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Isolation and biophysical studies of horse plasma gelsolin Ruiz Silva, Beatriz Eugenia 1991

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831-UBC_1991_A1 R84.pdf [ 5.9MB ]
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I S O L A T I O N AND B I O P H Y S I C A L S T U D I E S OF HORSE P L A S M A G E L S O L I N B y B e a t r i z E u g e n i a R u i z S i l v a B . S c , U n i v e r s i d a d M i c h o a c a n a , M e x i c o , 1 9 8 2 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF THE R E Q U I R E M E N T S FOR THE D E G R E E OF DOCTOR OF P H I L O S O P H Y i n T H E F A C U L T Y OF GRADUATE S T U D I E S (DEPARTMENT OF C H E M I S T R Y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A A p r i l 1 9 9 1 © B e a t r i z E u g e n i a R u i z S i l v a , 1 9 9 1 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department The University of British Columbia Vancouver, Canada Date ^ T R , - J IT, /?<?/ DE-6 (2/88) A B S T R A C T G e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a h a s b e e n i s o l a t e d i n g o o d a n d r e p r o d u c i b l e y i e l d s . I t h a s a n a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 . 4 m l / ( m g cm) a n d i s s i m i l a r i n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n t o o t h e r p l a s m a g e l s o l i n s . I t m i g r a t e s a s a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n i n p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w i t h a n a p p a r e n t m o l e c u l a r m a s s o f 9 0 k D a . H y d r o d y n a m i c c a l c u l a t i o n s s u g g e s t t h a t g e l s o l i n i s a g l o b u l a r p r o t e i n o f 7 5 k D a . T h e r m a l a n d c h e m i c a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s w e r e o b t a i n e d f o r g e l s o l i n b y m e a s u r i n g i t s i n t r i n s i c f l u o r e s c e n c e a n d e l l i p t i c i t y v a l u e s . T h e m e l t i n g t e m p e r a t u r e v a l u e s o b t a i n e d w e r e Tm « 4 6 °C i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m a n d Tm « 54 °C i n t h e p r e s e n c e o f t h e d i v a l e n t c a t i o n . T h e m i d - p o i n t o f t h e t r a n s i t i o n i n t h e g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e - i n d u c e d u n f o l d i n g o f g e l s o l i n w a s f o u n d t o b e a t « 1 . 5 M d e n a t u r a n t . G e l s o l i n i s a b l e t o n u c l e a t e a c t i n p o l y m e r i z a t i o n a n d s e v e r a c t i n f i l a m e n t s . T h e s e a c t i v i t i e s a r e m a n i f e s t e d b y t h e a b o l i t i o n o f t h e l a g p h a s e i n t h e t i m e c o u r s e o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n a n d t h e d e c r e a s e d s t e a d y s t a t e v i s c o s i t y o f a c t i n s o l u t i o n s p o l y m e r i z e d i n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n . G e l s o l i n i n t e r a c t s w i t h a c t i n l a b e l l e d w i t h t h e f l u o r e s c e n t p r o b e 6 - a c r y l o y l - 2 - d i m e t h y l a m i n o n a p h t h a l e n e ( a c r y l o d a n ) t o p r o d u c e a 2 : 1 a c t i n : g e l s o l i n c o m p l e x i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m . U p o n c h e l a t i o n o f t h e d i v a l e n t c a t i o n i i from t h e 2:1 complex, one a c t i n m o l e c u l e i s r e l e a s e d p r o d u c i n g a 1:1 E G T A - r e s i s t a n t complex . The f l u o r e s c e n c e o f 2 - ( N - m e t h y l a n i l i n o ) n a p h t h a l e n e - 6 -sulphonate (MANS), a f l u o r e s c e n t probe t h a t i s s e n s i t i v e t o the p o l a r i t y o f i t s environment, i s b o t h enhanced and b l u e s h i f t e d upon b i n d i n g t o g e l s o l i n . These r e s u l t s a r e i n d i c a t i v e o f the b i n d i n g o f MANS t o hydrophobic r e g i o n s i n g e l s o l i n . G e l s o l i n b i n d s 2.5 ± 0.9 molecules o f MANS w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f 0.24 ± 0.13 |1M. G e l s o l i n can be l a b e l l e d i n t h e absence o f d i v a l e n t c a t i o n s w i t h t h e s u l f h y d r y l - s p e c i f i c p r o b e N - ( l -p y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e (PIA) w i t h o u t a l t e r i n g i t s s t r u c t u r a l i n t e g r i t y . The l a b e l l e d p r o t e i n p r e s e n t s e x c i m e r - l i k e pyrene e m i s s i o n i n d i c a t i v e o f t h e p r o x i m i t y o f the l a b e l l e d c y s t e i n e s i n t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . The s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n i n d i c a t e t h a t t h e e x c i m e r e m i s s i o n a r i s e s from i n t e r a c t i o n s t h a t can be t r a c e d t o t h e ground s t a t e o f t h e pyrene m o l e c u l e s . T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e w e l l s t u d i e d excimer e m i s s i o n t h a t a r i s e s from molecules t h a t r e p e l each o t h e r i n t h e ground s t a t e . i i i TABLE OF CONTENTS page ABSTRACT i i LIST OF TABLES v i i i LIST OF FIGURES i x ACKNOWLEDGMENTS x i i ABBREVIATIONS x i i i INTRODUCTION 1 A. G e l s o l i n : An Act i n - B i n d i n g P r o t e i n 1 B. E x c i t e d S t a t e D e a c t i v a t i o n Pathways. An overview. 8 B . l . F l u o r e s c e n c e P o l a r i z a t i o n 13 B.2. E x c i t e d S t a t e Quenching 16 B.3. Excimer Formation 17 B. 4. E x c i t a t i o n Energy T r a n s f e r 20 C. Luminescence Probes i n the Study o f P r o t e i n s 21 C. l . I n t r i n s i c Probes 22 C.2. E x t r i n s i c Probes 23 C.2.a. Noncovalent Probes t o Study P r o t e i n s . . . 23 C.2.b. M o l e c u l e s t h a t B i n d C o v a l e n t l y t o P r o t e i n s 25 C.2.c. M e t a l Ions 25 RESULTS AND DISCUSSION 27 PART I . I s o l a t i o n o f G e l s o l i n from Horse Plasma 27 PART I I . P h y s i c o c h e m i c a l C h a r a c t e r i z a t i o n 32 A . A b s o r p t i o n C o e f f i c i e n t 32 B . M o l e c u l a r W e i g h t b y S D S - P A G E 3 3 C . A m i n o A c i d . C o m p o s i t i o n 34 D . S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t 3 6 E . M o l e c u l a r W e i g h t a n d S t o k e s ' R a d i u s D e t e r m i n e d b y G e l F i l t r a t i o n 3 8 F . U V A b s o r p t i o n a n d F l o r e s c e n c e E m i s s i o n S p e c t r a . . . 42 G . C i r c u l a r D i c h r o i s m S p e c t r a 44 H . S t a b i l i t y t o T e m p e r a t u r e a n d C h e m i c a l D e n a t u r a n t s 4 6 P A R T I I I . I n t e r a c t i o n w i t h A c t i n 54 A . D i f f e r e n c e A b s o r b a n c e 5 5 B . V i s c o m e t r y 57 C . I n t e r a c t i o n o f G e l s o l i n w i t h A c t i n L a b e l l e d w i t h A c r y l o d a n 58 C . l . S p e c t r a l C h a r a c t e r i s t i c s 5 9 C . 2 . C a l c i u m S e n s i t i v i t y a n d S t o i c h i o m e t r y o f B i n d i n g 62 D . C i r c u l a r D i c h r o i s m a n d UV A b s o r p t i o n S t u d i e s o f G e l s o l i n a n d i t s B i n d i n g t o A c t i n 67 P A R T I V . I n t e r a c t i o n o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n w i t h t h e H y d r o p h o b i c F l u o r e s c e n t P r o b e M A N S . . 7 0 A . B i n d i n g o f MANS t o G e l s o l i n 7 1 B . D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t a n d N u m b e r o f B i n d i n g S i t e s . 7 1 C . E f f e c t o f MANS o n G e l s o l i n A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e . 74 D . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f M A N S - G e l s o l i n ' . . 7 5 E . C o r r e l a t i o n T i m e o f M A N S - G e l s o l i n 77 v P A R T V . C o v a l e n t L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h T h e F l u o r e s c e n t P r o b e N - ( 1 - p y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e . A P r o b e o f C y s t e i n e s P r o x i m i t y 81 A . L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h P I A 8 7 B . D e g r e e o f L a b e l l i n g o f P I A - G e l s o l i n 88 C . E m i s s i o n C h a r a c t e r i s t i c s 8 9 D . G r o u n d S t a t e I n t e r a c t i o n s 91 F . L i f e t i m e M e a s u r e m e n t s 1 0 3 G . A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e o f P I A - G e l s o l i n 1 0 4 C O N C L U S I O N S 1 0 9 E X P E R I M E N T A L S E C T I O N 1 1 3 A . P r e p a r a t i o n o f p r o t e i n s 1 1 3 A . l G e l s o l i n I s o l a t i o n 1 1 3 A . l . a . P r e p a r a t i o n o f P l a s m a 1 1 3 A . l . b . G e l s o l i n P u r i f i c a t i o n 1 1 3 A . 2 . A c t i n I s o l a t i o n 1 1 4 B . S D S - P A G E 1 1 5 C . A m i n o A c i d A n a l y s i s 1 1 6 D . S e d i m e n t a t i o n V e l o c i t y 1 1 6 E . G e l F i l t r a t i o n 1 1 7 F . V i s c o m e t r y 1 1 8 G . L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h P I A 1 1 8 G . l . D e g r e e o f L a b e l l i n g o f P I A - G e l s o l i n 1 1 9 H . L a b e l l i n g o f A c t i n w i t h A c r y l o d a n 1 1 9 H . I. D e g r e e o f L a b e l l i n g o f A D A - a c t i n 1 2 0 vi I . A b s o r p t i o n S p e c t r o s c o p y . . 1 2 0 J . F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y 1 2 1 J . l . S t e a d y S t a t e M e a s u r e m e n t s 1 2 1 J . 2 . F l u o r e s c e n c e P o l a r i z a t i o n 1 2 1 J . 3 . L i f e t i m e M e a s u r e m e n t s 1 2 2 K . C i r c u l a r D i c h r o i s m M e a s u r e m e n t s 1 2 2 L . N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e 1 2 3 R E F E R E N C E S 1 2 4 v i i L I S T OF T A B L E S T a b l e C a p t i o n P a g e I. C a l c u l a t i o n o f t h e A b s o r p t i o n C o e f f i c i e n t o f G e l s o l i n 3 1 I I . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n o f P l a s m a G e l s o l i n s 3 5 I I I . S u m m a r y o f t h e P h y s i c o c h e m i c a l P a r a m e t e r s o f G e l s o l i n 5 3 I V . E f f e c t o f G e l s o l i n o n G - A c t i n P o l y m e r i z a t i o n a n d o n t h e V i s c o s i t y o f A c t i n F i l a m e n t s 58 V . E f f e c t o f MANS o n A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e o f G e l s o l i n 7 5 V I . p V a l u e s f o r t h e E x c i t a t i o n a n d A b s o r p t i o n S p e c t r a o f P I A - D T T , P I A - M E , P I A - G e l s o l i n a n d P I A - A c t i n 94 V I I P r o t o n NMR S p e c t r a l D a t a o f P I A i n DMF a n d D M F / b u f f e r 1 0 0 V I I I T h e r m a l l y - I n d u c e d C h a n g e s o n t h e D e c a y P a r a m e t e r s o f P I A - G e l s o l i n a t 4 8 3 nm 1 0 1 I X . A c t i v i t y o f P I A - G e l s o l i n o n A c t i n P o l y m e r i z a t i o n . 1 0 5 v i i i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e C a p t i o n P a g e 1 . P o l y m e r i z a t i o n o f A c t i n 3 2 . A c t i n B i n d i n g P r o t e i n s 5 3 . J a b l o n s k i D i a g r a m 9 4 . E m i s s i o n C h a r a c t e r i s t i c s o f P y r e n e S o l u t i o n s i n C y c l o h e x a n e 18 5. S c h e m a t i c D i a g r a m o f L u m i n e s c e n t P r o b e s t o S t u d y P r o t e i n s 22 6 . I s o l a t i o n o f G e l s o l i n f r o m H o r s e P l a s m a 30 7 . M o l e c u l a r M a s s o f G e l s o l i n b y S D S - P A G E 34 8. T y p i c a l S c h l i e r e n P a t t e r n 36 9 . I n t r i n s i c S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t o f G e l s o l i n . 37 1 0 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e M o l e c u l a r M a s s o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n b y G e l F i l t r a t i o n 39 1 1 . D e t e r m i n a t i o n o f S t o k e s ' R a d i u s o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n b y G e l F i l t r a t i o n 40 1 2 . A b s o r p t i o n S p e c t r u m o f G e l s o l i n 43 1 3 . P o l y p e t i d e R e f e r e n c e D a t a 44 1 4 . F a r UV C i r c u l a r D i c h r o i s m S p e c t r u m o f G e l s o l i n . . 45 1 5 . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f G e l s o l i n a s F o l l o w e d b y F l u o r e s c e n c e 47 1 6 . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f G e l s o l i n b y C i r c u l a r D i c h r o i s m 4 9 1 7 . U n f o l d i n g o f G e l s o l i n b y G u - H C l 50 ix 18. Schematic R e p r e s e n t a t i o n o f t h e E f f e c t s o f G e l s o l i n on A c t i n P o l y m e r i z a t i o n 55 19. N u c l e a t i o n A c t i v i t y o f Horse Plasma G e l s o l i n on A c t i n P o l y m e r i z a t i o n 56 20. Schematic R e p r e s e n t a t i o n o f the I n t e r a c t i o n o f A c t i n and G e l s o l i n 58 21. F l u o r e s c e n c e E m i s s i o n S p e c t r a o f ADA-actin 60 22. Stern-Volmer P l o t s f o r t h e Quenching o f A c r y l o d a n i n A c t i n and i n the A c r y l o d a n - L a b e l l e d A c t i n - G e l s o l i n Complex 61 23. T i t r a t i o n o f ADA-Actin w i t h G e l s o l i n 63 24. P o l a r i z a t i o n I n c r e a s e i n t h e F l u o r e s c e n c e o f G e l s o l i n upon B i n d i n g t o A c t i n 66 25. C o n f o r m a t i o n a l Changes i n G e l s o l i n upon I n t e r a c t i o n w i t h A c t i n 69 26. E m i s s i o n S p e c t r a o f MANS i n B u f f e r , G e l s o l i n and I s o p r o p a n o l 72 27. T i t r a t i o n s o f t h e I n c r e a s e i n t h e F l u o r e s c e n c e I n t e n s i t y o f MANS a t 420 nm 73 28. Thermal D e n a t u r a t i o n o f MANS:Gelsolin 7 6 29. P e r r i n P l o t f o r MANS : G e l s o l i n 78 30. P o t e n t i a l Energy Diagrams f o r t h e Ground and E x c i t e d S t a t e s o f M and Q 83 31. H y p o t h e t i c a l P o t e n t i a l Energy Curves o f Adsorbed Pyrene 85 32. E x c i t a t i o n and E m i s s i o n S p e c t r a o f P I A - G e l s o l i n . . . 90 33. Model Compounds PIA-DTT and PIA-ME 92 X 3 4 . P I A - G e l s o l i n E x c i m e r a n d D e c a y C u r v e s t o g e t h e r w i t h E x c i t a t i o n P u l s e 96 3 5 . P r o p o s e d M o d e l t o E x p l a i n t h e S p e c t r o s c o p i c C h a r a c t e r i s t i c s o f P I A - G e l s o l i n 97 3 6 . Q u e n c h i n g S t u d i e s o f t h e Two C o m p o n e n t s o f t h e E x c i m e r D e c a y o f P I A - G e l s o l i n 1 0 3 3 7 . T h e r m a l S t a b i l i t y o f P I A - G e l s o l i n 1 0 4 3 8 . T e m p e r a t u r e E f f e c t o n t h e F l u o r e s c e n c e o f P I A - G e l s o l i n 1 0 6 x i ACKNOWLED GEMENT S I t h a n k P r o f e s s o r L . D . B u r t n i c k f o r h i s g u i d a n c e d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k M s D a n a Z e n d r o w s k y , a n I n s t r u c t o r w i t h c o n t a g i o u s e n t h u s i a s m , f o r m a k i n g T A ' i n g a n i n v a l u a b l e e x p e r i e n c e f o r a l l t h e f o r t u n a t e T A ' s o f C h e m 2 3 0 . A l s o , . f o r h e r g r e a t h u m a n q u a l i t y . I w i l l a l w a y s b e i n d e b t t o P r o f e s s o r N . J . T u r r o f r o m C o l u m b i a U n i v e r s i t y f o r h i s h o s p i t a l i t y a n d c o n t i n u o u s a d v i c e d u r i n g t h e w r i t i n g o f t h i s t h e s i s . S p e c i a l t h a n k s f o r h i s g u i d a n c e a n d s u p e r v i s i o n d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f P A R T V o f t h i s t h e s i s . T h e " T u r r o g r o u p " i s a p l a c e o f c o n t i n u o u s l e a r n i n g . T h a n k s a r e d u e t o D r K . R . G o p i d a s f o r s h a r i n g h i s e x p e r t i s e i n m e a s u r i n g t h e l i f e t i m e s p r e s e n t e d i n t h e t h e s i s . T h a n k s t o M i g u e l , w h o b e s i d e s b e i n g my i n s p i r a t i o n a n d e x a m p l e h a s g i v e n t i m e f o r a d v i c e a n d e n c o u r a g e m e n t , m a k i n g my w o r k e a s i e r . F i n a n c i a l s u p p o r t f r o m t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a i n t h e f o r m o f a U n i v e r s i t y G r a d u a t e F e l l o w s h i p a n d f r o m C o n s e j o N a c i o n a l d e C i e n c i a y T e c n o l o g i a ( M e x i c o ) t o f i n i s h t h i s t h e s i s , i s a l s o g r e a t l y a p p r e c i a t e d . T o c l o s e w i t h a g o l d e n s e a l : q u i e r o a g r a d e c e r a mama y a p a p a p o r e l e j e m p l o y m o t i v a c i o n a l e s t u d i o q u e n o s i n c u l c a r o n d e s d e p e q u e f i a s . A m i s N i n a s C o n c h i t a y J o s e f i n a " m i s q u e r i d a s m a e s t r a s " . A m i s h e r m a n o s y a l a f a m i l i a M e n d o z a p o r l a s p o r r a s . G r a c i a s a I n g r i d p o r e s c u c h a r l a s p l a t i c a s q u e a l g u n a v e z t u v e q u e p r e s e n t a r y p o r s u v a l i o s a e i n u m e r a b l e a y u d a e n e l l a b o r a t o r i o . G r a c i a s a M i g u e l p o r e l a m o r e i n s p i r a c i o n q u e me d a y p o r q u e j u n t o s v e m o s q u e e s t a t e s i s n o e s e l f i n a l s i n o u n p a s o e n l a r e a l i z a c i o n d e n u e s t r o s p l a n e s . x i i A b b r e v i a t i o n s A D A A D A - A c t i n A T P . B u f f e r A B u f f e r D B u f f e r E A c r y l o d a n ( 6 - a c r y l o y 1 - 2 - d i m e t h y l a m i n o -n a p h t h a l e n e ) A c t i n l a b e l l e d w i t h a c r y l o d a n A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e 2 mM T r i s - H C l , 1 mM D T T , 0 . 2 mM C a C l 2 , 0 . 2 mM A T P , p H - 7 . 6 2 0 mM M O P S , 1 5 0 mM K C 1 , 1 mM E D T A , p H = 2 0 mM M O P S , 1 5 0 mM K C 1 , 1 mM E G T A , p H = 7 . 6 7 . 2 CD C i r c u l a r d i c h r o i s m DTT D i t h i o t h r e i t o l E D T A E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d E G T A E t h y l e n e b i s ( o x y e t h y l e n e n i t r i l o ) t e t r a a c e t i c a c i d G - A c t i n G l o b u l a r a c t i n G u - H C l G u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e F - A c t i n F i l a m e n t o u s a c t i n MANS 2 - ( N - M e t h y l a n i l i n o ) n a p h t h a l e n e - 6 - s u l f o n a t e MOPS 4 - ( N - M o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l p h o n i c a c i d ME M e r c a p t o e t h a n o l PMSF P h e n y l m e t h y l s u l p h o n y l f l u o r i d e P I A N - ( 1 - P y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e P I A - G e l s o l i n G e l s o l i n l a b e l l e d w i t h P I A P M N - ( 1 - P y r e n y l ) m a l e i m i d e S D S - P A G E S o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s T r i s T r i s ( h y d r o i f y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e x i i i INTRODUCTION A. G e l s o l i n . An A c t i n - B i n d i n g P r o t e i n . G e l s o l i n i s an abundant p r o t e i n i n v e r t e b r a t e s t h a t was named a f t e r i t s a b i l i t y t o p e r f o r m g e l - s o l t r a n s f o r m a t i o n s i n c y t o p l a s m i c e x t r a c t s . 1 G e l s o l i n e x i s t s b o t h as an i n t r a c e l l u l a r and as a s e c r e t e d p r o t e i n . 2 B o t h f o r m s h a v e s i m i l a r f u n c t i o n a l a n d s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s , d i f f e r i n g o n l y i n a 25 amino a c i d e x t e n s i o n a t t h e amino t e r m i n u s o f t h e e x t r a c e l l u l a r form as compared t o t h e i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n . 3 ' 4 The b i o l o g i c a l importance o f g e l s o l i n r e l i e s on t h e f a c t t h a t i t b i n d s t o a c t i n . A c t i n i s one o f t h e most abundant p r o t e i n s i n n a t u r e and i t can e x i s t as a s i n g l e m o l e c u l a r u n i t ( G - a c t i n o r g l o b u l a r a c t i n ) o r as a f i l a m e n t o u s p o l y m e r ( F - a c t i n ) depending on f a c t o r s such as pH, temperature, t h e presence of s a l t s and t h e presence o f a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n s . 5 - 1 0 The p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n has been s t u d i e d i n some d e t a i l . In t h e absence o f o t h e r b i n d i n g o r i n t e r a c t i n g p r o t e i n s i t has been shown t o c o n s i s t o f a t l e a s t 4 s t e p s : 8 ' 1 1 (a) Monomer a c t i v a t i o n . T h i s i s a c o n f o r m a t i o n a l change i n the s t r u c t u r e o f a c t i n t h a t r e s u l t s i n a f o r m t h a t i s m o r e r e s i s t a n t t o p r o t e o l y s i s . T h i s f o r m i s k n o w n t o e x h i b i t a UV a b s o r p t i o n s p e c t r u m d i f f e r e n t t h a n t h a t o f G - a c t i n . (b ) N u c l e a t i o n . P o l y m e r i z a t i o n r e q u i r e s t h e f o r m a t i o n o f a s t a b l e n u c l e u s c o n s i s t i n g o f a b o u t t h r e e a c t i n m o l e c u l e s f r o m w h i c h t h e p o l y m e r c h a i n c a n g r o w . ( c ) E l o n g a t i o n . A d d i t i o n o f a c t i n m o n o m e r s t o t h e s t a b l e n u c l e u s r e s u l t s i n f i l a m e n t g r o w t h . A t t h i s s t a g e t h e r a t e o f a s s o c i a t i o n o f a c t i n m o n o m e r s w i t h f i l a m e n t e n d s e x c e e d s t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n . T h e e n d s o f t h e p o l y m e r a r e d i f f e r e n t a n d i t i s p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h a f a s t g r o w i n g a n d a s l o w g r o w i n g e n d (B a n d P r e s p e c t i v e l y i n f i g u r e l a ) . (d ) B r e a k i n g a n d a n n e a l i n g o f a c t i n f i l a m e n t s . B r e a k i n g a n d a n n e a l i n g a r e p o s s i b l e m e c h a n i s m s f o r l e n g t h e n i n g a n d s h o r t e n i n g F - a c t i n . T h e s e e v e n t s a r e m a n i f e s t e d a s a d e c r e a s e i n t h e v i s c o s i t y o f p o l y m e r i c a c t i n w h i c h m a y o c c u r u p o n s o n i c a t i o n . A r e c o v e r y o f v i s c o s i t y i s o b s e r v e d a f t e r c e s s a t i o n o f t h e s o n i c a t i o n . T h e s e p r o c e s s e s c a n a l s o b e d e d u c e d t h r o u g h k i n e t i c m o d e l i n g o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . E x p e r i m e n t a l l y , t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n c a n b e e a s i l y i n d u c e d b y a d d i t i o n o f s a l t s s u c h a s M g C l 2 a n d K C 1 ( F i g u r e l a ) . T h i s p r o c e s s c a n b e f o l l o w e d i n s e v e r a l w a y s b y t a k i n g a d v a n t a g e o f p r o p e r t i e s t h a t s h o w s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e a c t i n m o n o m e r a n d p o l y m e r . A m o n g -2-t h e s e p r o p e r t i e s we f i n d : v i s c o s i t y , d i f f e r e n c e a b s o r b a n c e , f l o w b i r e f r i n g e n c e a n d f l u o r e s c e n c e o f p y r e n y l i o d o a c e t a m i d e - l a b e l l e d a c t i n . B y a n y o f t h e s e m e t h o d s , t h e s a l t i n d u c e d t i m e c o u r s e o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n ( F i g u r e l b ) i s f o u n d t o c o n s i s t o f a s l o w p h a s e t h a t d e p e n d s o n t h e t h i r d p o w e r o f a c t i n c o n c e n t r a t i o n a n d a f a s t p h a s e t h a t d e p e n d s d i r e c t l y o n a c t i n c o n c e n t r a t i o n . N u c l e a t i o n a c c o u n t s f o r t h e i n i t i a l s l o w p h a s e , a n d t h e r a p i d p h a s e i s a t t r i b u t e d t o t h e e l o n g a t i o n o f t h e f i l a m e n t s . J T 1-Time (tain) F i g u r e 1. P o l y m e r i z a t i o n o f A c t i n . A s a m p l e o f m o n o m e r i c a c t i n i s i n d u c e d t o p o l y m e r i z e b y a d d i n g s a l t a t t i m e e q u a l z e r o , ( a ) S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a c t i n a s s e m b l y , (b ) T i m e c o u r s e o f t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n i n d u c e d b y s a l t s . T h e p l o t i s c o n s t r u c t e d w i t h t h e c h a n g e s o b s e r v e d i n t h e m e a s u r e d p r o p e r t y a g a i n s t t i m e . 8 C o n d i t i o n s i n l i v i n g c e l l s s h o u l d f a v o u r p o l y m e r i z a t i o n . I n m u s c l e c e l l s , w h e r e t h e m a i n f u n c t i o n o f a c t i n i s c o n t r a c t i l e a c t i v i t y , m o s t o f t h e a c t i n i s f o u n d -3-i n p o l y m e r i c f o r m . I n n o n - m u s c l e c e l l s , a c t i n i s f o u n d i n a m o r e d y n a m i c s t a t e r e g u l a t e d i n a r e m a r k a b l y p r e c i s e m a n n e r b y s e v e r a l p r o t e i n s c a l l e d a c t i n b i n d i n g p r o t e i n s . A c t i n b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s a n d h a v e b e e n c l a s s i f i e d a c c o r d i n g t o t h e i r e f f e c t s o n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n i n t o t h r e e m a j o r c a t e g o r i e s : 6 (1) M o n o m e r S e q u e s t e r i n g P r o t e i n s . T h e s e a r e p r o t e i n s t h a t b i n d t o a c t i n m o n o m e r s a n d d o n o t a l l o w t h e m t o p o l y m e r i z e . I n a n a l r e a d y f o r m e d p o l y m e r , t h e a c t i n m o n o m e r s a s s o c i a t e a n d d i s s o c i a t e a t t h e e n d s o f t h e f i l a m e n t . B y t r a p p i n g a c t i n m o n o m e r s , s e q u e s t e r i n g p r o t e i n s h a v e t h e n e t e f f e c t o f d e p o l y m e r i z i n g F - a c t i n . (2) C a p p i n g a n d S e v e r i n g P r o t e i n s . T h e s e p r o t e i n s r e g u l a t e t h e a v e r a g e l e n g t h o f a c t i n f i l a m e n t s b y a c c e l e r a t i n g t h e ( s l o w ) n u c l e a t i o n s t e p i n t h e t i m e c o u r s e o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . T h i s e f f e c t r e s u l t s i n s h o r t e r , m o r e a b u n d a n t f i l a m e n t s t h a t f o r m f a s t e r t h a n d u r i n g p o l y m e r i z a t i o n i n t h e a b s e n c e o f t h e c a p p i n g p r o t e i n . T h e s e p r o t e i n s m a y a l s o r e d u c e t h e a v e r a g e p o l y m e r l e n g t h b y s e v e r i n g p r e v i o u s l y f o r m e d a c t i n f i l a m e n t s a t s i t e s a w a y f r o m t h e p o l y m e r e n d s . (3) C r o s s l i n k i n g P r o t e i n s . T h e s e p r o t e i n s c r o s s l i n k p o l y m e r i c a c t i n t o p r o d u c e n e t w o r k s o r b u n d l e s o f a c t i n f i l a m e n t s . - 4 -D i f f e r e n t a c t i n b i n d i n g p r o t e i n s m a y s h o w o n e o r a c o m b i n a t i o n o f t h e s e m a i n a c t i v i t i e s . A s a r e s u l t , a c t i n i n n o n - m u s c l e c e l l s i s f o u n d i n a w i d e v a r i e t y o f t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s ( F i g u r e 2 ) . MOltOMER SEQUESTRATION CAPWMG CROSSUHKItlO Short Capped Filaments * » Moncraar Bound to DepolynBrzlng Protein Monomers Long Filanent Network Bundle F i g u r e 2. A c t i n B i n d i n g P r o t e i n s . M o n o m e r i c a c t i n ( . ) , a c t i n p o l y m e r ( T r > ). T h e a c t i n b i n d i n g p r o t e i n s a r e r e p r e s e n t e d b y t h e f o l l o w i n g s y m b o l s : c a p p i n g a n d s e v e r i n g p r o t e i n s ( [ ) , m o n o m e r b i n d i n g p r o t e i n s ( c ) , c r o s s l i n k i n g p r o t e i n s ( ~ ) . 6 T h e d y n a m i c i n t e r c o n v e r s i o n o f t h e v a r i o u s f o r m s o f a c t i n p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n g o v e r n i n g c e l l m o t i l i t y a n d c e l l s h a p e . I n t h i s r e s p e c t , g e l s o l i n a f f e c t s a c t i n p o l y m e r i z a t i o n t h r o u g h m u l t i p l e a n d c o m p l e x i n t e r a c t i o n s . 1 2 T h e s e h a v e b e e n s h o w n t o o c c u r i n a t l e a s t t h r e e d i f f e r e n t w a y s : -5-(1) S e v e r i n g o f a c t i n f i l a m e n t s . (2) C a p p i n g ( b i n d i n g t o t h e B e n d o f t h e f i l a m e n t ) . (3) N u c l e a t i o n o f a c t i n a s s e m b l y . I t h a s b e e n s u g g e s t e d , t h e r e f o r e , t h a t t h e i m p o r t a n c e o f i n t r a c e l l u l a r g e l s o l i n a r i s e s f r o m i t s a b i l i t y t o c o n t r o l t h e c o n s i s t e n c y o f t h e c y t o p l a s m . 1 T h e i m p o r t a n c e o f t h e s e c r e t e d f o r m o f g e l s o l i n 1 3 - 1 6 i s a l s o a s s o c i a t e d w i t h i t s i n t e r a c t i o n s w i t h a c t i n . A c t i n i s o n e o f t h e m a j o r c o n s t i t u e n t s o f m a m m a l i a n c e l l s . A s a r e s u l t o f c e l l d e a t h o r i n j u r y a c t i n w i l l f i n d i t s w a y i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e . A c t i n t h a t e n t e r s t h e b l o o d , w h e r e i o n i c s t r e n g t h c o n d i t i o n s f a v o u r p o l y m e r i z a t i o n i n t o f i l a m e n t s s e v e r a l m i c r o n s l o n g , h a s t h e p o t e n t i a l t o d i s r u p t f l o w t h r o u g h c a p i l l a r i e s 1 7 ' 1 8 a n d m a y i n t e r f e r e w i t h b l o o d c l o t f o r m a t i o n . 1 9 G e l s o l i n , t o g e t h e r w i t h a n o t h e r p r o t e i n c a l l e d v i t a m i n D b i n d i n g p r o t e i n , D B P , i s t h o u g h t t o m i n i m i z e t h e n e g a t i v e e f f e c t s t h a t a c t i n i n t h e c i r c u l a t i o n m i g h t h a v e . 2 0 - 2 2 B o t h p r o t e i n s a r e p r e s e n t i n m i c r o m o l a r q u a n t i t i e s i n p l a s m a a n d b i n d t o a c t i n w i t h h i g h a f f i n i t y . DBP b i n d s a c t i n m o n o m e r s , r e n d e r i n g t h e m u n a b l e t o p o l y m e r i z e . 2 3 - 2 4 I n c o n t r a s t , g e l s o l i n p r e f e r e n t i a l l y b i n d s a n d s e v e r s f i l a m e n t o u s a c t i n , 2 0 d r a m a t i c a l l y r e d u c i n g i t s e f f e c t o n p l a s m a v i s c o s i t y . T h e c o n c e r t e d a c t i o n o f b o t h p r o t e i n s w o u l d c l e a r a c t i n f i l a m e n t s a n d m o n o m e r s f r o m t h e c i r c u l a t i o n . T h e i n t e r a c t i o n s o f g e l s o l i n w i t h a c t i n a r e r e g u l a t e d b y c a l c i u m a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l . T h e c a l c i u m -6-c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d v a r i e s f o r e a c h o f t h e d i f f e r e n t a c t i v i t i e s o f g e l s o l i n o n a c t i n , 2 5 s e v e r i n g b e i n g t h e a c t i v i t y w i t h t h e m o s t s t r i n g e n t r e q u i r e m e n t s . T h e s e p r o p e r t i e s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s f o u n d i n v e r t e b r a t e s . T h e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n v a r i e s i n r e s p o n s e t o d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l s t i m u l i o n t h e c e l l . T h i s f l u c t u a t i o n w o u l d a l l o w t h e i n t r a c e l l u l a r g e l s o l i n t o p e r f o r m i t s f u n c t i o n a n d c o n t r o l t h e c o n s i s t e n c y o f t h e c y t o p l a s m . T h e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n p l a s m a i s c o n s t a n t (=» 2 mM) . T h i s v a l u e i s l a r g e r t h a n t h e c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y (\iM) f o r g e l s o l i n t o a f f e c t a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . T h i s a s s u r e s ^ t h a t t h e p r o p o s e d r o l e o f g e l s o l i n a s a s e v e r i n g p r o t e i n i n p l a s m a w i l l b e i n e f f e c t a t a l l t i m e s . T h i s t h e s i s i s d i r e c t e d t o w a r d s t h e i s o l a t i o n o f g e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a a n d t h e s t u d y o f i t s s t r u c t u r e a n d i n t e r a c t i o n s w i t h a c t i n u s i n g s e v e r a l e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s . O f s p e c i a l i n t e r e s t a r e f o r m s o f a b s o r p t i o n a n d f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p i e s t h a t a r e p a r t i c u l a r l y u s e f u l f o r t h e s t u d y o f m a c r o m o l e c u l e s . T h e s e t e c h n i q u e s o f f e r c o m p l e m e n t a r y r a t h e r t h a n r e d u n d a n t i n f o r m a t i o n . A n a l y t i c a l l y , f l u o r e s c e n c e h a s s o m e a d v a n t a g e s o v e r a b s o r p t i o n ; i t s g r e a t e r s e n s i t i v i t y a l l o w s t h e s t u d y o f s m a l l a m o u n t s o f m a t e r i a l w h i c h a r e c o m m o n l y f o u n d i n b i o l o g i c a l s a m p l e s . S e v e r a l p a r a m e t e r s , c h a r a c t e r i s t i c o f a g i v e n s a m p l e c o m p o n e n t , c a n b e m e a s u r e d a n d a n a l y z e d . O n e a p p r o a c h c o m m o n l y u s e d i s t o s t u d y t h e s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f a s m a l l e r m o l e c u l e a t t a c h e d t o t h e p r o t e i n o f i n t e r e s t . C a r e f u l a n a l y s i s c o m b i n e d w i t h s o m e k n o w l e d g e o f t h e p r o t e i n u n d e r s t u d y ( p e r h a p s o b t a i n e d b y u s i n g d i f f e r e n t m e t h o d o l o g i e s ) a l l o w s o n e t o d e d u c e s t r u c t u r a l , e q u i l i b r i u m a n d d y n a m i c p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n u n d e r s t u d y . T h e d e v e l o p m e n t o f s e v e r a l f l u o r e s c e n t p r o b e s w i t h d i f f e r e n t s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s a l l o w s t h e s t u d y o f b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s u n d e r a w i d e v a r i e t y o f e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . W i t h t h i s i n m i n d , a b r i e f r e v i e w o f t h e f a c t o r s t h a t d e t e r m i n e t h e e x c i t e d s t a t e p r o p e r t i e s o f t h e s e p r o b e s i s i n o r d e r . B . E x c i t e d S t a t e D e a c t i v a t i o n P a t h w a y s . A n O v e r v i e w . M o l e c u l e s a r e f o u n d i n a n e x c i t e d s t a t e u p o n a b s o r p t i o n o f v i s i b l e o r u l t r a v i o l e t l i g h t . B e i n g d i s p l a c e d f r o m t h e r m o d y n a m i c e q u i l i b r i u m , s e v e r a l p r o c e s s e s c o n t r i b u t e t o t h e d e a c t i v a t i o n o f t h e e x c i t e d s t a t e . I f t h e p r o c e s s g i v e s r i s e t o a c h e m i c a l l y d i s t i n g u i s h a b l e p r o d u c t i t i s s a i d t o b e p h o t o c h e m i c a l , o t h e r w i s e i t i s s a i d t o b e p h o t o p h y s i c a l . P h o t o p h y s i c a l p r o c e s s e s i n c l u d e c o n v e r s i o n t o t h e r m a l e n e r g y , c o n v e r s i o n b e t w e e n s t a t e s , e n e r g y t r a n s f e r a n d r a d i a t i v e d i s s i p a t i o n . R a d i a t i v e m e c h a n i s m s a r e c h a r a c t e r i z e d b y e m i s s i o n o f a p h o t o n a n d a r e t e r m e d f l u o r e s c e n c e o r p h o s p h o r e s c e n c e , d e p e n d i n g o n w h e t h e r t h e t r a n s i t i o n i s b e t w e e n s t a t e s o f t h e s a m e o r d i f f e r e n t m u l t i p l i c i t y . -8-A s i m p l i f i e d v e r s i o n o f t h e J a b l o n s k i d i a g r a m w h e r e s t a t e s o f t h e s a m e m u l t i p l i c i t y a r e a r r a n g e d i n s t a c k s i l l u s t r a t e s s o m e o f t h e p a t h w a y s a v a i l a b l e t o t h e e x c i t e d s t a t e ( F i g u r e 3 ) . S i n g l e t s t a t e s ( S i , S2, e t c ) a r e t h o s e w h e r e t h e e l e c t r o n s a r e p a i r e d . A t r i p l e t s t a t e (T) i s o n e w i t h t w o u n p a i r e d e l e c t r o n s . T r a n s i t i o n s b e t w e e n s t a t e s o f t h e s a m e m u l t i p l i c i t y a r e s p i n a l l o w e d a n d t r a n s i t i o n s b e t w e e n s t a t e s o f d i f f e r e n t m u l t i p l i c i t y a r e s p i n f o r b i d d e n . Si . A So F i g u r e 3. J a b l o n s k i D i a g r a m . T h e a b s o r p t i o n o f l i g h t (A) i s g o v e r n e d b y q u a n t u m m e c h a n i c a l s e l e c t i o n r u l e s a n d o c c u r s o n a t i m e s c a l e o f t h e o r d e r o f 10"16 s . T h i s i s s m a l l c o m p a r e d w i t h t h e t i m e -9-r e q u i r e d f o r t h e d i s p l a c e m e n t o f n u c l e i , which i s o f t h e o r d e r o f 1 0 ~ 1 3 s. As a r e s u l t , the m o l e c u l e s are found i n a v i b r a t i o n a l l y as w e l l as i n an e l e c t r o n i c a l l y e x c i t e d s t a t e S n (n£l) (Franck-Condon p r i n c i p l e ) . I n s o l u t i o n and s o l i d s , r a p i d r e l a x a t i o n (vr) t o t h e l o w e s t v i b r a t i o n a l l e v e l o f t h e e x c i t e d s t a t e o c c u r s by g i v i n g up a quantum of energy at a t ime upon c o l l i s i o n s w i t h o t h e r m o l e c u l e s . With few e x c e p t i o n s , t h e h i g h e r e l e c t r o n i c e x c i t e d s t a t e s S n ( n > l ) , w i l l i n t e r c o n v e r t r a p i d l y ( i n t e r n a l c o n v e r s i o n , i c ) t o t h e l o w e s t e x c i t e d s i n g l e t ( S i ) . F u r t h e r d e a c t i v a t i o n from S i t o So may o c c u r by t h e e m i s s i o n o f a photon o r by r a d i a t i o n l e s s mechanisms. These p r o c e s s e s a r e known as f l u o r e s c e n c e (F) a n d i n t e r n a l c o n v e r s i o n ( i c ) , r e s p e c t i v e l y . M o l e c u l e s i n S i may a l s o undergo i n t e r s y s t e m c r o s s i n g ( i s c ) t o t h e t r i p l e t m a n i f o l d . R e t u r n from t h e t r i p l e t s t a t e t o t h e ground s t a t e i s a slow p r o c e s s due t o t h e f o r b i d d e n n a t u r e o f t h e t r a n s i t i o n and i t i s termed phosphorescence (P) i f t h e r e l a x a t i o n mechanism i n c l u d e s the e m i s s i o n of a photon. The a l t e r n a t e pathways ( i ) t h a t c o n t r i b u t e t o t h e d e a c t i v a t i o n o f t h e e x c i t e d s t a t e a r e c h a r a c t e r i z e d by an i n t r i n s i c r a t e c o n s t a n t (kj.) and compete w i t h each o t h e r f o r t h e d i s s i p a t i o n o f t h e energy. The e f f i c i e n c y o f each p r o c e s s i s d e f i n e d i n terms o f t h e r e l a t i v e r a t e s o f a l l t h e p a r t i c i p a t i n g p r o c e s s e s . In t h i s manner, t h e quantum - 1 0 -y i e l d o f f l u o r e s c e n c e (Of), w h i c h r e p r e s e n t s t h e f r a c t i o n o f m o l e c u l e s t h a t d e c a y b y f l u o r e s c e n c e , i s d e f i n e d : Of = kf/(kf+Ikr) ( 1 . 1 ) w h e r e _ _ k r g r o u p s a l l t h e c o m p e t i n g p r o c e s s e s f o r t h e d e a c t i v a t i o n o f S i . The q u a n t u m y i e l d , O f , i n d i c a t e s t h e e x t e n t t h a t o t h e r e n e r g y l o s s m e c h a n i s m s c o m p e t e w i t h e m i s s i o n w i t h i n a n e x c i t e d m o l e c u l e . I n t r a n s i e n t s t u d i e s , a f t e r a d e l t a p u l s e o f e x c i t i n g l i g h t , t h e i n t e n s i t y a t t i m e t , d ( t ) ) i s g i v e n b y : l ( t ) = 1 (0 ) e - t / t d - 2 * I ( 0 ) i s t h e i n t e n s i t y a t t i m e z e r o a n d T i s t h e f l u o r e s c e n c e l i f e t i m e , w h i c h r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e t i m e s p e n t b y t h e m o l e c u l e i n t h e e x c i t e d s t a t e . A c c o r d i n g t o t h e t h e o r y o f s p o n t a n e o u s e m i s s i o n , t h e p r o b a b i l i t y o f f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n kf i s d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e t r a n s i t i o n p r o b a b i l i t y o f l i g h t a b s o r p t i o n . T h e n a t u r a l f l u o r e s c e n c e l i f e t i m e (Tr), i s d e f i n e d a s t h e r e c i p r o c a l o f t h e " a l l o w e d n e s s " o f t h e t r a n s i t i o n : T r = 1 / kf ( 1 . 3 ) H o w e v e r , t h e o b s e r v e d l i f e t i m e (Tf), i s u s u a l l y l o w e r t h a n - 1 1 -t h e n a t u r a l l i f e t i m e d u e t o t h e o t h e r c o m p e t i n g p r o c e s s e s . T £ = 1 / ( k f + Ikp) ( 1 . 4 ) T h e m a g n i t u d e a n d e f f i c i e n c y o f e a c h o f t h e a l t e r n a t e p a t h w a y s t o t h e d e a c t i v a t i o n o f t h e e x c i t e d s t a t e i s d e t e r m i n e d b y f a c t o r s s u c h a s t h e s t r u c t u r e o f t h e m o l e c u l e , t h e k i n d o f e x c i t e d s t a t e , n a t u r e o f t h e m e d i u m s u r r o u n d i n g t h e m o l e c u l e , i t s t e m p e r a t u r e a n d p r e s s u r e , a s w e l l a s o t h e r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . M e d i u m E f f e c t s . U p o n a b s o r p t i o n , o f l i g h t , t h e r e i s a c h a r g e r e d i s t r i b u t i o n t h a t m a y r e s u l t i n d i f f e r e n t c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e e x c i t e d s t a t e . I n c o n d e n s e d m e d i a , t h e s o l v e n t m o l e c u l e s , o f t e n r e f e r r e d t o a s t h e e n v i r o n m e n t , m a y i n t e r a c t s t r o n g l y w i t h t h e a l t e r e d , e x c i t e d s t a t e . T h i s i n t e r a c t i o n m a y p r o d u c e a r e l a x e d s t a t e , f a r f r o m t h e i n i t i a l l y f o r m e d , F r a n k - C o n d o n s t a t e a n d / o r p r o d u c e s u b s t a n t i a l c h a n g e s i n t h e r a t e s o f t h e v a r i o u s d e a c t i v a t i n g p r o c e s s e s . T h e s e a l t e r a t i o n s a r e o f t e n m a n i f e s t e d i n t e r m s o f m o d i f i e d q u a n t u m y i e l d s , l i f e t i m e s a n d s p e c t r a l s h i f t s i n t h e e m i s s i o n m a x i m a . T h e i n t e r a c t i o n o f t h e s o l v e n t w i t h t h e m o l e c u l e m a y b e s p e c i f i c o r g e n e r a l : S p e c i f i c s o l v e n t e f f e c t s a p p r o a c h s t o i c h i o m e t r i c l i m i t s a n d a r i s e f r o m s p e c i f i c ( a n d r e l a t i v e l y l o n g l a s t i n g ) c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s s u c h a s h y d r o g e n b o n d i n g a n d f o r m a t i o n o f c h a r g e t r a n s f e r c o m p l e x e s . G e n e r a l s o l v e n t e f f e c t s , i n c o n t r a s t , d e p e n d o n b u l k p r o p e r t i e s s u c h a s s o l v e n t r e f r a c t i v e i n d e x a n d d i e l e c t r i c c o n s t a n t . T h e r i g i d i t y o f t h e m e d i u m m a y a f f e c t t h e m o b i l i t y o f t h e m o l e c u l e d u r i n g t h e l i f e t i m e o f t h e e x c i t e d s t a t e , w h i c h i n t u r n a f f e c t s t h e o b s e r v e d d e p o l a r i z a t i o n a n d b i m o l e c u l a r p r o c e s s e s . T h e c h a n g e s e x p e r i e n c e d b y a f l u o r e s c e n t p r o b e a s i t e x p e r i e n c e s d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s ( a l t h o u g h m o s t o f t h e m e m p i r i c a l ) c a n b e v e r y u s e f u l i n p r o t e i n s t u d i e s . D i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s m a y b e d e t e c t e d u p o n t r a n s f e r r i n g a f l u o r e s c e n t p r o b e t o a p r o t e i n f r o m t h e a q u e o u s m e d i u m . I n t h e c a s e o f p r o t e i n - b o u n d f l u o r o p h o r e s ( g r o u p s o f a t o m s r e s p o n s i b l e f o r t h e f l u o r e s c e n c e ) , c h a n g e s i n t h e e n v i r o n m e n t o f f e r e d b y t h e p r o t e i n t o t h e f l u o r e s c e n t m o l e c u l e m a y b e p r o d u c e d b y c h a n g i n g b u f f e r ( s o l v e n t ) c o m p o s i t i o n , t e m p e r a t u r e o r b i n d i n g t o o t h e r m a c r o m o l e c u l e s . T h e c h a n g e s e x p e r i e n c e d b y t h e f l u o r o p h o r e c a n u s u a l l y b e e x t r a p o l a t e d t o t h e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c s o f t h e p r o t e i n o f i n t e r e s t . B . l . F l o r e s c e n c e P o l a r i z a t i o n . I f a n i s o t r o p i c s a m p l e i s e x c i t e d w i t h p o l a r i z e d l i g h t , t h e r e i s p r e f e r e n t i a l e x c i t a t i o n o f t h e f l u o r o p h o r e s w i t h t h e i r d i p o l e m o m e n t s o r i e n t e d p a r a l l e l t o t h e e l e c t r i c v e c t o r o f t h e e x c i t a t i o n ( p h o t o s e l e c t i o n ) . T h i s r e s u l t s i n -13-p a r t i a l l y p o l a r i z e d e m i s s i o n . P o l a r i z a t i o n i s d e f i n e d a s t h e f r a c t i o n o f l i g h t w h i c h i s l i n e a r l y p o l a r i z e d : p = ( I v - I h ) / ( I v + I h ) ( 1 . 5 ) w h e r e I v a n d I n a r e t h e e m i s s i o n i n t e n s i t i e s o b s e r v e d p a r a l l e l a n d p e r p e n d i c u l a r w i t h r e s p e c t t o v e r t i c a l l y p o l a r i z e d e x c i t a t i o n . T h e p o l a r i z a t i o n w i l l b e a m a x i m u m i f t h e e x c i t e d m o l e c u l e s d o n o t c h a n g e t h e i r p o s i t i o n d u r i n g t h e i r l i f e t i m e a n d i f o t h e r e x t r i n s i c d e p o l a r i z a t i o n p r o c e s s e s a r e a b s e n t . T h e a n g l e b e t w e e n t h e a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n d i p o l e m o m e n t s d e t e r m i n e t h e m a x i m u m o r i n t r i n s i c p o l a r i z a t i o n v a l u e p o . T h e a n g l e b e t w e e n t h e a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n d i p o l e s , 6, a n d p o a r e r e l a t e d t h r o u g h t h e e x p r e s s i o n : PO = ( 3 c o s 2 0 - i ) / ( 3 + c o s 2 8 ) ( 1 . 6 ) C o m m o n l y 6 = 0 a n d po = 0 . 5 I n s o l u t i o n , B r o w n i a n m o t i o n c h a n g e s t h e o r i e n t a t i o n o f t h e m o l e c u l e . I f t h e t i m e o f t h e r o t a t i o n i s c o m p a r a b l e t o t h e i n t e r v a l b e t w e e n a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n , p a r t i a l p o l a r i z a t i o n i s o b s e r v e d . I n s t e a d y s t a t e m e a s u r e m e n t s , t h e r o t a t i o n a l p a r a m e t e r s f o r a m o l e c u l e w i t h s p h e r i c a l s h a p e - 1 4 -a r e r e l a t e d t o t h e d e g r e e o f p o l a r i z a t i o n a s g i v e n b y t h e e q u a t i o n o f P e r r i n . 2 6 1/P - 1/3 = ( l/Po-1/3) (1+ (1.7) <|> i s t h e r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e , w h i c h i s r e l a t e d t o t h e m o l e c u l a r p a r a m e t e r s a c c o r d i n g t o : <J>= TTV/kT = l/6D r (1.8) T] i s t h e v i s c o s i t y o f t h e s o l u t i o n , k i s t h e B o l t z m a n c o n s t a n t , T t h e a b s o l u t e t e m p e r a t u r e a n d V d e n o t e s t h e h y d r a t e d v o l u m e o f a s p h e r i c a l s h a p e . D r i s t h e r o t a t i o n a l d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t . T h e n e q u a t i o n (1.7) c a n b e r e w r i t t e n a s : 1/P - 1/3 = ( l/Po-1/3) (1+ kTT/TJV) (1.9) I n s t u d i e s o f p r o t e i n s i t i s a c o m m o n p r a c t i c e t o o b t a i n t h e c o r r e l a t i o n t i m e b y m e a s u r i n g t h e p o l a r i z a t i o n a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e a n d / o r v i s c o s i t y o f t h e s o l u t i o n . T h e c o r r e l a t i o n t i m e p r o v i d e s i n f o r m a t i o n o n t h e s i z e a n d s h a p e o f t h e m o l e c u l e . A l t e r n a t i v e l y , i f t h e m o l e c u l a r d i m e n s i o n s a r e r e a s o n a b l y w e l l k n o w n , i t i s p o s s i b l e t o g e t i n f o r m a t i o n o n s e g m e n t a l f l e x i b i l i t y . -15-B . 2 . E x c i t e d S t a t e Q u e n c h i n g . E x c i t e d s t a t e s ( n * ) c a n d e a c t i v a t e u p o n b i m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s w i t h s u i t a b l e " q u e n c h e r " m o l e c u l e s (Q) ( S c h e m e I ) S c h e m e I: k q n * + Q n + Q T h e q u e n c h i n g r a t e c o n s t a n t ( k q ) f o l l o w s S t e r n - V o l m e r k i n e t i c s : On/O = 1 + k q T0 [Q] ( 1 . 1 0 ) a n d a c c o r d i n g t o ( 1 . 1 ) a n d ( 1 . 4 ) : T0/T = 1 + k q T0 [Q] ( 1 . 1 1 ) To, Oo a n d T, O a r e t h e l i f e t i m e s a n d q u a n t u m y i e l d s o f t h e m o l e c u l e i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f q u e n c h e r , r e s p e c t i v e l y . [Q] i s t h e q u e n c h e r c o n c e n t r a t i o n , k q To = K s v , t h e S t e r n - V o l m e r c o n s t a n t . When t h e q u e n c h e r i s p r e s e n t i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h e f l u o r o p h o r e a t t h e i n s t a n t o f e x c i t a t i o n , t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f a s i n g l e e m i t t e r may b e a f f e c t e d b y b o t h " c o l l i s i o n a l q u e n c h i n g " a n d " s t a t i c q u e n c h i n g " a c c o r d i n g t o : - 1 6 -O n / O - 1 + k q T o [ Q ] e v t Q ] ( 1 . 1 2 ) V i s t h e s t a t i c q u e n c h i n g p a r a m e t e r t h a t c a n b e i n t e r p r e t e d a s t h e v o l u m e o f a s p h e r e s u r r o u n d i n g t h e e m i t t e r w i t h i n w h i c h t h e e m i s s i o n i s q u e n c h e d b y t h e q u e n c h e r i m m e d i a t e l y a f t e r e x c i t a t i o n . T h e S t e r n - V o l m e r c o n s t a n t i s a m e a s u r e o f t h e a c c e s s i b i l i t y o f t h e f l u o r o p h o r e t o t h e q u e n c h e r . O t h e r t h i n g s b e e n e q u a l , t h e m o r e e x p o s e d i s a f l u o r e s c e n t m o l e c u l e t o t h e q u e n c h e r , t h e h i g h e r t h e r a t e o f q u e n c h i n g . I n s t u d i e s o f p r o t e i n s , q u e n c h i n g o f t h e e x c i t e d s t a t e m a y p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e r e l a t i v e a c c e s s i b i l i t y o f a f l u o r o p h o r e i n t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . T h e p r e s e n c e o f a d d i t i v e s o r o t h e r p r o t e i n s m a y a l t e r t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e p r o t e i n u n d e r s t u d y a n d , s o , a l t e r t h e a c c e s s i b i l i t y o f t h e f l u o r o p h o r e t o q u e n c h e r s . B . 3 . E x c i m e r F o r m a t i o n . A s p e c i a l c a s e o f q u e n c h i n g i s f o u n d i n c a s e s s u c h a s c o n d e n s e d a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s w h e r e t h e q u e n c h e r (M) i n t h e g r o u n d s t a t e a n d t h e e x c i t e d p r o b e ( N * ) f o r m a t r a n s i e n t l u m i n e s c e n t c o m p l e x ( S c h e m e I I ) : i f N a n d M a r e t h e s a m e m o l e c u l e , t h e e x c i t e d c o m p l e x i s c a l l e d a n e x c i m e r 2 7 ( e x c i t e d d i m e r ) , i f t h e y a r e d i f f e r e n t i t i s c a l l e d a n e x c i p l e x ( e x c i t e d c o m p l e x ) . I n t h i s c a s e , t h e g r o u n d s t a t e i s d i s s o c i a t i v e a n d c o m p l e x a t i o n o c c u r s o n l y i n t h e e x c i t e d s t a t e . - 1 7 -I n a c o n t i n u o u s m e d i u m , t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f m o n o m e r a n d e x c i m e r e m i s s i o n a r e c o n t r o l l e d b y d i f f u s i o n a n d d e p e n d o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s p e c i e s i n v o l v e d . S c h e m e I I : N »~ N* + M [NM]* N +hv N + M+ hv (monomer emission) (excimer [exciplex] emission) P y r e n e i s a c l a s s i c a l e x a m p l e o f m o l e c u l e s t h a t f o r m e x c i m e r s . 2 8 F i g u r e 4 s h o w s t h e f l u o r e s c e n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f p y r e n e i n s o l u t i o n . 4 0 0 5 0 0 w a v e l e n g t h (nm) F i g u r e 4. E m i s s i o n P r o p e r t i e s o f P y r e n e S o l u t i o n s i n C y c l o h e x a n e . ( a ) E m i s s i o n s p e c t r a o f p y r e n e : A ) 1 0 " 2 M B ) 7 . 7 5 x l 0 - 3 C ) 5 . 5 x l 0 - 3 D) 3 - . 2 5 x l O _ 3 ' M E ) 1 0 _ 3 M G) I O - 4 M . ( b ) F l u o r e s c e n c e r e s p o n s e o f p y r e n e (5 x I O " 3 M) i n c y c l o h e x a n e . E x c i t a t i o n p u l s e , p ( t ) . M o n o m e r , f M ( t ) . E x c i m e r , f c ( t ) . 2 8 - 1 8 -I n s t e a d y s t a t e m e a s u r e m e n t s a t l o w c o n c e n t r a t i o n s ( ^ 1 0 4 * M ) f l u o r e s c e n c e o f t h e m o n o m e r p r e d o m i n a t e s . W i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n , a b r o a d b a n d a p p e a r s a t l o n g e r w a v e l e n g t h s t h a t i n c r e a s e s i n i n t e n s i t y r e l a t i v e t o t h a t o f t h e m o n o m e r ( f i g u r e 4 a h a s b e e n n o r m a l i z e d t o t h e i n t e n s i t y o f t h e m o n o m e r ) . I n t h e t i m e - d e p e n d e n t d o m a i n , t h e m o n o m e r s h o w s a c o n t i n u o u s d e c r e a s e w h i l e t h e e x c i m e r s h o w s a b u i l d u p t o a m a x i m u m a n d t h e n d e c r e a s e s ( F i g u r e 4 b ) . T h e r i s e t i m e o f t h e e x c i m e r i s c h a r a c t e r i s t i c o f e x c i t e d s t a t e r e a c t i o n s . I n s t u d i e s o f p r o t e i n s c o v a l e n t l y l a b e l l e d w i t h p y r e n e d e r i v a t i v e s , e x c i m e r f o r m a t i o n i s c o n t r o l l e d b y t h e s i t e s o f l a b e l l i n g a n d c h a i n d y n a m i c s r a t h e r t h a n b y d i f f u s i o n c o n t r o l . S t u d i e s o f p y r e n e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o s o m e s y n t h e t i c p o l y m e r s 2 9 - 3 3 a n d p r o t e i n s , 3 4 ' 3 5 h a v e s h o w n t h a t i n s o m e c a s e s t h e p y r e n e s i n a q u e o u s m e d i a c a n i n t e r a c t h y d r o p h o b i c a l l y i n t h e g r o u n d s t a t e , a n d t h a t e x c i m e r - l i k e f l u o r e s c e n c e a r i s e s f r o m t h e e x c i t a t i o n o f t h e c o m p l e x f o r m e d i n t h e g r o u n d s t a t e . G r o u n d s t a t e c o m p l e x e s h a v e a l s o b e e n d e t e c t e d w i t h p y r e n e a d s o r b e d t o s o m e s o l i d s u r f a c e s 3 6 - 3 8 a n d i n p a r a c y c l o p h a n e s . 3 9 I n s u c h s y s t e m s , i t seems t h a t the r i g i d i t y o f t h e p y r e n e s b r o u g h t a b o u t b y t h e s u r f a c e o r t h e h y d r o c a r b o n c h a i n s l i n k i n g t h e c h r o m o p h o r e s , i n t h e c a s e o f t h e p a r a c y c l o p h a n e s , h e l p s t o o v e r c o m e t h e r e p u l s i o n g e n e r a l l y e x h i b i t e d b e t w e e n m o l e c u l e s i n t h e g r o u n d s t a t e . S u c h d i m e r - e x c i m e r t r a n s i t i o n s a r e n o t u n c o m m o n p h e n o m e n a , b u t d i f f e r f r o m t h e m o r e w i d e l y s t u d i e d m e c h a n i s m o f m o n o m e r - e x c i m e r d e s c r i b e d a b o v e . M o n o m e r -e x c i m e r o r d i m e r - e x c i m e r p r o c e s s e s m a y b e d i s t i n g u i s h e d b y c e r t a i n o f t h e i r a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s . B . 4 . E x c i t a t i o n E n e r g y T r a n s f e r . U n d e r a p p r o p r i a t e c i r c u m s t a n c e s , t h e e x c i t e d s t a t e ( D * ) m a y t r a n s f e r i t s e n e r g y t o a n o t h e r g r o u n d s t a t e m o l e c u l e ( A ) , r e s u l t i n g i n t h e q u e n c h i n g o f t h e e x c i t e d s t a t e D * ( d o n o r ) a n d e x c i t a t i o n o f t h e q u e n c h e r A ( a c c e p t o r ) ( S c h e m e I I I ) . S c h e m e I I I D* + A D + A * A + hV T h i s e n e r g y t r a n s f e r b e t w e e n D a n d A m a y b e b y r a d i a t i v e o r n o n r a d i a t i v e p r o c e s s e s ; i t i s c a l l e d a t r i v i a l o r r a d i a t i v e m e c h a n i s m i f t h e e x c i t a t i o n o f A o c c u r s b y r e a b s o r p t i o n o f t h e l i g h t e m i t t e d b y D . R a d i a t i o n l e s s m e c h a n i s m s i n v o l v e t h e s i m u l t a n e o u s d e - e x c i t a t i o n o f t h e d o n o r a n d e x c i t a t i o n o f t h e a c c e p t o r . S e v e r a l m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n t h e n o n r a d i a t i v e e n e r g y -20-t r a n s f e r . T h e s e i n c l u d e c o u l o m b i c i n t e r a c t i o n s ( r e s o n a n c e t r a n s f e r ) a n d e l e c t r o n e x c h a n g e ( i n d u c t i v e r e s o n a n c e ) . F o r s t e r 4 0 d e r i v e d a q u a n t i t a t i v e e x p r e s s i o n t h a t r e l a t e s t h e r a t e o f e n e r g y t r a n s f e r o r i g i n a t i n g f r o m d i p o l e - d i p o l e c o u l o m b i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n a n i s o l a t e d d o n o r a n d a c c e p t o r p a i r a n d o b s e r v a b l e p a r a m e t e r s . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n e n e r g y t r a n s f e r e f f i c i e n c y (E ) a n d t h e d i s t a n c e b e t w e e n d o n o r a n d a c c e p t o r s i t e s (R) i s d e s c r i b e d b y : R = Ro ( E - 1 - l ) 1 ' 6 ( 1 . 1 3 ) Ro i s t h e d i s t a n c e a t w h i c h t h e e n e r g y t r a n s f e r e f f i c i e n c y i s 5 0 % . T h e v a l u e o f Ro i s h i g h l y d e p e n d e n t o n t h e s p e c t r a l o v e r l a p o f t h e d o n o r a c c e p t o r p a i r . T h u s , i t i s p o s s i b l e t o m a p o u t d i s t a n c e s i n p r o t e i n s b y s e l e c t i n g a s u i t a b l e d o n o r a c c e p t o r p a i r . C . L u m i n e s c e n c e P r o b e s t o S t u d y P r o t e i n s . T h e l u m i n e s c e n t p r o b e s u s e d t o s t u d y p r o t e i n s c a n b e d i v i d e d i n t w o m a j o r c a t e g o r i e s ( F i g u r e 5 ) : I n t r i n s i c a n d e x t r i n s i c : I n t r i n s i c f l u o r o p h o r e s a r e t h o s e t h a t a r e n a t u r a l c o m p o n e n t s o f t h e n a t i v e p r o t e i n w h i l e e x t r i n s i c f l u o r o p h o r e s a r e p u r p o s e l y a d d e d , s u c h a s o r g a n i c m o l e c u l e s c o v a l e n t l y o r n o n c o v a l e n t l y b o u n d , a n d m e t a l i o n s . - 2 1 -L u m i n e s c e n c e p r o b e s t o s t u d y p r o t e i n s t y r o s i n e t r y p t o p h a n c o v a l e n t n o n c o v a l e n t m e t a l i o n s ( l a n t h a n i d e s ) F i g u r e 5 . S c h e m a t i c D i a g r a m o f L u m i n e s c e n t P r o b e s t o S t u d y P r o t e i n s . C . l . I n t r i n s i c P r o b e s . T h e n a t u r a l l y o c c u r r i n g f l u o r e s c e n t c h r o m o p h o r e s i n p r o t e i n s a r e t h e a m i n o a c i d s t r y p t o p h a n , t y r o s i n e a n d p h e n y l a l a n i n e . T r y p t o p h a n u s u a l l y d o m i n a t e s t h e f l u o r e s c e n c e o f p r o t e i n s t h a t c o n t a i n b o t h t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e . T h i s e f f e c t i s m a i n l y d u e t o t h e F o r s t e r d i s t a n c e o f « 14 A f o r t y r o s i n e - t r y p t o p h a n t r a n s f e r , w h i c h i s c o m p a r a b l e t o t h e s i z e o f m a n y p r o t e i n s a n d r e s u l t s i n t h e e f f i c i e n t t r a n s f e r i n t h e n a t i v e p r o t e i n . T y r o s i n e f l u o r e s c e n c e i s a l s o q u e n c h e d b y o t h e r n e a r b y a m i n o a c i d r e s i d u e s s i n c e , i n t h e u n f o l d e d p r o t e i n a n d i n s o m e p r o t e i n s l a c k i n g t r y p t o p h a n , t h e e m i s s i o n i s a l s o l o w c o m p a r e d w i t h f r e e t y r o s i n e . E m i s s i o n f r o m p h e n y l a l a n i n e , i n c o n t r a s t , i s u s u a l l y n o t o b s e r v e d d u e t o i t s l o w s e n s i t i v i t y ( d e f i n e d a s a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t t i m e s q u a n t u m y i e l d ) . T h e f a c t t h a t t r y p t o p h a n e m i s s i o n i s v e r y -22-s e n s i t i v e t o e n v i r o n m e n t a l c h a n g e s 4 1 s h o u l d m a k e i t a n i d e a l p r o b e t o s t u d y p r o t e i n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t m a n y p r o t e i n s c o n t a i n a l a r g e n u m b e r o f . t y r o s i n e a n d / o r t r y p t o p h a n r e s i d u e s c a n m a k e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s d i f f i c u l t . S e v e r a l e x t r i n s i c f l u o r e s c e n t p r o b e s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o p r o v i d e s e l e c t i v e a n d s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f c h a n g e s i n t h e i r e n v i r o n m e n t s . C . 2 . E x t r i n s i c P r o b e s . T h e i d e a l e x t r i n s i c f l u o r e s c e n c e p r o b e s h o u l d h a v e a n u m b e r o f p r o p e r t i e s . B i n d i n g s h o u l d o c c u r i n a s e l e c t i v e a n d i d e n t i f i a b l e m a n n e r a n d s h o u l d b e a c h i e v e d e a s i l y s o t h a t t h e p r o t e i n i s l e f t i n t a c t i n i t s t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e ( e x c e p t f o r t h e s p e c t r o s c o p i c h a n d l e ) . E x c i t a t i o n s h o u l d p r o d u c e a s i g n a l w h i c h s h o u l d b e m o n i t o r e d i n a s i m p l e , s t a b l e a n d s e n s i t i v e w a y . I n p r a c t i c e , i t i s a l m o s t a l w a y s p o s s i b l e t o f i n d a p r o b e s u i t a b l e f o r a p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t . D e s t a b i l i z a t i o n o f t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e d u r i n g t h e l a b e l l i n g p r o c e d u r e o r a s a r e s u l t o f b i n d i n g o f t h e p r o b e t o t h e p r o t e i n m u s t b e r u l e d o u t b e f o r e t h e r e l e v a n c e o f t h e r e s u l t s c a n b e a s s e s s e d . C . 2 . a . N o n c o v a l e n t P r o b e s t o S t u d y P r o t e i n s . T h e m a i n a d v a n t a g e o f u s i n g n o n c o v a l e n t l y b o u n d o v e r c o v a l e n t l y b o u n d f l u o r e s c e n t p r o b e s i s t h a t m i l d l a b e l l i n g p r o c e d u r e s - 2 3 -c a n b e u s e d . A d i s a d v a n t a g e i s t h a t t h e e x a c t l o c a t i o n o f t h e p r o b e i s n o t a l w a y s p o s s i b l e t o b e d e t e r m i n e d . A l s o t h e p r o p e r t y m e a s u r e d m a y r e f l e c t b o u n d a n d f r e e f l u o r o p h o r e . O n e e x a m p l e o f a n o n c o v a l e n t p r o b e e x t e n s i v e l y u s e d i s 2 - ( N - m e t h y l a n i l i n o ) n a p h t h a l e n e - 6 - s u l f o n a t e ( M A N S ) . M A N S b e l o n g s t o a c l a s s o f a n i l i n o n a p h t h a l e n e d e r i v a t i v e s t h a t e x h i b i t l a r g e s o l v e n t e f f e c t s . T h e y a r e p r a c t i c a l l y n o n -f l u o r e s c e n t i n w a t e r b u t t h e i r f l u o r e s c e n c e i s e n h a n c e d a n d b l u e - s h i f t e d i n n o n p o l a r s o l v e n t s a n d w h e n a d s o r b e d t o p r o t e i n s o r o t h e r m a c r o m o l e c u l e s . T h e o b s e r v e d c h a n g e s a r e l a r g e , e - g . , t h e q u a n t u m y i e l d o f MANS i s Of = 0 . 0 0 6 i n w a t e r c o m p a r e d t o Of = 0 . 5 0 i n e t h a n o l . T h e s e c h a n g e s a n d t h e i r w i d e u s e i n s t u d i e s o f b i o l o g i c a l s y s t e m s h a v e l e d t o i n t e n s i v e i n v e s t i g a t i o n o f t h e p h o t o p h y s i c s o f t h e s e m o l e c u l e s . A c o m p l e x p i c t u r e o f s o l v e n t r e l a x a t i o n i n t h e e x c i t e d s t a t e h a s e m e r g e d . 4 2 E x c i t a t i o n o f t h e s i n g l e t s t a t e (So—>S_) l e a d s t o a c h a r g e t r a n s f e r s t a t e ( S i — » S i c t ) , b o t h s t a t e s b e i n g e m i s s i v e b u t s o l v e n t s o f h i g h p o l a r i t y p r o m o t e t h e c h a r g e t r a n s f e r t r a n s i t i o n a n d i t s r a d i a t i o n l e s s d e a c t i v a t i o n t o S o . H o w e v e r , t h e s e t r a n s i t i o n s a r e c o n t r o l l e d n o t o n l y b y t h e p o l a r i t y b u t b y t h e v i s c o s i t y o f t h e e n v i r o n m e n t . S p e c i f i c s o l v e n t e f f e c t s h a v e b e e n f o u n d a l s o i n t h e t r a n s i t i o n s o f t h e a r y l -n a p h t h a l e n e d e r i v a t i v e s . -24-S c h e m e I V : C . 2 . b . M o l e c u l e s t h a t B i n d C o v a l e n t l y t o P r o t e i n s . S e v e r a l f l u o r e s c e n t o r g a n i c r e a g e n t s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o l a b e l p a r t i c u l a r a m i n o a c i d s i n p r o t e i n s . T h e y o f f e r a d v a n t a g e s o v e r n o n c o v a l e n t p r o b e s i n t h a t t h e e x a c t p o s i t i o n o f l a b e l l i n g i n t h e p r o t e i n c a n b e d e t e r m i n e d i f t h e p r i m a r y s t r u c t u r e i s k n o w n . N - ( 1 - p y r e n y l ) - i o d o a c e t a m i d e ( P I A ) i s a f l u o r e s c e n t p r o b e t h a t r e a c t s m a i n l y w i t h c y s t e i n e s , a l t h o u g h t h e r e a r e a f e w r e p o r t s o f P I A r e a c t i o n w i t h m e t h i o n i n e o r h i s t i d i n e s i n p r o t e i n s t h a t l a c k c y s t e i n e . T h e f a c t t h a t t h e c y s t e i n e s i n t h e m a j o r i t y o f p r o t e i n s a r e f e w , p l u s t h e i n t r i n s i c r e a c t i v i t y o f c y s t e i n e t h i o l s , g i v e s P I A a h i g h d e g r e e o f s e l e c t i v i t y . P y r e n e d e r i v a t i v e s c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o p r o t e i n s s o m e t i m e s a r e a b l e t o f o r m e x c i m e r s , o f f e r i n g a n e x c e l l e n t m e a n s t o s t u d y t h e l o c a t i o n o f t h e s e a m i n o a c i d s i n t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . 4 3 C . 2 . C . M e t a l I o n s . T h e l a n t h a n i d e s , m a i n l y t e r b i u m a n d e u r o p i u m , h a v e b e e n u s e d e x t e n s i v e l y i n s t u d i e s o f p r o t e i n s . 4 4 ' 4 5 T h e s e p r o b e s h a v e a v e r y l o w s e n s i t i v i t y ( l o w a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t b u t h i g h q u a n t u m y i e l d ) . T o o b s e r v e t h e i r l u m i n e s c e n c e , t h e y c a n b e e x c i t e d d i r e c t l y u s i n g a l a s e r o r w i t h a c o n v e n t i o n a l l a m p t h r o u g h e n e r g y t r a n s f e r . I n p r o t e i n s , t r y p t o p h a n s a r e s u i t a b l e d o n o r s i f t h e y a r e s u f f i c i e n t l y c l o s e . T h e i s o m o r p h o u s r e p l a c e m e n t o f c a l c i u m b y t e r b i u m i n s o m e p r o t e i n s h a s e n c o u r a g e d t h e u s e o f t h e s e p r o b e s t o s t u d y c a l c i u m b i n d i n g s i t e s i n p r o t e i n s . - 2 6 -R E S U L T S AND D I S C U S S I O N P A R T I. I s o l a t i o n o f G e l s o l i n f r o m H o r s e P l a s m a . I n i s o l a t i n g a p r o t e i n , a f t e r a s o u r c e i s s e l e c t e d , a n i d e a l m e t h o d o f p r e p a r a t i o n s h o u l d p r o d u c e l a r g e q u a n t i t i e s i n a s i m p l e a n d i n e x p e n s i v e m a n n e r w h i l e p r e s e r v i n g t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . I n p r a c t i c e , t h e r e i s a l w a y s a b a l a n c e a m o n g t h e s e c r i t e r i a . T h e s e p a r a t i o n d e p e n d s o n p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n s u c h a s s o l u b i l i t y , m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s , i o n i c p r o p e r t i e s , s t a b i l i t y t o h e a t , e t c . T h e s t a g e s a l o n g t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e s s a r e f o l l o w e d b y s o m e r e c o g n i z e d p r o p e r t y o f t h e p r o t e i n , s u c h a s m o l e c u l a r w e i g h t o r i n v i t r o a c t i v i t y . G e l s o l i n w a s f i r s t d e t e c t e d i n r a b b i t m a c r o p h a g e s d u e t o i t s e f f e c t s o n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . 1 T h e s e e f f e c t s p r o v i d e d t h e r e q u i r e d a c t i v i t y t h a t c o u l d b e u s e d t o f o l l o w i t d u r i n g d e v e l o p m e n t o f v a r i o u s p u r i f i c a t i o n s c h e m e s . I t w a s s u b s e q u e n t l y i d e n t i f i e d i n a v a r i e t y o f v e r t e b r a t e c e l l s . 4 6 - 5 1 G e l s o l i n i s a l s o f o u n d a s a s e c r e t e d p r o t e i n i n p l a s m a . 3 ' 1 3 - 1 6 ' 4 6 ' 5 2 - 5 4 S e v e r a l p r o c e d u r e s h a v e b e e n u s e d f o r i t s i s o l a t i o n a n d o t h e r p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f g e l s o l i n h a v e b e e n r e p o r t e d w h i c h c a n b e u s e d t o o p t i m i z e f u r t h e r p r e p a r a t i v e m e t h o d o l o g i e s . G e l s o l i n h a s b e e n i s o l a t e d f r o m p l a t e l e t s o f v a r i o u s s p e c i e s b y t a k i n g a d v a n t a g e o f t h e t e r n a r y c o m p l e x t h a t o c c u r s w h e n i t b i n d s t o a c t i n a n d - 2 7 -D N A a s e 1 . 4 6 - 4 8 g y p a s s i n g a p l a t e l e t e x t r a c t t h r o u g h a c o l u m n c o n t a i n i n g a n i n e r t s u p p o r t t o w h i c h D N A a s e I h a d b e e n a t t a c h e d , a h i g h y i e l d p u r i f i c a t i o n i s o b t a i n e d i n a s i n g l e s t e p . I n p l a s m a , t h e p r e s e n c e o f a c t i n i s o n l y t r a n s i e n t , b u t s o m e a c t i n c o u l d b e a d d e d t o f o r m t h e a c t i n -g e l s o l i n c o m p l e x i n o r d e r t o p u r i f y i t b y t h i s m e t h o d . H o w e v e r , t h i s t e c h n i q u e s u f f e r s t h e d i s a d v a n t a g e t h a t t h e a c t i n - g e l s o l i n c o m p l e x i s d i f f i c u l t t o s e p a r a t e . A n o t h e r m e t h o d w h e r e t h e a d v a n t a g e o u s u s e o f s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s i s r e p o r t e d i s b a s e d o n t h e i s o l a t i o n o f g e l s o l i n b y i t s b i n d i n g t o a g e l s o l i n - s p e c i f i c a n t i b o d y . 3 ' 5 5 T h e l o w a v a i l a b i l i t y o f s u c h a n t i b o d i e s i s t h e l i m i t i n g f a c t o r t o i s o l a t i o n b a s e d o n t h i s s t r a t e g y . O t h e r p r o c e d u r e s i n c l u d e t h e f r a c t i o n a t i o n o f t h e c o m p o n e n t s o f p l a s m a b y p r e c i p i t a t i o n w i t h a m m o n i u m s u l f a t e , f o l l o w e d b y v a r i o u s c o l u m n c h r o m a t o g r a p h i c o r i o n e x c h a n g e s t e p s . T h e m e t h o d p r e s e n t e d h e r e f o r t h e i s o l a t i o n o f g e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a ( F i g u r e 6) i s a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d r e p o r t e d b y B r y a n 5 6 f o r t h e i s o l a t i o n o f h u m a n p l a s m a g e l s o l i n . T h e p l a s m a w a s p r e p a r e d a s t h e s u p e r n a t a n t t h a t r e s u l t e d f r o m c e n t r i f u g a t i o n o f h o r s e b l o o d i n t h e p r e s e n c e o f a n a n t i c o a g u l a n t ( s e e e x p e r i m e n t a l s e c t i o n f o r d e t a i l s ) a n d s t o r e d a t - 2 0 °C u n t i l u s e d . T h e m e t h o d f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f g e l s o l i n t a k e s a d v a n t a g e o f t h e c h a n g e i n t h e s u r f a c e c h a r g e o f t h e p r o t e i n u p o n b i n d i n g t o c a l c i u m i o n s . - 2 8 -1 1 t h a w e d p l a s m a i n t h e p r e s e n c e o f 3 5 mg P M S F  d i a l y s i s a g a i n s t (3 c h a n g e s i n 3 d a y s ) 2 5 mM T r i s - H C l -- I 0 . 5 mM C a C l 2 IpH 7 . 5 c e n t r i f u g e 1 0 0 0 0 x g ( 1 0 m i n u t e s ) a d d N a C l t o 3 5 mM ( d i s c a r d ) m i x w i t h 2 1 ( s e t t l e d v o l u m e ) D E A E - S e p h a d e x A - 5 0 e q u i l i b r a t e d a g a i n s t C_-^ . 2 5 mM T r i s - H C l l 0 . 5 mM C a C l 2 5 0 mM N a C l p H 7 . 5 s t i r (2 h ) ( c o n t i n u e n e x t p a g e ) - 2 9 -r e t e n t a t e f i l t r a t e ( r e g e n e r a t e D E A E - S e p h a d e x ) • a d d E D T A t o 1 0 mM a n d a d j u s t p H t o 7 . 8 ' 2 5 mM T r i s - H C l 1 mM E D T A 5 0 mM N a C I ImM N a N 3 . p H 7 . 8 • a p p l y t o c o l u m n ( 31 x 6 cm) p a c k e d w i t h D E A E - S e p h a d e x A - 5 0 e q u i l i b r a t e d a g a i n s t : e l u t e w i t h a 0 . 0 5 t o 0 . 3 M N a C I l i n e a r g r a d i e n t c o l l e c t f r a c t i o n s c o n t a i n i n g g e l s o l i n a n d c o n c e n t r a t e w i t h a m m o n i u m s u l f a t e a t 60 % s a t u r a t i o n p u r e g e l s o l i n ( y i e l d 3 0 - 4 0 mg) F i g u r e 6 . I s o l a t i o n o f G e l s o l i n f r o m H o r s e P l a s m a . -30-T h e t r e a t m e n t o f t h e p l a s m a w i t h a n a n i o n e x c h a n g e r i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s p e r m i t s a h i g h d e g r e e o f p u r i f i c a t i o n o f g e l s o l i n i n a s i n g l e s t e p . G e l s o l i n e m e r g e s i n t h e f i l t r a t e w h i l e m o s t o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e p l a s m a a r e r e t a i n e d b y t h e i o n e x c h a n g e r . T h i s s t e p , c a r r i e d o u t a s a b a t c h p r o c e d u r e , p r o v i d e d t h e s a m e y i e l d a s w h e n c o n d u c t e d i n a c o l u m n , b u t w a s c o n s i d e r a b l y s i m p l e r a n d f a s t e r (3 h v s 17 h ) t o p e r f o r m . F u r t h e r p u r i f i c a t i o n i s o b t a i n e d b y a d s o r b i n g t h e p r o t e i n t o t h e a n i o n e x c h a n g e r i n t h e a b s e n c e o f t h e d i v a l e n t c a t i o n s a n d e l u t i n g w i t h a NaCI g r a d i e n t . T h e e l u t i o n p r o f i l e v a r i e s d e p e n d i n g o n t h e a m o u n t o f i o n e x c h a n g e r u s e d i n t h e c a l c i u m s t e p . T h e m o r e i o n e x c h a n g e r t h a t i s u s e d , t h e g r e a t e r t h e l e v e l o f c o n t a m i n a n t p r o t e i n s r e t a i n e d . I f t h e q u a n t i t y u s e d i s 2 l i t e r s o r m o r e , a h i g h l y r e p r o d u c i b l e y i e l d i s o b t a i n e d . P r o t e o l y s i s w a s m i n i m i z e d b y p e r f o r m i n g a l l s t e p s a t 4 °C a n d b y t h e p r e s e n c e o f P M S F . T h e p u r i f i c a t i o n s c h e m e was f o l l o w e d u s i n g a 5 - 1 5 % g r a d i e n t p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , u s i n g t h e b u f f e r s y s t e m d e v e l o p e d b y L a e m m l i , 5 7 a n d , b y m o n i t o r i n g t h e a b i l i t y o f g e l s o l i n t o r e d u c e t h e v i s c o s i t y o f F - a c t i n s a m p l e s . - 3 1 -P A R T I I . P h y s i c o c h e m i c a l C h a r a c t e r i z a t i o n . A . A b s o r p t i o n C o e f f i c i e n t . T h e d i f f e r e n c e i n r e f r a c t i v e i n d e x a t 5 4 6 nm, (An) , b e t w e e n s o l u t i o n a n d s o l v e n t w a s m e a s u r e d w i t h a V i r - T i s m o d e l B P - 2 0 0 0 V d i f f e r e n t i a l r e fTactometer f o r a s e t o f g e l s o l i n s o l u t i o n s o f k n o w n a b s o r b a n c e (A) a t 2 8 0 nm ( T a b l e I ) • s a m p l e A An 1 0 0 2 0 . 3 0 4 0 . 2 9 1 3 0 . 5 8 7 0 . 5 7 0 4 0 . 6 0 8 ' 0 . 5 9 3 5 1 . 1 7 5 1 . 3 0 9 6 1 . 2 1 5 1 . 2 8 6 7 1 . 7 62 2 . 1 1 7 8 2 . 4 3 0 3 . 2 9 6 T a b l e I . C a l c u l a t i o n o f t h e A b s o r p t i o n C o e f f i c i e n t o f G e l s o l i n . D i f f e r e n c e i n r e f r a c t i v e i n d e x (An) b e t w e e n d i f f e r e n t g e l s o l i n s o l u t i o n s o f k n o w n a b s o r b a n c e (A) a n d s o l v e n t . B u f f e r u s e d : 2 0 mM T r i s - H C l - 1 5 0 mM K C 1 - 1 mM E G T A - ( p H 7 . 5 ) . S e e t e x t f o r d e t a i l s . A v a l u e o f 0 . 1 8 6 m l / g w a s a s s u m e d a s a r e f r a c t i v e i n c r e m e n t ( d n / d c ) f o r g e l s o l i n ( a v a l u e q u o t e d i n t h e H a n d b o o k o f B i o c h e m i s t r y f o r b o v i n e s e r u m a l b u m i n i n w a t e r a t p H 7 . 0 a n d t h a t s h o w s l i t t l e v a r i a t i o n a m o n g t h e p r o t e i n s l i s t e d ) . 5 8 M e a s u r e m e n t o f t h e s l o p e , dA /dAn, o f a p l o t o f A a g a i n s t An a n d a p p l i c a t i o n o f t h e r e s u l t A = e l c , - 3 2 -a l l o w s c a l c u l a t i o n o f t h e a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t a t 280 nm f o r h o r s e p l a s m a g e l s o l i n , £ = 1.4 m l m g - 1 c m - 1 . B. M o l e c u l a r W e i g h t by S o d i u m D o d e c y l S u l f a t e P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) . T h e p u r i f i e d g e l s o l i n m i g r a t e s a s a s i n g l e b a n d o f 90 k D a o n 8 % S D S - P A G E 5 7 ( F i g u r e 7), i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f m e r c a p t o e t h a n o l , s u g g e s t i n g t h a t g e l s o l i n i s c o m p o s e d o f a s i n g l e p o l y p e p t i d e a s o p p o s e d t o s u b u n i t s l i n k e d b y d i s u l f i d e b r i d g e s . T h i s v a l u e i s c o m p a r a b l e t o t h e 90-93 k D a m o l e c u l a r m a s s v a l u e s ( o b t a i n e d b y t h e s a m e m e t h o d ) r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e f o r o t h e r p l a s m a a n d c y t o p l a s m i c s o u r c e s . 3 ' 1 4 " 16,47-54 H o w e v e r , t h i s v a l u e i s a n o m a l o u s c o m p a r e d w i t h t h e v a l u e o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n a n d s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y ( v i d e i n f r a ! . T h e a b n o r m a l b e h a v i o r o f some p r o t e i n s o n SDS P A G E i s k n o w n f o r g l y c o p r o t e i n s a n d c h e m i c a l l y m o d i f i e d p r o t e i n s . N o n e o f t h e s e c a s e s c o r r e s p o n d s t o g e l s o l i n . F o r o t h e r p r o t e i n s , a n o m a l o u s m i g r a t i o n h a s b e e n a t t r i b u t e d t o t h e c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p a r t i c u l a r p r o t e i n d e t e r m i n e d b y i t s p r i m a r y s t r u c t u r e w h i c h m a y i n t e r f e r e w i t h n o r m a l S D S b i n d i n g . T h i s s t r u c t u r a l e f f e c t m a y h a v e t h e a b i l i t y o f a f f e c t i n g t h e c h a r g e t o m a s s r a t i o . 6 0 -33-F i g u r e 7 . M o l e c u l a r M a s s o f G e l s o l i n b y S D S - P A G E . H o r s e p l a s m a g e l s o l i n , i n d i c a t e d b y a s q u a r e s y m b o l , w a s d e t e r m i n e d t o h a v e m o l e c u l a r m a s s o f 9 0 0 0 0 D a u s i n g a s e r i e s o f s t a n d a r d s . M o l e c u l a r m a s s e s a r e i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s . A b b r e v i a t i o n s : B S A , b o v i n e s e r u m a l b u m i n . L D H , l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e . T h e s o l i d l i n e w a s d e t e r m i n e d by l e a s t s q u a r e a n a l y s i s . I n s e t i s a g e l t h a t s h o w s h o r s e p l a s m a i n l a n e 1, p h o s p h o r y l a s e b i n l a n e 2 a n d p u r i f i e d p l a s m a g e l s o l i n i n l a n e 3 . C . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n . T h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n p r e s e n t e d i n t a b l e I I f o r h o r s e p l a s m a g e l s o l i n w a s s c a l e d t o a c h i e v e a p r o t e i n o f 7 3 9 a m i n o a c i d r e s i d u e s , t h e s a m e a s f o r p i g p l a s m a g e l s o l i n . 6 1 S u c h a p r o t e i n w o u l d h a v e m o l e c u l a r w e i g h t M r = 8 0 9 0 8 . C a l c u l a t i o n s b a s e d u p o n t h i s c o m p o s i t i o n s u g g e s t a - 3 4 -p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e 6 2 ( V ) o f 0 . 7 2 7 c m 3 / g , a n d a h y d r a t i o n l e v e l 6 3 (8) o f 0 . 3 9 3 g w a t e r / g p r o t e i n . a m i n o a c i d h o r s e p i g 6 1 h u m a n 6 a s x 6 6 . 6 7 3 74 t h r 4 3 . 5 3 8 41 s e r 6 1 . 5 4 6 44 g l x 8 4 . 6 8 9 92 p r o 3 8 . 6 3 9 3 8 g l y 6 5 . 7 67 7 1 a l a 6 2 . 4 66 74 v a l 6 4 . 4 60 58 m e t 7 . 6 12 12 i l e 2 2 . 1 24 2 3 l e u 5 5 . 8 5 5 57 t y r 2 1 . 8 2 3 22 p h e 3 0 . 7 3 1 3 1 l y s 4 3 . 9 44 4 5 h i s 1 4 . 5 13 13 a r g 3 5 . 3 3 9 4 0 c y s n . d . 5 5 t r p n . d . 15 15 T O T A L 7 3 9 a 7 3 9 7 5 5 T a b l e I I . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n o f P l a s m a G e l s o l i n s . ( n . d . ) n o t d e t e r m i n e d . (a ) a s s u m i n g 5 c y s a n d 1 5 t r p r e s i d u e s p e r g e l s o l i n m o l e c u l e . - 3 5 -D . S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t I n a s o l u t i o n o f m a c r o m o l e c u l e s h a v i n g a h i g h e r d e n s i t y t h a n t h e s o l v e n t , t h e m a c r o m o l e c u l e s w i l l s e d i m e n t t o t h e b o t t o m o f t h e c e l l c o n t a i n i n g t h e m i f s u b j e c t e d t o a s t r o n g c e n t r i f u g a l f o r c e . A s t h e y s e d i m e n t d o w n , t h e y l e a v e b e h i n d i n t h e u p p e r p a r t o f t h e v e s s e l a r e g i o n c o n s i s t i n g o f p u r e s o l v e n t . T h i s g r a d i e n t c a n b e d e t e c t e d u s i n g S c h l i e r e n o p t i c s , w h i c h i s b a s e d o n t h e i m a g i n g o f a r e f r a c t i v e i n d e x g r a d i e n t . T h e i m a g e c a n b e r e c o r d e d o n a p h o t o g r a p h i c p l a t e a t d e f i n e d t i m e i n t e r v a l s ( F i g u r e 8). d n d r Solvent Boundary Plateau Region Region Region , Solukionifj(AtT Meni-I •n Solvent — Air Meniscus Schlieren Peak] t _ Base Line m | "t-Top of Cell inner Reference Ed_e Direction of Sedimentation Bottom of Cell -J j Outer Reference Edge F i g u r e 8. T y p i c a l S c h l i e r e n P a t t e r n . 65 T h e r a d i a l d i s t a n c e , r , t r a v e l e d b y t h e S c h l i e r e n p e a k i s m e a s u r e d a n d a p l o t o f I n r a g a i n s t t i m e ( F i g u r e 9, i n s e t ) y i e l d s a s l o p e e q u a l t o w 2 s : -36-s = ( 1 / w 2 ) ( d l n r / d t ) w h e r e : s = s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t ( s e c ) w = a n g u l a r v e l o c i t y ( r a d / s e c ) r = d i s t a n c e o f s e d i m e n t i n g b o u n d a r y f r o m c e n t e r o f r o t a t i o n (cm) t = t i m e ( s e c ) S20,w = (S) (Tl_,soln/T|20,w) ( [ l"Vp] 20, w/ [ l"Vp] T, soln) 5 T 0 4 . , 0 Absorbance at 280 nm 1 F i g u r e 9 . I n t r i n s i c S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t o f G e l s o l i n . T h e i n t r i n s i c s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f g e l s o l i n w a s d e t e r m i n e d t o b e 4 . 8 S b y e x t r a p o l a t i o n o f d e t e r m i n e d s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s (S20,w) t o z e r o c o n c e n t r a t i o n . I n s e t i s t h e d a t a f o r d e t e r m i n a t i o n o f o n e v a l u e o f S20,w - 3 7 -T h e s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t i s g e n e r a l l y f o u n d t o d e p e n d o n c o n c e n t r a t i o n . F o r t h i s r e a s o n i t i s d e s i r a b l e t o c a l c u l a t e t h e i n t r i n s i c s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t , S 20.w-S ° 2 0 , w " Um S 2 o , w c-^o F i g u r e 9 i s a p l o t o f S20,w v a l u e s f o r g e l s o l i n a g a i n s t s a m p l e a b s o r b a n c e s . s°20 ,w = 4 . 8 x 1 0 ~ 1 3 s e c w a s o b t a i n e d b y e x t r a p o l a t i n g t h e r e s u l t s t o z e r o c o n c e n t r a t i o n . T h i s v a l u e w a s o b t a i n e d b o t h i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f c a l c i u m . E . M o l e c u l a r W e i g h t a n d S t o k e s 1 R a d i u s D e t e r m i n e d b y G e l F i l t r a t i o n . D e t e r m i n a t i o n o f S t o k e s ' r a d i u s a n d m o l e c u l a r w e i g h t b y g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y i s w e l l d o c u m e n t e d . 6 6 T h e t e c h n i q u e i s b a s e d o n t h e a b i l i t y o f g e l f i l t r a t i o n m e d i a t o s e p a r a t e m o l e c u l e s a c c o r d i n g t o s i z e . M o l e c u l a r w e i g h t a n d S t o k e s 1 r a d i u s d e t e r m i n a t i o n b y g e l f i l t r a t i o n i s c a r r i e d o u t b y c o m p a r i n g s o m e e l u t i o n p a r a m e t e r s o f t h e s u b s t a n c e o f i n t e r e s t w i t h t h e v a l u e s o b t a i n e d f o r s e v e r a l g l o b u l a r p r o t e i n s t a n d a r d s . F i g u r e 1 0 s h o w s t h e p l o t o f K a v ( t h e a v e r a g e v a l u e o f g e l a c c e s s i b l e t o t h e p r o t e i n , s e e e x p e r i m e n t a l p a r t f o r d e t a i l s ) , v e r s u s l o g o f m o l e c u l a r w e i g h t , M r , f o r a s e t o f - 3 8 -standards to obtain by interpolation the molecular weight of g e l s o l i n equal to 75000. As described by Laurent and K i l l a n d e r , 6 6 a plot of (-log Kav) 1/ 2 versus Stokes' radius (Rs) of the same standards used to calculate the molecular weight provides a c a l i b r a t i o n curve for the determination of Rs of g e l s o l i n . Rs = 3.8 nm was calculated for horse plasma g e l s o l i n i n the presence and absence of calcium (Figure 11). Figure 10. Determination of the Molecular Mass of Horse Plasma Gelsolin by Gel F i l t r a t i o n . Standard proteins were dissolved i n 20 mM MOPS - 0.5 mM CaCl 2 - 150 mM KC1 (pH 7.0) and eluted with the same solvent from a column (1 x 30 cm) of Superose 6 HR 10/30. The square indicates the p o s i t i o n of horse plasma g e l s o l i n . The s o l i d l i n e was determined by linear least square analysis. -39-T h e v a l u e o f t h e S t o k e s ' r a d i u s ( R s ) d e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n c a n b e c o m b i n e d w i t h s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t ( s ° 2 0 , w ) f r o m s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s , t o c a l c u l a t e t h e m o l e c u l a r w e i g h t ( M r ) o f g e l s o l i n a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g r e l a t i o n s h i p : M r = 6JCT1 R s N s °20 , w / d _ V p) = 7 5 0 0 0 w h e r e : N = A v o g a d r o ' s n u m b e r T| = v i s c o s i t y o f t h e s o l u t i o n p = d e n s i t y o f t h e s o l u t i o n V = p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f t h e p r o t e i n 0.9 T 0 Stokes Radius (na) 10 F i g u r e 1 1 . D e t e r m i n a t i o n o f S t o k e s ' R a d i u s o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n b y G e l F i l t r a t i o n . T h e s a m e c o n d i t i o n s a n d b u f f e r w e r e u s e d a s i n f i g u r e 1 0 . T h e S t o k e s ' r a d i i o f t h e s t a n d a r d p r o t e i n s w a s a s s u m e d t o b e t h o s e i n d i c a t e d b y t h e P h a r m a c i a . T h e s q u a r e i n d i c a t e s t h e p o s i t i o n o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n . T h e s o l i d l i n e w a s d e t e r m i n e d b y l i n e a r l e a s t s q u a r e a n a l y s i s . - 4 0 -D i r e c t u s e o f g e l f i l t r a t i o n d a t a t o e s t i m a t e t h e M r o f g e l s o l i n a l s o g i v e s a v a l u e o f 7 5 0 0 0 . I m p l i c i t i n t h e u s e o f t h e s t a n d a r d c u r v e i n f i g u r e 1 0 , i s t h e a s s u m p t i o n t h a t , e s t i m a t i o n w i l l b e v a l i d o n l y f o r g l o b u l a r p r o t e i n s . T h e i d e n t i t y o f t h e t w o v a l u e s o b t a i n e d s u g g e s t s t h a t s u c h a n a s s u m p t i o n i s w a r r a n t e d i n t h e c a s e o f g e l s o l i n . F u r t h e r e v i d e n c e f o r s u c h a c o n c l u s i o n c o m e s f r o m t h e u s e o f t h e S t o k e s 1 r a d i u s , t h e d e g r e e o f h y d r a t i o n , a n d t h e m o l e c u l a r m a s s ( f r o m e i t h e r h y d r o d y n a m i c o r a m i n o a c i d s e q u e n c e d a t a ) f o r g e l s o l i n t o c a l c u l a t e i t s f r i c t i o n a l r a t i o , f / f o = 1 . 2 - 1 . 3 . I n t h i s r e l a t i o n , f i s t h e e x p e r i m e n t a l f r i c t i o n a l c o e f f i c i e n t a n d f o i s t h e f r i c t i o n a l c o e f f i c i e n t o f t h e m o l e c u l e i f i t w e r e a n a n h y d r o u s s p h e r e . T h i s v a l u e i s c o n s i s t e n t w i t h a g l o b u l a r p r o t e i n r a t h e r t h a n a n e l o n g a t e d o r f i l a m e n t o u s o n e . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e v a l u e o f M r = 7 5 0 0 0 o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n a n d s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s i s s o m e w h a t l o w e r , b u t c o m p a r a b l e t o m o l e c u l a r m a s s e s c a l c u l a t e d f o r g e l s o l i n s o f k n o w n a m i n o a c i d s e q u e n c e . 6 1 ' 6 4 C o m p a r i s o n o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t v a l u e o b t a i n e d b y S D S - P A G E f o r d e n a t u r e d g e l s o l i n w i t h t h a t o b t a i n e d w i t h t h e n a t i v e p r o t e i n , e i t h e r b y g e l f i l t r a t i o n , c h r o m a t o g r a p h y , o r s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s , d e m o n s t r a t e s t h a t g e l s o l i n d o e s n o t f o r m d i m e r s , t r i m e r s o r h i g h e r a g g r e g a t e s u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d . T h e v a l u e o f 90 k D a o b t a i n e d b y S D S - P A G E i s s o m e w h a t o v e r e s t i m a t e d . T h i s h a s b e e n f o u n d - 4 1 -a l s o f o r t h e o t h e r g e l s o l i n s o f known amino a c i d sequence. T h i s o v e r e s t i m a t i o n may be due t o an i n t r i n s i c p r o p e r t y of t h e p r o t e i n g i v e n by i t s p r i m a r y s t r u c t u r e . T h i s would o c c u r i f some s t r u c t u r a l f e a t u r e i n t e r f e r e s a t the b i n d i n g s i t e s o f SDS, a f f e c t i n g t h e m i g r a t i o n o f t h e complex i n t h e g e l . F. U l t r a v i o l e t A b s o r p t i o n and F l u o r e s c e n c e E m i s s i o n S p e c t r a . The a b s o r p t i o n spectrum o f g e l s o l i n ( F i g u r e 12) i s s i m i l a r t o t h a t o f most p r o t e i n s . The r e g i o n 240-300 nm c o n t a i n s a s i n g l e maximum at 280 nm where t h e t y r o s i n e and t r y p t o p h a n r e s i d u e s a b s o r b . A s h o u l d e r a t 290 nm can be a t t r i b u t e d t o t h e a b s o r p t i o n o f t r y p t o p h a n s a l o n e . The u n c o r r e c t e d f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n i n t e n s i t y o f g e l s o l i n i s maximal a t 328 nm ( F i g u r e 12 i n s e t ) . The spectrum o b t a i n e d on e x c i t a t i o n a t 280 nm (where t y r o s i n e s and t r y p t o p h a n s a b s o r b ) , can be s u p e r i m p o s e d on t h a t o b t a i n e d a t 295 nm by s e l e c t i v e e x c i t a t i o n o f t h e t r y p t o p h a n s . T h i s r e s u l t shows t h e e f f i c i e n t e n e r g y t r a n s f e r from t y r o s i n e s t o t r y p t o p h a n s , which are e x p e c t e d t o be i n c l o s e p r o x i m i t y i n t h e n a t i v e p r o t e i n . Tryptophan e m i s s i o n i s known t o be v e r y s e n s i t i v e t o t h e e n v i r o n m e n t . 4 1 The wavelength o f maximum e m i s s i o n v a r i e s from 320 nm t o 350 nm depending on t h e p o l a r i t y o f t h e s o l v e n t . I t has been r e p o r t e d t h a t g e l s o l i n p o s s e s s e s 15 t r y p t o p h a n s . 6 1 ' 6 4 The e m i s s i o n o b t a i n e d i s an average o f a l l t h e t r y p t o p h a n s i n t h e i r d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s i n t h e p r o t e i n . However, t h e v a l u e o f maximal e m i s s i o n a t 328 nm suggests t h a t t h e b u l k o f t h e t r y p t o p h a n s a r e i n a f a i r l y h y drophobic environment. F i g u r e 12. A b s o r p t i o n Spectrum o f G e l s o l i n . G e l s o l i n (1.9 mg/ml) i n a 2 mm c e l l i n 20 mM MOPS - 150 mM KC1 - 1.0 mM EGTA pH 7.6. I n s e t : f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r u m o f g e l s o l i n (0.035 mg/ml) i n t h e same b u f f e r w i t h e x c i t a t i o n a t 280 nm. a.u. «= a r b i t r a r y u n i t s . -43-G. C i r c u l a r D i c h r o i s m S p e c t r a . C i r c u l a r d i c h r o i s m (CD) i s a u s e f u l t e c h n i q u e f o r s t u d y i n g p r o t e i n c o n f o r m a t i o n i n s o l u t i o n under a wide range of c o n d i t i o n s . The 208-240 nm r e g i o n o f the spectrum i s used t o s t u d y t h e secondary s t r u c t u r e o f p r o t e i n s (main c h a i n c o n f o r m a t i o n s ) , as chromophores o t h e r t h a n amides have m i n i m a l e f f e c t s i n t h i s r e g i o n . F i g u r e 13 shows CD s p e c t r a f o r model p e p t i d e s , i n d i c a t i n g the c o n t r i b u t i o n of each o f t h e s t r u c t u r e s t o t h e e l l i p t i c i t y i n t h e f a r UV l e g i o n . 3 sheet s t r u c t u r e s show a s i n g l e minimum and a-h e l i c a l s t r u c t u r e s show two minima around 208 and 222 nm. 80 , 250 X (nm) 190 210 230 F i g u r e 13. P o l y p e p t i d e Reference Data. 100% (1) a - h e l i x , (2) (5-structure and (3) random c o i l i n the 200-240 r e g i o n . 6 7 T h e f a r U V CD s p e c t r u m o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n ( f i g u r e 1 4 ) s u g g e s t s s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n s f r o m a -h e l i x , r a n d o m c o i l a n d ^ - s t r u c t u r e s i n t h e n a t i v e p r o t e i n . T h e m e a n r e s i d u e e l l i p t i c i t y v a l u e c a l c u l a t e d f o r g e l s o l i n a t 2 0 8 n m , [6]208, i s - 7 8 0 0 d e g c m 2 / d m o l a n d [9]222 = - 6 1 0 0 d e g c m 2 / d m o l a t 2 2 2 n m . T X (nm) F i g u r e 1 4 . F a r UV C i r c u l a r D i c h r o i s m S p e c t r u m o f G e l s o l i n . G e l s o l i n ( 0 . 6 mg m l - 1 ) i n 2 0 mM M O P S , 1 5 0 mM K C 1 , 1 mM E G T A p H 7 . 5 . T h e s p e c t r u m w a s m e a s u r e d i n a 0 . 5 mm p a t h l e n g t h c e l l . T h e m e a n r e s i d u e e l l i p t i c i t y w a s c a l c u l a t e d u s i n g 1 1 0 a s t h e m e a n r e s i d u e w e i g h t o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n . - 4 5 -U p o n a d d i t i o n o f c a l c i u m , [0]208 = -6400 d e g c m 2 / d m o l a n d [0]222 = -5600 d e g c m 2 / d m o l . T h e s e v a l u e s a r e s i m i l a r t o t h o s e p r e s e n t e d b y D o i e t a l . f o r p i g p l a s m a g e l s o l i n , 6 8 b u t a r e i n c o n t r a s t t o t h e v a l u e s [ 8 ] 2 2 2 = -40430 d e g c m 2 / d m o l , b o t h i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f c a l c i u m , o b t a i n e d b y K w i a t k o w s k i e t a l . 6 9 T h e e l l i p t i c i t y v a l u e [6 ]222 = -40430 d e g c m 2 / d m o l i s l i k e l y t o b e a n e r r o r b e c a u s e a 100 % a - h e l i c a l p e p t i d e m o d e l s h o w s e l l i p t i c i t y v a l u e s o f 33000 d e g c m 2 / d m o l a t 222 n m . T h e a - h e l i c a l c o n t e n t o f g e l s o l i n i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m w a s c a l c u l a t e d t o b e a p p r o x i m a t e l y 19 % . 7 0 H . S t a b i l i t y t o T e m p e r a t u r e a n d C h e m i c a l D e n a t u r a n t s . T h e w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n a s w e l l a s t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o f t h e t r y p t o p h a n f l u o r e s c e n c e o f g e l s o l i n w e r e u s e d t o f o l l o w t h e t h e r m a l u n f o l d i n g o f g e l s o l i n . E x c i t a t i o n w a s p e r f o r m e d a t 2 95 nm t o a v o i d i n t e r f e r e n c e f r o m t h e t y r o s i n e s . T h e r m a l s t u d i e s o f f r e e t r y p t o p h a n 7 1 h a v e s h o w n t h a t t e m p e r a t u r e i n c r e a s e s t h e r a d i a t i o n l e s s d e a c t i v a t i o n o f t h e e x c i t e d s t a t e o f t r y p t o p h a n w i t h o u t a l t e r i n g t h e e n e r g y g a p b e t w e e n g r o u n d a n d e x c i t e d s t a t e s . T h a t i s , h e a t i n g p r o d u c e s a c o n t i n u o u s d e c r e a s e i n i n t e n s i t y w i t h o u t a l t e r i n g t h e w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n . T h e w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n i n g e l s o l i n i s c o n s t a n t u n t i l a p p r o x i m a t e l y 40 °C ( f i g u r e 15). A t h i g h e r t e m p e r a t u r e s , t h e m a x i m u m e m i s s i o n w a v e l e n g t h s t a r t s t o s h i f t t o w a r d s t h e r e d u n t i l i t r e a c h e s a v a l u e o f 3 5 0 n m . T h e o b s e r v e d c h a n g e s a r e l i k e l y d u e t o t h e u n f o l d i n g o f g e l s o l i n a n d e x p o s u r e o f t h e t r y p t o p h a n s t o t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t . T h e d e c r e a s e i n t r y p t o p h a n e m i s s i o n i n t e n s i t y w i t h t e m p e r a t u r e ( F i g u r e 1 5 ) s h o w s t h e e x p e c t e d i n c r e a s e d r a t e o f r a d i a t i o n l e s s d e c a y d i s c u s s e d f o r f r e e t r y p t o p h a n . H o w e v e r , t h e r e i s a b r e a k p o i n t t h a t c o i n c i d e s w i t h t h e m i d p o i n t i n t h e w a v e l e n g t h s h i f t , s u g g e s t i n g t h a t g e l s o l i n i s h a l f u n f o l d e d a t a p p r o x i m a t e l y 4 5 ° C . F i g u r e 1 5 . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f G e l s o l i n a s F o l l o w e d b y F l u o r e s c e n c e . G e l s o l i n u n f o l d i n g ( 0 . 0 3 5 m g / m l ) i n 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - ImM E G T A (pH 7 . 2 ) w a s f o l l o w e d b y t h e d e c r e a s e i n i n t e n s i t y a t 3 3 0 n m ( o p e n c i r c l e s ) a n d w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n ( c l o s e d c i r c l e s ) . T h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h w a s 2 9 5 n m . - 4 7 -T h e s h i f t f r o m 328 t o 350 n m u p o n u n f o l d i n g c o r r o b o r a t e s t h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f t h e e n v i r o n m e n t o f t h e b u l k o f t h e t r y p t o p h a n s i n t h e n a t i v e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n . A l t e r n a t i v e l y , t h e d e c r e a s e i n e l l i p t i c i t y u p o n i n c r e a s i n g t h e t e m p e r a t u r e w a s m o n i t o r e d t o s t u d y t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f g e l s o l i n . S i n c e 1951, w h e n L i n u s P a u l i n g 7 2 s u g g e s t e d t h e C C - h e l i x a s t h e m o s t s t a b l e s t r u c t u r e f o r p r o t e i n m o l e c u l e s , e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e h a s a c c u m u l a t e d t h a t t h e d i s r u p t i o n o f t h i s s t r u c t u r e i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f e a t u r e s o f t h e p r o c e s s o f p r o t e i n d e n a t u r a t i o n . T h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n o f g e l s o l i n i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m , a s m o n i t o r i n g t h e e l l i p t i c i t i e s a t 210 n m , r e v e a l s a c o o p e r a t i v e m e l t i n g t r a n s i t i o n n e a r 4 6 °C. I n t h e p r e s e n c e o f t h i s d i v a l e n t c a t i o n , t h e m e l t i n g t e m p e r a t u r e i s s h i f t e d t o 54 °C, s u g g e s t i n g t h a t a s t a b i l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n t o t e m p e r a t u r e i s b r o u g h t a b o u t b y c a l c i u m . - 4 8 -o CD 0.8-20 30 40 50 T (centigrades) 70 F i g u r e 1 6 . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f G e l s o l i n F o l l o w e d b y CD m e a s u r e m e n t s . G e l s o l i n u n f o l d i n g ( 2 . 6 m g / m l ) w a s f o l l o w e d b y t h e d e c r e a s e i n e l l i p t i c i t y a t 2 1 0 nm i n 2 0 mM MOPS -1 5 0 mM K C 1 (pH 7 . 5 ) a n d - 0 . 5 mM C a C l 2 ( c l o s e d c i r c l e s ) o r 1 mM E G T A ( o p e n c i r c l e s ) i n a 0 . 1 mm c e l l . T h e f i g u r e s w e r e o b t a i n e d p l o t t i n g t h e r a t i o o f t h e e l l i p t i c i t y a t t e m p e r a t u r e T t o t h a t o b t a i n e d a t 1 0 d e g r e e s a g a i n s t t e m p e r a t u r e . P r e c i p i t a t i o n o f g e l s o l i n b e c o m e s v i s i b l e a t t e m p e r a t u r e s a b o v e 5 0 ° C . T h e p r e c i p i t a t i o n o f g e l s o l i n w a s o b s e r v e d a t t e m p e r a t u r e s j u s t a b o v e t h e r e p o r t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e , t h i s p r e c i p i t a t i o n c a n n o t b e r e v e r s e d w i t h c o o l i n g . A l t h o u g h l i g h t s c a t t e r i n g h a m p e r s i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s , t h e t h e r m a l l y d e n a t u r e d p r o t e i n a p p e a r s t o r e t a i n s o m e s t r u c t u r e , s u g g e s t e d b y a b r o a d m i n i m u m i n e l l i p t i c i t y c e n t e r e d a t 2 1 5 n m ( s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f {$-s t r u c t u r e ) . T h e r m a l d e n a t u r a t i o n h a s t h e r e p u t a t i o n o f n o t p r o d u c i n g t o t a l u n f o l d i n g o f p r o t e i n s , i n c o n t r a s t t o d e n a t u r a t i o n b y o t h e r m e a n s . 7 3 T h e g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e ( G u - H C l ) i n d u c e d u n f o l d i n g o f g e l s o l i n w a s f o l l o w e d b y t h e d e c r e a s e i n e l l i p t i c i t y a n d t h e s h i f t i n e m i s s i o n maximum t h a t o c c u r s upon adding Gu-HC1 t o g e l s o l i n . The c u r v e s o b t a i n e d f o r t h e Gu-HCl d e n a t u r a t i o n o f g e l s o l i n ( F i g u r e 17) have a t r a n s i t i o n m i d p o i n t a t « 1.5 M Gu-HCl. The p r o t e i n seems t o be t o t a l l y u n f o l d e d a t > 2 M Gu-HCl. The e m i s s i o n maximum o f f r e e t r y p t o p h a n i s r e l a t i v e l y i n v a r i a n t w i t h Gu-HCl c o n c e n t r a t i o n . The changes o b s e r v e d i n e m i s s i o n maximum may be a t t r i b u t e d t o t h e u n f o l d i n g o f the p r o t e i n and exposure o f the t r y p t o p h a n s t o t h e medium. The u n f o l d i n g i s c o r r o b o r a t e d by t h e c i r c u l a r d i c h r o i s m u n f o l d i n g p r o f i l e . 1 . 2 -1 . 0 -* f o cz> e£ 0 . 8 -0 . 6 -0 . 4 -0 . 2 -i . . / — > V M t % a » * * • 0 . 0 -*>»—o-r 3 5 8 0 1 2 3 4 5 6 [Gu-HCl ] M F i g u r e 17. U n f o l d i n g o f G e l s o l i n by Gu-HCl. G e l s o l i n u n f o l d i n g was f o l l o w e d by: ( c l o s e d c i r c l e s ) s h i f t i n e m i s s i o n maximum upon e x c i t a t i o n a t 295 nm. [ g e l s o l i n ] = 0.035 mg/ml i n 25 mM MOPS - 150 mM KC1 - ImM EDTA and d i f f e r e n t amounts o f Gu-HCl. (open c i r c l e s ) d e c r e a s e i n e l l i p t i c i t y a t 215 nm. [ g e l s o l i n ] = 1.3 mg/ml i n t h e same b u f f e r . C e l l used 0.1 mm. Both curves were o b t a i n e d a t 25 °C. -50-C o m p a r i n g t h e u n f o l d i n g p r o c e s s e s b y t h e r m a l a n d c h e m i c a l m e a n s , i t i s f o u n d t h a t t h e w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n i s s h i f t e d f r o m 3 2 8 t o 3 5 0 nm o n t h e r m a l u n f o l d i n g o f g e l s o l i n a n d f r o m 3 2 8 t o 3 5 4 nm i n t h e g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e i n d u c e d d e n a t u r a t i o n . T h i s s i t u a t i o n c o u l d b e e x p l a i n e d i f t h e r e s i d u a l s t r u c t u r e o b s e r v e d b y CD a f t e r t h e r m a l d e n a t u r a t i o n i s r e a l a n d t h e t r y p t o p h a n s i n s u c h a s t r u c t u r e a r e n o t t o t a l l y e x p o s e d t o t h e e n v i r o n m e n t . A l t e r n a t i v e l y , t h e a g g r e g a t e d p r o t e i n m a y h i d e t h e t r y p t o p h a n s f r o m t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t . T h e u n f o l d i n g c u r v e s o f g e l s o l i n a r e r e l a t i v e l y s y m m e t r i c , c o o p e r a t i v e , a n d d i s p l a y n o r e a d i l y d i s t i n g u i s h a b l e i n t e r m e d i a t e s t a g e s . A l s o , t h e y a r e s i m i l a r a s d e t e c t e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s . T h e s e a r e c h a r a c t e r i s t i c s o f p r o t e i n s t h a t u n f o l d i n a o n e s t e p p r o c e s s , b e t w e e n t w o s t a t e s , f o l d e d a n d u n f o l d e d , 7 4 a s o p p o s e d t o m u l t i s t e p u n f o l d i n g t h a t h a s b e e n d e t e c t e d f o r s o m e p r o t e i n s . 7 5 - 7 7 A s m e n t i o n e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , c a l c i u m r e g u l a t e s t h e e f f e c t s o f g e l s o l i n o n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . T h i s r e g u l a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e s t r u c t u r e o f t h e g e l s o l i n m o l e c u l e i s a l t e r e d u p o n b i n d i n g o f t h e d i v a l e n t c a t i o n . T h e c a l c i u m i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e g e l s o l i n m o l e c u l e h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s a n d s h o w s o m e d i f f e r e n c e s a m o n g t h e m . 5 5 ' 6 8 ' 6 9 ' 7 8 ' 7 9 I n t h i s s t u d y , t h e m e t h o d o f p r e p a r a t i o n a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m m e a s u r e m e n t s i n d i c a t e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n g e l s o l i n u p o n b i n d i n g c a l c i u m . T h e f a c t t h a t t h e s e c h a n g e s w e r e n o t - 5 1 -d e t e c t e d b y s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n d g e l f i l t r a t i o n e x p e r i m e n t s s u g g e s t s t h a t c a l c i u m a c t i v a t e s t h e m o l e c u l e w i t h o u t a g r o s s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e . T h i s i s i n c o n t r a s t t o s o m e c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n s , s u c h a s t r o p o n i n , p a r v a l b u m i n , a n d c a l m o d u l i n , w h e r e l a r g e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a r e f o u n d u p o n b i n d i n g c a l c i u m . I n t h i s w a y t h e s e p r o t e i n s a r e a c t i v a t e d t o e f f e c t t h e i r f u n c t i o n s . - 5 2 -T a b l e I I I . S u m m a r y o f P h y s i c o c h e m i c a l P a r a m e t e r s o f G e l s o l i n . P a r a m e t e r h o r s e p l a s m a g e l s o l i n o t h e r g e l s o l i n s S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t , s °20 ,wr (S ) 4 . 8 P a r t i a l S p e c i f i c V o l u m e , V ( c m 3 / g ) 0 . 7 2 7 D e g r e e o f H y d r a t i o n , 8 0 . 3 9 3 ( g w a t e r / g p r o t e i n ) S t o k e s R a d i u s , R s (nm) 3 . 8 4 . 9 a , 4 . 8 [ 4 . 4 ] b 0 . 7 3 a - 0 . 7 2 8 b 4 .4 a « 3 . 4 [ 3 . 7 ] b « 3 . 7 n M o l e c u l a r W e i g h t , M r ( k D a ) : - S D S - P A G E 90 - G e l f i l t r a t i o n 7 5 - C a l c u l a t e d Mr=6TC TJRsN S ° 2 0 ,w / d " V p) 7 5 - A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n f / f o 1 . 2 - 1 . 3 E l l i p t i c i t y , [6]208 * 1 0 " 3 - 7 . 8 [ - 6 . 1 ] ( d e g c m 2 / d m o l ) A b s o r p t i o n C o e f f i c i e n t 1 . 4 ( m l / m g cm) M e l t i n g t e m p e r a t u r e , Tm ( °C ) 4 6 [ 5 4 ] T r a n s i t i o n m i d p o i n t b y G u - H C l 1 . 5 M G u - H C l 9 1 a • 91 b« 9 0 ^ 9 3 c 9 0 d 92J 7 7 n 9 5 . 3 a ' 6 9 b 8 3 f , 8 1 . 6 e 1 . 2 6 [ 1 . 3 8 ] b -1 . 4 3 a - 4 0 . 4 & - 8 . 1 2 [ 7 . 0 ] h 1 . 4 1 1 .8J 1 . 2 4 m 45J (a) r a b b i t m a c r o p h a g e s . 8 0 (b) b o v i n e s e r u m . 5 3 (C) h u m a n s e r u m . 5 2 (d) r a b b i t s e r u m . 5 4 (e ) p i g p l a s m a . 6 1 (f) h u m a n p l a s m a . 6 4 (g ) h u m a n p l a s m a . 6 9 ( h ) p i g p l a s m a . 6 8 (i) h u m a n p l a s m a . 8 1 (j) b o v i n e s e r u m . 7 9 (k) h u m a n p l a s m a . 1 5 (1) p i g p l a s m a . 1 6 (m) p i g p l a s m a . 4 6 (n) b o v i n e s e r u m . 5 9 B r a c k e t s : i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s - 5 3 -P A R T I I I . I n t e r a c t i o n w i t h A c t i n . As m e n t i o n e d i n t h e I n t r o d u c t i o n , g e l s o l i n i n t e r a c t i o n s w i t h a c t i n can l e a d t o a c c e l e r a t i o n o f t h e n u c l e a t i o n s t e p o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n , t o s e v e r i n g o f a c t i n f i l a m e n t s and t o capping o f a c t i n p o l y m e r s . 1 2 The k i n e t i c s o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n can be d e s c r i b e d i n terms o f a l a g phase a s s o c i a t e d w i t h f o r m a t i o n o f s t a b l e n u c l e i ( c o n s i s t i n g o f about t h r e e a c t i n monomers), f o l l o w e d by a r a p i d e l o n g a t i o n phase and, f i n a l l y , a steady s t a t e i n w hich t h e f i l a m e n t s can be c h a r a c t e r i z e d by an average polymer l e n g t h . 8 ' 1 1 The f i l a m e n t has d i r e c t i o n a l i t y . I t i s p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h a f a s t growing end (B) and a slow growing end (P) . The n u c l e a t i o n a c t i v i t y o f g e l s o l i n i s m a n i f e s t e d by a b o l i t i o n o f t h e l a g phase and p r o d u c t i o n o f f i l a m e n t s t h a t are s h o r t e r and form f a s t e r than i n samples p o l y m e r i z e d i n t h e absence o f t h e n u c l e a t i n g p r o t e i n . The c a p p i n g and s e v e r i n g a c t i v i t i e s o f g e l s o l i n r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f s h o r t e r f i l a m e n t s o f a c t i n when g e l s o l i n i s added t o a l r e a d y formed p o l y m e r s . C a p p i n g ( b i n d i n g t o t h e f a s t growing end o f t h e f i l a m e n t ) produces s h o r t e r f i l a m e n t s by p r e v e n t i n g p o l y m e r i z a t i o n a t the f a s t growing end. S e v e r i n g i s thought t o occur by d i r e c t b r e a k i n g o f t h e f i l a m e n t . The net r e s u l t o f t h e a c t i v i t i e s o f g e l s o l i n on a c t i n can be summarized i n F i g u r e 18. - 5 4 -l o n g f i l a m e n t >* ^ cS> ^B65555S$9 * s h o r t capped f i l a m e n t s F i g u r e 18. S c h e m a t i c R e p r e s e n t a t i o n o f t h e E f f e c t s o f G e l s o l i n on A c t i h P o l y m e r i z a t i o n . A c t i n ( c l e a r c i r c l e s ) . G e l s o l i n (dark c i r c l e s ) . B, f a s t g r o w i n g end. P, slow growing end. A. D i f f e r e n c e Absorbance. The d i f f e r e n c e i n absorbance between monomeric and p o l y m e r i c a c t i n was used t o s t u d y t h e e f f e c t s o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n on a c t i n . The d i f f e r e n c e a b s o r b a n c e spectrum o f a c t i n upon p o l y m e r i z a t i o n has one p o s i t i v e peak a t 280 and a more pronounced one a t 232 nm. 8 2 T a k i n g a sample o f g l o b u l a r a c t i n and a d d i n g s a l t a t time e q u a l t o -55-z e r o t o i n d u c e p o l y m e r i z a t i o n , i t i s p o s s i b l e t o f o l l o w t h e t i m e c o u r s e o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n b y f o l l o w i n g t h e i n c r e a s e i n d i f f e r e n c e a b s o r b a n c e a t 2 3 2 n m . G e l s o l i n g r e a t l y r e d u c e s t h e l a g p h a s e o f t h i s p r o c e s s ( F i g u r e 1 9 ) , d e m o n s t r a t i n g t h e e n h a n c e d n u c l e a t i o n a c t i v i t y o f a c t i n p o l y m e r i z a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n . F i g u r e 1 9 . N u c l e a t i o n A c t i v i t y o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n o n A c t i n P o l y m e r i z a t i o n . G - a c t i n i n b u f f e r A ( 0 . 5 mg m l - 1 i n 2 mM t r i s - H C l - 1 mM D T T - 0 . 2 mM C a C l 2 - 0 . 2 mM A T P - p H 7 . 6 ) w a s i n d u c e d t o p o l y m e r i z e b y a d d i t i o n o f M g C l 2 t o 1 . 0 mM. C u r v e 1 s h o w s t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 2 3 2 nm o f a c t i n i n d u c e d t o p o l y m e r i z e i n t h e a b s e n c e o f g e l s o l i n . C u r v e s 2 a n d 3 s h o w a m o r e r a p i d d e v e l o p m e n t i n a b s o r b a n c e i n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n . T h e r a t i o [ a c t i n ] / [ g e l s o l i n ] = 64 a n d 3 2 r e s p e c t i v e l y f o r c u r v e s 2 a n d 3 . - 5 6 -B . V i s c o m e t r y . C a p i l l a r y v i s c o m e t r y i s s e n s i t i v e t o m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n a n d o f f e r s a n e a s y m e t h o d t o s t u d y t h e a c t i v i t y o f g e l s o l i n . A s s h o w n i n T a b l e IV, s o l u t i o n s o f 0 . 5 m g / m l o f a c t i n i n 2 mM t r i s - H C l - 1 mM D T T - 0 . 2 mM C a C l 2 - 0 . 2 mM A T P - p H 7 . 6 ( h e n c e f o r t h c a l l e d b u f f e r A ) w e r e u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t . A c t i n i n d u c e d t o p o l y m e r i z e b y a d d i t i o n o f u p t o 1 mM M g C l 2 r e a c h e s a s t e a d y s t a t e r e l a t i v e v i s c o s i t y o f 1 . 5 . A d d i t i o n o f g e l s o l i n t o a c t i n i n a 1 / 1 0 0 m o l a r r a t i o r e d u c e s t h e v i s c o s i t y t o 1 . 2 . A g e l s o l i n / a c t i n s o l u t i o n w i t h a 1 / 5 0 m o l a r r a t i o h a s a r e l a t i v e v i s c o s i t y o f 1 . 0 . T h e s e v a l u e s a r e o b t a i n e d b o t h w h e n g e l s o l i n i s p r e s e n t w i t h a c t i n w h e n i t i s i n d u c e d t o p o l y m e r i z e ( T a b l e IV. A ) , o r i f i t i s a d d e d t o p r e f o r m e d a c t i n f i l a m e n t s ( T a b l e IV. B ) . T h e f i n a l s o l u t i o n i n e a c h c a s e i s t h o u g h t t o c o n s i s t o f m a n y s h o r t , g e l s o l i n - c a p p e d f i l a m e n t s . - 5 7 -S a m p l e r e l v i s c o s i t y A B F - a c t i n 1 . 5 1 . 5 G - a c t i n 1 . 0 1 . 0 a c t i n : g e l s o l i n 1 0 0 : 1 1 . 2 1 . 2 a c t i n : g e l s o l i n 5 0 : 1 1 . 0 1 . 0 T a b l e I V . E f f e c t o f G e l s o l i n o n G - a c t i n P o l y m e r i z a t i o n a n d o n t h e V i s c o s i t y o f A c t i n F i l a m e n t s . A c t i n ( 1 . 1 8 x 1 0 " 5 M) i n b u f f e r A ; (A ) A c t i n w a s m i x e d w i t h g e l s o l i n t o t h e i n d i c a t e d m o l a r r a t i o s a n i n d u c e d t o p o l y m e r i z e b y t h e a d d i t i o n o f 1 mM M g C l 2 (B ) a c t i n w a s p o l y m e r i z e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 mM M g C l 2 a n d g e l s o l i n w a s a d d e d 2 h l a t e r a t t h e i n d i c a t e d m o l a r r a t i o s . C . I n t e r a c t i o n o f G e l s o l i n w i t h A c t i n L a b e l l e d w i t h 6 -A c r y l o y l - 2 - d i m e t h y l a m i n o n a p h t h a l e n e ( A c r y l o d a n ) . T h e i n t e r a c t i o n o f g e l s o l i n w i t h a c t i n , w h e n a c t i n c o n c e n t r a t i o n i s l i m i t i n g , p r o d u c e s a 2 : 1 a c t i n : g e l s o l i n c o m p l e x i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m ( F i g u r e 2 0 ) . U p o n c h e l a t i o n o f t h e d i v a l e n t c a t i o n f r o m t h e 1 : 2 c o m p l e x , o n e a c t i n i s r e l e a s e d p r o d u c i n g a 1 : 1 E G T A r e s i s t a n t c o m p l e x . 83-86 A + G A 2 G -« A G + A + C a 2 + F i g u r e 2 0 . S c h e m a t i c R e p r e s e n t a t i o n o f t h e I n t e r a c t i o n o f A c t i n a n d G e l s o l i n , a t L i m i t i n g A c t i n C o n c e n t r a t i o n s . (A) a c t i n ; (G) g e l s o l i n . - 5 8 -T h i s m o d e l i s c o n s i s t e n t w i t h t h e b e h a v i o r o f g e l s o l i n s f r o m s e v e r a l d i f f e r e n t s o u r c e s . H o w e v e r , p i g p l a s m a g e l s o l i n h a s b e e n r e p o r t e d t o i n t e r a c t w i t h a c t i n e v e n , i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m . 8 7 A s t u d y b y P o p e e t a l . 8 8 s u g g e s t e d t h a t t h e c a l c i u m s e n s i t i v i t y m a y b e l o s t a s a r e s u l t o f f a c t o r s p r e s e n t i n p l a s m a t h a t a r e a c t i v a t e d w h e n g e l s o l i n i s p r e p a r e d i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m . T h e c a l c i u m d e p e n d e n c e o f t h e i n t e r a c t i o n o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n w i t h a c t i n w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g a c t i n l a b e l l e d w i t h a c r y l o d a n , a c c o r d i n g t o M a r r i o t e t a l . 8 9 C . l S p e c t r a l C h a r a c t e r i s t i c s . T h e u n c o r r e c t e d f l u o r e s c e n c e o f a c r y l o d a n - l a b e l l e d a c t i n ( A D A - a c t i n ) i s m a x i m a l a t 4 8 6 n m . U p o n a d d i n g g e l s o l i n t h e i n t e n s i t y d e c r e a s e s w i t h o u t a n a p p r e c i a b l e c h a n g e i n p o s i t i o n o f t h e e m i s s i o n m a x i m u m ( F i g u r e 2 1 ) . A c r y l o d a n b i n d s t o c y s 3 7 4 , t h e m o s t r e a c t i v e c y s t e i n e i n n a t i v e a c t i n . 8 9 T h e s a m e s i t e c a n b e l a b e l l e d w i t h o t h e r p r o b e s a n d i s k n o w n t o b e a f f e c t e d b y i n t e r a c t i o n o f a c t i n a n d o t h e r g e l s o l i n s . 8 3 ' 8 5 ' 8 7 T h u s , l a r g e c h a n g e s i n i n t e n s i t y a n d w a v e l e n g t h o f e m i s s i o n m a x i m u m w e r e e x p e c t e d w i t h t h i s s e n s i t i v e p r o b e . 9 0 -59-F (a.u.) 420 460 500 540 580 X (nm) F i g u r e 2 1 . F l u o r e s c e n c e E m i s s i o n S p e c t r a o f A D A - a c t i n (1 x 1 0 " 6 M) . I n t h e a b s e n c e ( u p p e r s p e c t r u m ) a n d p r e s e n c e ( l o w e r s p e c t r u m ) o f g e l s o l i n (2 x 1 0 ~ 6 M ) . Xex = 3 9 0 n m . T h e m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e i n b u f f e r A . a . u . = a r b i t r a r y u n i t s . Q u e n c h i n g s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h a t t h e p r o b e i n t h e c o m p l e x i s p r o t e c t e d f r o m t h e q u e n c h e r . T h e S t e r n - V o l m e r c o n s t a n t o b t a i n e d f o r A D A - a c t i n q u e n c h e d b y I" i s e q u a l t o 1 . 3 M " 1 ( F i g u r e 2 2 ) . I n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n , t h i s v a l u e i s d e c r e a s e d t o 0 . 9 0 9 M " 1 . T h e s m a l l e r t h e s l o p e ( S t e r n - V o l m e r c o n s t a n t ) , t h e s m a l l e r t h e q u e n c h i n g c o n s t a n t ( k q ) a n d t h e m o r e i n a c c e s s i b l e t h e f l u o r o p h o r e t o t h e q u e n c h e r ( s e e e q u a t i o n 1 . 1 1 ) . - 6 0 -1.6 [K I ] M F i g u r e 22. Stern-Volmer P l o t s f o r t h e Quenching o f A c r y l o d a n i n A c t i n and i n t h e A c r y l o d a n - l a b e l l e d A c t i n -g e l s o l i n Complex. Two i d e n t i c a l samples of ADA-actin (0.1 x 10~ 7 M open c i r c l e s ) and two o f A D A - a c t i n + g e l s o l i n i n a molar r a t i o o f 1:1 ( c l o s e d c i r c l e s ) were p r e p a r e d . F v a l u e s were measured from the s o l u t i o n s t o which KI was added and Fo v a l u e s were measured from th e s o l u t i o n s t o which KC1 was added as a c o n t r o l f o r i o n i c s t r e n g t h and d i l u t i o n . X-ex = 365 nm, Xem = 486 nm. B u f f e r used: b u f f e r A. KI and KC1 a f f e c t t h e s t a t e o f a c t i n ( g l o b u l a r v e r s u s f i l a m e n t o u s ) . To a v o i d p o l y m e r i z a t i o n i n t h e q u e n c h i n g e x p e r i m e n t s , a c t i n was used a t c o n c e n t r a t i o n s below th e v a l u e a t which p o l y m e r i z a t i o n o c c u r s . The s t a t e o f ADA-a c t i n was t a k e n t o be g l o b u l a r d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e s e s t u d i e s because i t s e m i s s i o n spectrum was not enhanced and b l u e s h i f t e d as would have been e x p e c t e d i f p o l y m e r i z a t i o n had o c c u r r e d . 8 9 The q u e n c h i n g o f a c r y l o d a n f l u o r e s c e n c e w i t h o u t an a s s o c i a t e d s h i f t i n the wavelength of maximal e m i s s i o n upon -61-i n t e r a c t i o n o f a c t i n a n d g e l s o l i n m a y b e a t t r i b u t e d t o s t a t i c q u e n c h i n g , o r t o a g r o u n d s t a t e i n t e r a c t i o n o f a c r y l o d a n w i t h g e l s o l i n t h a t d e c r e a s e s t h e o b s e r v e d f l u o r e s c e n c e . T h e s e t w o p o s s i b i l i t i e s , a l t h o u g h n o t p u r s u e d i n t h i s t h e s i s , c o u l d b e d i f f e r e n t i a t e d b y m e a s u r i n g t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m a n d / o r t h e l i f e t i m e o f a c r y l o d a n - a c t i n i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f g e l s o l i n . I f i n t e r a c t i o n s i n t h e g r o u n d s t a t e a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d d e c r e a s e i n t h e e m i s s i o n i n t e n s i t y , t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m m a y r e f l e c t i t . T h e l i f e t i m e s h o u l d r e m a i n t h e s a m e i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f g e l s o l i n i f t h i s b e h a v i o u r w a s d u e t o s o m e s t a t i c q u e n c h i n g . C . 2 . C a l c i u m S e n s i t i v i t y a n d S t o i c h i o m e t r y o f B i n d i n g . D e s p i t e t h e q u e s t i o n r e g a r d i n g t h e o r i g i n o f t h e o b s e r v e d c h a n g e i n a c r y l o d a n - a c t i n u p o n a d d i n g g e l s o l i n , t h e d e c r e a s e i n i n t e n s i t y o b s e r v e d w a s u s e d t o o b t a i n t h e s t o i c h i o m e t r y o f b i n d i n g o f t h e t w o p r o t e i n s . T i t r a t i o n s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d b y a d d i n g s m a l l a l i q u o t s o f g e l s o l i n t o l a b e l l e d a c t i n i n b u f f e r A ( F i g u r e 23, c l e a r c i r c l e s ) . F l u o r e s c e n c e i n t e n s i t i e s w e r e r e c o r d e d a t 486 nm o n e x c i t a t i o n a t 390 n m . C o n t r o l f o r d i l u t i o n w a s p e r f o r m e d b y a d d i n g b u f f e r t o a n o t h e r s a m p l e . T h e d a t a a r e p r e s e n t e d a s t h e r a t i o o f t h e f l u o r e s c e n c e v a l u e s i n t h e t e s t a n d c o n t r o l s a m p l e s . T h e p l o t s h o w s a c o n t i n u o u s i n c r e a s e i n -62-t h i s r a t i o u n t i l a p l a t e a u i s r e a c h e d a t a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m o l g e l s o l i n p e r m o l a c t i n . o 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 ge l so l in/ac t in 1.0 F i g u r e 2 3 . T i t r a t i o n o f A D A - A c t i n w i t h G e l s o l i n . T h e d e c r e a s e i n i n t e n s i t y a t 4 8 7 nm w a s m o n i t o r e d a d d i n g g e l s o l i n t o a c t i n ( F ) a n d t o b u f f e r ( F o ) . T h e d a t a i s p r e s e n t e d a s a p l o t o f t h e r a t i o F o / F a g a i n s t t h e m o l a r r a t i o o f g e l s o l i n t o a c t i n . A D A - a c t i n i n b u f f e r A ( o p e n c i r c l e s ) . I n b u f f e r A w i t h 2 mM M g C l 2 a n d 5 mM E G T A ( c l o s e d c i r c l e s ) . W h e n A D A - a c t i n w a s m i x e d w i t h 5 mM E G T A p r i o r t o a d d i n g g e l s o l i n , t h e d e c r e a s e d u e t o g e l s o l i n p a r a l l e l s t h e d e c r e a s e i n i n t e n s i t y d u e t o d i l u t i o n e f f e c t s ( F i g u r e 2 3 , c l o s e d c i r c l e s ) . M g C l 2 w a s p r e s e n t i n t h e s e e x p e r i m e n t s t o a v o i d d e n a t u r a t i o n o f a c t i n u p o n c h e l a t i o n o f c a l c i u m w i t h E G T A . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h a t g e l s o l i n b i n d s t o a c t i n o n l y i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s . - 6 3 -The b i n d i n g and r e l e a s e o f one a c t i n molecule from the A 2 G complex was s t u d i e d w i t h p o l a r i z a t i o n measurements. I f a sample i s e x c i t e d w i t h p o l a r i z e d l i g h t , t h e r e i s p r e f e r e n t i a l e x c i t a t i o n o f t h e m o l e c u l e s w i t h t h e i r t r a n s i t i o n d i p o l e moments o r i e n t e d p a r a l l e l t o t h e d i r e c t i o n o f t h e e l e c t r i c v e c t o r o f t h e p o l a r i z e d e x c i t a t i o n . T h i s p h o t o s e l e c t i o n may r e s u l t i n p o l a r i z e d e m i s s i o n . F o r a g i v e n chromophore, and i n t h e absence o f energy t r a n s f e r and o t h e r t r i v i a l causes o f d e p o l a r i z a t i o n , t h e p o l a r i z a t i o n v a l u e w i l l depend on r o t a t i o n a l d i f f u s i o n ( c o r r e l a t i o n t i m e <j>) t h a t d i s p l a c e s t h e e m i s s i o n d i p o l e d u r i n g t h e l i f e t i m e o f t h e e x c i t e d s t a t e . T h i s i n t u r n depends on t h e s i z e and shape o f t h e m o l e c u l e and t h e v i s c o s i t y o f t h e medium. S t u d i e s on t h e r o t a t i o n a l motion by p o l a r i z a t i o n measurements r e q u i r e t h a t t h e l i f e t i m e o f th e f l u o r o p h o r e be comparable t o t h e c o r r e l a t i o n t i me o f the m o l e c u l e . I n f o r m a t i o n r e l e v a n t t o the dynamics o f t h e macromolecule may be deduced from p o l a r i z a t i o n e v e n t s . F o r l a r g e p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r weight i n t h e range 1 x 10 6, such as immunoglobin M , l i f e t i m e s o f t h e o r d e r o f 100 ns are a p p r o p r i a t e . T h i s has been found i n t h e case o f pyrene and some o f i t s d e r i v a t i v e s as p o l a r i z a t i o n probes. S m a l l e r p r o t e i n s w i t h c o r r e l a t i o n t i m e s i n t h e range 10-150 ns r e q u i r e bound f l u o r o p h o r e s w i t h s h o r t e r l i f e t i m e s o f up t o 25 ns. The l i f e t i m e o f a c r y l o d a n i n o t h e r systems i s about 4 ns, w h i c h i s a p p r o p r i a t e f o r s t u d i e s o f a c t i n and g e l s o l i n . A D A - a c t i n i n b u f f e r A s h o w s a p o l a r i z a t i o n v a l u e o f 0.384 u p o n e x c i t a t i o n a t 390 nm a n d o b s e r v a t i o n o f t h e e m i s s i o n a t 486 n m . T h i s i s s i m i l a r t o t h e v a l u e o f 0.38 r e p o r t e d b y M a r r i o t e t a l . 8 9 a n d s u g g e s t s t h a t t h e p r o b e i s r i g i d l y a s s o c i a t e d w i t h t h e p r o t e i n . T h e d e p o l a r i z a t i o n o b s e r v e d r e f l e c t s t h e g l o b a l t u m b l i n g o f t h e a c t i n m o l e c u l e . T h i s i s i n c o n t r a s t t o r o t a t i o n o f t h e f l u o r o p h o r e i n d e p e n d e n t o f t h e m o t i o n o f t h e m a c r o m o l e c u l e , i n w h i c h c a s e t h e p o l a r i z a t i o n i n t h e a q u e o u s b u f f e r u s e d w o u l d b e e x p e c t e d t o b e v e r y l o w . F i g u r e 24 s h o w s a n i n c r e a s e i n p o l a r i z a t i o n w h e n g e l s o l i n i s a d d e d t o A D A - a c t i n . T h e a c t i n - g e l s o l i n c o m p l e x h a s a v o l u m e l a r g e r t h a n t h a t o f a c t i n a l o n e . T h e l a r g e r v o l u m e l o w e r s t h e r o t a t i o n a l d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t a n d t h i s i n t u r n a f f e c t s t h e c o r r e l a t i o n t i m e a c c o r d i n g t o : <•= T |V/kT = l / 6 D R . -65-0.42 0.41 -0, 0.40 -0.39 0.38 gelsolin/actin F i g u r e 2 4 . P o l a r i z a t i o n I n c r e a s e i n t h e F l u o r e s c e n c e o f G e l s o l i n u p o n B i n d i n g t o A c t i n . T h e p o l a r i z a t i o n i n c r e a s e t h a t o c c u r s u p o n a d d i n g g e l s o l i n a n d a c t i n i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m w a s m o n i t o r e d a t 4 8 7 nm u p o n e x c i t a t i o n a t 3 90 nm a n d p l o t t e d a g a i n s t t h e m o l a r r a t i o o f t h e t w o p r o t e i n s ( c l e a r c i r c l e s ) . T h e d a r k c i r c l e s h o w s t h e e f f e c t o f a d d i t i o n o f E G T A t o 5 mM. A p l a t e a u i s r e a c h e d a t a p p r o x i m a t e l y 2 m o l o f a c t i n p e r m o l o f g e l s o l i n . W h e n E G T A i s a d d e d t o c h e l a t e t h e c a l c i u m i o n s p r e s e n t , t h e r e i s a d e c r e a s e i n p o l a r i z a t i o n . T h i s d e c r e a s e , h o w e v e r , d o e s n o t r e a c h t h e i n i t i a l p o l a r i z a t i o n v a l u e o f t h e f r e e a c t i n . T h e e f f e c t s o f a d d i n g g e l s o l i n t o A D A - a c t i n o n t h e i n t e n s i t y a n d p o l a r i z a t i o n o f t h e f l u o r e s c e n c e o f a c r y l o d a n d o n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e t w o a c t i n m o n o m e r s t h a t b i n d d i r e c t l y t o g e l s o l i n . T h e s i m i l a r i t y o f t h e t w o a c t i n -b i n d i n g e n v i r o n m e n t s o n g e l s o l i n i s a l s o s u g g e s t e d b y t h e -66-l i n e a r i t y o f t h e q u e n c h i n g p l o t s . T w o d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s w o u l d g e n e r a l l y p r o d u c e a c o n c a v e d o w n w a r d S t e r n - V o l m e r p l o t . T h e s e r e s u l t s d i f f e r f r o m t h o s e o f B r y a n a n d K u r t h , 8 3 w h o f o u n d t h a t t h e f l u o r e s c e n c e o f t h e f i r s t a c t i n l a b e l l e d w i t h 7 - c h l o r o - 4 - n i t r o - b e n z o - 2 - o x a - l , 3 -d i a z o l e , i s n o t a f f e c t e d u p o n i n t e r a c t i o n w i t h g e l s o l i n . T h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s t h e s i s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e o f C o u e a n d K o r n 8 5 a n d W e e d s a n d c o w o r k e r s 8 7 w h o f o u n d s i m i l a r e n h a n c e m e n t i n t h e f l u o r e s c e n c e o f t h e s a m e p r o b e o n b o t h a c t i n s , u p o n i n t e r a c t i o n w i t h g e l s o l i n . T h e r e s u l t s o b t a i n e d s u g g e s t t h a t g e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a b e h a v e s a s s h o w n i n F i g u r e 2 0 a n d t h a t t h e e x p o s u r e i t h a s t o c a l c i u m i o n s d u r i n g i t s p r e p a r a t i o n d o e s n o t a b o l i s h i t s c a l c i u m s e n s i t i v i t y , o r , t h a t t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r t h e l o s s o f t h i s s e n s i t i v i t y a r e n o t p r e s e n t i n h o r s e p l a s m a . D . C i r c u l a r D i c h r o i s m a n d U l t r a v i o l e t / A b s o r p t i o n S t u d i e s o f G e l s o l i n a n d i t s B i n d i n g t o A c t i n . O t h e r s t u d i e s i n t h e l i t e r a t u r e h a v e b e e n d e v o t e d t o c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n g e l s o l i n w h i c h r e s u l t u p o n b i n d i n g c a l c i u m . 5 5 ' 7 8 ' 7 9 I n t h i s s t u d y , t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n g e l s o l i n u p o n b i n d i n g t o a c t i n w e r e i n v e s t i g a t e d u s i n g u l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n a n d c i r c u l a r d i c h r o i s m m e a s u r e m e n t s . -67-G e l s o l i n w a s p u t i n o n e s i d e o f a d o u b l e c h a m b e r c e l l a n d a c t i n i n t h e o t h e r . T h e s p e c t r u m w a s r e c o r d e d b e f o r e a n d a f t e r i n v e r t i n g t h e c e l l t o m i x . T h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e t w o s p e c t r a ( d a t a n o t s h o w n ) , s h o w s t h a t t h e r e i s n o t a m a j o r c h a n g e u p o n b i n d i n g d e t e c t e d b y t h i s t e c h n i q u e . C o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s u p o n b i n d i n g o f g e l s o l i n a n d a c t i n w e r e i n v e s t i g a t e d f u r t h e r u s i n g c i r c u l a r d i c h r o i s m . T h e f a r - U V CD r e p o r t s c h a n g e s i n t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d t h e n e a r - U V CD r e f l e c t s t h e e n v i r o n m e n t o f t h e a r o m a t i c a n d c y s t e i n e a m i n o a c i d s . T h e c i r c u l a r d i c h r o i s m s p e c t r a o f g e l s o l i n a n d a c t i n i n t h e f a r U V r e g i o n w e r e r e c o r d e d s e p a r a t e l y a n d t h e n t h e s p e c t r u m o f a m i x t u r e o f b o t h p r o t e i n s w a s r e c o r d e d ( F i g u r e 2 5 ) . T h e s a m e p r o c e d u r e w a s f o l l o w e d i n t h e n e a r U V r e g i o n w i t h g e l s o l i n , 3 . 0 2 x 1 0 " 5 M, a n d a c t i n , 5 . 5 5 x 1 0 " 5 M i n a 2 mm p a t h l e n g t h c e l l ( d a t a n o t s h o w n ) . I n b o t h c a s e s t h e c a l c u l a t e d CD c u r v e r e s e m b l e s t h e c u r v e o b t a i n e d w i t h t h e m i x t u r e , c o n f i r m i n g t h e l a c k o f s i g n i f i c a n t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n e i t h e r p r o t e i n o n i n t e r a c t i o n . T h i s b i n d i n g b e t w e e n t h e t w o p r o t e i n s w i t h o u t m a j o r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i s a n a l o g o u s t o t h e b i n d i n g o f D N A a s e I a n d a c t i n . 9 1 B o t h a r e i n c o n t r a s t t o t h e b i n d i n g o f c a l m o d u l i n t o m o d e l s u b s t r a t e s w h e r e l a r g e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s h a v e b e e n d e t e c t e d . 9 2 -68-240 wav«l«ngth 225 (nm) $• H H M I M « H F i g u r e 2 5 . C o n f o r m a t i o n a l C h a n g e s o n G e l s o l i n u p o n I n t e r a c t i o n w i t h A c t i n a s d e t e c t e d b y f a r UV C D . S p e c t r a o f g e l s o l i n ( 1 ) / a c t i n ( 2 ) , a o n e t o o n e g e l s o l i n : a c t i n m i x t u r e b y v o l u m e ( 3 ) , a n d t h e e x p e r i m e n t a l b a s e l i n e ( 4 ) . T h e b r o k e n l i n e r e p r e s e n t s t h e v a l u e s c a l c u l a t e d f o r t h e m i x t u r e . A l l s p e c t r a w e r e r e c o r d e d i n b u f f e r A i n a 0 . 0 5 mm p a t h l e n g t h c e l l . C u r v e 1 : [ G e l s o l i n ] = 3 . 0 2 x I O " 5 M a n d c u r v e 2 : [ a c t i n ] = 5 . 5 5 x 1 0 " 5 M . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , g e l s o l i n w a s d i a l y s e d i n b u f f e r A o v e r n i g h t b e f o r e m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t . I t w a s n o t e d t h a t s o m e p r e c i p i t a t i o n o f g e l s o l i n o c c u r s i n t h i s b u f f e r . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e l o w i o n i c s t r e n g t h o f b u f f e r A . S i m i l a r r e p o r t s o f t h e i n s t a b i l i t y o f g e l s o l i n i n l o w i o n i c s t r e n g t h b u f f e r s e x i s t , s u g g e s t i n g t h e s t a b i l i z a t i o n o f g e l s o l i n b y s a l t s . - 6 9 -P A R T I V . I n t e r a c t i o n o f H o r s e P l a s m a G e l s o l i n w i t h t h e H y d r o p h o b i c F l u o r e s c e n t P r o b e : 2 - ( N - M e t h y l a n y l i n o ) n a p h t h a l e n e - 6 - s u l f o n a t e ( M A N S ) . T h e b u r y i n g o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s o f a p o l y p e p t i d e c h a i n i n a q u e o u s s o l u t i o n t o a t t a i n t h e n a t i v e s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n i s n o t a l w a y s 1 0 0 % c o m p l e t e . A s a r e s u l t , h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s may b e f o u n d a t t h e s u r f a c e o r i n c r e v i c e s o f t h e p r o t e i n . I f t h e s e a m i n o a c i d s a r e l o c a t e d i n s t r a t e g i c p o s i t i o n s , t h e y may p a r t i c i p a t e i n t h e f o r m a t i o n o f h y d r o p h o b i c p o c k e t s o r p a t c h e s t h a t a r e e x p o s e d t o t h e a q u e o u s m e d i u m . 9 3 T h e s e p a t c h e s h a v e b e e n d e t e c t e d o n n a t i v e p r o t e i n s a n d h a v e b e e n f o u n d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p r o t e i n f u n c t i o n . 9 4 ' 9 5 G e l s o l i n , i n t h e p r e s e n c e o f m i c r o m o l a r C a 2 + , i s a b l e t o b i n d 2 a c t i n m o n o m e r s . A d d i t i o n o f C a 2 + - c h e l a t o r s r e s u l t s i n t h e r e m o v a l o f o n e o f t h e s e a c t i n u n i t s . 8 3 - 8 7 T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n g e l s o l i n a n d a c t i n i s n o n c o v a l e n t a n d m a y i n v o l v e b o t h i o n i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s . T o i n v e s t i g a t e h y d r o p h o b i c p a t c h e s o n g e l s o l i n , t h e f l u o r e s c e n t p r o b e MANS w a s u s e d . M A N S b e l o n g s t o a c l a s s o f a n i l i n o n a p h t h a l e n e d e r i v a t i v e s t h a t e x h i b i t e x t r e m e l y e n v i r o n m e n t - s e n s i t i v e e m i s s i o n p r o p e r t i e s . T h e y a r e a l m o s t n o n f l u o r e s c e n t i n a q u e o u s s o l u t i o n s b u t t h e i r e m i s s i o n i s e n h a n c e d a n d b l u e -s h i f t e d i n s o l v e n t s o f d e c r e a s e d p o l a r i t y . 9 6 - 9 7 MANS h a s - 7 0 -b e e n u s e d t o c h a r a c t e r i z e h y d r o p h o b i c p a t c h e s o n s e v e r a l p r o t e i n s 9 8 i n c l u d i n g a c t i n . 9 9 A . B i n d i n g o f MANS t o G e l s o l i n . F i g u r e 2 6 s h o w s t h e f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r u m o f MANS i n 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - ImM E G T A a t p H = 7 . 2 ( h e n c e f o r t h c a l l e d b u f f e r E ) . I t s e m i s s i o n e x h i b i t s a b r o a d b a n d w i t h m a x i m u m n e a r 5 2 0 n m . I n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n , t h i s s p e c t r u m i s b l u e - s h i f t e d t o 4 2 0 nm a n d t h e q u a n t u m y i e l d i s c o n s i d e r a b l y e n h a n c e d . T h i s e f f e c t c a n b e m i m i c k e d w i t h s o l u t i o n s o f MANS i n 2 - p r o p a n o l . T h e s e r e s u l t s a r e i n d i c a t i v e o f t h e b i n d i n g o f MANS t o h y d r o p h o b i c r e g i o n s i n g e l s o l i n . B . D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t a n d N u m b e r o f B i n d i n g S i t e s . A n a d a p t a t i o n o f t h e l i g a n d - b i n d i n g a n a l y s i s o f S c a t c h a r d p r o p o s e d b y Z i e l e r 1 0 0 w a s u t i l i z e d i n t h e p r e s e n t w o r k . T h e f l u o r e s c e n c e t i t r a t i o n d a t a w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s (n ) a n d t h e d i s o c i a t i o n c o n s t a n t ( Kd ) f o r t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n MANS a n d g e l s o l i n . T h i s a n a l y s i s a s s u m e s t h a t b i n d i n g o c c u r s i n e q u i v a l e n t a n d i n d e p e n d e n t p r o t e i n s i t e s . S e v e r a l t i t r a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t , e a c h i n v o l v i n g t h e f o l l o w i n g o f t h e i n c r e a s e i n f l u o r e s c e n c e a t 4 2 0 n m . A s e t o f s a m p l e s w a s m a i n t a i n e d a t c o n s t a n t g e l s o l i n c o n c e n t r a t i o n (G) w h i l e - 7 1 -t h e c o n c e n t r a t i o n o f MANS w a s i n c r e a s e d . Two o t h e r s e t s o f s a m p l e s w e r e u s e d w h e r e M A N S w a s k e p t a t c o n s t a n t c o n c e n t r a t i o n s ( M i ) a n d (M2) w h i l e t h e c o n c e n t r a t i o n o f g e l s o l i n w a s i n c r e a s e d . w a v e l e n g t h (nm) F i g u r e 2 6 . E m i s s i o n S p e c t r a o f MANS i n B u f f e r , B o u n d t o G e l s o l i n a n d i n I s o p r o p a n o l . E m i s s i o n s p e c t r a o f MANS ( 4 . 0 x 1 0 - 6 M) i n b u f f e r E ( 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - ImM E G T A , p H 7 . 2 ) , i n h o r s e p l a s m a g e l s o l i n ( 2 . 0 x 1 0 " 6 M) i n t h e s a m e b u f f e r , a n d i n i s o p r o p a n o l . T e m p e r a t u r e ; 2 5 ° C . E x c i t a t i o n w a v e l e n g t h > 3 1 7 n m . T y p i c a l t i t r a t i o n r u n s a r e s h o w n i n F i g u r e 2 7 . T h e i n i t i a l s l o p e s o f t h e p l o t s o f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y c h a n g e s a t c o n s t a n t g e l s o l i n c o n c e n t r a t i o n ( S g ) , a n d a t c o n s t a n t M A N S c o n c e n t r a t i o n , ( S m i ) , a n d ( S m 2 ) , w e r e d e t e r m i n e d a n d i n s e r t e d i n t o t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s : 1 0 0 - 7 2 -(a) Kd = (Sm2-Smi) / [ (Smi/Mi) - (Sm2/M2) ] (b) n - (Sm/Sg) + (Kd/Sg)[(Sm/M)-Sg/G)] Where G i s t h e c o n c e n t r a t i o n o f g e l s o l i n i n t i t r a t i o n o f g e l s o l i n w i t h MANS and Mi and M 2 a r e t h e r e s p e c t i v e MANS c o n c e n t r a t i o n s i n two d i f f e r e n t t i t r a t i o n s o f MANS w i t h g e l s o l i n . Both Smi and Sm2 can be used t o c a l c u l a t e n. The number o f M A N S - g e l s o l i n b i n d i n g s i t e s c a l c u l a t e d i n t h i s manner a f t e r a n a l y s i s o f 5 d i f f e r e n t t i t r a t i o n e xperiments was 2.5 ± 0.9 (mean ± s . d . ) . The d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t was c a l c u l a t e d t o be 0.24 ± 0.13 |iM (mean ± s. d . ) . MAMS TO WHICH GELSOLM HAS ADDED GHS0MI TO MHXCH MANS MAS ADDED [Gttlsolin] (UM) [MANS] (UM) F i g u r e 27. T i t r a t i o n s o f t h e Increments i n F l u o r e s c e n c e I n t e n s i t y a t 420 nm Upon E x c i t a t i o n a t 317 nm. MANS; (A) 6.5 x 10" 6 M and (B) 0.65 x 10" 6 M t o which g e l s o l i n was added. (C) G e l s o l i n 4.24 x 10" 6 M i n b u f f e r E t o which s m a l l a l i q u o t s o f a s t o c k s o l u t i o n o f MANS were added. The i n i t i a l s l o p e s o f t h e p l o t s were used i n (a) and (b) t o determine t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t Kd and t h e number o f b i n d i n g s i t e s n. a.u. « a r b i t r a r y u n i t s . -73-C . E f f e c t o f MANS o n G e l s o l i n A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e . T h e u s e o f a n e x t r i n s i c f l u o r e s c e n t p r o b e t o s t u d y a p a r t i c u l a r p r o t e i n m a y c h a n g e t h e p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n t o a c e r t a i n e x t e n t . T h e p r e s e n c e o f MANS d o e s n o t a f f e c t t h e e l l i p t i c i t y v a l u e s i n t h e p e p t i d e r e g i o n o f t h e CD s p e c t r u m o f g e l s o l i n ( T a b l e V ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r e i s n o t a s i g n i f i c a n t e f f e c t o f t h e b i n d i n g o f MANS o n t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f g e l s o l i n . M o r e o v e r , v i s c o s i t y d a t a d e m o n s t r a t e s t h a t g e l s o l i n ( 1 . 2 |1M) i n t h e p r e s e n c e o f MANS ( 2 . 4 JIM) i s a s c a p a b l e a s g e l s o l i n a l o n e o f s e v e r i n g F-a c t i n ( 1 2 . 0 (1M) f i l a m e n t s . T h i s o b s e r v a t i o n s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t M A N S d o e s n o t a l t e r t h e s t r u c t u r e o f g e l s o l i n i n a s i g n i f i c a n t m a n n e r . C o n t r o l e x p e r i m e n t s w i t h a c t i n w e r e r u n i n t h e p r e s e n c e o f MANS s i n c e i t h a s b e e n s h o w n t h a t a c t i n h a s o n e MANS b i n d i n g s i t e . " - 7 4 -S a m p l e R e l a t i v e v i s c o s i t y [0]2O8 [6]222 ( c l eg c m 2 / d m o l ) B u f f e r A 1 . 0 F - a c t i n 1 . 5 M A N S - a c t i n • 1 . 5 G e l s o l i n 1 . 0 7 8 0 0 - 6 1 0 0 M A N S - g e l s o l i n G e l s o l i n - a c t i n M A N S - g e l s o l i n - a c t i n ; 1 . 0 1 .1 1 .1 7800 - 6 1 0 0 T A B L E V . E f f e c t o f MANS o n A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e o f G e l s o l i n . V i s c o s i t y m e a s u r e m e n t s : a c t i n ( 12 u M ) , g e l s o l i n ( 1 . 2 |iM) MANS ( 2 . 4 JIM) i n 2 . 0 mM t r i s - H C l - 1 mM DTT - 0 . 2 mM C a C l 2 - 0 . 2 mM A T P (pH 7 . 6 ) . K C 1 t o 1 5 0 mM a n d M g C l 2 t o 2 mM w e r e a d d e d t o t h e s a m p l e s r e q u i r i n g p o l y m e r i z e d a c t i n . CD m e a s u r e m e n t s . G e l s o l i n ( 7 . 3 JIM) i n 2 0 mM M O P S , 1 5 0 mM K C 1 , 1 mM E G T A , p H 7 . 5 . i n t h e p r e s e n c e ( 1 . 5 JIM) a n d a b s e n c e o f M A N S . D . T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f M A N S - g e l s o l i n . T h e e f f e c t s o f h e a t i n g t h e M A N S : g e l s o l i n c o m p l e x c o u l d b e f o l l o w e d b y m o n i t o r i n g t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a t 4 2 0 nm o r b y d e t e c t i n g c h a n g e s i n t h e w a v e l e n g t h a t w h i c h t h e e m i s s i o n m a x i m u m o c c u r s ( F i g u r e 2 8 ) . T h e d o w n w a r d t r e n d i n i n t e n s i t y a n d t h e t r e n d t o w a r d l o n g e r w a v e l e n g t h e m i s s i o n a r e t o b e e x p e c t e d a s t h e g e l s o l i n u n f o l d s a n d r e l e a s e s MANS i n t o t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t . -75-460 100 410 20 10 20 30 40 50 60 T ( °C ) F i g u r e 28. T h e r m a l D e n a t u r a t i o n o f M A N S : G e l s o l i n . T h e t h e r m a l u n f o l d i n g o f g e l s o l i n (1.0 a n d MANS (2 |1M) i n 20 mM MOPS - 150 mM KC1 - 1 mM E G T A (pH 7.5) w a s f o l l o w e d b y t h e w a v e l e n g t h o f m a x i m u m e m i s s i o n ( o p e n c i r c l e s ) a n d f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ( c l o s e d c i r c l e s ) a t 420 n m . E x c i t a t i o n w a s a t 340 n m . a . u . = a r b i t r a r y u n i t s . T h e f l u o r e s c e n c e p r o p e r t i e s o f M A N S - g e l s o l i n d o n o t r e f l e c t t h e c o o p e r a t i v i t y o f t h e u n f o l d i n g a s w e l l a s d o e s t h e e l l i p t i c i t y a t 210 nm ( F i g u r e 16, p a g e 49) o r t h e t r y p t o p h a n f l u o r e s c e n c e ( F i g u r e 15, p a g e 47) . T h e p l o t s i n d i c a t e t h a t t h e r m a l l y a c t i v a t e d p r o c e s s e s t a k e p l a c e p r i o r t o s t r u c t u r a l c h a n g e s . T h i s m a y r e f l e c t h o w t e m p e r a t u r e c a n a f f e c t n o t o n l y t h e u n f o l d i n g o f g e l s o l i n , b u t a l s o d i r e c t l y a l t e r t h e b i n d i n g c o n s t a n t t h a t g o v e r n s t h e i n t e r a c t i o n o f g e l s o l i n w i t h M A N S . -7 6-E . C o r r e l a t i o n T i m e o f M A N S - g e l s o l i n . T h e t i g h t b i n d i n g o f MANS t o g e l s o l i n i s d e m o n s t r a t e d b y t h e s i g n i f i c a n t l y l a r g e v a l u e o f f l u o r e s c e n c e p o l a r i z a t i o n o f M A N S - g e l s o l i n s a m p l e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , p = 0 .3 (MANS i n b u f f e r E h a s p = 0.02) . I n a n a t t e m p t t o d e t e r m i n e t h e c o r r e l a t i o n t i m e o f M A N S - g e l s o l i n w i t h a P e r r i n p l o t ( F i g u r e 2 9 ) , t h e p o l a r i z a t i o n v a l u e s w e r e d e t e r m i n e d f o r s u c h s a m p l e s i n t h e t e m p e r a t u r e r a n g e b e t w e e n 1 0 a n d 4 0 ° C . E v i d e n c e f r o m c i r c u l a r d i c h r o i s m m e a s u r e m e n t s o v e r t h e s a m e t e m p e r a t u r e r a n g e s u g g e s t s t h a t t h e u n f o l d i n g o f g e l s o l i n d o e s n o t o c c u r t o a s i g n i f i c a n t e x t e n t . I t i s a l s o e x p e c t e d t h a t t h e b i n d i n g a f f i n i t y b e t w e e n g e l s o l i n a n d MANS s h o u l d n o t v a r y d r a m a t i c a l l y . P e r r i n 2 6 r e l a t e d t h e f l u o r e s c e n c e p o l a r i z a t i o n , P , t o t h e t e m p e r a t u r e , T , v i s c o s i t y , T|, f l u o r e s c e n c e l i f e t i m e , T, a n d r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e , <|>, i n t h e f o l o w i n g m a n n e r : 1/P - 1/3 = ( l / P o - 1 / 3 ) (1+ kTT/TTV) = ( l / P 0 - l / 3 ) (1+ T/<{» - 7 7 -2.3 i 1 . 1 . 1 1 « 1 • 0 1 2 3 4 5 T/Tt Jt 10* ( K - p o i s e " 1 ) F i g u r e 2 9 . P e r r i n P l o t f o r M A N S : G e l s o l i n . P l o t c o n s t r u c t e d w i t h t h e p o l a r i z a t i o n m e a s u r e d i n a s o l u t i o n o f MANS (2 |1M) a n d g e l s o l i n (1 JIM) i n b u f f e r E w h i l e t h e t e m p e r a t u r e w a s v a r i e d . T h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h w a s 3 4 0 n m a n d t h e e m i s s i o n 4 2 0 nm t o a v o i d i n t e r f e r e n c e f r o m t h e f r e e d y e . T h e v i s c o s i t y w a s e s t i m a t e d f r o m t h e v a l u e s g i v e n f o r w a t e r i n t h e H a n d b o o k o f C h e m i s t r y a n d P h y s i c s . T/TJ = K e l v i n / p o i s e . T h e i n t e r c e p t o f t h e l i n e a r p l o t o f l / P - 1 / 3 v e r s u s T j / T , ( l / P n - 1 / 3 ) , c a n b e u s e t o e s t i m a t e t h e l i m i t i n g p o l a r i z a t i o n . T h e l i m i t i n g p o l a r i z a t i o n v a l u e o b t a i n e d i n t h i s m a n n e r i s Po = 0 . 3 6 . A l i m i t e d d e g r e e o f r o t a t i o n a l m o b i l i t y o f MANS b o u n d t o g e l s o l i n i s i n d i c a t e d b y t h i s v a l u e w h i c h i s s o m e w h a t l o w e r t h a n t h e p o l a r i z a t i o n v a l u e a c h i e v a b l e w i t h MANS i n g l y c e r o l : P = 0 . 4 4 . T h e r a t i o o f s l o p e t o i n t e r c e p t i n a P e r r i n p l o t c a n b e u s e d t o c a l c u l a t e t h e r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e (j) a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g r e l a t i o n , i f t h e l i f e t i m e i s k n o w n : T/<|) = ( s l o p e / i n t e r c e p t ) T/TJ E v e n t h o u g h t h e l i f e t i m e f o r MANS i n b u f f e r i s s m a l l e r t h a n t h e l a m p p u l s e w i d t h a v a i l a b l e i n t h e p r e s e n t w o r k (< 2 n s ) , w h e n t h e m o l e c u l e i n t e r a c t s w i t h g e l s o l i n , a l o n g e r d e c a y i s o b s e r v e d . T h e f l u o r e s c e n c e o f M A N S b o u n d t o g e l s o l i n h a s b e e n f o u n d t o c o n t a i n t w o d e c a y c o m p o n e n t s w i t h l i f e t i m e s o f 4 . 8 n s a n d 2 0 . 9 n s . A r e p r e s e n t a t i v e l i f e t i m e o f 1 1 . 1 n s c a n b e a s s u m e d f r o m t h e w e i g h t e d a v e r a g e o f t h e t w o l i f e t i m e c o m p o n e n t s . A r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e o f 4 8 n s f o r g e l s o l i n c a n b e c a l c u l a t e d . C a l c u l a t i o n s o f a c o r r e l a t i o n t i m e f o r a s p h e r i c a l l y s h a p e d g e l s o l i n w i t h p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e , V = 0 . 7 2 7 c m 3 / g , d e g r e e o f h y d r a t i o n , 8 = ( 0 . 3 9 3 g w a t e r ) / ( g p r o t e i n ) , a n d , m o l e c u l a r m a s s o f 8 0 9 0 0 D a , g i v e s <j> = 3 7 n s . T h e c o r r e l a t i o n t i m e d e t e r m i n e d f o r g e l s o l i n i s « 1 . 3 t i m e s t h e v a l u e c a l c u l a t e d f o r a s p h e r i c a l s h a p e . T h e s i m i l a r i t y o f t h e e x p e r i m e n t a l a n d c a l c u l a t e d c o r r e l a t i o n t i m e s f o r g e l s o l i n f u r t h e r c o n f i r m s t h e g l o b u l a r s h a p e o f g e l s o l i n . T h e s e v a l u e s a r e n o t i d e n t i c a l b e c a u s e p r o t e i n m o l e c u l e s a r e n o t p e r f e c t l y s p h e r i c a l . A l s o , e r r o r s a s s o c i a t e d w i t h t h e c a l c u l a t i o n o f t h e d e g r e e o f h y d r a t i o n o f t h e p r o t e i n m a y b e s i g n i f i c a n t . B y c o m p a r i s o n , c o r r e l a t i o n t i m e s 3 - t o 4 - f o l d g r e a t e r t h a n t h a t o f a r i g i d s p h e r e o f e q u a l v o l u m e a r e c a l c u l a t e d f o r o b l a t e o r p r o l a t e h y d r a t e d e l l i p s o i d s w i t h f r i c t i o n a l r a t i o s 1 . 3 5 - 1 . 4 0 . T h e s e v a l u e s c o r r e s p o n d - 7 9 -t o a x i a l r a t i o s b e t w e e n 4 a n d 7 f o r t h e o b l a t e a n d p r o l a t e p a r t i c l e s . T h e p o s s i b i l i t y o f h a v i n g h y d r o p h o b i c p a t c h e s o n g e l s o l i n w h i c h m a y b e c o m p l e m e n t a r y t o t h e h y d r o p h o b i c p a t c h e s i n a c t i n i s p r o p o s e d . D u e t o t h e f a c t t h a t a c t i n a l s o b i n d s t o M A N S , i t w a s n o t u s e f u l t o s t u d y b o t h p r o t e i n s i n t h e p r e s e n c e o f M A N S . -80-P A R T V : C o v a l e n t L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h t h e F l u o r e s c e n c e P r o b e N - ( 1 - P y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e , ( P I A ) . T h e u s e o f p y r e n e a n d i t s d e r i v a t i v e s a s e x t r i n s i c f l u o r e s c e n t p r o b e s t o s t u d y m a c r o m o l e c u l a r s y s t e m s i s e x t e n s i v e . T h i s i n c l u d e s t h e s t u d y o f m i c e l l e s , 1 0 1 - 1 1 4 p o l y m e r i c s y s t e m s , 2 8 - 3 4 ' 1 1 5 " 1 2 1 c y c l o d e x t r i n s , 1 2 2 a n d s o l i d s u r f a c e s . 1 2 3 ' 1 2 4 T h e i r w i d e u s e a r i s e s p a r t l y f r o m t h e s e n s i t i v i t y o f t h e i r v i b r a t i o n a l s t r u c t u r e t o t h e p o l a r i t y o f t h e e n v i r o n m e n t . 1 2 5 I n t h i s r e s p e c t , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t t h e e m i s s i o n s p e c t r u m o f p y r e n e p r e s e n t s f i v e v i b r a t i o n a l b a n d s t h a t h a v e b e e n n u m b e r e d I-V i n g o i n g f r o m h i g h e r t o l o w e r w a v e l e n g t h s . 1 0 9 T h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s o f t h e b a n d s I I I ( 3 8 3 nm) t o I ( 3 7 2 nm) s h o w s a d i a g n o s t i c c o r r e l a t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e p o l a r i t y o f t h e s o l v e n t . T h i s p r o p e r t y h a s p e r m i t t e d i n v e s t i g a t i o n o f t h e f o r m a t i o n o f m i c e l l e s a n d t h e l o c a l p o l a r i t y o f t h e s e s y s t e m s a n d o t h e r m i c r o h e t e r o g e n e o u s s y s t e m s . A d d i t i o n a l a d v a n t a g e s a r i s e f r o m i t s r e l a t i v e l y l o n g l i f e t i m e a n d h i g h q u a n t u m y i e l d w h i c h p e r m i t s t u d i e s w h e r e s e v e r a l d y n a m i c e v e n t s c a n b e f o l l o w e d w i t h g r e a t s e n s i t i v i t y . A n o t h e r i m p o r t a n t p h o t o p h y s i c a l p r o p e r t y o f p y r e n e t h a t c a n b e u s e d t o s t u d y c e r t a i n d y n a m i c a n d s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s o f t h e s y s t e m u n d e r s t u d y c o m e s f r o m i t s a b i l i t y t o f o r m e x c i m e r s . E x c i m e r s a r e t r a n s i e n t c o m p l e x e s ( M M ) * t h a t f o r m b e t w e e n a n e x c i t e d (M* ) a n d a g r o u n d s t a t e (M) a r o m a t i c m o l e c u l e ( S c h e m e V I ) . E x c i m e r s a r e t h o u g h t t o o c c u r w h e n a - 8 1 -s a n d w i c h e d a r r a n g e m e n t i s p o s s i b l e b e t w e e n t h e t w o p a r t i c i p a t i n g m o l e c u l e s . 1 2 6 S c h e m e V I : k 3 M* + M „ * (MM) * M M + h V M + M M + M + hV monomer emiss ion exc imer emiss ion T h e p o t e n t i a l e n e r g y d i a g r a m f o r t h i s r e a c t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 3 0 . B e c a u s e o f t h e e x c i m e r s t a b i l i z a t i o n e n e r g y , ( A H ) , a n d g r o u n d s t a t e r e p u l s i o n , ( E R ) , t h e e x c i m e r f l u o r e s c e n c e o c c u r s a t l o n g e r w a v e l e n g t h s t h a n t h a t o f t h e m o n o m e r . I n s o l u t i o n , 2 8 p y r e n e f o r m s e x c i m e r a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n I O - 4 M w h e r e e n o u g h e x c i t e d m o l e c u l e s c a n d i f f u s e d u r i n g t h e i r l i f e t i m e t o e n c o u n t e r a g r o u n d s t a t e m o l e c u l e . I n t h e s e c a s e s t h e f o r w a r d r a t e c o n s t a n t , K3 ( S c h e m e V I ) i s d i f f u s i o n c o n t r o l l e d a n d d e p e n d s o n t h e v i s c o s i t y o f t h e s o l v e n t . I n a t i m e r e s o l v e d e x p e r i m e n t , a f t e r a d e l t a - p u l s e e x c i t a t i o n , t h e m o n o m e r i n t e n s i t y m a y g e n e r a l l y d e c a y a s a s u m o f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s . T h e e x c i m e r i n t e n s i t y i n i t i a l l y i n c r e a s e s a n d t h e n d e c r e a s e s a s a d i f f e r e n c e o f t w o e x p o n e n t i a l t e r m s . T h e r i s e t i m e o f t h e -82-e x c i m e r i s d i a g n o s t i c o f e x c i t e d s t a t e r e a c t i o n s . T h e s e p r o c e s s e s a r e o f t e n r e f e r r e d t o a s B i r k s ' k i n e t i c s . ro r -F i g u r e 3 0 . P o t e n t i a l E n e r g y P r o f i l e s f o r t h e G r o u n d a n d E x c i t e d S t a t e s o f m o l e c u l e s M a n d Q . I n t h e c a s e o f e x c i m e r f o r m a t i o n Q = M . T h e f i g u r e s h o w s t h e e n e r g y (E ) a s a f u n c t i o n o f t h e i n t e r m o l e c u l a r s e p a r a t i o n ( r ) . A H i s t h e s t a b i l i z a t i o n e n e r g y o f t h e e x c i m e r a n d E R i s t h e r e p u l s i o n e n e r g y o f t h e m o l e c u l e s i n t h e g r o u n d s t a t e . T h e m o n o m e r a n d e x c i m e r f l u o r e s c e n c e a r e m a r k e d a s h v m a n d h v e / r e s p e c t i v e l y . 1 2 7 W h e n t h e e x c i m e r f o r m i n g m o l e c u l e s a r e l i n k e d b y a p o l y m e r i c c h a i n , 1 2 8 t h e l o c a l c o n c e n t r a t i o n c a n b e g r e a t l y e n h a n c e d p e r m i t t i n g t h e o b s e r v a t i o n o f e x c i m e r a t m u c h l o w e r c o n c e n t r a t i o n s . E x c i m e r f o r m a t i o n i n p o l y m e r i c s y s t e m s l a b e l l e d w i t h p y r e n e m a y o c c u r i n t e r m o l e c u l a r l y w h e r e p y r e n e m o l e c u l e s a t t a c h e d t o d i f f e r e n t c h a i n s i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r , o r i n t r a m o l e c u l a r l y w h e n t h e i n t e r a c t i n g p y r e n e s a r e i n t h e s a m e c h a i n . T h e i n t e r m o l e c u l a r f o r m a t i o n o f e x c i m e r d e p e n d s g r e a t l y o n t h e m e d i u m a n d i s o f t e n d i f f u s i o n c o n t r o l l e d , w h i l e t h e - 8 3 -i n t r a m o l e c u l a r f o r m a t i o n o f e x c i m e r s d e p e n d s o n b o t h t h e m i c r o v i s c o s i t y o f t h e m e d i u m a n d t h e c o n f o r m a t i o n a l s t r u c t u r e o f t h e c h a i n p r e c e d i n g t h e s t r u c t u r e r e q u i r e d f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e e x c i m e r . T h e s t u d y o f p y r e n e a n d s o m e o f i t s d e r i v a t i v e s i n t h e p r e s e n c e o f s u r f a c t a n t s b e l o w t h e i r c r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n , i n p o l y m e r i c l a b e l l e d s y s t e m s , 2 9 - 3 3 i n s o m e p r o t e i n s 3 4 ' 3 5 a n d i n a q u e o u s s o l v e n t s , l e d t o s o m e u n u s u a l o b s e r v a t i o n s o n t h e i r s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s . F o r e x a m p l e , d i f f e r e n t e x c i t a t i o n s p e c t r a o f t h e m o n o m e r a n d t h e e x c i m e r w e r e o b s e r v e d . P r e v i o u s s t u d i e s i n o r g a n i c s o l v e n t s h a d p r o v i d e d t h e s a m e e x c i t a t i o n s p e c t r u m f o r m o n o m e r a n d e x c i m e r s i n c e b o t h s p e c i e s a r i s e f r o m t h e s a m e g r o u n d s t a t e s p e c i e s . T h e d i f f e r e n t e x c i t a t i o n s p e c t r a w e r e a t t r i b u t e d t o i s o l a t e d a n d i n t e r a c t i n g g r o u n d s t a t e p y r e n e m o l e c u l e s . G r o u n d s t a t e i n t e r a c t i o n s a r e t h o u g h t t o p r e c e d e t h e e x c i t e d s t a t e i n t e r a c t i o n s a n d t h e i r s u b s e q u e n t " e x c i m e r " f l u o r e s c e n c e . A g r o u n d s t a t e c o m p l e x t h a t p r e c e d e s e x c i m e r e m i s s i o n h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n t h e c a s e o f s o m e p a r a c y c l o p h a n e s 3 9 w h e r e c o v a l e n t b o n d s f o r c e t h e t w o c h r o m o p h o r e s t o g e t h e r b o t h i n g r o u n d a n d e x c i t e d s t a t e s . T h i s a l s o o c c u r s i n f r o z e n s o l u t i o n s 1 2 9 a n d w i t h p y r e n e a d s o r b e d t o s u r f a c e s , 3 5 - 3 7 w h e r e b i m o l e c u l a r r e p u l s i v e f o r c e s c a n b e c o u n t e r a c t e d b y t h e r i g i d i t y o f t h e e n v i r o n m e n t . Two h y p o t h e t i c a l p o t e n t i a l e n e r g y c u r v e s h a v e b e e n s u g g e s t e d i n t h e c a s e o f p y r e n e a d s o r b e d t o s i l i c a 3 7 i n -84-o r d e r t o a c c o u n t f o r t h e d i f f e r e n c e s i n e x c i t a t i o n s p e c t r a o f t h e m o n o m e r a n d e x c i m e r ( F i g u r e 3 1 ) . T h e s e d i f f e r e n c e s s u g g e s t t h e p r e s e n c e o f t w o d i f f e r e n t s p e c i e s g i v i n g r i s e t o t h e m o n o m e r a n d e x c i m e r i n t e n s i t i e s r e s p e c t i v e l y . T h e s m a l l m i n i m u m i n t h e p o t e n t i a l e n e r g y o f t h e g r o u n d s t a t e r e p r e s e n t s t h e s t a b i l i z a t i o n o f t h e c o m p l e x u p o n i n t e r a c t i o n w i t h t h e s u r f a c e . T h i s i n t e r a c t i o n m a y c h a n g e t h e e l e c t r o n i c p o l a r i z a t i o n o f t h e p y r e n e m o l e c u l e s a n d c o u n t e r - b a l a n c e t h e r e p u l s i o n i n t h e i r g r o u n d s t a t e . F i g u r e 3 1 . H y p o t h e t i c a l P o t e n t i a l C u r v e s o f A d s o r b e d P y r e n e . R - ( P - P ) i s t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e m o l e c u l e s f o r m i n g t h e g r o u n d s t a t e c o m p l e x . M a , D a a n d E a r e p r e s e n t t h e m o n o m e r , g r o u n d s t a t e c o m p l e x a n d e x c i m e r r e s p e c t i v e l y . ( a ) e x c i t e d s t a t e o f t h e c o m p l e x i s r a t h e r u n s t a b l e a n d r a d i a t i o n l e s s t r a n s i t i o n s t o t h e e x c i m e r m a y t a k e p l a c e , (b ) e x c i t a t i o n t o t h e e x c i m e r o c c u r s d i r e c t l y f r o m t h e g r o u n d s t a t e . 3 7 - 8 5 -S i m i l a r a r g u m e n t s m a y h o l d i n t h e c a s e o f l a b e l l e d p o l y m e r s i n a q u e o u s s o l u t i o n s w h e r e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s a r e t h e m a j o r d r i v i n g f o r c e r e s p o n s i b l e f o r t h e m i n i m a i n t h e p o t e n t i a l e n e r g y d i a g r a m . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t h i s i n t e r a c t i o n o c c u r s o n l y u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , i m p l i e s t h a t t h e m e d i u m i s i m p o r t a n t t o o . B y d e f i n i t i o n , e x c i t e d c o m p l e x e s f o r m e d t h r o u g h g r o u n d s t a t e i n t e r a c t i n g m o l e c u l e s a r e n o t e x c i m e r s . S t e v e n s 2 7 i n t r o d u c e d t h e t e r m e x c i m e r t o d i s t i n g u i s h t h e e x c i t e d d i m e r w h i c h i s d i s s o c i a t e d i n t h e g r o u n d s t a t e f r o m a n e x c i t e d d i m e r t h a t a l s o e x i s t s i n t h e g r o u n d s t a t e . D i s t i n c t i o n s i n n o m e n c l a t u r e , h o w e v e r , a r e n o t a l w a y s m a d e i n t h e l i t e r a t u r e . T h i s s e e m s j u s t i f i e d b y t h e f a c t t h a t i t i s t h o u g h t t h a t t h e g r o u n d s t a t e g e o m e t r y o f t h e c o m p l e x m a y n o t b e i n t h e p r o p e r c o n f i g u r a t i o n f o r e x c i m e r f o r m a t i o n . B i r k s k i n e t i c s d o n o t a p p l y i n t h e s e c a s e s . N - ( 1 - P y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e ( P I A ) i s a p y r e n e d e r i v a t i v e t h a t r e a c t s s p e c i f i c a l l y w i t h t h e t h i o l g r o u p s o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s i n p r o t e i n s . T h e l a b e l l i n g o f p r o t e i n s w i t h p y r e n e d e r i v a t i v e s m a y r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f e x c i m e r , p r o v i d i n g i n f o r m a t i o n o n c y s t e i n e e n v i r o n m e n t s a n d c o n f o r m a t i o n a l d y n a m i c s . B y u s i n g c i r c u l a r d i c h r o i s m m e a s u r e m e n t s a n d a s s a y i n g s o m e a c t i v i t y o f t h e p r o t e i n i n a b i o c h e m i c a l i n v i t r o e v e n t , i t i s p o s s i b l e t o e s t a b l i s h t h e i n t e g r i t y o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n . -86-I n t h i s s t u d y t h e p r o p e r t i e s o f g e l s o l i n l a b e l l e d w i t h P I A w e r e i n v e s t i g a t e d i n a n a t t e m p t t o u n c o v e r f u r t h e r s t r u c t u r a l a n d d y n a m i c p r o p e r t i e s . A . L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h P I A . G e l s o l i n w a s l a b e l l e d w i t h P I A b y f i r s t d i a l y s i n g t h e p r o t e i n f o r 2 4 h a g a i n s t : 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - 1 . 0 mM E D T A - p H 7 . 8 ( b u f f e r D) , i n t h e p r e s e n c e o f 1 mM d i t h i o t h r e i t o l (DTT ) t o r e d u c e t h e t h i o l g r o u p s o f t h e p r o t e i n . T h e p r o t e i n w a s t h e n d i a l y s e d f o r 4 h v e r s u s b u f f e r D w i t h o u t D T T , w h i c h c o m p e t e s w i t h * t h e p r o t e i n f o r t h e f r e e d y e . T h e r e d u c e d g e l s o l i n a t 2 m g / m l , t y p i c a l l y 4 -8 m l , w a s m i x e d w i t h a 2 0 f o l d m o l a r e x c e s s o f N - ( l -p y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e d i s s o l v e d i n a m i n i m a l a m o u n t o f N - N -d i m e t h y l f o r m a m i d e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e o n a m e c h a n i c a l r o c k e r . T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 1 5 0 0 0 x g i n a b e n c h t o p c e n t r i f u g e . T h e f r e e a n d n o n - s p e c i f i c a l l y b o u n d d y e w e r e r e m o v e d b y d i a l y s i s a g a i n s t b u f f e r D c o n t a i n i n g 1 mM D T T a n d b y g e l f i l t r a t i o n i n a B i o R a d P 2 c o l u m n e q u i l i b r a t e d v e r s u s t h e s a m e b u f f e r . P r i o r t o a n y e x p e r i m e n t , t h e l a b e l l e d p r o t e i n w a s c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 0 0 0 x g f o r h a l f a n h o u r . - 8 7 -B . D e g r e e o f L a b e l l i n g o f P I A - g e l s o l i n . T h e d e g r e e o f l a b e l l i n g , d e f i n e d a s ( m o l d y e ) / ( m o l p r o t e i n ) , w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e d y e b y s i m p l e a p p l i c a t i o n o f t h e B e e r - L a m b e r t l a w a t 3 4 4 n m . T h e p r o t e i n d o e s n o t a b s o r b a t t h i s w a v e l e n g t h a n d t h e a b s o r p t i v i t y c o e f f i c i e n t o f t h e d y e h a s b e e n d e t e r m i n e d . 1 3 0 T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n c a n n o t b e d e t e r m i n e d i n t h e s a m e m a n n e r s i n c e t h e d y e h a s a b s o r p t i o n b a n d s a t t h e w a v e l e n g t h s o f t h e p r o t e i n a b s o r p t i o n . T h e c o n c e n t r a t i o n o f g e l s o l i n w a s d e t e r m i n e d i n s t e a d u s i n g t h e B r a d f o r d 1 3 1 p r o t e i n a s s a y ( B I O RAD ) w i t h a c a l i b r a t i o n c u r v e p r e p a r e d b y u s i n g u n l a b e l l e d g e l s o l i n . T h i s a s s a y i s b a s e d i n t h e s h i f t i n t h e a b s o r p t i o n m a x i m u m o f a n a c i d i c s o l u t i o n o f t h e d y e C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e G - 2 5 0 . A s h i f t f r o m 4 65 t o 5 9 5 nm o c c u r s w h e n t h e d y e b i n d s t o t h e p r o t e i n . A s t a n d a r d c u r v e i s p r e p a r e d w i t h u n l a b e l l e d p r o t e i n b y p l o t t i n g t h e a b s o r b a n c e o f t h e s o l u t i o n a t 5 95 nm a g a i n s t t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n i s f o u n d b y e x t r a p o l a t i o n . T h e d e g r e e o f l a b e l l i n g d e t e r m i n e d i n t h i s m a n n e r w a s f o u n d t o b e 1 . 6 ± 0 . 3 ( m o l P I A ) / ( m o l g e l s o l i n ) i n t h e a b s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n s . T h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n i s n o t k n o w n b u t i t h a s b e e n s h o w n t o b e v e r y s i m i l a r i n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f g e l s o l i n s f r o m o t h e r s o u r c e s w h o s e a m i n o a c i d s e q u e n c e h a s b e e n i n v e s t i g a t e d ( R E S U L T S AND -88-D I S C U S S I O N p a g e 3 4 ) . T h e r e p o r t e d a m i n o a c i d s e q u e n c e s s u g g e s t t h a t g e l s o l i n i s a h i g h l y c o n s e r v e d p r o t e i n . 6 1 ' 6 4 B y a n a l o g y w i t h t h e o t h e r g e l s o l i n s , i t i s a s s u m e d t h a t h o r s e p l a s m a g e l s o l i n h a s 5 c y s t e i n e s . T h e a c c e s s i b i l i t y o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s i n g e l s o l i n i n c r e a s e s w i t h t h e a m o u n t o f c a l c i u m p r e s e n t . 7 9 T h e l a b e l l i n g o f g e l s o l i n i n t h i s s t u d y w a s p e r f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m i o n s t o o b t a i n a h i g h e r s e l e c t i v i t y . T h e d e g r e e o f l a b e l l i n g o f 1 . 6 ± 0 . 3 i m p l i e s t h a t t h e d e s i r e d s e l e c t i v i t y w a s o b t a i n e d a n d t h a t t h e r e a r e s i n g l e a n d d o u b l e l a b e l l e d m o l e c u l e s . C . E m i s s i o n C h a r a c t e r i s t i c s . T h e l a b e l l e d g e l s o l i n c o m p l e x ( P I A - g e l s o l i n ) d i s p l a y s e x c i m e r e m i s s i o n . F i g u r e 3 2 s h o w s t h a t t h e e m i s s i o n s p e c t r u m o f P I A - g e l s o l i n c o n s i s t s o f t h r e e m a x i m a . T h e p e a k s a t 3 8 5 nm a n d 4 0 7 nm c o r r e s p o n d t o t h e m o n o m e r e m i s s i o n a n d a b r o a d b a n d c e n t e r e d a t 4 8 3 nm c o r r e s p o n d s t o t h e e m i s s i o n o f t h e e x c i m e r . T h e f i n e s t r u c t u r e i n t h e e m i s s i o n o f t h e p y r e n e m o n o m e r i s n o t o b s e r v e d i n t h i s d e r i v a t i v e . T h i s p r e c l u d e s d e t e r m i n a t i o n o f t h e p o l a r i t y t h r o u g h a n a l y s i s o f t h e i n t e n s i t y r a t i o o f t h e v i b r a t i o n a l b a n d s I I I a n d I . O t h e r s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e v i b r i o n i c s t r u c t u r e a n d f i n e s t r u c t u r e i s l o s t w i t h t h e a s y m m e t r i c s u b s t i t u t i o n o f t h e p y r e n e r i n g . - 8 9 -o II 300 350 400 450 500 W a v e l e n g t h (nm) F i g u r e 3 2 . E x c i t a t i o n a n d E m i s s i o n S p e c t r a o f P I A - g e l s o l i n . ( 1 ) F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n o f P I A - g e l s o l i n a t a c o n c e n t r a t i o n 1 . 0 x 1 0 - 6 M i n 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - 1 . 0 mM E G T A (pH 7 . 2 ) . Xex = 3 4 4 n m . (2 ) E x c i t a t i o n m o n i t o r e d a t 3 9 6 nm f o r t h e m o n o m e r a n d (3 ) e x c i t a t i o n m o n i t o r e d a t 4 8 3 nm f o r t h e e x c i m e r . a . u . • a r b i t r a r y u n i t s . F o u r d i f f e r e n t l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s y i e l d e d t h e s a m e s p e c t r u m w i t h e x c i m e r / m o n o m e r i n t e n s i t y r a t i o a l w a y s c l o s e t o f o u r , s u g g e s t i n g t h a t t h e s a m e s i t e s w e r e l a b e l l e d e a c h t i m e . I t w a s f o u n d t h a t t h e e x c i m e r / m o n o m e r i n t e n s i t y r a t i o d o e s n o t d e p e n d o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f P I A - g e l s o l i n i n t h e -90-r a n g e 4 . 0 x 1 0 " 5 - 1 . 0 x 1 0 " 7 M . T h i s c o n c e n t r a t i o n r a n g e i s w e l l b e l o w t h e c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h p y r e n e f o r m s e x c i m e r s i n s o l u t i o n (> 1 0 " 4 ) . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h e i n t r a m o l e c u l a r c h a r a c t e r o f t h e e x c i m e r s i n c e g e l s o l i n d o e s n o t f o r m d i m e r s o r h i g h e r a g g r e g a t e s u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ( s e e R E S U L T S AND D I S C U S S I O N , p a g e 3 3 ) . D . G r o u n d S t a t e I n t e r a c t i o n s . T h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f t h e e x c i m e r i n P I A - g e l s o l i n p r e s e n t s a m a x i m u m a t 3 4 6 nm a n d a s h o u l d e r a t 3 3 4 nm w h e n t h e e m i s s i o n i s o b s e r v e d a t 4 8 3 n m . T h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f t h e m o n o m e r e m i s s i o n , o b s e r v e d a t 3 8 5 o r 4 0 7 , r e v e a l s v a l u e s w i t h a m a x i m u m a t 3 4 4 nm a n d a n d a s h o u l d e r a t 3 3 2 nm ( F i g u r e 3 2 ) . T h e b a n d s i n t h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f t h e e x c i m e r a r e a l s o b r o a d e r t h a n t h o s e i n t h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f t h e m o n o m e r . T h e s e d i f f e r e n c e s o n t h e e x c i t a t i o n s p e c t r a o f t h e f l u o r o p h o r e c a n a r i s e , w h e n b o u n d t o a p r o t e i n , a s a r e s u l t o f a p o p u l a t i o n o f p y r e n e m o l e c u l e s r e s p o n s i b l e f o r e x c i m e r e m i s s i o n e x p e r i e n c i n g a d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t t h a n t h e m o l e c u l e s r e s p o n s i b l e f o r m o n o m e r e m i s s i o n . T h e b r o a d e n i n g a n d r e d s h i f t a l s o s u g g e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t w o p y r e n e m o l e c u l e s m a y b e i n t e r a c t i n g i n t h e g r o u n d s t a t e d u e t o a n e n f o r c e d p r o x i m i t y . T h i s w o u l d r e s u l t f r o m t h e i r s t r u c t u r a l d i s p o s i t i o n i n t h e p r o t e i n a n d t h e a q u e o u s m e d i u m . T o s t u d y t h i s p o s s i b i l i t y , t h e e m i s s i o n p r o p e r t i e s o f P I A - g e l s o l i n w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o f t w o m o d e l c o m p o u n d s p o s s e s s i n g p r o x i m a t e t h i o l f u n c t i o n a l i t i e s . M e r c a p t o e t h a n o l , ME ( S H -C H 2 - C H 2 - O H ) a n d d i t h i o t h r e i t r o l , DTT ( S H - C H 2 - C H ( O H ) - C H ( O H ) -C H 2 - S H ) w e r e l a b e l l e d w i t h P I A f o r t h e s e p u r p o s e s ( P I A - M E a n d P I A - D T T , r e s p e c t i v e l y , F i g u r e 3 3 ) . L e r h e r a n d I s h i i 3 4 s t u d i e d t h e a d d u c t s o f t h e s e t h i o l c o m p o u n d s w i t h N - ( - l -p y r e n e m a l e i m i d e ) , ( P M - D T T a n d PM-ME ) t o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b i l i t y o f h a v i n g p y r e n e m o l e c u l e s i n t e r a c t i n g i n t h e g r o u n d s t a t e p r i o r t o e x c i m e r e m i s s i o n . T h e s e a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t a s a m o d e l s t u d y i n c o n n e c t i o n i n t h e i r w o r k w i t h p y r e n e - l a b e l l e d t r o p o m y o s i n ( P M - t r o p o m y o s i n ) . I n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o f L e h r e r a n d I s h i i , i t w a s o b s e r v e d t h a t a t l o w c o n c e n t r a t i o n s P I A - M E p r e s e n t s m o n o m e r e m i s s i o n w h i l e P I A - D T T p r e s e n t s e x c i m e r e m i s s i o n t h a t a r i s e s f r o m i n t e r a c t i o n s t h a t c a n b e t r a c e d t o t h e g r o u n d s t a t e . OH OH P I A - M E P I A - D T T F i g u r e 3 3 . M o d e l C o m p o u n d s P I A - D T T a n d P I A - M E . -92-T h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f P I A - g e l s o l i n i s c o m p a r a b l e t o t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f P I A - D T T i n t h e r e g i o n 310 t o 380 n m . B o t h a r e b r o a d e r t h a n t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e P I A - M E a d d u c t s u g g e s t i n g t h e g r o u n d s t a t e i n t e r a c t i o n o f t h e p y r e n e s i n P I A - g e l s o l i n i n a s i m i l a r m a n n e r a s t h e m o d e l c o m p o u n d P I A - D T T ( T a b l e V I ) . T h e p a r a m e t e r p , s u g g e s t e d b y H e r k s t r o e t e r e t a l . , 3 0 i s a q u a l i t a t i v e m e a s u r e o f t h e b r o a d e n i n g a n d i s g i v e n f o r t h e s y s t e m s s t u d i e d i n T a b l e V I . T h e d e f i n i t i o n o f p i s g i v e n b y t h e p e a k t o v a l l e y i n t e n s i t y r a t i o f o r t h e 0-0 t r a n s i t i o n b a n d . I n s t u d i e s o f p r o t e i n s i t i s s o m e t i m e s f o u n d t h a t t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e d y e i s a l t e r e d u p o n b i n d i n g d u e t o p e r t u r b a t i o n s b y t h e e n v i r o n m e n t o f f e r e d t o t h e d y e b y t h e p r o t e i n . T h e f a c t t h a t t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f P I A -g e l s o l i n i s s i m i l a r t o t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f t h e m o d e l c o m p o u n d P I A - D T T i n w a t e r s u g g e s t s t h a t a g r e a t p a r t o f t h e b r o a d e n i n g i s d u e t o i n t e r a c t i o n o f t h e p y r e n e s i n t h e g r o u n d s t a t e . B y c o m p a r i s o n , t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f P I A u p o n b i n d i n g t o a c t i n r e s e m b l e s m o r e t h e s p e c t r u m o f P I A - M E ( T a b l e V I ) . I n t h e r e g i o n b e t w e e n 300-380 n m , t h e e x c i t a t i o n s p e c t r a o f P I A - D T T i s i d e n t i c a l t o t h e e x c i t a t i o n s p e c t r a o f P I A - g e l s o l i n p r e s e n t e d i n F i g u r e 32. I n b o t h c a s e s , t h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f t h e e x c i m e r i s b r o a d e r a n d r e d s h i f t e d c o m p a r e d t o t h e s p e c t r u m o f t h e m o n o m e r . B e l o w 300 nm ( d a t a n o t s h o w n ) , t h e e x c i t a t i o n s p e c t r u m o f P I A - g e l s o l i n p r e s e n t s a p e a k a r o u n d 285 nm w h i c h i s a b s e n t i n P I A - D T T a n d P I A - M E . T h i s r e f l e c t s e n e r g y -93-t r a n s f e r f r o m t h e t r y p t o p h a n s o f t h e p r o t e i n t o t h e p y r e n e m o i e t i e s . s a m p l e p ( a b s o r p t i o n ) p ( e x c i t a t i o n ) y\.em — 3 8 5 nm Xem = 4 8 3 nm P I A - D T T 1 . 1 7 1 . 5 0 1 . 1 2 P I A - g e l s o l i n 1 . 1 6 1.5.5 1 . 1 1 P I A - M E 1 . 4 5 P I A - a c t i n 1 . 4 4 T A B L E V I . p V a l u e s f o r t h e E x c i t a t i o n a n d A b s o r p t i o n S p e c t r a o f P I A - D T T , P I A - M E , P I A - g e l s o l i n . p i s m e a s u r e d a s t h e r a t i o o f t h e f i r s t a b s o r p t i o n m a x i m u m t o t h e n e x t m i n i m u m a t l o w e r w a v e l e n g t h s . T h e d i f f e r e n c e i n t h e p v a l u e s o f t h e a b s o r p t i o n a n d e x c i t a t i o n s p e c t r a o f P I A - g e l s o l i n a n d P I A - D T T , i s d u e t o t h e f a c t t h a t t h e a b s o r p t i o n r e f l e c t s b o t h i n t e r a c t i n g a n d n o n - i n t e r a c t i n g p y r e n e s . I n t h e e x c i t a t i o n s p e c t r a , t h e s e t w o s p e c i e s a r e r e s o l v e d b y s e l e c t i n g t h e e m i s s i o n w a v e l e n g t h . - 9 4 -D. L i f e t i m e M e a s u r e m e n t s . T h e t i m e d e p e n d e n t r e s p o n s e f u n c t i o n s w e r e m e a s u r e d o b s e r v i n g t h e e m i s s i o n a t 3 8 5 o r 4 0 7 n m , f o r t h e m o n o m e r a n d a t 4 8 5 nm f o r t h e e x c i m e r ( F i g u r e 3 4 ) . E x c i t a t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 3 4 0 n m . S e v e r a l s i g n i f i c a n t o b s e r v a t i o n s c a n b e m a d e . N o t a b l y , t h e e x c i m e r r i s e t i m e i s s h o r t e r t h a n t h e r e s o l u t i o n o f t h e m e a s u r e m e n t ( « 2 n s ) a n d b o t h t h e m o n o m e r a n d e x c i m e r e x h i b i t c o m p l e x d e c a y s . T h e m o n o m e r s h o w s a n i n i t i a l d e c a y f a s t e r t h a n t h a t o f t h e e x c i m e r w i t h a v e r y s m a l l c o n t r i b u t i o n o f a l o n g l i v e d c o m p o n e n t v i s i b l e a t l o n g e r t i m e s . T h e m o n o m e r d e c a y c o u l d n o t b e f i t a d e q u a t e l y w i t h e i t h e r o n e o r t w o e x p o n e n t i a l s . M o s t o f t h e m o n o m e r i n t e n s i t y i s l o s t v e r y r a p i d l y . T h e d e c a y a t l o n g t i m e s , a l t h o u g h a m i n o r c o n t r i b u t i o n t o t o t a l m o n o m e r e m i s s i o n c o u l d b e f i t w i t h a l i f e t i m e o f 7 0 n s . T h e e x c i m e r c o u l d b e f i t w i t h a s h o r t ( 1 9 . 8 n s , 52 % o f t h e t o t a l i n t e n s i t y ) a n d a l o n g c o m p o n e n t ( 5 4 . 3 n s , 4 8 % o f t h e i n t e n s i t y ) , X 2 = 1 . 1 2 . -95-10«7 *? 10 3 oo c c S102 10 e o z 10* •»—r 10° fc> ** t I*. l \ ! v II * • • 11 100 200 300 T i m e ( n s e c ) F i g u r e 3 4 . - P I A - g e l s o l i n E x c i m e r a n d M o n o m e r D e c a y C u r v e s T o g e t h e r w i t h E x c i t a t i o n P u l s e . B u f f e r u s e d : 2 0 mM MOPS -1 5 0 mM K C 1 -1 mM E G T A - (pH 7 . 2 ) . (1 ) D e c a y o f m o n o m e r Xem = 3 9 0 n m , ( 2 ) D e c a y o f e x c i m e r Xem = 4 8 5 n m , (3 ) lamp p r o f i l e . Xex = 3 4 0 n m . I n a g r e e m e n t w i t h t h e d e g r e e o f l a b e l l i n g o f 1 . 6 ± 0 . 3 M / M , t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f P I A - g e l s o l i n c a n b e e x p l a i n e d i n t e r m s o f t w o d i f f e r e n t l y l a b e l l e d s p e c i e s ( F i g u r e 3 5 ) . S i n g l e l a b e l l e d p r o t e i n s m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e m o n o m e r e m i s s i o n , w h i l e d o u b l e l a b e l l e d p r o t e i n s w i t h t i g h t l y h e l d p y r e n e m o l e c u l e s i n t e r a c t i n g i n t h e g r o u n d s t a t e a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e m i s s i o n o f t h e e x c i m e r . -96-(a ) h v M M + hv. M (b ) F i g u r e 35. M o d e l P r o p o s e d t o E x p l a i n t h e S p e c t r o s c o p i c P r o p e r t i e s o f P I A - g e l s o l i n . ( a ) S i n g l e l a b e l l e d m o l e c u l e s a r e r e s p o n s i b l e f o r m o n o m e r e m i s s i o n , h V M . (b ) D o u b l e l a b e l l e d m o l e c u l e s w i t h p y r e n e s i n t e r a c t i n g i n t h e g r o u n d s t a t e a r e r e s p o n s i b l e f o r e x c i m e r e m i s s i o n , hV£ . W i t h t h i s e x p l a n a t i o n i n m i n d , t h e r e s p o n s e f u n c t i o n o f t h e m o n o m e r s h o u l d c o r r e s p o n d t o t h e d e c a y o f P I A i n s i n g l e l a b e l l e d p r o t e i n s w i t h t h e a b s e n c e o f a n y q u e n c h i n g d u e t o e x c i m e r f o r m a t i o n . T h e d e c a y o f t h e l o n g w a v e l e n g t h b a n d s h o u l d r e f l e c t t h e l i f e t i m e o f t h e e x c i t e d d i m e r . U n d e r t h e c o n d i t i o n s p r e s e n t e d f o r t h e l a b e l l i n g o f g e l s o l i n , e x c i m e r e m i s s i o n w a s a l w a y s p r e s e n t a n d t h e l i f e t i m e o f m o n o m e r i n t h e a b s e n c e o f e x c i m e r c o u l d n o t b e - 9 7 -m e a s u r e d . T h e l i f e t i m e o f t h e s m a l l m o d e l a d d u c t s h a s b e e n s h o w n t o v a r y d r a m a t i c a l l y i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f t h e p r o t e i n i n a q u e o u s s o l u t i o n . 1 3 2 T h i s v a r i a b i l i t y m a k e s t h e m u n s u i t a b l e c a n d i d a t e s f o r c o m p a r i s o n o f t h e m a g n i t u d e o f t h e d e c a y c o n s t a n t o f t h e m o n o m e r i n p r o t e i n s . O t h e r s t u d i e s o f s i n g l y l a b e l l e d p r o t e i n s w i t h P I A o r P M s h o w e d t h a t t h e d e c a y o f t h e s e p y r e n e d e r i v a t i v e s i s c o m p l e x . T h e d e c a y b e h a v i o u r , h o w e v e r , i s s i m i l a r i n m a g n i t u d e i n t h e d i f f e r e n t p r o t e i n s s t u d i e d . T h e d e c a y o f t h e m o n o m e r h a s b e e n r e p o r t e d a s a s u m o f t h r e e e x p o n e n t i a l s c o r r e s p o n d i n g t o l i f e t i m e s o f 2.92, 13.5 a n d 59.8 n s f o r P I A b o u n d t o a c t i n 1 3 2 a n d 4.2-5.7, 18.8-27.8, a n d 53.8-81.5 n s f o r P I A l a b e l l e d c r y s t a l l i n s i n t h e a b s e n c e o f e x c i m e r e m i s s i o n . 1 3 3 I n t h e l a t t e r c a s e , t h e p r o t e i n s w e r e n o t s i n g l e l a b e l l e d , b u t t h e l i f e t i m e s m e a s u r e d p r o v i d e a c o m p a r i s o n f o r t h e m a g n i t u d e o f t h e m o n o m e r d e c a y . T h e d e c a y o f P I A - g e l s o l i n m e a s u r e d a t l o n g t i m e s (70 n s ) f a l l s i n t h e r a n g e o f t h e v a l u e s r e p o r t e d . A l s o , t h e f a c t t h a t t h e d e c a y o f t h e m o n o m e r o c c u r s o v e r a l o n g e r t i m e b a s e t h a n t h a t o f t h e e x c i m e r , i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r o p o s e d m o d e l . T h e c o m p l e x d e c a y o b s e r v e d f o r a s i n g l e f l u o r o p h o r e w h e n b o u n d t o p r o t e i n s i s a c o m m o n p h e n o m e n o n a s m i c r o h e t e r o g e n e o u s e n v i r o n m e n t s o f f e r e d t o t h e f l u o r o p h o r e b y t h e p r o t e i n a r e e x p e c t e d . T h e p y r e n e d e r i v a t i v e s , P I A a n d P M , h a v e b e e n s h o w n t o h a v e c o n s i s t e n t l y m u l t i e x p o n e n t i a l d e c a y w h e n b o u n d t o a c t i n 1 3 0 ' 1 3 2 ' 1 3 4 a n d t o b o v i n e s e r u m a l b u m i n . 1 3 5 I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t -98-t h i s b e h a v i o u r i s o b s e r v e d i n s p i t e o f t h e f a c t t h a t b o t h t h e s e p r o t e i n s c o n t a i n o n l y o n e h i g h l y r e a c t i v e c y s t e i n e r e s i d u e . H o w e v e r , L i n 1 3 2 r e p o r t e d t h a t e v e n t h e s m a l l a d d u c t s P I A - M E a n d PM-ME e x h i b i t c o m p l e x d e c a y i n a q u e o u s s o l v e n t s . A l s o , S c o u t e n a n d c o - w o r k e r s 1 3 5 i n v e s t i g a t e d t h e m u l t i p l e l i f e t i m e o f s e v e r a l N - s u b s t i t u t e d p o l y a r o m a t i c r i n g c o m p o u n d s i n c l u d i n g , P M . T h e i r r e s u l t s s u g g e s t t h a t m u l t i p l e e x p o n e n t i a l d e c a y o f t h e s e p r o b e s i s a n i n t r i n s i c p r o p e r t y o f t h e s e p y r e n e d e r i v a t i v e s . S t r u c t u r a l h e t e r o g e n e i t y d u e t o d i f f e r e n t m o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n s o r c o n f i g u r a t i o n s m a y e x p l a i n t h e b e h a v i o u r o f t h o s e p r o b e s i n s o l u t i o n . P r o t o n NMR s p e c t r a o f P I A w e r e m e a s u r e d i n DMF a n d i n D M F / b u f f e r ( T a b l e V I I ) . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n DMF o n l y o n e c o n f o r m a t i o n o f t h e p r o b e i s d e t e c t e d . I n b u f f e r , i n c o n t r a s t , t w o s p e c i e s a r e r e a d i l y d e t e c t e d . T h e c o m p o n e n t s o f t h e b u f f e r m a y h a v e a s p e c i f i c i n t e r a c t i o n w i t h t h e a m i d e b o n d g i v i n g r i s e t o t h e s y n a n d a n t i c o n f o r m a t i o n s o f t h e m o l e c u l e . T h e s e s p e c i e s c o u l d h a v e d i f f e r e n t l i f e t i m e s a n d c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e c o m p l e x d e c a y o b s e r v e d i n s p i t e o f t h e i r r e l a t i v e l y s m a l l s i z e s . -99-s o l v e n t p p m m u l t i p l i c i t y DMF D M F / B u f f e r 4 . 1 s i n g l e t 8 . 2 m u l t i p l e t 1 0 . 4 5 s i n g l e t 4 . 1 a n d 4 . 4 5 s i n g l e t s 8 . 2 m u l t i p l e t 1 0 . 4 a n d 1 0 . 5 s i n g l e t s T A B L E V I I . - NMR S p e c t r a l D a t a o f P I A i n DMF a n d D M F / B u f f e r E . T h e p r o f i l e o f t h e d e c a y a t 4 8 3 nm a n d t h e p o s i t i v e p r e - e x p o n e n t i a l t e r m s f i t t o t h e l i f e t i m e m e a s u r e m e n t i n d i c a t e t h e a b s e n c e o f a r i s i n g c o m p o n e n t i n t h e e x c i m e r e m i s s i o n . T h i s r e s u l t i m p l i e s t h a t t h e e x c i m e r a r i s e s f r o m t w o p y r e n e m o l e c u l e s t h a t a r e i n c l o s e p r o x i m i t y . I t i s p r e s u m e d t h a t t h e e x c i m e r f o r m s v e r y f a s t w i t h r e s p e c t t o t h e t i m e r e s o l u t i o n o f t h e m e a s u r e m e n t (< 2 n s e c ) . T h i s e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e s u p p o r t s t h e m o d e l d e s c r i b e d a b o v e w h i c h w a s b a s e d m a i n l y o n s t e a d y s t a t e o b s e r v a t i o n s s u c h a s t h e b r o a d e n i n g o f t h e e x c i t a t i o n s p e c t r a . T h e d e c a y o b s e r v e d a t 4 8 5 nm r e f l e c t s t h e l i f e t i m e o f t h e e x c i t e d c o m p l e x . T h e e x c i m e r s h o w s t w o l i f e t i m e s . T h e d e c a y a n d m a g n i t u d e o f e a c h c o m p o n e n t i s c o n s t a n t w h e n m e a s u r e d i n t h e r e g i o n 4 7 0 - 4 9 0 n m . T h e r m a l s t u d i e s i n t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 1 5 - 3 5 ° C , w h e r e CD h a s s h o w n t h a t t h e p r o t e i n d o e s n o t s u f f e r m a j o r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , s h o w t h a t b o t h - 1 0 0 -c o m p o n e n t s u n d e r g o a s i m i l a r a n d s m a l l d e c r e a s e u p o n i n c r e a s i n g t h e t e m p e r a t u r e . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t t h a t t h e r a d i a t i v e r a t e c o n s t a n t o f e x c i m e r s d o e s n o t d e p e n d o n t e m p e r a t u r e ( T a b l e V I I I ) . T e m p e r a t u r e ( ° C ) T l ( n s ) T 2 ( n s ) B i B 2 15 5 5 . 2 8 1 9 . 9 6 0 . 4 8 3 0 . 5 1 7 2 0 5 4 . 3 1 1 9 . 7 6 0 . 4 8 1 0 . 5 1 9 2 5 5 2 . 9 8 1 9 . 0 2 0 . 4 8 0 0 . 5 2 0 3 0 5 1 . 0 2 1 7 . 8 6 0 . 4 7 9 0 . 5 2 1 3 5 5 0 . 3 2 1 7 . 3 7 0 . 4 8 3 0 . 5 1 7 T a b l e V I I I . T h e r m a l l y I n d u c e d C h a n g e s o n t h e t h e D e c a y P a r a m e t e r s o f P I A - G e l s o l i n a t L o n g W a v e l e n g t h s . B i a n d B 2 a r e t h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n s o f t h e m e a s u r e d l i f e t i m e s T i a n d T 2 , r e s p e c t i v e l y , t o t h e t i m e d e p e n d e n t d e c a y . Xex = 3 4 0 nm a n d X-em = 4 8 5 n m . T h e r e i s n o t a s i m p l e e x p l a n a t i o n f o r t h e t w o c o m p o n e n t s o f t h e d e c a y . I t may b e s u g g e s t e d , h o w e v e r , t h a t t w o d i f f e r e n t s p e c i e s w i t h s i m i l a r e m i s s i o n s p e c t r a b u t w i t h d i f f e r e n t l i f e t i m e s m a y e x i s t . S t u d i e s w i t h b i c h r o m o p h o r i c c o m p o u n d s l i n k e d b y a l k y l c h a i n s 1 1 5 h a v e s u g g e s t e d t h a t m u l t i e x p o n e n t i a l d e c a y o f t h e e x c i m e r may be o b s e r v e d e v e n f o r a s i n g l e c h a i n c o n f o r m a t i o n i f t h e e x c i m e r s m a y b e f o r m e d w i t h d i f f e r e n t g e o m e t r i e s . S u c h a s i t u a t i o n m a y o p e r a t e i n t h e c a s e o f P I A - g e l s o l i n i f d i f f e r e n t g e o m e t r i e s a r e a l l o w e d f o r t h e s a m e g l o b a l - 1 0 1 -p r o t e i n - d y e c o n f i g u r a t i o n . I f b o u n d p y r e n e a c e t a m i d e b e h a v e s i n a s i m i l a r m a n n e r a s t h e f r e e m o l e c u l e b e h a v e s i n s o l u t i o n , a t l e a s t t w o c o n f o r m a t i o n s , s y n a n d a n t i , m a y b e p r e s e n t . T h i s b r i n g s a b o u t t h e p o s s i b i l i t y o f h a v i n g d i f f e r e n t e x c i m e r c o n f i g u r a t i o n s s u c h a s t h e s y n - s y n o r s y n - a n t i , e t c . w h i c h m a y r e s u l t f r o m a n e q u i l i b r i u m p r o b a b l y p r e s e n t i n P I A . T h e s y n - a n d a n t i - a l t e r n a t i v e s c o u l d g i v e r i s e t o u p t o f o u r p o s s i b l e d i f f e r e n t e x c i m e r s : s y n - s y n , a n t i - s y n , s y n - a n t i a n d a n t i - a n t i . T h e g o o d f i t o f t h e d e c a y t o a d o u b l e e x p o n e n t i a l s u g g e s t s t h a t l e s s t h a n t h e f o u r p o s s i b l e a l t e r n a t i v e s a c t u a l l y o c c u r , o r t h a t some o f t h e m m a y b e i n d i s t i n g u i s h a b l e . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h i s e x p l a n a t i o n i s h i g h l y s p e c u l a t i v e . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e l o c a l c o n f i g u r a t i o n s o f t h e s i d e c h a i n s o f t h e a m i n o a c i d s a r o u n d t h e p r o b e , o r o t h e r s o u r c e s o f h e t e r o g e n e i t y , may g i v e r i s e t o v a r i o u s d e c a y c o m p o n e n t s . Q u e n c h i n g s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d w i t h p o t a s s i u m i o d i d e i n o r d e r t o g e t m o r e i n s i g h t i n t o t h e p r o p e r t i e s o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n . I t w a s o b s e r v e d t h a t K I d e c r e a s e s t h e l i f e t i m e o f b o t h c o m p o n e n t s . S t e r n - V o l m e r p l o t s s h o w n i n F i g u r e 3 5 p r o v i d e d q u e n c h i n g c o n s t a n t s o f 4 . 0 5 x 1 0 7 M - 1 s _ 1 f o r t h e s h o r t c o m p o n e n t a n d o f 1 . 3 1 x 1 0 7 M _ 1 s - 1 f o r t h e l o n g c o m p o n e n t . A c c o r d i n g t o t h e s e r e s u l t s , t h e s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r t h e s h o r t c o m p o n e n t o f t h e d e c a y i s s l i g h t l y m o r e a c c e s s i b l e t o t h e q u e n c h e r a s c o m p a r e d t o t h e s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r t h e l o n g c o m p o n e n t . T h i s d i f f e r e n c e s u g g e s t s t h a t t h e s h o r t e r l i v e d s p e c i e s m a y h a v e a l o c a l - 1 0 2 -s t r u c t u r e i n t h e p r o t e i n t h a t m a k e s i t m o r e a c c e s s i b l e t o t h e q u e n c h e r . [ I ] M F i g u r e 3 6 . - Q u e n c h i n g S t u d i e s o f t h e Two C o m p o n e n t s o f t h e E x c i m e r D e c a y o f P I A - G e l s o l i n . T h e d e c a y a t 4 8 5 nm w a s m e a s u r e d u p o n e x c i t a t i o n a t 3 4 0 nm w i t h i n c r e a s i n g K I c o n c e n t r a t i o n . T h e p l o t i s c o n s t r u c t e d w i t h t h e r a t i o o f t h e l i f e t i m e T o i n t h e a b s e n c e o f K I t o t h e l i f e t i m e T m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e q u e n c h e r , v e r s u s t h e q u e n c h e r c o n c e n t r a t i o n . S h o r t c o m p o n e n t : c l o s e d c i r c l e s . L o n g c o m p o n e n t : o p e n c i r c l e s . F . A c t i v i t y a n d S t r u c t u r e o f P I A - G e l s o l i n . T o i n v e s t i g a t e c h a n g e s i n t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n c a u s e d b y t h e a t t a c h e d l a b e l o r t h e l a b e l l i n g p r o c e d u r e , t h e t h e r m a l u n f o l d i n g o f t h e l a b e l l e d g e l s o l i n w a s s t u d i e d . A s s h o w n i n F i g u r e 3 7 , c h a n g e s i n t h e e l l i p t i c i t y a t 2 1 5 nm w e r e m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f - 1 0 3 -i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e . T h e m e l t i n g t e m p e r a t u r e o f P I A -g e l s o l i n w a s f o u n d t o o c c u r a t 4 3 °C w h i c h c o m p a r e s q u i t e f a v o u r a b l y w i t h t h e m e l t i n g t e m p e r a t u r e o f 4 6 ° C d e t e r m i n e d f o r u n l a b e l e d g e l s o l i n u n d e r t h e s a m e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . 1.00-20 30 4 0 50 60 T ( c e n t i g r a d e s ) F i g u r e 3 7 . T h e r m a l S t a b i l i t y o f P I A - G e l s o l i n . T h e t h e r m a l u n f o l d i n g o f P I A - g e l s o l i n ( o p e n c i r c l e s ) a n d g e l s o l i n ( c l o s e d c i r c l e s ) i n b u f f e r E w a s f o l l o w e d b y t h e d e c r e a s e i n e l l i p t i c i t y a t 2 1 5 nm u p o n i n c r e a s i n g t h e t e m p e r a t u r e . C e l l s i z e w a s 0 . 1 mm. P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n = 1 . 7 m g / m l . P r e c i p i t a t i o n b e c o m e s v i s i b l e a t t e m p e r a t u r e s a b o v e 5 0 ° C . T h e a c t i v i t y o f t h e c o v a l e n t l y l a b e l l e d g e l s o l i n ( P I A -g e l s o l i n ) w a s s t u d i e d b y c a p i l l a r y v i s c o s i m e t r y . T a b l e V I I I s h o w s t h a t t h e l a b e l l e d a n d u n l a b e l l e d p r o t e i n s h a v e i d e n t i c a l e f f e c t s o n t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n . - 1 0 4 -T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e l a b e l a f f e c t s t h e s t r u c t u r e o f g e l s o l i n o n l y t o a m i n o r e x t e n t w i t h o u t a m a j o r e f f e c t o n i t s a c t i v i t y o n a c t i n p o l y m e r i z a t i o n . s a m p l e r e l v i s c o s i t y F - a c t i n 1 . 5 3 G - a c t i n 1 . 0 0 A c t i n g e l s o l i n 1 0 0 : 1 1 . 2 2 A c t i n : g e l s o l i n 5 : 1 1 . 0 0 A c t i n : P I A G 1 0 0 : 1 1 . 2 3 A c t i n : P I A G 5 : 1 1 . 0 0 T a b l e I X . A c t i v i t y o f P I A G o n A c t i n P o l y m e r i z a t i o n . A c t i n ( 1 . 1 8 x 1 0 - 5 M) i n b u f f e r A (2 mM t r i s - H C l - 1 mM DTT - 0 . 2 mM C a C 1 2 0 . 2 mM A T P p H 7 . 6 ) w a s m i x e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e a m o u n t o f g e l s o l i n o r P I A G a t t h e i n d i c a t e d m o l a r r a t i o s . I t w a s i n d u c e d t o p o l y m e r i z e b y t h e a d d i t i o n o f 2 mM M g C 1 2 a n d 1 5 0 mM K C 1 . R e l a t i v e v i s c o s i t y i s e x p r e s s e d a s t h e r a t i o o f t h e f l o w t i m e o f t h e s a m p l e d i v i d e d b y t h e f l o w t i m e o f b u f f e r a l o n e . T h e e m i s s i o n p r o p e r t i e s o f t h e l a b e l w e r e a l s o u s e d t o f o l l o w t h e t h e r m a l u n f o l d i n g o f P I A - g e l s o l i n . F i g u r e 3 8 p r e s e n t s c h a n g e s i n t h e i n t e n s i t y o f t h e f l u o r e s c e n c e o f P I A - g e l s o l i n r e l a t i v e t o t h e i n t e n s i t y o f t h e m o d e l c o m p o u n d P I A - D T T a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e . T h e m e l t i n g r a n g e o b s e r v e d i n t h i s s t u d y i s b r o a d e r t h a n t h e m e l t i n g r a n g e d e t e r m i n e d b y CD m e a s u r e m e n t s . I t h a d b e e n s h o w n -105-b e f o r e t h a t g e l s o l i n p r e c i p i t a t e s w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e a t a p p r o x i m a t e l y 50 °C ( R E S U L T S AND D I S C U S S I O N , p a g e 4 7 ) . T h e a g g r e g a t i o n o f p r o t e i n m o l e c u l e s c a u s i n g t h e i r p r e c i p i t a t i o n m a y a l l o w f o r i n t e r m o l e c u l a r e x c i m e r f o r m a t i o n i n t h e u n f o l d e d p r o t e i n , a s s u g g e s t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e r e i s s o m e r e s i d u a l e x c i m e r f l u o r e s c e n c e e v e n a t 60 ° C . T h e b r o a d e n i n g o f t h e m e l t i n g c u r v e m a y b e a t t r i b u t e d t o c o n t r i b u t i o n s f r o m a d e c r e a s e i n e x c i m e r i n t e n s i t y d u e t o u n f o l d i n g o f t h e p r o t e i n a n d t o i n t e r m o l e c u l a r e x c i m e r f o r m a t i o n a s t h e p r o t e i n a g g r e g a t e s . « 8 •H ._ a * c 1* •p « rH W 1.1 1.0 0.9-0.8-0.7-0.6 • • • -> r T ' 1 10 20 30 40 T (centigrades) 50 60 F i g u r e 3 8 . - T e m p e r a t u r e E f f e c t o n t h e F l u o r e s c e n c e o f P I A -G e l s o l i n . T h e f l u o r e s c e n c e o f P I A - g e l s o l i n a t 1.0 x 10-6 M i n b u f f e r E a n d P I A - D T T i n t h e s a m e b u f f e r w e r e f o l l o w e d u p o n i n c r e a s i n g t h e t e m p e r a t u r e . T h e p l o t i s c o n s t r u c t e d w i t h t h e r e l a t i v e f l u o r e s c e n c e o f t h e t w o c o m p o u n d s a t e a c h d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e . P r o t e i n p r e c i p i t a t i o n o c c u r s a t t e m p e r a t u r e s a b o v e 50 ° C . -106-T h e i n a b i l i t y o f t e m p e r a t u r e t o e l i m i n a t e a l l e x c i m e r f l u o r e s c e n c e i n p r o t e i n s l a b e l l e d w i t h t h e s e d e r i v a t i v e h a s b e e n f o u n d i n t h e c a s e o f t h e c r y s t a l l i n s . 1 3 3 A d d i t i o n a l s t u d i e s i n t h e c a s e s o f t r o p o m y o s i n a n d a c t i n 1 3 2 h a v e s h o w n t h a t t e m p e r a t u r e a n d c h e m i c a l d e n a t u r a n t s s u c h a s g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e o r u r e a d e c r e a s e b u t d o n o t c o m p l e t e l y e l i m i n a t e t h e e x c i m e r e m i s s i o n . T h e t o t a l d i s a p p e a r a n c e o f t h e e x c i m e r f l u o r e s c e n c e w a s o b t a i n e d b y d i g e s t i n g P I A -g e l s o l i n w i t h a - c h y m o t r y p s i n a c c o r d i n g t o K w i a t k o w s k i e t a l . " I n s p i t e o f t h e c o m p l e x i t y o f t h e o r i g i n o f t h e o b s e r v e d s p e c t r o s c o p i c c h a r a c t e r i s t i c s o f P I A - g e l s o l i n , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t u p t o 2 c y s t e i n e s c a n b e l a b e l l e d i n g e l s o l i n i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m i o n s a n d t h a t t h o s e t w o c y s t e i n e s a r e i n c l o s e p r o x i m i t y i n t h e f o l d e d p r o t e i n . T h e m e t h o d o f l a b e l l i n g a n d t h e p r o b e u s e d d o n o t p r o d u c e a d r a s t i c c h a n g e i n t h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f g e l s o l i n . H y d r o p h o b i c a n d s t r u c t u r a l i n t e r a c t i o n s s h o u l d b e t a k e n i n t o a c c o u n t w h e n i n t e r p r e t i n g t h e s p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e s o f p y r e n e d e r i v a t i v e s a t t a c h e d t o p r o t e i n s . O t h e r s t u d i e s o f c o v a l e n t l y l a b e l l e d g e l s o l i n i n c l u d e t h o s e o f J a n m e y e t a l . 1 3 7 u s i n g a p y r e n e m a l e i m i d e a d d u c t t o d e t e c t t h e b i n d i n g o f p h o s p h o i n o s i t i d e s t o g e l s o l i n . D o i a n d F r i e d e n 1 3 8 s t u d i e d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a c t i n a n d g e l s o l i n b y u s i n g g e l s o l i n l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e i n . C o o p e r a n d h i s g r o u p 1 3 9 s t u d i e d g e l s o l i n l a b e l l e d w i t h - 1 0 7 -l i s s a m i n e - r o d a m i n e B s u l p h o n y l c h l o r i d e i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e l o c a t i o n o f g e l s o l i n i n c e l l s . O f t h e s e s t u d i e s , t h o s e o f J a n m e y e t a l . c o n t r a s t w i t h t h o s e r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s . T h e f o r m a t i o n o f p y r e n e e x c i m e r s w a s n o t r e p o r t e d i n t h e c a s e o f g e l s o l i n l a b e l l e d w i t h p y r e n e m a l e i m i d e . I n t h e c o u r s e o f t h e s t u d i e s p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s , g e l s o l i n w a s a l s o l a b e l l e d w i t h p y r e n e m a l e i m i d e a n d t h e b r o a d b a n d e m i s s i o n c o r r e s p o n d i n g t o e x c i m e r a t 4 8 5 nm w a s o b s e r v e d . H o w e v e r , t h e u s e o f p y r e n e i o d o a c e t a m i d e i n s t e a d o f p y r e n e m a l e i m i d e w a s d e c i d e d d u e t o t h e t i m e - d e p e n d e n t s p e c t r a l c h a n g e s o b s e r v e d w i t h t h e m a l e i m i d e d e r i v a t i v e . T h i s a d d i t i o n a l v a r i a b l e h a s b e e n o b s e r v e d a l s o f o r o t h e r s y s t e m s . 1 4 0 ' 1 4 1 T h e l a c k o f e x c i m e r e m i s s i o n i n t h e l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s o f J a n m e y , may b e d u e t o t h e f a c t t h a t t h e d e g r e e o f l a b e l l i n g t h a t t h e a u t h o r s a c h i e v e d w a s 0 . 2 - 0 . 4 , c o m p a r e d w i t h 1 . 3 - 1 . 9 o b t a i n e d i n t h i s w o r k . - 1 0 8 -C O N C L U S I O N S G e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a w a s i s o l a t e d a n d p u r i f i e d f o r t h e f i r s t t i m e i n r e l a t i v e l y h i g h y i e l d s . T h e m e t h o d u s e d i n t h i s w o r k i s a n i m p r o v e d m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d d e v e l o p e d b y B r y a n a n d t a k e s a d v a n t a g e o f t h e c h a n g e i n t h e s u r f a c e c h a r g e o f t h e p r o t e i n u p o n b i n d i n g t o c a l c i u m i o n s . T r e a t m e n t o f t h e p l a s m a w i t h a n i o n e x c h a n g e r i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s a n d s u b s e q u e n t l y i n t h e a b s e n c e o f t h e d i v a l e n t c a t i o n p r o d u c e s 3 0 - 4 0 mg o f g e l s o l i n p e r l i t e r o f p l a s m a . T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p u r i f i e d p r o t e i n o b t a i n e d f r o m h o r s e p l a s m a a r e s i m i l a r t o t h o s e o f o t h e r g e l s o l i n s i s o l a t e d f r o m o t h e r p l a s m a a n d c y t o p l a s m i c s o u r c e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t g e l s o l i n i s a h i g h l y c o n s e r v e d p r o t e i n a n d e s t a b l i s h e s i t s i d e n t i t y . G e l s o l i n f r o m h o r s e p l a s m a h a s a n a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 . 4 m l / ( m g - c m ) a t 2 8 0 nm a n d a n a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 0 0 0 0 o n p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f g e l s o l i n w a s d e t e r m i n e d h e r e b y d i f f e r e n t i a l r e f r a c t o m e t r y f o r t h e f i r s t t i m e a n d w a s f o u n d t o c o m p a r e w e l l w i t h t h o s e o b t a i n e d b y o t h e r m e t h o d s . T h e i n t r i n s i c s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f g e l s o l i n w a s d e t e r m i n e d t o b e 4 . 8 S . I t s S t o k e s 1 r a d i u s w a s c a l c u l a t e d t o b e 3 . 8 n m . C o m b i n a t i o n o f t h e s e v a l u e s w i t h h y d r a t i o n a n d p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e v a l u e s s u g g e s t s h o r s e p l a s m a g e l s o l i n t o h a v e M r = 7 5 0 0 0 . C o m p a r i s o n o f t h i s v a l u e w i t h t h e v a l u e o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n d a t a ( a l s o 7 5 0 0 0 ) a n d c a l c u l a t i o n o f i t s f r i c t i o n a l r a t i o o f 1 . 2 - 1 . 3 i n d i c a t e t h a t g e l s o l i n i s a g l o b u l a r p r o t e i n . T h e t e m p e r a t u r e a n d c h e m i c a l l y i n d u c e d u n f o l d i n g p r o f i l e s o f g e l s o l i n , d e t e r m i n e d b y i n t r i n s i c f l u o r e s c e n c e , c o m p a r e w e l l w i t h t h o s e r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e s e m e a s u r e m e n t s w e r e t h e n f u r t h e r c o n f i r m e d b y c i r c u l a r d i c h r o i s m s t u d i e s . T h e u n f o l d i n g c u r v e s i n d i c a t e t h a t g e l s o l i n u n f o l d s i n a t w o s t a t e p r o c e s s . T h e m e l t i n g t e m p e r a t u r e s o b t a i n e d w e r e 4 6 °C i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m a n d 54 °C i n t h e p r e s e n c e o f t h e d i v a l e n t c a t i o n . I t w a s o b s e r v e d t h a t g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e h a l f u n f o l d s g e l s o l i n a t a c o n c e n t r a t i o n o f c a . 1 . 5 M . T h e n u c l e a t i n g a c t i v i t y o f h o r s e p l a s m a g e l s o l i n o n t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n , d e t e c t e d b y f o l l o w i n g a n i n c r e a s e i n t h e a b s o r b a n c e a t 2 3 2 nm o f s o l u t i o n s c o n t a i n i n g t h e t w o p r o t e i n s , w a s d e m o n s t r a t e d . T h e s e v e r i n g a n d c a p p i n g a c t i v i t y o f g e l s o l i n w e r e m a n i f e s t e d i n t h e d e c r e a s e i n t h e s t e a d y s t a t e v i s c o s i t y o f s o l u t i o n s o f a c t i n p o l y m e r i z e d i n t h e p r e s e n c e o f g e l s o l i n . T h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a n d p o l a r i z a t i o n v a l u e s o f a c t i n l a b e l l e d w i t h 6 - a c r y l o y l - 2 - d i m e t h y l a m i n o n a p h t h a l e n e w e r e u s e d h e r e t o s t u d y t h e i n t e r a c t i o n o f g e l s o l i n a n d a c t i n w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a c t i n i s l i m i t i n g . I t w a s f o u n d t h a t g e l s o l i n i n t e r a c t s w i t h l a b e l l e d a c t i n o n l y i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s t o p r o d u c e a 2 : 1 a c t i n : g e l s o l i n c o m p l e x . O n e o f t h e a c t i n m o l e c u l e s i s - 1 1 0 -r e l e a s e d t o p r o d u c e a 1 : 1 c o m p l e x u p o n c h e l a t i o n o f t h e d i v a l e n t c a t i o n . T h e p r e s e n c e o f h y d r o p h o b i c p a t c h e s o n g e l s o l i n w e r e i n v e s t i g a t e d f o r t h e f i r s t t i m e b y u s i n g t h e f l u o r e s c e n t p r o b e 2 - N - ( m e t h y l a n i l i n o ) n a p h t h a l e n e s u l f o n a t e , M A N S . C h a n g e s i n t h e f l o r e s c e n c e i n t e n s i t y a n d e m i s s i o n m a x i m a o f t h e p r o b e a c c o r d i n g t o e x p e c t e d e n v i r o n m e n t - i n d u c e d p e r t u r b a t i o n s s u g g e s t e d a n o n - c o v a l e n t i n t e r a c t i o n w i t h t h e p r o t e i n . I t w a s f o u n d t h a t 2 . 5 ± 0 . 9 m o l e c u l e s o f MANS b i n d i n a n o n - c o v a l e n t m a n n e r t o g e l s o l i n w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f 0 . 2 4 ± 0 . 1 3 |XM. I t i s i n t e r e s t i n g t o s p e c u l a t e o n w h e t h e r t h e s e p a t c h e s t a k e p a r t i n t h e i n t e r a c t i o n o f g e l s o l i n w i t h a c t i n . F l u o r e s c e n c e s t u d i e s w i t h t h e c o v a l e n t p r o b e N - ( l -p y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e i n d i c a t e d t h a t u p t o t w o c y s t e i n e r e s i d u e s o f g e l s o l i n c a n b e l a b e l l e d . T h a t t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s l a b e l l e d a r e i n c l o s e p r o x i m i t y i n t h e t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n i s s u g g e s t e d b y t h e e x c i m e r - l i k e e m i s s i o n o f t h e p y r e n e l a b e l l e d p r o t e i n . T h e f l u o r e s c e n c e e x c i t a t i o n s p e c t r a a n d l i f e t i m e o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n e m i s s i o n i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e a t l e a s t t w o d i f f e r e n t l y l a b e l l e d s p e c i e s . S i n g l y l a b e l l e d m o l e c u l e s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e m i s s i o n o f t h e m o n o m e r , w h i l e d o u b l y l a b e l l e d m o l e c u l e s w i t h p y r e n e p a i r s i n t e r a c t i n g i n t h e g r o u n d s t a t e a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e e m i s s i o n o f t h e e x c i m e r . T h e g r o u n d s t a t e i n t e r a c t i o n o f t h e p y r e n e m o l e c u l e s i s t h e r e s u l t o f t h e f o r c e d s t r u c t u r a l p r o x i m i t y - 1 1 1 -i n t h e p r o t e i n a n d r e f l e c t s a t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e t h a t i n v o l v e s c l o s e p r o x i m i t y o f t h e c y s t e i n e r e s i d u e s . T h e c o v a l e n t i n c o r p o r a t i o n o f t h e l a b e l d o e s n o t a l t e r i n a s i g n i f i c a n t m a n n e r t h e s t r u c t u r e a n d a c t i v i t y o f t h e n a t i v e p r o t e i n . -112-E X P E R I M E N T A L A . P r e p a r a t i o n o f P r o t e i n s . A . l . I s o l a t i o n o f G e l s o l i n . A . l . a . P r e p a r a t i o n o f p l a s m a . F r e s h b l o o d w a s c o l l e c t e d d i r e c t l y i n t o a c i t r a t e b u f f e r - d e x t r o s e a n t i c o a g u l a n t s y s t e m 1 4 2 t h a t c o n t a i n e d t h e p r o t e a s e i n h i b i t o r s l e u p e p t i n a n d p e p s t a t i n a t 1 . 0 m g / 1 o f a n t i c o a g u l a n t . P l a s m a w a s c o l l e c t e d a s t h e s u p e r n a t a n t o f a 5 0 0 0 x g c e n t r i f u g a t i o n , b o t t l e d i n 1 o r 2 1 q u a n t i t i e s , f r o z e n a n d s t o r e d a t - 2 0 °C u n t i l n e e d e d . A . l . b . P u r i f i c a t i o n o f G e l s o l i n . G e l s o l i n w a s p u r i f i e d f r o m f r o z e n b l o o d p l a s m a b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f B r y a n 5 6 f o r t h e i s o l a t i o n o f h u m a n p l a s m a g e l s o l i n . T h e p r e p a r a t i o n o f g e l s o l i n b e g a n w i t h 1 1 o f t h a w e d p l a s m a , i n t h e p r e s e n c e o f 3 5 m g / 1 o f P M S F ( d i s s o l v e d i n i t i a l l y i n a s m a l l v o l u m e o f m e t h a n o l ) , t h a t h a d b e e n d i a l y s e d a g a i n s t t h r e e c h a n g e s o f 5 1 o f 2 5 mM T r i s - H C l - 0 . 5 mM C a C l 2 ( p H 7 . 5 ) a n d c e n t r i f u g e d a t 10000 x g f o r 10 m i n . T o t h e s u p e r n a t a n t , s o l i d N a C l w a s a d d e d t o 3 5 mM. T h i s w a s m i x e d w i t h 2 1 ( s e t t l e d v o l u m e ) o f D E A E - S e p h a d e x A - 5 0 t h a t h a d b e e n e q u i l i b r a t e d a g a i n s t 5 0 mM N a C l - 2 5 mM T r i s - H C l - 0 . 5 mM C a C l 2 (pH 7 . 5 ) a n d s t i r r e d f o r 2 h . T h e m i x t u r e w a s f i l t e r e d a n d E D T A w a s a d d e d t o 1 0 - 1 1 3 -mM t o t h e f i l t r a t e a n d i t s p H a d j u s t e d t o 7 . 8 . T h i s s o l u t i o n w a s a p p l i e d a t 6 0 m l / h t o a 3 1 x 6 cm c o l u m n o f D E A E - S e p h a d e x A - 5 0 t h a t h a d b e e n e q u i l i b r i a t e d a g a i n s t 5 0 mM N a C I - 2 5 mM T r i s - H C l - 1 mM E D T A - 1 mM N a N 3 (pH 7 . 8 ) . A f t e r e x t e n s i v e w a s h i n g o f t h e c o l u m n w i t h t h e e q u i l i b r a t i o n b u f f e r , t h e p r o t e i n s w e r e e l u t e d w i t h a 0 . 0 5 -0 . 3 0 M N a C I g r a d i e n t . F r a c t i o n s w e r e a s s a y e d f o r t h e i r a b i l i t y t o l o w e r t h e f i n a l v i s c o s i t y o f s o l u t i o n s o f F-a c t i n a n d p o o l e d a p p r o p r i a t e l y ( t y p i c a l l y b e t w e e n 0 . 1 5 a n d 0 . 2 2 M N a C I ) . G e l s o l i n w a s c o n c e n t r a t e d t h e n b y p r e c i p i t a t i o n w i t h a m m o n i u m s u l f a t e ( a d d e d t o 60 % o f s a t u r a t i o n ) , f o l l o w e d b y r e - s u s p e n s i o n a n d d i a l y s i s a g a i n s t 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - 1 . 0 mM E D T A (pH 7 . 8 ) a n d s t o r e d a t 4 °C u n t i l u s e d . P u r i t y w a s c h e c k e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n 5 - 1 5 % p o l y a c r y l a m i d e g r a d i e n t g e l s i n t h e p r e s e n c e o f s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . A . 2 . I s o l a t i o n o f A c t i n . A c t i n w a s p u r i f i e d f r o m a n a c e t o n e p o w d e r o f r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e a c c o r d i n g t o S p u d i c h a n d W a t t , 1 4 3 a n d s t o r e d a s F - a c t i n i n 2 mM t r i s - H C l - 1 mM D T T - 0 . 2 mM C a C l 2 - 0 . 2 mM A T P - 2 mM M g C l 2 - 1 5 0 mM K C 1 - 0 . 0 1 % N a N 3 (pH 7 . 6 ) , a t 4 ° C . B e f o r e u s e , i t w a s d i a l y s e d i n d e p o l y m e r i z i n g b u f f e r : 2 mM t r i s - H C l - 1 mM D T T - 0 . 2 mM C a C l 2 - 0 . 2 mM A T P (pH 7 . 6 ) a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 0 x g t o r e m o v e r e m a i n i n g p o l y m e r s o r d e n a t u r e d m a t e r i a l . - 1 1 4 -B . S D S - P A G E . ( S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) . S D S - P A G E w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e b u f f e r s y s t e m d e v e l o p e d b y L a e m m l i . 5 7 I n t h i s m e t h o d , p r o t e i n s a r e b o i l e d i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s S D S a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . T h i s m e t h o d r e s u l t s i n e l o n g a t e d S D S - p r o t e i n c o m p l e x e s w i t h a c o n s t a n t c h a r g e t o l e n g t h r a t i o , a n d i n t h e s e p a r a t i o n o f p o l y p e p t i d e c h a i n s . T h e s a m p l e i s a p p l i e d t h e n t o a p o l y a c r y l a m i d e g e l a n d a v o l t a g e i s a p p l i e d . T h e S D S a n d t h e m e r c a p t o e t h a n o l a s s u r e t h a t t h e p r o t e i n s m i g r a t e a c c o r d i n g t o p o l y p e p t i d e c h a i n s i z e o n l y . T h e g e l i s c h a r a c t e r i z e d b y a n a v e r a g e p o r e s i z e . I f t h e s i z e o f t h e m a c r o - i o n s i s c o m p a r a b l e t o t h e p o r e s i z e , t h e y w i l l b e i m p e d e d i n t h e i r m o t i o n . I n g e n e r a l , t h e l a r g e r t h e m a c r o -i o n t h e s m a l l e r i t s m o b i l i t y i n t h e g e l . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f g e l s o l i n w a s o b t a i n e d u s i n g a n 8 % p o l y a c r y l a m i d e g e l u s i n g a c a l i b r a t i o n k i t f r o m P h a r m a c i a a n d f o l l o w i n g t h e i n s t r u c t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r . S t a n d a r d s u s e d : (Mr v a l u e s i n p a r e n t h e s e s ) : p h o s p h o r y l a s e b ( 9 3 0 0 0 ) , b o v i n e s e r u m a l b u m i n (67 0 0 0 ) , c a t a l a s e ( s u b u n i t , 60 0 0 0 ) , o v a l b u m i n ( 4 3 0 0 0 ) , a n d l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ( s u b u n i t , 3 6 0 0 0 ) . T h i s m e t h o d w a s a l s o u s e d a s a m e a s u r e o f p r o t e i n p u r i t y a s a n y c o n t a m i n a n t p r o t e i n s p r e s e n t i n c o n s i d e r a b l e a m o u n t s s h o u l d b e d e t e c t e d i n t h e g e l . T h e g e l s u s e d f o r t h i s p u r p o s e w e r e 5 - 1 5 % p o l y a c r y l a m i d e g r a d i e n t g e l s . - 1 1 5 -C . A m i n o A c i d A n a l y s i s . T h e a m i n o a c i d a n a l y s i s o f g e l s o l i n w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o t h e c o n v e n t i o n a l m e t h o d d e s c r i b e d b y M o o r e a n d S t e i n . 1 4 4 T h e p u r i f i e d g e l s o l i n w a s d i a l y s e d e x t e n s i v e l y i n w a t e r a n d t r i p l i c a t e s a m p l e s w e r e h y d r o l y z e d i n 6 N H C 1 f o r 2 2 , 4 6 , a n d 7 2 h u n d e r v a c u u m a t 1 0 5 ° C . T h e s a m p l e s w e r e c o o l e d , o p e n e d , d r i e d u n d e r v a c u u m o v e r a t r a y o f N a O H p e l l e t s , a n d s u b m i t t e d t o a n a l y s i s w i t h a D u r r u m D - 5 0 0 a m i n o a c i d a n a l y z e r a t t h e U n i v e r s i t y o f A l b e r t a . M o s t o f t h e v a l u e s r e p o r t e d w e r e t h e a v e r a g e f r o m r e s u l t s o b t a i n e d a t t h e t h r e e h y d r o l y s i s t i m e s . T h e c o n t e n t s o f t h r e o n i n e a n d s e r i n e , h o w e v e r , w e r e e s t i m a t e d b y e x t r a p o l a t i n g t o z e r o h y d r o l y s i s t i m e . T h e v a l u e s o b t a i n e d a f t e r 72 h w e r e t a k e n i n t h e c a s e s o f v a l i n e a n d i s o l e u c i n e . D . S e d i m e n t a t i o n V e l o c i t y E x p e r i m e n t s . S e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d w i t h a B e c k m a n S p i n c o m o d e l E a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e a s d e s c r i b e d b y C h e r v e n k a . 6 5 T h e s o l v e n t u s e d ( 1 5 0 mM K C 1 - 2 0 mM MOPS - 2 mM M g C l 2 - ( pH 7 . 2 ) a n d 0 . 2 mM C a C l 2 o r ImM E G T A ) a n d s a m p l e s o f g e l s o l i n w e r e p l a c e d i n t o s e p a r a t e s e c t o r s o f a 12-mm d o u b l e - s e c t o r c e l l r e g u l a t e d t o 2 0 °C a n d c e n t r i f u g e d a t 5 2 0 0 0 r p m . A S c h l i e r e n o p t i c a l s y s t e m -116-was used t o photograph t h e s e d i m e n t i n g boundary a t 8 min i n t e r v a l s . E. G e l F i l t r a t i o n . G e l f i l t r a t i o n s t u d i e s were c o n d u c t e d i n t h e l a b o r a t o r y o f P r o f e s s o r S.G. W i t h e r s (UBC) w i t h a 1 x 30 cm column o f Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia) on a Pharmacia FPLC system. The column was c a l i b r a t e d w i t h a s e t o f g l o b u l a r s t a n d a r d s (Pharmacia) t h a t i n c l u d e d ( m o l e c u l a r weight, Mr and S t o k e s ' r a d i u s , Rs, quoted i n p a r e n t h e s e s ) : r i b o n u c l e a s e A (13 700, 1.64 nm), chymotrypsinogen (25 000, 2.09 nm), ovalbumin (43 000, 3.05 nm), bovine serum albumin (67 000, 3.55 nm) , a l d o l a s e (158 000, 4.81 nm) , c a t a l a s e (232 000, 5.22 nm) , f e r r i t i n (440 000, 6.10 nm) , and t h y r o g l o b u l i n (669 000, 8.50 nm). S o l v e n t used: 20 mM MOPS - 150 mM KC1 - (pH 7.0) and 0.5 mM CaCl2 or 1 mM EGTA. As d e s c r i b e d by L a u r e n t and K i l l a n d e r , 6 6 the average v a l u e o f g e l a c c e s s i b l e t o t h e p r o t e i n (Kav) was determined f o r each p r o t e i n a c c o r d i n g t o t h e r e l a t i o n : Kav = (Ve - V o ) / ( V t - Vo) where: Ve i s t h e e l u t i o n volume of t h e p r o t e i n o f i n t e r e s t , Vo i s t h e v o i d volume of t h e column, and Vt i s t h e t o t a l bed volume of t h e column. -117-A p l o t o f K a v a g a i n s t l o g M r , p r o v i d e s a c a l i b r a t i o n c u r v e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f g e l s o l i n . A p l o t o f ( - l o g K a v ) 1 / 2 a g a i n s t R s f o r t h e s t a n d a r d p r o t e i n p r o v i d e s a c a l i b r a t i o n c u r v e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f R s . F . V i s c o m e t r y . V i s c o s i t y m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n a t h e r m o s t a t i c a l l y c o n t r o l l e d w a t e r b a t h a t 2 7 °C w i t h a C a n n o n - M a n n i n g s e m i - m i c r o v i s c o m e t e r ( s i z e 1 0 0 ) . T h e s a m p l e s i z e w a s 1 . 0 m l . R e l a t i v e v i s c o s i t i e s r e p r e s e n t t h e r a t i o o f t h e f l o w t i m e f o r t h e p r o t e i n s o l u t i o n t o t h a t o f t h e b u f f e r a l o n e . G . L a b e l l i n g o f G e l s o l i n w i t h P I A . P u r i f i e d g e l s o l i n w a s d i a l y s e d f o r 24 h a g a i n s t : 2 0 mM MOPS - 1 5 0 mM K C 1 - 1 . 0 mM E D T A - p H 7 . 8 ( b u f f e r E ) , i n t h e p r e s e n c e o f 1 mM d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) . T h e p r o t e i n w a s t h e n d i a l y s e d f o r 4 h v e r s u s b u f f e r E w i t h o u t D T T . G e l s o l i n a t 2 m g / m l , t y p i c a l l y 4 - 8 m l , w a s m i x e d w i t h a 2 0 f o l d m o l a r e x c e s s o f N - ( 1 - p y r e n y l ) i o d o a c e t a m i d e ( M o l e c u l a r P r o b e s ) , d i s s o l v e d i n a m i n i m a l a m o u n t o f N , N - d i m e t h y l f o r m a m i d e . T h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e o n a m e c h a n i c a l r o c k e r . T h e m i x t u r e w a s - 1 1 8 -c e n t r i f u g e d a t 1 5 0 0 0 x g i n a b e n c h t o p c e n t r i f u g e . T h e f r e e a n d n o n - s p e c i f i c a l l y b o u n d d y e w e r e r e m o v e d b y d i a l y s e s a g a i n s t b u f f e r D + 1 mM DTT a n d b y g e l f i l t r a t i o n o n a P 2 c o l u m n ( B i o R a d P 2 ) e q u i l i b r a t e d v e r s u s t h e s a m e b u f f e r . P r i o r t o a n y e x p e r i m e n t t h e l a b e l l e d p r o t e i n w a s c l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 0 0 0 x g f o r h a l f a n h o u r . G . l . D e g r e e o f L a b e l l i n g o f P I A - G e l s o l i n . T o d e t e r m i n e t h e d e g r e e o f l a b e l l i n g o f P I A - g e l s o l i n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e B r a d f o r d 1 3 0 p r o t e i n a s s a y ( B i o R a d ) . A c a l i b r a t i o n c u r v e w i t h u n l a b e l l e d g e l s o l i n w a s o b t a i n e d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f b o u n d d y e w a s d e t e r m i n e d u s i n g a m o l a r a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t a t 3 4 4 nm o f 2 . 2 x 1 0 4 M _ 1 c m - 1 . 1 2 9 H . L a b e l l i n g o f A c t i n w i t h A c r y l o d a n . A c t i n w a s l a b e l l e d w i t h a c r y l o d a n a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f M a r r i o t t e t a l . 8 9 B r i e f l y : F r e s h l y p r e p a r e d a c t i n w a s d i a l y z e d a g a i n s t 2 mM t r i s - H C l - 0 . 2 mM C a C l 2 ~ 0 . 2 mM A T P ( p H 7 . 6 ) a n d p o l y m e r i z e d b y t h e a d d i t i o n o f M g C l 2 t o 2 . 0 mM f o r 3 h a t 4 ° C . A c r y l o d a n ( M o l e c u l a r P r o b e s ) d i s s o l v e d i n d i m e t h y l f o r m a m i d e w a s a d d e d i n a 2 - f o l d m o l a r e x c e s s a n d t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d f o r 3 h a t 4 ° C . T h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d a n d t h e e x c e s s d y e w a s r e m o v e d b y d i a l y s i n g e x t e n s i v e l y a g a i n s t t h e s a m e b u f f e r + I. 0 mM D T T . T h e l a b e l l e d a c t i n w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 0 0 x g 3 h t o r e m o v e d e n a t u r e d m a t e r i a l . T h e i n t e g r i t y o f t h e l a b e l l e d p r o t e i n w a s c o n f i r m e d b y t h e i n c r e a s e i n i n t e n s i t y a n d s h i f t i n e m i s s i o n m a x i m u m t h a t o c c u r s a f t e r p o l y m e r i z a t i o n . H . l . D e g r e e o f L a b e l l i n g o f A D A - A c t i n . T o d e t e r m i n e t h e d e g r e e o f l a b e l l i n g , t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d w i t h t h e B r a d f o r d p r o t e i n a s s a y f r o m B i o R a d u s i n g u n l a b e l e d a c t i n a s a s t a n d a r d . T h e d y e c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d u s i n g a n a b s o r p t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 . 8 5 x 1 0 4 M " 1 c m - 1 a t 3 7 5 n m . 1 4 5 T h e d e g r e e o f l a b e l l i n g o f t h e a c t i n u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w a s t y p i c a l l y 0 . 8 . I. A b s o r p t i o n S p e c t r o s c o p y . A l l a b s o r p t i o n m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h a d o u b l e b e a m P e r k i n E l m e r L a m b d a 4 B s p e c t r o p h o t o m e t e r . F o r d i f f e r e n c e a b s o r b a n c e m e a s u r e m e n t s , 2 i d e n t i c a l s a m p l e s w e r e p l a c e d i n e a c h c o m p a r t m e n t . S a l t w a s a d d e d t o o n e s a m p l e t o i n d u c e t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n a n d b u f f e r t o t h e o t h e r t o c o r r e c t f o r d i l u t i o n . T o s t u d y c h a n g e s r e s u l t i n g f r o m t h e i n t e r a c t i o n o f g e l s o l i n a n d a c t i n , a s p l i t c e l l w a s u s e d . G e l s o l i n w a s p u t i n o n e s i d e o f t h e d o u b l e c h a m b e r c e l l a n d a c t i n i n t h e o t h e r . T h e s p e c t r u m w a s r e c o r d e d b e f o r e a n d a f t e r i n v e r t i n g t h e c e l l t o m i x . - 1 2 0 -J . F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y . J . l . S t e a d y S t a t e F l u o r e s c e n c e M e a s u r e m e n t s . S t e a d y s t a t e f l u o r e s c e n c e s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d w i t h P e r k i n E l m e r L S - 5 B (UBC ) a n d L S - 5 ( C o l u m b i a ) l u m i n e s c e n c e s p e c t r o m e t e r s . A l l s a m p l e s u s e d i n f l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s d i s p l a y e d a n o p t i c a l d e n s i t y _. 0 . 0 7 a t t h e e x c i t a t i o n w a v e l e n g t h t o a v o i d i n n e r f i l t e r e f f e c t s . T h e s p e c t r a h a v e n o t b e e n c o r r e c t e d f o r i n s t r u m e n t a l r e s p o n s e . J . 2 . F l u o r e s c e n c e P o l a r i z a t i o n . P o l a r i z a t i o n m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e s a m e i n s t r u m e n t s e q u i p p e d w i t h a f l u o r e s c e n c e p o l a r i z a t i o n a c c e s s o r y ( P e r k i n E l m e r ) a n d a c i r c u l a t i n g w a t e r b a t h ( H a a k e ) . R e s u l t s f r o m t h e p o l a r i z a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e a n a l y z e d u s i n g P T P O L s o f t w a r e ( P e r k i n E l m e r ) t h a t c a l c u l a t e s t h e p o l a r i z a t i o n a c c o r d i n g t o t h e e q u a t i o n : p = ( I v-GIh)/(Iv+ G I h ) Iv a n d Ih a r e t h e p o l a r i z e d e m i s s i o n i n t e n s i t i e s o b s e r v e d p a r a l l e l a n d p e r p e n d i c u l a r , w i t h r e s p e c t t o v e r t i c a l l y p o l a r i z e d e x c i t a t i o n . T h e c o r r e c t i o n f a c t o r , G, a c c o u n t s f o r t h e u n e q u a l t r a n s m i s s i o n b y t h e m o n o c h r o m a t o r s o f v e r t i c a l l y a n d h o r i z o n t a l l y p o l a r i z e d l i g h t . - 1 2 1 -J . 3 L i f e t i m e M e a s u r e m e n t s . F l u o r e s c e n c e l i f e t i m e m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n t h e l a b o r a t o r y o f P r o f e s s o r N . J . T u r r o a t C o l u m b i a U n i v e r s i t y . A P R A ( P h o t o c h e m i c a l R e s e a r c h A s s o c i a t e s , L o n d o n , O n t a r i o ) s i n g l e p h o t o n c o u n t i n g i n s t r u m e n t e q u i p p e d w i t h a T N 1 7 1 0 m u l t i c h a n n e l a n a l y z e r a n d a n E d i n b u r g h m o d e l 1 9 9 F f l a s h l a m p w e r e u s e d . D e c o n v o l u t i o n w a s p e r f o r m e d o n a PDP I I c o m p u t e r w i t h P R A s o f t w a r e w h i c h e m p l o y s i t e r a t i v e l e a s t - s q u a r e s d e c o n v o l u t i o n . T h e q u a l i t y o f t h e f i t i s e v a l u a t e d b y X 2 a n a l y s i s a n d b y v i s u a l i n s p e c t i o n o f t h e w e i g h t e d r e s i d u a l s . K . C i r c u l a r D i c h r o i s m (CD) M e a s u r e m e n t s . C i r c u l a r D i c h r o i s m m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e w i t h a J a s c o J - 2 0 s p e c t r o p o l a r i m e t e r , e q u i p p e d w i t h a p h o t o e l a s t i c m o d u l a t o r a n d m o d i f i e d f o r c o m p u t e r c o n t r o l a n d d a t a a c q u i s i t i o n ( L a n d i s i n s t r u m e n t ) . T h e m e a n r e s i d u e m o l a r e l l i p t i c i t i e s [8] w e r e c a l c u l a t e d f r o m : [6]= Gobs m r w / l O O d c mrw = m e a n r e s i d u e w e i g h t = 1 1 0 g / m o l d = i s t h e p a t h l e n g t h i n dm c = i s t h e c o n c e n t r a t i o n i n g / c m 3 T h e e l l i p t i c i t y o f a s o l u t i o n o f D - P a n t o l a c t o n e i n w a t e r w a s u s e d t o c a l i b r a t e t h e i n s t r u m e n t a t 2 2 0 n m . 1 4 6 - 1 2 2 -T h e p e r c e n t o f a - h e l i x w a s c a l c u l a t e d a c c o r d i n g t o C h e n e t a l . ™ F o r t h e r m a l d e n a t u r a t i o n o f p r o t e i n s , t h e i n s t r u m e n t w a s s e t a t t h e i n d i c a t e d w a v e l e n g t h a n d t h e r e a d i n g w a s a v e r a g e d o v e r t h r e e m i n u t e s a f t e r 1 5 m i n u t e s h a d b e e n a l l o w e d f o r t h e r m a l e q u i l i b r a t i o n . P r i o r t o a n y m e a s u r e m e n t , t h e p r o t e i n s w e r e c e n t r i f u g e d a n d t h e b u f f e r s f i l t e r e d t h r o u g h a 0 . 2 2 Jim p o r e s i z e f i l t e r f r o m M i l l i p o r e . T e m p e r a t u r e c o n t r o l w a s a c h i e v e d w i t h a G r a n t c i r c u l a t i n g w a t e r b a t h . F o r s p e c t r a l m e a s u r e m e n t s a t i n c r e a s i n g G u - H C l , s e p a r a t e s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d f r o m s t o c k s o l u t i o n s o f g e l s o l i n , G u - H C l a n d t h e b u f f e r i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d s . T h e s o l u t i o n s w e r e a l l o w e d t o s t a n d 2 h a t r o o m t e m p e r a t u r e b e f o r e a n y m e a s u r e m e n t w a s p e r f o r m e d . L . N u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c e M e a s u r e m e n t s . N u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r a w e r e r e c o r d e d a t C o l u m b i a U n i v e r s i t y i n a B r u k e r A F 2 5 0 NMR s p e c t r o m e t e r . S p e c t r a w e r e m e a s u r e d , f i r s t w i t h a s a m p l e c o n t a i n i n g 2 mg o f p y r e n y l i o d o a c e t a m i d e i n 0 . 5 m l o f d 6 ~ N , N - d i m e t h y 1 f o r m a m i d e , a n d t h e n a f t e r t h e a d d i t i o n o f 0 . 0 2 m l o f b u f f e r E . C h e m i c a l s h i f t s a r e r e p o r t e d i n 8 u n i t s , o r p a r t s p e r m i l l i o n ( p p m ) , r e l a t i v e t o t e t r a m e t h y l s i l a n e (TMS 8=0) w h i c h w a s u s e d a s a n e x t e r n a l s t a n d a r d . - 1 2 3 -R E F E R E N C E S 1 . - Y i n , H . L . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 1 , 5 8 3 - 5 8 6 . 2 . - K w i a t k o w s k i , D . J . , M e h l , R . , a n d Y i n , H . L . ( 1 9 8 8 ) J . C e l l . B i o l . 1 0 6 , 3 7 5 - 3 8 4 . 3 . - Y i n , H . L . , K w i a t k o w s k i , D . J . , M o l e , J . E . , a n d C o l e , F . S . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 5 2 7 1 - 5 2 7 6 . 4 . - Y i n , H . L . , a n d C o l e , F . S . ( 1 9 8 3 ) J . C e l l B i o l . 9 7 , 3 7 4 a ( A b s t r . ) 5 . - S c h l i w a , M . ( 1 9 8 1 ) C e l l 2 5 , 5 8 7 - 5 9 0 . 6 . - C r a i g , S . W. a n d P o l l a r d , T . D . ( 1 9 8 2 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 7 , 8 8 - 9 2 . 7 . - P o l l a r d , T . D . , a n d C o o p e r , J . A . ( 1 9 8 6 ) A n n . R e v . B i o c h e m . 5 5 , 9 8 7 - 1 0 3 5 . 8 . - K o r n E . D . ( 1 9 8 2 ) P h y s i o l . R e v . 6 2 , 6 7 2 - 7 3 7 . 9 . - W e e d s , A . ( 1 9 8 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 9 6 , 8 1 1 - 8 1 6 . 1 0 . - S t o s s e l , T . P . , C h a p o n n i e r , C , E z z e l , R . M . , H a r t w i g , J . H . , J a n m e y , P . A . , K w i a t k k o w s k i , D . J . , L i n d , S . E . , S m i t h , D . B . , S o u t h w i c k , F . S . , Y i n , H . L . , a n d Z a n e r , K . S . ( 1 9 8 5 ) A n n . R e v . C e l l B i o l . 1 , 3 5 3 - 4 0 2 . 1 1 . - P o l l a r d , T . D . , a n d C r a i g , S . W. ( 1 9 8 2 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 7 , 5 5 - 5 8 1 2 . - Y i n , H . L . ( 1 9 8 8 ) B i o e s s a y s 7 , 1 7 6 - 1 7 9 . 1 3 . - N o r b e r g , R . , T h o r s t e n s s o n , R . , U t t e r , G . , a n d F r a g a e u s , A . ( 1 9 7 9 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 0 0 , 5 7 5 - 5 8 3 . 1 4 . - H a r r i s , H . E . , B a m b u r g , J . R . , a n d W e e d s , A . G . ( 1 9 8 0 ) F E B S L e t t . 1 2 1 , 1 7 5 - 1 7 7 . 1 5 . - C h a p o n n i e r , C , P a t e b e x , P . , a n d G a b b i a n i , G . ( 1 9 8 5 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 4 6 , 2 6 7 - 2 7 6 . 1 6 . - H a r r i s , H . E . , a n d G o o c h , J . ( 1 9 8 1 ) F E B S L e t t . 1 2 3 , 4 9 -5 3 . 1 7 . - L i n d , S . E . , S m i t h , D . B . , J a n m e y , P . A . a n d S t o s s e l , T , P . ( 1 9 8 8 ) A m . R e v . R e s p i r . D i s . 1 3 8 , 4 2 9 - 4 3 4 . - 1 2 4 -1 8 . - S m i t h , D . B . , J a n m e y , P . A . , S h e r w o o d , J . A . , H o w a r d , R . J . , a n d L i n d , S . E . ( 1 9 8 8 ) B l o o d 7 2 , 2 1 4 - 4 3 4 . 1 9 . - J a n m e y , P . A . , L i n d , S . E . , Y i n , H . L . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 5 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 4 1 , 1 5 1 - 1 5 8 . 2 0 . - L i n d , S . E . , S m i t h , D . B . , J a n m e y , P . A . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 6 ) J . C l i n . I n v e s t . 7 8 , 7 3 6 - 7 4 2 . 2 1 . - J a n m e y , P . A . , S t o s s e l , T , P . , a n d L i n d , S . E . ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 3 6 , 7 2 - 7 9 . 2 2 . - J a n m e y , P . A . , a n d L i n d , S . E . ( 1 9 8 7 ) B l o o d 7 0 , 5 2 4 - 5 3 0 . 2 3 . - V a n B a e l e n , H . , B o u i l l o n , R . , a n d De M o o r , P . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 2 2 7 0 - 2 2 7 2 . 2 4 . - C o o k e , N . E . , a n d H a d d a d , G . J . ( 1 9 8 9 ) E n d o c r i n e R e v . 1 0 , 2 9 4 - 3 0 7 . 2 5 . - K i l h o f f e r , M - C , M e l y , Y . a n d G e r a r d , D . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Comm. 1 3 1 , 1 1 3 2 - 1 1 3 8 . 2 6 . - P e r r i n . F , ( 1 9 2 6 ) J . P h y s . R a d i u m 7 , 3 9 0 - 4 0 1 2 7 . - S t e v e n s , B . a n d H u t o n , E . ( 1 9 6 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 1 8 6 , 1 0 4 5 - 1 0 4 6 . 2 8 . - B i r k s , J . B . ( 1 9 7 0 ) P h o t o p h y s i c s o f A r o m a t i c M o l e c u l e s , New Y o r k : W i l e y . 2 9 . - C h e u n g , S - T . , W i n n i k , M . A . , a n d R e d p a t h , E . C . ( 1 9 8 2 ) M a k r o m o l . C h e m . 1 8 3 , 1 8 1 5 - 1 8 2 4 . 3 0 . - H e r k s t r o e t e r , W. G . , M a r t i c , P . A . , H a r t m a n , S . E . , W i l l i a m s , J . L . R . , a n d F a r i d , S . ( 1 9 8 3 ) J . P o l y m . S c i . P o l y m . C h e m . E d n . 2 1 , 2 4 7 3 - 2 4 9 0 . 3 1 . - T u r r o , N . J . , a n d A r o r a , K . S . ( 1 9 8 5 ) P o l y m e r 2 7 , 7 8 3 -7 9 6 . 3 2 . - W i n n i k , F . M . , W i n n i k , M . A . , T a z u k e , S . , a n d O b e r , C . K . ( 1 9 8 7 ) M a c r o m o l e c u l e s 2 0 , 3 8 - 4 4 . 3 3 . - C h a r , K . , F r a n k , C . W . , G a s t , A . P . , T a n g , W . T . ( 1 9 8 7 ) M a c r o m o l e c u l e s , 2 0 , 1 8 3 3 - 1 8 3 8 . 3 4 . - I s h i i , Y . , a n d L e h r e r , S . S . ( 1 9 8 6 ) B i o p h y s . J . 5 0 , 7 5 - 8 0 . 3 5 . - I s h i i , Y . , a n d L e h r e r , S . S . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y 2 9 , 1 1 6 0 - 1 1 6 6 . - 1 2 5 -3 6 . - S u i b , S . L . , K o s t a p a p a s , A . ( 1 9 8 4 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 6 , 7 7 0 5 - 7 7 1 0 . 3 7 . - H a r a , K . , d e M a y o , P . , W a r e , W . R . , W e e d o n , A . C . , W o n g , G . S . K . , a n d Wu , K . C . ( 1 9 8 0 ) C h e m . P h y s . L e t t . 6 9 , 1 0 5 - 1 0 8 . 3 8 . - B a u e r , R . K . , d e M a y o , P . , W a r e , W . R . , a n d W u , K . C . ( 1 9 8 2 ) J . P h y s C h e m . 8 6 , 3 7 8 1 - 3 7 8 9 . 3 9 . - V a l a , M . T . , H a e b u g , J . , a n d R i c e , S . A . ( 1 9 6 5 ) J . C h e m . P h y s . 4 3 , 8 8 6 - 8 9 7 4 0 . - F o r s t e r , T . ( 1 9 4 7 ) A n n . P h y s i k . ( L i e p z i g ) 3 , 5 5 - 7 5 . 4 1 . - L a k o w i c z s , J . R . , P r i n c i p l e s o f F l u o r e s c e n c e S p e c t r o s c o p y . ( 1 9 8 4 ) P l e n u m P r e s s , New Y o r k . 4 2 . - K o s o w e r , E . M . , D o d i u k , H . , a n d K a n e t y , H . ( 1 9 7 7 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 0 , 4 1 7 9 - 4 1 8 8 . 4 3 . - B e t c h e r - L a n g e , S . L . , a n d L e h r e r , S . S . ( 1 9 7 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 3 7 5 7 - 3 7 6 0 . 4 4 . - H o r r o c k s , W . , a n d S u n d i c k , D . ( 1 9 8 1 ) A c c . C h e m . R e s . 1 4 , 3 8 4 - 3 9 2 . 4 5 . - R i c h a r d s o n , F . ( 1 9 8 2 ) . C h e m . R e v . 8 2 , 5 4 1 - 5 5 2 . 4 6 . - W e e d s , A . G . , G o o c h , J . , P o p e , B . , a n d H a r r i s , H . E . ( 1 9 8 6 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 6 1 , 6 9 - 7 6 . 4 7 . - M a r k e y , F . , P e r s s o n , T . , a n d L i n d b e r g , U . ( 1 9 8 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 0 9 , 1 2 2 - 1 3 3 . 4 8 . - Y i n , H . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 2 ) J . C l i n . I n v e s t . 6 9 , 1 3 8 4 - 1 3 8 7 . 4 9 . - W a n g , L - L . , a n d B r y a n , J . ( 1 9 8 1 ) C e l l 2 5 , 6 3 7 - 6 4 9 . 5 0 . - P e t r u c c i , T . C . , T h o m a s , C , a n d B r a y , D . ( 1 9 8 2 ) J . N e u r o c h e m . 4 0 , 1 5 0 7 - 1 5 1 6 . 5 1 . - B a d e r , M - F . , T a r i f a r o , J - M . , L a n g l e y , O . K . , T h i e r s e , D . a n d A u n i s , D . ( 1 9 8 6 ) J . C e l l B i o l . 1 0 2 , 6 3 6 - 6 4 6 . 5 2 . - T h o r s t e n s s o n , R . , S t e r k y , C , a n d N o r b e r g R. ( 1 9 8 5 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 4 7 , 6 3 7 - 6 4 0 . 5 3 . - S o u a , Z . , P o r t e , F . , H a r r i c a n e , A - C , F e i n b e r g , J . , a n d C a p o n y , J - P . ( 1 9 8 5 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 5 3 , 2 7 5 - 2 7 8 . -126-5 4 . - H a r r i s , D . A . , a n d S c h w a r t z , J . A . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 8 , 6 7 9 8 - 6 8 0 2 . 5 5 . - H w o , S . , a n d B r y a n , J . ( 1 9 8 6 ) J . C e l l B i o l . 1 0 2 , 2 2 7 -2 3 6 . 5 6 . - B r y a n , J . ( 1 9 8 8 ) J . C e l l B i o l . 1 0 6 , 1 5 5 3 - 1 5 6 2 . 5 7 . - L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 7 7 , 6 8 0 - 6 8 5 . 5 8 . - S o b e r , H . A . ( E d i t o r ) . 1 9 7 0 . H a n d b o o k o f B i o c h e m i s t r y . 2 n d e d . T h e C h e m i c a l R u b b e r C o . , C l e v e l a n d O H . 5 9 . - P o r t e , F . , a n d H a r r i c a n e , M - C . ( 1 9 8 6 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 5 4 , 8 7 - 9 3 . 6 0 . - P i t t - R i v e r s , R. a n d I m p i o m b a t o , F . S . A . ( 1 9 6 8 ) B i o c h e m . J . 1 0 9 , 8 2 5 - 8 3 0 6 1 . - W a y , M . , a n d W e e d s , A . ( 1 9 8 8 ) J . M o l . B i o l . 2 0 3 , 1 1 2 7 -1 1 3 3 . 6 2 . - C o h n , E . J . , a n d E d s a l l , J . T . ( 1 9 4 3 ) P r o t e i n s , a m i n o a c i d s a n d p e p t i d e s a s i o n s a n d d i p o l a r i o n s . R e i n h o l d P u b l i s h i n g C o r p . , New Y o r k . p . 3 7 0 . 6 3 . - K u n t z , I . D . ( 1 9 7 1 ) H y d r a t i o n o f m a c r o m o l e c u l e s . I l l H y d r a t i o n o f p o l y p e p t i d e s . J . A m . C h e m . S o c . 9 3 , 5 1 4 -5 1 6 . 6 4 . - K w i a t k o w s k i , D . J . , S t o s s e l , T . P , O r k i n , S . H . , M o l e , J . E . , C o l t e n , H . R . , a n d Y i n , H . L . ( 1 9 8 6 ) N a t u r e ( L o n d o n ) , 3 2 3 , 4 5 5 - 4 5 8 . 6 5 . - C h e r v e n k a , C . H . ( 1 9 6 9 ) A m a n u a l o f m e t h o d s f o r t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e . S p i n c o D i v i s i o n o f B e c k m a n I n s t r u m e n t s , I n c . , P a l o A l t o C A . 6 6 . - L a u r e n t , T . C . , a n d K i l l a n d e r , J . ( 1 9 6 4 ) J . C h r o m a t o g . 1 4 , 3 1 7 - 3 3 0 . 6 7 . - G r e e n f i e l d , N . , a n d F a s m a n , G . D . ( 1 9 6 9 ) B i o c h e m i s t r y 8 , 4 1 0 8 - 4 1 1 6 . 68. - D o i , Y . , K i m f F . , a n d K i d o , S . ( 1 9 9 0 ) B i o c h e m i s t r y 2 9 , 1 3 9 2 - 1 3 9 7 . 6 9 . - K w i a t k o w s k i , D . J . , J a n m e y , P . A . , M o l e , J . E . , a n d Y i n , H . L . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 1 5 2 3 2 - 1 5 2 3 8 . 7 0 . - C h e n , Y . - H . , Y a n g , J . S . T . , a n d C h a u , K . H . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y 1 3 , 3 3 5 0 - 3 3 5 9 . - 1 2 7 -7 1 . - G a i l y , J . A . , a n d E d e l m a n , G . M . ( 1 9 6 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 0 , 4 9 9 - 5 0 9 . 7 2 . - P a u l i n g , L . , C o r y , R . B . , a n d B r a n s o n , H . R . ( 1 9 5 1 ) P r o c . N a t . A c a d . S c i . U . S . A . 3 7 , 2 0 5 - 2 1 1 . 7 3 . - T a n f o r d , C . ( 1 9 6 8 ) A d v . P r o t e i n C h e m . 2 3 , 1 2 1 - 2 8 2 . 7 4 . - K i m , P . S . , a n d B a l d w i n , R . L . ( 1 9 8 2 ) A n n . R e v . B i o c h e m . 5 1 , 4 5 9 - 4 8 9 . 7 5 . - N o z a k a , M . , K u w a j i m a , K . , N i t t a , K . , a n d S u g a i , S . ( 1 9 7 8 ) B i o c h e m i s t r y 1 7 , 3 7 5 3 - 3 7 5 8 . 7 6 . - D o l g i k i h , D . A . , G i l m a n i s h , R. I . , B r a z h n i k o v , E . V . , B y c h k o v a , V . E . , S e m i s o t n o v , G . V . , V e n y a m i n o v , S . Y . a n d P t i t s y n , O . B . ( 1 9 8 1 ) F E B S L e t t . 1 3 6 , 3 1 1 - 3 1 5 . 7 7 . - O h g u s h i , M . , a n d W a d a , A . ( 1 9 8 3 ) F E B S L e t t . 1 6 4 , 2 1 -24 . 7 8 . - R o u a y r e n c , J - F . , F a t t o u m , A . , Me j e a n , C , a n d K a s s a b , R. ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m i s t r y 2 5 , 3 8 5 9 - 3 8 6 7 . 7 9 . - K i l h o f f e r , M - C , a n d G e r a r d , D . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m i s t r y 2 4 , 5 6 5 3 - 5 6 6 0 . 8 0 . - Y i n , H . L . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 0 ) , J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 9 4 9 0 - 9 4 9 3 . 8 1 . - Y i n , H . L . , I i d a , K . , a n d J a n m e y , P . A . ( 1 9 8 8 ) J . C e l l B i o l . 1 0 6 , 8 0 5 - 8 1 2 . 8 2 . - H i g a s h i , S . , a n d O o s a w a , F . ( 1 9 6 5 ) J . M o l . B i o l . 1 2 , 8 4 3 - 8 6 5 . 8 3 . - B r y a n , J . , a n d K u r t h , M . C . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 7 4 8 0 - 7 4 8 7 . 8 4 . - K u r t h , M . C , a n d B r y a n , J . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 7 4 7 3 - 7 4 9 0 . 8 5 . - C o u e , M . , a n d K o r n , E . D . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 0 , 1 5 0 3 3 - 1 5 0 4 1 . 8 6 . - H a r r i s , H . E . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m i s t r y 2 4 , 6 6 1 3 - 6 6 1 8 . 8 7 . - W e e d s , A . G . , H a r r i s , H . E . , G r a t z e r , W . , a n d G o o c h , J . ( 1 9 8 6 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 6 1 , 7 7 - 8 4 . 8 8 . - P o p e , B . , a n d W e e d s , A . G . ( 1 9 8 6 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 6 1 , 8 5 - 9 3 . - 1 2 8 -8 9 . - M a r r i o t t , G . , Z e c h e l , K . , a n d J o v i n , T . M . ( 1 9 8 8 ) B i o c h e m i s t r y 2 7 , 6 2 1 4 - 6 2 2 0 . 9 0 . - P r e n d e r g a s t , F . G . , M e y e r , M . , C a r l s o n , G . L . , L i d a , S . , a n d P o t t e r , J . D . ( 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 7 5 4 1 -7 5 4 4 . 9 1 . - A j t a i , K . , a n d V e n y a m i n o v , S . Y u . ( 1 9 8 3 ) F E B S L e t t . 1 5 1 , 9 4 - 9 6 . 9 2 . - K l e v i t , R . E . , B l u m e n t h a l , D . K . , Wemmer , D . E . , K r e b s , G . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m i s t r y . 2 4 , 8 1 5 2 - 8 1 5 6 . 9 3 . - T a n f o r d , C . ( 1 9 8 0 ) T h e H y d r o p h o b i c E f f e c t . 2 n d E d i t i o n , W i l e y I n t e r s c i e n c e . New Y o r k . 9 4 . - H a i e c h , J . , K l e e , C . B . , a n d D e m a i l l e , J . G . ( 1 9 8 1 ) B i o c h e m i s t r y 2 0 , 3 8 9 0 - 3 8 9 7 . 9 5 . - O l w i n , B . B . , a n d S t o r m , D . R . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m i s t r y 2 4 , 8 0 8 1 - 8 0 8 6 . 9 6 . - S e l i s k a r , C , a n d B r a n d , L . ( 1 9 7 1 ) J . A m . C h e m . S o c . 9 3 , 5 4 0 5 - 5 4 1 4 . 9 7 . - S e l i s k a r , C , a n d B r a n d , L . ( 1 9 7 1 ) J . A m . C h e m . S o c . 9 3 , 5 4 1 4 - 5 4 2 0 . 9 8 . - B r a n d , L . , a n d G o h l k e , J . R . ( 1 9 7 2 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 1 , 8 4 3 - 8 6 7 . 9 9 . - B u r t n i c k , L . D . , a n d C h a n , K . W . ( 1 9 8 3 ) C a n . J . B i o c h e m . C e l l B i o l . 6 1 , 9 8 1 - 9 8 8 . 1 0 0 . - Z i e r l e r , K . ( 1 9 7 7 ) B i o p h y s . S t r u c t . M e c h . 3 , 2 7 5 - 2 8 9 . 1 0 1 . - T u r r o , N . J . , A i k a w a , M . a n d Y e k t a , A . ( 1 9 7 9 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 1 , 7 7 2 . 1 0 2 . - K o n u k , R . , C o r n e l i s s e , J . , a n d M c G l y n , S . P . ( 1 9 8 9 ) J . P h y s . C h e m . 9 3 , 7 4 0 5 - 7 4 0 8 . 1 0 3 . - T u r r o , N . J . , B a r e t z , B . H . , a n d K u o , P - L . ( 1 9 8 4 ) M a c r o m o l . 1 7 , 1 3 2 1 - 1 3 2 4 . 1 0 4 . - T u r r o , N . J . , a n d O k u b o , T . ( 1 9 8 1 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 3 , 7 2 2 4 - 7 2 2 8 . 1 0 5 . - A t i k , S . S . , N a m , M . , a n d S i n g e r , L . A . ( 1 9 7 9 ) C h e m . P h y s . L e t t . 6 7 , 7 5 - 8 0 . 1 0 6 . - L i a n o s , P . , a n d Z a n o , R. ( 1 9 8 0 ) C h e m . P h y s . L e t t . 7 2 , 1 7 1 - 1 7 5 . - 1 2 9 -1 0 7 . - T u r r o , N . J . , K u o , P - L . , S o m a s u n d a r a m , P . , a n d W o n g , K . ( 1 9 8 6 ) J . P h y s . C h e m . 9 0 , 2 8 8 - 2 9 1 . 1 0 8 . - G o u l d , I . R . , K u o , P . L . , a n d T u r r o , N . J . ( 1 9 8 5 ) J . P h y s . C h e m . 8 9 , 3 0 3 0 - 3 0 3 4 . 1 0 9 . - K a l y a s u n d a r a m , K . , a n d T h o m a s , J . K . ( 1 9 7 7 ) J . A m . C h e m . S o c . 9 9 , 2 0 3 9 - 2 0 4 4 . 1 1 0 . - G r a t z e l , N . , a n d T h o m a s , J . K . ( 1 9 7 3 ) J . A m . C h e m . S o c . 2 1 , 6 8 8 5 - 6 8 8 9 1 1 1 . - R o d g e r s , M . A . , D a S i l v a , M . F . , a n d W h e e l e r , E . ( 1 9 7 6 ) C h e m . P h y s . L e t t . 4 3 , 5 8 7 - 5 9 1 . 1 1 2 . - P a r t h a s a r a r a t h y , R . , a n d L a b e s , M . M . ( 1 9 9 0 ) J . A m . C h e m . S o c . 6 , 5 4 2 - 5 4 7 . 1 1 3 . - F l a m m , M . , O k u b o , T . , T u r r o . N . J . , a n d S c h a a h t e r , D . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a ( 1 9 8 2 ) 6 8 7 , 1 0 1 - 1 0 4 . 1 1 4 . - A n a n t h a p a d m a n a b h a n , K . P . , G o d d a r d , E . D . , T u r r o , N . J . a n d K u o , P . L . ( 1 9 8 5 ) L a n g m u i r 1 , 3 5 2 - 3 5 5 . 1 1 5 . - Z a c h a r i a s s e , K . A . , B u s s e , R . , D u v e n e c k , G . , a n d K u h n l e , W. ( 1 9 8 5 ) J . P h o t o c h e m . 2 8 , 2 3 7 - 2 5 3 . 1 1 6 . - Z a c h a r i a s s e , K . A . , a n d K u h n l e , W. ( 1 9 7 6 ) Z . P h y s . C h e m . 1 0 1 , 2 6 7 1 1 7 . - Z a c h a r i a s s e , K . A . , K u h n l e , W . , a n d W e l l e r , A . ( 1 9 7 8 ) C h e m . P h y s . L e t t . 5 9 , 3 7 5 . 1 1 8 . - Z a c h a r i a s s e , K . A . , D u v e n e c k , G . , a n d B u s s e , R. ( 1 9 8 4 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 6 , 1 0 4 5 - 1 0 5 1 1 1 9 . - P r a n i s , R . A . , a n d K l o t z , I . M . ( 1 9 7 7 ) B i o p o l y m e r s . 1 6 , 2 9 9 - 3 1 6 1 2 0 . - M a s u h a r a , H . , T a n a k a , J . A . , M a t a g a , N . , De S c h r y v e r , F . C , a n d C o l l a r t , P . ( 1 9 8 3 ) P o l y m . J . 1 5 , 9 1 5 - 9 1 7 . 1 2 1 . - T a z u k e , S . , O o k i , H . , a n d S a t o , K . ( 1 9 8 2 ) M a c r o m o l e c u l e s , 1 5 , 4 0 0 - 4 0 6 . 1 2 2 . - N e l s o n , G . , a n d W a r n e r , I. M . ( 1 9 9 0 ) J . P h y s . C h e m . 9 4 , 5 7 6 - 5 8 1 . A n d r e f e r e n c e s c i t e d t h e r e i n . 1 2 3 . - B a r e t z , B . , a n d T u r r o , N . J . ( 1 9 8 4 ) J . P h o t o c h e m i s t r y 2 4 , 2 0 1 - 2 0 9 . 1 2 4 . - L e v i t s , P . , V a n Damme, H . , a n d K e r a v i s , D . ( 1 9 8 4 ) J . P h y s . C h e m . 8 8 , 2 2 8 - 2 2 3 5 . - 1 3 0 -1 2 5 . - N a k a j i m a , A . ( 1 9 7 1 ) B u l l . C h e m . S o c . J p n . 4 4 , 3 2 7 2 -3 2 7 2 . 12 6 . - C h a n d r o s , E . A . , a n d D e m p s t e r , C . J . ( 1 9 7 0 ) J . A m . C h e m . S o c . 9 2 , 3 5 8 6 - 3 5 9 3 . 1 2 7 . - M c C u l l o u g h , J . J . ( 1 9 8 7 ) C h e m . R e v . 8 7 , 8 1 1 - 8 6 0 . 1 2 8 . - D e S c h r y v e r , F . C , C o l l a r t , P . , V a n d e e n e r i e s s c h e , J . , G o e d e w e e c k , R . , S w i n n e n , A . , a n d V a n d e r A u w e r a e r , M . ( 1 9 8 7 ) A c c . C h e m . R e s . 2 0 , 1 5 9 - 1 6 6 . 1 2 9 . - M a t a g a , N . , T o r i h a s h i , Y . a n d O t a , Y . ( 1 9 6 7 ) C h e m . P h y s . L e t t . 1 , 3 8 5 - 3 8 7 . 1 3 0 . - K o u y a m a , T . , a n d M i h a s h i , K . ( 1 9 8 1 ) E u r . J . B i o c h e m . 1 1 4 , 3 3 - 3 8 . 1 3 1 . - B r a d f o r d , M . ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 . 1 3 2 . - L i n , T . I . , a n d D o w b e n , R . M . ( 1 9 8 2 ) B i o p h y s . C h e m . 1 5 , 2 8 9 - 2 9 8 . 1 3 3 . - S e n , A . C . , a n d C h a k r a b a r t i , B . ( 1 9 9 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 5 , 1 4 2 7 7 - 1 4 2 8 4 . 1 3 4 . - K a w a s a k i , Y . , M i h a s h i , K . , T a n a k a , H . , a n d O h n u m a , H . ( 1 9 7 6 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 4 6 , 1 6 6 - 1 7 8 . 1 3 5 . - W e l t m a n , J . K . , S z a r o , R . P . , F r a n c k e l t o n , A . R . D o w b e n , R . M . B u n t i n g , J . R . , a n d C a n t h o u , R . E . ( 1 9 7 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 3 1 7 3 - 3 1 7 7 . 1 3 6 . - S c o u t e n , W . H . , G r a a f - H e s s , A . C . , d e K o k , A . , G r a n d e , H . J . , V i s s e r , A . J . W . G . a n d V e e g e r , C . ( 1 9 7 8 ) E u r . J . B i o c h e m . 8 4 , 1 7 - 2 5 . 1 3 7 . - J a n m e y , P . A . , I i d a , K . , Y i n , H . L . , a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 2 , 1 2 2 2 8 - 1 2 2 3 6 . 1 3 8 . - D o i , Y . , a n d F r i e d e n , C . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 1 1 8 6 8 - 1 1 8 7 5 . 1 3 9 . - C o o p e r , J . A . , L o f t u s , D . J . , F r i e d e n , C , B r y a n , J . , and Elson, E. L. ( 1 9 8 8 ) J . C e l l B i o l . 1 0 6 , 1 2 2 9 -1 2 4 0 . 1 4 0 . - W u , C - W . , Y a r b r o u g h , L . R . , a n d Wu , F . Y - H . ( 1 9 7 6 ) B i o c h e m i s t r y 1 5 , 2 8 6 3 - 2 8 6 8 . 1 4 1 . - G r a c e f f a , P . , a n d L e h r e r , S . S . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 1 1 2 9 6 - 2 6 1 2 . - 1 3 1 -1 4 2 . - C 6 t e , G . P . , a n d S m i l l i e , L . B . ( 1 9 8 1 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 6 , 1 1 0 0 4 - 1 1 0 1 0 . 1 4 3 . - S p u d i c h , J . A . , a n d W a t t , S . ( 1 9 7 1 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 6 , 4 8 6 6 - 4 8 7 1 . 1 4 4 . - M o o r e , S . , a n d S t e i n , W . H . ( 1 9 6 3 ) M e t h . E n z y m o l . 6 , 8 1 9 - 8 3 1 . 1 4 5 . - W e b e r , G . , a n d F a r r i s , F . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m i s t r y . 1 8 , 3 0 7 5 - 3 0 7 8 . 14 6 . - T u z i m u r a , K . , K o n n o , T . , M e g u r o , H . , H a t a n o , M . , M u r a k a m i , T . , K a s h i w a b a r a , K . , S a i t o , T . , K o n d o , Y . , a n d S u z u k i , T . M . ( 1 9 7 7 ) A n a l . B i o c h e m . 8 1 , 1 6 7 - 1 7 4 . - 1 3 2 -

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