i s p e r s i o n , D (CJ ) , c o m p o n e n t s I n l i q u i d s , t h e a b s o r p t i o n s i g n a l i s L o r e n t z i a n a n d t h e c o n t r i b u t i o n d u e t o s p i n s a t p o s i t i o n x ' , i n a l i n e a r m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t , G , i s g i v e n b y A(x,w) = M e/T 2 w h e r e M 0 i s t h e e q u i l i b r i u m m a g n e t i z a t i o n a n d T 2 i s t h e 32 s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e . F o r c o n v e n i e n c e t h e L a r m o r f r e q u e n c y w a s c h o s e n e q u a l t o z e r o . F o r a n o b j e c t o f l e n g t h , / , w i t h D ^ s y m m e t r y , a n d a l i n e a r f i e l d g r a d i e n t a l o n g i t s p r i n c i p a l a x i s , c ( x ) i s c o n s t a n t , a n d t h e n o r m a l i z e d a b s o r p t i o n s i g n a l c a n b e o b t a i n e d e x a c t l y V M = ^ (tan~V,(i/2-%) - tan"GxT2(-l/2 [2-36] w i t h a l i n e w i d t h a t h a l f - h e i g h t VXV^'T [2-37] F o r NMR i m a g i n g , t h e n a t u r a l l i n e w i d t h i m p o s e s a l i m i t o n t h e s p a t i a l r e s o l u t i o n a t t a i n a b l e w i t h a p a r t i c u l a r g r a d i e n t . I f we l e t / b e t h e s m a l l e s t r e s o l v a b l e e l e m e n t , t h e n t h e m a g n i t u d e o f t h e g r a d i e n t w h i c h i s r e q u i r e d i s g i v e n b y t h e e x p r e s s i o n G>W, [2-38] A s i m i l a r e x p r e s s i o n t h a t a l s o i n c o r p o r a t e s t h e e f f e c t o f i n h o m o g e n e i t y o f t h e m a g n e t i c f i e l d h a s b e e n g i v e n b y B o t t o m l e y (56). A c o m m o n s i t u a t i o n , f o r w h i c h t h e a n a l y t i c a l s o l u t i o n o f E q . [ 2 . 3 3 ] h a s n o t b e e n o b t a i n e d , i s t h a t o f a c y l i n d e r w i t h t h e g r a d i e n t a p p l i e d p e r p e n d i c u l a r t o i t s p r i n c i p a l a x i s . 33 T o e x t e n d t h e a n a l y s i s a n d t o i n c o r p o r a t e t h e e f f e c t s o f g r a d i e n t n o n l i n e a r i t y , we s i m p l i f y t h e i n t e g r a t i o n i n E q . [ 2 . 3 3 ] b y c o n s i d e r i n g s y s t e m s f o r w h i c h t h e c o n t r i b u t i o n o f s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t o t h e l i n e w i d t h ( a s i n E q . [ 2 . 3 8 ] ) i s s m a l l c o m p a r e d t o t h a t o f t h e g r a d i e n t ; i . e . , Y G / >> X 2 / T 2 . F o r a s a m p l e c o n t a i n e d i n a 5 mm NMR t u b e i n a w e a k g r a d i e n t o f 1 m T n r 1 , T 2 s h o u l d b e g r e a t e r t h a n 15 m s . Now t h e c o n t r i b u t i o n t o t h e s i g n a l f r o m s p i n s a t p o s i t i o n x ' , A ( x ' , w ) , c a n b e r e p l a c e d b y a d e l t a f u n c t i o n : I n a l i n e a r f i e l d g r a d i e n t , w i t h u> d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o x A(w)= A(G xx) = c(x) . T h e a b s o r p t i o n l i n e s h a p e d i r e c t l y m e a s u r e s t h e s p i n d i s t r i b u t i o n . F o r a c y l i n d r i c a l o b j e c t o f r a d i u s r , w i t h a l i n e a r 34 g r a d i e n t a p p l i e d p e r p e n d i c u l a r t o i t s p r i n c i p a l a x i s , t h e s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n c a n b e e x p r e s s e d a s ( F i g . 2 . 1 ) c ( x ) = - ^ J ( r - x ) - r s x s r . Q./J] T h e c o r r e s p o n d i n g e x p r e s s i o n f o r t h e F I D o r t i m e d o m a i n s i g n a l i s o b t a i n e d b y t a k i n g t h e F o u r i e r t r a n s f o r m o f E q . [ 2 . 4 1 ] w h i c h g i v e s t h e B e s s e l f u n c t i o n J , ( G r t ) (17). B y a n a l o g y w i t h E q . [ 2 . 3 7 ] , t h e l i n e w i d t h a t h a l f h e i g h t i s vv(4*3rtfrT 12-42] B e f o r e p r o c e e d i n g f u r t h e r i t i s w o r t h w h i l e t o n o t e t h a t NMR l i n e s h a p e s a r e a l s o a f f e c t e d b y t h e i n h o m o g e n e i t y o f t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e r a d i o f r e q u e n c y f i e l d u s e d t o e l i c i t t h e n u c l e a r r e s p o n s e s . I d e n t i c a l n u c l e a r s p i n s a t d i f f e r e n t p o s i t i o n s i n t h e s a m p l e d o n o t c o n t r i b u t e e q u a l l y t o t h e o b s e r v e d s i g n a l . T h e r e s u l t a n t s p e c t r u m c a n b e r e p r e s e n t e d a s A(u)=Jf(x')c(x') S(GXX-CJ) dx 12-43] w h e n T 2 e f f e c t s a r e n e g l e c t e d a n d w h e r e f ( x ' ) i s a r e d u c e d r a d i o f r e q u e n c y f i e l d d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n . I n t h e f o l l o w i n g d i s c u s s i o n f ( x ' ) i s a s s u m e d t o b e c o n s t a n t a c r o s s t h e s a m p l e a n d i s o m i t t e d . 35 F i g . 2 . 1 T h e n u m b e r o f s p i n s i n a t h i n s l i c e , d x , t h r o u g h a 1 / 2 c y l i n d e r i s p r o p o r t i o n a l t o y = 2 ( r 2 - x 2 ) ' /irr2 w h e r e r i s t h e r a d i u s . 3 6 T o d e s c r i b e t h e e f f e c t o f c h e m i c a l s h i f t i t i s u s e f u l t o i n t r o d u c e a f r e q u e n c y o f f s e t , w f . E q u a t i o n [ 2 . 3 9 ] t h e n b e c o m e s A l ^ M p ) * jc(x ' ) 6 ( < V 6 x x ' - ( " + ^ ) ) d x ' . [2-AA] W h e n t h e f r e q u e n c y o f f s e t , , i s e q u a l t o t h e L a r m o r f r e q u e n c y , u0, we o b t a i n A(u)+w0) =C(x). [2-45] T h e s p e c t r u m s t i l l m e a s u r e s t h e s p i n d i s t r i b u t i o n b u t t h e p o s i t i o n o f t h e l i n e i s s h i f t e d d e p e n d i n g u p o n t h e L a r m o r f r e q u e n c y a n d c h e m i c a l s h i f t . I n a s a m p l e w i t h s p i n s h a v i n g d i f f e r e n t L a r m o r f r e q u e n c i e s , t h e r e s u l t w o u l d b e a s e t o f o v e r l a p p i n g l i n e s e a c h g i v i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f a p a r t i c u l a r s e t o f s p i n s . I n g e n e r a l , t h e f r e q u e n c y , CJ, o f s p i n s a t p o s i t i o n x i s g i v e n b y (J = Q0 + G x x = 0 . . G W x - ? a ! « A l ^ ? x ' - . . . [2-46] w h e r e t h e m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t i s e x p r e s s e d a s a T a y l o r s e r i e s . I n a n o n l i n e a r g r a d i e n t , c a u s e d b y t h e h i g h e r o r d e r t e r m s i n E q . [ 2 . 4 6 ] , i d e n t i c a l s p i n s a t d i f f e r e n t p o s i t i o n s i n t h e o b j e c t m a y r e s o n a t e a t t h e s a m e f r e q u e n c y . T h e n e t 37 a b s o r p t i o n s i g n a l c a n t h e n b e r e p r e s e n t e d a s n A ^ M = I ! c ( x . ) x . < x i + 1 [2.47] 1 = 1 s u c h t h a t O J = G x . . H o w e v e r i n N M R , n o n l i n e a r i t i e s o v e r t h e X 1 s a m p l e a r e u s u a l l y s u f f i c i e n t l y s m a l l s o t h a t c ( x ^ ) = 0 f o r i > 1 . I n t h i s s i t u a t i o n t h e a p p e a r a n c e o f t h e s p e c t r u m f r o m a s q u a r e - p r o f i l e o b j e c t w i l l n o t r e f l e c t t h e n o n l i n e a r i t i e s . T h u s we h a v e s h o w n t h a t w h e n t h e e f f e c t s o f s p i n - s p i n r e l a x a t i o n a r e n e g l i g i b l e a n d t h e n o n l i n e a r i t y o f t h e g r a d i e n t i s s m a l l , t h e NMR s i g n a l i s g i v e n b y t h e m a p p i n g o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n f r o m t h e x d o m a i n i n t o t h e f r e q u e n c y d o m a i n . I n t h e a b s e n c e o f t h e e f f e c t o f i n h o m o g e n e i t y o f t h e a p p l i e d r a d i o f r e q u e n c y f i e l d , t h e s p e c t r u m s h o u l d r e f l e c t t h e o n e - d i m e n s i o n a l p r o j e c t i o n o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n . F o r a NMR t u b e t h e l i n e s h a p e w o u l d t h e n b e g i v e n b y E q . [ 2 . 4 1 ] a n d m e a s u r e m e n t o f i n t e n s i t y a l l o w s t h e c a l c u l a t i o n o f t h e s p a t i a l c o o r d i n a t e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e d i s p l a c e m e n t o f t h e s p i n s a l o n g t h e d i r e c t i o n o f t h e g r a d i e n t . A g r a p h o f L a r m o r f r e q u e n c y a s a f u n c t i o n o f d i s p l a c e m e n t c a n t h e n b e p r e p a r e d a n d t h e v a r i a t i o n o f t h e g r a d i e n t a c r o s s t h e s a m p l e c a n b e d e t e r m i n e d f r o m t h e s l o p e . T h i s p r o c e d u r e c a n n o t b e a p p l i e d t o s i t u a t i o n s w h e r e t h e r e d u c e d s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n i s i n d e p e n d e n t o f x b e c a u s e t h e n t h e r e l a t i o n i n E q . [ 2 . 4 0 ] c a n n o t b e i n v e r t e d . I n NMR i m a g i n g e x p e r i m e n t s w h e r e g r a d i e n t s a r e a p p l i e d a l o n g t h r e e a x e s o f a s p h e r i c a l 3 8 o b j e c t , a n a l y s i s o f t h e s p e c t r a w i l l y i e l d f r e q u e n c y a s a f u n c t i o n o f x , y a n d z c o o r d i n a t e s a n d a l l o w t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e d i s p l a c e m e n t o f t h e o b j e c t a n d t h e m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t d i s t r i b u t i o n f o r t h e t h r e e c o i l s . 3 . T W O - D I M E N S I O N A L NMR I M A G I N G B y v a r y i n g t h e e x c i t a t i o n , f u r t h e r p r o p e r t i e s o f t h e m a g n e t i s m c a n b e s t u d i e d . I n t h e f o l l o w i n g , a p u l s e s e q u e n c e u s e d i n , t h i s w o r k f o r i m a g i n g w i l l b e d e s c r i b e d . T h e f a c t o r s w h i c h d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o r t h e c o n t r a s t b e t w e e n f e a t u r e s i n t h e i m a g e a n d s p a t i a l r e s o l u t i o n i n NMR i m a g i n g w i l l b e b r i e f l y d i s c u s s e d i n t h e n e x t t w o s e c t i o n s . S o c a l l e d t w o - d i m e n s i o n a l NMR s p e c t r o s c o p y r e q u i r e s m e a s u r e m e n t s a s a f u n c t i o n o f t w o i n d e p e n d e n t t i m e i n t e r v a l s t o g i v e a n a r r a y o f s i g n a l s , S ( t , , t 2 ) (10). F o l l o w i n g c o n v e n t i o n , t h e p u l s e s e q u e n c e f o r s u c h e x p e r i m e n t s i s d i v i d e d i n t o p e r i o d s f o r p r e p a r a t i o n , e v o l u t i o n a n d d e t e c t i o n ( F i g . 2 . 2 ) . D u r i n g t h e d e t e c t i o n p e r i o d , t h e t i m e H ( 2 > e v o l u t i o n i s g o v e r n e d b y t h e h a m i l t o n i a n / • a n d F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n o f t h e s i g n a l w i l l g i v e t h e c o r r e s p o n d i n g f r e q u e n c y s p e c t r u m , S ( t 1 f c o 2 ) . T h e e v o l u t i o n u n d e r t h e i n f l u e n c e o f " d u r i n g t , , w i l l c a u s e t h e p h a s e , a m p l i t u d e o r b o t h , o f t h e a c q u i r e d s i g n a l t o b e m o d u l a t e d a n d F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n w i l l a g a i n y i e l d t h e a s s o c i a t e d s p e c t r u m , S ( w , , C J 2 ) . 39 PREPARATORY PERIOD EVOLUTION PERIOD t DETECTION PERIOD F i g . 2 . 2 The g e n e r a l scheme f o r a two d i m e n s i o n a l e x p e r i m e n t w h e r e i n t h e t i m e a x i s i s p a r t i t i o n e d i n t o two i n d e p e n d e n t t i m e i n t e r v a l s t , and t 2 . The t i m e e v o l u t i o n i s g o v e r n e d b y t h e h a m i l t o n i a n s rr a n d rh d u r i n g t h e e v o l u t i o n a n d d e t e c t i o n p e r i o d s r e s p e c t i v e l y . 4 0 T h e p u l s e s e q u e n c e u s i n g m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s t h a t w a s u s e d i n t h i s w o r k f o r t w o d i m e n s i o n a l i m a g i n g i s s h o w n i n F i g 2 . 3 . S t a r t i n g f r o m e q u i l i b r i u m w i t h t h e m a g n e t i z a t i o n a l i g n e d a l o n g t h e z - a x i s , a 9 0 ° p u l s e r o t a t e s t h e X m a g n e t i z a t i o n t o t h e y - d i r e c t i o n . S u b s e q u e n t l y t h e m a g n e t i z a t i o n w i l l p r e c e s s a r o u n d t h e z - d i r e c t i o n g i v i n g r i s e t o a n o b s e r v a b l e s i g n a l ( s e e p . 2 1 ) . I n t h e p r e s e n c e o f a n i n h o m o g e n e o u s f i e l d , s u c h a s t h a t c a u s e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f t h e y - g r a d i e n t , t h e s p i n s w i l l p r e c e s s w i t h d i f f e r e n t L a r m o r f r e q u e n c i e s w j = T ( B 0 + G y . ) . [2-48] F o r a y - g r a d i e n t p u l s e a p p l i e d f o r a d u r a t i o n d a n d f o l l o w e d b y a d e l a y T , t h e p h a s e p r i o r t o t h e 1 8 0 ° p u l s e w i l l b e 0 i = CJ 0T + a) d . [2-49] A s s h o w n i n F i g 2 . 4 , t h e r o t a t i o n o f t h e s p i n s a r o u n d t h e y - d i r e c t i o n b y 1 8 0 ° c a u s e s t h e p h a s e t o d e c r e a s e b y - 2 ( u 0 T + w ^ d ) . T h e s u b s e q u e n t p r e c e s s i o n c a u s e s t h e p h a s e 4>^ t o i n c r e a s e . A t f i r s t w i t h a f r e q u e n c y o f a>0 u n t i l t i m e T + r , t h e n a t f r e q u e n c y CJ^ w h e n t h e y - g r a d i e n t i s a p p l i e d . A l l o f t h e s p i n s a r e r e - a l i g n e d a l o n g t h e y - d i r e c t i o n a t 2 r = 2 T + 2 d . T h e r e f o c u s s i n g o f t h e s p i n s p r o d u c e s a n o t h e r o b s e r v a b l e s i g n a l r e f e r r e d t o a s a s p i n e c h o (16) a n d t h e t i m e , 2 T , i s c a l l e d t h e e c h o t i m e . T h e s p i n e c h o i s m e a s u r e d 4 OA F i g . 2 . 3 T i m i n g d i a g r a m f o r a t w o d i m e n s i o n a l i m a g i n g e x p e r i m e n t . S t a r t i n g a t e q u i l i b r i u m t h e a p p l i c a t i o n o f 9 0 ° a n d 1 8 0 ° r f p u l s e s i n d u c e t h e f o r m a t i o n o f a s p i n e c h o a t 2 T . A y - g r a d i e n t p u l s e o f f i x e d m a g n i t u d e i s a p p l i e d i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e 9 0 £ p u l s e f o r a d u r a t i o n d . A f t e r a t i m e d e l a y T s u c h t h a t T = d + T a n d a f u r t h e r d e l a y T , t h e y - g r a d i e n t i s s w i t c h e d o n a g a i n a t T + T f o r t h e d u r a t i o n o f t h e d e t e c t i o n p e r i o d , t 2 . T h e x - g r a d i e n t i s s w i t c h e d o n f o r a t i m e t , i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 1 8 0 ° s u c h t h a t t , < T . T h e g r i l l w o r k i n d i c a t e s t h a t t h e e x p e r i m e n t i s r e p e a t e d a s t h e m a g n i t u d e G i s v a r i e d , u s u a l l y i n 1 2 8 e q u a l i n c r e m e n t s f r o m a n e g a t i v e v a l u e . ^2, TT. quilibrium T 0 T T ACQUISITION I A I 2Z spin echo T I 1 > 42 F i g . 2 . 4 P r e c e s s i o n d i a g r a m s h o w i n g t h e e f f e c t o f t h e 1 8 0 ° p u l s e f o r t h e p u l s e s e q u e n c e i n F i g . 2 . 3 . T h e a r r o w s i n d i c a t e t h e d i r e c t i o n o f p r e c e s s i o n . A s i n d i c a t e d t h e m o t i o n f o l l o w i n g t h e 1 8 0 ° b r i n g s t h e m a g n e t i z a t i o n b a c k t o t h e y - d i r e c t i o n a t t i m e 2 T . 4 3 a s a f u n c t i o n o f t h e o b s e r v a t i o n t i m e t 2 , f o r m i n g o n e d i m e n s i o n o f t h e e x p e r i m e n t . T h e s e c o n d d i m e n s i o n i s o b t a i n e d b y a p p l y i n g a x - g r a d i e n t p u l s e f o r a d u r a t i o n t 1 r i n t h e i n t e r v a l T , f o l l o w i n g t h e 1 8 0 ° p u l s e . T h e s p i n e c h o a c q u i s i t i o n p r o c e d u r e i s r e p e a t e d f o r v a r i o u s v a l u e s o f t h e g r a d i e n t G . T h e a p p l i c a t i o n o f G v c a u s e s t h e L a r m o r f r e q u e n c y o f t h e s p i n s t o v a r y a l o n g t h e x - d i r e c t i o n . T h e p h a s e t h a t i s g a i n e d b y t h e s p i n s d u r i n g t , f r o m G c a u s e s X t h e r e f o c u s s i n g o f t h e s p i n s a t t i m e 2 r t o b e i n c o m p l e t e , h e n c e G x i s r e f e r r e d t o a s t h e p h a s e e n c o d i n g p u l s e . T h e a m p l i t u d e o f t h e e c h o q u i c k l y d e c r e a s e s a s G x b e c o m e s l a r g e r . T h e r e s u l t i n g a r r a y o f d a t a c o n s t i t u t e s a t w o - d i m e n s i o n a l m e a s u r e m e n t o f t h e t i m e r e s p o n s e S ( G , t 2 ) X w i t h # =-X(B0 +G xx)I z and # = -? ( B0 + G y y)I z. [2-50] I f now t h e v e c t o r k o f r e c i p r o c a l s p a c e i s d e f i n e d s u c h t h a t w i t h r e s p e c t t o k g i v e s t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f t h e NMR s i g n a l (57) 0) k , = 7G t i a n d k 2 = 7G t 2 t h e n t h e F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n x y [251] A t h i r d c o m p o n e n t f o r k w o u l d b e r e q u i r e d f o r t h e t h r e e d i m e n s i o n a l v e r s i o n o f t h e e x p e r i m e n t . I n g e n e r a l , t h e 4 4 s i g n a l S ( r ) i s a c o n v o l u t i o n o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n c ( r ) w i t h a l i n e s h a p e f u n c t i o n (41) w h i c h i s L o r e n t z i a n f o r l i q u i d s . A v a r i a t i o n o f t h e p r o c e d u r e i n w h i c h t h e s p i n s a r e a l l o w e d t o e v o l v e f r e e l y d u r i n g t h e d e t e c t i o n i n t h e a b s e n c e o f a g r a d i e n t a l l o w s t h e m e a s u r e m e n t o f c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d s p e c t r a ( F i g . 2 . 5 ) . A z - g r a d i e n t p u l s e i s a p p l i e d d u r i n g t h e e v o l u t i o n p e r i o d a n d t h e s i g n a l i s m e a s u r e d f o r v a r i o u s v a l u e s o f G^. T h e r e s u l t i n g d a t a s e t m a y b e r e p r e s e n t e d a s S ( k , t 2 ) w i t h k = 7 G _ t a n d t h e c o r r e s p o n d i n g z z z F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n s g i v e s a t w o - d i m e n s i o n a l s p e c t r u m S ( z , w ) w i t h z - c o o r d i n a t e o n o n e a x i s a n d L a r m o r f r e q u e n c y a l o n g t h e o t h e r . T h e t w o d i m e n s i o n a l s p e c t r u m s h o w s t h e i n t e n s i t y o f t h e NMR s i g n a l a s a f u n c t i o n o f o n e s p a t i a l c o o r d i n a t e , f o r e a c h c h e m i c a l s h i f t a n d w i l l b e r e f e r r e d t o a s a p r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p . 4 . I M A G E C O N T R A S T A n i m a g e i s o b t a i n e d b y d i s p l a y i n g , u s u a l l y i n t w o s p a t i a l d i m e n s i o n s , t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e i n t e n s i t y o f t h e NMR r e s p o n s e f r o m t h e s a m p l e . V a r i a t i o n s i n t h e i n t e n s i t y d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e d e n s i t y a n d r e l a x a t i o n o f t h e s p i n s , g i v e r i s e t o p a t t e r n s w h i c h g e n e r a l l y r e f l e c t t h e i n t e r n a l s t r u c t u r e o f t h e s a m p l e . B y v a r y i n g t h e e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s s u c h a s t h e e c h o t i m e i t i s p o s s i b l e t o c h a n g e t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o r c o n t r a s t b e t w e e n d i f f e r e n t f e a t u r e s i n t h e i m a g e . F o r t h e p u l s e s e q u e n c e s 45 90, t. 180, Acquisition T 0 X F i g . 2 . 5 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d m a p p i n g o f t h e s p i n d i s t r i b u t i o n a l o n g t h e z - d i r e c t i o n . T h e e c h o i s a c q u i r e d i n t h e a b s e n c e o f g r a d i e n t s a n d a z - g r a d i e n t p u l s e i s a p p l i e d d u r i n g t h e e v o l u t i o n p e r i o d , t , . 4 6 s h o w n i n F i g s . 2 . 3 a n d 2 . 5 , t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y f o r t w o s e t s o f s p i n s w i t h s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s , T 0 a n d z , a T , h , i s g i v e n b y - ( 1 / T 2 4 - 1 f U 2 ? e [2-52] w 0 w h e r e ( A ^ A ^ o i s t h e i n i t i a l r e l a t i v e i n t e n s i t y . I f T 2 a i s l a r g e r t h a n T 2 ^ , t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y A a / A ^ c a n b e i n c r e a s e d b y m a k i n g t h e e c h o t i m e l o n g e r . I t i s a l s o p o s s i b l e t o c o n t r a s t f e a t u r e s a c c o r d i n g t o d i f f e r e n c e s i n s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s . T h i s c a n b e a c h i e v e d b y a p p l y i n g a n i n v e r s i o n - r e c o v e r y s e q u e n c e w h i c h c o n s i s t s o f a l 8 0 ° - p u l s e f o l l o w e d b y a d e l a y i n w h i c h t h e s p i n s a r e a l l o w e d t o e v o l v e f r e e l y , t o a s y s t e m a t e q u i l i b r i u m ( F i g . 2 . 6 ) . T h e 1 8 0 ° p u l s e r o t a t e s t h e e q u i l i b r i u m m a g n e t i z a t i o n t o t h e - Z d i r e c t i o n a n d d u r i n g t h e s u b s e q u e n t d e l a y , t h e m a g n e t i z a t i o n r e t u r n s t o e q u i l i b r i u m a c c o r d i n g t o t h e e x p r e s s i o n M 2 ( t ) = M e , ( 1 - 2 e ' t / T ' ) [2-53] w h e r e M i s t h e e q u i l i b r i u m v a l u e , e q F o l l o w i n g t h e i n v e r s i o n - r e c o v e r y s e q u e n c e , a 9 0 ° - p u l s e m a y b e a p p l i e d f o r t h e s p e c t r o s c o p i c d e t e r m i n a t i o n o f s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s o r a n i m a g i n g p u l s e s e q u e n c e s u c h a s t h a t i n F i g . 2 . 3 m a y b e a p p l i e d t o g i v e a T , c o n t r a s t e d i m a g e . T h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f s i g n a l s f r o m 47 180°x ~1 d, B z 11 •*y 1804 14 *y e q u i l i b r i u m inversion Z r e c o v e r y F i g . 2 . 6 ( A ) I n v e r s i o n - r e c o v e r y p u l s e s e q u e n c e . F o l l o w i n g t h e d e l a y , d , , a 9 0 ° - p u l s e may b e a p p l i e d f o r t h e s p e c t r o s c o p i c d e t e r m i n a t i o n o f T , o r a n i m a g i n g p u l s e s e q u e n c e s u c h a s t h a t i n F i g . 2 . 3 m a y b e a p p l i e d t o g i v e a T , c o n t r a s t e d i m a g e . ( B ) T h e e f f e c t o f a n i n v e r s i o n - r e c o v e r y s e q u e n c e o n a s p i n s y s t e m , i n i t i a l l y a t e q u i l i b r i u m . 48 s p i n s w i t h s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s T 1 , a a n d T 1 , b ' w i l l b e g i v e n b y t h e e x p r e s s i o n Mz.q, _ M < f , a (1-2e -t/Ta [2-54] M 2 , t )M^b (1-2e T h e c o n t r a s t w i l l b e h i g h e s t w h e n t h e s i g n a l f r o m o n e o f t h e c o m p o n e n t s i s c o m p l e t e l y r e m o v e d b y s a t i s f y i n g t h e c o n d i t i o n 5. S P A T I A L R E S O L U T I O N I N NMR I M A G I N G A s d i s c u s s e d i n t h e t w o p r e v i o u s s e c t i o n s , NMR m e t h o d s f o r t h e m a p p i n g o f s p i n d i s t r i b u t i o n s r e l y u p o n t h e a p p l i c a t i o n o f m a g n e t i c f i e l d g r a d i e n t s w h i c h c a u s e t h e L a r m o r f r e q u e n c y o f t h e s p i n s t o v a r y a c c o r d i n g t o t h e i r p o s i t i o n s . F a c t o r s s u c h a s m a g n e t i c f i e l d i n h o m o g e n e i t y , a n d s p i n - s p i n r e l a x a t i o n , w h i c h c a u s e t h e L a r m o r f r e q u e n c y t o v a r y f u r t h e r , l i m i t t h e s p a t i a l r e s o l u t i o n o f t h e s e m e t h o d s . A l s o , t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n ( B r o w n i a n m o t i o n ) c o n t r i b u t e s a n u n c e r t a i n t y i n t h e p o s i t i o n o f t h e s p i n s a n d i s t h o u g h t t o b e t h e p r o c e s s u l t i m a t e l y l i m i t i n g t h e r e s o l u t i o n o f NMR i m a g i n g m e t h o d s (1). t = T 1 , a o r b I n 2 . [2-55] 4 9 F o r a n u n w a n t e d d i s p e r s i o n o f f r e q u e n c i e s c h a r a c t e r i z e d b y t h e l i n e w i d t h a t h a l f - h e i g h t , w 1 / / 2 ' fc^e l i f t i n g s p a t i a l r e s o l u t i o n , / , c a n b e e s t i m a t e d f r o m t h e e x p r e s s i o n . W4 (Hz) r . l- yo/2/T(Hz/cm) ' t 2 5 6 ] T h e c o m b i n e d e f f e c t s o f m a g n e t i c f i e l d i n h o m o g e n i t y , s p i n - s p i n r e l a x a t i o n a n d t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o n t h e l i m i t i n g r e s o l u t i o n c a n b e e s t i m a t e d f r o m t h e e x p r e s s i o n (1) ^ = • 7 ^ / 2 D F [2-57] * w h e r e G x i n d i c a t e s t h e e f f e c t i v e x - g r a d i e n t d u e t o m a g n e t i c f i e l d i n h o m o g e n e i t y , t i s t h e m e a s u r e m e n t t i m e , x i n d i c a t e s t h e p o s i t i o n o f t h e s p i n a n d t h e g r a d i e n t i s c o n s i d e r e d t o b e a p p l i e d a l o n g t h e x - d i r e c t i o n . T h e e x p r e s s i o n s u g g e s t s t h a t s p a t i a l r e s o l u t i o n m a y b e i m p r o v e d b y i n c r e a s i n g t h e * g r a d i e n t a n d b y u s i n g s h o r t m e a s u r e m e n t t i m e s . T h e G x t e r m a l s o i m p l i e s t h a t , f o r i m a g i n g o f l a r g e r o b j e c t s t h e h o m o g e n e i t y o f t h e m a g n e t i c f i e l d m u s t b e h i g h e r . A f u r t h e r s o u r c e o f f r e q u e n c y v a r i a t i o n i s f r o m c h e m i c a l s h i f t s . F o r s p i n s w i t h c h e m i c a l s h i f t s a , a n d o2, a n a p p a r e n t d i s p l a c e m e n t , A x , b e t w e e n t h e s p i n s i s o b s e r v e d a n d i s g i v e n b y AX:'V'B°- [2-58] 5 0 F o r a f i e l d o f 6 . 3 T , t h e - a p p a r e n t d i s p l a c e m e n t f o r w a t e r ( 4 . 8 P P M ) a n d l i p i d p r o t o n s ( 1 . 2 P P M ) i s 2 mm a n d 0 . 2 mm f o r g r a d i e n t s o f 10 a n d 1 0 0 m T n r 1 r e s p e c t i v e l y . T h u s , f o r i m a g i n g i t i s n e c e s s a r y t o s u p p r e s s c h e m i c a l s h i f t d i f f e r e n c e s b e t w e e n s p i n s b y u s i n g l a r g e g r a d i e n t s . I n h i g h r e s o l u t i o n NMR e x p e r i m e n t s , t h e d i s t i n c t i o n b e t w e e n c h e m i c a l s h i f t s i s o p t i m u m a n d t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n c a n b e d e t e r m i n e d w h e r e a s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f s p i n s i s m i n i m i z e d . I n c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d i m a g i n g e x p e r i m e n t s i t i s p o s s i b l e t o d e t e r m i n e t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f t h e s p i n s a t e a c h c h e m i c a l s h i f t a n d a c o m p o s i t e i m a g e w o u l d g i v e t h e s t r u c t u r e o f t h e o b j e c t (58). O t h e r f a c t o r s w h i c h a f f e c t t h e r e s o l u t i o n a r e t h e s i g n a l t o n o i s e r a t i o , r e c e i v e r c o i l d i m e n s i o n , a n d t h e e x p e r i m e n t a l r e p e t i t i o n r a t e . M a n s f i e l d a n d M o r r i s (1) h a v e d e r i v e d a n e x p r e s s i o n , u n d e r o p t i m u m c o n d i t i o n s , f o r t h e i m a g i n g t i m e n e e d e d t o r e s o l v e a v o l u m e e l e m e n t , ( A x ) 3 , a s f o l l o w s w h e r e S / N i s t h e d e s i r e d s i g n a l t o n o i s e , " a " t h e c o i l r a d i u s , a n d f t h e s p e c t r o m e t e r f r e q u e n c y i n m e g a h e r t z . F r o m t h i s e x p r e s s i o n , f o r a n i m a g i n g t i m e o f 1 0 0 0 s e c o n d s E c c l e s a n d C a l l a g h a n (59) e s t i m a t e d t h e a t t a i n a b l e r e s o l u t i o n f o r 51 s m a l l - s c a l e o r m i c r o s c o p i c i m a g i n g a t 6 0 0 M H z t o b e 12 Mm, b u t s u g g e s t e d t h a t 3 0 urn w o u l d b e a m o r e r e a s o n a b l e v a l u e . A t a f r e q u e n c y o f 2 7 0 M H z u s e d i n t h i s w o r k , t h e p r e d i c t e d o p t i m a l r e s o l u t i o n i s 19 Mm. T h i s e s t i m a t i o n d o e s n o t i n c l u d e l i n e b r o a d e n i n g e f f e c t s f r o m a n i s o t r o p i c m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y o r f r o m c h e m i c a l - s h i f t v a r i a t i o n . 6 . S P I N E C H O : P U L S E D F I E L D G R A D I E N T T E C H N I Q U E F O R D I F F U S I O N C o n s i d e r a n e n s e m b l e o f i d e n t i c a l s p i n s i n a n i n h o m o g e n e o u s m a g n e t i c f i e l d , i n a l i q u i d s o t h a t t h e r e i s r a p i d t u m b l i n g a n d m o t i o n a l n a r r o w i n g p r e v a i l s . A 9 0 ° p u l s e a p p l i e d a l o n g t h e x - a x i s r o t a t e s t h e m a g n e t i z a t i o n t o t h e y - a x i s . S p i n s a t d i f f e r e n t p o s i t i o n s i n t h e s a m p l e w i l l p r e c e s s a t d i f f e r e n t f r e q u e n c i e s a n d w i l l d e p h a s e a c c o m p a n i e d b y t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e t r a n s v e r s e m a g n e t i z a t i o n . T h e a p p l i c a t i o n o f a 1 8 0 ° p u l s e a l o n g t h e y - a x i s w i l l c h a n g e t h e s i g n o f t h e p h a s e a n d t h e s u b s e q u e n t m o t i o n w i l l r e s u l t i n a c o m p l e t e r e p h a s i n g a t t i m e 2 T , i f o n e n e g l e c t s e f f e c t s o f s p i n - s p i n r e l a x a t i o n a n d d i f f u s i o n . A l l o f t h e m a g n e t i z a t i o n w i l l b e a l i g n e d a l o n g t h e y d i r e c t i o n g i v i n g r i s e t o a n o t h e r s i g n a l o r s p i n e c h o . T h e e f f e c t o f B r o w n i a n m o t i o n o f t h e m o l e c u l e s i s t o c a u s e t h e L a r m o r f r e q u e n c y o f t h e a s s o c i a t e d s p i n s t o v a r y c o r r e s p o n d i n g l y . A s a r e s u l t , t h e p o s i t i o n s o f t h e m o l e c u l e s a n d t h e p h a s e o f t h e s p i n s c a n b e p r e d i c t e d o n l y w i t h s o m e u n c e r t a i n t y w h i c h w i l l i n c r e a s e w i t h t i m e . S o i n s t e a d o f a s h a r p d i s t r i b u t i o n , a G a u s s i a n d i s t r i b u t i o n o f p h a s e s i s 52 o b t a i n e d c a u s i n g a n a v e r a g i n g a n d t h e s i g n a l i s a t t e n u a t e d . T h e a m p l i t u d e o f t h e s i g n a l w i l l a l s o b e l e s s e n e d b y t h e e f f e c t s o f r e l a x a t i o n . T h e e f f e c t o f d i f f u s i o n h a s b e e n d i s c u s s e d i n t e r m s o f r a n d o m w a l k (17) o r b y a d d i n g a d i f f u s i o n t e r m t o t h e B l o c h e q u a t i o n (12,50) HM MT + MT M-M ~ mYM X § - - U K . v.D.VM. [2-60] F o r M a n d M t h e f o l l o w i n g i s o b t a i n e d x y 3 [2-61] dM M ^ = S B 2 M - - * + V - D . V M , dt 2 y T2 - * " dNL M ^ = - X B r M , - - ^ + V . D . V M y . dt z x T2 - * - y C o m b i n i n g t h e e x p r e s s i o n s f o r M x a n d t o g i v e a n e x p r e s s i o n f o r t h e c o m p l e x m a g n e t i z a t i o n , m = + i M y f w e o b t a i n lni = - i c j 0 m - ^ + V . D - V m - i y G . r m . [2-621 dt l 2 ~ S 5 ~ T r a n s f o r m i n g t o t h e r o t a t i n g f r a m e a n d a l l o w i n g f o r t h e t r a n s v e r s e r e l a x a t i o n , s e t - K + \ ) t m-.Ve 2 . [263] 53 T h e n t a k i n g t h e d e r i v a t i v e w i t h r e s p e c t t o t i m e dm _ dt " - ( i^ 0 + 1 / Tjt ff-(i«jf1/Tjy dt [2-64] a n d b y c o m p a r i s o n w i t h E q . [ 2 . 6 2 ] o b t a i n = v-D.vr-rG.rr. dt [2-65] F o r D a n d G d e p e n d i n g o n l y o n t i m e , a f o r m a l s o l u t i o n t o t h e e x p r e s s i o n f o r \p a n d h e n c e f o r m c a n b e o b t a i n e d (12) m = nrv e o J F.g.Fdt'-Afl-Dj F d / + A r fD f ( t - r ) [2-66] w i t h £ =0 for o<t<r r =1 for t>r, E= J Gdt and f = 0r i . [2-67] T h e q u a n t i t y m / m 0 i s i n d e p e n d e n t o f s p a t i a l c o o r d i n a t e s f o r t h e p r i n c i p a l e c h o w h i c h o c c u r s a t t = 2 r . A s d i s c u s s e d b y S t e j s k a l a n d T a n n e r (12), t h e f o r m a t i o n o f t h e e c h o m a y o c c u r a t a n y t i m e o r n o t a t a l l d e p e n d i n g u p o n t h e s a m p l e a n d t h e a p p l i e d g r a d i e n t . A n y i n e q u i v a l e n c e o f t h e t i m e 54 e v o l u t i o n i n d u c e d b y t h e g r a d i e n t s b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e w i l l c a u s e t h e e c h o t o b e s h i f t e d o r a t t e n u a t e d . I n t h e p u l s e d g r a d i e n t m o d i f i c a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t , F i g . 2 . 7 , g r a d i e n t p u l s e s o f m a g n i t u d e G , d u r a t i o n 6 , a n d s e p a r a t i o n A , a r e a p p l i e d b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e o f a s p i n e c h o p u l s e s e q u e n c e (12). F o r i s o t r o p i c , t i m e i n d e p e n d e n t d i f f u s i o n , t h e d e c a y o f t h e e c h o a m p l i t u d e i s g i v e n b y - 2 r -*VDS2(A- S/3) m(2r)=m ee T* e . [2-68] T h u s a d e t e r m i n a t i o n o f D , t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t , c a n b e o b t a i n e d b y v a r y i n g G , 6 o r A . W h e n t h e d u r a t i o n o f t h e g r a d i e n t p u l s e , 6 , i s m u c h l e s s t h a n t h e t i m e , A , t h e P F G m e t h o d m e a s u r e s t h e m o t i o n t h a t o c c u r r e d d u r i n g A (12). T h i s i s u s e f u l w h e n d i f f u s i o n i s b o u n d e d a s f o u n d i n p o r o u s m e d i a a n d b i o l o g i c a l t i s s u e (24,61). O v e r s h o r t t i m e s , t h e m o l e c u l e s w i l l n o t t r a v e l v e r y f a r a n d w i l l n o t e n c o u n t e r b a r r i e r s t o m o t i o n . T h u s t h e d i f f u s i o n w i l l b e u n r e s t r i c t e d . F o r l o n g e r t i m e s , t h e m o t i o n o f t h e m o l e c u l e w i l l b e l i m i t e d b y t h e b o u n d a r i e s a n d t h e e f f e c t i v e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t w i l l b e r e d u c e d . B y p e r f o r m i n g m e a s u r e m e n t s o v e r a r a n g e o f d i f f u s i o n i n t e r v a l s , t h e s i z e o f t h e r e s t r i c t i o n s c a n b e d e t e r m i n e d (24). F o r t h e s t a t i c g r a d i e n t e x p e r i m e n t 6 , A a n d T a r e 55 77/2 / SPIN ECHO i 0 T T 2T F i g . 2 . 7 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n u s i n g p u l s e d g r a d i e n t s . G r a d i e n t p u l s e s o f d u r a t i o n 6 a n d s e p a r a t i o n A a r e a p p l i e d b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e o f a H a h n e c h o p u l s e s e q u e n c e . 5 6 e q u a l , s o t h e d e c a y i s g i v e n b y .2 2 3 - 2 T - 2 2 f 6 D r m(2r) = m„e T 2 e 3 [2-69] T h e d e c a y i s i n d e p e n d e n t o f t h e a m p l i t u d e s a n d l e n g t h s o f t h e r f p u l s e s p r o v i d e d t h e s e d o n o t v a r y d u r i n g t h e e x p e r i m e n t (62). F o r e x p e r i m e n t s u s i n g a s u r f a c e c o i l ( s e e e x p e r i m e n t a l ) , t h e d e c a y w i l l t h e n b e g i v e n b y t h e s e s a m e e x p r e s s i o n s d e s p i t e t h e r f i n h o m o g e n e i t y . T h e s p i n e c h o m a y a l s o b e m o d u l a t e d b y t h e e f f e c t o f s c a l a r s p i n - s p i n c o u p l i n g (54,63). I t i s t h u s a d v a n t a g e o u s t o v a r y t h e g r a d i e n t m a g n i t u d e o r t h e d u r a t i o n o f t h e g r a d i e n t p u l s e w h i l s t k e e p i n g t h e e c h o t i m e 2A, f i x e d . T h i s w o u l d m a k e t h e e f f e c t s d u e t o J - c o u p l i n g a n d s p i n - s p i n r e l a x a t i o n c o n s t a n t , s i m p l i f y i n g t h e a n a l y s i s (64). C o m p a r e d t o s t a t i c g r a d i e n t m e a s u r e m e n t s t h e p u l s e d g r a d i e n t t e c h n i q u e h a s t h e a d v a n t a g e o f g i v i n g c h e m i c a l s h i f t r e s o l u t i o n . T h i s a l l o w s t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s f o r m i x t u r e s s u c h a s a q u e o u s s o l u t i o n s , m i c e l l a r s o l u t i o n s a n d m i c r o e m u l s i o n s . T h e f a c t o r s w h i c h a f f e c t t h e a c c u r a c y a n d r e p r o d u c i b i l i t y o f d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s h a v e b e e n t h e s u b j e c t o f s e v e r a l p a p e r s (13,29,65). T h e s t a t i c f i e l d g r a d i e n t m e t h o d s u f f e r s f r o m t h e e x p e r i m e n t a l l i m i t a t i o n t h a t a s t h e g r a d i e n t i s i n c r e a s e d , t h e NMR l i n e w i d t h a l s o i n c r e a s e s . I n o r d e r t o m e a s u r e a m o r e r a p i d l y d e c a y i n g s i g n a l , t h e b a n d w i d t h o f t h e d e t e c t i o n s y s t e m w i l l h a v e t o 57 b e i n c r e a s e d t o i m p r o v e i t s t r a n s i e n t r e s p o n s e , a p r o c e d u r e w h i c h w i l l a d m i t m o r e n o i s e . W i t h i n c r e a s i n g l i n e w i d t h , t h e p o w e r o u t p u t o f t h e t r a n s m i t t e r w i l l h a v e t o b e i n c r e a s e d t o k e e p t h e r f f i e l d a m p l i t u d e B , g r e a t e r t h a n t h e l i n e w i d t h . T h e p u l s e d g r a d i e n t t e c h n i q u e e n c o u n t e r s d i f f i c u l t y i n t h e g e n e r a t i o n o f c l e a n g r a d i e n t p u l s e s r e q u i r i n g s t a b l e p o w e r s u p p l i e s a n d m e a n s f o r e l i m i n a t i o n a n d c o m p e n s a t i o n o f e d d y c u r r e n t s . C a l l a g h a n h a s p r o v i d e d e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e t h a t i f t h e e f f e c t s o f e d d y c u r r e n t s , s a m p l e m o v e m e n t a n d p i c k - u p a r e m i n i m i z e d , a c c c u r a c i e s o f 1% c a n b e a c h i e v e d (65). F o r d i f f u s i o n c o n t r a s t i n g i n NMR i m a g i n g e x p e r i m e n t s , f u r t h e r g r a d i e n t p u l s e s a r e a p p l i e d i n t h e i m a g i n g p u l s e s e q u e n c e (66-68). S u c h a p u l s e s e q u e n c e i s s h o w n i n F i g . 2 . 8 , w h e r e t h e x a n d y g r a d i e n t s a r e u s e d f o r i m a g i n g a n d z - g r a d i e n t p u l s e s a r e a p p l i e d t o c a u s e a f u r t h e r a t t e n u a t i o n o f t h e s i g n a l p r o p o r t i o n a l t o t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e m o l e c u l e s c o n t a i n i n g t h e s p i n s . I n c o m p a r i n g t h e n o r m a l a n d d i f f u s i o n c o n t r a s t e d i m a g e s , t h e c h a n g e i n i n t e n s i t i e s f o r a g i v e n s e t o f s p i n s i s g i v e n b y E q . [ 2 . 6 8 ] a n d t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s f o r s p i n s w i t h d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s D a n d D, i s a D -* G 8 ( A - S / 3 ) ( D , - D 2 ) w i t h A = 2 r . S i n c e t h e y - g r a d i e n t i s a p p l i e d i n a s i m i l a r 58 go; 1 180 0 2T Time F i g . 2 . 8 P u l s e s e q u e n c e f o r d i f f u s i o n c o n t r a s t e d i m a g i n g . T h e s p i n e c h o i s a c q u i r e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e y - g r a d i e n t s t a r t i n g a t t i m e 2 r - d . T h e e x p e r i m e n t i s r e p e a t e d f o r i n c r e m e n t a l v a l u e s o f p h a s e e n c o d i n g x - g r a d i e n t p u l s e s o f d u r a t i o n 6 . F i x e d z - g r a d i e n t p u l s e s a l s o o f d u r a t i o n 6 , a r e a p p l i e d t o c a u s e d i f f u s i o n c o n t r a s t i n g . 5 9 f a s h i o n , a n o r m a l i m a g e i s a l r e a d y d i f f u s i o n c o n t r a s t e d . 7 . M E A S U R E M E N T O F D I F F U S I O N BY M U L T I P L E Q U A N T U M S P I N E C H O E S M u l t i p l e q u a n t u m s p e c t r o s c o p y , b y a l l o w i n g m a n i p u l a t i o n s o f t h e h i g h e r o r d e r c o h e r e n c e s b e t w e e n c o u p l e d s p i n s , h a s b e e n s h o w n t o b e u s e f u l i n f i l t e r i n g o u t r e s o n a n c e s i n c o m p l e x o v e r l a p p i n g s p e c t r a (69). M u l t i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e s a l s o s h o w a n i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o a p p l i e d g r a d i e n t s (70-73) a n d w o u l d a l l o w t h e m e a s u r e m e n t o f s l o w e r d i f f u s i o n a l m o t i o n t h a n b y s i n g l e q u a n t u m c o h e r e n c e s . We now d e s c r i b e t h e m e a s u r e m e n t o f d i f f u s i o n u s i n g p u l s e d g r a d i e n t s t o s e l e c t m u l t i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s . T h e m e t h o d w a s u s e d p r e v i o u s l y f o r m e a s u r i n g t h e a n i s o t r o p i c d i f f u s i o n o f o r i e n t e d m o l e c u l e s i n l i q u i d c r y s t a l s (21,22). W h i l e t h i s w o r k w a s b e i n g c o m p l e t e d a s i m i l a r m e t h o d , u s i n g p h a s e c y c l i n g o f t h e r a d i o f r e q u e n c y e x c i t a t i o n p u l s e s f o r t h e d e t e c t i o n o f d o u b l e q u a n t u n s p i n e c h o e s , h a s b e e n u s e d f o r m e a s u r i n g t h e d i f f u s i o n o f f l u o r i n a t e d m o l e c u l e s (74). I n n o r m a l p u l s e d NMR e x p e r i m e n t s w h e r e t h e f r e e i n d u c t i o n d e c a y i s m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f r f r a d i a t i o n , t h e m e a s u r e d c o m p o n e n t s o f t h e p o l a r i z a t i o n , d e s c r i b e d b y t h e o p e r a t o r s I a n d I , c o r r e s p o n d o n l y t o s i n g l e q u a n t u m x y c o h e r e n c e s , AM = ± 1 . Z e r o q u a n t u m a n d c o h e r e n c e s c o r r e p o n d i n g t o AM > 2 a r e d e s c r i b e d b y c o m b i n a t i o n s o f t h e o p e r a t o r s I , I a n d I (75,76) a n d c a n n o t b e d i r e c t l y x y z o b s e r v e d (77). H o w e v e r , t w o - d i m e n s i o n a l NMR m e t h o d s p r o v i d e a c o n v e n i e n t m e a n s f o r o b s e r v i n g m u l t i p l e q u a n t u m 6 0 t r a n s i t i o n s . T h e p u l s e s e q u e n c e , s h o w n i n F i g . 2 . 9 , u s e s t h e r f p u l s e s e q u e n c e t o p r e p a r e a l l o r d e r s o f c o h e r e n c e (7 8). T h e c o h e r e n c e s a r e a l l o w e d t o e v o l v e f r e e l y d u r i n g t h e p e r i o d 2T < t < t , + 2T a n d a t t = t , + 2 T , a 9 0 ° m i x i n g p u l s e i s a p p l i e d A t o t r a n s f o r m t h e u n o b s e r v a b l e MQ c o h e r e n c e s i n t o o b s e r v a b l e s i n g l e q u a n t u m c o h e r e n c e s . S e l e c t i v e d e t e c t i o n o f m a g n e t i z a t i o n f r o m d i f f e r e n t o r d e r s o f c o h e r e n c e s i s a c h i e v e d b y a p p l y i n g a g r a d i e n t p u l s e a n d d e l a y d u r i n g t h e m u l t i p l e q u a n t u m e v o l u t i o n p e r i o d f o l l o w e d b y n i d e n t i c a l g r a d i e n t - d e l a y p e r i o d s i n t h e m i x i n g p e r i o d . T h e s p i n e c h o s i g n a l o b t a i n e d i s d u e o n l y t o m a g n e t i z a t i o n w h i c h e v o l v e d d u r i n g t , a s a n n q u a n t u m c o h e r e n c e (71,79). T h e p u l s e s e q u e n c e i s m o d i f i e d f o r m e a s u r i n g d i f f u s i o n b y f u r t h e r a p p l y i n g g r a d i e n t p u l s e s e q u a l l y , b e f o r e a n d a f t e r a 1 8 0 ° p u l s e d u r i n g t h e t i m e e v o l u t i o n p e r i o d . T h e f i r s t g r a d i e n t p u l s e s e r v e s t o l a b e l t h e s p i n s w i t h a s p a t i a l l y d e p e n d e n t p h a s e w h i c h i s p r o p o r t i o n a l t o t h e o r d e r o f c o h e r e n c e n , a n d t o g r a d i e n t m a g n i t u d e . T h e 1 8 0 ° p u l s e a p p l i e d a l o n g t h e y - a x i s c h a n g e s t h e s i g n o f t h e p h a s e . T h e n t h e s e c o n d g r a d i e n t p u l s e c a u s e s o n l y p a r t i a l r e p h a s i n g b e c a u s e t h e p o s i t i o n s o f t h e s p i n s m a y h a v e c h a n g e d d u r i n g t h e i n t e r v e n i n g t i m e . T h e s p i n e c h o 90 - T / 2 - 180 - T / 2 - 90 - T / 2 - 1 8 0 - T / 2 - 90 X X X x 61 MQC PREPARATION T T / 2 , 2T A B 7 T l y < — s 8 7T/2, 3T + mixing period 2 . 9 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e p r e p a r a t i o n a n d s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f m u l t i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s . T h e p u l s e s e q u e n c e i n E q . [ 2 . 7 1 ] i s a p p l i e d d u r i n g t h e MQC p r e p a r a t i o n p e r i o d t o p r e p a r e a l l o r d e r s o f c o h e r e n c e . A f t e r t h e (ir/2)^ m i x i n g p u l s e , g r a d i e n t p u l s e s a r e a p p l i e d t o p r o d u c e s i n g l e ( A ) , d o u b l e ( B ) a n d t r i p l e ( C ) q u a n t u m e c h o e s . A 7r + p u l s e w i t h g r a d i e n t p u l s e s o f d u r a t i o n 6 , b e f o r e a n d a f t e r , a r e a p p l i e d f o r d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t . 62 w i l l d e c a y a c c o r d i n g t o E q . [ 2 . 6 8 ] m o d i f i e d f o r n q u a n t u m e v o l u t i o n , b y r e p l a c i n g G b y n G , t o g i v e KITT\ A ' 2 T / T 2 -**nG2D/(A-*/3) A(2r)=At,e ' e . [2-72] 8 . S P I N E C H O : T H E E F F E C T O F R A N D O M I Z E D F L O W F l o w w i l l d i m i n i s h t h e s p i n e c h o s i g n a l b y m o v i n g s p i n s o u t o f t h e r e g i o n o f t h e c o i l a n d w i l l , i n t h e p r e s e n c e o f t h e g r a d i e n t , a l s o c a u s e t h e L a r m o r f r e q u e n c y o f t h e s p i n s t o v a r y w i t h t h e i r v e l o c i t i e s *j(t) = w0+*G.r(t) t = cJ 0 + *G.r(OMG.[ ydt [2-73] t 0 = «j'+ Tvdt o - ; o -w h e r e CJ0 ' i s t h e i n i t i a l L a r m o r f r e q u e n c y , a n d t h e v e l o c i t y v m a y d e p e n d u p o n p o s i t i o n a n d t i m e . A s d i s c u s s e d e a r l i e r , t h e p h a s e t h a t i s g a i n e d b y t h e s p i n s d u e t o t h e c o n s t a n t t e r m o > 0 ' i s c o m p l e t e l y r e m o v e d a t t i m e 2T i n a s p i n e c h o e x p e r i m e n t c o n s e q u e n t l y , o n l y t h e d i s p l a c e m e n t o f t h e s p i n s f r o m t h e i r i n i t i a l p o s i t i o n s i s m e a s u r e d . T h e v a r i a t i o n o f t h e L a r m o r f r e q u e n c y i s d e s c r i b e d b y a n a d d i t i o n a l t e r m i n t h e B l o c h e q u a t i o n s (5) 6 3 T h e f i n d i c a t e s t h e c o n t r i b u t i o n d u e t o f l o w . F o r a s p i n e c h o e x p e r i m e n t , t h e e x p r e s s i o n f o r t h e c o m p l e x m a g n e t i z a t i o n b e c o m e s { - i J [Hir ) -2Jhl } m(T) f = m(0)e [275] w h e r e T w a s d e f i n e d p r e v i o u s l y a n d H (t)= S-Gdt', h=H(r) [276] S(t)= Jy dt ' , s = S(r). F o r a p u l s e d g r a d i e n t e x p e r i m e n t w i t h s t e a d y , u n i f o r m f l o w w i t h v e l o c i t y v 0 , t h e a m p l i t u d e o f t h e e c h o s h o w s o s c i l l a t o r y b e h a v i o u r m|2T) ( = e - i j e v - r S . [277] T h e w e i g h t e d a v e r a g e f o r a G a u s s i a n d i s t r i b u t i o n o f v e l o c i t i e s i s CO 1 m(2T) f = J2 TT <V*> v 1 e 2 < v 00 ^(v-<v>f e - i , 6 v T « d v [ 2 7 8 ] w h e r e <v> i s t h e a v e r a g e v e l o c i t y . I f t h e a v e r a g e v e l o c i t y i s z e r o , f o r m o t i o n w h i c h i s r a n d o m i n o r i e n t a t i o n t h e n t h e e c h o w i l l d e c a y a c c o r d i n g t o m(2r ) f = e - 4 < v ' > ! r ' e V s ' [2-79] 64 w i t h a n a p p a r e n t d i f f u s i v i t y , b y c o m p a r i s o n o f E q s . [ 2 . 6 9 ] a n d [ 2 . 7 9 ] T h e c o m b i n e d e f f e c t s o f d i f f u s i o n a n d r a n d o m f l o w , f o r a s i n g l e s y s t e m , w o u l d g i v e r i s e t o a n e t d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f T h e o b s e r v e d a p p a r e n t d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t w o u l d i n c r e a s e w i t h t h e o b s e r v a t i o n t i m e . A . E X P E R I M E N T A L T h e f o l l o w i n g i s a d i s c u s s i o n o f t h e r e q u i r e m e n t s , a s p e c t s o f g r a d i e n t c o i l d e s i g n a n d m o d i f i c a t i o n s w h i c h w e r e i m p l e m e n t e d , f i r s t , f o r m i c r o s c o p i c i m a g i n g u s i n g t h e 6 . 3 T m a g n e t a n d t h e n f o r s u r f a c e c o i l , p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s o n t h e 1 . 9 T m a g n e t . S p e c i f i c a t i o n s o f t h e g r a d i e n t c o i l s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 1 . 1 . A P P A R A T U S F O R D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T AND M I C R O S C O P I C M e a s u r e m e n t s o f d i f f u s i o n a n d i m a g i n g f o r s a m p l e s c o n t a i n e d i n 5 mm NMR t u b e s i n c l u d i n g Barbara colfaxiana ( s e e c h a p t e r I V ) a n d o n Acetabularia medi t erranea ( s e e D^  = 3<v2>r/4. I M A G I N G 6 5 c h a p t e r I V ) w e r e m a d e w i t h a s p e c t r o m e t e r b a s e d o n a 6 . 3 T , 5 4 mm b o r e s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t m a d e b y O x f o r d I n s t r u m e n t s , w i t h a N i c o l e t 1 1 8 0 c o m p u t e r a n d 2 9 3 B p u l s e p r o g r a m m e r . T h e l o c k c h a n n e l o f t h e s p e c t r o m e t e r w a s n o t u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s s i n c e t h e g r a d i e n t s i n t e r f e r e w i t h t h e l o c k a n d v i c e - v e r s a . W h i l e t h e m a g n e t w a s a l r e a d y s u p p l i e d w i t h s h i m c o i l s w h i c h p r o d u c e g r a d i e n t s o f 1 m T m " 1 f o r t h e x , y a n d z d i r e c t i o n s , i t w a s n e c e s s a r y t o c o n s t r u c t a n o t h e r s y s t e m o f c o i l s t o g e n e r a t e l a r g e r g r a d i e n t s w h i c h a r e r e q u i r e d f o r a c c u r a t e d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s a n d h i g h e r s p a t i a l r e s o l u t i o n i n i m a g i n g . A g r a d i e n t c o i l c o n s i s t s o f a n a r r a n g e m e n t o f w i r e s s u c h t h a t t h e p a s s a g e o f a n e l e c t r i c c u r r e n t p r o d u c e s a l i n e a r l y v a r y i n g m a g n e t i c f i e l d o v e r t h e r e g i o n o f t h e s a m p l e . T h e c r i t e r i a f o r t h e g r a d i e n t c o i l s w e r e t h a t g r a d i e n t s o f a b o u t 1 0 0 m T m " 1 b e a c h i e v e d t o a l l o w i m a g i n g o f o b j e c t s w h i c h m i g h t r a n g e i n s i z e u p t o a p p r o x i m a t e l y 1 c m i n l e n g t h . N o n l i n e a r i t y o f t h e g r a d i e n t p r o d u c e s d i s t o r t i o n s o f t h e i m a g e a n d i n t e r f e r e s w i t h d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s , a n d s h o u l d b e k e p t a t a m i n i m u m . S e v e r a l c o n f i g u r a t i o n s h a v e b e e n d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e , b u t f o r s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t s c o i l s w h i c h c a n b e w o u n d c y l i n d r i c a l l y t o c o n f o r m w i t h t h e s h a p e o f t h e NMR p r o b e a r e p r e f e r r e d . T h i s s i m p l i f i e s t h e c o n s t r u c t i o n a n d s a m p l e s c a n b e i n s e r t e d i n t o t h e p r o b e i n t h e u s u a l w a y . S u c h c o i l s i n c l u d e G o l a y c o i l s f o r G ^ a n d G ^ , a n d M a x w e l l c o i l s f o r G z ( 5 6 , 8 0 ) . P r e s u m a b l y t h e s e s a m e d e s i g n s w e r e u s e d f o r t h e x , y a n d z s h i m c o i l s . 66 O n e o t h e r d e s i g n w h i c h g i v e s u n i f o r m g r a d i e n t s w i t h a n i n d u c t a n c e 10 t i m e s l e s s t h a n t h a t o f a M a x w e l l i s t h e q u a d r u p o l e c o i l (81,82). H o w e v e r t h e d i s t r i b u t i o n o f w i n d i n g s i s s u c h t h a t i t i s m o r e d i f f i c u l t t o c o n s t r u c t t h e s e f o r a s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t . T h e m a g n e t i c f i e l d , B , p r o d u c e d a t a p o i n t P b y a n e l e c t r i c c u r r e n t p a s s i n g t h r o u g h a w i r e i s g i v e n b y t h e B i o t - S a v a r t l a w (83) w h e r e I i s t h e c u r r e n t , r , a n d r 2 a r e t h e p o s i t i o n v e c t o r s f o r t h e p o i n t P a n d t h e c u r r e n t e l e m e n t d l r e s p e c t i v e l y ( F i g . 2 . 1 0 ) . T h e i n t e g r a l i s o v e r e v e r y e l e m e n t d l o f t h e c l o s e d l o o p i n w h i c h t h e c u r r e n t f l o w s . T h e m a g n e t i c i n d u c t i o n d u e t o t w o o r m o r e c u r r e n t l o o p s i s t h e v e c t o r s u m o f t h e m a g n e t i c i n d u c t i o n p r o d u c e d b y t h e i n d i v i d u a l e l e m e n t s s e p a r a t e l y . T h e m a g n e t i c f i e l d p r o d u c e d b y a n y c o i l i s i n h o m o g e n e o u s . A s i m p l e i l l u s t r a t i o n o f t h i s i s t h e f i e l d p r o d u c e d b y a s i n g l e c u r r e n t l o o p . A l o n g t h e a x i s o f t h e l o o p , t h e d i r e c t i o n o f B p a r a l l e l t o t h e a x i s a n d i t s m a g n i t u d e i s g i v e n b y r B(rz) }X0l d j x ( r 2 - £ t ) [282] 2 67 F i g . 2 . 1 0 T h e c o o r d i n a t e s o f t h e c u r r e n t e l e m e n t d l w h i c h p r o d u c e s a m a g n e t i c f i e l d a t p o i n t P , w i t h p o s i t i o n v e c t o r s r , a n d r 2 r e s p e c t i v e l y . 6 8 I n g e n e r a l , t h e g r a d i e n t o f a m a g n e t i c f i e l d , B , i s a s e c o n d r a n k t e n s o r , H, =VB = Z j r ' J U=x,y,z [2-84] i j b u t i n t h e p r e s e n c e o f a m u c h l a r g e r f i e l d B 0 , o n l y t h o s e c o m p o n e n t s w i t h B p a r a l l e l t o t h e m a i n f i e l d c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y a n d t o g o o d a p p r o x i m a t i o n (I) T h u s f o r t h e f i e l d a l o n g t h e a x i s o f t h e c u r r e n t l o o p , t h e g r a d i e n t , G , i s g i v e n b y z 2 (z + r ) w h i c h i s a l s o n o t c o n s t a n t . H o w e v e r a u n i f o r m g r a d i e n t i s r e q u i r e d t o p r o d u c e a n u n d i s t o r t e d i m a g e a n d t h e r e s o l u t i o n d e p e n d s u p o n t h e i n h o m o g e n e i t i e s o f t h e a p p l i e d f i e l d s . T h e M a x w e l l 1 c o i l c o n s i s t s o f t w o s e t s o f c i r c u l a r l o o p s o f w i r e c o n n e c t e d s o t h a t c u r r e n t p a s s i n g t h r o u g h t h e m w i l l g e n e r a t e o p p o s i n g m a g n e t i c f i e l d s . B y s y m m e t r y , t h e e v e n o r d e r d e r i v a t i v e s o f t h e f i e l d s c a n c e l . T h e s e p a r a t i o n o f t h e o p p o s i n g l o o p s i s c h o s e n s o t h a t t h e t h i r d d e r i v a t i v e i s z e r o a t t h e c o i l c e n t e r (84). T h e r e s u l t i n g g e o m e t r y i s s h o w n i n F i g . 2 . 1 1 ( B ) . ' O r i g i n a l l y r e f e r r e d t o a s a n t i o r o p p o s e d H e l m h o l t z c o i l . 68A F i g . 2 . 1 1 ( A ) C r o s s - s e c t i o n a l v i e w t h r o u g h t h e s a m p l e c h a m b e r o f t h e NMR p r o b e w i t h t h e o u t e r a l u m i n i u m c a n r e m o v e d . O n l y , t h e s l o t s f o r t h e c o i l w i n d i n g s w h i c h a r e c o n c e n t r i c w i t h t h e P e r s p e x f o r m e r a r e s h o w n . T h e f o r m e r a l s o h a s f o u r s l o t s a t r i g h t a n g l e s t o e a c h o t h e r f o r t h e v e r t i c a l w i n d i n g s . ( B ) & ( C ) T h e p o s i t i o n s a n d t h e d i r e c t i o n s o f t h e w i n d i n g s f o r t h e z - g r a d i e n t ( M a x w e l l ) c o i l a n d t h e y - g r a d i e n t ( G o l a y ) c o i l r e s p e c t i v e l y . T h e x - g r a d i e n t c o i l i s t h e s a m e a s i n ( C ) b u t r o t a t e d t h r o u g h 9 0 ° . Perspex gradient coil glass rf coil sample tube i—•—i 1 cm B C i « -2 r—H i<— 2 r—>i ON 7 0 T h e G o l a y c o i l d e s i g n i s b a s e d u p o n t h e e x p a n s i o n o f t h e m a g n e t i c f i e l d i n t e r m s o f s p h e r i c a l h a r m o n i c s (85) w h e r e oo 77 5 =-I Z r" P™( cose) [A* cos m0 • B^sinm/]. [2-87] 7?-/ n-o I n t h e p r e s e n c e o f a s t r o n g m a g n e t i c f i e l d B 0 c h o s e n t o l i e a l o n g z , t h e z c o m p o n e n t a n d i t s d e r i v a t i v e s m a y b e e x p r e s s e d i n t e r m s o f t h e s p h e r i c a l e x p a n s i o n B 2 = - e | | ^ | f . [2-88] T h e f i r s t f e w t e r m s o f t h i s e x p a n s i o n i n c l u d e t h o s e w h i c h v a r y w i t h x , y , z a n d x 2 - y 2 (84). O r i g i n a l l y s u c h c o i l s w e r e c o n s t r u c t e d b y p o s i t i o n i n g c o n d u c t o r s o n t h e s u r f a c e o f a s p h e r e a l o n g t h e l o c u s o f a p a r t i c u l a r s p h e r i c a l h a r m o n i c f u n c t i o n w h e r e t h e f u n c t i o n v a n i s h e d , k e e p i n g t r a c k o f t h e p o s i t i v e a n d n e g a t i v e v a l u e s o f t h e f u n c t i o n . T h e s e g e o m e t r i c a l c o n f i g u r a t i o n s o f t h e c u r r e n t f l o w l o c i w e r e t h e n p r o j e c t e d , v i e w e d f r o m t h e c e n t e r o f t h e s p h e r e , t o f l a t p o l e f a c e s f o r a n e l e c t r o m a g n e t . A m o d i f i e d v e r s i o n f o r p r o d u c i n g x a n d y g r a d i e n t s f o r a s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t i s d e s c r i b e d b y H o u l t a n d R i c h a r d s (80). N u m e r i c a l e v a l u a t i o n o f t h e B i o t - S a v a r t l a w s h o w s t h a t t h e G o l a y c o i l p r o d u c e s g r a d i e n t s w h i c h a r e l i n e a r t o w i t h i n 71 - 5 % o v e r a r e g i o n r £ 0 . 5 a w h e r e a i s t h e c o i l r a d i u s (56). T h e s p e c i f i c a t i o n s f o r t h e l o c a t i o n o f c u r r e n t e l e m e n t s i n F i g . 2 . 1 1 ( B ) & ( C ) d e f i n e s u r f a c e s o n w h i c h t h e c o i l s s h o u l d b e w o u n d s o t h a t o p t i m a l l i n e a r i t y o f t h e g r a d i e n t s i s a c h i e v e d . W h e n c o i l s f o r x , y a n d z g r a d i e n t s w e r e a l l t o b e w o u n d o n t h e s a m e f o r m e r , i t w a s n e c e s s a r y t o s i m p l i f y t h e s e s h a p e s t o s l o t s a s s h o w n ( F i g . 2 . 1 1 ( A ) ) . T h e p r o b e u s e d i n t h i s w o r k c o n s i s t e d o f t h e u s u a l c o m p o n e n t s o f a h i g h r e s o l u t i o n d e v i c e , f i t t e d i n s i d e a n a l u m i n i u m t u b e o f 37 mm o u t e r d i a m e t e r . T h e o u t e r g l a s s D e w a r , w h i c h n o r m a l l y p r o v i d e s t h e r m a l i n s u l a t i o n f o r v a r i a b l e t e m p e r a t u r e o p e r a t i o n w a s r e m o v e d a n d r e p l a c e d b y a P e r s p e x c y l i n d e r o f o u t e r d i a m e t e r 3 4 mm a n d w a l l t h i c k n e s s 5 mm. G r o o v e s , 3 mm d e e p a n d 3 mm w i d e , m a c h i n e d i n t o t h e o u t e r s u r f a c e p r o v i d e d t h e p h y s i c a l l o c a l i z a t i o n o f t h e 27 g a u g e , i n s u l a t e d c o p p e r w i r e u s e d f o r t h e g r a d i e n t c o i l s ( F i g . 2 . 1 1 ( A ) ) . I n i t i a l l y , 8 t u r n s e a c h w e r e u s e d f o r t h e t h r e e c o i l s b u t a n o t h e r s e t w i t h 12 t u r n s f o r x a n d y , a n d 2 0 t u r n s f o r z w a s u s e d f o r t h e m a j o r i t y o f t h e w o r k . T h e m a g n i t u d e s o f t h e g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e s e c o i l s a r e g i v e n i n T a b l e 2 . 1 , a n d w e r e d e t e r m i n e d b y m e t h o d s t o b e d i s c u s s e d i n t h e r e s u l t s s e c t i o n . H i g h f r e q u e n c y f i l t e r s ( F i g . 2 . 1 2 ( A ) ) o n b o t h l e a d s o f e a c h c o i l m i n i m i z e d t h e i n d u c t i v e c o u p l i n g w i t h t h e r f c o i l . R e s i s t o r s c o n n e c t e d i n s e r i e s w i t h t h e c o i l s s e r v e d t o i n c r e a s e t h e i m p e d a n c e a n d r e d u c e p r o b l e m s w i t h f e e d b a c k . A n i n t e r f a c e w i t h D A C ( d i g i t a l t o a n a l o g c o n v e r t e r ) i n p u t f r o m t h e c o m p u t e r a n d 72 Coils Number Gradient Magnitudes Resistance Inductance for 270 of turns { mTm"1 A"') (n) (yUH) A. X 8 38-9 1-1 35 Y 8 382 1-1 32 Z 8 — 0-6 12 B. X 12 48-3 1-8 60 Y 12 50-4 1-6 62 Z 20 655 1-0 43 Radius of coils 1-6 cm Gauge of wire 27 C. X.Y shims — 1-1 mTm'1 D. Coils for 80 X 10 1-82 1-1 360 Y 10 1-82 1-1 370 Z 15 1 85 0-5 110 Radius of coils 8 cm Gauge of wire 12 T a b l e 2 . 1 S p e c i f i c a t i o n s a n d g r a d i e n t m a g n i t u d e s o f g r a d i e n t c o i l s f o r t h e m o d i f i e d h i g h r e s o l u t i o n p r o b e i n ( A ) a n d ( B ) , t h e x a n d y s h i m c o i l s o f t h e h i g h r e s o l u t i o n m a g n e t i n ( C ) , a n d f o r t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s i n (D) . 73 0 5^tH coil 0 5 ^ H -^ nnr—i 3 f l x,y 2 A z 100 pF 100 pF DAC O B _n_ inv/non inv on/off manual control OUT F i g . 2 . 1 2 ( A ) C i r c u i t d i a g r a m f o r t h e h i g h f r e q u e n c y f i l t e r s p l a c e d o n e a c h l e a d o f t h e g r a d i e n t c o i l s . ( B ) S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e g r a d i e n t c o n t r o l u n i t . 7 4 c o n t r o l l i n e s f r o m t h e N i c o l e t 2 9 3 B p u l s e p r o g r a m m e r a l l o w e d t h e g e n e r a t i o n o f v a r i a b l e a m p l i t u d e T T L c o n t r o l p u l s e s ( F i g . 2 . 1 2 ( B ) ) . A u d i o a m p l i f i e r s ( A M C R O N M - 6 0 0 a n d T E C R O N 7 5 6 0 , s u p p l i e d b y CROWN I N T E R N A T I O N A L ) w o r k i n g i n t h e c o n s t a n t v o l t a g e m o d e a n d w i t h v a r i a b l e g a i n c o n t r o l s p r o v i d e d c u r r e n t s u p t o 2 0 A . H o w e v e r , t h e a m p l i f i e r s w e r e s u s c e p t i b l e t o f e e d b a c k a t h i g h g a i n s a n d i n e l e c t r o n i c t e s t i n g i t w a s f o u n d t h a t u p t o 15 A c o u l d b e p r o d u c e d s a f e l y . M e a s u r e m e n t o f t h e v o l t a g e a c r o s s t h e r e s i s t o r s i n s e r i e s w i t h t h e c o i l s u s i n g a n o s c i l l o s c o p e , s h o w e d r i s e t i m e s w e r e 6 0 M S f o r t h e a c h i e v e m e n t o f 98 % o f g r a d i e n t p u l s e . T h e l i n e a r i t y o f o u t p u t w a s b e t t e r t h a n 9 9 % ( F i g . 2 . 1 3 ) . C o r r e s p o n d i n g l y , g r a d i e n t p u l s e s w e r e a p p l i e d f o r a m i n i m u m o f 1 m s . NMR s i g n a l s w e r e m e a s u r e d u s i n g a s a d d l e s h a p e d t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l , 1 1 . 5 mm i n d i a m e t e r , w i t h a 1 8 0 ° p u l s e l e n g t h o f 2 9 M S . F u r t h e r c o m p l i c a t i o n s w e r e o b s e r v e d i n a c t u a l NMR e x p e r i m e n t s . T h e f i r s t w a s f r o m e d d y c u r r e n t s i n d u c e d b y g r a d i e n t p u l s e s i n t h e a l u m i n i u m c o v e r i n g o f t h e p r o b e a n d t h e w a l l o f t h e m a g n e t . S l o t s , 2 mm w i d e a n d 5 c m l o n g , w e r e c u t i n t o t h e c o v e r i n g t o m i n i m i z e e d d y c u r r e n t s t h e r e . N o a t t e m p t w a s m a d e t o e l i m i n a t e s u c h e f f e c t s i n t h e m a g n e t i t s e l f . W h i l e e d d y c u r r e n t s s h o u l d d e c a y a w a y i n t i m e s o f a b o u t 5 - 1 0 m s , m u c h l o n g e r v a r i a t i o n s i n t h e f i e l d s l a s t i n g f o r u p t o 5 0 ms w e r e o b s e r v e d f o r m o d e r a t e g r a d i e n t s o f 5 0 m T m " 1 . T h e s e e f f e c t s w e r e s e e n m o s t o f t e n i n s p i n e c h o e x p e r i m e n t s w i t h g r a d i e n t p u l s e s a p p l i e d . T h e s o u r c e o f 75 < CL o 0 2 4 6 8 Input (a.u.) F i g . 2 . 1 3 G r a p h o f a m p l i f i e r o u t p u t ( A ) a s a f u n c t i o n o f D A C i n p u t ( a r b i t r a r y u n i t s ) . 7 6 t h e s e v a r i a t i o n s i s u n k n o w n . I n t e r a c t i o n s w i t h e i t h e r t h e s h i m c o i l s o r t h e m a i n f i e l d m a y b e t h e c a u s e . 2 . A P P A R A T U S F O R S U R F A C E C O I L , P U L S E D G R A D I E N T S P I N E C H O  M E A S U R E M E N T S P u l s e d g r a d i e n t s p i n - e c h o m e a s u r e m e n t s o n h u m a n f o r e a r m ( s e e c h a p t e r I I I ) w e r e p e r f o r m e d u s i n g a 1 . 9 T , 3 0 cm b o r e O x f o r d I n s t r u m e n t s s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t w i t h a m o d i f i e d N i c o l e t N T - 3 0 0 NMR c o n s o l e . T h e b u i l t - i n g r a d i e n t c o i l s o f t h e m a g n e t g a v e 10 m T m - 1 f o r x , y a n d z d i r e c t i o n s b u t w e r e i n a d e q u a t e f o r d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s b e c a u s e o f l o n g r i s e - t i m e s , w h i c h c o u l d o n l y b e p a r t i a l l y o v e r c o m e b y p r e - e m p h a s i s , a n d l a r g e e d d y - c u r r e n t e f f e c t s . H e n c e a n o t h e r s e t o f g r a d i e n t c o i l s w a s c o n s t r u c t e d t o p r o v i d e h i g h e r g r a d i e n t s w i t h s h o r t e r r i s e t i m e s . T h e x a n d y c o i l s w e r e w o u n d a r o u n d p e g s o n a P V C f o r m e r , 6 . 5 i n c h e s i n o u t e r d i a m e t e r w i t h 0 . 2 5 i n c h w a l l t h i c k n e s s . T h e l o c a t i o n s o f t h e p e g s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a n e f f e c t i v e r a d i u s o f 8 . 3 cm f o r t h e c o i l s . T h e Z c o i l w a s w o u n d i n g r o o v e s , 3 mm d e e p a n d 9 mm w i d e . T h e c u r r e n t w a s p r o v i d e d u s i n g t h e s a m e a u d i o a m p l i f i e r s a s b e f o r e ( s e c t i o n B . 2 ) e x c e p t t h e T e c r o n s w e r e o p e r a t e d i n c o n s t a n t c u r r e n t m o d e . T h e m a g n i t u d e s o f t h e g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e g r a d i e n t c o i l s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e m e a s u r e m e n t o f l i n e w i d t h s f o r s p e c t r a t a k e n w i t h a s p h e r i c a l b u l b 2 (4 c m d i a m e t e r ) f i l l e d w i t h 2 [2-89] 7 7 w a t e r ( T a b l e 2 . 1 ) . NMR s i g n a l s w e r e m e a s u r e d u s i n g a 27 mm d i a m e t e r s u r f a c e c o i l c o n s i s t i n g o f t w o l o o p s o f c o p p e r w i r e w i t h T e f l o n t a p e i n s u l a t i o n . T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e r f f i e l d p r o d u c e d b y a s u r f a c e c o i l i s i n h o m o g e n e o u s a n d c o r r e s p o n d i n g l y t h e f l i p a n g l e a n d c o n t r i b u t i o n o f s p i n s t o t h e s i g n a l d e p e n d s u p o n t h e i r p o s i t i o n i n t h e c o i l . F o r N M R , o n l y t h e c o m p o n e n t B 1 i n t h e x y p l a n e i s i m p o r t a n t . A l o n g l , x y t h e a x i s o f t h e c o i l , t h e m a g n i t u d e o f B . d e c r e a s e s 1 , x y m o n o t o n i c a l l y t o a f e w p e r c e n t a t a d i s t a n c e o f 1 . 5 r f r o m t h e c e n t e r o f t h e c o i l , w h e r e r i s t h e c o i l r a d i u s (86,87). T h e e x a c t f l i p a n g l e d i s t r i b u t i o n a n d t h e r e g i o n f r o m w h i c h t h e s i g n a l i s o b t a i n e d w i l l d e p e n d u p o n t h e p u l s e l e n g t h . I t i s a s s u m e d t h a t t h e s i g n a l i s d e t e c t e d f r o m a r o u g h l y h e m i s p h e r i c a l r e g i o n o f t h e d i a m e t e r o f t h e c o i l . T h e s u r f a c e c o i l w a s m o u n t e d o n a P e r s p e x p l a t e w h i c h a l s o p r o v i d e d s u p p o r t f o r t h e m a t c h i n g a n d t u n i n g c a p a c i t o r s ( F i g . 2 . 1 4 ) . P l a c e m e n t o f t h e s u r f a c e c o i l w a s s u c h t h a t i n s e r t i o n o f t h e a r m c a u s e d t h e p a l m t o r e s t o n t h e p l a t e . I t w a s f o u n d n e c e s s a r y t o w r a p t h e p l a t e a n d c a p a c i t o r s w i t h a l u m i n i u m f o i l t o m i n i m i z e i n d u c t i v e c o u p l i n g o f t h e t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l s y s t e m , e x c e p t f o r t h e c o i l i t s e l f , w i t h t h e s a m p l e . T h e m a g n e t w a s s h i m m e d u s i n g t h e s u r f a c e c o i l a n d a b e a k e r o f w a t e r , u s i n g a n o p t i m a l p u l s e l e n g t h o f 1 0 M S t o p r o d u c e s p e c t r a w i t h l i n e w i d t h s o f a b o u t 14 H z . TOP VIEW It SIDE VIEW Perspex capacitor surface coil Styrofoam support 1 cm F i g . 2 . 1 4 S c h e m a t i c d i a g r a m o f s u r f a c e c o i l p r o b e . OO 7 9 3 . P A R A M E T E R S F O R NMR E X P E R I M E N T S A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h q u a d r a t i v e p h a s e c y c l i n g a n d a u t o m a t i c b a s e l i n e c o r r e c t i o n . I n a l l s p i n e c h o e x p e r i m e n t s , f o r i m a g i n g a n d d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t , t h e 1 8 0 ° p u l s e w a s a p p l i e d a l t e r n a t e l y a l o n g t h e y a n d - y d i r e c t i o n s t o c o m p e n s a t e f o r p u l s e i m p e r f e c t i o n s . I n d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s , d a t a a c q u i s i t i o n w a s i n i t i a t e d a t t h e e c h o t i m e s o t h a t p h a s e s e n s i t i v e s p e c t r a c o u l d b e o b t a i n e d . I n i m a g i n g e x p e r i m e n t s , t h e e c h o t i m e w a s c h o s e n t o c o i n c i d e w i t h t h e m i d d l e o f t h e d a t a a c q u i s i t i o n p e r i o d . A l l NMR s i g n a l s w e r e b a s e l i n e c o r r e c t e d a n d a p o d i z e d b e f o r e F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n . A p o d i z a t i o n r e f e r s t o t h e m u l t i p l i c a t i o n o f t h e t i m e d o m a i n NMR s i g n a l w i t h a w e i g h t i n g f u n c t i o n b e f o r e F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n a n d i s u s e d h e r e t o i m p r o v e t h e s i g n a l t o n o i s e r a t i o . F o r n o r m a l 9 0 ° p u l s e a n d d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s t h e w e i g h t i n g f u n c t i o n w a s a d e c a y i n g e x p o n e n t i a l e~^^, w h e r e i n t e g e r j = 0 t o N - 1 f o r a n N p o i n t F I D , a n d k i s g i v e n b y T h e l i n e b r o a d e n i n g w a s 0 . 3 H z a n d 3 H z f o r h i g h r e s o l u t i o n a n d s u r f a c e c o i l s p e c t r a r e s p e c t i v e l y . I n NMR i m a g i n g , a w e i g h t i n g f u n c t i o n o f t h e f o r m s i n ( 7 r j / N ) , w h e r e j =0 t o N - 1 f o r a n N p o i n t F I D w a s a p p l i e d b e f o r e e a c h F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n . A f t e r t h e s e c o n d F o u r i e r t r a n s f o r m a t i o n , t h e p o w e r s p e c t r u m w a s c a l c u l a t e d t o p r o d u c e t h e i m a g e . 7T * l ine broadening 2 « s w e e p width 8 0 T h e f i e l d o f v i e w ( F V ) i n a d i m e n s i o n o f t h e NMR i m a g e i s g i v e n b y t h e r e l a t i o n 3 T h e s w e e p w i d t h m u s t b e l a r g e e n o u g h t o e n c o m p a s s t h e e n t i r e s p e c t r u m o f f r e q u e n c i e s i n t h e s a m p l e . A l s o , i n o r d e r t h a t a n u n d i s t o r t e d i m a g e b e o b t a i n e d , t h e f i e l d o f v i e w m u s t b e t h e s a m e i n e a c h o f t h e s p a t i a l d i m e n s i o n s i n t h e i m a g e . F o r t h e p u l s e s e q u e n c e i n F i g . 2 . 3 , t h i s r e s u l t s i n t h e c o n d i t i o n d k , = d k 2 o r 7 t , d G = 7G d t 2 w h e r e k , a n d k 2 a r e x y t h e c o m p o n e n t s o f t h e v e c t o r k i n r e c i p r o c a l s p a c e . I n i m a g i n g , t h e s m a l l e s t a v a i l a b l e d w e l l t i m e w a s 14 M S s o t h a t f o r 8 mm d i a m e t e r s a m p l e s , t h e m a x i m u m g r a d i e n t w h i c h c o u l d b e u s e d i n t h e d e t e c t i o n p e r i o d i s 2 1 0 m T m " 1 . I m a g e s w e r e d i s p l a y e d e i t h e r a s s t a c k e d p l o t s o f p r o t o n s i g n a l a m p l i t u d e v e r s u s x - c o o r d i n a t e , e a c h f o r a f i x e d y o r a s i m a g e s w i t h 16 c o l o r l e v e l s , f r o m d a r k t o l i g h t f o r i n c r e a s i n g p r o t o n s i g n a l . M e a s u r e m e n t s o f d i f f u s i o n f r o m h i g h r e s o l u t i o n s p e c t r a w e r e b y i n t e g r a t i o n o f t h e a p p r o p r i a t e s i g n a l . F o r m e a s u r e m e n t s o f r e l a x a t i o n t i m e s , T , a n d T 2 f f o r b i o l o g i c a l s a m p l e s ( c h a p t e r s I I I a n d I V ) a n d s u r f a c e - c o i l d i f f u s i o n , p e a k h e i g h t s w e r e u s e d b e c a u s e o f o v e r l a p b e t w e e n p e a k s . S t r a i g h t l i n e f i t s t o d a t a f r o m l i n e s h a p e s , f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s , a n d d i f f u s i o n FV = sweep width (Hz) y gradient magnitude (Hz/cm)' 2TT 3 S w e e p w i d t h o f t h e r e c e i v e r , s e e f o o t n o t e n u m b e r 6 , p . 8 5 . 81 c o e f f i c i e n t s w e r e o b t a i n e d b y l i n e a r l e a s t s q u a r e s . T h e e r r o r w a s e s t i m a t e d f r o m t h e u n c e r t a i n t y i n t h e s l o p e s a n d c o r r e s p o n d t o ± t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s . F o r c u r v e f i t t i n g t o l i n e s h a p e d a t a a N i c o l e t d a t a r e d u c t i o n r o u t i n e f o r q u a r t i c p o l y n o m i a l s w a s u s e d . S p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m i n v e r s i o n - r e c o v e r y d a t a u s i n g a t h r e e p a r a m e t e r f i t t o t h e f u n c t i o n (88) y = A { l - [ 1 + W ( 1 - e -R/T ) } e - x / T } [2.92] w h e r e A i s t h e e q u i l i b r i u m v a l u e , W a c c o u n t s f o r t h e i n i t i a l m a g n e t i z a t i o n , T t i s t h e s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e a n d k i s t h e r e l a x a t i o n d e l a y . A l l m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a t u r e . B . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N U G R A D I E N T M A G N I T U D E S N o r m a l NMR s p e c t r a f o r w a t e r i n a n NMR t u b e , r e c o r d e d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a 9 0 ° - p u l s e i n t h e p r e s e n c e o f a s t a t i c g r a d i e n t , a r e s h o w n i n F i g . 2 . 1 5 . T h e g r a d i e n t s w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e x a n d y s h i m c o i l s o f t h e s u p e r c o n d u c t i n g m a g n e t . T h e m a g n i t u d e o f t h e g r a d i e n t p r o d u c e d b y t h e s h i m c o i l c a l c u l a t e d f r o m t h e l i n e w i d t h a t h a l f - h e i g h t , G = 1 . 1 1 m T m - 1 , i s c o n s i s t e n t w i t h v a l u e s c a l c u l a t e d f r o m a 82 3 F i g . 2 . 1 5 S p e c t r a a n d g r a p h s o f L a r m o r f r e q u e n c y vs p o s i t i o n f o r t h e x s h i m c o i l ( A ) , y s h i m c o i l ( B ) a n d x s h i m c o i l ( C ) w i t h a s m a l l e r t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l ( 6 mm d i a m e t e r ) . (D ) s h o w s t h e a t t e n u a t i o n o f t h e s p i n e c h o i n p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t ( A = 2 8 0 m s , 8 = 2 0 - 2 0 0 m s ) . 8 3 g r a p h o f L a r m o r f r e q u e n c y a s a f u n c t i o n o f p o s i t i o n ( F i g . 2 . 1 5 ( A ) ) a n d c a l i b r a t i o n v i a a s p i n e c h o e x p e r i m e n t w i t h p u l s e d g r a d i e n t u s i n g k n o w n v a l u e s f o r t h e s e l f - d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e v a l u e , = 2 . 5 m T m " 1 , o b t a i n e d b y t a k i n g t h e a v e r a g e f r o m t h e f i r s t f i v e z e r o e s o f J , ( G r t ) w a s m u c h t o o l a r g e . W h e n l a r g e r g r a d i e n t s w e r e u s e d , t h e v a l u e s o f G o b t a i n e d f r o m t h e f o u r m e t h o d s w e r e i n e x c e l l e n t a g r e e m e n t s u g g e s t i n g t h a t n o n l i n e a r i t i e s w e r e a f f e c t i n g t h e v a l u e s f r o m t h e J , ( G r t ) c a l c u l a t i o n f o r w e a k g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e s h i m c o i l s . I n a n e x p e r i m e n t i n w h i c h t h e m a g n e t w a s n o t o p t i m a l l y s h i m m e d , a n a s y m m e t r i c s p e c t r u m f o r t h e y s h i m c o i l w a s o b t a i n e d ( F i g . 2 . 1 5 ( B ) ) . T h e a s y m m e t r y w a s i n d e p e n d e n t o f t h e o r i e n t a t i o n o f t h e p r o b e , c o n f i r m i n g o u r s u p p o s i t i o n t h a t n o n l i n e a r i t y o f t h e e f f e c t i v e y g r a d i e n t a n d n o t a n i n h o m o g e n e o u s d i s t r i b u t i o n o f r a d i o f r e q u e n c y p o w e r w a s t h e c a u s e . T h e g r a p h o f L a r m o r f r e q u e n c y vs y c o o r d i n a t e w a s a s m o o t h c u r v e c o r r e s p o n d i n g t o a l i n e a r g r a d i e n t o f 1 . 0 8 m T m " 1 , w h i c h i s s i m i l a r i n m a g n i t u d e t o t h a t p r o d u c e d b y t h e x s h i m , a n d a * c o m p o n e n t o f 1 . 2 m T m " 2 . T h e Ay* o t h e r m e t h o d s o n l y a l l o w e d t h e e s t i m a t i o n o f t h e l i n e a r c o m p o n e n t o f t h e g r a d i e n t ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e n o n l i n e a r i t y o b s e r v e d i n t h e g r a d i e n t s i s d e p e n d e n t o n how w e l l t h e m a g n e t i s s h i m m e d ; t h e x 2 - y 2 s h i m c a n b e a d j u s t e d t o c a u s e e i t h e r t h e x o r y g r a d i e n t t o b e n o n l i n e a r . T h e d i s t o r t i o n s h o w n i n t h e s p e c t r u m a n d t h e d i s c o n t i n u i t y i n t h e g r a p h o f F i g . 2 . 1 5 ( C ) a r e d u e t o a n i n h o m o g e n e o u s d i s t r i b u t i o n o f 84 Method of calculation x-shim y-shim x-gradient Linewidth 1.11 ± 0.02a 1.08 ± 0.02 2.43 ± 0.03 Lineshape** 1.12 t 0.04 1.10 ± 0.06C 2.51 ± 0.09 Calibration* 1 1.11 ± 0.05 1.04 + 0.09 2.39 + 0.11 J x(&rt) 2.47 ± 0.3 2.79 + 0.3 2.45 ± 0.3 Uncertainties are ± 2 a ^From graphs of frequency vs. position Cfr'(o) - 1.2 ± 0.2 mTm"2 y ^By a pulsed f i e l d gradient diffusion experiment. T a b l e 2 . 2 G r a d i e n t m a g n i t u d e s b y l i n e w i d t h s , l i n e s h a p e s , J , ( G r t ) a n d c a l i b r a t i o n b y d i f f u s i o n . 8 5 r a d i o f r e q u e n c y p o w e r f r o m a s m a l l e r t r a n s m i t t e r c o i l ( d i a m e t e r 6 m m ) . A G o l a y c o i l o f r a d i u s 15 mm c o n s i s t i n g o f 8 t u r n s o f n u m b e r 27 g a u g e w i r e w a s f o u n d t o p r o d u c e a g r a d i e n t o f a b o u t 38 m T m " 1 A " 1 . I n a n e x p e r i m e n t w i t h a c u r r e n t o f 6 4 m A , t h e m a g n i t u d e o f g r a d i e n t c a l c u l a t e d f r o m t h e l i n e w i d t h , G = 2 . 4 3 m T m " 1 , w a s i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h a t o b t a i n e d f r o m a d i f f u s i o n e x p e r i m e n t , G = 2 . 3 9 m T m " 1 . 2 . E F F E C T O F R E C E I V E R D E A D T I M E A d i f f i c u l t y w i t h t h e a n a l y s i s o f l i n e s h a p e s w i t h l a r g e f r e q u e n c y d i s p e r s i o n , a s w i l l a r i s e w h e n l a r g e g r a d i e n t s a r e u s e d , i s a s s o c i a t e d w i t h t h e f a s t d e c a y o f t h e t i m e d o m a i n s i g n a l ( F i g . 2 . 1 6 ) . N o r m a l p r o c e d u r e i s t o a l l o w a d e l a y b e f o r e b e g i n n i n g a c q u i s i t i o n t o a v o i d b r e a k t h r o u g h o f t h e r a d i o f r e q u e n c y p u l s e (55). T h e l o s s i n i n t e n s i t y a n d i n f o r m a t i o n c o n t e n t w h e n t h e i n i t i a l p a r t o f a r a p i d l y d e c a y i n g s i g n a l i s n o t a c q u i r e d , l e a d s t o a r e d u c t i o n i n s i g n a l t o n o i s e r a t i o a n d a c h a r a c t e r i s t i c b a s e l i n e d i s t o r t i o n . W i t h t h e s i g n a l s e t e q u a l t o z e r o d u r i n g t h e d e a d t i m e , t h e r e s u l t i n g s p e c t r u m i s a c o n v o l u t i o n o f t h e i d e a l s p e c t r u m w i t h ( - s i n x ) / x . T h o s e p r o b l e m s h a v e b e e n s u r m o u n t e d b y u t i l i z i n g a n a t u r a l f e a t u r e o f s p i n - e c h o e x p e r i m e n t s : t h e f o r m a t i o n o f t h e e c h o p r o d u c e s a s e c o n d a r y s i g n a l w h i c h c a n b e a c q u i r e d w i t h o u t t h e e f f e c t f r o m d e a d t i m e p r o v i d e d t h e e c h o t i m e i s m u c h l o n g e r t h a n t h e d w e l l 86 Time (ms) F i g . 2 . 1 6 T h e s p i n e c h o s i g n a l i s a c q u i r e d i n t h e p r e s e n c e o f a y - g r a d i e n t o f 7 6 m T m " 1 a n d l a s t s f o r a b o u t 0 . 3 m s . 87 t i m e * . T h e g r a d i e n t s p e c t r a i n F i g s . 2 . 1 7 ( A ) a n d ( C ) w e r e a c q u i r e d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a 9 0 ° p u l s e i n t h e p r e s e n c e o f a s t a t i c y - g r a d i e n t o f 21 m T m " 1 a n d w i t h d w e l l t i m e s o f 1 0 0 M S a n d 5 0 M S r e s p e c t i v e l y w h i l e F i g s . 2 . 1 7 ( B ) a n d ( D ) s h o w t h e c o r r e s p o n d i n g s p i n e c h o s p e c t r a , o b t a i n e d b y m a g n i t u d e c a l c u l a t i o n 5 . C o m p a r i s o n o f t h e s p e c t r a s h o w s t h a t t h e s p i n e c h o s p e c t r a g i v e m u c h b e t t e r s i g n a l t o n o i s e a n d l i n e s h a p e s . T h e s p e c t r u m i n F i g . 2 . 1 7 ( C ) s h o w s s o m e i m p r o v e m e n t o v e r t h a t o f F i g . 2 . 1 7 ( A ) b e c a u s e o f r e d u c e d d w e l l t i m e , a n d s h o r t e r d e a d t i m e . 3 . E F F E C T O F R A D I O F R E Q U E N C Y I N H O M O G E N E I T Y A s o b s e r v e d i n s p e c t r u m ( C ) o f F i g . 2 . 1 5 , a f u r t h e r d i f f i c u l t y i n l i n e s h a p e m e a s u r e m e n t s s t e m s f r o m r a d i o f r e q u e n c y i n h o m o g e n e i t y . C o n s i d e r a t i o n o f t h e s t a n d a r d a r r a n g e m e n t f o r NMR p r o b e s w h e r e i n t h e s a m p l e e x t e n d s b e y o n d t h e r e g i o n o f t h e t r a n s m i t t e r c o i l ( F i g . 2 . 1 1 ( A ) ) , t o m a x i m i z e s i g n a l s t r e n g t h a n d m i n i m i z e s u s c e p t i b i l i t y v a r i a t i o n s , s h o w s t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f B , a l o n g t h e z d i r e c t i o n i s i n h o m o g e n e o u s . I n o r d e r t h a t l i n e s h a p e a n a l y s i s b e v a l i d f o r x a n d y g r a d i e n t s i t i s r e q u i r e d t h a t B , ( x ) a n d * D w e l l t i m e : T h e t i m e i n t e r v a l b e t w e e n s u c c e s s i v e s a m p l e s o f t h e t i m e d o m a i n NMR s i g n a l b y t h e d i g i t i z e r . F o r q u a d r a t u r e d e t e c t i o n t h e w i d t h o f t h e o b s e r v e d s p e c t r u m o r s w e e p w i d t h , i s g i v e n b y ± (2 x d w e l l t i m e ) " 1 . U s u a l l y t h e d e a d t i m e i s a u t o m a t i c a l l y s e t e q u a l t o t h e d w e l l t i m e . 5 M a g n i t u d e c a l c u l a t i o n : T h e r e a l a n d i m a g i n a r y p a r t s o f t h e s p e c t r u m S a r e c o m b i n e d t o g i v e S = ( R e S 2 + I m S 2 ) 1 ' 2 . 88 2 0 - 2 1 1 f 2 0 2 KHz C 2 0-2 2 0 -2 KHz F i g . 2 . 1 7 ( A ) & ( C ) S p e c t r a r e c o r d e d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a 9 0 ° p u l s e i n t h e p r e s e n c e o f a g r a d i e n t w i t h d w e l l t i m e s 1 0 0 M S a n d 50 M S r e s p e c t i v e l y . ( B ) & ( D ) T h e c o r r e s p o n d i n g s p i n e c h o s p e c t r a o b t a i n e d b y m a g n i t u d e c a l c u l a t i o n w i t h d w e l l t i m e s 1 0 0 M S a n d 5 0 M S r e s p e c t i v e l y . T h e s e s p e c t r a w e r e a c q u i r e d w i t h 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e l e n g t h s o f 13 M S a n d 2 7 M S r e s p e c t i v e l y ; a 10 m s , 21 m T m " 1 , y - g r a d i e n t p u l s e i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 9 0 ° p u l s e t h e n a d e l a y o f 4 0 ms b e f o r e t h e 1 8 0 ° p u l s e . T h e y - g r a d i e n t w a s s w i t c h e d o n a g a i n 4 0 ms a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e . T h e e c h o t i m e w a s 100 ms a n d t h e r e l a x a t i o n d e l a y w a s 6 s . 8 9 B , ( y ) b e u n i f o r m . T h e s e c o n d i t i o n s w e r e v e r i f i e d b y m a p p i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f B , a c r o s s t h e s a m p l e . A t w o - d i m e n s i o n a l e x p e r i m e n t f o r m a p p i n g B ^ x ) a n d B , ( z ) c o n s i s t s o f a s p i n - e c h o p u l s e s e q u e n c e w i t h t h e d u r a t i o n o f t h e e x c i t a t i o n p u l s e i n c r e m e n t e d f o r t h e e v o l u t i o n p e r i o d a n d t h e a c q u i s i t i o n o f t h e s i g n a l i n t h e p r e s e n c e o f a g r a d i e n t f o r t h e d e t e c t i o n p e r i o d ( F i g . 2 . 1 8 ) . T h e r e s u l t i n g m a p s h o w s t h e d i s t r i b u t i o n o f f r e q u e n c i e s , OJ, = 7 B , , a l o n g o n e d i r e c t i o n a c r o s s t h e s a m p l e . I n F i g . 2 . 1 9 ( A ) s h o w i n g t h e z - d i s t r i b u t i o n o f CJ , , t h e n o n - u n i f o r m i t y o b s e r v e d a t 0 . 5 c m o r g r e a t e r a w a y f r o m t h e c e n t e r c o r r e s p o n d s t o t h e e x t e n t o f t h e t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l w h i c h i s 1 c m i n l e n g t h . T h e y - d i s t r i b u t i o n o f CJ, e x t e n d s a c r o s s t h e NMR t u b e a n d s h o w s m u c h b e t t e r u n i f o r m i t y ( F i g . 2 . 1 9 ( B ) ) . T h e w i d t h o f t h e p e a k s i n d i c a t e s a d i s t r i b u t i o n o f t h a t e x i s t s o v e r a g i v e n s l i c e t h r o u g h t h e s a m p l e . T h e f r e q u e n c y a t t h e c e n t e r o f t h e p e a k s , 1 9 . 7 K H z , c o r r e s p o n d s t o a 9 0 ° p u l s e l e n g t h o f 1 2 . 7 jus , i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e v a l u e 13 us o b t a i n e d b y m e a s u r i n g i n t e n s i t i e s o f n o r m a l h i g h r e s o l u t i o n s p e c t r a . T h u s t h e d i s t r i b u t i o n o f r a d i o f r e q u e n c y r a d i a t i o n a c r o s s t h e s a m p l e t h a t i s p r o d u c e d b y t h e t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l i s u n i f o r m i n t h e y d i r e c t i o n a n d n o n - u n i f o r m i n t h e z - d i r e c t i o n . C o n s e q u e n t l y , g r a d i e n t m a g n i t u d e s c a n b e d e t e r m i n e d f r o m l i n e s h a p e s f o r t h e y - g r a d i e n t b u t n o t f o r t h e z - g r a d i e n t . 90 R 27 T T { I i \ ECHO • 1 F i g . 2.18 P u l s e s e q u e n c e f o r t h e one d i m e n s i o n a l m a p p i n g of t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e r f f i e l d a c r o s s t h e s a m p l e . The e x c i t a t i o n p u l s e P^ i s i n c r e m e n t e d f o r t h e e v o l u t i o n p e r i o d . A g r a d i e n t p u l s e o f d u r a t i o n d, f o l l o w e d by a d e l a y T, a 180° p u l s e , a f u r t h e r d e l a y T and f i n a l l y a g r a d i e n t p u l s e d u r i n g t h e d e t e c t i o n p e r i o d p r o d u c e s an e c h o a t 2 ( d + T ) . 9 OA F i g . 2 . 1 9 T h e o n e d i m e n s i o n a l m a p s f o r t h e d i s t r i b u t i o n o f co, f o r t h e z ( A ) a n d y ( B ) d i r e c t i o n s . T h e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e i n F i g 2 . 1 3 w i t h d a n d T i n t e r v a l s o f 5 a n d 20 ms r e s p e c t i v e l y , 1 8 0 ° p u l s e o f 2 7 M S a n d e x c i t a t i o n p u l s e , P ^ , i n c r e m e n t e d f r o m 15 M S t o 9 6 0 M S i n i n c r e m e n t s o f 15 M S . F o r ( A ) t h e f i x e d z - g r a d i e n t w a s 24 m T m " 1 a n d f o r ( B ) t h e f i x e d y - g r a d i e n t w a s 2 5 m T m " 1 . T h e s a d d l e s h a p e d t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l w a s 1 1 . 5 mm i n d i a m e t e r . 9 2 4 . S T A T I C G R A D I E N T D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T F o r c o m p a r i s o n w i t h t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t s w i t h g r a d i e n t s o f 1 . 1 m T m - 1 a n d 2 . 4 m T m * 1 ( F i g . 2 . 1 5 ) , s p e c t r a w i t h g r a d i e n t s o f 7 5 m T m - 1 a n d 151 m T m " 1 a r e s h o w n i n F i g . 2 . 2 0 . D e s p i t e t h e b a c k g r o u n d g r a d i e n t s p r o d u c e d b y t h e g r a d i e n t c o i l s y s t e m , t h e m a g n e t c a n s t i l l b e s h i m m e d t o p r o d u c e l i n e w i d t h s o f 4 H z f o r a n NMR t u b e ( F i g . 2 . 2 0 ( A ) ) . T h e s p e c t r u m i n F i g . 2 . 2 0 ( C ) i s i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e e x p e c t e d l i n e s h a p e a s i n d i c a t e d b y t h e g r a p h o f f r e q u e n c y vs p o s i t i o n f r o m E q . 2 . 4 7 ( F i g . 2 . 2 0 ( D ) ) . I n F i g . 2 . 2 1 ( A ) a s t a c k e d p l o t o f s p e c t r a f r o m a s t a t i c g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t f o r w a t e r i n a g l a s s c a p i l l a r y i s s h o w n . A c a p i l l a r y w a s c h o s e n s i n c e t h i s w o u l d a l l o w t h e u s e o f l a r g e g r a d i e n t s w i t h o u t s i g n i f i c a n t r e s o n a n c e o f f s e t e f f e c t s 6 d u r i n g t h e r f p u l s e s w h i c h w o u l d f u r t h e r c o m p l i c a t e t h e l i n e s h a p e (89). T h e i n t e n s i t y o f t h e s p e c t r a d e c r e a s e s a s t h e e c h o t i m e , 2 r , i s i n c r e a s e d . F r o m t h e l i n e w i d t h a t h a l f - h e i g h t , t h e e f f e c t i v e g r a d i e n t i s 1 3 0 m T m " 1 a n d f r o m t h e s l o p e o f t h e l i n e i n F i g . 2 . 2 1 ( B ) , a n a b s o l u t e v a l u e f o r t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r , 2 . 2 3 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 , w a s o b t a i n e d . T h i s v a l u e w a s i n a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e o f 2 . 1 9 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 f o r a t e m p e r a t u r e o f 2 3 ° C (11), a d i f f e r e n c e o f a b o u t 2 % . P o s s i b l e s o u r c e s o f e r r o r i n t h e m e a s u r e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t i n c l u d e t e m p e r a t u r e , w h i c h i s o n l y k n o w n a p p r o x i m a t e l y s i n c e t h e s a m p l e w a s n o t t h e r m o s t a t e d , i m p r e c i s i o n i n t h e v a l u e f o r t h e r a d i u s o f t h e 6 T h e c o n d i t i o n o>, >> (CJ 0-W ) f o r a l l o f t h e s p i n s i n t h e s a m p l e may n o l o n g e r a p p l y . 92A F i g . 2 . 2 0 ( A ) N o r m a l 9 0 ° p u l s e s p e c t r u m f o r w a t e r i n a NMR t u b e ; t h e l i n e w i d t h i s a b o u t 4 H z . ( B ) S p i n e c h o s p e c t r u m w i t h 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e l e n g t h s o f 13 a n d 2 7 M S , y - g r a d i e n t p u l s e o f 151 m T m " 1 a n d d u r a t i o n 1 . 5 ms f o l l o w i n g t h e 9 0 ° p u l s e , d e l a y 2 ms i m m e d i a t e l y b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e a n d a c q u i s i t i o n w i t h t h e y - g r a d i e n t o n . T h e e c h o t i m e w a s 7 ms a n d t h e d w e l l t i m e 16 M S . ( C ) S p i n e c h o s p e c t r u m w i t h t h e s a m e p u l s e s e q u e n c e a s i n ( B ) b u t w i t h y - g r a d i e n t p u l s e o f 7 5 m T m " 1 a n d d u r a t i o n 1 ms f o l l o w e d b y a d e l a y o f 4 m s . T h e e c h o t i m e w a s 10 ms a n d t h e d w e l l t i m e 3 3 M S . ( D ) G r a p h o f u vs x f o r d a t a f r o m ( C ) ; a g r a d i e n t o f 7 4 . 6 m T m " 1 w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e . 93 Frequency (KHz) 93A F i g . 2 . 2 1 ( A ) S p e c t r a f r o m a s t a t i c g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t f o r w a t e r i n a g l a s s c a p i l l a r y . T h e r a d i u s , 0 . 6 1 0 mm, o f t h e c a p i l l a r y w a s e s t i m a t e d f r o m t h e v o l u m e o f w a t e r ( a s s u m i n g a d e n s i t y o f 1 g / m l ) i n a l e n g t h , / , o f t h e t u b e ( V = i r r 2 / ) . F r o m t h e l i n e w i d t h t h e e f f e c t i v e g r a d i e n t i s 1 2 9 m T m " 1 . T h e d a t a w e r e a c q u i r e d u s i n g a H a h n e c h o p u l s e s e q u e n c e w i t h t h e y - g r a d i e n t a p p l i e d t h r o u g h o u t . T h e e c h o t i m e ( 2 T ) w a s i n c r e m e n t e d f r o m 5 ms t o 2 5 ms i n 2 0 i n c r e m e n t s o f 1 m s . T h e d e c a y o f t h e w a t e r s i g n a l o v e r t h i s t i m e i n t e r v a l w a s n e g l i g i b l e a n d n o c o r r e c t i o n f o r T 2 w a s n e e d e d . R o o m t e m p e r a t u r e w a s 2 3 ° C . ( B ) P l o t o f Ln(A/AQ) vs T3 f o r t h e s p e c t r a i n ( A ) . X ( * 1 0 6 s 3 ) 9 5 c a p i l l a r y t u b e a n d m i s a l i g n m e n t o f t h e t u b e . 5 . P U L S E D G R A D I E N T D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T S T h e p u l s e d g r a d i e n t e x p e r i m e n t r e q u i r e s g r a d i e n t p u l s e s t o b e a p p l i e d e q u a l l y b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e ( F i g . 2 . 7 ) . T h e d e c a y o f t h e e c h o i s g i v e n b y E q . [ 2 . 6 8 ] , P u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p e c t r a a c q u i r e d w i t h v a r y i n g d e l a y t i m e s a f t e r t h e g r a d i e n t p u l s e a n d t h e c o r r e s p o n d i n g g r a p h o f i n t e n s i t y vs d e l a y t i m e a r e s h o w n i n F i g . 2 . 2 2 . . T h e r e d u c t i o n i n i n t e n s i t y f o r d e l a y t i m e s l e s s t h a n 2 5 ms i s d u e t o t h e e f f e c t o f e i t h e r e d d y c u r r e n t s o r t r a i l i n g o f t h e g r a d i e n t p u l s e . T h e a p p l i c a t i o n o f t h e 1 8 0 ° p u l s e i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r o f t h e s e w o u l d r e s u l t i n a n u n e q u a l d e p h a s i n g a n d r e p h a s i n g o f t h e s p i n s . T h i s w o u l d c a u s e e i t h e r a t i m e s h i f t , a d e c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f t h e e c h o o r b o t h . I n e i t h e r o f t h e s e c a s e s , t h e e f f e c t i s m o s t s e v e r e f o r t h e s h o r t e s t d e l a y s . H o w e v e r a t d e l a y s l o n g e r t h a n 2 5 ms t h e e c h o d e c a y s i n a n o r m a l f a s h i o n . T h e o v e r l a p b e t w e e n t h e 1 8 0 ° p u l s e a n d t h e " t a i l " o f t h e g r a d i e n t p u l s e i s s m a l l , a n d t h e e f f e c t i v e a p p l i e d g r a d i e n t i s t h e s a m e b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e f o r t h o s e d e l a y s . T h e d e c a y o f t h e s p i n e c h o f r o m w a t e r a t 2 3 ° C , i n a p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t i s s h o w n i n F i g . 2 . 2 3 . G r a d i e n t p u l s e s o f 3 ms a n d a s e p a r a t i o n o f 4 3 . 5 ms b e t w e e n t h e p u l s e s w e r e s u f f i c i e n t t o p r o d u c e a l i n e a r p l o t o f Ln(A/A0) vs y 2 G 2 S 2 ( A - 6 / 3 ) . U s i n g v a l u e s f o r t h e g r a d i e n t m a g n i t u d e o b t a i n e d f r o m l i n e s h a p e a n a l y s i s , t h e d i f f u s i o n 96 F i g . 2 . 2 2 ( A ) P u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a f o r w a t e r . Y - g r a d i e n t p u l s e s o f 2 5 . 2 m T m " 1 a n d 10 ms i n d u r a t i o n w e r e u s e d . T h e d e l a y , d , f o l l o w i n g t h e g r a d i e n t p u l s e s v a r i e d f r o m 1 , 2 , 4 , 1 0 , 1 5 , 2 0 , 2 5 , 3 0 , 3 5 , 4 0 , 4 5 a n d 5 0 m s . A c q u i s i t i o n w a s t r i g g e r e d a t t i m e 2 T . ( B ) G r a p h o f p e a k h e i g h t vs t i m e d . 97 I 1 1 0 0-5 1 yGY(A-S/3) (xio'm-'s) F i g . 2 . 2 3 D e c a y o f t h e s p i n e c h o f r o m w a t e r i n p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t . T h e g r a d i e n t p u l s e s w e r e 3 ms i n d u r a t i o n a n d v a r i e d f r o m 2 . 1 3 m T m " 1 t o 8 3 . 1 m T m " 1 i n 19 i n c r e m e n t s o f 4 . 2 6 m T m " 1 . T h e t i m e b e t w e e n t h e g r a d i e n t p u l s e s w a s 4 3 . 5 m s . R o o m t e m p e r a t u r e w a s 2 3 ° C . 98 c o e f f i c i e n t o f w a t e r c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e w a s 2 . 2 7 x 1 0 - 9 m 2 s " 1 ; t h e l i t e r a t u r e v a l u e i s 2 . 1 9 x 1 0 " 9 m 2 s - 1 (11), a d i f f e r e n c e o f 3 . 7 % . T h e l a r g e r o b s e r v e d v a l u e i s p r o b a b l y d u e a t l e a s t i n p a r t t o t h e e f f e c t s d e s c r i b e d a b o v e s i n c e t h e s e w o u l d s e r v e t o i n c r e a s e t h e e f f e c t i v e d u r a t i o n o f t h e g r a d i e n t p u l s e , t h e r e b y t e n d i n g t o c a u s e t h e e c h o t o d e c r e a s e f u r t h e r t h a n w o u l d o t h e r w i s e b e t h e c a s e . A n o t h e r p o s s i b l e s o u r c e o f e r r o r l i e s i n t h e v a r i a t i o n i n t e m p e r a t u r e s i n c e t h e s a m p l e w a s n o t t h e r m o s t a t t e d . W i t h t h e s e e x p e r i m e n t a l u n c e r t a i n t i e s i n m i n d , i n p u l s e d f i e l d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s i t i s s t i l l p r e f e r r a b l e t o u s e w a t e r a s t h e s t a n d a r d f o r d e t e r m i n i n g t h e e f f e c t i v e g r a d i e n t f o r a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t , t h e r e b y a l l o w i n g f o r b o t h t r a i l i n g o f t h e g r a d i e n t p u l s e s a n d e d d y c u r r e n t s . S i m i l a r e f f e c t s w e r e o b s e r v e d w i t h t h e l a r g e r g r a d i e n t c o i l s c o n s t r u c t e d f o r s u r f a c e c o i l m e a s u r e m e n t s . I n F i g . 2 . 2 4 , t h e e c h o a t t e n u a t i o n f r o m p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s f o r w a t e r , i n w h i c h t h e y - g r a d i e n t w a s i n c r e m e n t e d f r o m 1 . 1 t o 8 m T m - 1 w i t h g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n o f 2 0 ms a n d e c h o t i m e o f 1 . 0 4 s , i s s h o w n . D a t a o b t a i n e d n o r m a l l y b y i n t e g r a t i o n o f t h e w a t e r s i g n a l a r e i n d i c a t e d b y a c l o s e d c i r c l e , w i t h t h e c o p p e r s h i e l d 7 r e m o v e d , b y a n o p e n t r i a n g l e , a n d f r o m p e a k h e i g h t s w i t h t h e s h i e l d i n p l a c e , b y a n o p e n c i r c l e . T h e e x p e c t e d d e c a y u s i n g v a l u e s f o r g r a d i e n t m a g n i t u d e f r o m T a b l e 2 . 1 i s s h o w n b y t h e s t r a i g h t l i n e . I n 7 c o p p e r c y l i n d e r , 2 6 . 5 c m o . d . a n d 1 / 1 6 i n w a l l t h i c k n e s s , w h i c h l i n e s t h e b o r e o f t h e m a g n e t a n d a c t s a s s h i e l d i n g f r o m u n w a n t e d r a d i o f r e q u e n c y r a d i a t i o n . 99 0 4 8 YG*b'(*-5/3) (xlO'Vm1) F i g . 2 . 2 4 D e c a y o f t h e s p i n e c h o i n p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s f o r w a t e r w i t h e c h o t i m e 1 . 0 s a n d 1 . 1 m T m " 1 , y - g r a d i e n t p u l s e s o f d u r a t i o n 2 0 m s . D a t a i n d i c a t e d b y (O) a n d ( • ) w e r e o b t a i n e d w i t h t h e c o p p e r s h i e l d i n p l a c e , b y m e a s u r e m e n t o f p e a k h e i g h t s a n d i n t e g r a t i o n o f t h e s i g n a l r e s p e c t i v e l y . (A ) i n d i c a t e s d a t a o b t a i n e d b y i n t e g r a t i o n , w i t h t h e s h i e l d r e m o v e d . T h e p r e d i c t e d b e h a v i o u r i s s h o w n b y t h e s t r a i g h t l i n e . 1 0 0 a l l c a s e s t h e o b s e r v e d d e c a y d e v i a t e d f r o m t h e e x p e c t e d b e h a v i o u r i n d i c a t i n g t h a t e f f e c t s f r o m g r a d i e n t p u l s e s l a s t f o r a s l o n g a s 0 . 5 s . T h e r e d u c e d r e l a t i v e e c h o a m p l i t u d e ( A / A 0 ) o b t a i n e d w i t h t h e c o p p e r s h i e l d i n p l a c e c o m p a r e d w i t h t h e s h i e l d r e m o v e d , s h o w s t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e s h i e l d e n h a n c e s t h e e d d y c u r r e n t e f f e c t s . F o r m e a s u r e m e n t s w i t h t h e s h i e l d i n p l a c e , t h e l o w e r r e l a t i v e v a l u e s o f e c h o a m p l i t u d e ( A / A 0 ) f r o m i n t e g r a t i o n c o m p a r e d w i t h p e a k h e i g h t s r e s u l t f r o m s i g n i f i c a n t v a r i a t i o n i n t h e p h a s e o f t h e e a c h l i n e s h a p e . T h i s c a n b e s e e n f r o m t h e s p i n e c h o F I D w h i c h d o e s n o t d e c a y e x p o n e n t i a l l y . D a t a f r o m a n o t h e r e x p e r i m e n t u s i n g t h e g r a d i e n t c o i l s p r o v i d e d w i t h t h e m a g n e t a r e s h o w n i n F i g . 2 . 2 5 . T h e d a t a w e r e a c q u i r e d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n o f a p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o p u l s e s e q u e n c e s t a r t i n g a t t h e e c h o t i m e , 0 . 1 3 s i n ( A ) a n d 0 . 6 3 s i n ( B ) . T h e F I D o b s e r v e d a t t h e s h o r t e r e c h o t i m e i s 2 6 t i m e s l e s s i n t e n s e d u e t o i m p r o p e r r e f o c u s s i n g o f t h e s p i n s a n d a l s o s h o w s d e v i a t i o n f r o m t h e e x p o n e n t i a l d e c a y w h i c h i s o b s e r v e d w i t h t h e l o n g e r e c h o t i m e . H o w e v e r , b y v a r y i n g t h e d u r a t i o n a n d a m p l i t u d e o f g r a d i e n t p u l s e s , a n d t h e e c h o t i m e , i t w a s p o s s i b l e t o o b t a i n e c h o a t t e n u a t i o n d a t a w h i c h s h o w m o r e l i n e a r b e h a v i o u r . D a t a o b t a i n e d f r o m p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o e x p e r i m e n t s o n w a t e r , u s i n g t h e x a n d z g r a d i e n t c o i l s , a r e s h o w n i n F i g . 2 . 2 6 . T h e e x p e c t e d b e h a v i o u r f o r w a t e r w i t h a d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f 2 . 1 9 x 1 0 ~ 9 m 2 s " 1 a t 2 3 ° C a n d g r a d i e n t m a g n i t u d e s f r o m l i n e w i d t h s , i s a l s o s h o w n . 100A F i g . 2 . 2 5 S p i n e c h o , F I D s i g n a l s f r o m a p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t f o r w a t e r u s i n g t h e s u r f a c e - c o i l a p p a r a t u s , w i t h 1 . 0 m T m " 1 x - g r a d i e n t p u l s e s o f d u r a t i o n 15 m s , a n d e c h o t i m e s 0 . 1 3 a n d 0 . 6 3 s i n ( A ) a n d ( B ) r e s p e c t i v e l y . r A < x26 I 0 200 400 Acquisition Time (ms) B -3 CL £ < r T 0 200 400 Acquisition Time (ms) 102 0 1 2 3 4 rttf(A-5/3) («10"*fs/rn) F i g . 2 . 2 6 D e c a y o f t h e s p i n e c h o i n p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s f o r w a t e r , u s i n g t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s w i t h x ( • ) a n d z ( O ) g r a d i e n t s . T h e p r e d i c t e d b e h a v i o u r i s s h o w n b y t h e d a s h e d l i n e . D a t a f o r t h e z - c o i l w e r e o b t a i n e d w i t h z - g r a d i e n t i n c r e m e n t 2 . 1 m T m " 1 , g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n 16 ms a n d e c h o t i m e 0 . 1 9 s . F o r t h e x - c o i l , t h e x - g r a d i e n t i n c r e m e n t w a s 0 . 6 5 m T m " 1 , g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n w a s 12 ms a n d t h e e c h o t i m e 2 2 5 m s . 1 0 3 T h e o b s e r v e d d e c a y i s f a s t e r t h a n e x p e c t e d , b y f a c t o r s o f 1 . 6 a n d 12 f o r t h e z a n d x c o i l s r e s p e c t i v e l y . P u l s i n g o f t h e x - g r a d i e n t c o i l a l s o p r o d u c e d a l o u d e r a c o u s t i c a l n o i s e t h a n t h e z c o i l . T h e b e h a v i o u r o f t h e y - c o i l w a s s i m i l a r t o t h a t o f t h e x - c o i l . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t x a n d y g r a d i e n t p u l s e s i n d u c e s t r o n g e r e d d y c u r r e n t s t h a n t h e z c o i l . I n F i g . 2 . 2 7 , s u r f a c e c o i l d i f f u s i o n d a t a a r e s h o w n f o r a 4 : 1 m i x t u r e o f w a t e r a n d e t h a n o l . T h e v a l u e s o f t h e d i f f u s i o n c o e f i c i e n t s o b t a i n e d f r o m t h e d a t a i n F i g . 2 . 2 7 , 1 . 2 6 x 1 0 " 9 m 2 s _ 1 f o r w a t e r a n d 8 . 0 x 1 0 ~ 1 0 m 2 s ~ 1 f o r e t h a n o l a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e v a l u e s o b t a i n e d i n d e p e n d e n t l y u s i n g t h e h i g h r e s o l u t i o n NMR a p p a r a t u s , 1 . 1 9 x 1 0 ~ 8 a n d 7 . 0 4 x 1 0 " 1 0 m 2 s _ 1 r e s p e c t i v e l y . T h u s , a c c u r a t e d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s c o u l d b e p e r f o r m e d u s i n g t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d p r o v i d e d t h e d e l a y f o l l o w i n g e a c h g r a d i e n t p u l s e w a s l o n g e n o u g h t o a l l o w t h e m a g n e t i c f i e l d t o s e t t l e d o w n , b u t w i t h l e s s p r e c i s i o n o n t h e s u r f a c e c o i l a p p a r a t u s t h a n t h e h i g h r e s o l u t i o n a p p a r a t u s . T h e p r e c i s i o n o f s u r f a c e c o i l m e a s u r e m e n t s w a s i m p r o v e d l a t e r ( c h a p t e r I I I ) b y e x t e n d i n g t h e m e a s u r e m e n t o v e r a w i d e r r a n g e o f e c h o a t t e n u a t i o n . 6 . D I F F U S I O N O F A C R Y L O N I T R I L E B Y MQ E C H O E S T h e m o d i f i e d p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s e q u e n c e o f F i g . 2 . 9 w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e t h e p r o t o n r e s o n a n c e s o f w h i c h c o n s t i t u t e a n AMX s p i n s y s t e m . B y a l l o w i n g t h e s e l e c t i v e d e t e c t i o n o f 104 0 2 A 6 * 2 GY (A-S /3 ) (*1Cf8,s/m2) F i g . 2 . 2 7 D a t a f o r t h e d i f f u s i o n o f a m i x t u r e o f w a t e r ( • ) a n d e t h a n o l ( O ) , 4 : 1 ( v / v ) , o b t a i n e d u s i n g t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d w i t h e f f e c t i v e z - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 1 . 6 m T m " 1 , g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n , 12 m s , a n d e c h o t i m e 0 . 1 1 2 s . T h e d a t a f o r c a l i b r a t i o n u s i n g w a t e r a r e i n d i c a t e d b y " x " . 1 0 5 m u l t i p l e q u a n t u m e c h o e s , g r a d i e n t s o f f e r a n a l t e r n a t i v e m e a n s f o r o p t i m i z i n g t h e e x c i t a t i o n p a r a m e t e r s i n MQ e x p e r i m e n t s . T h e v a r i a t i o n i n t h e e c h o a m p l i t u d e w i t h p r e p a r a t i o n t i m e a r i s i n g f r o m s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e s , i s s h o w n i n F i g . 2 . 2 8 . T h e o s c i l l a t o r y b e h a v i o u r i s d u e t o t h e p r e c e s s i o n o f t h e m a g n e t i z a t i o n c o m p o n e n t s g i v i n g r i s e t o t h e c o h e r e n c e . T h e p r e p a r a t i o n t i m e T, t h e m u l t i p l e q u a n t u m e v o l u t i o n t i m e t , , a n d t h e d e l a y p e r i o d T w e r e o p t i m i z e d t o g i v e t h e m a x i m u m s i g n a l . S p e c t r a a n d d e c a y o f t h e s p i n e c h o e s f o r t h e t h r e e o r d e r s o f c o h e r e n c e s a r e s h o w n i n F i g . 2 . 2 9 . T h e l i n e s w e r e o b t a i n e d b y l i n e a r l e a s t s q u a r e s f i t t o E q . [ 2 . 7 2 ] . F i g u r e 2 . 3 0 s h o w s t h e e n e r g y l e v e l s c h e m e f o r a n AMX s y s t e m . T h e r e s h o u l d b e o n e t r i p l e a n d s i x d o u b l e q u a n t u m t r a n s i t i o n s a n d a l l a r e o b s e r v e d i n t h e s p e c t r a . T h e l a r g e r n e g a t i v e s l o p e s f o r t h e s e c o n d a n d t h i r d o r d e r s o f c o h e r e n c e s h o w s t h e g r e a t e r s e n s i t i v i t y t o d i f f u s i o n . T h e c a l c u l a t e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . 3 . T h i s m e t h o d w i l l b e u s e f u l i n s t u d i e s o f c o m p l e x m i x t u r e s , a n d a l s o f o r t h e m e a s u r e m e n t o f s l o w e r d i f f u s i o n r a t e s w h e n t e c h n i c a l l i m i t a t i o n s p r e c l u d e t h e u s e o f g r a d i e n t s l a r g e e n o u g h f o r s i n g l e q u a n t u m m e a s u r e m e n t s . H o w e v e r , t h e r e l a t i v e i n e f f i c i e n c y o f c o n v e r s i o n o f s i n g l e q u a n t u m i n t o h i g h e r o r d e r c o h e r e n c e s , a n d t h e r e l a t i v e l y l o n g e c h o t i m e s may p r e s e n t s o m e d i f f i c u l t y w h e n t h e T 2 i s s h o r t a n d t h e s y s t e m i s d i l u t e . I n t h i s c o n t e x t , we n o t e t h e r e c e n t p u b l i c a t i o n o f d o u b l e q u a n t u m i m a g e s o f h u m a n f o r e a r m 106 F i g . 2 . 2 8 T h e v a r i a t i o n i n t h e a m p l i t u d e o f t h e s i n g l e ( A ) , d o u b l e ( B ) a n d t r i p l e ( C ) q u a n t u m e c h o e s w i t h p r e p a r a t i o n t i m e , r . 106A F i g . 2 . 2 9 S p e c t r a a n d d e c a y o f t h e s p i n e c h o e s f o r s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e s o f a c r y l o n i t r i l e . T h e s i n g l e q u a n t u m s p e c t r u m w a s o b t a i n e d w i t h a n o r m a l 9 0 ° p u l s e . T h e d o u b l e q u a n t u m s p e c t r u m i s t h e p r o j e c t i o n o f a t w o d i m e n s i o n a l d a t a s e t a c q u i r e d w i t h r o f 3 0 m s , y - g r a d i e n t p u l s e o f 3 . 8 m T m " 1 , d o f 8 ms a n d T o f 3 0 0 m s . T h e i n c r e m e n t a l MQ e v o l u t i o n t i m e w a s 0 . 8 ms a n d 2 5 6 i n c r e m e n t s w e r e u s e d . T h e t r i p l e q u a n t u m s p e c t r u m w a s a c q u i r e d w i t h r o f 21 m s , y - g r a d i e n t p u l s e o f 2 5 . 2 m T m " 1 , d o f 1 ms a n d T o f 1 0 0 m s . T h e i n c r e m e n t a l MQ e v o l u t i o n t i m e w a s 1 . 6 7 ms a n d 2 5 6 i n c r e m e n t s w e r e u s e d . F o r t h e d i f f u s i o n e x p e r i m e n t s , a 5 o f 10 m s , A o f 1 1 0 ms w i t h x - g r a d i e n t i n c r e m e n t s o f 1 . 6 1 m T m " 1 , 0 . 7 7 m T m " 1 a n d 0 . 5 4 m T m " 1 w e r e u s e d f o r t h e s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m e c h o e s r e s p e c t i v e l y . R e l a x a t i o n d e l a y s o f 3 s w e r e a l l o w e d f o r e q u i l i b r a t i o n . 107 S Q C | « < X o t > -F i g . 2 . 3 0 S c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e e n e r g y l e v e l s f o r a n AMX s p i n s y s t e m a s f o u n d i n a c r y l o n i t r i l e . T h e s i x d o u b l e q u a n t u m t r a n s i t i o n s a r e l a b e l l e d D . N o t i n d i c a t e d i s o n e t r i p l e q u a n t u m t r a n s i t i o n . 109 TABLE 2-3 coherence D U l o V s " ' ) single 4-2 ± 04 double 4-3 ± 0 2 triple 4-1 ± 0-2 T a b l e 2 . 3 D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c r y l o n i t r i l e f r o m s i n g l e , d o u b l e a n d t r i p l e q u a n t u m s p i n e c h o e s . T h e u n c e r t a i n t i e s a r e 9 8 % c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f r o m l e a s t s q u a r e s f i t t o t h e d a t a i n F i g . 2 . 2 9 . 1 1 0 ( 9 0 ) . 7 . I M A G I N G O F G L A S S C A P I L L A R I E S C O N T A I N I N G W A T E R A N D A C E T O N E I n F i g . 2 . 3 1 , t w o d i m e n s i o n a l NMR i m a g e s o f c a p i l l a r y t u b e s c o n t a i n i n g w a t e r , 1 . 2 mm i . d . i n ( A ) a n d 1 4 0 - 2 2 0 um i . d . i n ( B ) a r e s h o w n , w i t h s i g n a l t o n o i s e r a t i o o f 15 a n d 2 8 r e s p e c t i v e l y . T h e i m a g e s c o r r e s p o n d t o a p r o j e c t i o n o f t h e p r o t o n d e n s i t y a l o n g a n 11 mm l e n g t h o f t h e c a p i l l a r i e s , c o r r e s p o n d i n g t o t h e e x t e n t o f t h e t r a n s m i t t e r - r e c e i v e r c o i l , i n t o t h e x y - p l a n e . T h e e l l i p s o i d a l s h a p e o f t h e c a p i l l a r y i m a g e s i n ( A ) i s d u e t o d i f f e r i n g f i e l d o f v i e w s a l o n g t h e x a n d y d i r e c t i o n s , o f 0 . 4 7 a n d 1 . 0 1 cm r e s p e c t i v e l y . T h e t r a n s v e r s e r e s o l u t i o n i n ( B ) i s c o m p a r a b l e t o t h a t o f a n i m a g e o b t a i n e d b y E c c l e s a n d C a l l a g h a n (59) f o r c a p i l l a r i e s o f s i m i l a r s i z e u s i n g a s o l e n o i d a l r f c o i l o f r a d i u s 2 . 8 mm, b u t w i t h m o r e d e m a n d i n g e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s i n c l u d i n g a s m a l l e r s l i c e t h i c k n e s s , 1 . 5 mm, a n d a s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e o f 5 . 8 m s . T h e e c h o t i m e s f o r t h e s e i m a g e s , 2 0 ms i n F i g . 2 . 3 1 ( A ) , a n d 30 ms i n F i g . 2 . 3 1 ( B ) , a r e m u c h l e s s t h a n t h e t i m e f o r w h i c h e d d y c u r r e n t e f f e c t s w e r e o b s e r v e d i n t h e p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t o f F i g . 2 . 2 2 . I n t h e p r e s e n c e o f a l a r g e g r a d i e n t , t h e w e a k e r g r a d i e n t s p r o d u c e d b y e d d y c u r r e n t s w i l l h a v e a s m a l l e r e f f e c t o n t h e s h a p e o f t h e e c h o t h a n i f t h e r e w e r e n o g r a d i e n t a p p l i e d . A l s o , s i n c e t h e f o r m a t i o n o f t h e e c h o o c c u r s i n t h e m i d d l e o f t h e a c q u i s i t i o n p e r i o d , t h e 110A F i g . 2 . 3 1 T w o d i m e n s i o n a l i m a g e s o f g l a s s c a p i l l a r y t u b e s c o n t a i n i n g w a t e r . ( A ) T o p p h o t o g r a p h . NMR i m a g e o f 1 . 2 mm i . d . c a p i l l a r y t u b e s a c q u i r e d w i t h t h e p u l s e s e q u e n c e s h o w n i n F i g 2 . 2 e x c e p t t h a t T = 0 , d = T a n d t h e p h a s e e n c o d i n g g r a d i e n t p u l s e o f d u r a t i o n r w a s a p p l i e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 9 0 ° - p u l s e i n s t e a d o f t h e l 8 0 ° - p u l s e . T h e i m a g e w a s a c q u i r e d w i t h a d w e l l t i m e o f 2 5 0 M S , T o f 10 m s , f i x e d y - g r a d i e n t o f 9 . 3 m T m " 1 , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 5 m T m " 1 , 1 8 0 ° p u l s e o f 2 8 MS a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 4 s . T h e f i e l d o f v i e w s w e r e 0 . 4 7 a n d 1 . 0 1 cm a l o n g x a n d y r e s p e c t i v e l y . ( B ) B o t t o m p h o t o g r a p h . NMR i m a g e o f c a p i l l a r i e s w i t h 1 4 0 - 2 2 0 Mm i . d . a n d a c q u i r e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e i n ( A ) . T h e i m a g e w a s a c q u i r e d w i t h a d w e l l t i m e o f 1 6 7 M S , T o f 15 m s , f i x e d y - g r a d i e n t o f 3 8 . 9 m T m " 1 , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 6 m T m - 1 , 1 8 0 ° p u l s e o f 28 MS a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 4 s . T h e f i e l d o f v i e w s w e r e 0 . 2 6 a n d 0 . 3 8 cm a l o n g x a n d y r e s p e c t i v e l y . T h e 1 8 0 ° p u l s e l e n g t h w a s 2 8 MS a n d 4 s c a n s w e r e u s e d f o r e a c h i m a g e . 111 1 12 e c h o m a y f o r m a l i t t l e e a r l i e r o r l a t e r t h a n 2 r a n d t h e i n t e n s i t y o f t h e s i g n a l w i l l n o t c h a n g e . T h u s t h e 1 8 0 ° p u l s e m a y o v e r l a p t h e t a i l o f t h e f i r s t s p i n e c h o g r a d i e n t p u l s e . T h u s t h e g r a d i e n t s e r v e s t o s t a b i l i z e t h e f o r m a t i o n o f t h e e c h o (13) a n d i m a g e s c a n b e o b t a i n e d w i t h e c h o t i m e s o f 7 m s , a s d e s c r i b e d i n c h a p t e r I V . I n F i g . 2 . 3 2 , a n o r m a l i m a g e o f 1 . 2 mm i . d . c a p i l l a r i e s , o n e c o n t a i n i n g w a t e r o n t h e r i g h t a n d t h e o t h e r o n t h e l e f t c o n t a i n i n g a c e t o n e , i s s h o w n i n ( A ) a n d a d i f f u s i o n c o n t r a s t e d i m a g e i s s h o w n i n ( B ) . T h e i m a g e s w e r e a c q u i r e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e o f F i g . 2 . 8 . T h e d e c r e a s e i n t h e i n t e n s i t y o f t h e s i g n a l s i n ( B ) c o m p a r e d t o ( A ) i s g r e a t e r f o r a c e t o n e w h i c h h a s a l a r g e r d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t t h a n w a t e r . B y c o m p a r i n g t h e i n t e n s i t i e s i n ( A ) a n d ( B ) , a n d t a k i n g t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r t o b e 2 . 1 9 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 a t 2 3 ° C , t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f a c e t o n e w a s c a l c u l a t e d , u s i n g E q . 2 . 6 9 , t o b e 4 . 1 0 x 1 0 " 9 m 2 s _ 1 . T h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e v a l u e o b t a i n e d i n a p u l s e d g r a d i e n t d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t o f 4 . 1 8 x 1 0 - 9 m 2 s - 1 ( F i g . 2 . 3 3 ) . 112A F i g . 2 . 3 2 ( A ) NMR i m a g e o f c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g w a t e r ( o n t h e r i g h t ) a n d a c e t o n e ( o n t h e l e f t ) . T h e i m a g e w a s a c q u i r e d w i t h t h e p u l s e s e q u e n c e i n F i g . 2 . 8 w i t h a y - g r a d i e n t p u l s e o f 7 5 . 6 m T m " 1 a n d a n d d w e l l t i m e 50 M S , a x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 1 . 3 m T m " 1 w i t h p h a s e e n c o d i n g t i m e , d , o f 3 ms a n d T o f 2 0 m s . T h e d u r a t i o n s o f t h e 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e s w e r e 13 a n d 27 MS r e s p e c t i v e l y . T h e f i e l d o f v i e w w a s 0 . 6 2 cm a l o n g t h e x a n d y d i r e c t i o n s a n d t h e z - g r a d i e n t w a s n o t a p p l i e d . S i g n a l a v e r a g i n g o f 4 a c q u i s i t i o n s a n d 128 i n c r e m e n t s o f w e r e u s e d . ( B ) S a m e a s i n ( A ) e x c e p t a z - g r a d i e n t p u l s e o f 4 5 . 8 m T m " 1 w i t h 6 = 5 ms w a s a p p l i e d t o p r o d u c e a d i f f u s i o n c o n t r a s t e d i m a g e . X-coordinate (cm) acetone water ~ 1 — i — i — i — r ~ -8 -4 0 U 8 Frequency (kHz) 2 . 3 3 A s t a c k e d p l o t o f s p e c t r a f o r c a p i l l a r i e s c o n t a i n i n g w a t e r a n d a c e t o n e , a c q u i r e d w i t h t h e p u l s e s e q u e n c e a n d p a r a m e t e r s o f F i g . 2 . 3 2 e x c e p t w i t h t h e x - g r a d i e n t t u r n e d o f f a n d t h e z - g r a d i e n t i n c r e m e n t e d f r o m 3 . 8 m T m " 1 t o 1 4 5 m T m " 1 . I I I . D I F F U S I O N M E A S U R E M E N T A . I N T R O D U C T I O N NMR h a s b e c o m e a n i m p o r t a n t t e c h n i q u e f o r t h e s t u d y o f t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n , w i t h t h e c a p a b i l i t y o f p e r f o r m i n g m e a s u r e m e n t s o n m a n y d i f f e r e n t t y p e s o f s a m p l e s . T h e t e c h n i q u e p o s s e s s e s a w i d e d y n a m i c r a n g e , f r o m 1 x I 0 " 9 m 2 s " 1 f o r l i q u i d s t o 5 x I 0 ~ 1 3 m 2 s ~ 1 f o r d i s s o l v e d p o l y m e r s , a n d i s l i m i t e d o n l y b y t h e m a g n i t u d e o f g r a d i e n t t h a t c a n b e a c h i e v e d ; i n p r a c t i c e g r a d i e n t s m a y r e a c h 1 . 5 T m " 1 . T h e r a n g e o f a p p l i c a t i o n i n p u b l i s h e d w o r k i s a l r e a d y q u i t e l a r g e , w i t h s t u d i e s o f w a t e r i n b i o l o g i c a l s y s t e m s (91-94), d i s s o l v e d m o l e c u l e s i n c o l l o i d s (24,95-99), p o l y m e r s i n s o l u t i o n (100-103), m o l e c u l e s o n s u r f a c e s (104), h y d r o g e n i n m e t a l s (105,106) a n d i n a q u e o u s s o l u t i o n (107-109) . S e c t i o n B o f t h i s c h a p t e r r e p o r t s t h e d e t e r m i n a t i o n b y t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e a - a n d 0 - a n o m e r s o f D - g l u c o s e a n d m e t h y l - D - g l u c o s i d e i n H 2 0 a n d i n D 2 0 , a n d a l s o o f d e x t r a n , a p o l y s a c c h a r i d e c o n s i s t i n g o f 1 - 6 l i n k e d g l u c o s e m o n o m e r i c u n i t s , i n D 2 0 . T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f g l u c o s e a t i n f i n i t e d i l u t i o n w a s d e t e r m i n e d b y e x t r a p o l a t i o n f r o m m e a s u r e m e n t s o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s . S e c t i o n C d e s c r i b e s p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o m e a s u r e m e n t s t o c h a r a c t e r i z e t h e m o t i o n o f w a t e r a n d l i p i d , i n - v i v o , i n h u m a n f o r e a r m ; a s u r f a c e c o i l w a s u s e d t o 1 15 1 1 6 p r o v i d e l o c a l i z a t i o n o f s i g n a l s . B . D I F F U S I O N I N L I Q U I D S T h e s t u d y o f d i f f u s i o n i n l i q u i d s o n c e ( 1 9 0 5 - 1 9 1 2 ) p l a y e d a r o l e i n e s t a b l i s h i n g t h e m o l e c u l a r t h e o r y o f m a t t e r . E i n s t e i n w a s a b l e t o m a k e a c o n n e c t i o n b e t w e e n t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o b t a i n e d b y a m a c r o s c o p i c m e a s u r e m e n t , a n d t h e s i z e o f s u s p e n d e d p a r t i c l e s i n a l i q u i d u n d e r g o i n g i r r e g u l a r m o t i o n d u e t o c o l l i s i o n s w i t h m o l e c u l e s o f t h e l i q u i d w h e r e f i s t h e f r i c t i o n c o e f f i c i e n t . F o r a s p h e r i c a l p a r t i c l e o f r a d i u s r , m o v i n g w i t h u n i f o r m v e l o c i t y i n a c o n t i n u o u s f l u i d o f v i s c o s i t y n, f 0 i s g i v e n b y F r o m t h i s , A v o g a d r o ' s n u m b e r c o u l d b e d e t e r m i n e d a n d w a s f o u n d t o b e i n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o f s t u d i e s o f o t h e r t y p e s o f p h e n o m e n a (110). T o d a y t h i s r e l a t i o n , k n o w n a s t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n , s t i l l p r o v i d e s a v e r y u s e f u l m e a n s o f i n t e r p r e t i n g d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s a n d m u c h e f f o r t h a s b e e n g i v e n t o e s t a b l i s h i n g a m o r e r i g o r o u s c o n n e c t i o n f o r t h e m o l e c u l e s t h e m s e l v e s (111,112). T h e e q u a t i o n i s v a l i d s t r i c t l y i n t h e D = kT f [3-1] fe = 6TTVjr [3-2] 117 l i m i t t h a t t h e d i f f u s i n g p a r t i c l e i s m u c h l a r g e r t h a n t h e m o l e c u l e s o f t h e s u r r o u n d i n g m e d i u m . A s d i s c u s s e d b y E d w a r d , t h e e q u a t i o n s e e m s t o b e v a l i d f o r m o l e c u l e s a s s m a l l a s 5 A i n r a d i u s (113). D e v i a t i o n s f r o m t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n a r e o f t e n d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e v a r i a t i o n o f s h a p e o f t h e s o l u t e a n d i n t e r a c t i o n s w i t h t h e s o l v e n t m o l e c u l e s . I n t h i s t h e s i s we a p p l y t h e p u l s e d g r a d i e n t m e t h o d t o m e a s u r e t h e d i f f u s i o n o f t h e a a n d /3 a n o m e r s o f D - g l u c o s e a n d m e t h y l D - g l u c o p y r a n o s i d e i n a q u e o u s s o l u t i o n . C a r b o h y d r a t e s , p a r t i c u l a r l y g l u c o s e , o c c u r w i d e l y a s b i o l o g i c a l " f u e l s " a n d a s " b u i l d i n g b l o c k s " f o r p o l y s a c c h a r i d e s s u c h a s c e l l u l o s e . T h e h y d r a t i o n , c o n f o r m a t i o n a n d s o l u t e i n t e r a c t i o n o f c a r b o h y d r a t e s i n a q u e o u s s o l u t i o n s h a v e b e e n o f s o m e i n t e r e s t . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e n u m b e r o f e q u a t o r i a l h y d r o x y l g r o u p s a f f e c t s t h e h y d r a t i o n o f s u g a r m o l e c u l e s (114) a n d t h a t t h e s u g a r m o l e c u l e w h i c h h a s t h e l a r g e r n u m b e r o f e q u a t o r i a l g r o u p s h a s a s t r o n g e r e f f e c t o n w a t e r s t r u c t u r e . I n a s t u d y o f t h e d i f f u s i o n o f s u g a r s i n a q u e o u s s o l u t i o n , a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e l i m i t i n g v a l u e s o f d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s a n d t h e n u m b e r o f e q u a t o r i a l h y d r o x y l g r o u p s i n t h e m o l e c u l e w a s f o u n d (115). B y p r o v i d i n g a n a c c u r a t e m e a n s f o r d e t e r m i n i n g d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s NMR c o u l d p r o v e u s e f u l i n s u c h s t u d i e s . 118 1 . E X P E R I M E N T A L E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e a p p a r a t u s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y i n s e c t i o n B . 1 , o f c h a p t e r I I . T h e g r a d i e n t m a g n i t u d e s f o r a l l p u l s e d g r a d i e n t m e a s u r e m e n t s w e r e d e t e r m i n e d b y c a l i b r a t i o n w i t h t h e k n o w n d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r . 2 . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N F i g . 3 . 1 s h o w s a s t a c k e d p l o t o f p u l s e d g r a d i e n t s p e c t r a f o r D - g l u c o s e , 1 . 0 M i n w a t e r . T h e a a n d 0 a n o m e r s g i v e r i s e t o d i s t i n c t p e a k s a t 5 . 8 a n d 4 . 6 P P M r e s p e c t i v e l y . T h e l a r g e s i g n a l d u e t o p r o t o n s o f w a t e r i n t h e n o r m a l 1 H s p e c t r u m h a s b e e n r e d u c e d b e c a u s e o f c h e m i c a l e x c h a n g e w i t h t h e h y d r o x y l p r o t o n s o f t h e g l u c o s e m o l e c u l e s . T h i s l e a d s t o a s h o r t e n e d s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e , T 2 , s o t h a t t h e w a t e r s i g n a l c a n b e r e d u c e d b y u s i n g a s u f f i c i e n t l y l o n g e c h o t i m e , 0 . 3 8 s i n t h e s e s p e c t r a , t o a l l o w r e l a x a t i o n . T h u s t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s f o r e a c h i s o m e r c a n b e d e t e r m i n e d s e p a r a t e l y . I n T a b l e 3 . 1 , d i f f u s i o n d a t a f o r t h e i s o m e r s o f D - g l u c o s e a n d m e t h y l D - g l y c o s i d e a r e s u m m a r i z e d . T h e o b s e r v e d d i f f e r e n c e s a r e w i t h i n t h e l i m i t s o f e x p e r i m e n t a l e r r o r , e s t i m a t e d t o b e 2 % . F r o m t h i s we c o n c l u d e t h a t a n y d i f f e r e n c e s i n s h a p e a n d h y d r a t i o n b e t w e e n a a n d 0 i s o m e r s a r e n o t s u f f i c i e n t t o a l t e r t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t . T h e d i f f u s i o n o f g l u c o s e ( 1 . 0 M) i n D 2 0 i s s l o w e r t h a n i n H 2 0 a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n b y 2 9 % . T h i s r e d u c t i o n c a n o n l y b e p a r t i a l l y a c c o u n t e d f o r b y t h e d i f f e r e n c e i n t h e v i s c o s i t y 119 Chemical Shift (PPM) F i g . 3 . 1 A s t a c k e d p l o t o f p u l s e d g r a d i e n t 1 H s p e c t r a f o r g l u c o s e , 0 . 5 M i n w a t e r . T h e d o u b l e t s a t 4 . 6 a n d 5 . 8 P P M a r e a s s i g n e d t o t h e a n o m e r i c p r o t o n s o f t h e 0 a n d a a n o m e r s o f D - g l u c o s e r e s p e c t i v e l y . 120 TABLE 3-1 D-glucose 1 - 0 M in D 2 0 <x -anomer -anomer 2-95 x 1 0 " 9 m V 1 2-97 D-glucose 1 0 M in H 2 0 anomer (3 -anomer 4-19 4-16 methylglycoside 0-1M"in D 2 0 <x- anomer (9- anomer 4-84 4 -88 T a b l e 3 . 1 D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e a a n d /3 a n o m e r s o f D - g l u c o s e a n d D - m e t h y l g l y c o s i d e . 121 o f D 2 0 w h i c h i s 1 . 2 3 t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t o f H 2 0 a t 2 5 ° C (116) . I n F i g . 3 . 2 , t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f D e x t r a n ( P h a r m a c i a T - 1 0 , M w 9 0 0 0 ) 4 . 3 %(w/v ) i n D 2 0 , w a s d e t e r m i n e d i n a n e x p e r i m e n t w h e r e t h e g r a d i e n t w a s i n c r e m e n t e d u p t o 151 m T m " 1 , t o b e 6 . 2 4 x 1 0 " 1 1 m 2 s ' 1 , i n r e a s o n a b l e a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e o f 6 . 3 x 1 0 " 1 1 m 2 s " 1 (102). T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f g l u c o s e i n a q u e o u s s o l u t i o n s o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s w a s m e a s u r e d u s i n g t h e p u l s e d f i e l d g r a d i e n t m e t h o d . I n F i g . 3 . 3 , e x t r a p o l a t i o n o f t h e p l o t o f s e l f - d i f f u s i o n d a t a g i v e s a v a l u e f o r D o f 6 . 7 0 ± 0 . 0 5 x 1 0 " 1 0 m 2 s " 1 a t i n f i n i t e d i l u t i o n . T h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e l i t e r a t u r e v a l u e o f 6 . 7 5 x I 0 r 1 ° m 2 s " 1 o b t a i n e d f r o m t h e s h i f t o f i n t e r f e r e n c e f r i n g e s (117) a n d o f 6 . 7 8 x 1 0 " 1 0 m 2 s " 1 b y t h e N o r t h r o p M c B a i n p o r o u s d i s k t e c h n i q u e (118). T h e p r e d i c t e d v a l u e o f 6 . 1 7 x 1 0 " 1 0 m 2 s " 1 f r o m t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n i s s m a l l e r t h a n t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e . S u c h d e v i a t i o n i s a l r e a d y k n o w n a n d i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a n e m p i r i c a l c o r r e c t i o n b e m a d e (113). C . I N - V I V O P R O T O N S P E C T R O S C O P Y O F HUMAN F O R E A R M 1 . I N T R O D U C T I O N T h e r e i s i n t e r e s t i n t h e a p p l i c a t i o n o f NMR t o b i o l o g y a n d m e d i c i n e . F o r e x a m p l e , 3 1 P s p e c t r a f r o m h u m a n f o r e a r m s h o w p e a k s a t t r i b u t e d t o A D P , A T P , p h o s p h o c r e a t i n e a n d 121A F i g . 3 . 2 ( A ) S t a c k e d p l o t o f p u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p e c t r a o f d e x t r a n ( T 1 0 ) , 4 . 3 % ( w / v ) i n D 2 0 . T h e g r a d i e n t p u l s e s w e r e 15 ms i n d u r a t i o n a n d i n c r e m e n t e d f r o m 3 . 9 8 m T m - 1 t o 151 m T m - 1 i n 19 i n c r e m e n t s o f 7 . 9 7 m T m " 1 . T h e t i m e b e t w e e n g r a d i e n t p u l s e s w a s 1 1 5 m s . ( B ) T h e g r a p h o f Ln(A/A0) vs y2G262(A-6/3) f o r s p e c t r a i n ( A ) . F r o m t h e s l o p e t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t i s 6 . 2 4 x 1 0 " 1 1 m 2 s _ 1 . 5 4 3 Chemical Shift (PPM) 0 1 2 3 KVox(A-S/3) ("Itf.s/rrf) 123 Concentration of Glucose (M) F i g . 3 . 3 T h e v a r i a t i o n o f t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f D - g l u c o s e w i t h c o n c e n t r a t i o n i n a q u e o u s s o l u t i o n . T h e r o o m t e m p e r a t u r e w a s 2 3 ° C . 124 i n o r g a n i c p h o s p h a t e (119). C h a n g e s i n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s r e f l e c t d i f f e r e n c e s i n t h e b o d y c o m p o s i t i o n a n d t r a n s p o r t p r o p e r t i e s o f t h e s u b j e c t . C o n s i d e r i n g t h e h e t e r o g e n e o u s n a t u r e o f t h e f o r e a r m a n d t h e m e t a b o l i c p r o c e s s e s c a r r i e d o u t w i t h i n , s u c h s p e c t r a a r e p o t e n t i a l l y q u i t e c o m p l e x . T h e g o a l o f t h e in vivo s p e c t r o s c o p i s t m a y b e d i v i d e d i n t o t w o p a r t s . F i r s t , t o s p a t i a l l y l o c a l i z e t h e r e g i o n f r o m w h i c h t h e s i g n a l i s o b t a i n e d a n d , s e c o n d , t o e x t r a c t i n f o r m a t i o n a b o u t t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d t r a n s p o r t p r o p e r t i e s f r o m t h e r e s u l t a n t s p e c t r a . S p i n e c h o s p e c t r o s c o p y p r o v i d e s o n e w a y o f s i m p l i f y i n g s u c h s p e c t r a . A s d i s c u s s e d i n c h a p t e r I I , t h e c o n t r i b u t i o n t o t h e s p i n e c h o s i g n a l w i l l b e d e t e r m i n e d b y t h e q u a n t i t y a n d a l s o , b y t h e s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s o f t h e s p i n s . I t i s p o s s i b l e t o d i s c r i m i n a t e a g a i n s t s p i n s w i t h s h o r t e r T 2 v a l u e s b y i n c r e a s i n g t h e e c h o t i m e a n d c a u s i n g t h e c o r r e s p o n d i n g t r a n s v e r s e m a g n e t i z a t i o n t o d e c a y . I n b i o l o g i c a l s y s t e m s , t h i s o f f e r s a m e a n s f o r e l i m i n a t i n g t h e l a r g e w a t e r s i g n a l t h a t i s o b s e r v e d i n n o r m a l p r o t o n s p e c t r a . R e c e n t l y , s p i n e c h o s p e c t r a h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m r a t a t 3 6 0 MHz s h o w i n g p e a k s a t t r i b u t e d t o p r o t o n s o f p h o s p h o c r e a t i n e , t a u r i n e a n d a n s e r i n e (120). I n t h i s w o r k we a p p l y t h e p u l s e d g r a d i e n t t e c h n i q u e t o c h a r a c t e r i z e t h e t r a n s l a t i o n a l m o t i o n o f t h e w a t e r a n d f a t i n h u m a n f o r e a r m m u s c l e . T h e g r a d i e n t w a s a p p l i e d i n t h e l o n g i t u d i n a l ( p r o x i m o d i s t a l ) d i r e c t i o n a l o n g t h e f o r e a r m s o t h a t d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s w e r e e f f e c t i v e l y o n e - d i m e n s i o n a l 1 2 5 i n t h a t d i r e c t i o n . A c r o s s - s e c t i o n a l v i e w t h r o u g h t h e m i d d l e o f t h e f o r e a r m i s s h o w n i n F i g . 3 . 4 . T h e p o s i t i o n o f t h e s u r f a c e c o i l , p l a c e d o n t h e s k i n , i s a l s o s h o w n t o s c a l e . T h e r e g i o n s a m p l e d i s p r o b a b l y s o m e w h a t m o r e t h a n h a l f m u s c l e , c h i e f l y t h e f l e x o r c a r p i r a d i a l i s a n d b r a c h i o - r a d i a l i s m u s c l e s , a n d t h e r e m a i n d e r s u b c u t a n e o u s f a t , c o n n e c t i v e t i s s u e a n d s k i n . T h e g r e a t e r p a r t o f t h e w a t e r i n t h i s s y s t e m s h o u l d b e i n t r a c e l l u l a r , b u t s o m e t h i n g l i k e 10% s h o u l d b e f l o w i n g b l o o d (122). M u s c l e f i b r e s , i n w h i c h a b o u t h a l f t h e w a t e r o f t h e s y s t e m may r e s i d e , a r e a f e w t e n s o f m i c r o n s i n t r a n s v e r s e d i m e n s i o n s , b u t u p t o s e v e r a l c e n t i m e t r e s l o n g (123). W a t e r i n e n v i r o n m e n t s w i t h d i f f e r e n t c h e m i c a l c o m p o s i t i o n w i l l h a v e d i f f e r i n g d e g r e e s o f m o t i o n d u e t o i n t e r a c t i o n s i n c l u d i n g c h e m i c a l e x c h a n g e w i t h d i s s o l v e d m o l e c u l e s , a n d r e s t r i c t e d m o t i o n a t s u r f a c e s (124). S p i n r e l a x a t i o n t i m e s w i l l b e c o r r e s p o n d i n g l y a f f e c t e d . F o r a s y s t e m c o n s i s t i n g o f n e x c h a n g i n g p h a s e s (125), i f d e n o t e s t h e f r a c t i o n o f w a t e r p r e s e n t i n t h e i f c ^ p h a s e , T^ d e n o t e s a g e n e r a l r e l a x a t i o n t i m e (T^ or T 2 ) , t h e m a g n e t i z a t i o n M ( t ) f o r t h e s l o w e x c h a n g e c a s e (T^<< l i f e t i m e i n t h e i t h p h a s e ) i s g i v e n b y M(t)= I B e 71 [33] 125A F i g . 3.4 C r o s s - s e c t i o n through the middle of the forearm (A) and the s u p e r f i c i a l muscles on the f r o n t of the forearm (B) (from Grant's A t l a s of Anatomy (121)). The approximate l o c a t i o n of the 2.7 cm diameter s u r f a c e c o i l i s shown. 1 2 7 r e l a x e s i n d e p e n d e n t l y w i t h t i m e c o n s t a n t T \ . S u c h a s i t u a t i o n w o u l d p e r t a i n , f o r i n s t a n c e , i n t h e p r e s e n c e o f c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n , w h e r e t h e w a t e r i s p h y s i c a l l y b a r r e d f r o m d i f f u s i o n b e t w e e n t h e v a r i o u s r e g i o n s . F o r t h e c a s e o f r a p i d e x c h a n g e (T\ >> l i f e t i m e i n t h e p h a s e ) , I n t h i s r e g i m e , t h e w h o l e s y s t e m r e l a x e s w i t h a s i n g l e c h a r a c t e r i s t i c t i m e T g i v e n b y I n t h e f o r e a r m , w i t h d i f f e r e n t t y p e s o f t i s s u e , c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n i s e x p e c t e d t o l e a d t o m u l t i e x p o n e n t i a l r e l a x a t i o n r a t e s . P r e v i o u s s t u d i e s o f b i o l o g i c a l t i s s u e h a v e s h o w n t h a t s p i n - s p i n r e l a x a t i o n r a t e s o f w a t e r i n d e e d t e n d t o b e m u l t i e x p o n e n t i a l a n d a r e a b o u t f i f t y t i m e s f a s t e r t h a n s p i n l a t t i c e r e l a x a t i o n r a t e s (126,127). L i p i d s 1 0 o c c u r i n t h e b o d y i n a w i d e v a r i e t y o f f o r m s . T h e t r i a c y l g l y c e r o l s ( t r i g l y c e r i d e s , ( I ) ) s e r v e p r i m a r i l y a s e f f i c i e n t b i o l o g i c a l " f u e l s " . T h e p h o s p h o l i p i d s ( I I ) a r e M (t) = e it, 1/T=jr IJ/Tj. [3-5] 1 0 L i p i d s a r e c o n s t i t u e n t s o f a n i m a l o r p l a n t t i s s u e t h a t a r e i n s o l u b l e i n w a t e r b u t c a n b e d i s s o l v e d a n d e x t r a c t e d b y o r g a n i c s o l v e n t s . 128 e s s e n t i a l c o m p o n e n t s o f m e m b r a n e s . 0 II R,—C 0 0 II R — C — 0 — C H 2 0 0 (I) R - c 0 CH (II) R - C - O - C H 0 II 0 II P — 0 — R _ R 3 - C 0 C H 2 — 0 OH T h e l a t t e r f o r m o r i e n t e d p h a s e s a n d w i l l g e n e r a l l y g i v e r i s e t o b r o a d NMR l i n e s d u e t o o n l y p a r t i a l a v e r a g i n g o f t h e d i p o l e - d i p o l e i n t e r a c t i o n a n d c h e m i c a l s h i f t a n i s o t r o p y (128). C o n s e q u e n t l y , w h e n m e a s u r e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f h i g h r e s o l u t i o n NMR s p e c t r o s c o p y ( a s d i s t i n c t f r o m s o l i d s t a t e N M R ) , t h e a s s o c i a t e d s i g n a l w i l l d e c a y r a p i d l y , w i t h i n a f e w m i c r o s e c o n d s a n d w i l l n o t b e d e t e c t e d . I n m a m m a l s , t h e m a j o r s i t e o f s t o r a g e o f t r i a c y l g l y c e r o l s i s t h e c y t o p l a s m o f a d i p o s e c e l l s ( a d i p o c y t e s ) w h i c h o c c u r i n m u s c l e , m a m m a r y g l a n d s , t h e a b d o m i n a l c a v i t y , a n d u n d e r t h e s k i n . I n m a n y c e l l s t h e s e i n s o l u b l e t r i g l y c e r i d e s c o a l e s c e i n t h e c y t o s o l 1 1 t o f o r m l a r g e , a n h y d r o u s d r o p l e t s f r o m 0 . 2 t o 5 jum i n d i a m e t e r (129). I n a d i p o c y t e s , t h e c e l l s s p e c i a l i z e d f o r f a t s t o r a g e , t h e s e d r o p l e t s c a n b e a s l a r g e a s 8 0 jum i n d i a m e t e r , o c c u p y i n g v i r t u a l l y t h e e n t i r e c y t o s o l . 1 1 A l l i n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m t a k e s p l a c e i n t h e c y t o p l a s m , m o s t o f i t i n t h e c y t o s o l . T h e c y t o s o l g e n e r a l l y r e p r e s e n t s a b o u t 5 5 % o f t h e t o t a l c e l l v o l u m e a n d c o n t a i n s t h o u s a n d s o f e n z y m e s t h a t c a t a l y z e t h e r e a c t i o n s o f g l y c o l y s i s a n d g l u c o n e o g e n e s i s , a s w e l l a s t h e b i o s y n t h e s i s o f s u g a r s , f a t t y a c i d s , n u c l e o t i d e s a n d a m i n o a c i d s (129). 1 2 9 T h e r e l e a s e o f t r i a c y l g l y c e r o l s f r o m a d i p o s e t i s s u e i n v o l v e s t h e i r h y d r o l y s i s b y l i p a s e s . T h e f r e e f a t t y a c i d s p r o d u c e d t h i s w a y a r e t r a n s f e r r e d t o t h e b l o o d , w h e r e t h e y a r e r e v e r s i b l y b o u n d b y t h e p r o t e i n s e r u m a l b u m i n a n d t r a n s p o r t e d t o v a r i o u s t i s s u e s . I m m e d i a t e l y a f t e r a m e a l , n o r m a l h u m a n p l a s m a m a y c o n t a i n a b o u t a m i l l i g r a m p e r m i l l i l i t e r o f t r i a c y l g l y c e r o l f a t . W h o l e p l a s m a c o n t a i n s a b o u t 7 - 8 % p r o t e i n , 5 5 % o f w h i c h i s s e r u m a l b u m i n (MW 6 9 0 0 0 ) (130). T H E E F F E C T O F B L O O D F L O W B l o o d f l o w s f r o m t h e h e a r t t h r o u g h t h e a o r t a i n t o a n i n c r e a s i n g l y m o r e d i v i d e d s y s t e m o f a r t e r i e s , a r t e r i o l e s a n d f i n a l l y . a n e t w o r k o f c a p i l l a r i e s . I f a l l v e s s e l s w e r e p u t s i d e b y s i d e , t h e i r t o t a l c r o s s s e c t i o n a l a r e a w o u l d r a n g e f r o m 2 . 5 c m 2 f o r t h e a o r t a t o 2 5 0 0 c m 2 f o r t h e c a p i l l a r i e s ( T a b l e 3 . 2 (131)). T h e v e l o c i t y o f b l o o d f l o w i n e a c h s e g m e n t o f t h e c i r c u l a t i o n i s i n v e r s e l y p r o p o r t i o n a l t o i t s c r o s s - s e c t i o n a l a r e a . T h u s , u n d e r r e s t i n g c o n d i t i o n s , t h e v e l o c i t y a v e r a g e s 3 3 c m p e r s e c o n d i n t h e a o r t a a n d a b o u t 0 . 3 mm p e r s e c o n d i n t h e c a p i l l a r i e s . H o w e v e r , s i n c e t h e c a p i l l a r i e s h a v e a t y p i c a l l e n g t h o f o n l y 0 . 3 mm t o 1 mm, e a c h s e g m e n t o f f l o w i n g b l o o d r e m a i n s i n t h e c a p i l l a r i e s f o r o n l y 1 t o 3 s e c o n d s . T h e c a p i l l a r i e s a r e l e s s t h a n 10 urn i n d i a m e t e r a n d a r e r a n d o m l y o r i e n t e d . O n l y a f e w p e r c e n t o f t h e b l o o d i s i n t h e s m a l l c a p i l l a r i e s a t a n y i n s t a n t , b u t a b o u t 2 / 3 o f i t i s i n t h e v e n o u s s y s t e m , i n w h i c h f l o w i s 130 TABLE 3-2 c m 2 Aorta 2-5 Small arteries 20 Arterioles 40 Capillaries 2500 Venules 250 Small veins 80 Venae cavae 8 T a b l e 3 . 2 C r o s s - s e c t i o n a l a r e a s o f b l o o d v e s s e l s (131). 131 s l o w , a n d p o o l i n g a n d b a c k - e d d i e s c o m m o n , s o t h a t v e l o c i t i e s o f 3 m m s " 1 may e x i s t i n a l a r g e f r a c t i o n o f t h e b l o o d s u p p l y . S u f f i c i e n t l y r a n d o m i z e d i n d i r e c t i o n . , t h i s f l o w c o u l d m i m i c d i f f u s i o n o n t h e t i m e s c a l e o f a s p i n - e c h o e x p e r i m e n t . 2 . E X P E R I M E N T A L E x p e r i m e n t s w e r e d o n e u s i n g t h e a p p a r a t u s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d i n c h a p t e r I I , B . 2 . NMR s i g n a l s w e r e m e a s u r e d u s i n g a s u r f a c e c o i l w h i c h w a s p l a c e d o n t h e s k i n a n d e c h o t i m e s w e r e m a d e l o n g e n o u g h s o t h a t e f f e c t s f r o m s l o w g r a d i e n t r e s p o n s e w e r e m i n i m i z e d . T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s w e r e d e t e r m i n e d f r o m t h e v a r i a t i o n o f p e a k h e i g h t s o f l i n e s i n p u l s e d g r a d i e n t s p e c t r a a n d g r a d i e n t m a g n i t u d e s w e r e d e t e r m i n e d b y c a l i b r a t i o n u s i n g t h e k n o w n v a l u e f o r t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r . A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e , 2 3 - 2 6 ° C . 3 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N N o r m a l p r o t o n s p e c t r o s c o p y o f t h e r i g h t f o r e a r m s o f t w o s u b j e c t s ' * M & F , i n t h e r e g i o n o f t h e f l e x o r c a r p i r a d i a l i s a n d b r a c h i - r a d i a l i s m u s c l e s a r e s h o w n i n F i g . 3 . 5 . T h e i n c r e a s e d r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e l i p i d p e a k i n F i g . 3 . 5 ( B ) r e f l e c t s a n o b v i o u s d i f f e r e n c e i n t h e b o d y c o m p o s i t i o n o f t h e t w o s u b j e c t s ; t h e l i p i d p e a k s a t 1 . 7 a n d 5 . 3 P P M i n F i g . 3 . 5 ( B ) a r e a l s o s e e n i n H a h n s p i n e c h o 1 2 s u b j e c t M w a s a m a l e ( 1 . 6 m , 5 2 k g ) w h e r e a s F w a s a f e m a l e ( 1 . 5 m , 4 7 k g ) . 132 A B i i 1 1 — 5 0 5 0 Chemical Shift (PPM) Chemical Shift (PPM) F i g . 3 . 5 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a o f t h e r i g h t f o r e a r m s o f t w o s u b j e c t s ( M : m a l e , 1 . 6 m, 5 2 k g ; F : f e m a l e , 1 . 5 m, 4 7 k g ) . 1 3 3 s p e c t r a f o r s u b j e c t M . T h e s p i n e c h o s p e c t r a i n F i g . 3 . 6 ( B ) w e r e m e a s u r e d w i t h e c h o t i m e s r a n g i n g f r o m 4 0 0 t o 6 0 0 m s . C h a n g e s i n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s c l e a r l y s h o w t h a t t h e s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s o f t h e l i p i d p e a k s a t 1 . 3 a n d 1 . 7 P P M a r e d i f f e r e n t . T h e s p e c t r a a l s o s h o w t h a t t h e w a t e r r e l a x e s m u c h m o r e s l o w l y . F u r t h e r c o n f i r m a t i o n o f t h i s c o m e s f r o m c o m p a r i s o n w i t h t h e l a r g e r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e l i p i d p e a k s i n t h e p u l s e d g r a d i e n t s p e c t r a i n F i g . 3 . 6 ( C ) w i t h s h o r t e r s p i n e c h o t i m e , 2 2 4 m s . T h e s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s , f o r t h e s p e c t r a i n F i g . 3 . 6 ( B ) , w e r e d e t e r m i n e d b y l i n e a r l e a s t s q u a r e s f i t t o t h e g r a p h o f Ln(A/A0) vs 2T ( F i g . 3 . 7 ) a n d a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . 3 . T h e s h o r t e r v a l u e s o f T 2 , 8 6 & 8 8 m s , f o r t h e l i p i d p r o t o n s c o m p a r e d t o t h a t o f W i l l i a m s et at. (120) ( 2 9 2 m s ) b y a C P M G p u l s e s e q u e n c e i s p r o b a b l y d u e t o d i f f u s i o n i n t h e i n h o m o g e n e o u s f i e l d . H o w e v e r , l o n g e r r e l a x a t i o n t i m e s f o r t h e l a t t e r e x p e r i m e n t a r e a l s o e x p e c t e d b e c a u s e t h e s p e c t r a l d e n s i t y a t 3 6 0 MHz i s l i k e l y t o b e s m a l l e r t h a n a t 8 0 M H z . T h e T 2 v a l u e f o r t h e w a t e r , 7 4 0 m s , i s l o n g c o m p a r e d w i t h t h a t o f W i l l i a m s et al. (120) ( 2 8 . 8 m s , b y t h e C P M G m e t h o d ) . T h e l a t t e r v a l u e w i l l b e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e m a j o r c o m p o n e n t , i n t r a c e l l u l a r w a t e r , s i n c e t h e e c h o t i m e s r a n g e d f r o m 2 . 7 t o 1 0 0 m s . S i m i l a r T 2 v a l u e s f o r i n t r a c e l l u l a r w a t e r h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m s t u d i e s o n g i a n t b a r n a c l e m u s c l e (126,127). F o r e c h o t i m e s o f 2 0 0 ms t h e s i g n a l f r o m t h e i n t r a c e l l u l a r c o m p o n e n t w i l l b e a t t e n u a t e d 134 F i g . 3 . 6 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a a n d a s t a c k e d p l o t o f H a h n e c h o s p e c t r a f o r s u b j e c t M i n ( A ) a n d ( B ) r e s p e c t i v e l y . P u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a w i t h e c h o t i m e o f 2 2 4 ms i n ( C ) w i t h a n e n l a r g e d v i e w o f t h e 4 - 6 P P M r e g i o n i n ( D ) . D 0 -t 04 0-5 0-6 0-4 0-5 0-6 Echo time (2T,s) Echo time (2Z,s) P l o t o f Ln(A/A0) vs r f o r w a t e r ( A ) a n d l i p i d ( B - D ) f r o m H a h n e c h o s p e c t r a o f s u b j e c t M . 136 TABLE 33 EXPERIMENTAL VALUES Lipid Lipid Water Unsaturated lipid Chemical Shift T2 (PPM) (ms) 120 1-3 1-7 4- 8 5- 3 88 740 86 D/D0 0-20,0.23,0.26,0-17 070,0.64, —,1-11 022,021,0-21,0-17 LITERATURE VALUES Assignment Intracellular water Extracellular water Fat T2 (ms) 35 Foster et al. 28-8 Williams et al. 400 Foster et al. 292 Williams et al. T a b l e 3 . 3 C h e m i c a l s h i f t s , s p i n - s p i n ( T 2 ) r e l a x a t i o n t i m e s a n d r e l a t i v e d i f f u s i o n r a t e s ( D / D 0 ) f o r w a t e r a n d f a t in-vivo; D 0 = 3 . 0 5 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 * : T h e d a t a ( a , b , c , d ) c o r r e s p o n d t o e x p e r i m e n t s w i t h e c h o t i m e s o f 2 2 4 ms f o r a , b a n d c , a n d 4 0 0 ms f o r d . 1 3 7 b y a b o u t t h r e e o r d e r s o f m a g n i t u d e . T h u s t h e s i g n a l a t 4 . 8 P P M i n F i g . 3 . 6 ( B ) i s p r o b a b l y d u e t o e x t r a c e l l u l a r w a t e r . A p r e v i o u s s t u d y o f t h e s p i n - s p i n r e l a x a t i o n o f w a t e r i n b a r n a c l e m u s c l e g a v e a c o m p o n e n t w i t h a T 2 o f 4 0 0 ms w h i c h w a s a l s o a t t r i b u t e d t o e x t r a c e l l u l a r w a t e r ( F o s t e r et al. , (127)). F u r t h e r e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e a s s i g n m e n t w a s o b t a i n e d f r o m d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s . P u l s e d f i e l d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a w e r e m e a s u r e d k e e p i n g A , t h e s e p a r a t i o n b e t w e e n t h e 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e s f i x e d a n d i n c r e m e n t i n g t h e g r a d i e n t . S p e c t r a o b t a i n e d f r o m s u b j e c t M a r e s h o w n i n F i g . 3 . 6 ( C ) a n d a n e n l a r g e d v i e w o f t h e 4 - 6 P P M r e g i o n i s s h o w n i n F i g . 3 . 6 ( D ) . T h e i n c r e a s e d r e l a t i v e i n t e n s i t y o f t h e l i p i d s i g n a l i s d u e t o t h e s h o r t e r T 2 o f t h e m a j o r i t y o f t h e w a t e r . T h e d e c r e a s e i n t h e a m p l i t u d e o f t h e s i g n a l s a s t h e g r a d i e n t i s i n c r e a s e d i s d u e t o t h e e f f e c t o f d i f f u s i o n . T h e w a t e r s i g n a l a t 4 . 5 P P M d e c a y s m o r e q u i c k l y a n d r e f l e c t s t h e h i g h e r m o b i l i t y . G r a p h s s h o w i n g t h e d e c a y o f t h e w a t e r a n d f a t s i g n a l s f o r s p i n e c h o t i m e s o f 2 2 4 ms a n d 4 0 0 ms a r e s h o w n i n F i g . 3 . 8 . T h e s t r a i g h t l i n e s a r e t h e b e s t f i t b y l i n e a r l e a s t s q u a r e s a n a l y s i s . E x c e p t f o r t h e f i r s t f e w p o i n t s i n F i g . 3 . 8 ( C ) , f o r w a t e r a t e c h o t i m e 4 0 0 m s , a l l o f t h e d a t a a r e n e a r l y o n t h e l i n e s . T h e r e i s n o a p p a r e n t e f f e c t o f b u l k f l o w w h i c h w o u l d c a u s e o s c i l l a t o r y b e h a v i o u r . A l l o f t h e m o t i o n s a r e d i f f u s i v e . D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s f r o m r e p e t i t i o n s o f t h e s e e x p e r i m e n t s , t h r e e w i t h e c h o t i m e 2 2 4 ms a n d o n e a t 4 0 0 m s , 137A F i g . 3 . 8 ( A ) D e c a y o f t h e w a t e r s i g n a l f r o m p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a a c q u i r e d w i t h g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n , 6 , o f 12 ms a n d e c h o t i m e 0 . 2 2 4 s . D a t a a r e s h o w n f o r t w o s e p a r a t e e x p e r i m e n t s ( 0 a n d x ) a n d t h e e f f e c t i v e z - g r a d i e n t i n c r e m e n t i s 1 . 8 4 m T m " 1 . ( B ) D e c a y o f w a t e r ( x ) a n d l i p i d ( 0 ) s i g n a l s f r o m in-vivo, p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a o f h u m a n f o r e a r m a c q u i r e d w i t h t h e s a m e e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s a s i n ( A ) . ( C ) D e c a y o f w a t e r ( • ) a n d l i p i d ( 0 0 ) s i g n a l s f r o m p u l s e d g r a d i e n t s p i n e c h o s p e c t r a o f h u m a n f o r e a r m a c q u i r e d w i t h g r a d i e n t p u l s e d u r a t i o n , 6 , o f 20 ms a n d e c h o t i m e 0 . 4 s . C a l i b r a t i o n d a t a ( 0 0 ) u s i n g w a t e r g a v e a n e f f e c t i v e g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 5 3 m T m " 1 . 139 a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 3 . 3 . O n e o f t h e m e a s u r e m e n t s w i t h e c h o t i m e 2 2 4 ms w a s o f s u b j e c t F a n d t h e r e m a i n d e r w e r e o f s u b j e c t M . T h e m e a s u r e m e n t s a t e c h o t i m e 2 2 4 ms g a v e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f a b o u t 2 . 2 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 w h i c h i s s m a l l e r t h a n t h a t o f n o r m a l w a t e r a t 37 ° C , 3 . 0 5 X 1 0 " 9 m 2 s _ 1 (11), b y a f a c t o r o f 0 . 7 . T h i s r e d u c t i o n m a y b e c o m p a r e d w i t h t h a t o b s e r v e d f o r t h e d i f f u s i o n o f i n t r a c e l l u l a r w a t e r i n e x c i s e d f r o g m u s c l e , 0 . 6 - 0 . 6 6 (132-134), a n d i n b a r n a c l e m u s c l e 0 . 5 - 0 . 6 (92). F r o m t h e m e a s u r e m e n t w i t h e c h o t i m e , 4 0 0 m s , a l a r g e r d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t f o r w a t e r w a s o b t a i n e d , 3 . 5 x 1 0 " 9 m 2 s " 1 . T h e i n c r e a s e i n d i f f u s i o n r a t e i s a n i n d i c a t i o n t h a t t h e r e m a y b e r a n d o m i z e d f l o w . F r o m t h e d a t a i n T a b l e 3 . 3 , a n d u s i n g E q . [ 2 . 8 1 ] , t h e c o n t r i b u t i o n d u e t o n o r m a l d i f f u s i o n i s 5 . 5 x 1 0 " 1 0 m 2 s " 1 a n d t o r a n d o m i z e d f l o w i s 0 . 1 4 m m s " 1 . T h e e s t i m a t e d v a l u e f o r t h e r o o t - m e a n - s q u a r e d v e l o c i t y i s l e s s t h a n w o u l d b e e x p e c t e d f o r b l o o d f l o w i n c a p i l l a r i e s , 0 . 3 3 m m s - 1 , b u t w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e m a j o r p a r t o f t h e m o t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r w a t e r i s d u e t o r a n d o m i z e d f l o w . T h e c o n t r i b u t i o n d u e t o n o r m a l d i f f u s i o n c o r r e s p o n d s t o a r e d u c t i o n o f 0 . 2 c o m p a r e d t o t h e d i f f u s i o n o f n o r m a l w a t e r a n d s u g g e s t s t h a t a t e c h o t i m e s o f 0 . 1 - 0 . 2 s , t h e e x t r a c e l l u l a r w a t e r i s u n d e r g o i n g r e s t r i c t e d d i f f u s i o n . T h e l i p i d s g i v i n g r i s e t o NMR s i g n a l s a r e i n t r a c e l l u l a r f o r t h e f o l l o w i n g r e a s o n s . T h e q u a n t i t y o f f a t i n t h e b l o o d p l a s m a i s s m a l l ( T a b l e 3 . 4 , (135,136)), a n d s i n c e t h e T 2 o f 140 TABLE 3-4 Water content ref. Skeletal muscle 79-2 K-Diem 1970 Epidermis 64-5 K-Diem 1970 Blood plasma 93 P-L Altman 1973 T a b l e 3 . 4 N o r m a l t i s s u e w a t e r c o n t e n t i n a d u l t h u m a n s e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e p e r k i l o o f f a t - f r e e t i s s u e f r o m D i e m (135) a n d A l t m a n (136). 141 t h e l i p i d s i s l e s s t h a n t h a t o f e x t r a c e l l u l a r w a t e r , a n y c o n t r i b u t i o n f r o m e x t r a c e l l u l a r f a t w o u l d n o t b e d e t e c t a b l e u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e s e e x p e r i m e n t s . F u r t h e r m o r e i f t h e s i g n a l s w e r e d u e t o f a t i n t h e b l o o d p l a s m a , t h e e f f e c t o f r a n d o m i z e d f l o w s h o u l d c a u s e t h e d i f f u s i v i t y t o i n c r e a s e a s t h e e c h o t i m e i n c r e a s e d . I n s t e a d t h e d i f f u s i v i t y d e c r e a s e d i n d i c a t i n g r e s t r i c t e d m o t i o n . T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f t h e l i p i d s c a n b e e s t i m a t e d u s i n g t h e S t o k e s - E i n s t e i n e q u a t i o n . T a k i n g a s a t y p i c a l t r i g l y c e r i d e , t h e e s t e r w i t h t h r e e o l e i c a c i d m o l e c u l e s a t t a c h e d , t h e m o l e c u l a r v o l u m e i s e s t i m a t e d u s i n g v a n d e r W a a l s a t o m i c a n d g r o u p i n c r e m e n t s (113). T h e v a l u e o b t a i n e d i s 9 8 7 A 3 w i t h a c o r r e s p o n d i n g v a n d e r W a a l s r a d i u s o f 9 . 0 5 A . S i n c e t h e f a t i n t h e c y t o p l a s m f o r m s l i q u i d g l o b u l e s , t h e v i s c o s i t y o f o l i v e o i l a t 30 ° C , 50 c p (137), i s u s e d a s a r o u g h e s t i m a t e a n d t h e c a l c u l a t e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t i s 5 x 1 0 " 1 2 m 2 s - 1 . T h e o b s e r v e d v a l u e o f 6 . 5 7 x 1 0 " 1 0 m 2 s _ 1 i s 1 0 0 t i m e s l a r g e r . T h e i n c r e a s e d d i f f u s i v i t y m i g h t b e a t t r i b u t a b l e t o t h e e f f e c t s o f c y t o p l a s m i c s t r e a m i n g e n t r a i n i n g t h e f a t g l o b u l e s . T h i s w o u l d p r o d u c e r a n d o m m o t i o n o n t h e t i m e s c a l e o f t h e NMR e x p e r i m e n t . T h e s l i g h t d e c r e a s e i n d i f f u s i v i t y a s t h e e c h o t i m e i s i n c r e a s e d , c o n t r a r y t o t h e p r e d i c t i o n o f E q . 3 . 1 6 i s p r o b a b l y d u e t o r e s t r i c t e d m o t i o n i n s i d e t h e c e l l . T h e r o o t - m e a n - s q u a r e d d i s p l a c e m e n t f o r t h e o b s e r v e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t i s 17 um a n d 2 3 urn f o r e c h o t i m e s o f 0 . 2 2 4 a n d 0 . 4 s r e s p e c t i v e l y . T h e s e d i s t a n c e s a r e o f t h e s a m e o r d e r o f 1 4 2 t h e s i z e o f t h e g l o b u l e s t h a t w o u l d b e f o u n d i n a d i p o c y t e s . T h e e f f e c t i v e r o o t - m e a n - s q u a r e d v e l o c i t y i s 6 6 / z m s - 1 . M e a s u r e m e n t s o f c y t o p l a s m i c s t r e a m i n g i n p l a n t s h a v e g i v e n v a l u e s o f a b o u t 7 0 a m s ~ 1 (137) i n a f e w c a s e s , b u t s t r e a m i n g i n a n i m a l c e l l s i s r a r e l y f a s t e r t h a n 5 u r n s - 1 . F u r t h e r e x p e r i m e n t s w i l l b e r e q u i r e d t o c o n f i r m t h e s e o b s e r v a t i o n s . I V . NMR I M A G I N G A . I N T R O D U C T I O N T w o - a n d t h r e e - d i m e n s i o n a l p r o t o n m a g n e t i c r e s o n a n c e i m a g i n g i s c o m i n g i n t o i n c r e a s i n g u s e i n m e d i c a l d i a g n o s i s (1~4) o f s o f t t i s s u e d e f e c t s i n m a n . S p a t i a l r e s o l u t i o n f r o m a w h o l e b o d y s c a n n e r , q u o t e d t w o y e a r s a g o (3) a s a t b e s t 5 mm 3 o n a v o l u m e b a s i s , t o d a y c a n s o m e t i m e s b e b e t t e r t h a n 1 mm i n - p l a n e i n a s l i c e t h i c k n e s s a b o u t 2 mm. F o r b i o l o g i c a l s t u d i e s o f s m a l l e r s a m p l e s , t h e r e i s c o n s i d e r a b l e c u r r e n t i n t e r e s t i n i m p r o v i n g s p a t i a l r e s o l u t i o n , s a y t o 0 . 1 mm f o r p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s s u c h a s w a t e r t r a n s p o r t i n p l a n t s , o r t o 10 txm o r b e t t e r f o r a w i d e r r a n g e o f a p p l i c a t i o n s i n d e v e l o p m e n t a l b i o l o g y . R e c e n t i m a g e s (59,139) o f b i o l o g i c a l s a m p l e s s h o w i d e n t i f i a b l e s u b s t r u c t u r e s o f 0 . 1 - 0 . 2 mm d i m e n s i o n s . H e r e , we u s e t h e t e r m " s p a t i a l r e s o l u t i o n " t o m e a n t h i s q u a n t i t y . N u m b e r s f r o m 10 t o 2 0 Mm i n (59,139) a r e p i x e l s i z e s , s h o w i n g t h a t t h e d i s p l a y c a p a b i l i t y o f t h e c o m p u t e r s y s t e m e x c e e d s t h e s p a t i a l r e s o l u t i o n o f t h e d a t a , a s i t s h o u l d . T h e m a p p i n g o f t h e d i s t r i b u t i o n i s a c h i e v e d b y a p p l y i n g g r a d i e n t s a s d e s c r i b e d i n c h a p t e r I I . W h i l e T , a n d T 2 c o n t r a s t e d i m a g i n g c a n p r o v i d e s u b s t a n t i a l i n f o r m a t i o n , a n d m u c h e f f o r t h a s b e e n d i r e c t e d a t m a n i p u l a t i n g t h e s e p a r a m e t e r s (1-4), o t h e r p a r a m e t e r s s u c h a s c h e m i c a l s h i f t a n d d i f f u s i o n a r e a l s o p o t e n t i a l l y u s e f u l . 143 1 44 I n t h i s c h a p t e r , t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d a p p a r a t u s a n d t e c h n i q u e s f o r i m a g i n g a r e u s e d t o m a p p r o t o n d i s t r i b u t i o n s i n p u p a e o f t h e D o u g l a s f i r c o n e m o t h , Barbara colfaxiana ( s e c t i o n B ) a n d i n r e p r o d u c t i v e c a p s o f t h e m a r i n e a l g a , Acetabularia mediterranea ( s e c t i o n C ) . B . BARBARA COLFAXIANA 1 . I N T R O D U C T I O N A l t h o u g h NMR c a n b e u s e d t o s t u d y a n y i n s e c t s p e c i e s , p h a r a t e a d u l t s o f t h e D o u g l a s - f i r c o n e m o t h , Barbara colfaxiana ( L e p i d o p t e r a : O l e t h r e u t i d a e ) , a r e p a r t i c u l a r l y s u i t e d t o p r o t o n NMR ( 1 H ~ N M R ) s t u d i e s b e c a u s e t h e y h a v e m o r e t h a n t w o s e p a r a t e c o m p a r t m e n t s c o n t a i n i n g a q u e o u s f l u i d s ( h a e m o l y m p h a n d m o u l t i n g f l u i d s ) a s w e l l a s l i p i d r e s e r v e s (140)^3. T h e a p p l i c a t i o n o f ' H - N M R i m a g i n g t o t h e s t u d y o f t h e s e a n i m a l s h a s a l l o w e d t h e in-vivo o b s e r v a t i o n o f t h e s e d i s c r e t e f l u i d b o d i e s f o r t h e f i r s t t i m e . I n t h e c o u r s e o f t h e s e e x p e r i m e n t s i t w a s f o u n d t h a t B. colfaxiana p h a r a t e a d u l t s r e s p o n d e d d i f f e r e n t l y t o t h e t w o o p p o s i n g p r i n c i p a l o r i e n t a t i o n s w i t h r e s p e c t t o g r a v i t y , h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s " h e a d - u p " a n d " h e a d - d o w n " . 1 3 T h e t e r m " p h a r a t e " a d u l t i s u s e d t o d e s c r i b e t h e s t a g e o f i n s e c t d e v e l o p m e n t i n w h i c h t h e d e v e l o p i n g a d u l t i s w i t h i n t h e p u p a l c u t i c l e a n d s e p a r a t e d f r o m i t b y m o u l t i n g f l u i d . U s e d i n t e r c h a n g e a b l y i n t h i s p a p e r a r e t h e t e r m s " p h a r a t e a d u l t " , " p u p a e " , " i n s e c t " a n d " a n i m a l " , t h e y a r e u s e d t o d e s c r i b e t h i s s a m e d e v e l o p m e n t a l s t a g e . " P u p a e " i s u s e d m o s t o f t e n a s t h i s t e r m i s t h e m o s t d e s c r i p t i v e o f t h e e x t e r n a l c h a r a c t e r i s t i c s . 1 4 5 Barbara colfaxi ana d a m a g e s c o n e s a n d s e e d s o f D o u g l a s - f i r , Pseudotsuga menziesii ( M i r b . ) , F r a n c o , i n b o t h n a t u r a l s t a n d s a n d s e e d o r c h a r d s . T h i s i n s e c t e x h i b i t s a d i a p a u s e t h a t s p a n s o n e , t w o , o r m o r e w i n t e r s (141-144). T h e d i a p a u s e o c c u r s i n t h e p h a r a t e a d u l t s t a g e , b u t t h e e x t e r n a l c h a r a c t e r i s t i c s a r e t h o s e o f a p u p a (140). I n s e c t s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e c o n t a i n e d i n s i d e D o u g l a s - f i r c o n e s c o l l e c t e d n e a r K e r e m e o s , B r i t i s h C o l u m b i a . T h e y w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y D r . J o h n F . M a n v i l l e o f t h e P a c i f i c F o r e s t r y C e n t r e ( C a n a d i a n F o r e s t r y S e r v i c e , V i c t o r i a , B . C . ) 2 . E X P E R I M E N T A L C o n e s w e r e s t o r e d i n u n h e a t e d s h e d s u n t i l b o t h l i g h t ( w i l l n o t e c l o s e n e x t s p r i n g ) a n d d a r k ( w i l l e m e r g e n e x t s p r i n g ) p u p a e w e r e e x t r a c t e d f r o m t h e i r c o n e s a n d e x a m i n e d d u r i n g t h e m o n t h s o f N o v e m b e r , 1 9 8 4 a n d A p r i l , 1 9 8 5 . A l l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n i n d i v i d u a l p u p a e . T h e p r e f e r r e d n a t u r a l o r i e n t a t i o n o f t h e s e p u p a e i n s i d e D o u g l a s - f i r c o n e s i s h e a d u p p e r m o s t w i t h t h e b o d y a t + 1 5 t o 20 d e g r e e s f r o m h o r i z o n t a l ( J . M a n v . i l l e , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . 1 H - N M R s p e c t r a a n d NMR i m a g e s o f i n d i v i d u a l p u p a e w e r e r u n u s i n g t h e s a m e 6 . 3 T m a g n e t a n d i m a g i n g h a r d w a r e a s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2 . T h e 9 0 ° - p u l s e w a s 18 us a n d e i g h t t r a n s i e n t s w e r e u s e d . E x p e r i m e n t s w e r e d o n e a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e ( 2 1 - 2 4 ° C ) . T h e p u p a e w e r e m a i n t a i n e d i n a v e r t i c a l p o s i t i o n i n s i d e a 5 mm NMR t u b e u s i n g a 3 mm i . d . g l a s s t u b e . T h e p u p a e w e r e h e l d a t t h e c e n t e r o f t h e r f c o i l 1 4 6 b y s m a l l p i e c e s o f t i s s u e p a p e r p l a c e d i n t h e b o t t o m o f t h e NMR t u b e . T h e p u p a e w e r e e x a m i n e d i n b o t h t h e h e a d - u p ( H / U ) a n d t h e h e a d - d o w n ( H / D ) o r i e n t a t i o n s . P r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e s h o w n i n F i g . 2 . 5 . A l l in vivo NMR s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d o n w h o l e i n s e c t s . T h e e n t i r e a n i m a l (3 b y 7 mm) w a s w e l l w i t h i n t h e s e n s i n g f i e l d o f t h e r f c o i l ; a r t i f a c t s o f i n c o m p l e t e a n i m a l e x p o s u r e w e r e t h u s p r e c l u d e d . 3 . R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N T h e p r o t o n NMR s p e c t r a o f t w o p u p a e , f o r t h e h e a d - u p a n d h e a d - d o w n o r i e n t a t i o n s a r e s h o w n i n F i g . 4 . 1 . T h e s p e c t r a s h o w s i g n a l s a t a b o u t 1 P P M a n d 4 . 8 P P M d u e t o l i p i d a n d w a t e r p r o t o n s r e s p e c t i v e l y . S p e c t r a o b t a i n e d w i t h t h e p u p a e i n t h e h e a d - u p o r i e n t a t i o n a l s o s h o w a n i n c r e a s e d d i s p e r s i o n a n d s p l i t t i n g w h i c h i s m o r e p r o n o u n c e d f o r t h e w a t e r p e a k . T h e o r i e n t a t i o n a l d i f f e r e n c e s i n t h e p r o t o n s p e c t r a w e r e r e v e r s i b l e , a n d w e r e c o n s i s t e n t f o r a l l v i a b l e p u p a e — o v e r 5 0 i n d i v i d u a l s f r o m t w o s i t e s , c o l l e c t e d o v e r t w o y e a r s ; f o r b o t h l i g h t a n d d a r k , m a l e a n d f e m a l e i n d i v i d u a l s . T h e s p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s d e t e r m i n e d f r o m a n o t h e r p u p a i n t h e h e a d - u p o r i e n t a t i o n w e r e 1 . 2 a n d 0 . 4 s f o r t h e w a t e r a n d l i p i d p r o t o n s r e s p e c t i v e l y ( F i g . 4 . 2 ) . T h e d e c a y o f t h e w a t e r s i g n a l i n a H a h n e c h o e x p e r i m e n t w i t h e c h o t i m e s r a n g i n g f r o m 2 ms t o 1 2 0 m s , s h o w e d m u l t i - e x p o n e n t i a l b e h a v i o u r ( F i g . 4 . 3 ) s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f t w o d i s t i n c t w a t e r c o m p o n e n t s w i t h s p i n - s p i n A B T—I—I— i — i — r 10 5 0 10 5 0 Chemical shift (PPM) 4 . 1 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a o f p u p a e o f Barbara colfaxiana f o r t h e h e a d - u p a n d h e a d - d o w n o r i e n t a t i o n s . 147A F i g . 4 . 2 P r o t o n s p e c t r a ( A ) a n d g r a p h s o f p e a k h e i g h t v i r e c o v e r y t i m e f o r w a t e r ( B ) a n d l i p i d ( C ) f r o m i n v e r s i o n - r e c o v e r y s p e c t r a o f Barbara colfaxiana. T h e r e c o v e r y t i m e s v a r i e d f r o m 7 , 1 2 , 1 7 , 2 2 , 3 2 , 4 2 , 5 2 , 7 7 , 1 0 2 , 1 5 2 , 2 0 2 , 2 5 2 a n d 4 0 2 m s , 1 . 0 , 1 . 4 , 1 . 8 , 2 . 2 , 2 . 6 a n d 3 . 0 s . U s i n g t h r e e p a r a m e t e r f i t s , t h e T , v a l u e s w e r e 1 . 2 ± 0 . 1 a n d 0 . 4 ± 0 . 0 4 s f o r w a t e r a n d f a t r e s p e c t i v e l y . 148 Recovery time (s) 148A F i g . 4 . 3 P r o t o n s p e c t r a ( A ) a n d p l o t o f p e a k h e i g h t V J e c h o t i m e f o r w a t e r ( B ) a n d l i p i d ( C ) f r o m H a h n e c h o s p e c t r a o f Barbara colfaxiana. T h e e c h o t i m e s v a r i e d f r o m 2 , 4 , 8 , 1 2 , 1 6 , 2 0 , 2 4 , 3 0 , 3 6 , 4 4 , 5 2 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 0 , 1 0 0 , 1 1 0 a n d 120 m s . T h e d e c a y o f t h e w a t e r s i g n a l g i v e t w o s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s , 21 a n d 5 5 m s , c o r r e s p o n d i n g t o 7 3 % a n d 27 % o f t h e i n i t i a l s i g n a l a n d t h e l i p i d s i g n a l g a v e a T 2 o f 19 m s . 1 1 1 1— 10 5 0 -5 Chemical shift (PPM) B 0 005 0-1 Echo Time (2t,s) 3 < c 0 005 Echo time 1 5 0 r e l a x a t i o n t i m e s 21 a n d 5 5 m s , a n d c o r r e s p o n d i n g t o 7 3 a n d 2 7 % o f t h e o b s e r v e d s i g n a l r e s p e c t i v e l y . T h e T 2 o f t h e l i p i d p r o t o n s w a s 19 m s . T h e o b s e r v e d l i n e w i d t h s a t h a l f h e i g h t , 2 8 0 H z f o r w a t e r p r o t o n s a n d 2 3 5 H z f o r l i p i d p r o t o n s , a r e m u c h l a r g e r t h a n w o u l d b e e x p e c t e d f r o m t h e m e a s u r e d s p i n - s p i n r e l a x a t i o n t i m e s , 15 H z a n d 17 H z r e s p e c t i v e l y . T h i s s u g g e s t s t h a t m a g n e t i c f i e l d i n h o m o g e n e i t y i s t h e m a j o r f a c t o r d e t e r m i n i n g t h e l i n e s h a p e a n d l i n e w i d t h . T h e NMR s p e c t r u m o f h a e m o l y m p h t a k e n f r o m a p u p a u s i n g a m i c r o p i p e t i s s h o w n i n F i g . 4 . 4 . T h e n a r r o w l i n e o b s e r v e d i s f u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h e b r o a d e n i n g o f t h e l i n e s in-vivo i s d u e t o i n h o m o g e n e i t y . T h e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r a n d l i p i d a l o n g t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n o f a h e a l t h y p u p a , o b t a i n e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e o f F i g . 2 . 5 , f o r t h e h e a d - u p a n d h e a d - d o w n o r i e n t a t i o n s i s s h o w n i n F i g . 4 . 5 . C o m p a r i s o n o f t h e d i s t r i b u t i o n s s h o w s t h a t t h e l i p i d r e s e r v e s a r e l o c a t e d m a i n l y i n t h e a b d o m e n i n b o t h o r i e n t a t i o n s . T h e a q u e o u s f l u i d s i n t h e u p p e r a n d l o w e r p a r t s o f t h e p u p a a r e q u i t e w e l l s e p a r a t e d a n d p r o b a b l y c o r r e s p o n d t o t h e t w o c o m p o n e n t s p r o p o s e d p r e v i o u s l y t o e x p l a i n t h e T 2 d a t a . C o m p a r i s o n o f t h e p r o t o n s p e c t r a w i t h t h e d i s t r i b u t i o n m a p s s h o w s t h a t t h e c h a n g e s i n t h e s p e c t r a p r o d u c e d b y t h e i n v e r s i o n o f t h e p u p a e , a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e r e d i s t r i b u t i o n o f t h e f l u i d s b e t w e e n d i f f e r e n t p a r t s o f t h e p u p a e . T h e r e s o n a n c e f r e q u e n c i e s o f t h e w a t e r a n d l i p i d p r o t o n s v a r y c o n t i n u o u s l y b e t w e e n t h e u p p e r a n d l o w e r p a r t s 151 ~~1 1 1 10 5 0 Chemical Shift (PPM) F i g . 4 .4 N o r m a l p r o t o n s p e c t r u m o f h a e m o l y m p h e x t r a c t e d f r o m a p u p a o f Barbara colfaxi ana. T S P ( S o d i u m 3 -t r i m e t h y l s i l y l p r o p i o n a t e ) w a s a d d e d a s a r e f e r e n c e . 151A F i g . 4 . 5 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a a n d p r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s a l o n g t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n o f a l i v e Barbara colfaxiana p u p a i n t h e " h e a d - u p " a n d " h e a d - d o w n " o r i e n t a t i o n s . T h e m a p s w e r e a c q u i r e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e o f F i g . 2 . 5 w i t h z - g r a d i e n t i n c r e m e n t 1 . 2 m T m - 1 a n d p h a s e e n c o d i n g t i m e 2 m s , e c h o t i m e , 16 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y , 1 s . T h e f i e l d o f v i e w w a s 1 . 0 c m o f w h i c h 0 . 8 6 c m w e r e d i s p l a y e d . T h e r e w e r e 1 2 8 g r a d i e n t i n c r e m e n t s o f f o u r a c q u i s i t i o n s a n d t h e t o t a l t i m e f o r t h e e x p e r i m e n t w a s a b o u t 17 m i n u t e s . Down "T" 15 10 0 T •5 Chemical shift (PPM) Up T" 15 ~T~ 10 T" 5 0 -5 Chemical shift (PPM) 1 5 3 o f t h e p u p a . S i n c e b o t h t h e w a t e r a n d l i p i d r e s o n a n c e s a r e a f f e c t e d i n t h e s a m e w a y , t h e v a r i a t i o n may b e a t t r i b u t e d t o c o r r e s p o n d i n g c h a n g e s i n m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y . T h i s i s m o r e c l e a r l y s e e n i n t h e p r o t o n d i s t r i b u t i o n m a p s ( F i g . 4 . 6 ) o b t a i n e d f r o m a n o t h e r p u p a , w h i c h w a s r e m o v e d f r o m a c o n e s e v e r a l w e e k s b e f o r e t h e e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d . T h e p r o t o n s p e c t r u m f o r t h i s p u p a i n t h e h e a d - u p o r i e n t a t i o n a l s o s h o w s a n u n u s u a l d e g r e e o f s p l i t t i n g a n d a c o r r e s p o n d i n g f e a t u r e a t 0 . 4 c m a n d 5 P P M i s o b s e r v e d i n t h e p r o t o n m a p . A s i m i l a r f e a t u r e b u t w i t h l e s s i n t e n s i t y i s a l s o o b s e r v e d i n t h e p r o t o n m a p f o r t h e h e a d - d o w n o r i e n t a t i o n ( F i g . 4 . 6 ( A ) ) . T h e r e s o n a n c e f r e q u e n c i e s o f t h e p r o t o n s i n t h e 0 . 5 t o 3 . 5 c m r e g i o n f o r t h e h e a d - u p o r i e n t a t i o n ( F i g . 4 . 6 ( B ) ) a l s o s h o w a l a r g e r d e g r e e o f v a r i a b i l i t y c o m p a r e d t o t h a t o b s e r v e d i n t h e p r e v i o u s m a p ( F i g . 4 . 5 ( B ) ) . T h e s e d i f f e r e n c e s s u g g e s t a n i n c r e a s e d s p a t i a l h e t e r o g e n e i t y i n t h e p u p a o f F i g . 4 . 6 d u e t o a d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e o r t h a t t h e p u p a m a y b e d e a d . P r o t o n NMR s p e c t r a o f l i v e a n d d e a d p u p a e a r e s h o w n i n F i g . 4 . 7 ( A ) - ( D ) . T h e f i r s t p a i r o f s p e c t r a , ( A ) , s h o w a h e a l t h y p u p a w i t h t y p i c a l o r i e n t a t i o n a l r e s p o n s e s . T h e s p e c t r a i n ( B ) a n d ( C ) a r e o f t h e s a m e i n d i v i d u a l , t a k e n i m m e d i a t e l y ( B ) , a n d t h e n t w e n t y m i n u t e s ( C ) a f t e r a t w o m i n u t e i n m e r s i o n i n l i q u i d n i t r o g e n . T h e c h a n g e i n t h e s p e c t r a i n ( C ) w i t h i n v e r s i o n o f t h e p u p a i s s m a l l e r t h a n t h a t i n ( A ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e h a e m o l y m p h i s p a r t l y d e t e r m i n e d b y t h e p u p a ' s h e a r t . T h e 153A F i g . 4.6 Normal proton s p e c t r a and proton d i s t r i b u t i o n maps along the a n t e r o - p o s t e r i o r d i r e c t i o n of a Barbara colfaxiana pupa, s e v e r a l weeks a f t e r h a r v e s t i n g , in the "head-up" and "head-down" o r i e n t a t i o n s . The map was a c q u i r e d with the pul s e sequence of F i g . 2.5 with a z - g r a d i e n t increment of 1.2 mTm"1 with phase encoding time of 2 ms, and echo time 24 ms. The f i e l d of view was 0.96 cm of which 0.68 cm are shown. Four a c q u i s t i o n s were used for each of the 128 g r a d i e n t increments and the t o t a l time f o r the experiment was about 17 minutes. 155 T 1 1 — T 1 r 10 5 0 10 5 0 Chemical shift (PPM) 1 1 1 I I I 10 5 0 10 5 0 Chemical shift ( PPM) F i g . 4 . 7 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a o f a Barbara colfaxiana p u p a b e f o r e ( A ) a n d a f t e r i m m e r s i o n ( B ) i n l i q u i d n i t r o g e n , a n d t w e n t y m i n u t e s l a t e r ( C ) . S p e c t r a i n (D ) a r e o f a p u p a w h i c h d i e d o f f u n g a l i n f e c t i o n . 1 5 6 f o u r t h p a i r o f s p e c t r a , ( D ) , a r e o f a p u p a t h a t d i e d o f a f u n g a l i n f e c t i o n , a n d t h e r e d u c e d s i g n a l t o n o i s e r a t i o i n d i c a t e s a l o s s o f b o d y f l u i d s ; o r i e n t a t i o n a l c h a n g e s w e r e n o t o b s e r v e d f o r t h i s i n d i v i d u a l . I n c o n c l u s i o n , c h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d i m a g i n g h a s b e e n u s e d t o m a p t h e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r a n d l i p i d a l o n g t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n o f B. colfaxiana p h a r a t e a d u l t s . T h e s e m a p s s h o w t h a t t h e a q u e o u s f l u i d s , c o n s i s t i n g m o s t l y o f h a e m o l y m p h , w e r e r e d i s t r i b u t e d w h e n t h e v e r t i c a l o r i e n t a t i o n o f t h e p u p a e w a s c h a n g e d . V a r i a t i o n s i n t h e r e s o n a n c e f r e q u e n c i e s o f t h e p r o t o n s p r o b a b l y d u e t o c o r r e s p o n d i n g d i f f e r e n c e s i n m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y p r o v i d e d a n i n d i c a t o r o f s p a t i a l h e t e r o g e n e i t y . C . ACETABULARIA MEDITERRANEA 1 . I N T R O D U C T I O N Acetabularia mediterranea i s a n u n u s u a l l y l a r g e s i n g l e - c e l l e d , m a r i n e g r e e n a l g a . O v e r s e v e r a l m o n t h s i t d e v e l o p s , l a r g e l y b y t i p g r o w t h , i n t o a c y l i n d r i c a l c e l l u p t o 4 c m l o n g a n d 4 0 0 um i n d i a m e t e r . A t t h e c u l m i n a t i o n o f i t s v e g e t a t i v e g r o w t h , t h e c e l l p r o d u c e s a t i t s u p p e r e x t r e m i t y a d i s c o i d c a p , a b o u t 8 mm i n d i a m e t e r a n d w i t h 4 0 - 7 0 r a y s . E a c h r a y i s a b o u t 4 0 ym w i d e w h e r e i t l e a v e s t h e c e n t r a l s t e m , a n d b r o a d e n s t o 4 0 0 um a t t h e p e r i p h e r y . When t h e c a p i s f u l l y f o r m e d , t h e r a y s a t f i r s t c o n t a i n c o n t i n u o u s c y t o p l a s m w i t h m a n y c h l o r o p l a s t s . T h e s i n g l e 157 n u c l e u s , a t t h e l o w e r e x t r e m i t y o f t h e c e l l , t h e n d i v i d e s a n d n u m e r o u s d a u g h t e r n u c l e i p o p u l a t e t h e c a p r a y s . E a c h o f t h e s e , t o g e t h e r w i t h c h l o r o p l a s t s a n d c y t o p l a s m , b e c o m e s e n c y s t e d i n a s p h e r i c a l c y s t w i t h a h e a v y c e l l u l o s i c w a l l . T h e n u c l e i d i v i d e f u r t h e r , a n d t h e u l t i m a t e d a u g h t e r s a r e m e m b r a n e - e n c l o s e d t o f o r m b i f l a g e l l a t e g a m e t e s . A l l t h e l i v i n g m a t e r i a l i s b u n d l e d i n t o t h e r a t h e r c r o w d e d a r r a y s o f m u l t i m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s i n t h e c y s t s ; o u t s i d e , t h e r e i s o n l y a q u e o u s s o l u t i o n . W a t e r i n s i d e t h e c y s t s i s l i k e l y t o d i f f e r f r o m t h a t o u t s i d e i n w a y s w h i c h a f f e c t t h e v a r i o u s p a r a m e t e r s w h i c h g o v e r n s e n s i t i v i t y i n p r o t o n m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y . W i t h o u t d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y o f d i f f e r e n t w a t e r t y p e s , t h e c a p w o u l d b e a v e r y l o w c o n t r a s t o b j e c t f o r NMR i m a g i n g ; i t h a s n o d r y r e g i o n s . C a p s v a r y s u b s t a n t i a l l y i n s h a p e , f r o m c u p - s h a p e d t o u m b r e l l a - s h a p e d . I t i s p o s s i b l e t o s e l e c t m a n y w h i c h a r e m o r e o r l e s s f l a t , a s w a s d o n e i n t h i s w o r k . I m a g i n g t h e n n e e d s n o s l i c e s e l e c t i o n a n d c a n b e a c h i e v e d t w o - d i m e n s i o n a l l y i n t h e p l a n e o f t h e d i s c ( x y p l a n e ) w i t h n o z - a x i s s p a t i a l d i s c r i m i n a t i o n , b y p r o j e c t i n g t h e t o t a l w a t e r s i g n a l i n t o t h e x y p l a n e . T h e e f f e c t i v e s p a t i a l r e s o l u t i o n c a n b e e s t i m a t e d b y c o m p a r i s o n o f t h e NMR i m a g e w i t h a n o r d i n a r y p h o t o g r a p h , t a k e n i n t h e d i s s e c t i n g m i c r o s c o p e . T h e c e l l s u s e d i n t h i s w o r k a r e f r o m s p e c i m e n s o r i g i n a l l y c o l l e c t e d i n t h e B a y o f N a p l e s , a n d m a i n t a i n e d i n c u l t u r e f o r m a n y g e n e r a t i o n s , f i r s t i n E u r o p e , t h e n i n t h e 1 5 8 l a b o r a t o r y o f D r . B . R . G r e e n ( B o t a n y , U B C ) a n d c u r r e n t l y i n t h e l a b o r a t o r y o f D r . L . G . H a r r i s o n ( C h e m i s t r y , U B C ) . T h e y a r e k e p t i n a r t i f i c i a l s e a - w a t e r (145,146) / c a l l e d ( S h e p a r d ' s m e d i u m ) a t 2 0 ° C i n g r o w t h c h a m b e r s l i t a t 3 0 0 - 5 0 0 f t - c a n d l e s o n a 1 2 : 1 2 l i g h t : d a r k c y c l e . F o r i m a g i n g , c a p s w e r e c u t o f f t h e s t a l k s a n d k e p t i n S h e p a r d ' s m e d i u m f o r u p t o s e v e r a l d a y s . 2 . E X P E R I M E N T A L I m a g e s w i t h T 2 c o n t r a s t i n g w e r e o b t a i n e d b y i n c r e a s i n g t h e e c h o t i m e w h i l s t t h e i n v e r s i o n - r e c o v e r y m e t h o d w a s u s e d f o r T , c o n t r a s t . D i f f u s i o n c o n t r a s t i n g r e q u i r e s t w o g r a d i e n t p u l s e s t o b e a p p l i e d e q u a l l y b e f o r e a n d a f t e r t h e 1 8 0 ° p u l s e ( F i g 2 . 8 ) a n d t h i s w a s a c h i e v e d c o n v e n i e n t l y u s i n g t h e z g r a d i e n t , w h i c h w a s n o t u s e d d i r e c t l y i n t h e i m a g i n g . E x p e r i m e n t s w e r e d o n e o n c a p s w h i c h w e r e s e v e r e d f r o m t h e s t a l k . F o r m a t u r e c a p s , t h e w o u n d a t t h e c e n t r e p r o b a b l y n e v e r h e a l s . W a t e r i n s i d e t h e o u t e r e n v e l o p e o f t h e c a p , b u t o u t s i d e t h e c y s t s , i s t h e n d i r e c t l y i n c o n t a c t w i t h , t h e s u r r o u n d i n g m e d i u m . T h e c a p s w e r e k e p t i n S h e p a r d ' s m e d i u m . F o r i m a g i n g , t h e y w e r e r e m o v e d f r o m t h e m e d i u m a n d m o u n t e d o n t h e e n d o f a g l a s s t u b e w h i c h w a s t h e n p l a c e d i n t h e m a g n e t . C o n t a c t o f t h e e n d o f t h i s t u b e w i t h t h e s a m p l e i s i m a g e d f a i n t l y i n F i g s . 4 . 1 0 ( B ) a n d v e r y c l e a r l y , a s a c o m p l e t e c i r c l e o f 5 mm O . D . , i n F i g . 4 . 1 2 ( A ) . M o u n t i n g o f t h e s a m p l e i n t h e m a g n e t t o o k o n l y a f e w m i n u t e s . D a t a a c q u i s i t i o n t o o k 17 m i n s f o r 1 2 8 x 128 p o i n t s 1 5 9 i n t h e i m a g e s s h o w n i n F i g s . 4 . 1 0 - 4 . 1 2 , u s i n g s i g n a l a v e r a g i n g o f f o u r c o m p l e t e r e p e a t s w i t h a 2 s r e l a x a t i o n d e l a y . S p e c i m e n s l o s t w a t e r d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a n d w e r e o f t e n r e t u r n e d t o t h e m e d i u m a n d u s e d a g a i n . T h e r e c o v e r y w a s i n c o m p l e t e a n d t h e c o n d i t i o n o f t h e c a p s d e t e r i o r a t e d w i t h r e p e a t e d r e m o v a l f r o m t h e m e d i u m . T h i s w a s m o s t c l e a r l y s e e n b y t h e i r r e s p o n s e t o b r i e f i m m e r s i o n i n S h e p a r d ' s m e d i u m m a d e w i t h D 2 0 . W a t e r i n t h e c y s t s o f a h e a l t h y s p e c i m e n d i d n o t e x c h a n g e w i t h t h e D 2 0 i n 5 m i n u t e s ( F i g . 4 . 1 0 ) ; b u t t h e i m a g e o f a s p e c i m e n w h i c h h a d p r e v i o u s l y b e e n u s e d s e v e r a l t i m e s v a n i s h e d a l m o s t c o m p l e t e l y a f t e r t h i s t r e a t m e n t . T h e s t a c k e d p l o t s r e q u i r e d l i t t l e c o m p u t e r t i m e a n d d e m o n s t r a t e d a n e f f e c t i v e r e s o l u t i o n n o b e t t e r t h a n 0 . 3 - 0 . 4 mm; t h e c o u n t o f r a y s w a s u s u a l l y s e v e r a l f e w e r t h a n t h o s e v i s i b l e i n a p h o t o m i c r o g r a p h o f t h e s a m p l e . T h e c o l o r - c o d e d i m a g e s r e q u i r e d m o r e c o m p u t e r t i m e a n d t h e b e s t c o n t r a s t e d e x a m p l e s g a v e t h e s a m e c o u n t o f r a y s a s t h e p h o t o m i c r o g r a p h . 3 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N P r o t o n s p e c t r a f o r o n e i m m a t u r e a n d t w o m a t u r e c a p s a r e s h o w n i n F i g . 4 . 8 . T h e s p i n - l a t t i c e ( T , ) a n d s p i n - s p i n ( T 2 ) r e l a x a t i o n t i m e s f o r m a t u r e c a p s w e r e a b o u t 0 . 5 8 s a n d 19 ms r e s p e c t i v e l y ( F i g . 4 . 9 ) . T h e s e v a l u e s a r e c o n s i s t e n t w i t h l i t e r a t u r e v a l u e s f o r i n t r a c e l l u l a r w a t e r (126,127). T h e l i n e w i d t h s o f a b o u t 1 . 8 K H z a r e a b o u t 1 0 0 t i m e s g r e a t e r t h a n w o u l d b e e x p e c t e d f r o m t h e v a l u e , 17 H z f r o m T 2 . T h i s 160 B i i 1 1 r -A - 2 0 2 A Frequency (KHz) i—r T—r - 6 -A -2 0 2 4 6 Frequency (KHz) i r i — r 6 -A -2 0 2 A 6 Frequency ( K H z ) F i g . 4 . 8 N o r m a l p r o t o n s p e c t r a f o r : ( A ) a n i m m a t u r e c a p ; ( B ) a n d ( C ) t w o m a t u r e c a p s , a c q u i r e d w i t h r e l a x a t i o n d e l a y 2 s a n d 4 c o m p l e t e r e p e a t s . 160A F i g . 4 . 9 P r o t o n s p e c t r a i n ( A ) a n d g r a p h o f i n t e n s i t y vs r e c o v e r y t i m e i n ( B ) f r o m a n i n v e r s i o n - r e c o v e r y NMR e x p e r i m e n t o n a m a t u r e A. med. c a p . T h e 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e s w e r e 13 a n d 27 MS r e s p e c t i v e l y , a n d t h e r e c o v e r y t i m e w a s v a r i e d f r o m 1 , 1 0 , 2 5 , 5 0 , 1 0 0 , 2 5 0 , 5 0 0 , t o 7 5 0 ms a n d t h e n f r o m 1 , 1 . 5 , 2 t o 2 . 5 s . T h e r e l a x a t i o n d e l a y w a s 10 s a n d t h e c a l c u l a t e d , T , w a s 0 . 5 8 s ± 0 . 0 5 s b y a t h r e e p a r a m e t e r f i t . H a h n e c h o s p e c t r a i n ( C ) a n d t h e c o r r e s p o n d i n g p l o t o f e c h o a t t e n u a t i o n vs e c h o t i m e ( D ) w h i c h v a r i e d f r o m 2 , 4 , 8 , 1 2 , 1 6 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 0 , 1 0 0 , a n d 1 1 0 m s . T h e c a l c u l a t e d T 2 i s 1 8 . 7 m s . 161 162 i n d i c a t e s t h a t i n h o m o g e n e o u s b r o a d e n i n g i s t h e m a j o r f a c t o r g o v e r n i n g t h e l i n e s h a p e w h i c h v a r i e d s i g n i f i c a n t l y f r o m o n e s a m p l e t o a n o t h e r . T h e l a t t e r w a s a c o n s e q u e n c e o f d i f f e r e n c e s i n t h e s a m p l e s a n d a l s o t h e p o s i t i o n i n g o n t h e s a m p l e h o l d e r . T h e p r o b a b l e c a u s e o f t h e i n h o m o g e n e i t y a r e g r a d i e n t s t h a t e x i s t a t i n t e r f a c e s d u e t o d i f f e r e n c e s i n d i a m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y . A p h o t o m i c r o g r a p h a n d a d e u t e r i u m - c o n t r a s t e d i m a g e , b y t h e 5 m i n u t e i m m e r s i o n i n D 2 0 , o f a m a t u r e c a p a r e s h o w n i n F i g . 4 . 1 0 . T h e 4 7 m a i n c l u m p s o f c y s t s w e r e s e r i a l l y n u m b e r e d a n d e v e r y r a y c o u l d b e i d e n t i f i e d a s p r e s e n t i n b o t h p i c t u r e s . A s t h e b u n d l e s o f c y s t s t a p e r t o w a r d s t h e c e n t r e o f t h e c a p a n d b r e a k u p i n t o " d o t t e d l i n e s " , i t c a n b e s e e n i n t h e i m a g e t h a t t h e " d o t s " b e c o m e c o n f u s e d w i t h s p u r i o u s n o i s e a t a b o u t t h e 0 . 1 mm l e v e l o f s p a t i a l r e s o l u t i o n . I n i m a g e s w i t h T , a n d T 2 c o n t r a s t ( F i g . 4 . 1 1 ) , i t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h e " r i d g e s " a r e t h e b u n d l e s o f c y s t s o r t h e s p a c e s b e t w e e n t h e m . A d i f f u s i o n c o n t r a s t e d i m a g e ( F i g . 4 . 1 2 ) w i t h z - g r a d i e n t p u l s e s o f 16 m T m - 1 a n d 4 ms l o n g , w i t h e c h o t i m e 31 ms s h o w e d s o m e c o r r e s p o n d e n c e ; t h e d e f e c t i v e p a i r o f r a y s a t " 9 o ' c l o c k " , w h i c h h a v e f a i l e d t o p r o d u c e c y s t s , a r e c l e a r l y v i s i b l e a s l o w - s i g n a l r e g i o n s i n b o t h t h e " n o r m a l " a n d t h e d i f f u s i o n - c o n t r a s t e d i m a g e . A " n o r m a l " i m a g e o f a c a p w i t h 2 5 6 x 2 5 6 p o i n t s i s s h o w n i n F i g . 4 . 1 3 . T h e r a y s a r e c l e a r l y r e s o l v e d i n t w o s e c t i o n s a n d p o o r l y i n t h e r e m a i n d e r o f t h e c a p . T h e u n e v e n i n t e n s i t y a n d r e s o l u t i o n m a y b e d u e t o t h e d r y i n g o f t h e c a p d u r i n g t h e 162A F i g . 4 . 1 0 ( A ) T o p p h o t o g r a p h : P h o t o m i c r o g r a p h o f a m a t u r e A. med. r e p r o d u c t i v e c a p . T h e d a r k p a t c h e s a r e b u n d l e s o f c y s t s c o n t a i n i n g e s s e n t i a l l y a l l t h e l i v i n g m a t e r i a l . ( B ) B o t t o m p h o t o g r a p h : P r o t o n m a g n e t i c r e s o n a n c e i m a g e o f t h e s a m e c a p , i n t h e s a m e o r i e n t a t i o n , a f t e r 5 m i n i m m e r s i o n i n a n a r t i f i c i a l s e a w a t e r m e d i u m m a d e w i t h D 2 0 . T h e i m a g e w a s a c q u i r e d w i t h a f i x e d y - g r a d i e n t o f 1 0 . 1 m T m " 1 w i t h d w e l l t i m e 2 2 M S , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 1 1 1 m T m " 1 w i t h p h a s e e n c o d i n g t i m e 2 m s , e c h o t i m e 7 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 2 s . C o l o u r - c o d i n g : d a r k i s l o w s i g n a l a m p l i t u d e ; l i g h t i s h i g h s i g n a l a m p l i t u d e . T h e i m a g e i s c o m p r i s e d o f 128 x 128 d a t a p o i n t s i n t e r p o l a t e d t o 2 5 6 x 2 5 6 f o r d i s p l a y . T h e v e r t i c a l l i n e i s a n i m a g e a r t i f a c t . T h e w h i t e a n d b l a c k l i n e s m a r k t h e s a m e f e a t u r e o f t h e p h o t o m i c r o g r a p h a n d t h e i m a g e r e s p t i v e l y . 163A F i g . 4 . 1 1 ( A ) T , - c o n t r a s t e d i m a g e o f a m a t u r e c a p o b t a i n e d u s i n g a n i n v e r s i o n p u l s e f o l l o w e d b y a r e c o v e r y t i m e o f 0 . 3 s . I m a g i n g p a r a m e t e r s w e r e a f i x e d y - g r a d i e n t o f 1 7 . 7 m T m " 1 w i t h d w e l l t i m e 14 M S , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 1 2 4 m T m " 1 w i t h p h a s e e n c o d i n g t i m e o f 2 m s , e c h o t i m e 6 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 2 s . ( B ) T 2 c o n t r a s t e d i m a g e o f a m a t u r e Acetabularia mediterranea c a p a c q u i r e d w i t h a f i x e d y - g r a d i e n t o f 151 m T m " 1 a n d d w e l l t i m e 16 MS, x - g r a d i e n t i n c r e m e n t 0 . 4 8 m T m " 1 a n d p h a s e e n c o d i n g t i m e 5 m s , e c h o t i m e 32 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y 2 s . T h e f i e l d o f v i e w w a s 0 . 9 7 c m i n b o t h t h e x a n d y d i r e c t i o n s . X-coordinate (cm) 164A F i g . 4 . 1 2 ( A ) I m a g e o f a m a t u r e c a p d i s p l a y e d a s 128 p l o t s o f s i g n a l i n t e n s i t y v e r s u s x - c o o r d i n a t e ( h o r i z o n t a l ) , s t a c k e d i n t h e y - d i r e c t i o n ( v e r t i c a l ) . T h e d a t a w e r e a c q u i r e d u s i n g a s p i n e c h o s e q u e n c e w i t h f i x e d y - g r a d i e n t o f 1 0 . 1 m T m " 1 a n d d w e l l t i m e 2 5 JUS, x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 1 2 6 m T m " 1 w i t h p h a s e e n c o d i n g t i m e o f 1 . 5 m s , e c h o t i m e 7 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 2 s . ( B ) X e r o g r a p h i c c o p y o f a p h o t o m i c r o g r a p h o f t h e s a m e c a p a s ( A ) a n d ( C ) , w i t h a s c a l e o f mm. ( C ) D i f f u s i o n - c o n t r a s t e d i m a g e o f t h e s a m e c a p i n t h e s a m e o r i e n t a t i o n . T h e d a t a w e r e a c q u i r e d w i t h a f i x e d y - g r a d i e n t o f 1 0 . 1 m T m " 1 w i t h d w e l l t i m e 24 M S , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 0 . 0 6 3 m T m " 1 w i t h p h a s e e n c o d i n g t i m e 4 m s , e c h o t i m e 31 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y 2 s . T h e z - g r a d i e n t p u l s e s o f 16 m T m " 1 w e r e 4 ms l o n g , s p a c e d 1 5 . 1 ms a p a r t , a n d a p p l i e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 9 0 ° a n d 1 8 0 ° p u l s e s . 165 165A F i g . 4 . 1 3 N o r m a l i m a g e o f Acelabularia mediterranea c a p a c q u i r e d u s i n g t h e p u l s e s e q u e n c e o f F i g . 2 . 3 w i t h f i x e d y - g r a d i e n t o f 151 m T m - 1 a n d d w e l l t i m e 16 M S , x - g r a d i e n t i n c r e m e n t o f 1 . 2 m T m " 1 a n d p h a s e e n c o d i n g t i m e o f 2 m s , e c h o t i m e 8 ms a n d r e l a x a t i o n d e l a y o f 2 s . T h e i m a g e c o n s i s t s o f 2 5 6 x 2 5 6 p o i n t s a n d t h e f i e l d o f v i e w w a s 0 . 9 7 cm a l o n g t h e x a n d y d i r e c t i o n s . 166 1 6 7 e x p e r i m e n t w h i c h l a s t e d 3 4 m i n u t e s . S i m i l a r i n t e n s i t y v a r i a t i o n s a r e o b s e r v e d i n t h e o t h e r i m a g e s b u t t o a l e s s e r e x t e n t b e c a u s e t h e e x p e r i m e n t a l t i m e i s l e s s . T h e s i g n a l t o n o i s e r a t i o i n n o r m a l i m a g e s , F i g s . 4 . 1 2 ( A ) a n d 4 . 1 3 , w a s a b o u t 2 5 . U l t i m a t e l y , t h e f a c t o r l i m i t i n g r e s o l u t i o n i s t h e t r a n s l a t i o n a l m o t i o n o f t h e s p i n s d u r i n g t h e i n t e r v a l s f o r p h a s e e n c o d i n g a n d f r e q u e n c y e n c o d i n g , a n d a l s o b e t w e e n t h o s e i n t e r v a l s . F o r t h e f r e q u e n c y e n c o d i n g g r a d i e n t o n l y m o t i o n d u r i n g t h e d e t e c t i o n p e r i o d i s i m p o r t a n t a n d t h e i n i t i a l y - g r a d i e n t p u l s e i n F i g . 2 . 2 c a n b e i g n o r e d . T h e p u l s e s e q u e n c e i n F i g . 2 . 2 m i n i m i z e d t h e s e i n t e r v a l s a n d f o r Acetabularia t i m e s o f 4 ms h a v e b e e n a c h i e v e d . T h e r o o t - m e a n - s q u a r e d d i s p l a c e m e n t f o r w a t e r o v e r t h a t i n t e r v a l i s 4 . 2 u m . I n c o n c l u s i o n , t w o d i m e n s i o n a l NMR i m a g e s o f m a t u r e c a p s o f Acetabularia medit erranea s h o w f e a t u r e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e d i s t r i b u t i o n o f c y s t s w i t h s p a t i a l r e s o l u t i o n o f 0 . 1 mm. B e s i d e s s i g n a l t o n o i s e , a f e a t u r e l i m i t i n g i m a g e q u a l i t y i s i n h o m o g e n e o u s b r o a d e n i n g a r i s i n g f r o m t h e v a r i a t i o n i n d i a m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y a t t h e a i r - c a p i n t e r f a c e . C O N C L U S I O N S T h e d e t e r m i n a t i o n o f g r a d i e n t m a g n i t u d e s f r o m l i n e s h a p e s a n d l i n e w i d t h s g a v e v a l u e s w h i c h w e r e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e o b t a i n e d b y c a l i b r a t i o n u s i n g k n o w n v a l u e s f o r t h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f w a t e r . I n t h e s t u d y o f p r o t o n s p e c t r a o f h u m a n f o r e a r m , a w a t e r s i g n a l w i t h T 2 o f a b o u t 0 . 8 s w a s a t t r i b u t e d t o i n t e r c e l l u l a r w a t e r . M e a s u r e m e n t s o f t h e " d i f f u s i v i t y " o f t h e w a t e r s u g g e s t s t h a t a m a j o r p a r t o f t h e m o t i o n o b s e r v e d i s d u e t o r a n d o m i z e d f l o w i n c a p i l l a r i e s w i t h a r o o t - m e a n - s q u a r e v e l o c i t y o f 0 . 1 5 m m s " 1 . C h e m i c a l s h i f t r e s o l v e d p r o t o n m a p s s h o w i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f w a t e r a n d l i p i d i n t h e a n t e r o p o s t e r i o r d i r e c t i o n o f p u p a e o f Barbara colfaxiana h a v e b e e n o b t a i n e d . T h e s e m a p s s h o w t h a t t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e w a t e r d e p e n d e d u p o n t h e v e r t i c a l o r i e n t a t i o n o f t h e p u p a . T h e m a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y v a r i e d b e t w e e n d i f f e r e n t p a r t s o f t h e p u p a c a u s i n g t h e r e s o n a n c e f r e q u e n c i e s o f t h e p r o t o n s t o v a r y c o r r e s p o n d i n g l y . I m a g e s o f Acetabularia medi t er r anea s h o w e d f e a t u r e s r e s e m b l i n g t h e r a d i a l s t r u c t u r e o f t h e c a p s f r o m m a t u r e s p e c i m e n s . T h e s p a t i a l r e s o l u t i o n w a s e s t i m a t e d t o b e 0 . 1 mm. F o r T , a n d T 2 c o n t r a s t i n g , i t i s n o t c l e a r w h e t h e r f e a t u r e s i n t h e i m a g e a r i s e f r o m t h e g r o u p s o f c y s t s w i t h i n t h e c a p s o r t h e s p a c e s b e t w e e n t h e m . D 2 0 - c o n t r a s t i n g g a v e t h e b e s t r e s o l u t i o n i n w h i c h t h e f e a t u r e s " h i g h l i g h t e d " i n t h e i m a g e a r e p r o b a b l y d u e t o t h e c y s t s . 1 6 8 S U G G E S T I O N S F O R F U T U R E WORK 1 . I N - V I V O P U L S E D G R A D I E N T S P I N E C H O M E A S U R E M E N T S In-vivo d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s o n t h e 8 0 MHz s y s t e m w e r e c o m p l i c a t e d b y t h e e f f e c t s o f e d d y c u r r e n t s a n d l o n g e c h o t i m e s w e r e r e q u i r e d i n o r d e r t o o b t a i n r e l i a b l e d a t a . T h e u s e o f s i n u s o i d a l i n s t e a d o f s q u a r e g r a d i e n t p u l s e s , b e c a u s e o f t h e l e s s a b r u p t c h a n g e w i l l p r o d u c e l e s s c o u p l i n g , a n d r e d u c e e d d y c u r r e n t s a n d a c o u s t i c a l v i b r a t i o n . T h i s s h o u l d a l l o w m o r e a c c u r a t e d i f f u s i o n m e a s u r e m e n t s w i t h s h o r t e r e c h o t i m e s . E c h o t i m e s o f 30 t o 5 0 ms w o u l d b e a d e q u a t e f o r t h e s t u d y o f r e s t r i c t e d d i f f u s i o n i n c o m p a r t m e n t s a s s m a l l a s 10 urn (24), a s w o u l d b e r e q u i r e d f o r m e a s u r e m e n t s o f t h e a n i s o t r o p i c d i f f u s i o n i n m u s c l e c e l l s (91). A s d e s c r i b e d i n c h a p t e r I I I , s e c t i o n B , i t a p p e a r s t o b e f e a s i b l e , b y u s i n g l o n g e c h o t i m e s , t o s u p p r e s s t h e i n t r a c e l l u l a r H 2 0 s i g n a l w h i c h h a s s h o r t T 2 a n d l o o k p r i m a r i l y a t b l o o d a n d o t h e r e x t r a c e l l u l a r w a t e r , w i t h l o n g e r T 2 . T h e e x i s t i n g d a t a s h o w e d t h a t t h e d i f f u s i v i t y o f t h e e x t r a c e l l u l a r w a t e r i n c r e a s e d w i t h e c h o t i m e a n d i t w a s s u g g e s t e d t h a t t h i s m i g h t b e d u e t o b l o o d u n d e r g o i n g r a n d o m l y o r i e n t e d f l o w i n s t e a d o f m o t i o n d u e t o g e n u i n e d i f f u s i o n . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s o f t h e s e e f f e c t s may i n v o l v e m e a s u r e m e n t s o v e r a r a n g e o f e c h o t i m e s , i n t h e t r a n s v e r s e d i r e c t i o n o f t h e a r m , o r w i t h a l a r g e p r o p o r t i o n o f m u s c l e i n t h e s a m p l e r e g i o n , a f t e r r e s t a n d a f t e r 1 6 9 1 70 v i g o r o u s e x e r c i s e . O t h e r r e g i o n s o f t h e a r m may a l s o b e m e a s u r e d s u c h a s o v e r a p r o m i n e n t v e i n t o m a x i m i z e b l o o d s i g n a l ; t h e n t h e f l o w w o u l d b e l e s s r a n d o m . 2 . I M A G I N G Acetabularia c a p s p r o v e d t o b e a v e r y s u i t a b l e o b j e c t t o t e s t " m i c r o s c o p i c " s p a t i a l r e s o l u t i o n o f NMR i m a g i n g a t t h e 0 . 1 mm l e v e l , b e c a u s e o f i t s s i z e a n d g e o m e t r y , a n d b e c a u s e i t c o u l d b e r e m o v e d b r i e f l y f r o m t h e H 2 0 e n v i r o n m e n t w i t h o u t s e r i o u s d a m a g e . F u t u r e w o r k o n t h i s a n d o t h e r s m a l l b i o l o g i c a l s a m p l e s c o u l d b e a l o n g t h r e e l i n e s : 1) F u r t h e r w o r k w i t h t h e s a m e k i n d o f Acetabularia s a m p l e . S p a t i a l r e s o l u t i o n c a n p r o b a b l y n o t b e i m p r o v e d m u c h , s o f a r a s i t i s d e t e r m i n e d b y i n s t r u m e n t a l f a c t o r s w i t h t h e p r e s e n t e q u i p m e n t b e c a u s e t h e g r a d i e n t u s e d i s , f o r t h i s s i z e o f c o i l , t h e h i g h e s t c o m p a t i b l e w i t h t h e d w e l l t i m e o f t h e d i g i t i z e r , a n d t h e r f c o i l c a n n o t b e m a d e s m a l l e r b e c a u s e o f t h e s a m p l e s i z e . A l l t h e p o s s i b i l i t i e s o f v a r i o u s k i n d s o f c o n t r a s t i n g h a v e n o t , h o w e v e r , y e t b e e n e x h a u s t i v e l y i n v e s t i g a t e d . E s p e c i a l l y , i t i s n o t y e t q u i t e c e r t a i n w h i c h p a r t s o f t h e s a m p l e , t h e b u n d l e s o f c y s t s o r t h e s p a c e s b e t w e e n t h e m , a r e h i g h l i g h t e d b y T , a n d T 2 c o n t r a s t i n g , a n d f u r t h e r w o r k s h o u l d b e d o n e o n t h i s . 2 ) I f m i c r o s c o p i c NMR i m a g i n g i s t o a c h i e v e a p p l i c a b i l i t y i n d e v e l o p m e n t a l b i o l o g y , e s p e c i a l l y f o r a n i m a l s , i t i s g o i n g 171 t o b e n e c e s s a r y t o l o o k a t s a m p l e s i m m e r s e d i n a q u e o u s e n v i r o n m e n t . NMR p u l s e s e q u e n c e s f o r s o l v e n t n u l l i n g a r e n o t s u i t a b l e f o r t h i s a p p l i c a t i o n s i n c e t h e s e r e l y u p o n c h e m i c a l s h i f t d i f f e r e n c e s t o s e l e c t i v e l y p r e p a r e t r a n s v e r s e m a g n e t i z a t i o n d u e t o t h e d e s i r e d c o m p o n e n t . T h e p r o b l e m i s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n w a t e r i n s i d e a n d o u t s i d e t h e c e l l s a n d c h e m i c a l s h i f t d i f f e r e n c e s w i l l b e n e g l i g i b l e . T h i s m a y b e a c h i e v e d b y a d d i n g p a r a m a g n e t i c s p e c i e s t o t h e m e d i u m a n d a p p l y i n g T 2 c o n t r a s t i n g t o r e d u c e t h e c o n t r i b u t i o n o f t h e e x t e r n a l w a t e r ; p a r a m a g n e t i c a g e n t s w h i c h d o n o t d i f f u s e i n t o t h e c e l l s h o u l d b e u s e d . Acetabularia c o u l d s e r v e a s a u s e f u l s a m p l e f o r p r e l i m i n a r y s t u d i e s o f how t o e l i m i n a t e t h e i n t e r f e r e n c e f r o m t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t . I f a n y o f t h e s e m e t h o d s p r o v e s u c c e s s f u l , s o t h a t h e a l t h y c e l l s c a n b e s t u d i e d in-vivo, t h e n s u c h p r o p e r t i e s a s t h e v e r y r a p i d w a t e r t r a n s p o r t b y c y t o p l a s m i c s t r e a m i n g c o u l d b e s t u d i e d i n t h e m a i n s t a l k o f t h i s p l a n t , a n d a l s o i n t h e c h a r o p h y t e s ( s t o n e w o r t s ) Chara a n d Nit el I a, i n w h i c h s t r e a m i n g r e a c h e s v e l o c i t i e s u p t o 1 0 0 M m s " 1 . 3 ) T h e s p a t i a l r e s o l u t i o n m a y b e i m p r o v e d b y i m p l e m e n t i n g t h e f o l l o w i n g : a ) T h e s e n s i t i v i t y m a y b e i m p r o v e d b y i n c r e a s i n g t h e f i l l i n g f a c t o r ( r a t i o o f s a m p l e v o l u m e t o v o l u m e o f t h e r f c o i l ) w h i c h w a s a b o u t 0 . 1 f o r B. colfaxiana a n d A. mediterranea s a m p l e s . T h i s c o u l d b e a c h i e v e d b y c o n s t r u c t i n g a s m a l l e r r f c o i l p r e f e r r a b l y f o l l o w i n g a s o l e n o i d a l d e s i g n ; t h e p r o b e 1 72 w o u l d t h e n h a v e t o b e m o d i f i e d t o a l l o w i n s e r t i o n o f s a m p l e s f r o m t h e s i d e . b ) F u r t h e r i m p r o v e m e n t m a y b e a c h i e v e d b y i n c r e a s i n g t h e n u m b e r o f s c a n s p e r g r a d i e n t i n c r e m e n t , t h e n u m b e r o f p o i n t s i n t h e i m a g e t o 5 1 2 x 5 1 2 a n d t h e n u m b e r o f c o l o r l e v e l s i n t h e d i s p l a y e d i m a g e . c ) F o r i m a g i n g o f o b j e c t s 1 mm i n s i z e , t h e e x i s t i n g g r a d i e n t c o i l s a r e c a p a b l e o f a c h i e v i n g 4 0 0 m T m " 1 f o r a b o u t 10 A o f c u r r e n t . E d d y c u r r e n t e f f e c t s a r e l i k e l y t o p r e s e n t a p r o b l e m a t s u c h g r a d i e n t m a g n i t u d e s a n d a s m a l l e r s e t o f g r a d i e n t c o i l s , r a d i u s o f a b o u t 8 - 1 0 mm, s h o u l d b e b u i l t . T h e i m p l e m e n t a t i o n o f t h e a b o v e , a n d t h e a t t a i n a b l e s p a t i a l r e s o l u t i o n w i l l d e p e n d u p o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s a m p l e . I n p a r t i c u l a r , t h e q u a n t i t y a n d p a r t i t i o n i n g o f t h e w a t e r w i l l v a r y f r o m o n e s a m p l e t o a n o t h e r . B i o l o g i c a l s y s t e m s f o r s t u d y c o u l d i n c l u d e i m m a t u r e Acetabularia s p e c i m e n s l a c k i n g t h e w i d e c a p a n d a n i m a l e m b r y o s . I m a g i n g o f t h e s i n g l e - c e l l s t a g e o f t h e e m b r y o o f Xenopus laevis h a s a l r e a d y b e e n r e p o r t e d (139) a n d t h i s c o u l d b e e x t e n d e d t o l a t e r s t a g e s . M a n y e m b r y o s o f m a r i n e i n v e r t e b r a t e s , s u c h a s e c h i n o d e r m s ( e . g . s e a u r c h i n s a n d s e a s t a r s ) , w h i c h a r e w i d e l y s t u d i e d b y d e v e l o p m e n t a l b i o l o g i s t s , c o u l d b e s u i t a b l e o b j e c t s i f t h e w a t e r s u p p r e s s i o n p r o b l e m s c a n b e s o l v e d a n d r e s o l u t i o n i m p r o v e d t o t e n s o f m i c r o n s . G L O S S A R Y O F T E R M S B i f l a g e l l a t e g a m e t e s : M a t u r e h a p l o i d r e p r o d u c t i v e o r s e x c e l l s w h i c h a r e m o t i l e a n d p o s s e s s t w o f l a g e l l a ( s l e n d e r , w h i p l i k e p r o c e s s e s o f a c e l l ) . C h l o r o p l a s t : A t y p e o f c e l l p l a s t i d o c c u r r i n g i n t h e g r e e n p a r t s o f p l a n t s , c o n t a i n i n g c h l o r o p h y l l p i g m e n t s , a n d f u n c t i o n i n g i n p h o t o s y n t h e s i s a n d p r o t e i n s y n t h e s i s . C u t i c l e : A n o n c e l l u l a r , h a r d e n e d o r m e m b r a n o u s s e c r e t i o n o f a n e p i t h e l i a l s h e e t , s u c h a s t h e e x o s k e l e t o n o f a r t h r o p o d s . C y t o p l a s m : T h e l i v i n g c o n t e n t s o f a c e l l e x c l u d i n g t h e p l a s m a m e m b r a n e , v a c u o l e s a n d n u c l e u s . I t i s a v i s c o u s f l u i d s u r r o u n d e d b y t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d c o n t a i n s o r g a n e l l e s s u c h a s m i t o c h o n d r i a , G o l g i a p p a r a t u s , r i b o s o m e s . D i a p a u s e : A p e r i o d o f s p o n t a n e o u s l y s u s p e n d e d g r o w t h o r d e v e l o p m e n t i n c e r t a i n i n s e c t s , m i t e s , c r u s t a n c e a n s a n d s n a i l s . E c l o s i o n : E m e r g e n c e o f t h e a d u l t f r o m t h e p u p a c a s e . H a e m o l y m p h : T h e c i r c u l a t o r y f l u i d o f a n i m a l s w i t h a n o p e n c i r c u l a t o r y s y s t e m . M a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y : M a g n e t i c s u s c e p t i b i l i t y i s m e a s u r e d b y t h e r a t i o o f t h e i n t e n s i t y o f t h e m a g n e t i z a t i o n p r o d u c e d i n a s u s b s t a n c e t o t h e m a g n e t i z i n g f o r c e o r i n t e n s i t y o f f i e l d t o w h i c h i t i s s u b j e c t e d . M o u l t i n g f l u i d s : A f l u i d w h i c h s o f t e n s t h e l o w e r l a y e r o f t h e c u t i c l e p r i o r t o m o u l t i n g . P h a r a t e i n s t a r : A s t a g e i n t h e d e v e l o p m e n t o f a n i n s e c t d u r i n g w h i c h t h e c u t i c l e h a s b e c o m e s e p a r a t e d f r o m t h e h y p o d e r m i s b u t h a s n o t y e t b e e n r u p t u r e d o r c a s t o f f . A p h a r a t e a d u l t i s w i t h i n b u t f r e e f r o m t h e p u p a l i n t e g u m e n t . P u p a : A n o n - f e e d i n g a n d r e l a t i v e l y i n a c t i v e s t a g e b e t w e e n t h e l a r v a a n d t h e a d u l t i n H o l o m e t a b o l o u s i n s e c t s . 1 7 3 B I B L I O G R A P H Y 1 . P . M a n s f i e l d a n d P . G . M o r r i s , NMR I m a g i n g i n B i o m e d i c i n e , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 8 2 . 2 . P . A . B o t t o m l e y , R e v . S c i . I n s t r u m . 5 3 , 1 3 1 9 ( 1 9 8 2 ) . 3 . T . F . B u d i n g e r , a n d P . C . L a u t e r b u r , S c i e n c e 2 2 6 , 2 8 8 ( 1 9 8 4 ) . 4 . R . E . G o r d o n , P h y s . M e d . B i o l . 3 0 , 741 ( 1 9 8 5 ) . 5 . E . O . S t e j s k a l , J . C h e m . P h y s . 4 3 , 3 5 9 7 ( 1 9 6 5 ) 6 . K . J . P a c k e r , M o l . P h y s . 1 7 , 3 5 5 ( 1 9 6 9 ) . 7 . D . W . J o n e s a n d T . F . C h i l d , A d v . M a g n . R e s o n . 8 , 1 2 3 ( 1 9 7 6 ) . 8 . J . R . S i n g e r , J . P h y s . E 1 1 , 2 8 1 ( 1 9 7 8 ) . 9 . K . J . P a c k e r , C . R e e s a n d D . J . T o m l i n s o n , A d v a n . M o l . R e l a x a t i o n P r o c e s s e s 3 , 1 1 9 ( 1 9 7 2 ) . 1 0 . W . P . A u e , E . B a r t h o l d i a n d R . R . E r n s t , J . C h e m . P h y s . 6 4 , 2 2 2 9 ( 1 9 7 6 ) . 1 1 . R . M i l l s , J . P h y s . C h e m . 7 7 , 6 8 5 ( 1 9 7 3 ) . 1 2 . E . O . S t e j s k a l a n d J . E . T a n n e r , J . C h e m . P h y s . 4 2 , 2 8 8 ( 1 9 6 5 ) . 1 3 . M . I . H r o v a t a n d C . G . W a d e , J . M a g n . R e s o n . 4 4 , 6 2 ( 1 9 8 1 ) . 1 4 . F . B l o c h , W . W . H a n s e n a n d M . P a c k a r d , P h y s . R e v . 7 0 , 4 7 4 ( 1 9 4 6 ) . 1 5 . E . M . P u r c e l l , H . C . T o r r e y , a n d R . V . P o u n d , P h y s . R e v . 6 9 , 3 7 ( 1 9 4 6 ) . 1 6 . E . L . H a h n , P h y s . R e v . 8 0 , 5 8 0 ( 1 9 5 0 ) . 1 7 . H . Y . C a r r a n d E . M . P u r c e l l , P h y s . R e v . 9 4 , 6 3 0 ( 1 9 5 4 ) . 1 8 . D . W . M c C a l l , D . C . D o u g l a s a n d E . W . A n d e r s o n , B e r . B u n s e n g e s . P h y s i k . C h e m . 6 7 , 3 3 6 ( 1 9 6 3 ) . 1 9 . K . P a c k e r , C . R e e s a n d D . J . T o m l i n s o n , M o l e c . P h y s . 1 8 , 4 2 1 ( 1 9 7 0 ) . 2 0 . M . I . H r o v a t , C O . B r i t t , T . C . M o o r e a n d C . G . W a d e , J . M a g n . R e s o n . 4 9 , 4 1 1 ( 1 9 8 2 ) . 1 7 4 1 7 5 2 1 . D . Z a x a n d A . P i n e s , J . C h e m . P h y s . 78, 6 3 3 3 ( 1 9 8 3 ) . 2 2 . J . F . M a r t i n , L . S . S e l w y n , R . R . V o i d a n d R . L . V o i d , J . C h e m . P h y s . 76, 2 6 3 2 ( 1 9 8 2 ) . 2 3 . L . W . R e e v e s , i n " D y n a m i c N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e S p e c t r o s c o p y " , J a c k m a n L . M . a n d C o t t o n F . A . e d s , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 7 5 , p 101 . 2 4 . J . E . T a n n e r , i n " M a g n e t i c R e s o n a n c e i n C o l l o i d a n d I n t e r f a c e S c i e n c e " , R e s i n g H . H . a n d W a d e C . G . e d s , A C S S y m p o s i u m S e r i e s 1 9 7 6 , p l 6 2 5 . N . J . T r a p p e n i e r s , C . J . G e r r i t s m a a n d P . H . O o s t i n g , P h y s . L e t t . 18, 2 5 6 ( 1 9 6 5 ) . 2 6 . J . S . M u r d a y a n d R . M . C o t t s , Z . N a t u r f o r s c h . A 26, 8 5 ( 1 9 7 1 ) . 2 7 . L . D . H a l l a n d V . R a j a n a y a g a m , J . M a g n . R e s o n . 60, 1 9 9 ( 1 9 8 4 ) . 2 8 . J . S . M u r d a y , J . M a g n . R e s o n . 10, 111 ( 1 9 7 3 ) . 2 9 . K . R . H a r r i s , R . M i l l s , P . J . B a c k a n d D . S . W e b s t e r , J . M a g n . R e s o n . 29, 4 7 3 ( 1 9 7 8 ) . 3 0 . P . T . C a l l a g h a n , C M . T r o t t e r a n d K . W . J o l l e y , J . M a g n . R e s o n . 37, 2 4 7 ( 1 9 8 0 ) . 3 1 . G . S u r y a n , P r o c . I n d i a n A c a d . S c i . , S e c t i o n A 33, 1 0 7 ( F e b u a r y , 1 9 5 1 ) . 3 2 . V . K u d r a v c e v a n d R . L . B o w m a n , D i g . T e c h . P a p e r s , 1 3 t h A n n . C o n f . E n g . i n M e d . & B i o l . , W a s h i n g t o n , D . C . ( 1 9 6 0 ) , p p . 21 a n d 2 5 . 3 3 . J . R . S i n g e r , S c i e n c e 130, 1 6 5 2 ( 1 9 5 9 ) . 3 4 . J . R . S i n g e r a n d T . G r o v e r , i n M o d e r n D e v e l o p m e n t s i n F l o w M e a s u r e m e n t , C . G . C l a y t o n ( e d . ) , L o n d o n , P e t e r P e r e g r i n u s , 1 9 7 2 , p p . 3 8 . 3 5 . H . v a n A s a n d T . J . S c h a a f s m a , B u l l . M a g n . R e s o n . 2, 3 5 9 ( 1 9 8 0 ) . 3 6 . J . H . B a t t o c l e t t i , R . E . H a l b a c h , S . S a l l e s - C u n h a a n d A . S a n c e s J r . , M e d . P h y s . 8, 4 3 5 ( 1 9 8 1 ) . 3 7 . H . v a n A s a n d T . J . S c h a a f s m a , i n " A n I n t r o d u c t i o n t o B i o m e d i c a l N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e " , S . B . P e t e r s e n , R . N . M u l l e r a n d P . A . R i n c k , e d s . , G e o r g e T h i e m e V e r l a g , S t u t t g a r t , 1 9 8 5 . 3 8 . J . S t e p i s n i k , P r o g . NMR S p e c t r o s c . 17, 1 8 7 ( 1 9 8 5 ) . 1 7 6 3 9 . R . G a b i l l a r d , P h y s . R e v . 85, 6 9 4 ( 1 9 5 2 ) . 4 0 . P . C . L a u t e r b u r , N a t u r e ( L o n d o n ) 242, 1 9 0 ( 1 9 7 3 ) 4 1 . A . K u m a r , D . W e l t i a n d R . R . E r n s t , J . M a g n . R e s o n . 18, 6 9 ( 1 9 7 5 ) 4 2 . A . B a x , T w o D i m e n s i o n a l N M R , D e l f t U n i v . P r e s s , D e l f t , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 8 2 . K . N a g a y a m a , A d v . B i o p h y s . 14, 1 3 9 ( 1 9 8 1 ) . 4 3 . P . M a n s f i e l d a n d P . K . G r a n n e l , J . P h y s . C . 6, L 4 2 2 ( 1 9 7 3 ) 4 4 . W . S . H i n s h a w , J . A p p l y . P h y s . 47, 3 7 0 9 ( 1 9 7 6 ) . 4 5 . R . D a m a d i a n , L . M i n k o f f , M . G o l d s m i t h , M . S t a n f o r d a n d J . K o u t c h e r , S c i e n c e 194, 1 4 3 0 ( 1 9 7 6 ) . 4 6 . A . A b r a g a m , P r i n c i p l e s o f N u c l e a r M a g n e t i s m , O x f o r d , L o n d o n , 1 9 6 1 . 4 7 . C P . S l i c h t e r , P r i n c i p l e s o f M a g n e t i c R e s o n a n c e , S p r i n g e r - V e r l a g , New Y o r k , 1 9 8 0 . 4 8 . U . F a n o , R e v . M o d . P h y s . 29, 7 4 ( 1 9 5 7 ) . 4 9 . K . B l u m , D e n s i t y M a t r i x T h e o r y a n d A p p l i c a t i o n s , 1 9 8 1 , P l e n u m P r e s s , New Y o r k . 5 0 . I . J . L o w e a n d R . E . N o r b e r g , P h y s . R e v . 107, 4 6 ( 1 9 5 7 ) . 5 1 . A . G . R e d f i e l d a n d R . K . G u p t a , A d v . M a g n . R e s o n . 5, 81 ( 1 9 7 1 ) . 5 2 . F . B l o c h , P h y s . R e v . 70, 4 6 0 ( 1 9 4 6 ) . 5 3 . R . G . G o r d o n , A d v . M a g n . R e s o n a n c e 3 , 4 3 ( 1 9 6 8 ) . 5 4 . E . L . H a h n a n d D . E . M a x w e l l , P h y s . R e v . 88, 1 0 7 0 ( 1 9 5 2 ) . 5 5 . E . F u k u s h i m a a n d S . B . W . R o e d e r , E x p e r i m e n t a l P u l s e N M R ; A N u t s a n d B o l t s A p p r o a c h , A d d i s o n - W e s l e y , M a s s a c h u s e t t s , 1 9 8 1 . 5 6 . P . A . B o t t o m l e y , J . P h y s . E 14, 1081 ( 1 9 8 1 ) . 5 7 . S . L j u n g g r e n , J . M a g n . R e s o n . 54, 3 3 8 ( 1 9 8 3 ) . 5 8 . L . D . H a l l , V . R a j a n a y a g a m a n d S . S u k u m a r , J . M a g n . R e s o n . 61, 1 8 8 ( 1 9 8 5 ) . 5 9 . C D . E c c l e s a n d P . T . C a l l a g h a n , J . M a g n . R e s o n . 68, 3 9 3 ( 1 9 8 6 ) . 1 7 7 6 0 . H . C . T o r r e y , P h y s . R e v . 104, 5 6 3 ( 1 9 5 6 ) . 6 1 . D . E . W o e s s n e r , J . P h y s . C h e m . 67, 1 3 6 5 ( 1 9 6 3 ) . 6 2 . B . M u l l e r a n d M . B l o o m , C a n . J . P h y s . 38, 1 3 1 8 ( 1 9 6 0 ) . 6 3 . H . S . G u t o w s k y , D . W . M c C a l l , a n d C P . S l i c h t e r , J . C h e m . P h y s . 21, 2 7 9 ( 1 9 5 3 ) . 6 4 . P . S t i l b s , J . C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . 87, 3 8 3 ( 1 9 8 2 ) . 6 5 . P . T . C a l l a g h a n , K . W . J o l l e y a n d C M . T r o t t e r , J . M a g n . R e s o n . 39, 5 2 5 ( 1 9 8 0 ) . 6 6 . G . E . W e s b e y , A . M a u d s l e y a n d R . L . E h m a n , I n v e s t i g a t i v e R a d i o l . 19, 4 9 1 ( 1 9 8 4 ) . 6 7 . D . G . T a y l o r a n d M . C B u s h w e l l , P h y s . M e d . B i o l . 30, 3 4 5 ( 1 9 8 5 ) . 6 8 . K . M e r b o l d t , W. H a n i c k e a n d J . F r a h m , J . M a g n . R e s o n . 64, 4 7 9 ( 1 9 8 5 ) . 6 9 . M . H . L e v i t t a n d R . R . E r n s t , C h e m . P h y s . L e t t 1 0 0 , 119 ( 1 9 8 3 ) . 7 0 . A . W o k a u n a n d R . R . E r n s t , M o l . P h y s . 36, 3 1 7 ( 1 9 7 8 ) 7 1 . A . B a x , P . G . D e J o n g , A . F . M e h l k o p f a n d J . S m i d t , C h e m . P h y s . L e t t . 69, 5 6 7 ( 1 9 8 0 ) . 7 2 . G . B o d e n h a u s e n , R . L . V o i d a n d R . R . V o i d , J . M a g n . R e s o n . 37, 9 3 ( 1 9 8 0 ) 7 3 . S . V e g a a n d A . P i n e s , J . C h e m . P h y s . 66, 5 6 2 4 ( 1 9 7 7 ) . 7 4 . L . E . K a y a n d J . H . P r e s t e g a r d , J . M a g n . R e s o n . 67, 1 0 3 ( 1 9 8 6 ) . 7 5 . B . C . S a n c t u a r y , J . C h e m . P h y s . 64, 4 3 5 2 ( 1 9 7 9 ) . 7 6 . O . W . S 0 r e n s e n , G . W . E i c h , M . H . L e v i t t , G . B o d e n h a u s e n a n d R . R . E r n s t , P r o g . NMR S p e c t . 16, 1 6 3 ( 1 9 8 3 ) . 7 7 . D . P . W e i t e k a m p , A d v . M a g n . R e s o n . 11, 111 ( 1 9 8 3 ) . 7 8 . M . H . L e v i t t a n d R . R . E r n s t , J . C h e m . P h y s . 83, 3 2 9 7 ( 1 9 8 5 ) . 7 9 . A . A . M a u d s l e y , A . W o k a u n a n d R . R . E r n s t , C h e m . P h y s . L e t t . 55, 9 ( 1 9 7 8 ) . 8 0 . D . I . H o u l t a n d R . E . R i c h a r d s , P r o c . R . S o c . L o n d . A . 344, 3 1 1 ( 1 9 7 5 ) . 178 8 1 . D . S . W e b s t e r a n d K . H i M a r s d e n , R e v . S c i . I n s t r u m . 45, 1 2 3 2 ( 1 9 7 4 ) . 8 2 . G . O d b e r g a n d L . O d b e r g , J . M a g n . R e s o n . 16, 3 4 2 ( 1 9 7 4 ) . 8 3 . S . G a r t e n h a u s , P h y s i c s ; B a s i c P r i n c i p l e s . H o l t , R h i n e h a r t a n d W i n s t o n . New Y o r k , 1 9 7 7 . 8 4 . W . A . A n d e r s o n , R e v . S c i . I n s t r . 32, 2 4 1 ( 1 9 6 1 ) . 8 5 . M . J . E . G o l a y , U . S . P a t e n t , S e r . N o . 7 3 3 5 2 2 , ( 1 9 6 8 ) . 8 6 . J . L . E v e l h o c h a n d J . J . H . A c k e r m a n , J . M a g n . R e s o n . 53, 5 2 ( 1 9 8 3 ) . 8 7 . A . H a a s e , W. H a n i c k e a n d J . F r a h m , J . M a g n . R e s o n . 56, 401 ( 1 9 8 4 ) . 8 8 . G . L e v y a n d I. P e a t , J . M a g n . R e s o n . 18, 5 0 0 ( 1 9 7 5 ) . 8 9 . M . B l o o m , J . H . D a v i s a n d M . I . V a l i c , C a n . J . P h y s . 58, 1 5 1 0 ( 1 9 8 0 ) . 9 0 . C . D u m o u l i n a n d D . V a t i s , M a g n . R e s o n . M e d . 3, 2 8 2 ( 1 9 8 6 ) . 9 1 . D . B . C h a n g , R . L . C o o p e r , A . C . Y o u n g , C . J . M a r t i n a n d B . A n c k e r - J o h n s o n , J . T h e o r . B i o l . 50, 2 8 5 ( 1 9 7 5 ) , R . L . C o o p e r , D . B . C h a n g , A . C . Y o u n g , C . J . M a r t i n a n d B . A n c k e r - J o h n s o n , B i o p h y s . J . 14, 161 ( 1 9 7 4 ) . 9 2 . M . E . C l a r k , E . E . B u r n e l l , N . R . C h a p m a n a n d J . A . M . H i n k e , B i o p h y s . J . 39, 2 8 9 ( 1 9 8 2 ) . 9 3 . R . M a t h u r - D e V r e , P r o g . B i o p h y s . M o l e c . B i o l . 35, 1 0 3 ( 1 9 7 9 ) . 9 4 . J . E . T a n n e r , B i o p h y s . J . 28, 1 0 7 ( 1 9 7 9 ) . 9 5 . R . B l i n c , V . D i m i c , J . P i r s , M . V i l f a n a n d I. Z u p a n c i c , M o l e c . C r y s . L i q . C r y s . 14, 97 ( 1 9 7 1 ) 9 6 . G . L i n d b l o m a n d H . W e n n e r s t r o m , B i o p h y s . C h e m . 6, 1 6 7 ( 1 9 7 7 ) . 9 7 . A . K u o a n d C . G . W a d e , B i o c h e m i s t r y 18, 2 3 0 0 ( 1 9 7 9 ) . 9 8 . B . L i n d m a n , P . S t i l b s a n d M . E . M o s e l e y , J . C o l l o i d I n t e r f a c e S c i . 83, 5 6 9 ( 1 9 8 1 ) . 9 9 . P . T . C a l l a g h a n a n d 0 . S o d e r m a n , J . P h y s . C h e m . 87, 1 7 3 7 ( 1 9 8 3 ) 1 0 0 . R . D . F e r g u s o n a n d E . V o n M e e r w a l l , J . P o l y m . S c i . P o l y m . P h y s . E d . 18, 1 2 8 5 ( 1 9 8 0 ) . 1 7 9 1 0 1 . W. B r o w n a n d P . S t i l b s , P o l y m e r 24, 1 8 8 ( 1 9 8 3 ) 1 0 2 . P . T . C a l l a g h a n a n d D . N . P i n d e r , M a c r o m o l e c u l e s 16, 9 6 8 ( 1 9 8 3 ) 1 0 3 . P . T . C a l l a g h a n a n d D . N . P i n d e r , M a c r o m o l e c u l e s 17, 4 3 1 ( 1 9 8 4 ) 1 0 4 . J . T a b o n y a n d S . R o s e r , M o l e c . P h y s . 44, 3 2 9 ( 1 9 8 1 ) 1 0 5 . L . D . B u s t a r d , R . M . C o t t s a n d E . F . W . S e y m o u r , P h y s . R e v . 22, 12 ( 1 9 8 0 ) 1 0 6 . P . A . H o r n u n g , A . D . K h a n , D . R . T o r g e s o n a n d R . G . B a r n e s , Z . f u r P h y s i k . C h e m i e . N e u e F o l g e , B d . 116, 7 7 ( 1 9 7 9 ) 1 0 7 . H . G . H e r t z , B . L i n d m a n a n d V . S i e p e , B e r . B u n s e n g e s . p h y s i k . C h e m . 73, 5 4 2 ( 1 9 6 9 ) 1 0 8 . A . W e i s s a n d K . H . N o t h a n g e l , B e r . B u n s e n g e s . p h y s i k C h e m . 75, 2 1 6 ( 1 9 7 1 ) 1 0 9 . I. A r t a k i a n d J . J o n a s , J . C h e m . P h y s . 82, 3 3 6 0 ( 1 9 8 5 ) 1 1 0 . A . E i n s t e i n , A n n . d e r P h y s i k ( L e i p z i g ) 17, 5 4 9 ( 1 9 0 5 ) . T r a n s l a t e d i n R . F u r t h , e d . , " I n v e s t i g a t i o n s o n t h e B r o w n i a n M o v e m e n t " . M e t h u e n , L o n d o n , 1 9 2 6 . J . P e r r i n , " A t o m s " ( D . L . H a m m i c k , t r a n s l a t o r ) . V a n N o s t r a n d , New Y o r k , 1 9 1 6 . 1 1 1 . R . Z w a n z i g a n d A . K . H a r r i s o n , J . C h e m . P h y s . 83, 5 8 6 1 ( 1 9 8 5 ) . 1 1 2 . G . L . P o l l a c k a n d J . J . E n y e a r t , P h y s . R e v . A 31, 9 8 0 ( 1 9 8 5 ) . 1 1 3 . J . T . E d w a r d , J . C h e m . E d . 47, 2 6 1 ( 1 9 7 0 ) . 1 1 4 . M . J . T a i t , A . S u g g e t t , F . F r a n k s , S . A b l e t t a n d P . A . Q u i c k e n d e n , J . S o l u t i o n C h e m . 1, 131 ( 1 9 7 2 ) . 1 1 5 . H . U e d a i r a a n d H . U e d a i r a , J . S o l u t i o n C h e m . 14, 2 7 ( 1 9 8 5 ) . 1 1 6 . M . W i n d h o l z , e d . , " T h e M e r c k I n d e x , A n E n c y l o p e d i a o f C h e m i c a l s a n d D r u g s " , M e r c k & C o . , I n c . , New J e r s e y , 9 t h e d i t i o n , 1 9 7 6 . 1 1 7 . J . K . G l a d d e n a n d M . D o l e , J . A m e r . C h e m . S o c . 75, 3 9 0 0 ( 1 9 5 3 ) . 1 1 8 . L . F r e i d m a n a n d P . G . C a r p e n t e r , J . A m e r . C h e m . S o c . 61, 1 7 4 5 ( 1 9 3 9 ) . 1 1 9 . J . J . H . A c k e r m a n , T . H . G r o v e , G . G . W o n g , D . G . G a d i a n a n d 1 8 0 G . K . R a d d a , N a t u r e ( L o n d o n ) 283, 167 ( 1 9 8 0 ) ; R . E . G o r d o n , P . E . H a n l e y , D . S h a w , D . G . G a d i a n , G . K . R a d d a , P . S t y l e s , P . J . B o r e , a n d L . C h a n , i b i d . 287, 7 3 6 ( 1 9 8 0 ) . 1 2 0 . S . R . W i l l i a m s , D . G . G a d i a n , E . P r o c t o r , D . B . S p r a g u e , D . F . T a l b o t , I . R . Y o u n g a n d F . F . B r o w n , J . M a g n . R e s o n . 63, 4 0 6 ( 1 9 8 5 ) . 1 2 1 . J . C . G r a n t , G r a n t ' s A t l a s o f A n a t o m y , S i x t h e d . , T h e W i l l i a m s a n d W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e , 1 9 7 2 . 1 2 2 . W . F . G a n o n g , R e v i e w o f M e d i c a l p h y s i o l o g y , L a n g e M e d i c a l P u b l i c a t i o n s , L o s A l t o s , C a l i f o r n i a , 1 9 8 1 , p . 1 2 1 2 3 . W . A . R . T h o m s o d , e d . , B l a c k ' s M e d i c a l D i c t i o n a r y , A . a n d C . B l a c k L t d . , L o n d o n , 1 9 8 4 . 1 2 4 . K . J . P a c k e r , P h i l . T r a n s . R . S o c . L o n d . B . 278, 5 9 ( 1 9 7 7 ) . 1 2 5 . J . R . Z i m m e r m a n a n d W . E . B r i t t i n , J . P h y s . C h e m . 61, 1 3 2 8 ( 1 9 5 7 ) . 1 2 6 . E . E . B u r n e l l , M . E . C l a r k , J . A . M . H i n k e a n d N . R . C h a p m a n , B i o p h y s . J . 33, 1 ( 1 9 8 1 ) . 1 2 7 . K . R . F o s t e r , H . A . R e s i n g a n d A . N . G a r r o w a y , S c i e n c e 194, 3 2 4 ( 1 9 7 6 ) . 1 2 8 . M . B l o o m , K . T . H o l m e s , C E . M o u n t f o r d a n d P . G . W i l l i a m s , J . M a g n . R e s o n . 69, 7 3 ( 1 9 8 6 ) . 1 2 9 . B . A l b e r t s , D . B r a y , J . L e w i s , M . R a f f , K . R o b e r t s , J . D . W a t s o n , M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e C e l l , G a r l a n d P u b l i s h i n g , . New Y o r k , ( 1 9 8 3 ) . 1 3 0 . R . F . S t e i n e r a n d S . P o m e r a n t z , T h e C h e m i t r y o f L i v i n g S y s t e m s , D . V a n N o s t r a n d , New Y o r k , 1 9 8 1 . 1 3 1 . A . C G u y t o n , T e x t b o o k o f M e d i c a l P h y s i o l o g y , S i x t h e d . , W . B . S a u n d e r s C o . , 1 9 8 1 . 1 3 2 . G . G . C l e v e l a n d , D . C C h a n g , C . F . H a z e l w o o d a n d H . E . R o r s a c h , B i o p h y s . J . 16, 1 0 4 3 ( 1 9 7 6 ) . 1 3 3 . J . E . T a n n e r , B i o p h y s . J . 28, 1 0 7 ( 1 9 7 9 ) . 1 3 4 . K . Y o s h i z a k i , Y . S e o , H . N i s h i k a w a a n d T . M o r i m o t o , B i o p h y s . J . 38, 2 0 9 ( 1 9 8 2 ) . 1 3 5 . K . D i e m a n d C . L e u t n e r ( E d s . ) , " D o c u m e n t a G e i g y S c i e n t i f i c T a b l e s " , G r e g o r y , B a s e l , ( 1 9 7 0 ) p . 5 1 7 . 1 3 6 . P . L . A l t m a n a n d D . S . D i t t m e v ( E d s . ) , " B i o l o g y D a t a B o o k 181 2 " , F e d . o f A m e r . S o c . f o r E x p . B i o l . , B e t h e s d a , M a r y l a n d , ( 1 9 7 3 ) p . 1 2 0 6 . 1 3 7 . R . C . W e a s t , E d . , C R C H a n b o o k o f C h e m i s t r y a n d P h y s i c s , 5 8 t h e d . , C R C P r e s s , P a l m B e a c h , ( 1 9 7 7 ) . 1 3 8 . N . K a m i y a , A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l . 3 2 , 2 0 5 ( 1 9 8 1 ) . 1 3 9 . J . B . A g u a y o , S . J . B l a c k b a n d , J . S c h o e n i g e r , M . A . M a t t i n g l y a n d M . H i n t e r m a n , N a t u r e 3 2 2 , 1 9 0 ( 1 9 8 6 ) . 1 4 0 . T . S . S a h o t a , D . S . R u t h , A . I b a r a k i , S . H . F a r r i s a n d F . G . P e e t , C a n . E n t . 114, 1 1 7 9 ( 1 9 8 2 ) . 1 4 1 . D . N . R a d c l i f f , C a n . D e p . A g r i c , F o r . B i o l . D i v . , B i - m o n . P r o g . R e p . 8 , 3 ( 1 9 5 2 ) . 1 4 2 . A . F . H e d l i n , C a n . E n t . 9 2 , 8 2 6 ( 1 9 6 0 ) . 1 4 3 . A . F . H e d l i n et al. , C a n . F o r . S e r v . O t t a w a , 60 ( 1 9 8 0 ) . 1 4 4 . T . S . S a h o t a , A . I b a r a k i a n d S . H . F a r r i s , C a n . E n t . 117, 8 7 3 ( 1 9 8 5 ) . 1 4 5 . B . R . G r e e n , P h y c o l o g i a 16, 8 7 ( 1 9 7 7 ) . 1 4 6 . D . S . S h e p a r d , M e t h o d s o f C e l l P h y s i o l . , v o l . I V ( D . P r e s c o t t , e d . ) , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1 9 7 0 , p . 4 9 . 

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