Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

Hair cortisol : sampling methodology and associations with health and reproduction in dairy cows Burnett, Tracy Anne 2014

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata


24-ubc_2014_november_burnett_tracy.pdf [ 2.72MB ]
JSON: 24-1.0167611.json
JSON-LD: 24-1.0167611-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0167611-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0167611-rdf.json
Turtle: 24-1.0167611-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0167611-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0167611-source.json
Full Text

Full Text

HAIR	  CORTISOL:	  SAMPLING	  METHODOLOGY	  AND	  ASSOCIATIONS	  WITH	  HEALTH	  AND	  REPRODUCTION	  IN	  DAIRY	  COWS	  by	  Tracy	  Anne	  Burnett	  	  B.Sc.,	  The	  University	  of	  British	  Columbia,	  2011	  	  A	  THESIS	  SUBMITTED	  IN	  PARTIAL	  FULFILLMENT	  OF	  	  THE	  REQUIREMENTS	  FOR	  THE	  DEGREE	  OF	  	  MASTER	  OF	  SCIENCE	  	  in	  THE	  FACULTY	  OF	  GRADUATE	  AND	  POSTDOCTORAL	  STUDIES	  (Applied	  Animal	  Biology)	  	  	  	  THE	  UNIVERSITY	  OF	  BRITISH	  COLUMBIA	  	  (Vancouver)	  	  October	  2014	  	  ©Tracy	  Anne	  Burnett,	  2014	  	   ii	  Abstract	  	   Dairy	  cattle	  are	  often	  challenged	  with	  stressful	  practices	  and	  conditions.	  Cortisol	  is	  often	  used	  as	  a	  biomarker	  to	  detect	  stress.	  Hair	  is	  a	  promising	  new	  medium	  to	  detect	  long-­‐term	  changes	  of	  circulating	  cortisol.	  This	  thesis	  investigated	  methodologies	  for	  the	  collection	  and	  processing	  of	  hair	  for	  cortisol	  analysis,	  and	  determined	  associations	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  health	  disorders	  and	  fertility	  in	  lactating	  Holstein	  cows.	  	  First,	  we	  investigated	  the	  effects	  of	  hair	  colour,	  sampling	  location,	  and	  processing	  method	  on	  the	  amount	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  samples	  of	  18	  black	  and	  white	  Holstein	  dairy	  cows.	  Second,	  we	  investigated	  the	  associations	  between	  hair	  cortisol	  with	  clinical	  and	  subclinical	  disease,	  and	  reproductive	  success.	  Hair	  samples	  were	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  of	  lactating	  Holstein	  cows	  to	  determine	  the	  effects	  of	  clinical	  disease	  and	  fertility	  	  (n	  =	  64),	  or	  subclinical	  disease	  (n	  =	  54).	  	  White	  hair	  had	  greater	  cortisol	  concentrations	  than	  black	  hair	  (Geometric	  Mean	  [95%	  CI])	  (7.8	  [6.8,	  9.2]	  vs.	  4.2	  [3.6,	  5.0]	  pg/mg).	  When	  only	  white	  samples	  were	  analyzed,	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  had	  more	  cortisol	  than	  the	  shoulder	  (11.0	  [7.6,	  16.0]	  vs.	  6.2	  [4.2,	  9.2]	  pg/mg).	  Processing	  with	  a	  ball	  mill	  yielded	  greater	  concentrations	  of	  extracted	  cortisol	  than	  when	  using	  scissors	  (10.4	  [5.8,	  18.8]	  vs.	  4.7	  [2.6,	  8.4]	  pg/mg).	  In	  Holsteins,	  the	  tail	  switch	  is	  always	  white	  and	  grows	  faster	  making	  it	  an	  ideal	  location	  for	  measuring	  hair	  cortisol.	  Animals	  with	  clinical	  disease	  presented	  higher	  hair	  cortisol	  concentrations	  than	  clinically	  healthy	  animals	  (8.8	  [7.8,	  9.9]	  vs.	  10.7	  [9.6,	  12.0]	  pg/mg);	  however,	  animals	  	   iii	  diagnosed	  with	  subclinical	  disease	  did	  not	  differ	  (11.5	  [9.7,	  13.7]	  vs.	  11.3	  [9.6,	  13.3]	  pg/mg	  for	  healthy	  and	  subclinical	  groups,	  respectively).	  Multiparous	  cows	  that	  became	  pregnant	  by	  100	  days	  postpartum	  had	  lower	  hair	  cortisol	  concentrations	  at	  42	  and	  84	  DIM.	  	  Overall,	  using	  standard	  and	  consistent	  methods	  to	  sample,	  cortisol	  in	  hair	  offers	  important	  insights	  into	  long-­‐term	  changes	  of	  circulating	  cortisol.	  Hair	  cortisol	  concentrations	  appear	  to	  be	  associated	  with	  clinical	  disorders	  and	  have	  a	  direct	  association	  with	  pregnancy	  outcomes;	  however,	  hair	  cortisol	  concentrations	  may	  not	  be	  suited	  to	  differentiate	  situations	  of	  stress	  with	  lower	  magnitudes,	  such	  as	  subclinical	  disease.	  	  	  	  	  	  	  	   	  	   iv	  Preface	  	  	   All	  of	  the	  work	  presented	  in	  this	  thesis	  was	  conducted	  at	  the	  University	  of	  British	  Columbia’s	  Dairy	  Education	  and	  Research	  Centre	  in	  Agassiz,	  BC.	  The	  projects	  and	  associated	  methods	  within	  this	  thesis	  were	  approved	  by	  the	  University	  of	  British	  Columbia’s	  Animal	  Care	  Ethics	  Committee	  [certificate	  #A11-­‐0319].	  	   A	  version	  of	  the	  material	  in	  Chapter	  2	  has	  been	  accepted	  for	  publication:	  Burnett,	  T.A.,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.	  Tahmasbi,	  D.M.	  Veira,	  R.L.A.	  Cerri.	  2014.	  Short	  communication:	  Factors	  affecting	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  In	  Press.	  Additionally,	  a	  version	  of	  the	  material	  in	  Chapter	  3	  has	  been	  submitted	  for	  publication:	  Burnett,	  T.A.,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.	  Tahmasbi,	  D.M.	  Veira,	  R.L.A.	  Cerri.	  2014.	  Relationship	  of	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  with	  health,	  plasma	  metabolites	  and	  reproductive	  parameters	  in	  dairy	  cows.	  Both	  manuscripts	  were	  co-­‐authored	  by	  my	  main	  supervisor,	  R.L.A.	  Cerri,	  my	  supervisory	  committee	  member,	  D.M.	  Veira,	  and	  four	  colleagues,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.	  Tahmasbi.	  	  Cerri	  and	  Veira	  supervised,	  helped	  with	  concept	  formation	  and	  interpreting	  material,	  as	  well	  as	  editing	  and	  providing	  comments	  on	  manuscript	  drafts.	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  and	  A.	  Tahmasbi	  were	  involved	  with	  data	  collection,	  processing,	  and	  analysis.	  I	  was	  the	  lead	  investigator,	  responsible	  for	  all	  major	  areas	  of	  concept	  formation,	  material	  interpretation,	  data	  collection	  and	  processing,	  statistical	  analysis,	  and	  manuscript	  composition.	  	  	   	  	   v	  Table	  of	  Contents	  	  Abstract	  ...................................................................................................................................................	  ii	  Preface	  ....................................................................................................................................................	  iv	  Table	  of	  Contents	  ...................................................................................................................................	  v	  List	  of	  Tables	  ........................................................................................................................................	  vii	  List	  of	  Figures	  .....................................................................................................................................	  viii	  List	  of	  Abbreviations	  ..........................................................................................................................	  ix	  Acknowledgements	  ..............................................................................................................................	  x	  Chapter	  1:	  Introduction	  .....................................................................................................................	  1	  1.1	  Introduction	  to	  stress	  .............................................................................................................................	  1	  1.2	  The	  stress	  response	  .................................................................................................................................	  2	  1.2.1	  Acute	  stress	  versus	  chronic	  stress	  ................................................................................................................	  4	  1.3	  Regulation	  of	  the	  neuroendocrine	  stress	  response	  .....................................................................	  5	  1.3.1	  Hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  ...........................................................................................................	  6	  1.3.2	  Sympathetic	  nervous	  system	  ...........................................................................................................................	  7	  1.4	  Biological	  responses	  to	  glucocorticoid	  production	  ......................................................................	  8	  1.4.1	  Effects	  of	  stress	  on	  the	  immune	  system	  ......................................................................................................	  9	  1.4.2	  Effects	  of	  stress	  on	  reproduction	  ................................................................................................................	  11	  1.5	  How	  is	  stress	  measured?	  .....................................................................................................................	  13	  1.5.1	  Using	  blood	  to	  measure	  cortisol	  ..................................................................................................................	  15	  1.5.2	  Using	  saliva	  to	  measure	  cortisol	  ..................................................................................................................	  15	  1.5.3	  Using	  faeces	  to	  measure	  cortisol	  .................................................................................................................	  16	  1.5.4	  Using	  hair	  to	  measure	  cortisol	  .....................................................................................................................	  17	  1.6	  Important	  concepts	  when	  using	  hair	  for	  the	  measurement	  of	  stress	  ..................................	  18	  1.6.1	  How	  is	  cortisol	  incorporated	  into	  hair?	  ...................................................................................................	  18	  1.6.2	  What	  factors	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations?	  ................................................................................	  19	  1.7	  Objectives	  and	  hypotheses	  .................................................................................................................	  20	  Chapter	  2:	  Factors	  Affecting	  Hair	  Cortisol	  Concentrations	  in	  Lactating	  Dairy	  Cows	  ..	  22	  2.1	  Introduction	  .............................................................................................................................................	  22	  2.2	  Materials	  and	  methods	  .........................................................................................................................	  24	  2.2.1	  Animals	  and	  housing	  ........................................................................................................................................	  25	  2.2.2	  Hair	  processing	  and	  analysis	  ........................................................................................................................	  27	  2.2.3	  Statistical	  analyses	  ............................................................................................................................................	  28	  2.3	  Results	  and	  discussion	  .........................................................................................................................	  29	  Chapter	  3:	  Relationship	  of	  Concentrations	  of	  Cortisol	  in	  Hair	  with	  Health,	  Plasma	  Metabolites	  and	  Reproductive	  Parameters	  in	  Dairy	  Cows	  ..................................................	  37	  3.1	  Introduction	  .............................................................................................................................................	  37	  3.2	  Materials	  and	  methods	  .........................................................................................................................	  39	  	   vi	  3.2.1	  Animals	  and	  housing	  ........................................................................................................................................	  39	  3.2.2	  Blood	  sampling	  and	  analysis	  .........................................................................................................................	  42	  3.2.3	  Hair	  sampling	  and	  analysis	  ............................................................................................................................	  43	  3.2.4	  Uterine	  cytology	  and	  ultrasonography	  .....................................................................................................	  44	  3.2.5	  Statistical	  analyses	  ............................................................................................................................................	  45	  3.3	  Results	  .......................................................................................................................................................	  46	  3.4	  Discussion	  .................................................................................................................................................	  51	  Chapter	  4:	  General	  Discussion	  .......................................................................................................	  66	  4.1	  Summary	  ...................................................................................................................................................	  66	  4.2	  Limitations	  ...............................................................................................................................................	  71	  4.3	  Future	  directions	  ...................................................................................................................................	  74	  Chapter	  5:	  Conclusions	  .....................................................................................................................	  76	  References	  ............................................................................................................................................	  77	  	  	  	  	  	   	  	   vii	  List	  of	  Tables	  	  Table	  2.1:	  Effect	  of	  hair	  colour,	  sampling	  location	  and	  processing	  method	  on	  	  concentrations	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  from	  black	  and	  white	  Holstein	  cows	  .................................................................................................................................................	  33	  Table	  3.1:	  Comparative	  statistics	  (Geometric	  Mean	  [95%	  CI])	  for	  the	  Subclinical	  endometritis	  (Endo)	  and	  Control	  groups	  of	  Experiment	  2	  ........................................................	  58	  Table	  3.2:	  Pearson	  correlation	  coefficients	  found	  between	  hair	  cortisol,	  plasma	  haptoglobin,	  plasma	  ceruloplasmin,	  percent	  neutrophils,	  milk	  yield	  and	  cervix	  endometrium	  diameter	  in	  Holstein	  dairy	  cows	  (Experiment	  2)	  ..............................................	  59	  	  	  	   	  	   viii	  List	  of	  Figures	  	  Figure	  2.1:	  Hair	  sampling	  locations:	  a)	  shoulder,	  hair	  located	  at	  the	  scapula;	  b)	  top	  line,	  hair	  located	  at	  the	  dorsal	  side	  of	  the	  vertebrae;	  c)	  hip,	  hair	  located	  over	  the	  femur-­‐ischium	  junction;	  and	  d)	  tail	  switch,	  hair	  located	  at	  the	  distal	  end	  of	  the	  tail	  .....................................	  34	  Figure	  2.2:	  Hair	  growth	  rates	  at	  different	  body	  locations	  (Mean	  ±	  SE)	  collected	  from	  black	  and	  white	  Holstein	  cows	  ............................................................................................................................	  35	  Figure	  2.3:	  Effect	  of	  parity	  and	  DIM	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  (Mean	  ±	  SE)	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  of	  37	  clinically	  healthy	  lactating	  cows	  (18	  primiparous	  and	  19	  multiparous)	  at	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM	  .....................................	  36	  Figure	  3.1:	  Schematic	  of	  the	  experimental	  and	  sampling	  design	  of	  Experiment	  1	  and	  Experiment	  2	  ..................................................................................................................................................	  60	  Figure	  3.2:	  Effect	  of	  DIM	  on	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  at	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM	  from	  all	  cows	  in	  Experiment	  1	  ...............................................................................................................................................................................	  61	  Figure	  3.3:	  Effect	  of	  disease	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  extracted	  from	  hair	  samples	  from	  multiparous	  animals	  in	  Experiment	  1	  ..........................	  62	  Figure	  3.4:	  Hair	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  of	  multiparous	  cows	  that	  were	  diagnosed	  as	  clinically	  diseased	  or	  clinically	  healthy	  by	  126	  DIM	  ..............................	  63	  Figure	  3.5.	  	  Scatter	  plots	  representing	  Pearson	  correlations	  between	  hair	  cortisol	  and	  blood	  BHBA	  (r	  =	  0.10;	  P	  =	  0.46),	  hair	  cortisol	  and	  blood	  glucose	  (r	  =	  0.26;	  P	  =	  0.07)	  and	  glucose	  and	  BHBA	  (r	  =	  -­‐0.26;	  P	  =	  0.07)	  concentrations	  at	  21	  DIM	  in	  Experiment	  1	  .......	  64	  Figure	  3.6:	  	  Hair	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  of	  multiparous	  (panel	  A)	  and	  primiparous	  cows	  (panel	  B)	  that	  were	  diagnosed	  non-­‐pregnant	  or	  pregnant	  by	  100	  DIM	  ......................................................................................................................................................................	  65	  	  	   	  	   ix	  List	  of	  Abbreviations	  	  ACTH	  -­‐	  Adrenocorticotropin	  hormone	  AVP	  -­‐	  Arginine	  vasopressin	  BCS	  -­‐	  Body	  condition	  score	  	  BHBA	  -­‐	  Beta-­‐hydroxybutyrate	  acid	  CI	  –	  Confidence	  interval	  CRH	  -­‐	  Corticotrophin-­‐releasing	  hormone	  	  DIM	  –	  Days	  in	  milk	  FSH-­‐	  Follicle-­‐stimulating	  hormone	  	  GnRH	  –	  Gonadotropin-­‐releasing	  hormone	  	  HPA	  -­‐	  Hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  HPG	  -­‐	  Hypothalamic-­‐pituitary-­‐gonadal	  LH-­‐	  Luteinizing	  hormone	  NEFA	  -­‐	  Non	  esterified	  fatty	  acids	  	  PMNT	  -­‐	  Phenylethanolamine-­‐N-­‐methyltransferase	  SNS	  -­‐	  Sympathetic	  nervous	  system	  TMR	  –	  Total	  mixed	  ration	   	  	   x	  Acknowledgements	  First	  and	  foremost,	  I	  would	  like	  to	  thank	  Ronaldo	  Cerri	  and	  Douglas	  Veira	  for	  teaching	  me	  all	  I	  know	  about	  research	  and	  dairy	  cattle.	  Their	  passion	  and	  encouragement	  has	  pushed	  me	  intellectually	  and	  nurtured	  my	  aspiration	  to	  continue	  my	  studies	  in	  dairy	  cattle	  research.	  I	  am	  extremely	  thankful	  for	  Nelson	  Dinn	  who	  introduced	  me	  to	  the	  world	  of	  dairy	  cattle	  in	  the	  summer	  of	  2009,	  and	  very	  patiently	  (and	  calmly)	  taught	  me	  the	  ins	  and	  outs	  of	  working	  on	  a	  dairy	  farm	  and	  sparked	  my	  love	  for	  cows.	  A	  special	  thank	  you	  to	  Audrey	  Nadalin	  for	  all	  the	  lab	  work	  she	  did	  for	  me	  and	  keeping	  me	  stay	  sane	  while	  I	  tediously	  cleaned	  and	  processed	  hair	  samples	  for	  hours.	  To	  my	  family,	  Mom,	  Dad,	  Christen	  and	  Karen,	  for	  their	  support	  through	  this	  time,	  particularly	  for	  their	  invaluable	  advice	  and	  engulfing	  me	  in	  a	  cloud	  of	  Burnett	  laughter.	  	  To	  João,	  for	  always	  knowing	  how	  to	  make	  me	  happy,	  supporting	  me,	  and	  going	  on	  amazing	  adventures	  with	  me	  all	  around	  the	  world!	  And	  to	  my	  friends,	  Karen,	  Jillian,	  Liz,	  and	  Chelsea,	  for	  being	  understanding	  and	  always	  by	  my	  side	  no	  matter	  the	  distance.	  	  	   Finally,	  I	  cannot	  express	  how	  much	  my	  time	  at	  the	  UBC	  Dairy	  has	  meant	  to	  me;	  I	  have	  met	  the	  most	  amazing	  people	  at	  that	  farm.	  Most	  importantly	  João,	  who	  without	  the	  farm	  I	  would	  have	  never	  met.	  Augusto,	  Ruby,	  Heather	  and	  Maria,	  who	  have	  all	  been	  the	  best	  of	  friends	  -­‐	  from	  early	  mornings	  to	  unlucky	  night	  checks	  that	  went	  just	  a	  little	  too	  long,	  they	  were	  all	  there	  making	  even	  the	  worst	  situations	  fun.	  To	  the	  original	  Repro	  Team	  (Augusto,	  Bruna,	  Maria,	  and	  Cristiano),	  thank	  you	  for	  all	  the	  amazing	  memories!	  And	  last	  but	  not	  least,	  thank	  you	  to	  the	  farmers,	  Ted,	  Brad,	  Barry,	  Bill,	  Andrew,	  Eric	  and	  Hendrik	  for	  all	  the	  help,	  and	  for	  always	  covering	  my	  back	  when	  it	  needed	  covering	  ;)	  	   1	  Chapter	  1:	  Introduction	  1.1	  Introduction	  to	  stress	  	   The	  study	  of	  stress	  has	  been	  a	  topic	  of	  interest	  for	  many	  years	  in	  both	  humans	  and	  in	  non-­‐human	  animals.	  	  The	  word	  ‘stress’	  has	  been	  used	  loosely	  in	  popular	  magazines	  and	  newspapers	  but	  within	  the	  scientific	  literature	  the	  term	  has	  a	  more	  strict	  definition;	  however,	  even	  within	  the	  scientific	  field,	  different	  researchers	  have	  their	  own	  definition	  of	  stress.	  Unlike	  most	  diseases,	  stress	  has	  no	  distinct	  prognosis,	  which	  makes	  it	  much	  more	  difficult	  to	  define	  (Moberg	  and	  Mench,	  2000).	  Broom	  and	  Johnson	  (1993)	  defined	  stress	  as	  “an	  environmental	  effect	  on	  an	  individual	  which	  overtaxes	  its	  control	  systems	  and	  reduces	  its	  fitness	  or	  appears	  likely	  to	  do	  so”,	  while	  Mormède	  et	  al.	  (2007)	  defined	  stress	  as	  a	  “general	  term	  used	  to	  describe	  environmental	  factors	  soliciting	  adaptation	  mechanisms	  and	  the	  response	  to	  these	  challenges”.	  In	  this	  thesis,	  stress	  will	  be	  defined	  as	  a	  biological	  response	  elicited	  when	  an	  individual	  perceives	  a	  threat	  to	  its	  homeostasis	  (Moberg	  and	  Mench,	  2000).	  Although	  the	  word	  stress	  is	  commonly	  thought	  to	  imply	  a	  negative	  event,	  it	  is	  not	  inherently	  bad.	  Activities	  such	  as	  exercise	  and	  courtship	  are	  events	  that	  have	  the	  biological	  effects	  of	  stress	  but	  may	  be	  interpreted	  by	  certain	  individuals	  as	  exhilarating	  or	  rewarding	  (Broom	  and	  Johnson,	  1993).	  This	  phenomenon	  is	  due	  to	  stress	  being	  contextual	  and	  highly	  dependent	  on	  how	  stimuli	  are	  perceived,	  and	  if	  the	  biological	  response	  elicited	  is	  warranted	  for	  that	  specific	  stimuli	  or	  not.	  Stress	  that	  is	  perceived	  as	  a	  positive	  condition	  is	  defined	  as	  eustress,	  while	  stress	  that	  is	  perceived	  as	  a	  negative	  condition	  and	  causes	  a	  reduction	  of	  well-­‐being	  is	  defined	  as	  distress	  (Trevisi	  and	  Bertoni,	  2009);	  for	  the	  remainder	  	   2	  of	  this	  thesis,	  the	  word	  ‘stress’	  will	  be	  used	  in	  reference	  to	  ‘distress’.	  Moreover,	  the	  stress	  response	  is	  also	  seen	  as	  beneficial	  due	  to	  its	  ability	  to	  create	  a	  state	  of	  adaptation	  in	  an	  animal	  where	  they	  have	  increased	  vigilance	  and	  blood	  flow	  to	  the	  extremities	  and	  vital	  organs	  that	  allow	  the	  animal	  to	  remove	  itself	  from	  harmful	  situations	  quickly	  (Broom	  and	  Johnson,	  1993).	  	  	  1.2	  The	  stress	  response	  	   Stress	  results	  from	  first,	  a	  stimulus	  leading	  to	  an	  imbalance	  of	  homeostasis,	  termed	  a	  stressor,	  followed	  by	  the	  corresponding	  defence	  reaction,	  termed	  the	  stress	  response	  (Möstl	  and	  Palme,	  2002).	  The	  stress	  response	  is	  inherently	  very	  important	  to	  animals	  because	  it	  allows	  for	  the	  perception	  of	  external	  stimuli	  that	  are	  threatening	  to	  its	  homeostasis,	  and	  allows	  the	  body	  to	  make	  necessary	  physiological	  and	  metabolic	  changes	  required	  to	  cope	  with	  the	  demand	  of	  a	  homeostatic	  challenge	  and	  defend	  itself	  against	  the	  threat	  (Moberg,	  1985;	  Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002).	  Moberg	  (1985)	  initially	  created	  a	  model	  of	  animal	  stress	  that	  was	  categorized	  into	  three	  general	  stages:	  stressor	  recognition,	  biological	  defence	  against	  the	  stressor,	  and	  the	  consequences	  of	  the	  stress	  response.	  	  The	  consequences	  resulting	  from	  the	  stress	  response	  are	  what	  characterize	  the	  stress	  as	  a	  positive	  or	  negative	  event.	  Stressor	  recognition	  is	  initiated	  from	  the	  central	  nervous	  system,	  where	  stimuli	  are	  assessed	  to	  determine	  if	  they	  are	  a	  threat	  and	  may	  cause	  a	  significant	  challenge	  to	  the	  animal,	  and	  thus	  considered	  a	  stressor.	  A	  very	  broad	  range	  of	  stressors	  are	  present	  in	  the	  natural	  world	  and	  may	  include	  anything	  from	  changes	  in	  temperature,	  to	  pain,	  or	  the	  presence	  of	  a	  predator.	  Once	  a	  stressor	  has	  been	  perceived	  as	  	   3	  such,	  whether	  this	  perception	  is	  appropriate	  or	  not,	  the	  animal	  mounts	  a	  biological	  response.	  	  	  The	  stress	  response	  has	  four	  main	  divisions:	  behavioural,	  autonomic	  nervous	  system,	  immune,	  and	  neuroendocrine	  (Moberg,	  2000).	  The	  behavioural	  response	  usually	  consists	  of	  actions	  that	  have	  the	  purpose	  of	  removing	  the	  animal	  from	  the	  stressful	  stimuli,	  such	  as	  avoiding	  a	  predator	  or	  taking	  refuge	  in	  the	  shade	  to	  decrease	  its	  internal	  temperature.	  This	  type	  of	  response	  is	  usually	  the	  first	  reaction	  of	  an	  animal,	  and	  although	  it	  may	  not	  be	  suitable	  or	  effective	  for	  certain	  stressors,	  it	  is	  thought	  to	  be	  the	  most	  biologically	  economic	  response	  in	  comparison	  with	  the	  other	  divisions	  of	  the	  stress	  response	  (Moberg,	  2000).	  	  Behavioural	  responses	  may	  vary	  greatly	  and	  even	  be	  inhibited	  in	  captivity	  and	  thus	  may	  be	  hard	  to	  assess	  in	  certain	  situations	  (Moberg,	  2000).	  	  The	  second	  line	  of	  defense	  for	  an	  animal	  is	  the	  autonomic	  nervous	  system	  response,	  which	  is	  the	  basis	  for	  the	  commonly	  known	  “fight	  or	  flight”	  response.	  It	  is	  a	  rapid	  and	  specific	  response	  where	  the	  sympathetic	  and	  parasympathetic	  systems	  alter	  many	  biological	  systems	  such	  as	  the	  cardiovascular	  system,	  gastrointestinal	  system,	  exocrine	  glands	  and	  adrenal	  medulla	  (Moberg,	  2000).	  The	  autonomic	  nervous	  system	  response	  results	  in	  many	  quick	  and	  dramatic	  reactions,	  such	  as	  increased	  heart	  rate	  and	  blood	  pressure,	  in	  response	  to	  acute	  stress	  situations;	  however,	  these	  responses	  last	  for	  quite	  a	  short	  period	  of	  time	  making	  them	  quite	  difficult	  and	  impractical	  to	  accurately	  measure	  (Moberg,	  1985).	  	  The	  immune	  system	  is	  also	  negatively	  impacted	  by	  stress	  due	  to	  the	  suppression	  of	  immune	  competence	  during	  stressful	  events	  (Moberg,	  2000).	  The	  link	  between	  the	  nervous	  	   4	  system	  and	  the	  immune	  system	  is	  thought	  to	  be	  through	  different	  mediators	  such	  as	  glucocorticoids,	  catecholamines	  and	  some	  endorphins	  (Dunn,	  1988).	  Although	  immune	  suppression	  is	  measurable,	  there	  is	  limited	  research	  on	  how	  this	  information	  can	  be	  interpreted	  (Moberg,	  2000).	  The	  effects	  stress	  has	  on	  the	  immune	  system	  are	  discussed	  in	  more	  detail	  below.	  Contrary	  to	  the	  other	  divisions	  of	  the	  stress	  response,	  the	  neuroendocrine	  system	  response	  has	  long	  lasting	  effects	  on	  the	  body	  and	  thus	  is	  much	  easier	  to	  measure.	  Stress	  causes	  activation	  of	  the	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  (HPA)	  axis	  and	  the	  sympathetic	  nervous	  system	  (SNS)	  (Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002),	  which	  stimulates	  the	  secretion	  of	  many	  stress	  mediators.	  These	  substances	  may	  compromise	  processes	  that	  are	  controlled	  by	  the	  pituitary,	  such	  as	  reproduction	  and	  metabolism,	  and	  thus	  negatively	  impact	  the	  animal’s	  fitness	  (Moberg,	  2000).	  	  	  1.2.1	  Acute	  stress	  versus	  chronic	  stress	  	   Stress	  can	  be	  described	  in	  two	  general	  conditions	  in	  relationship	  to	  the	  duration	  of	  the	  consequent	  responses:	  acute	  and	  chronic.	  Acute	  stress	  is	  defined	  as	  a	  short	  term	  and	  low	  magnitude	  condition	  that	  generally	  allows	  for	  a	  quick	  and	  complete	  recovery	  of	  homeostasis	  (Trevisi	  and	  Bertoni,	  2009).	  Acute	  stress	  responses	  may	  cause	  a	  shift	  of	  resources	  towards	  functions	  necessary	  for	  survival,	  such	  as	  arousal,	  vigilance,	  increased	  oxygenation	  and	  nutrition	  of	  the	  brain,	  heart	  and	  skeletal	  muscles,	  and	  subsequently	  down	  regulate	  functions	  unnecessary	  for	  survival	  at	  that	  specific	  moment	  such	  as	  eating,	  growth,	  and	  reproduction	  (Chrousos,	  2009).	  Overall,	  the	  acute	  stress	  response	  is	  thought	  to	  be	  	   5	  intrinsically	  beneficial	  for	  animals	  as	  it	  is	  essential	  for	  the	  survival	  of	  animals	  in	  the	  wild	  (Sapolsky,	  2000).	  	  On	  the	  contrary,	  chronic	  stress	  is	  characterised	  as	  a	  sustained	  stress	  response	  and/or	  the	  excessive	  secretion	  of	  stress	  mediators	  such	  as	  cortisol,	  epinephrine	  and	  norepinephrine	  (Chrousos,	  2009;	  Matteri	  et	  al.,	  2000);	  the	  condition	  is	  also	  characterized	  as	  an	  inability	  to	  adapt	  and	  recover	  homeostasis	  for	  an	  extended	  period	  of	  time	  (Trevisi	  and	  Bertoni,	  2009).	  Chronic	  stress	  can	  occur	  when	  the	  body	  experiences	  too	  many	  stressors	  or	  repeated	  exposure	  to	  the	  same	  stressor,	  such	  that	  the	  body	  is	  under	  a	  continuous	  stress	  response	  and	  unable	  to	  activate	  a	  relaxation	  response,	  eventually	  resulting	  in	  an	  overexposure	  of	  stress	  hormones	  (Trevisi	  and	  Bertoni,	  2009).	  Although	  dependent	  on	  the	  stressor,	  repeated	  exposure	  to	  the	  same	  stressor	  may	  also	  result	  in	  the	  loss	  of	  a	  stress	  response	  to	  that	  specific	  stressor,	  which	  is	  usually	  a	  result	  of	  desensitization	  (Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002).	  Overall,	  without	  the	  ability	  to	  adapt	  and	  recover	  homeostasis,	  increased	  production	  of	  stress	  hormones	  can	  cause	  many	  behavioural	  and	  somatic	  disorders	  (Chrousos,	  2009).	  	  	  1.3	  Regulation	  of	  the	  neuroendocrine	  stress	  response	  	   Two	  endocrinological	  systems	  are	  activated	  during	  stress	  events	  that	  mediate	  the	  stress	  response:	  the	  HPA	  axis	  and	  the	  SNS.	  Activation	  of	  the	  HPA	  axis	  and	  SNS	  is	  required	  to	  be	  able	  to	  achieve	  the	  optimal	  homeostasis,	  or	  eustasis,	  and	  is	  done	  by	  causing	  many	  physiological	  changes	  during	  stress	  events	  (Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002).	  Many	  different	  hormones	  and	  neurotransmitters	  are	  released	  into	  the	  body	  during	  the	  stress	  response	  	   6	  such	  as	  cortisol,	  vasopressin,	  oxytocin,	  epinephrine,	  and	  norepinephrine	  (Chrousos,	  2009;	  Matteri	  et	  al.,	  2000).	  Generally,	  the	  HPA	  axis	  is	  responsible	  for	  the	  production	  of	  glucocorticoids	  (e.g.:	  cortisol)	  while	  the	  SNS	  is	  responsible	  for	  the	  production	  of	  catecholamines	  (e.g.:	  epinephrine)	  (Matteri	  et	  al.,	  2000).	  	  	  1.3.1	  Hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  	   The	  three	  key	  hormones	  secreted	  with	  activation	  of	  the	  HPA	  axis:	  corticotrophin-­‐releasing	  hormone	  (CRH),	  adrenocorticotropin	  hormone	  (ACTH)	  and	  a	  glucocorticoid	  that	  is	  specific	  for	  each	  species,	  in	  cattle	  this	  hormone	  is	  cortisol.	  The	  HPA	  axis	  is	  controlled	  through	  a	  negative	  feed	  back	  loop,	  where	  the	  end	  product,	  cortisol,	  inhibits	  the	  production	  of	  the	  initiating	  substance,	  CRH.	  The	  initiating	  step	  of	  the	  neuroendocrine	  stress	  response	  is	  the	  synthesis	  of	  CRH	  from	  neurons	  located	  at	  the	  paraventricular	  nucleus	  in	  response	  to	  internal	  or	  external	  stimuli	  (Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002).	  The	  CRH	  travels	  from	  the	  paraventricular	  nucleus	  until	  the	  median	  eminence	  where	  it	  then	  travels	  through	  the	  hypothalamo-­‐hypophyseal	  portal	  system	  to	  the	  anterior	  lob	  of	  the	  pituitary	  (Aguilera,	  1998).	  Upon	  the	  arrival	  of	  CRH,	  ACTH	  is	  synthesized	  and	  secreted	  from	  the	  anterior	  pituitary	  into	  the	  blood	  system	  where	  it	  stimulates	  the	  secretion	  of	  cortisol	  from	  the	  cortex	  of	  the	  adrenal	  gland.	  In	  conjunction	  with	  CRH	  expression,	  arginine	  vasopressin	  (AVP)	  is	  also	  secreted	  from	  the	  CRH	  neurons	  that	  are	  responsible	  for	  ACTH	  secretion;	  the	  ACTH	  response	  from	  either	  CRH	  or	  AVP	  alone	  is	  much	  lower	  than	  when	  both	  peptides	  are	  secreted	  together	  (Scott	  and	  Dinan,	  1998).	  The	  ratio	  of	  CRH	  to	  AVP	  that	  is	  secreted	  to	  the	  anterior	  pituitary	  has	  been	  shown	  to	  change	  depending	  on	  different	  stimuli	  and	  stress	  	   7	  paradigms	  (Scott	  and	  Dinan,	  1998),	  such	  that	  chronic	  stress	  situations	  lead	  to	  a	  greater	  increase	  in	  AVP	  than	  CRH	  (Aguilera,	  1998).	  The	  increased	  ratio	  of	  AVP	  to	  CRH	  found	  during	  chronic	  stress	  is	  thought	  to	  be	  necessary	  so	  that	  animals	  can	  still	  respond	  to	  novel	  stimuli	  during	  a	  time	  of	  desensitization	  that	  can	  be	  found	  with	  repeated	  exposure	  to	  the	  same	  stressor	  (Aguilera,	  1998;	  Scott	  and	  Dinan,	  1998).	  	  1.3.2	  Sympathetic	  nervous	  system	  	   The	  SNS	  stress	  response	  is	  characterized	  as	  the	  “fight	  or	  flight”	  response,	  which	  quickly	  increases	  the	  activity	  and	  readiness	  of	  the	  animal.	  Epinephrine	  and	  norepinephrine	  are	  two	  important	  catecholamines	  that	  are	  produced	  by	  the	  activation	  of	  the	  SNS	  during	  stressful	  events	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  In	  contrast	  to	  glucocorticoids,	  which	  take	  20	  –	  30	  min	  to	  have	  effects	  on	  the	  body,	  catecholamines	  are	  fast	  acting	  –	  a	  characteristic	  that	  is	  crucial	  during	  emergency	  situations	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  Once	  an	  animal	  perceives	  a	  stimulus	  as	  threatening,	  epinephrine	  and	  norepinephrine	  are	  released	  from	  both	  the	  adrenal	  medulla	  and	  nerve	  terminals	  that	  are	  part	  of	  the	  SNS	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  The	  synthesis	  of	  epinephrine	  in	  the	  adrenal	  medulla	  is	  controlled	  by	  the	  production	  of	  glucocorticoids	  (Wurtman,	  2002).	  Glucocorticoids	  travel	  from	  the	  adrenal	  cortex	  to	  the	  medulla	  via	  the	  portal	  vascular	  system	  within	  the	  adrenal	  gland	  where	  they	  induce	  the	  production	  of	  phenylethanolamine-­‐N-­‐methyltransferase	  (PNMT),	  which	  is	  the	  rate-­‐limiting	  enzyme	  needed	  for	  the	  synthesis	  of	  epinephrine	  (Wurtman,	  2002).	  Biological	  responses	  from	  epinephrine	  and	  norepinephrine	  include	  decreased	  visceral	  activity	  and	  digestion,	  and	  increased	  blood	  flow	  to	  the	  brain,	  visual	  acuity,	  gas	  exchange	  efficiency	  in	  the	  lungs,	  	   8	  break	  down	  of	  glycogen	  to	  glucose,	  increased	  heart	  rate	  and	  vasodilation	  in	  muscles	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  Overall,	  the	  SNS	  biological	  response	  increases	  bodily	  functions,	  such	  as	  alertness,	  that	  may	  benefit	  the	  animal	  during	  an	  acute	  emergency,	  and	  decrease	  others,	  such	  as	  digestion,	  that	  will	  not	  benefit	  them	  at	  that	  specific	  time;	  although	  these	  responses	  are	  valuable	  during	  acute	  stress,	  they	  become	  overtaxing	  when	  persistent	  (Romero	  and	  Butler,	  2007)	  	  1.4	  Biological	  responses	  to	  glucocorticoid	  production	  	   The	  biological	  responses	  to	  glucocorticoid	  production	  can	  be	  summarized	  as	  five	  broad	  actions:	  increasing	  blood	  glucose	  concentrations,	  altering	  behaviour,	  inhibiting	  growth,	  inhibiting	  reproduction	  and	  modulating	  the	  immune	  system	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  The	  role	  of	  these	  biological	  responses	  is	  thought	  to	  function	  as	  a	  method	  to	  help	  the	  animal	  recover	  from	  a	  stressor,	  and	  down	  regulate	  systems	  whose	  functions	  are	  not	  mandatory	  at	  that	  time.	  Increased	  glucose	  availability	  provides	  energy	  for	  the	  body	  tissues	  for	  the	  increased	  metabolic	  demands	  associated	  with	  an	  emergency	  situation	  (Miller	  and	  O’Callaghan,	  2002).	  	  Elevation	  of	  blood	  glucose	  is	  done	  indirectly	  by	  increasing	  the	  breakdown	  of	  glycogen	  and	  by	  stimulating	  gluconeogenesis;	  additionally	  glucocorticoids	  reduce	  the	  uptake	  of	  glucose	  by	  targeting	  tissues	  thus	  increasing	  the	  amount	  of	  glucose	  available	  for	  tissues	  that	  are	  required	  to	  respond	  to	  the	  stressor	  (e.g.:	  muscles)	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  The	  specific	  mechanism	  on	  how	  glucocorticoids	  affect	  behaviour	  is	  unknown;	  although	  the	  behavioural	  response	  is	  not	  known	  to	  be	  specific	  to	  a	  stressor,	  it	  is	  reportedly	  dependent	  upon	  how	  the	  stressor	  is	  presented	  and	  perceived	  by	  the	  animal	  	   9	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  Glucocorticoids	  are	  known	  to	  inhibit	  growth	  by	  blocking	  the	  secretion	  of	  growth	  hormone	  from	  the	  pituitary,	  decreasing	  the	  sensitivity	  of	  target	  cells	  to	  growth	  hormone	  and	  inhibiting	  overall	  protein	  synthesis	  in	  the	  body	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  The	  effects	  of	  glucocorticoids	  are	  not	  easily	  seen	  in	  the	  over	  all	  growth	  of	  an	  animal	  unless	  there	  is	  prolonged	  exposure,	  such	  as	  during	  chronic	  stress.	  The	  modulations	  in	  which	  glucocorticoids	  have	  on	  the	  immune	  system	  and	  reproduction	  are	  discussed	  in	  detail	  below.	  	  	  1.4.1	  Effects	  of	  stress	  on	  the	  immune	  system	  	   Dysfunction	  of	  the	  HPA	  axis	  has	  been	  shown	  to	  negatively	  impact	  animal	  health	  (Chrousos,	  2009).	  Chronic	  stress-­‐induced	  HPA	  activity	  has	  been	  associated	  with	  reduced	  feed	  intake,	  negative	  energy	  balance,	  and	  increased	  metabolic	  rate	  (Rushen	  et	  al.,	  2010);	  however,	  most	  health	  disorders	  have	  been	  related	  to	  immunosuppression.	  Although	  the	  acute	  stress	  response	  has	  been	  associated	  with	  the	  enhancement	  of	  the	  immune	  system	  through	  release	  of	  blood	  leukocytes	  from	  the	  blood	  to	  organs	  such	  as	  lymph	  nodes,	  skin	  and	  bone	  marrow	  (Dhabhar	  and	  McEwen,	  1997;	  Sapolsky,	  2000),	  many	  researchers	  agree	  that	  chronic	  stress	  has	  detrimental	  effects	  on	  the	  immune	  system	  (Dhabhar	  and	  McEwen,	  1997;	  Chrousos,	  2009).	  It	  is	  suggested	  that	  the	  initial	  enhancement	  of	  the	  immune	  system	  is	  a	  defensive	  response	  to	  a	  stressor,	  and	  the	  succeeding	  immunosuppressive	  response	  is	  to	  prevent	  an	  overreaction	  to	  these	  defensive	  responses	  (Rushen	  et	  al.,	  2010).	  The	  immunosuppressive	  effects	  of	  increased	  concentrations	  of	  glucocorticoids	  have	  been	  seen	  in	  many	  farm	  animals	  such	  as	  in	  dairy	  cattle	  and	  pigs	  (Hopster	  et	  al.,	  1998;	  Tuchscherer	  et	  	   10	  al.,	  2004).	  Generally,	  glucocorticoids	  impede	  the	  immune	  system	  by	  inhibiting	  the	  action	  of	  cytokines	  and	  other	  mediators	  that	  promote	  immune	  and	  inflammatory	  responses	  (Rushen	  et	  al.,	  2010).	  In	  dairy	  cattle,	  increased	  concentrations	  of	  glucocorticoids	  have	  been	  reportedly	  linked	  to	  the	  depression	  of	  anti-­‐body	  concentrations	  (through	  either	  suppression	  of	  antibody	  production	  or	  increased	  antibody	  catabolism),	  inducing	  neutrophilia	  (migration	  of	  neutrophils	  out	  of	  tissues	  and	  into	  blood),	  and	  reducing	  the	  phagocytic	  functions	  in	  monocytes	  and	  macrophages	  (Roth,	  1985).	  In	  humans,	  there	  is	  evidence	  that	  chronic	  stress	  can	  induce	  immune	  dysfunction	  reducing	  the	  activation	  and	  proliferation	  of	  T	  and	  B	  cells	  (Sapolsky	  et	  al.,	  2000)	  and	  switching	  the	  immune	  response	  from	  T1	  mediated	  (cellular)	  to	  T2	  mediated	  (humoral),	  which	  may	  cause	  the	  body	  to	  be	  vulnerable	  to	  certain	  infections	  (Chrousos,	  2009).	  	  Comin	  et	  al.	  (2013)	  reported	  that	  cows	  that	  were	  clinically	  compromised	  (e.g.:	  laminitis,	  metritis	  or	  mastitis)	  had	  higher	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  than	  those	  that	  had	  an	  absence	  of	  disease.	  Many	  researchers	  have	  reported	  that	  intramammary	  infections	  increase	  cortisol	  concentrations	  in	  dairy	  cattle	  (Huszenicza	  et	  al.,	  2004).	  Additionally,	  Lavon	  et	  al.	  (2008)	  reported	  that	  animals	  administrated	  E.	  coli	  endotoxin	  (using	  both	  intramammary	  and	  IV	  injection)	  showed	  a	  significant	  increase	  in	  plasma	  cortisol	  when	  compared	  to	  control	  animals	  suggesting	  that	  an	  inflammatory	  response	  may	  induce	  increases	  in	  cortisol.	  Although	  it	  is	  hard	  to	  determine	  the	  causal	  relationship	  between	  infection	  and	  cortisol	  concentrations	  (i.e.:	  whether	  infection	  causes	  increases	  in	  cortisol	  concentrations,	  or	  vice	  versa),	  there	  is	  mounting	  evidence	  suggesting	  that	  clinical	  disease	  may	  initiate	  a	  stress	  response	  in	  animals.	  	   11	  	  1.4.2	  Effects	  of	  stress	  on	  reproduction	  	   The	  effects	  that	  stress	  has	  on	  reproduction	  in	  humans	  have	  been	  thoroughly	  studied;	  examples	  of	  these	  stressors	  include	  infectious	  diseases,	  psychiatric	  disorders,	  surgical	  trauma,	  and	  strenuous	  exercise	  (Rivier	  and	  Rivest,	  1991).	  In	  cows,	  stressors	  such	  as	  isolation,	  transport	  and	  restraint	  have	  been	  found	  to	  interfere	  with	  endocrine	  events	  preceding	  ovulation	  and	  thus	  resulting	  in	  ovulation	  failure	  (Moberg,	  2000).	  Stress	  affects	  the	  hypothalamus-­‐pituitary-­‐gonadal	  (HPG)	  axis	  at	  the	  hypothalamus	  (inhibiting	  GnRH	  secretion),	  at	  the	  pituitary	  gland	  (interfering	  with	  gonadotropin-­‐releasing	  hormone	  	  (GnRH)	  induced	  luteinizing	  hormone	  (LH)	  release)	  and,	  to	  a	  lesser	  extent,	  at	  the	  gonads	  (altering	  the	  stimulatory	  effect	  of	  gonadotropins	  on	  sex	  steroid	  secretion)	  (Rivier	  and	  Rivest,	  1991).	  Short-­‐term	  and	  long-­‐term	  stressors	  may	  affect	  reproduction	  differently:	  short-­‐term	  stressors	  have	  been	  shown	  to	  have	  neutral	  or	  inhibitory	  effects	  in	  dairy	  cattle	  (von	  Borell	  et	  al.,	  2007),	  while	  detrimental	  effects	  on	  reproduction	  generally	  appear	  to	  result	  from	  long-­‐term	  stress	  (Tilbrook	  et	  al.,	  2000).	  Short-­‐term	  stressors	  have	  been	  shown	  to	  have	  stimulatory	  effects	  on	  reproduction	  with	  certain	  species	  (e.g.:	  increased	  LH),	  but	  within	  the	  dairy	  cattle	  literature	  stimulatory	  effects	  have	  rarely	  been	  reported.	  	  	  	  High	  concentrations	  of	  cortisol	  have	  been	  shown	  to	  suppress	  pulsatile	  GnRH	  secretion,	  and	  subsequently	  reduce	  LH	  pulse	  frequency	  (von	  Borell	  et	  al.,	  2007);	  it	  is	  not	  known	  if	  the	  suppression	  of	  GnRH	  secretion	  is	  primarily	  due	  to	  the	  high	  concentrations	  of	  cortisol	  or	  if	  it	  is	  due	  to	  high	  concentrations	  of	  CRH	  (Moberg,	  2000).	  Due	  to	  disruptions	  in	  GnRH	  and	  LH	  pulses,	  stress	  has	  detrimental	  effects	  on	  ovarian	  cyclicity,	  reduced	  estradiol	  	   12	  production	  by	  growing	  follicles,	  and	  often	  results	  in	  ovulation	  failure	  (Dobson	  et	  al.,	  2003;	  Smith	  et	  al.,	  2003).	  Reduced	  estradiol	  production	  also	  has	  negative	  effects	  on	  estrous	  behaviour	  leading	  to	  poor	  estrous	  detection	  and	  timing	  of	  artificial	  insemination	  (Dobson	  and	  Smith,	  2000).	  Furthermore,	  glucocorticoids	  have	  been	  shown	  to	  exert	  an	  inhibitory	  effect	  on	  the	  GnRH	  neuron,	  the	  pituitary	  gonadotroph,	  and	  the	  gonads,	  and	  render	  target	  tissues	  resistant	  to	  gonadal	  hormones	  (Charmandari	  et	  al.,	  2005).	  It	  has	  also	  been	  hypothesized	  that	  stress	  may	  have	  an	  effect	  on	  the	  feedback	  actions	  of	  inhibin,	  since	  glycoprotein	  is	  a	  major	  feedback	  regulator	  of	  the	  secretion	  of	  follicle-­‐stimulating	  hormone	  (FSH)	  (Tilbrook	  et	  al.,	  2000).	  	  Many	  researchers	  have	  shown	  that	  chronic	  stress	  due	  to	  lameness	  has	  detrimental	  effects	  on	  dairy	  cattle	  fertility.	  Walker	  et	  al.	  (2008)	  reported	  that	  cattle	  experiencing	  chronic	  lameness	  have	  altered	  estrous	  behaviour	  and	  hypothesized	  this	  may	  be	  due	  to	  disruptions	  of	  the	  pulsatile	  patterns	  of	  GnRH	  that	  leads	  to	  insufficient	  gonadotropin	  support	  at	  the	  ovary,	  resulting	  in	  low	  progesterone	  concentrations,	  and	  subsequently	  causing	  decreased	  estrous	  behaviour.	  Progesterone	  priming	  in	  the	  luteal	  phase	  prior	  to	  estrus	  has	  been	  suggested	  to	  increase	  estradiol	  receptors	  in	  the	  hypothalamus,	  making	  it	  more	  sensitive	  to	  estradiol,	  resulting	  in	  stronger	  estrous	  expression	  (Walker	  et	  al.,	  2008).	  Moreover,	  Dobson	  and	  Esslemont	  (2002)	  reported	  that	  bouts	  of	  clinical	  mastitis	  or	  infection	  in	  the	  uterus	  have	  negative	  effects	  on	  fertility	  in	  dairy	  cattle.	  Additionally,	  extended	  ACTH	  administration	  has	  been	  shown	  to	  create	  follicular	  cysts	  in	  dairy	  cattle,	  due	  to	  the	  inhibition	  of	  LH	  but	  not	  of	  FSH	  (Dobson	  et	  al.,	  2000).	  Furthermore,	  chronic	  stress	  can	  lead	  to	  such	  low	  LH	  pulses	  that	  the	  estrus	  cycle	  can	  not	  be	  completed	  and	  the	  cow	  enters	  	   13	  anestrus	  (Dobson	  and	  Smith,	  2000)	  	  1.5	  How	  is	  stress	  measured?	  	   Of	  all	  the	  stress	  mediators,	  cortisol	  is	  the	  most	  common	  physiological	  parameter	  used	  to	  measure	  stress,	  and	  has	  therefore	  been	  validated	  as	  a	  reliable	  measure	  of	  the	  stress	  response	  in	  animals	  such	  as	  cows	  (Christison	  and	  Johnson,	  1972),	  goats	  (Aoyama	  et	  al.,	  2008),	  horses	  (Visser	  et	  al.,	  2008),	  pigs	  (Turner	  et	  al.,	  2005),	  and	  sheep	  (Smith	  and	  Dobson,	  2002).	  The	  preference	  for	  the	  quantification	  of	  glucocorticoids,	  rather	  than	  catecholamines,	  is	  a	  result	  of	  the	  fast	  clearance	  rate	  of	  catecholamines,	  making	  them	  much	  more	  difficult	  to	  measure	  in	  comparison	  to	  glucocorticoids	  (Romero	  and	  Butler,	  2007).	  Cortisol	  can	  be	  analyzed	  from	  many	  different	  mediums,	  most	  notably	  from	  the	  blood	  (Lefcourt	  et	  al.,	  1993),	  saliva	  (Negrão	  et	  al.,	  2004)	  and	  faeces	  (Möstl	  et	  al.,	  2002),	  and	  more	  recently	  from	  hair	  (Comin	  et	  al,	  2011).	  Each	  of	  these	  media	  have	  been	  individually	  demonstrated	  in	  cattle,	  and	  have	  been	  shown	  to	  represent	  HPA	  axis	  activation	  over	  different	  periods	  of	  time.	  Blood,	  saliva,	  and	  faeces	  are	  all	  mediums	  useful	  for	  measuring	  cortisol	  produced	  as	  a	  result	  of	  acute	  stress	  responses	  but	  are	  not	  able	  to	  capture	  long-­‐term	  increases	  in	  circulating	  cortisol;	  the	  use	  of	  hair	  to	  measure	  cortisol	  as	  an	  indicator	  of	  chronic	  stress	  responses	  has	  recently	  been	  a	  research	  topic	  of	  interest.	  	  Despite	  the	  wide	  use	  of	  cortisol	  concentrations	  as	  a	  marker	  of	  the	  stress	  response,	  interpretation	  can	  be	  quite	  complex	  due	  to	  the	  diurnal	  and	  pulsatile	  patterns	  of	  cortisol	  secretion,	  thus	  leading	  to	  substantial	  individual	  variation	  within	  the	  animal	  and	  throughout	  the	  day;	  cortisol	  concentrations	  are	  highest	  in	  the	  morning	  and	  diminish	  as	  the	  day	  	   14	  progresses	  (Thun	  et	  al.,	  1981;	  Lefcourt	  et	  al.,	  1993).	  Circadian	  rhythms	  of	  cortisol	  are	  driven	  mainly	  by	  the	  innate	  “biologic	  clock”,	  which	  is	  an	  internal	  timekeeping	  system	  that	  allows	  organisms	  to	  anticipate	  and	  prepare	  for	  changes	  within	  the	  environment	  and	  thus	  behave	  appropriately	  for	  the	  time	  of	  day	  (Chung	  et	  al.,	  2011).	  Ultradian	  rhythms	  of	  cortisol	  are	  produced	  by	  the	  pulsatile	  fashion	  that	  cortisol	  is	  secreted	  from	  the	  adrenal	  gland	  (Lefcourt	  et	  al.,	  1993).	  The	  pulsatile	  nature	  of	  cortisol	  release	  is	  important	  to	  consider	  when	  measuring	  chronic	  stress,	  as	  several	  samples	  per	  day	  would	  be	  necessary	  to	  control	  for	  the	  variations	  of	  cortisol	  throughout	  the	  day	  (Rushen	  et	  al.,	  2010);	  when	  measuring	  acute	  stress,	  it	  is	  important	  to	  control	  for	  the	  time	  of	  day	  the	  sample	  is	  collected.	  Handling	  and	  restraint	  of	  dairy	  cattle	  needed	  for	  blood	  and	  saliva	  collection	  has	  been	  shown	  to	  rapidly	  increase	  plasma	  cortisol	  and	  consequently	  may	  confound	  sampling	  results	  (Cook	  et	  al.,	  2000),	  thus	  feedback-­‐free	  sampling	  methodologies	  are	  desirable.	  It	  is	  also	  noteworthy	  to	  mention	  that	  the	  release	  of	  cortisol	  during	  stress	  responses	  has	  been	  shown	  to	  be	  stressor	  dependant	  (Pacak	  and	  Palkovits,	  2001),	  and	  does	  not	  occur	  with	  every	  stressor	  (Broom	  and	  Johnson,	  1993).	  For	  example,	  in	  comparison	  with	  control	  mice,	  immobilization	  was	  shown	  to	  greatly	  increase	  plasma	  ACTH,	  norepinephrine	  and	  epinephrine	  in	  relatively	  equal	  amounts,	  pain	  was	  shown	  to	  increase	  all	  three	  with	  norepinephrine	  increasing	  almost	  twice	  as	  much	  as	  the	  others,	  and	  cold	  stress	  was	  shown	  to	  increase	  norepinephrine	  but	  not	  ACTH	  or	  epinephrine	  (Pacak	  and	  Palkovits,	  2001).	  Although	  the	  stress	  responses	  varied	  in	  hormone	  profile	  between	  stressors,	  they	  were	  shown	  to	  be	  consistent	  within	  the	  same	  stressor.	  	  	   15	  1.5.1	  Using	  blood	  to	  measure	  cortisol	  	   The	  use	  of	  blood	  as	  a	  medium	  to	  measure	  cortisol	  has	  been	  widely	  used	  within	  dairy	  cattle	  research	  to	  demonstrate	  the	  stress	  responses	  associated	  with	  common	  practices	  such	  as	  handling	  (Cook	  et	  al.,	  2000),	  transportation	  (Lay	  et	  al.,	  1996),	  regrouping	  (Friend	  et	  al.,	  1977),	  dehorning	  (Stafford	  and	  Mellor,	  2005),	  and	  overstocking	  (Friend	  et	  al.,	  1979).	  	  The	  analysis	  of	  plasma	  for	  cortisol	  represents	  the	  concentration	  of	  the	  free	  and	  bonded	  fraction	  of	  cortisol	  that	  is	  present	  in	  the	  blood	  at	  the	  time	  of	  sample	  collection	  (Mormède	  et	  al.,	  2007).	  Although	  the	  use	  of	  blood	  is	  very	  practical	  and	  well	  validated,	  it	  has	  many	  disadvantages;	  in	  addition	  to	  being	  affected	  by	  handling	  (Cook	  et	  al.,	  2000),	  and	  circadian	  rhythms	  of	  cortisol	  release	  (Thun	  et	  al.,	  1981),	  repeated	  blood	  sampling	  has	  also	  been	  shown	  to	  increase	  cortisol	  concentrations	  (Hopster	  et	  al.,	  1999).	  Under	  certain	  experimental	  designs,	  sampling	  concerns	  may	  be	  alleviated	  using	  remote	  sampling	  procedures	  (e.g.:	  a	  very	  long	  catheter),	  and	  by	  standardizing	  the	  time	  of	  day	  samples	  are	  collected	  (Negrão	  et	  al.,	  2004).	  	  1.5.2	  Using	  saliva	  to	  measure	  cortisol	  	   Sampling	  of	  saliva	  is	  considered	  to	  be	  a	  less	  invasive	  method	  in	  comparison	  to	  blood	  sampling	  (Möstl	  and	  Palme,	  2002);	  however,	  some	  researchers	  suggest	  it	  is	  not	  completely	  stress-­‐free	  because	  restraint	  is	  still	  needed	  for	  adult	  cows	  (Negrão	  et	  al.,	  2004).	  Cortisol	  enters	  the	  saliva	  by	  passive	  transfer,	  is	  unaffected	  by	  salivary	  flow	  rate	  (Negrão	  et	  al.,	  2004),	  and	  is	  detectable	  without	  delay	  in	  plasma	  cortisol	  concentrations	  (Mormède	  et	  al.,	  	   16	  2007;	  Yates	  et	  al.,	  2010).	  	  In	  contrast	  with	  plasma	  cortisol,	  salivary	  cortisol	  only	  represents	  the	  free	  fraction	  of	  cortisol	  resulting	  in	  lower	  overall	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  saliva	  than	  plasma;	  consequently	  samples	  must	  be	  concentrated	  before	  extraction	  and	  sometimes	  may	  be	  too	  low	  to	  be	  detected	  by	  saliva	  cortisol	  test	  kits	  (Negrão	  et	  al.,	  2004).	  During	  stress	  events	  the	  free	  fraction	  of	  cortisol	  increases	  more	  than	  the	  bonded	  fraction,	  thus	  some	  researchers	  suggest	  that	  measuring	  the	  free	  fraction	  of	  cortisol	  is	  a	  better	  measure	  of	  the	  stress	  response	  than	  measuring	  both	  the	  free	  and	  bonded	  fractions	  together,	  as	  done	  in	  plasma	  cortisol	  analysis	  (Mormède	  et	  al.,	  2007).	  Like	  plasma	  cortisol,	  salivary	  cortisol	  can	  be	  measured	  at	  a	  fixed	  time	  before	  and	  after	  an	  imposed	  stress,	  which	  is	  advantageous	  if	  a	  specific	  stressor	  is	  to	  be	  tested	  (Negrão	  et	  al.,	  2004).	  Sampling	  saliva	  can	  be	  disadvantageous	  in	  free	  moving	  animals	  because,	  although	  less	  affected	  than	  plasma,	  the	  effects	  of	  restraint	  and	  circadian	  rhythms	  may	  still	  confound	  results	  (Möstl	  and	  Palme,	  2002).	  	  	  1.5.3	  Using	  faeces	  to	  measure	  cortisol	  	   	  In	  contrast	  to	  plasma	  and	  salivary	  cortisol	  concentrations,	  faecal	  cortisol	  metabolite	  concentrations	  are	  less	  responsive	  to	  small	  changes	  in	  diurnal	  fluctuations	  of	  circulating	  cortisol,	  and	  reflect	  cortisol	  concentrations	  from	  10	  to	  12	  hr	  prior	  to	  faecal	  collection	  (Möstl	  et	  al.,	  2002);	  faecal	  sampling	  is	  reported	  to	  be	  a	  feedback-­‐free	  method	  of	  measuring	  HPA	  axis	  activation	  as	  it	  is	  a	  less	  invasive	  procedure	  and	  is	  easier	  to	  collect	  than	  saliva	  and	  plasma	  (Möstl	  and	  Palme,	  2002).	  Faecal	  cortisol	  metabolite	  analysis	  represents	  an	  integrated	  hormone	  profile	  of	  HPA	  activity	  and	  is	  not	  solely	  a	  point	  measure	  like	  when	  	   17	  analysing	  from	  saliva	  and	  blood	  (Sheriff	  et	  al.,	  2010).	  Due	  to	  rapid	  digestion	  of	  glucocorticoids,	  faecal	  cortisol	  metabolite	  concentrations	  must	  be	  measured	  instead	  of	  true	  cortisol	  concentrations	  (Palme	  et	  al.,	  1996);	  11,	  17-­‐dioxoandrostanes,	  a	  group	  of	  glucocorticoid	  metabolites,	  have	  been	  found	  to	  parallel	  cortisol	  concentrations	  found	  in	  blood	  (Möstl	  et	  al.,	  2002).	  A	  disadvantage	  of	  using	  faeces	  to	  measure	  the	  stress	  response	  is	  that	  the	  time	  period	  between	  the	  application	  of	  a	  stressor	  and	  collection	  of	  the	  faeces	  is	  not	  easily	  controlled	  because	  it	  relies	  heavily	  on	  the	  passage	  rate	  of	  digesta	  (Negrão	  et	  al.,	  2004).	  	  	  1.5.4	  Using	  hair	  to	  measure	  cortisol	  	   Sampling	  concerns	  and	  the	  lack	  of	  a	  reliable	  method	  for	  measuring	  chronic	  stress	  in	  farm	  animals	  has	  contributed	  to	  the	  need	  for	  non-­‐invasive	  cortisol	  sampling	  methods	  which	  can	  reflect	  long-­‐term	  changes	  in	  cortisol	  (Moberg	  and	  Mench,	  2000);	  this	  pressure	  has	  resulted	  in	  the	  development	  of	  methodologies	  for	  the	  use	  of	  hair	  cortisol	  as	  a	  measure	  of	  chronic	  stress.	  Hair	  assays	  have	  been	  used	  for	  numerous	  purposes	  such	  as	  DNA	  extraction	  (Morin	  et	  al.,	  1994),	  drug	  tests,	  and	  measurement	  of	  trace	  metals	  and	  sex	  hormones	  (Wheeler	  et	  al.,	  1998).	  	  	  Hair	  cortisol	  has	  been	  demonstrated	  as	  a	  measure	  of	  chronic	  stress	  in	  rhesus	  macaques	  (Davenport	  et	  al.,	  2008),	  rock	  hyraxes	  (Koren	  et	  al.,	  2008),	  dairy	  cows	  (Comin	  et	  al.,	  2011),	  and	  dairy	  calves	  (González	  de	  la	  Vara	  et	  al.,	  2011).	  Hair	  cortisol	  concentrations	  represent	  the	  accumulation	  of	  the	  free	  fraction	  of	  cortisol	  from	  the	  blood	  as	  the	  hair	  grows;	  the	  slow	  incorporation	  of	  cortisol	  into	  hair	  provides	  a	  long-­‐term	  endocrine	  profile	  that	  is	  a	  measure	  of	  the	  hormonal	  activity	  of	  the	  animal	  averaged	  	   18	  over	  a	  chosen	  period	  (Accorsi	  et	  al.,	  2008;	  Moya	  et	  al.,	  2013).	  Circadian	  variations	  and	  acute	  stress	  responses	  do	  not	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations,	  and	  thus	  hair	  appears	  to	  be	  an	  ideal	  medium	  to	  measure	  chronic	  activation	  of	  the	  HPA	  axis	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  With	  the	  emergence	  of	  hair	  cortisol	  as	  a	  new	  measure	  of	  chronic	  stress,	  standardized	  methodology	  for	  lactating	  dairy	  cows	  needs	  to	  be	  formulated	  such	  that	  values	  can	  be	  easily	  compared	  between	  animals	  and	  over	  experiments.	  Moreover,	  the	  relationship	  between	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  and	  common	  stressors	  (i.e.:	  lameness,	  metritis,	  heat	  stress,	  etc.)	  that	  affect	  dairy	  cows	  under	  current	  management	  systems	  are	  not	  yet	  clear.	  	  1.6	  Important	  concepts	  when	  using	  hair	  for	  the	  measurement	  of	  stress	  	  	   As	  using	  hair	  as	  a	  medium	  to	  measure	  cortisol	  concentrations	  is	  quite	  new	  in	  the	  field	  of	  dairy	  cattle	  science,	  it	  is	  important	  to	  understand	  how	  cortisol	  is	  incorporated	  into	  the	  hair	  and	  which	  factors	  may	  affect	  the	  incorporation	  and	  extraction	  of	  cortisol	  from	  hair.	  These	  topics	  are	  discussed	  below.	  	  1.6.1	  How	  is	  cortisol	  incorporated	  into	  hair?	  	  Several	  mechanisms	  have	  been	  proposed	  as	  to	  how	  cortisol	  is	  incorporated	  into	  hair.	  The	  most	  common	  hypothesis,	  which	  has	  been	  used	  to	  explain	  the	  incorporation	  of	  drugs	  into	  human	  hair,	  is	  that	  the	  free	  fraction	  of	  cortisol	  enters	  the	  hair	  at	  the	  medulla	  of	  the	  hair	  shaft	  through	  passive	  diffusion	  from	  the	  blood	  (Pragst	  and	  Balikova,	  2006).	  It	  has	  also	  been	  hypothesized	  that	  cortisol	  may	  be	  deposited	  into	  the	  completed	  hair	  shaft	  by	  sebum	  or	  	   19	  sweat	  (Pragst	  and	  Balikova,	  2006);	  however,	  extensive	  research	  has	  not	  been	  done	  to	  confirm	  this	  theory	  (Russell	  et	  al.,	  2012).	  The	  free	  fraction	  of	  cortisol	  is	  diffused	  from	  the	  blood	  capillaries,	  which	  bathe	  the	  hair	  follicle,	  into	  the	  growing	  cells	  within	  the	  length	  of	  the	  follicle,	  between	  the	  basement	  membrane	  and	  the	  end	  of	  the	  keratinization	  zone;	  once	  hair	  has	  completed	  the	  keratinization	  process,	  substances	  from	  the	  blood	  can	  no	  longer	  diffuse	  into	  the	  hair	  shaft	  (Pragst	  and	  Balikova,	  2006).	  As	  the	  hair	  grows,	  the	  cells	  that	  make	  up	  the	  hair	  shaft	  are	  moved	  further	  and	  further	  way	  from	  the	  follicle,	  creating	  a	  map	  of	  endocrinological	  events	  (Russell	  et	  al.,	  2012).	  Therefore,	  the	  rate	  of	  hair	  growth	  can	  be	  used	  to	  associate	  substances	  found	  within	  a	  particular	  segment	  of	  hair	  to	  a	  specific	  time	  period;	  it	  is	  important	  to	  note	  that	  since	  there	  is	  hair	  between	  the	  follicle	  and	  surface	  of	  the	  skin,	  the	  collected	  hair	  sample	  has	  a	  time	  delay	  that	  is	  directly	  related	  to	  hair	  growth	  rate	  and	  the	  depth	  of	  the	  hair	  follicle	  (Russell	  et	  al.,	  2012).	  	  1.6.2	  What	  factors	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations?	  	   With	  this	  emerging	  measure	  of	  chronic	  stress,	  appropriate	  hair	  cortisol	  sampling	  methodology	  must	  be	  developed	  and	  validated,	  including	  ideal	  hair	  colour,	  body	  location	  and	  processing	  methods	  for	  hair	  samples.	  Bennett	  and	  Hayssen	  (2010)	  reported	  cortisol	  concentrations	  differed	  depending	  on	  hair	  colour	  in	  dogs,	  where	  black	  hair	  contained	  the	  least	  amount	  of	  cortisol	  compared	  to	  blonde	  and	  agouti	  coloured	  hair.	  	  There	  has	  been	  limited	  research	  on	  the	  relationship	  of	  hair	  cortisol	  and	  hair	  colour	  in	  dairy	  cattle.	  However,	  a	  study	  by	  González-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.	  (2011)	  reported	  that	  white	  hair	  contained	  higher	  cortisol	  concentrations	  when	  compared	  to	  black	  hair.	  	   20	  There	  have	  been	  reports	  that	  suggest	  that	  the	  location	  on	  the	  body	  may	  affect	  the	  amount	  of	  cortisol	  found	  within	  hair	  samples,	  but	  previous	  publications	  using	  dairy	  cattle,	  hair	  has	  been	  sampled	  from	  different	  locations,	  including	  the	  forehead	  (Comin	  et	  al.,	  2011),	  ribs	  (Gonzalez-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.,	  2011),	  and	  shoulder	  (Maiero	  et	  al.,	  2005).	  Macbeth	  et	  al.	  (2010)	  reported	  that	  hair	  collected	  from	  the	  neck	  of	  grizzly	  bears	  had	  significantly	  higher	  cortisol	  concentrations	  than	  hair	  collected	  from	  the	  shoulder,	  rump,	  and	  abdomen.	  Furthermore,	  recent	  research	  in	  beef	  cattle	  has	  shown	  that	  cortisol	  concentrations	  are	  highest	  in	  hair	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  compared	  with	  the	  head	  and	  shoulder,	  while	  hair	  from	  the	  neck	  and	  hip	  had	  higher	  concentrations	  compared	  with	  the	  shoulder	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  	  	  	  Additionally,	  there	  have	  been	  different	  methods	  used	  for	  processing	  hair	  samples	  prior	  to	  cortisol	  extraction.	  Two	  main	  methods	  reported	  in	  the	  literature	  are	  mincing	  the	  hair	  into	  small	  pieces	  using	  scissors	  (Accorsi	  et	  al.,	  2008;	  Koren	  et	  al.,	  2002)	  and	  the	  use	  of	  a	  ball	  mill	  to	  create	  a	  powder	  from	  the	  hair	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  There	  has	  been	  no	  research	  published	  comparing	  the	  effects	  of	  different	  processing	  methods	  on	  the	  concentrations	  of	  cortisol	  that	  can	  be	  extracted	  from	  hair	  of	  dairy	  cows.	  	  	  1.7	  Objectives	  and	  hypotheses	  	   This	  thesis	  reports	  research	  investigating	  methodology	  for	  the	  collection	  and	  processing	  of	  hair	  from	  lactating	  Holstein	  dairy	  cows	  for	  hair	  cortisol	  analysis,	  and	  associations	  between	  hair	  cortisol	  concentrations	  and	  reproductive	  success,	  clinical	  and	  subclinical	  disease.	  We	  hypothesized	  that	  hair	  cortisol	  concentrations	  would	  be	  affected	  by	  	   21	  hair	  colour,	  sampling	  location,	  and	  processing	  method.	  In	  addition,	  we	  hypothesized	  that	  animals	  with	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  will	  have	  poorer	  fertility	  and	  a	  higher	  prevalence	  of	  disease.	  	  	   	  	   22	  Chapter	  2:	  Factors	  Affecting	  Hair	  Cortisol	  Concentrations	  in	  Lactating	  Dairy	  Cows1	  2.1	  Introduction	  Cortisol	  is	  a	  key	  mediator	  of	  the	  stress	  response	  in	  animals,	  produced	  through	  the	  activation	  of	  the	  HPA	  axis	  during	  a	  stressful	  event.	  Activation	  of	  the	  HPA	  axis	  can	  cause	  many	  physiological	  changes	  during	  acute	  stress	  events	  (i.e.	  short	  term	  or	  low	  magnitude	  increases	  in	  cortisol)	  and	  promotes	  a	  shift	  of	  resources	  towards	  adaptive	  functions	  such	  as	  arousal,	  vigilance,	  and	  increased	  oxygenation	  and	  nutrition	  of	  the	  brain,	  heart	  and	  skeletal	  muscles.	  As	  a	  consequence,	  it	  may	  down	  regulate	  non-­‐adaptive	  functions	  such	  as	  eating,	  growth,	  and	  reproduction	  (Chrousos,	  2009).	  Many	  common	  farm	  practices	  such	  as	  handling	  (Cook	  et	  al.,	  2000),	  transportation	  (Lay	  et	  al.,	  1996),	  regrouping	  (Friend	  et	  al.,	  1977),	  dehorning	  (Stafford	  and	  Mellor,	  2005),	  and	  overstocking	  (Friend	  et	  al.,	  1979)	  induce	  acute	  stress	  responses	  in	  dairy	  cattle.	  Prolonged	  or	  excessive	  activation	  of	  the	  HPA	  axis	  may	  result	  in	  chronic	  stress	  that	  can	  cause	  additional	  behavioural	  (Chrousos	  and	  Gold,	  1992)	  and	  somatic	  disorders	  (Chrousos	  et	  al.,	  1998;	  Charmandari	  et	  al.,	  2005).	  In	  dairy	  cattle,	  long-­‐term	  increases	  in	  glucocorticoid	  concentrations	  have	  been	  linked	  to	  immunosuppression	  (Roth,	  1985),	  and	  reduced	  fertility	  (Dobson	  and	  Esslemont,	  2002).	  Comin	  et	  al.	  (2013)	  reported	  that	  cows	  that	  were	  clinically	  compromised	  (e.g.:	  laminitis,	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  1	  A	  version	  of	  this	  chapter	  has	  been	  accepted	  for	  publication:	  Burnett,	  T.A.,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.	  Tahmasbi,	  D.M.	  Veira,	  R.L.A.	  Cerri.	  2014.	  Short	  communication:	  Factors	  affecting	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  In	  Press.	  	  	  	   23	  metritis	  or	  mastitis)	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  than	  those	  that	  had	  an	  absence	  of	  disease.	  	  	   Cortisol	  has	  been	  used	  extensively	  as	  a	  physiological	  measure	  of	  acute	  stress	  response	  in	  animals	  (Moberg	  and	  Mench,	  2000).	  Cortisol	  can	  be	  analyzed	  from	  many	  different	  media,	  most	  notably	  from	  the	  blood,	  saliva	  and	  faeces;	  however,	  handling	  and	  restraint	  of	  dairy	  cattle	  has	  also	  been	  shown	  to	  rapidly	  increase	  plasma	  cortisol,	  leading	  to	  confounding	  results	  (Cook	  et	  al.,	  2000).	  In	  addition,	  circulating	  cortisol	  follows	  a	  diurnal	  pattern	  in	  a	  pulsatile	  fashion,	  leading	  to	  substantial	  individual	  animal	  variation	  depending	  on	  the	  time	  of	  day	  (Thun	  et	  al.,	  1981).	  Although	  fecal	  samples	  are	  less	  responsive	  to	  small	  changes	  in	  circulating	  cortisol,	  and	  reflect	  cortisol	  concentrations	  from	  10	  to	  12	  hr	  prior	  to	  fecal	  collection,	  they	  still	  cannot	  be	  practically	  used	  to	  measure	  the	  long-­‐term	  changes	  that	  are	  characteristic	  of	  chronic	  stress	  (Möstl	  et	  al.,	  2002).	  Sampling	  concerns	  and	  the	  lack	  of	  a	  reliable	  method	  for	  measuring	  chronic	  stress	  in	  farm	  animals,	  has	  contributed	  to	  the	  need	  for	  non-­‐invasive	  cortisol	  sampling	  methods	  that	  can	  reflect	  long-­‐term	  increases	  in	  cortisol	  (Moberg	  and	  Mench,	  2000).	  One	  promising	  sampling	  method	  is	  the	  use	  of	  hair	  to	  assess	  cortisol	  levels;	  this	  method	  has	  been	  used	  in	  rhesus	  macaques	  (Davenport	  et	  al.,	  2008),	  dairy	  cows	  (Comin	  et	  al.,	  2011),	  and	  dairy	  calves	  (González-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.,	  2011).	  Hair	  cortisol	  concentrations	  have	  been	  found	  to	  have	  a	  positive	  correlation	  with	  chronic	  stress	  found	  in	  humans	  in	  different	  adverse	  circumstances	  and	  uncertain	  health,	  such	  as	  hospitalized	  neonates	  (Yamada	  et	  al.,	  2007),	  chronic	  pain	  in	  adults	  (Van	  Uum	  et	  al.,	  2008),	  acute	  myocardial	  infarction	  in	  men	  (Pereg	  et	  al.,	  2011)	  and	  Cushing’s	  syndrome	  (Thomson	  et	  al.,	  2010).	  	  	   24	  Bennett	  and	  Hayssen	  (2010)	  reported	  that	  cortisol	  concentrations	  differed	  depending	  on	  hair	  colour	  in	  dogs,	  where	  black	  hair	  contained	  the	  least	  amount	  of	  cortisol	  compared	  to	  blonde	  and	  agouti	  coloured	  hair.	  There	  has	  been	  some	  evidence	  that	  the	  location	  on	  the	  body	  where	  the	  hair	  sample	  originates	  from	  may	  affect	  cortisol	  concentrations.	  Macbeth	  et	  al.	  (2010)	  found	  that	  hair	  collected	  from	  the	  neck	  of	  grizzly	  bears	  had	  significantly	  higher	  cortisol	  concentrations	  than	  hair	  collected	  from	  the	  shoulder,	  rump,	  and	  abdomen.	  In	  addition,	  research	  with	  beef	  cattle	  has	  shown	  that	  cortisol	  concentrations	  were	  highest	  when	  hair	  was	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  Furthermore,	  different	  methods	  have	  been	  used	  to	  process	  hair	  samples	  prior	  to	  analysis.	  The	  two	  main	  processing	  methods	  used	  include	  mincing	  the	  hair	  into	  small	  pieces	  using	  scissors	  (Accorsi	  et	  al.,	  2008;	  Koren	  et	  al.,	  2002)	  and	  using	  a	  ball	  mill	  to	  powder	  the	  hair	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  	  The	  aim	  of	  this	  study	  was	  to	  determine	  the	  effect	  of	  hair	  colour	  and	  sampling	  location	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  lactating	  Holstein	  dairy	  cows,	  and	  to	  identify	  the	  most	  effective	  processing	  method	  for	  cortisol	  extraction	  from	  hair.	  The	  hypothesis	  was	  that	  white-­‐coloured	  hair	  would	  yield	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  and	  that	  a	  location	  effect	  would	  be	  evident.	  Furthermore,	  more	  finely	  processed	  hair,	  such	  as	  by	  using	  a	  ball	  mill,	  would	  have	  greater	  amounts	  of	  cortisol	  extracted	  from	  each	  sample.	  	  	  2.2	  Materials	  and	  methods	  	  	   This	  project	  was	  conducted	  at	  the	  University	  of	  British	  Columbia’s	  Dairy	  Education	  and	  Research	  Centre	  in	  Agassiz,	  BC	  from	  March	  2011	  to	  October	  2011	  in	  Experiment	  1	  (n	  =	  	   25	  18),	  July	  2011	  to	  January	  2012	  in	  Experiment	  2	  (n	  =	  12),	  and	  March	  2011	  to	  March	  2012	  (n	  =	  37)	  in	  Experiment	  3.	  The	  average	  temperature	  and	  photoperiod	  during	  the	  entire	  experimental	  period	  were	  10.5	  °C	  and	  14:38:43	  (hh:mm:ss)	  hr	  light/d,	  17.8	  °C	  and	  14:38:47	  hr	  light/d,	  7.4	  °C	  and	  9:44:27	  hr	  light/d,	  and	  4.9	  °C	  and	  9:44:59	  hr	  light/d	  for	  the	  spring,	  summer,	  fall	  and	  winter	  seasons,	  respectively.	  All	  procedures	  were	  carried	  out	  in	  accordance	  with	  the	  University	  of	  British	  Columbia’s	  Animal	  Care	  Committee.	  In	  addition,	  animals	  used	  in	  this	  experiment	  were	  cared	  for	  as	  outlined	  by	  the	  guidelines	  provided	  by	  the	  Canadian	  Council	  of	  Animal	  Care.	  	  2.2.1	  Animals	  and	  housing	  	   All	  animals	  within	  this	  study	  were	  housed	  indoors	  within	  the	  same	  free	  stall	  barn	  equipped	  with	  deep	  sand	  bedded	  stalls.	  Animals	  were	  milked	  twice	  daily	  at	  0500	  and	  1500	  hr	  and	  fed	  a	  total	  mixed	  ration	  (TMR)	  twice	  daily	  at	  approximately	  0700	  and	  1600	  hr.	  	  The	  TMR	  was	  formulated	  to	  meet	  or	  exceed	  the	  requirements	  of	  Holstein	  cows	  weighing	  620	  kg,	  producing	  45	  kg/d	  of	  3.5%	  fat	  corrected	  milk	  (NRC,	  2001);	  the	  animals	  had	  ad	  libitum	  access	  to	  both	  TMR	  and	  water.	  An	  initial	  set	  of	  animals	  consisted	  of	  18	  lactating	  Holstein	  dairy	  cows	  were	  used	  to	  test	  the	  effect	  of	  hair	  colour,	  sampling	  location	  and	  processing	  method	  on	  hair	  cortisol	  concentrations.	  The	  animals	  had	  an	  average	  of	  3.2	  ±	  1.9	  (Mean	  ±	  SD)	  lactations	  (3	  primiparous	  and	  15	  multiparous),	  producing	  11,720	  ±	  2,214	  kg	  of	  milk,	  and	  an	  average	  of	  163.0	  ±	  123.9	  days	  in	  milk	  (DIM).	  All	  18	  dairy	  cows	  were	  sampled	  at	  4	  different	  locations:	  shoulder,	  top	  line,	  hip	  and	  tail	  switch	  (Figure	  2.1);	  samples	  of	  both	  black	  and	  white	  hair	  	   26	  were	  taken	  at	  each	  location	  when	  available	  with	  the	  exception	  of	  the	  tail	  switch	  because	  Holstein	  cattle	  only	  have	  white	  hair	  at	  this	  location.	  Hair	  collected	  from	  the	  body	  of	  the	  animal	  was	  carefully	  clipped	  with	  electric	  clippers	  	  (blade	  size	  40,	  Oster,	  Rye,	  NY;	  2	  Speed	  Clipper,	  Andis,	  Sturtevant,	  WI).	  Hair	  from	  the	  tail	  switch	  was	  collected	  with	  scissors,	  due	  to	  its	  coarse	  nature,	  and	  the	  hair	  material	  closest	  (2.5	  cm	  of	  hair)	  to	  the	  skin	  was	  kept	  for	  analysis.	  	  In	  both	  cases,	  the	  hair	  was	  cut	  as	  close	  to	  the	  skin	  as	  possible	  and	  stored	  at	  room	  temperature	  in	  the	  dark,	  in	  dry	  paper	  envelopes	  until	  processed.	  	  An	  additional	  12	  dairy	  cows	  were	  used	  to	  determine	  the	  rate	  at	  which	  hair	  grows	  in	  three	  different	  areas	  of	  the	  body:	  shoulder,	  hip,	  and	  tail	  switch.	  Only	  white	  hair	  was	  collected	  from	  each	  region.	  Hair	  from	  each	  region	  was	  cut	  as	  close	  as	  possible	  to	  the	  skin	  using	  electric	  clippers,	  for	  the	  rump	  and	  shoulder,	  or	  surgical	  scissors	  for	  the	  tail	  switch.	  Leftover	  hair	  stubble	  was	  dyed	  using	  black	  hair	  dye	  for	  a	  minimum	  of	  30	  min	  and	  washed	  off	  with	  cold	  water.	  Three	  weeks	  later,	  using	  a	  permanent	  red	  marker,	  hair	  was	  marked	  at	  the	  surface	  of	  the	  skin	  and	  plucked	  out	  using	  rat	  tooth	  tweezers.	  Hair	  length	  was	  measured	  using	  a	  light	  table	  and	  a	  jeweller’s	  eyepiece	  equipped	  with	  a	  small	  ruler;	  10	  to	  12	  hairs/	  location/cow	  were	  measured	  to	  the	  nearest	  0.1	  mm.	  	  The	  amount	  of	  hair	  found	  between	  the	  dyed	  black	  hair	  and	  the	  red	  marker	  was	  defined	  as	  the	  growth	  length.	  	  A	  third	  set	  of	  animals	  was	  collected	  to	  test	  for	  the	  effect	  of	  parity	  and	  DIM.	  Hair	  samples	  were	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  of	  37	  lactating	  cows	  (18	  primiparous	  and	  19	  multiparous)	  with	  no	  history	  of	  health	  disorders	  at	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM.	  All	  samples	  were	  processed	  using	  a	  ball	  mill	  following	  the	  previously	  described	  hair	  collection	  protocol.	  The	  sequential	  collection	  of	  hair	  samples	  occurred	  every	  3	  wk	  from	  calving	  until	  126	  DIM	  	   27	  to	  test	  if	  samples	  could	  be	  properly	  collected	  and	  analyzed	  over	  short-­‐term	  intervals	  from	  the	  same	  animal.	  	  2.2.2	  Hair	  processing	  and	  analysis	  	   In	  preparation	  for	  analysis,	  samples	  were	  cleaned	  thoroughly	  of	  dirt,	  dander	  and	  hairs	  of	  the	  wrong	  colour	  by	  hand	  using	  tweezers.	  	  The	  samples	  were	  then	  washed	  with	  warm	  water	  for	  no	  longer	  than	  3	  min	  and	  let	  dry	  for	  a	  minimum	  of	  1	  d	  until	  completely	  dry.	  To	  prepare	  the	  hair	  samples	  used	  to	  test	  the	  effects	  of	  hair	  colour,	  sampling	  location	  and	  processing	  method,	  two	  250	  mg	  of	  hair	  sample	  were	  weighed	  and	  washed	  in	  two	  5	  ml	  washes	  of	  isopropanol	  of	  3	  min	  each,	  as	  suggested	  by	  Davenport	  et	  al.	  (2006).	  Both	  samples	  were	  left	  to	  dry	  for	  5	  d	  and	  one	  was	  finely	  cut	  (less	  than	  3	  mm)	  using	  a	  pair	  of	  surgical	  scissors,	  while	  the	  other	  was	  ground	  in	  10	  ml	  stainless	  steel	  milling	  cups	  with	  a	  12	  mm	  stainless	  steel	  ball	  in	  a	  Retsch	  Mixer	  Mill	  MM400	  ball	  mill	  (Retsch,	  Hannover,	  Germany)	  for	  5	  min	  at	  a	  frequency	  of	  30	  repetitions/s.	  Hair	  samples	  collected	  to	  test	  the	  effect	  of	  parity	  and	  DIM	  were	  prepared	  for	  analysis	  in	  the	  same	  manner	  as	  previously	  described;	  however,	  all	  samples	  were	  ground	  using	  the	  ball	  mill	  method	  only.	  Ground	  hair	  samples	  were	  then	  stored	  in	  the	  dark	  in	  glass	  jars	  at	  room	  temperature.	  	  Extraction	  of	  hair	  cortisol	  was	  performed	  following	  the	  procedure	  of	  Koren	  et	  al.	  (2002),	  with	  modifications.	  We	  took	  20	  ±	  0.2	  mg	  of	  clean,	  dried	  and	  ground	  bovine	  hair	  and	  weighed	  it	  into	  7	  ml	  glass	  scintillation	  vials.	  Then,	  1	  ml	  of	  HPLC-­‐grade	  methanol	  (EMD	  Chemicals,	  Darmstdat,	  Germany)	  was	  added.	  The	  vials	  were	  tightly	  capped,	  gently	  swirled	  to	  ensure	  the	  hair	  came	  into	  contact	  with	  the	  methanol,	  and	  sonicated	  for	  30	  min.	  The	  	   28	  samples	  were	  incubated	  overnight	  (New	  Brunswick	  Scientific	  Incubator	  Shaker,	  Edison,	  NJ)	  at	  100	  rpm	  and	  50	  oC	  to	  extract	  the	  steroids	  and	  0.8	  ml	  of	  the	  original	  volume	  of	  methanol	  was	  pipetted	  into	  a	  2	  ml	  microcentrifuge	  tube	  and	  evaporated	  at	  45	  oC	  under	  a	  stream	  of	  ultrapure	  nitrogen	  gas.	  The	  samples	  were	  reconstituted	  in	  100	  ul	  of	  the	  phosphate	  buffered	  saline	  supplied	  with	  the	  assay	  kit.	  Hair	  cortisol	  was	  analyzed	  using	  a	  commercially	  available	  assay	  kit	  designed	  for	  salivary	  cortisol	  (Salimetrics	  Expanded	  Range,	  High	  Sensitivity	  1-­‐E3002,	  State	  College,	  PA).	  The	  minimal	  concentration	  of	  cortisol	  that	  can	  be	  distinguished	  from	  the	  0	  standard	  using	  this	  kit	  is	  0.003	  ug/dl.	  Samples	  were	  aliquoted	  into	  wells	  in	  duplicate	  (25	  ul),	  and	  absorbance	  measured	  using	  a	  wavelength	  of	  450	  mm	  in	  a	  microplate	  plate	  reader	  (Biorad	  xMark,	  Hercules,	  CA).	  The	  average	  inter-­‐	  and	  intra-­‐assay	  CV	  was	  7.4%	  and	  3.5%,	  respectively.	  	  2.2.3	  Statistical	  analyses	  	   The	  key	  hypothesis	  for	  study	  1	  was	  that	  hair	  colour	  would	  have	  an	  effect	  (black	  >	  white)	  on	  hair	  cortisol	  concentrations.	  The	  acceptable	  difference	  (Δ)	  was	  defined	  as	  0.50	  (50%)	  with	  a	  one-­‐sided	  test	  (α	  =	  0.05)	  and	  power	  (1-­‐β)	  =	  0.8.	  Using	  these	  assumptions,	  at	  least	  10	  cows	  were	  required	  (Minitab	  17;	  Minitab	  Inc.,	  State	  College,	  PA).	  Prior	  to	  statistical	  analyses,	  all	  data	  were	  checked	  for	  normality	  using	  probability	  distribution	  plots.	  Statistical	  analyses	  were	  performed	  using	  SAS	  (version	  9.4;	  SAS	  Institute	  Inc.,	  Cary,	  NC).	  	  To	  test	  for	  differences	  in	  cortisol	  concentrations	  for	  hair	  colour,	  location	  on	  the	  body,	  and	  processing	  method,	  as	  well	  as	  the	  analysis	  for	  sequential	  collections	  (parity	  	   29	  and	  DIM)	  data	  were	  analyzed	  by	  ANOVA	  using	  the	  MIXED	  procedure.	  Differences	  between	  processing	  methods	  only	  used	  samples	  of	  white	  hair.	  The	  hair	  growth	  measurements	  were	  pooled	  within	  animal	  and	  analyzed	  by	  ANOVA	  using	  the	  GLM	  procedure.	  	  2.3	  Results	  and	  discussion	  	   The	  overall	  hair	  cortisol	  concentrations	  measured	  within	  this	  experiment	  (5.7	  ±	  1.7	  pg/mg;	  Mean	  ±	  SD)	  were	  less	  than	  reported	  for	  lactating	  dairy	  cattle	  by	  González-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.	  (2011)	  (12.15	  ±	  1.85	  pg/mg),	  but	  greater	  than	  those	  reported	  by	  Comin	  et	  al.	  (2011)	  (2.5	  ±	  0.10	  pg/mg)	  from	  dairy	  cattle	  and	  Moya	  et	  al.	  (2013)	  (2.35	  ±	  0.176	  pg/mg)	  from	  beef	  cattle.	  Values	  obtained	  from	  this	  study	  may	  be	  greater	  than	  previously	  found	  by	  Comin	  et	  al.	  (2011)	  due	  to	  the	  difference	  in	  hair	  processing	  method	  used.	  Furthermore,	  the	  values	  reported	  here	  were	  greatly	  different	  than	  those	  found	  in	  dairy	  heifer	  calves	  (114.5	  ±	  14.43	  pg/mg;	  González-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.,	  2011),	  and	  male	  rhesus	  macaques	  (110.3	  ±	  10.2	  pg/mg;	  Davenport	  et	  al.,	  2006),	  suggesting	  that	  developmental	  stages	  and	  species	  greatly	  affect	  the	  amount	  of	  cortisol	  found	  in	  hair.	  	  A	  difference	  in	  cortisol	  concentrations	  was	  found	  for	  hair	  of	  different	  colours	  (P	  <	  0.001;	  Table	  2.1).	  White	  hair	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  than	  black	  hair.	  This	  difference	  was	  found	  irrespective	  of	  the	  location	  and	  the	  analysis	  excluded	  the	  data	  from	  the	  tail	  switch	  because	  of	  the	  lack	  of	  black	  hair.	  Similarly,	  González-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.	  (2011)	  also	  described	  black	  hair	  as	  having	  approximately	  half	  the	  concentration	  of	  cortisol	  than	  white	  hair	  from	  dairy	  cows.	  In	  addition,	  differences	  in	  hair	  cortisol	  affected	  by	  colour	  have	  been	  reported	  in	  dogs,	  where	  yellow	  hair	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  than	  agouti	  	   30	  and	  black	  hair	  from	  German	  shepherds	  (Bennett	  and	  Hayssen,	  2010).	  Reasons	  for	  this	  difference	  are	  not	  well	  understood	  but	  could	  be	  related	  to	  mechanisms	  associated	  with	  melanocyte	  development	  (Slominski	  et	  al.,	  2004),	  differentiation	  (Roulin	  et	  al.,	  2008),	  or	  simply	  a	  question	  of	  physical	  space	  within	  the	  hair	  shaft	  as	  white	  or	  yellow	  hair	  have	  less	  pigmentation.	  	  Hair	  colour	  may	  have	  an	  effect	  on	  skin	  temperature,	  and	  therefore	  increase	  the	  blood	  flow	  through	  the	  microvasculature,	  compromising	  the	  dermal	  papilla	  and	  root	  sheaths	  of	  hair	  follicles;	  however,	  animals	  in	  this	  study	  were	  housed	  indoors,	  away	  from	  direct	  sunlight.	  	  Although	  it	  has	  been	  suggested	  that	  season	  may	  effect	  hair	  cortisol	  concentrations	  (Comin	  et	  al.,	  2011)	  by	  changing	  the	  rate	  of	  hair	  growth	  and	  the	  hair	  growth	  cycle	  (Courtois	  et	  al.,	  1996),	  the	  effects	  of	  photoperiod	  and	  temperature	  has	  not	  been	  shown	  in	  cattle.	  Concentrations	  of	  cortisol	  from	  hair	  of	  both	  colours	  did	  not	  differ	  among	  the	  shoulder,	  top	  line	  and	  hip	  (P	  =	  0.36;	  Table	  2.1).	  When	  only	  white	  was	  included	  in	  the	  analysis	  in	  order	  to	  include	  the	  tail	  switch,	  a	  difference	  between	  the	  tail	  switch	  and	  shoulder	  was	  found	  (P	  =	  0.01),	  but	  not	  between	  the	  tail	  switch	  and	  the	  hip	  or	  top	  line	  (Table	  2.1).	  These	  results	  for	  white	  hair	  are	  consistent	  with	  a	  recent	  study	  performed	  on	  beef	  cattle	  by	  Moya	  et	  al.	  (2013)	  where	  it	  was	  also	  reported	  that	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  than	  the	  head	  and	  shoulder,	  whereas	  hair	  from	  the	  neck	  and	  hip	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  compared	  with	  the	  shoulder.	  In	  this	  study,	  the	  hair	  from	  the	  top	  line	  and	  hip	  were	  not	  different	  than	  from	  the	  shoulder.	  The	  causes	  for	  the	  marked	  differences	  between	  the	  tail	  switch	  and	  shoulder	  are	  unclear;	  however,	  it	  has	  been	  suggested	  that	  the	  increased	  hair	  growth	  rate	  found	  at	  the	  tail	  switch	  may	  be	  the	  driving	  factor	  for	  increased	  cortisol	  concentrations	  (Moya	  et	  al.,	  2013).	  	   31	  Furthermore,	  Moya	  et	  al.	  (2013)	  reported	  that	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  had	  a	  stronger	  correlation	  to	  both	  salivary	  and	  fecal	  cortisol	  concentrations	  than	  hair	  from	  the	  head,	  neck,	  shoulder,	  and	  hip.	  The	  processing	  method	  of	  the	  hair	  significantly	  affected	  the	  amount	  of	  cortisol	  extracted	  from	  each	  sample.	  Samples	  processed	  with	  a	  ball	  mill	  had	  greater	  amount	  of	  cortisol	  extracted	  from	  each	  sample	  (P	  <	  0.001)	  compared	  with	  surgical	  scissors	  (Table	  2.1).	  The	  increase	  in	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  is	  likely	  caused	  by	  the	  increased	  surface	  area	  created	  by	  grinding	  the	  hair	  into	  much	  smaller	  pieces.	  Processing	  methods	  have	  not	  previously	  been	  directly	  compared	  for	  cortisol	  extraction	  from	  hair	  samples	  from	  dairy	  cows,	  but	  studies	  using	  surgical	  scissors	  have	  reported	  overall	  smaller	  concentrations	  of	  cortisol	  (Comin	  et	  al.,	  2011;	  Comin	  et	  al.,	  2013).	  The	  rate	  of	  hair	  growth	  is	  affected	  by	  location.	  The	  growth	  rate	  of	  the	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  is	  over	  ten	  times	  faster	  (P	  <	  0.001)	  than	  the	  rate	  of	  hair	  growth	  at	  the	  hip	  and	  shoulder,	  whereas	  the	  hip	  and	  shoulder	  have	  similar	  hair	  growth	  rates	  (Geometric	  Mean	  [95%	  CI])	  (0.51	  [0.45,	  0.60]	  vs.	  0.04	  [0.03,	  0.05]	  vs.	  0.03	  [0.03,	  0.04]	  mm/d;	  Figure	  2.2).	  The	  hair	  growth	  results	  from	  the	  tail	  switch	  were	  similar	  to	  values	  reported	  by	  Fisher	  et	  al.	  (1985)	  and	  Schwertl	  et	  al.	  (2003)	  from	  beef	  cattle.	  Resampling	  intervals	  of	  biological	  significance	  in	  lactating	  dairy	  cows,	  such	  as	  during	  the	  transition	  period,	  can	  only	  be	  achieved	  with	  the	  growth	  rate	  found	  at	  the	  tail	  switch.	  	  Parity	  only	  tended	  to	  affect	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair,	  where	  multiparous	  cows	  had	  slightly	  greater	  concentrations	  than	  primiparous	  cows	  (9.6	  [9.1,	  10.2]	  vs.	  8.9	  [8.4,	  9.4];	  P	  =	  0.10).	  Such	  a	  small	  difference	  is	  unlikely	  to	  indicate	  a	  clear	  parity	  effect,	  although	  it	  	   32	  is	  common	  belief	  that	  primiparous	  cows	  may	  suffer	  more	  from	  stress	  than	  multiparous	  cows.	  Within	  this	  portion	  of	  the	  experiment,	  hair	  was	  only	  collected	  from	  cows	  with	  no	  sign	  of	  clinical	  disease	  throughout	  the	  sampling	  period.	  In	  a	  sister	  study	  (Chapter	  2),	  it	  was	  observed	  that	  parity	  had	  a	  more	  pronounced	  effect,	  even	  when	  only	  including	  clinically	  healthy	  animals.	  In	  addition,	  as	  DIM	  increased,	  a	  decrease	  in	  hair	  cortisol	  concentrations	  was	  observed	  (P	  <	  0.001)	  (Figure	  2.3),	  indicating	  that	  hair	  cortisol	  may	  be	  a	  valuable	  indicator	  of	  changes	  in	  stress	  during	  the	  weeks	  following	  parturition.	  No	  interaction	  between	  parity	  and	  DIM	  was	  found	  (P	  >	  0.16).	  	  The	  colour	  of	  the	  hair,	  sampling	  location	  and	  processing	  method	  largely	  affects	  the	  amount	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair.	  This	  study	  suggests	  that	  the	  tail	  switch	  is	  the	  ideal	  location	  for	  hair	  sampling	  from	  black	  and	  white	  Holsteins	  for	  analysis	  of	  cortisol	  due	  to	  the	  consistent	  white	  colour	  hair,	  greater	  growth	  rates	  and	  easier	  access.	  In	  addition	  a	  ball	  mill	  should	  be	  used	  to	  maintain	  consistent	  particle	  sizes	  among	  samples	  as	  well	  as	  to	  improve	  cortisol	  extraction.	  The	  creation	  of	  a	  more	  standardized	  method	  for	  hair	  sample	  collection	  for	  the	  analysis	  of	  cortisol	  in	  dairy	  cattle	  will	  improve	  the	  interpretation	  and	  consistency	  of	  results	  in	  different	  studies	  aiming	  to	  compare	  chronic	  stress	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  	  	  	   	  	   33	  Table	  2.1:	  Effect	  of	  hair	  colour1,	  sampling	  location1	  and	  processing	  method	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  from	  black	  and	  white	  Holstein	  cows.	  	   Hair	  Cortisol	  Concentration	  Mean	  [95%	  CI]	  (pg/mg)	   P-­‐value	  Colour	   	   	  Black	   4.2	  [3.6,	  5.0]	   <	  0.001	  White	   7.8	  [6.8,	  9.2]	  Location	  (black	  and	  white	  hair)	   	   	  Shoulder	   4.8	  [1.4,	  5.6]	   0.36	  Top	  line	   5.1	  [1.5,	  6.0]	  Hip	   5.8	  [1.6,	  6.9]	  Location	  (only	  white	  hair)	   	   	  Shoulder	   6.2	  [4.2,	  9.2]a	  0.03	  Top	  line	   8.9	  [5.8,	  13.8]ab	  Hip	   9.5	  [6.3,	  14.3]ab	  Tail	  switch	   11.0	  [7.6,	  16.0]b	  Processing	  method	   	   	  Ball	  mill	   10.4	  [5.8,	  18.8]	   <	  0.001	  Surgical	  scissors	   4.7	  [2.6,	  8.4]	  ab	  Values	  with	  different	  superscripts	  in	  the	  same	  column	  are	  significantly	  different	  	  (P	  <	  0.05).	  1	  All	  comparisons	  of	  colour	  and	  location	  were	  done	  using	  the	  ball	  mill	  processing	  method.	  	   	  	   34	  Figure	  2.1:	  Hair	  sampling	  locations:	  a)	  shoulder,	  hair	  located	  at	  the	  scapula;	  b)	  top	  line,	  hair	  located	  at	  the	  dorsal	  side	  of	  the	  vertebrae;	  c)	  hip,	  hair	  located	  over	  the	  femur-­‐ischium	  junction;	  and	  d)	  tail	  switch,	  hair	  located	  at	  the	  distal	  end	  of	  the	  tail.	  	  	  	  ©	  Domicoolka/	  Dollar	  Photo	  Club	  	   	  c d b a 	   35	  Figure	  2.2:	  Hair	  growth	  rates	  at	  different	  body	  locations	  (Mean	  ±	  SE)	  collected	  from	  black	  and	  white	  Holstein	  cows.	  Different	  superscripts	  (a,b)	  indicate	  significant	  differences	  (P	  <	  0.001).	  	  	  	   	  0	  4	  8	  12	  Tail	   Hip	   Shoulder	  Hair	  Growth	  Rate	  (mm/21d)	  Hair	  Sampling	  Location	  	  	  	  a	  b	   b	  	   36	  Figure	  2.3:	  Effect	  of	  parity	  and	  DIM	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  (Mean	  ±	  SE)	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  from	  the	  tail	  switch	  of	  37	  clinically	  healthy	  lactating	  cows	  (18	  primiparous	  and	  19	  multiparous)	  at	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM.	  There	  was	  a	  tendency	  for	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  multiparous	  cows	  (P	  =	  0.10).	  Days	  in	  milk	  affected	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  (P	  <	  0.001);	  d	  0	  and	  21	  had	  elevated	  concentrations	  of	  cortisol	  compared	  with	  the	  other	  collections.	  No	  interaction	  between	  parity	  and	  DIM	  was	  found	  (P	  >	  0.16).	  	  	  	  	   	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  0	   20	   40	   60	   80	   100	   120	  Cortisol	  Concentration	  	  (pg/mg)	  Days	  in	  Milk	  Multiparous	  Primiparous	  	   37	  Chapter	  3:	  Relationship	  of	  Concentrations	  of	  Cortisol	  in	  Hair	  with	  Health,	  Plasma	  Metabolites	  and	  Reproductive	  Parameters	  in	  Dairy	  Cows2	  3.1	  Introduction	  	  	   Chronic	  stress,	  characterized	  as	  a	  sustained	  stress	  response	  or	  the	  excessive	  secretion	  of	  stress	  mediators,	  has	  been	  shown	  to	  impair	  the	  immune	  response	  and	  reproductive	  function	  in	  animals	  (Chrousos,	  2009;	  Matteri	  et	  al.,	  2000).	  In	  cattle,	  several	  reports	  have	  shown	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  plasma	  in	  different	  scenarios	  involving	  clinical	  diseases	  and	  inflammatory	  responses.	  Comin	  et	  al.	  (2013)	  reported	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  plasma	  from	  clinically	  compromised	  (e.g.:	  laminitis,	  metritis	  or	  mastitis)	  cows	  compared	  with	  those	  with	  an	  absence	  of	  disease.	  	  Additionally,	  Lavon	  et	  al.	  (2008)	  observed	  that	  animals	  administrated	  with	  E.	  coli	  endotoxin	  showed	  an	  increase	  in	  cortisol	  in	  plasma	  suggesting	  that	  an	  inflammatory	  response	  induces	  increases	  in	  cortisol.	  Some	  researchers	  have	  reported	  that	  an	  inflammatory	  infection	  caused	  by	  E.	  coli	  endotoxins	  administered	  into	  the	  uterine	  lumen	  has	  negative	  impacts	  on	  reproduction	  which	  suggests	  this	  may	  be	  due	  to	  the	  release	  of	  cortisol	  as	  a	  result	  of	  the	  inflammation	  (Lopez-­‐Diaz	  and	  Bosu,	  1992;	  Huszenicza	  et	  al.,	  2004).	  However,	  it	  is	  unclear	  if	  subclinical	  states	  of	  common	  disorders	  in	  dairy	  cows	  such	  as	  subclinical	  endometritis	  and	  mastitis	  trigger	  the	  same	  corticotrophin-­‐releasing	  hormone	  (CRH)	  responses	  from	  the	  hypothalamus.	  In	  addition,	  increased	  concentrations	  of	  cortisol	  are	  known	  to	  cause	  immunosuppressive	  effects	  in	  dairy	  cattle	  and	  swine	  (Hopster	  et	  al.,	  1998;	  Tuchscherer	  et	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  2	  A	  version	  of	  this	  chapter	  has	  been	  submitted	  for	  publication:	  Burnett,	  T.A.,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.	  Tahmasbi,	  D.M.	  Veira,	  R.L.A.	  Cerri.	  2014.	  Relationship	  of	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  with	  health,	  plasma	  metabolites	  and	  reproductive	  parameters	  in	  dairy	  cows.	  	   38	  al.,	  2004)	  and	  are	  linked	  to	  decreases	  in	  anti-­‐body	  concentrations	  and	  reductions	  in	  the	  phagocytic	  functions	  in	  monocytes	  and	  macrophages	  (Roth,	  1985).	  Chronic	  and	  acute	  stress	  can	  trigger	  disruptions	  in	  reproductive	  function.	  Chronic	  lameness	  in	  cattle,	  for	  example,	  is	  linked	  to	  disruptions	  in	  the	  pulsatile	  pattern	  of	  GnRH	  and	  consequent	  impairment	  of	  estrous	  behaviour	  expression	  (Walker	  et	  al.,	  2008).	  Acute	  stress,	  characterized	  as	  short	  term	  and	  normally	  measured	  through	  the	  blood,	  saliva	  and	  faeces,	  has	  detrimental	  effects	  on	  ovarian	  cyclicity	  by	  disrupting	  the	  normal	  release	  of	  hormones	  from	  the	  hypothalamus-­‐pituitary-­‐gonadal	  (HPG)	  axis	  that	  controls	  reproduction	  (Dobson	  et	  al.,	  2003;	  Smith	  et	  al.,	  2003).	  Stressors	  such	  as	  isolation,	  transport	  and	  restraint	  (acute	  causes)	  have	  been	  found	  to	  interfere	  with	  the	  endocrine	  events	  preceding	  ovulation	  and	  thus	  resulting	  in	  ovulation	  failure	  (Moberg,	  2000).	  	  Most	  of	  the	  literature	  in	  dairy	  cattle	  concerning	  cortisol	  measurements	  has	  been	  done	  in	  plasma	  (Forslund	  et	  al.,	  2010),	  saliva	  (Negrão	  et	  al.,	  2004)	  or	  faeces	  (Huzzey	  et	  al.,	  2011).	  Alternatively,	  the	  measurement	  of	  cortisol	  in	  hair	  has	  recently	  received	  attention	  and	  has	  the	  advantage	  of	  being	  a	  non-­‐invasive	  procedure;	  however	  no	  research	  has	  demonstrated	  the	  dynamic	  changes	  on	  how	  disease	  (clinical	  and	  subclinical)	  events	  and	  reproductive	  state	  modify	  the	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  over	  time.	  In	  addition,	  the	  relationship	  between	  cortisol	  in	  hair,	  energy	  metabolites	  and	  acute	  phase	  proteins	  is	  currently	  unclear	  and	  can	  provide	  valuable	  information	  about	  the	  validity	  of	  hair	  cortisol	  tests.	  	  The	  aim	  of	  this	  study	  was	  to	  determine	  the	  associations	  between	  cortisol	  in	  hair,	  as	  a	  measure	  of	  chronic	  stress,	  with	  clinical	  and	  subclinical	  health	  disorders,	  and	  	   39	  reproductive	  success	  in	  dairy	  cows.	  Furthermore,	  this	  study	  determined	  the	  association	  between	  cortisol	  in	  hair	  with	  energy	  metabolites	  in	  blood	  (glucose	  and	  BHBA)	  and	  acute	  phase	  proteins	  in	  plasma	  (ceruloplasmin	  and	  haptoglobin).	  It	  was	  hypothesized	  that	  (a)	  the	  concentration	  of	  cortisol	  found	  in	  the	  hair	  of	  dairy	  cows	  has	  a	  negative	  relationship	  with	  the	  health	  and	  reproductive	  success	  of	  dairy	  cows,	  and	  (b)	  there	  is	  a	  positive	  association	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  concentrations	  of	  BHBA,	  glucose,	  ceruloplasmin	  and	  haptoglobin	  in	  plasma	  during	  the	  transition	  period.	  	  3.2	  Materials	  and	  methods	  	  	   This	  experiment	  was	  conducted	  between	  June	  2011	  and	  March	  2012	  at	  the	  University	  of	  British	  Columbia’s	  Dairy	  Education	  and	  Research	  Centre,	  Agassiz,	  BC.	  All	  procedures	  were	  approved	  by	  the	  Animal	  Care	  Committee	  of	  the	  University	  of	  British	  Columbia.	  Animals	  used	  in	  this	  experiment	  were	  cared	  for	  as	  outlined	  by	  the	  guidelines	  provided	  by	  the	  Canadian	  Council	  of	  Animal	  Care	  (2009).	  	  3.2.1	  Animals	  and	  housing	  	  	   A	  total	  of	  118	  high	  producing	  Holstein	  dairy	  cows	  were	  used	  in	  this	  study	  which	  consisted	  of	  two	  experiments	  (Experiment	  1:	  n	  =	  64;	  Experiment	  2:	  n	  =	  54).	  Cows	  produced	  a	  mean	  ±	  SD	  of	  12,236	  ±	  2,219	  kg	  of	  milk	  (305-­‐d	  mature-­‐equivalent	  yield)	  and	  a	  range	  of	  body	  condition	  score	  (BCS)	  from	  1.75	  –	  3.25	  at	  30	  ±	  3	  DIM.	  All	  animals	  were	  housed	  in	  the	  same	  naturally	  ventilated	  wooden-­‐framed	  barn	  with	  a	  free	  stall	  design,	  equipped	  with	  deep	  sand	  bedded	  stalls.	  Animals	  were	  milked	  twice	  daily	  at	  0500	  and	  1500	  hr	  with	  automatic	  	   40	  milking	  machines.	  Fresh	  TMR	  was	  delivered	  twice	  daily	  at	  approximately	  0700	  and	  1600	  hr.	  The	  TMR	  was	  formulated	  following	  the	  NRC	  guidelines	  (NRC,	  2001)	  to	  meet	  or	  exceed	  the	  requirements	  of	  a	  620	  kg	  Holstein	  cow	  producing	  40	  kg/d	  of	  3.5%	  fat	  corrected	  milk;	  the	  animals	  had	  ad	  libitum	  access	  to	  both	  TMR	  and	  water.	  	  	  During	  both	  experimental	  periods,	  various	  potential	  forms	  of	  stressors	  were	  recorded,	  including	  retained	  placenta,	  clinical	  hypocalcaemia,	  displaced	  abomasum,	  bouts	  of	  clinical	  mastitis	  and	  metritis,	  surgical	  procedures,	  and	  milk	  yield	  (305-­‐d	  mature-­‐equivalent	  yield).	  All	  animals	  were	  body	  condition	  scored	  at	  30	  ±	  3	  DIM	  on	  a	  5-­‐point	  scale	  from	  thin	  (1)	  to	  obese	  (5)	  by	  increments	  of	  0.25	  as	  outlined	  by	  Edmonson	  et	  al.	  (1989).	  Animals	  were	  later	  classified	  as	  Thin	  (BCS	  <	  2.75),	  Average	  (BCS	  =	  2.75)	  or	  Moderate	  (BCS	  >	  2.75).	  All	  health	  and	  production	  information	  was	  collected	  with	  the	  assistance	  of	  the	  dairy	  herd	  personnel	  and	  the	  herd	  veterinarian,	  and	  recorded	  using	  the	  on-­‐farm	  Dairy	  Comp	  305	  software	  (Valley	  Agricultural	  Software,	  Tulare,	  CA).	  	  Experiment	  1	  Sixty-­‐four	  Holstein	  dairy	  cows	  were	  enrolled	  in	  Experiment	  1,	  including	  20	  primiparous	  and	  44	  multiparous	  cows.	  Each	  cow	  had	  hair	  sampled	  from	  the	  tail	  switch	  on	  the	  day	  of	  calving,	  and	  was	  resampled	  every	  3	  wk	  (21	  ±	  3	  DIM)	  until	  126	  ±	  3	  DIM;	  however,	  only	  samples	  on	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM	  were	  subsequently	  analyzed.	  Blood	  samples	  were	  collected	  at	  0,	  21,	  and	  42	  DIM	  and	  analyzed	  for	  glucose	  and	  BHBA.	  A	  visual	  schematic	  of	  the	  sampling	  schedule	  can	  be	  found	  in	  Figure	  3.1.	  Glucose	  and	  BHBA	  were	  used	  to	  investigate	  possible	  correlations	  of	  these	  metabolites	  and	  negative	  energy	  balance	  during	  	   41	  the	  transition	  period	  with	  hair	  cortisol	  samples.	  Cows	  were	  submitted	  to	  the	  regular	  reproductive	  program	  of	  the	  Dairy	  Centre	  that	  consisted	  of	  a	  pre-­‐synchronization	  with	  the	  administration	  of	  two	  injections	  of	  PGF2α	  14	  d	  apart	  at	  30	  ±	  3	  and	  44	  ±	  3	  DIM	  and	  artificial	  insemination	  (AI)	  performed	  upon	  spontaneous	  estrus	  from	  50	  until	  100	  DIM;	  if	  estrus	  was	  not	  detected	  by	  100	  DIM,	  cows	  were	  submitted	  to	  the	  ovsynch	  program	  (Pursley	  et	  al.,	  1997).	  At	  the	  time	  of	  each	  pre-­‐synchronization	  injection	  animals	  were	  examined	  by	  per	  rectum	  palpation	  using	  ultrasonography	  for	  cyclicity,	  diameter	  of	  the	  inner	  layer	  of	  the	  cervix	  and	  asymmetry	  of	  the	  diameter	  of	  the	  endometrium	  between	  both	  uterine	  horns	  and	  pregnancy	  diagnosis	  at	  40	  ±	  7	  d	  after	  AI;	  a	  more	  detailed	  description	  is	  included	  below.	  Animals	  were	  classified	  as	  being	  cyclic	  if	  they	  had	  a	  presence	  of	  at	  least	  one	  corpus	  luteum	  at	  the	  time	  of	  either	  pre-­‐synchronization	  injection.	  Estrous	  detection	  was	  carried	  out	  using	  a	  combination	  of	  visual	  observation	  and	  the	  use	  of	  automated	  activity	  monitors	  (Heatime®;	  SCR	  Engineering	  Ltd.,	  Netanya,	  Israel).	  Data	  on	  the	  reproductive	  success	  and	  episodes	  of	  health	  disorders	  of	  the	  animals	  were	  recorded.	  Animals	  were	  classified	  as	  Healthy	  if	  they	  had	  an	  absence	  of	  clinical	  disease	  during	  the	  entire	  experimental	  period,	  or	  as	  Clinically	  Diseased	  if	  they	  were	  diagnosed	  with	  one	  or	  more	  clinical	  disease	  event.	  Sampling	  methodologies	  are	  detailed	  below.	  	  Experiment	  2	  A	  different	  set	  of	  54	  Holstein	  dairy	  cows	  was	  used	  for	  Experiment	  2,	  consisting	  of	  24	  primiparous	  and	  30	  multiparous	  cows.	  Animals	  were	  chosen	  retrospectively	  by	  parity	  and	  divided	   into	   two	   groups	   according	   to	   their	   health	   status:	   diagnosed	   with	   subclinical	  endometritis	  (Endo)	  or	  healthy	  (control).	  All	  animals	  were	  enrolled	  at	  30	  ±	  3	  DIM.	  Samples	  	   42	  of	   hair	   and	  blood	  were	   collected	   and	   a	   uterine	  health	  diagnosis	  was	   obtained	   from	  each	  cow	   using	   a	   cytobrush	   and	   ultrasonography	   (Figure	   3.1).	   Subclinical	   endometritis	   was	  positively	  diagnosed	  when	  the	  proportion	  of	  neutrophils	  on	  the	  uterine	  smear	  was	  >	  18	  %	  in	  relation	  to	  the	  total	  number	  of	  cells	  (Kasimanickam	  et	  al.,	  2004);	  all	  animals	  in	  the	  Endo	  group	   were	   also	   diagnosed	   with	   some	   uterine	   luminal	   fluid	   (ecogenic	   or	   non-­‐ecogenic	  fluid)	   by	   the	   ultrasound	   examination.	   Uterine	   smears	   with	   <	   18%	   of	   neutrophils	   and	  absence	  of	  ecogenic	  fluid	  in	  the	  lumen	  of	  the	  uterus	  were	  classified	  as	  healthy	  and	  placed	  in	  the	  Control	  group;	  all	  animals	  in	  the	  Control	  group	  had	  an	  absence	  of	  clinical	  disease.	  Blood	  samples	  were	  analysed	  for	  acute	  phase	  proteins,	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin,	  and	  hair	  was	  analysed	  for	  cortisol.	  	  Sampling	  methodologies	  are	  detailed	  below.	  	  3.2.2	  Blood	  sampling	  and	  analysis	  	  	   All	  blood	  samples	  were	  drawn	  by	  puncture	  of	  the	  median	  coccygeal	  vein	  or	  artery	  utilizing	  untreated	  Vacutainer	  tubes	  (Becton	  Dickinson	  Vacutainer	  Systems,	  Rutherford,	  NJ)	  for	  Experiment	  1	  and	  K2EDTA	  Vacutainer	  tubes	  (Becton	  Dickinson	  Vacutainer	  Systems,	  Rutherford,	  NJ)	  for	  Experiment	  2.	  For	  Experiment	  1,	  whole	  blood	  was	  immediately	  analyzed	  for	  glucose	  (Precision	  Xtra	  blood	  glucose	  kit;	  Abbott	  Diabetes	  Care,	  Alameda,	  CA)	  and	  BHBA	  (Precision	  Xtra	  blood	  ketone	  kit;	  Abbott	  Diabetes	  Care,	  Alameda,	  CA)	  concentrations	  using	  the	  procedures	  described	  by	  Iwersen	  et	  al.	  (2009).	  For	  Experiment	  2,	  analyses	  for	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  were	  performed	  using	  the	  commercially	  available	  PHASE	  Haptoglobin	  kit	  (Tridelta	  Development	  Ltd.,	  TP801,	  Maynooth,	  CK,	  	   43	  Ireland)	  and	  using	  a	  method	  outlined	  by	  Demetriou	  et	  al.,	  (1974)	  determined	  by	  the	  rate	  of	  p-­‐phenylenediamine	  oxidation,	  respectively.	  	  3.2.3	  Hair	  sampling	  and	  analysis	  	  	   All	  hair	  samples	  collected	  for	  this	  study	  were	  harvested	  from	  the	  tail	  switch	  as	  described	  by	  Burnett	  et	  al.	  (2014).	  For	  the	  first	  hair	  collection	  in	  either	  experiment,	  the	  hair	  was	  cut	  as	  close	  to	  the	  skin	  as	  possible	  using	  surgical	  scissors,	  and	  the	  3	  cm	  closest	  to	  the	  skin	  was	  kept	  for	  analysis.	  For	  Experiment	  1,	  all	  subsequent	  hair	  samples	  were	  harvested	  from	  the	  same	  region	  and	  the	  total	  regrown	  hair	  was	  collected	  and	  used	  for	  analysis;	  only	  samples	  at	  0,	  21,	  42,	  84,	  126	  DIM	  were	  analysed.	  For	  Experiment	  2,	  only	  one	  sample	  was	  collected	  at	  30	  ±	  3	  DIM.	  Once	  the	  hair	  was	  collected,	  it	  was	  stored	  at	  room	  temperature	  in	  dry,	  non-­‐translucent	  envelopes	  in	  a	  dark	  room	  until	  analysis.	  Hair	  samples	  were	  cleaned,	  dried	  and	  ground	  according	  to	  the	  procedures	  outlined	  in	  Burnett	  et	  al.	  (2014).	  Grinding	  was	  performed	  on	  250	  mg	  of	  sample	  in	  a	  10	  ml	  stainless	  steel	  milling	  cup	  with	  a	  12	  mm	  stainless	  steel	  ball	  in	  a	  Retsch	  Mixer	  Mill	  MM400	  ball	  mill	  (Retsch,	  Hann,	  Germany)	  for	  5	  min	  at	  a	  frequency	  of	  30	  reps/sec.	  Ground	  hair	  samples	  were	  stored	  in	  the	  dark	  in	  glass	  jars	  at	  room	  temperature.	  	  Extraction	  of	  hair	  cortisol	  was	  performed	  using	  methanol	  following	  the	  procedures	  of	  Burnett	  et	  al.	  (2014),	  which	  were	  adapted	  from	  Koren	  et	  al.	  (2002).	  Hair	  cortisol	  concentrations	  were	  determined	  using	  a	  commercially	  available	  assay	  kit	  designed	  for	  salivary	  cortisol	  (Salimetrics	  Expanded	  Range,	  High	  Sensitivity	  1-­‐E3002,	  State	  College,	  PA),	  as	  previously	  performed	  by	  Davenport	  et	  al.	  (2006)	  and	  Bennett	  and	  Hayssen	  (2010).	  The	  	   44	  sensitivity	  of	  the	  cortisol	  kit	  was	  0.01	  ug/dl.	  Samples	  were	  analyzed	  for	  cortisol	  content	  following	  the	  instructions	  supplied	  by	  the	  manufacturer.	  Duplicate	  25	  ul	  samples	  were	  aliquoted	  into	  wells,	  and	  absorbance	  of	  the	  samples	  was	  read	  at	  450	  nm	  using	  a	  microplate	  plate	  reader	  (Biorad	  xMark,	  Hercules,	  CA).	  Results	  were	  calculated	  using	  the	  microplate	  reader	  software	  using	  a	  4	  parameter	  logistic	  curve	  fit.	  Results	  were	  converted	  from	  ug/dl	  to	  pg/mg.	  The	  average	  intra	  assay	  CV	  between	  samples	  on	  the	  plates	  was	  3.51%.	  	  3.2.4	  Uterine	  cytology	  and	  ultrasonography	  	  	   Uterine	  health	  monitoring	  was	  performed	  by	  the	  method	  of	  uterine	  cytology	  and	  ultrasound.	  Cytological	  examination	  of	  the	  endometrium	  was	  performed	  by	  way	  of	  a	  cytobrush	  (VWR	  Canlab,	  Mississauga,	  ON).	  The	  vulva	  was	  cleaned	  of	  any	  debris	  and	  the	  cytobrush,	  threaded	  onto	  a	  steal	  rod	  and	  covered	  with	  an	  outer	  steel	  tube,	  was	  inserted	  into	  the	  vagina	  and	  through	  the	  cervix.	  With	  contact	  of	  the	  uterine	  wall,	  the	  cytobrush	  was	  extended	  from	  inside	  the	  steel	  tube	  and	  immediately	  rotated	  to	  collect	  a	  sample.	  The	  cytobrush	  was	  then	  retracted	  inside	  the	  steel	  tube	  prior	  to	  removal	  from	  the	  uterus	  so	  as	  to	  not	  contaminate	  the	  sample.	  Once	  retracted,	  the	  cytobrush	  was	  rolled	  onto	  a	  glass	  microscope	  slide	  to	  make	  an	  endometrial	  smear.	  Smears	  were	  air-­‐dried	  and	  stained	  using	  a	  Romanowsky	  stain	  (Diff-­‐Quick,	  Fisher	  Diagnostics,	  Middletown,	  VA).	  The	  slides	  were	  examined	  to	  determine	  the	  percent	  neutrophils.	  	  To	  do	  so,	  three	  sections	  of	  100	  cells	  each	  were	  counted	  for	  each	  slide,	  and	  the	  total	  number	  of	  neutrophils	  and	  epithelial	  endometrial	  cells	  were	  tallied.	  Subclinical	  endometritis	  was	  defined	  when	  the	  proportion	  of	  neutrophils	  	   45	  was	  ≥	  18%	  in	  relation	  to	  the	  total	  number	  of	  the	  cells	  (Kasimanickam	  et	  al.,	  2004;	  Sheldon	  et	  al.,	  2006).	  	  After	  the	  uterine	  sample	  collection,	  ultrasonography	  was	  performed	  on	  the	  uterus	  via	  rectal	  palpation	  using	  an	  ultrasonographic	  machine	  (Aloka	  SSD-­‐500,	  Aloka	  Co	  Ltd.,	  Wallingford,	  CT)	  equipped	  with	  a	  7.5	  MHz	  linear	  transducer.	  The	  following	  uterine	  health	  measures	  that	  have	  previously	  been	  demonstrated	  to	  be	  associated	  with	  subclinical	  endometritis	  (Cerri	  et	  al.,	  2012)	  were	  measured:	  diameter	  of	  the	  inner	  layer	  of	  the	  cervix	  (Small	  <	  18	  mm	  ≤	  Large),	  asymmetry	  of	  the	  diameter	  of	  the	  endometrium	  between	  both	  uterine	  horns	  (Moderate	  <	  3	  mm	  ≤	  High)	  and	  lumen	  content	  (0	  =	  no	  fluid,	  1	  =	  clear	  fluid,	  2	  =	  fluid	  with	  intermediary	  ecogenocity,	  and	  3	  =	  fluid	  highly	  ecogenic).	  In	  addition,	  cyclicity	  was	  assessed	  by	  ultrasonography	  of	  each	  ovary	  by	  recording	  the	  presence	  of	  at	  least	  one	  corpus	  luteum	  at	  either	  30	  ±	  3	  or	  44	  ±	  3	  DIM.	  	  3.2.5	  Statistical	  analyses	  	  	  	   The	  key	  hypothesis	  for	  Study	  2	  was	  that	  health	  would	  have	  an	  effect	  (diseased	  >	  healthy)	  on	  cortisol	  concentrations.	  The	  acceptable	  difference	  (Δ)	  was	  defined	  as	  0.30	  (30%)	  with	  a	  one-­‐sided	  test	  (α	  =	  0.05)	  and	  power	  (1-­‐β)	  =	  0.8.	  Using	  these	  assumptions,	  25	  cows	  per	  group	  were	  required	  (Minitab	  17;	  Minitab	  Inc.,	  State	  College,	  PA).	  Analyses	  for	  this	  experiment	  were	  performed	  using	  SAS	  (version	  9.4;	  SAS	  Inst.	  Inc.,	  Cary,	  NC)	  using	  cow	  as	  the	  experimental	  unit.	  Prior	  to	  all	  analyses	  data	  were	  checked	  for	  normality	  using	  the	  UNIVARIATE	  procedure	  and	  probability	  distribution	  plots;	  any	  	   46	  variables	  deemed	  not	  normal	  were	  transformed	  to	  fit	  normality	  and	  subsequently	  back	  transformed	  for	  geometric	  means.	  For	  Experiment	  1,	  hair	  cortisol,	  BHBA	  and	  glucose	  concentrations	  in	  whole	  blood	  were	  used	  as	  dependent	  variables.	  Parity,	  BCS,	  milk	  production,	  cervical	  diameter,	  horn	  asymmetry,	  pregnancy	  status,	  and	  disease	  prevalence	  during	  the	  experimental	  period	  were	  evaluated.	  For	  Experiment	  2,	  hair	  cortisol,	  ceruloplasmin	  and	  haptoglobin	  concentrations	  were	  used	  as	  dependent	  variables.	  The	  effects	  of	  group,	  parity,	  BCS,	  milk	  production,	  cervical	  diameter,	  horn	  asymmetry,	  and	  disease	  prevalence	  prior	  to	  30	  DIM	  were	  used	  as	  independent	  variables.	  Continuous	  variables	  were	  analyzed	  using	  the	  MIXED	  procedure	  of	  SAS.	  For	  Experiment	  1,	  the	  model	  specified	  experimental	  day	  as	  the	  repeated	  measure	  and	  cow	  as	  the	  subject;	  an	  autoregressive	  covariance	  structure	  was	  used	  when	  more	  than	  2	  experimental	  days	  were	  included.	  Independent	  variables	  were	  first	  assessed	  by	  univariable	  analysis	  and	  eliminated	  from	  the	  final	  model	  once	  found	  insignificant.	  Pearson’s	  correlations	  were	  calculated	  using	  the	  CORR	  procedure	  and	  frequency	  statistics	  were	  calculated	  using	  the	  FREQ	  procedure.	  	  	  3.3	  Results	  	  Experiment	  1	  The	  mean	  hair	  cortisol	  concentration	  for	  the	  entire	  experimental	  period	  was	  9.8	  ±	  3.7	  pg/mg	  (Mean	  ±	  SD)	  for	  n	  =	  64	  cows.	  For	  both	  primiparous	  and	  multiparous	  cows,	  DIM	  had	  an	  effect	  on	  hair	  cortisol	  concentration:	  d	  21	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  than	  d	  42,	  d	  84	  and	  d	  126	  	  (Figure	  3.2;	  P	  <	  0.001).	  The	  same	  effect	  was	  also	  observed	  	   47	  when	  using	  only	  clinically	  healthy	  animals	  in	  the	  analysis	  (P	  <	  0.001).	  Furthermore,	  when	  using	  only	  clinically	  healthy	  animals,	  parity	  significantly	  affected	  hair	  cortisol	  concentrations,	  where	  multiparous	  animals	  had	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  than	  primiparous	  (Geometric	  Mean	  [95%	  CI])	  (9.2	  [8.2,	  10.4]	  vs.	  7.8	  [7.0,	  8.6]	  pg/mg;	  P	  =	  0.03).	  However,	  hair	  cortisol	  at	  d	  0	  (calving),	  probably	  representing	  circulating	  cortisol	  concentrations	  of	  the	  3	  to	  4	  wk	  period	  prior	  to	  calving,	  did	  not	  differ	  between	  multiparous	  and	  primiparous	  cows	  (P	  =	  0.78)	  or	  by	  the	  development	  of	  clinical	  disease	  within	  the	  experimental	  period	  (P	  =	  0.54).	  Multiparous	  cows	  with	  Moderate	  and	  Average	  BCS	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  than	  Thin	  cows	  at	  d	  0	  (12.0	  [10.2,	  14.1],	  11.0	  [9.1,	  13.3],	  8.7	  [7.4,	  10.3]	  pg/mg	  for	  Moderate,	  Average,	  and	  Thin	  cows,	  respectively;	  P	  =	  0.03);	  BCS	  did	  not	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations	  of	  primiparous	  cows	  at	  d	  0	  (P	  =	  0.66).	  	  For	  multiparous	  cows,	  clinical	  disease	  during	  the	  experimental	  period	  had	  a	  significant	  effect	  on	  cortisol	  concentration	  in	  hair.	  Multiparous	  cows	  that	  were	  classified	  as	  clinically	  diseased	  had	  greater	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  than	  those	  with	  an	  absence	  of	  disease	  (Figure	  3.3;	  P	  =	  0.02).	  The	  frequency	  of	  disease	  events	  within	  the	  experimental	  period	  also	  affected	  hair	  cortisol	  concentrations,	  as	  multiparous	  cows	  with	  2	  or	  more	  disease	  events	  had	  elevated	  concentrations	  in	  comparison	  to	  healthy	  cows	  (Figure	  3.3;	  P	  =	  0.03);	  from	  this	  trial	  we	  were	  unable	  to	  determine	  if	  clinical	  disease	  had	  an	  effect	  on	  primiparous	  cows	  due	  to	  the	  low	  prevalence	  of	  disease	  in	  these	  animals	  (5.0%;	  1/20).	  Furthermore,	  animals	  with	  clinical	  disease	  tended	  to	  have	  higher	  hair	  cortisol	  at	  d	  21	  (P	  =	  0.05),	  d	  84	  (P	  =	  0.05),	  and	  d	  126	  (P	  =	  0.07)	  DIM	  (Figure	  3.4).	  	  	   48	  Throughout	  the	  experimental	  period,	  39.1%	  (24/64)	  of	  the	  overall	  animals	  were	  classified	  as	  clinically	  diseased	  (i.e.:	  	  diagnosed	  with	  at	  least	  one	  clinical	  disease).	  The	  following	  types	  of	  clinical	  diseases	  were	  diagnosed	  during	  the	  experimental	  period:	  mastitis	  (n	  =	  19),	  clinical	  metritis	  (n	  =	  7),	  displaced	  abomasum	  (n	  =	  3),	  retained	  placenta	  (n	  =	  4),	  milk	  fever	  (n	  =	  5),	  clinical	  ketosis	  (n	  =	  1)	  and	  chronic	  lameness	  (n	  =	  2).	  These	  clinical	  diseases	  were	  distributed	  among	  animals	  as	  follows:	  13	  animals	  were	  diagnosed	  with	  multiple	  clinical	  diseases,	  7	  were	  diagnosed	  with	  only	  mastitis	  (one	  or	  more	  bouts	  per	  animal),	  and	  5	  were	  diagnosed	  with	  only	  one	  clinical	  disease	  other	  than	  mastitis.	  	  	  Within	  the	  transition	  period,	  whole	  blood	  concentrations	  of	  glucose	  had	  a	  positive	  effect	  on	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  for	  multiparous	  cows	  (slope	  =	  m	  =	  0.11	  Ln	  cortisol/	  glucose;	  P	  =	  0.03);	  there	  was	  a	  tendency	  for	  a	  negative	  relationship	  between	  hair	  cortisol	  and	  BHBA	  (m	  =	  -­‐	  0.12	  Ln	  cortisol/	  Ln	  BHBA;	  P	  =	  0.11).	  For	  primiparous	  cows,	  glucose	  concentration	  had	  a	  positive	  relationship	  with	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  (m	  =	  0.09	  Ln	  cortisol/	  glucose;	  P	  =	  0.04);	  BHBA	  did	  not	  have	  an	  effect	  on	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  primiparous	  cows	  (P	  =	  0.18).	  Correlations	  between	  hair	  cortisol,	  BHBA	  and	  glucose	  at	  21	  DIM	  are	  shown	  in	  Figure	  3.5.	  Although	  hair	  cortisol	  and	  blood	  glucose	  tended	  to	  be	  correlated,	  only	  7%	  of	  the	  variation	  in	  hair	  cortisol	  was	  explained	  by	  blood	  glucose	  (R2	  =	  0.07;	  P	  =	  0.07).	  	  Glucose	  concentrations	  of	  multiparous	  cows	  were	  effected	  by	  disease,	  where	  clinically	  diseased	  animals	  had	  higher	  concentrations	  than	  healthy	  animals	  (8.8	  [7.8,	  10.0]	  vs.	  10.7	  [9.4,	  12.1]	  mg/dl).	  BHBA	  concentrations	  did	  not	  differ	  between	  animals	  classified	  as	  clinically	  diseased	  or	  healthy.	  Neither	  cervix	  diameter	  (P	  =	  0.86)	  nor	  asymmetry	  of	  	   49	  uterine	  horns	  (P	  =	  0.20)	  affected	  hair	  cortisol	  concentrations	  within	  multiparous	  cows.	  However,	  primiparous	  cows	  with	  a	  cervix	  diameter	  classified	  as	  Large	  were	  found	  to	  have	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  within	  the	  transition	  period	  than	  those	  classified	  as	  Small	  (9.3	  [8.1,	  10.6]	  vs.	  7.5	  [6.7,	  8.4]	  mm	  for	  Large	  and	  Small	  cervix	  diameter,	  respectively;	  P	  =	  0.02).	  Hair	  cortisol	  concentrations	  of	  multiparous	  cows	  that	  were	  pregnant	  at	  100	  DIM	  were	  lower	  at	  d	  42	  (P	  =	  0.04)	  and	  at	  d	  84	  (P	  =	  0.03),	  but	  not	  at	  d	  0,	  d	  21,	  or	  d	  126	  (Figure	  3.6).	  The	  proportion	  of	  multiparous	  cows	  that	  were	  clinically	  diseased	  or	  healthy	  was	  different	  between	  cows	  that	  were	  diagnosed	  pregnant	  or	  non-­‐pregnant	  at	  100	  DIM,	  where	  20.0%	  of	  pregnant	  cows	  and	  71.4%	  of	  non-­‐pregnant	  cows	  were	  diagnosed	  with	  clinical	  disease.	  These	  effects	  were	  not	  observed	  in	  primiparous	  cows	  that	  were	  pregnant	  at	  100	  DIM	  at	  any	  of	  the	  sampling	  periods	  analyzed.	  At	  the	  end	  of	  the	  pre-­‐synchronization	  75.0%	  of	  all	  cows	  were	  classified	  as	  being	  cyclic	  (55.0%	  of	  primiparous	  and	  84.1%	  of	  multiparous).	  Hair	  cortisol	  concentrations	  were	  not	  different	  for	  animals	  that	  were	  cyclic	  compared	  to	  those	  that	  did	  not	  cycle	  for	  either	  parity.	  	  Experiment	  2	  The	  mean	  cortisol	  concentration	  was	  12.6	  ±	  5.6	  pg/mg	  (Arithmetic	  Mean	  ±	  SD)	  for	  n	  =	  54	  cows.	  No	  effect	  of	  group	  (Endo	  vs.	  Control)	  was	  found	  for	  either	  parity	  (P	  =	  0.84).	  Comparative	  statistics	  for	  the	  Endo	  and	  Control	  groups	  have	  been	  summarized	  in	  Table	  3.1.	  There	  was	  a	  disproportionate	  number	  of	  animals	  that	  were	  clinically	  ill	  by	  30	  DIM	  found	  between	  parity;	  12.5%	  of	  the	  primiparous	  animals	  were	  diagnosed	  with	  disease	  compared	  	   50	  to	  36.7%	  of	  multiparous	  animals	  (P	  =	  0.04).	  For	  multiparous	  cows,	  there	  was	  an	  effect	  of	  BCS	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  with	  Moderate	  having	  greater	  cortisol	  than	  both	  Average	  and	  Thin	  (22.2	  [15.5,	  31.8],	  12.0.	  [9.7,	  14.8],	  and	  13.1	  [10.9,	  15.9]	  pg/mg	  of	  cortisol	  in	  hair	  for	  BCS	  categories	  Moderate,	  Average,	  and	  Thin,	  respectively).	  No	  effects	  of	  BCS	  were	  found	  for	  primiparous	  cows.	  Additionally,	  milk	  yield	  and	  hair	  cortisol	  tended	  to	  have	  a	  negative	  relationship	  for	  both	  multiparous	  (P	  =	  0.08)	  and	  primiparous	  cows	  (P	  =	  0.07),	  where	  greater	  milk	  yield	  was	  associated	  with	  lower	  hair	  cortisol.	  Cyclicity,	  cervix	  diameter,	  and	  asymmetry	  of	  uterine	  horns	  had	  no	  effect	  on	  hair	  cortisol	  found	  within	  either	  parity.	  When	  using	  only	  animals	  with	  an	  absence	  of	  clinical	  disease	  there	  was	  an	  effect	  of	  parity,	  where	  multiparous	  cows	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  than	  primiparous	  (12.9	  [10.4,	  15.9]	  vs.	  9.0	  [7.4,	  10.8]	  pg/mg;	  P	  =	  0.01).	  	  Haptoglobin	  concentration	  was	  not	  affected	  by	  group	  (P	  =	  0.67);	  however,	  milk	  yield	  had	  an	  effect	  on	  haptoglobin	  concentration,	  as	  cows	  with	  greater	  concentrations	  of	  haptoglobin	  tended	  to	  produce	  less	  milk	  (P	  =	  0.05).	  Animals	  with	  at	  least	  one	  clinical	  disease	  prior	  to	  30	  DIM	  tended	  to	  have	  greater	  haptoglobin	  concentrations	  than	  animals	  with	  an	  absence	  of	  disease	  (0.79	  [0.66,	  0.93]	  vs.	  0.63	  [0.56,	  0.70]	  mg/ml;	  P	  =	  0.06).	  Although	  ceruloplasmin	  concentrations	  were	  not	  affected	  by	  group	  (P	  =	  0.78),	  there	  was	  a	  tendency	  for	  clinical	  disease	  to	  affect	  ceruloplasmin	  concentrations.	  Animals	  with	  at	  least	  one	  clinical	  disease	  event	  tended	  to	  have	  greater	  ceruloplasmin	  than	  healthy	  animals	  (10.9	  [8.9,	  13.0)	  vs.	  8.5	  (7.1,	  9.8)	  mg/dl;	  P	  =	  0.08).	  Animals	  with	  a	  Moderate	  BCS	  had	  greater	  ceruloplasmin	  concentrations	  than	  both	  Average	  and	  Thin	  animals	  (11.44	  [9.15,	  13.73],	  9.35	  [7.73,	  10.97],	  8.21	  [6.66,	  9.75]	  mg/dl	  for	  BCS	  categories	  Moderate,	  Average	  and	  Thin,	  respectively).	  Cows	  diagnosed	  with	  clinical	  disease	  within	  the	  first	  30	  DIM	  produced	  less	  	   51	  milk	  than	  healthy	  animals	  (10,835	  ±	  453	  vs.	  11,525	  ±	  634	  kg;	  P	  =	  0.02);	  although	  milk	  yield	  was	  not	  affected	  by	  group	  (P	  =	  0.39).	  Interestingly,	  if	  group	  is	  replaced	  by	  percent	  neutrophils	  in	  the	  model,	  both	  haptoglobin	  (P	  =	  0.02)	  and	  ceruloplasmin	  (P	  =	  0.02)	  are	  positively	  affected	  by	  percent	  neutrophils;	  however,	  hair	  cortisol	  concentration	  is	  not	  affected	  by	  percent	  neutrophils	  (P	  =	  0.41).	  	  No	  correlation	  was	  found	  between	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  and	  haptoglobin	  or	  ceruloplasmin	  concentration	  in	  plasma	  (Table	  3.2).	  A	  strong	  correlation	  between	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  concentrations	  was	  found	  (P	  <	  0.001;	  Table	  3.2).	  	  All	  correlations	  found	  between	  hair	  cortisol,	  plasma	  haptoglobin,	  plasma	  ceruloplasmin,	  neutrophils,	  milk	  yield,	  and	  cervix	  diameter	  are	  summarized	  in	  Table	  3.2.	  	  	  3.4	  Discussion	  	  	   The	  aim	  of	  this	  study	  was	  to	  investigate	  the	  association	  of	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  with	  known	  stressors	  (clinical	  and	  subclinical	  disease),	  pregnancy	  status	  and	  with	  concentrations	  of	  other	  metabolic	  and	  inflammatory	  markers	  in	  blood	  (BHBA,	  glucose,	  ceruloplasmin	  and	  haptoglobin).	  In	  addition,	  other	  variables	  such	  as	  DIM,	  milk	  yield,	  parity,	  BCS,	  cervix	  diameter	  and	  asymmetry	  of	  the	  uterine	  horns	  were	  evaluated.	  As	  initially	  hypothesized,	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  can	  be	  used	  to	  detect	  significant	  differences	  when	  comparing	  healthy	  with	  clinically	  diseased	  lactating	  cows,	  and	  can	  demonstrate	  that	  multiparous	  cows	  pregnant	  by	  100	  DIM	  have	  lower	  levels	  of	  cortisol	  in	  hair	  at	  42	  and	  84	  DIM	  compared	  with	  non-­‐pregnant	  ones.	  However	  we	  were	  unable	  to	  find	  any	  associations	  	   52	  between	  cortisol	  in	  hair	  and	  some	  important	  biomarkers	  found	  in	  blood.	  Furthermore,	  when	  a	  subclinical	  form	  of	  disease	  that	  is	  common	  to	  dairy	  cows	  (endometritis)	  was	  evaluated,	  the	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  was	  unaffected.	  Hair	  cortisol	  has	  been	  described	  in	  the	  literature	  as	  a	  chronic	  stress	  marker	  in	  dairy	  cattle	  (Comin	  et	  al.,	  2013).	  The	  choice	  for	  using	  cortisol	  in	  hair,	  a	  relatively	  new	  biomarker	  in	  humans	  and	  domestic	  species	  (Meyer	  and	  Novak,	  2012),	  to	  measure	  chronic	  HPA	  axis	  activation	  relies	  in	  the	  sampling	  advantages	  associated	  with	  the	  long	  term	  interpretation	  of	  the	  results.	  However,	  the	  literature	  on	  dairy	  cows	  lacks	  information	  on	  the	  validity	  of	  this	  test	  in	  relation	  to	  common	  stressors	  and	  factors	  (e.g.:	  environmental,	  clinical	  and	  subclinical	  disorders,	  pregnancy	  status,	  etc.)	  and	  its	  correlation	  with	  other	  important	  biomarkers.	  The	  results	  from	  this	  study	  demonstrate	  that	  clinical	  disease	  in	  early	  lactation	  significantly	  altered	  the	  concentration	  of	  cortisol	  in	  dairy	  cattle	  hair;	  however,	  Experiment	  2	  showed	  a	  lack	  of	  an	  effect	  of	  subclinical	  endometritis	  on	  hair	  cortisol.	  Our	  results	  are	  consistent	  with	  those	  of	  Comin	  et	  al.	  (2013)	  who	  reported	  that	  animals	  that	  were	  clinically	  compromised	  with	  mastitis,	  lameness,	  clinical	  metritis,	  or	  multiple	  illnesses	  had	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  than	  clinically	  healthy	  animals.	  	  Much	  of	  the	  literature	  relating	  stress	  to	  health	  and	  reproduction	  has	  used	  plasma	  cortisol	  as	  a	  biomarker	  of	  stress.	  Our	  findings	  are	  further	  supported	  by	  studies	  demonstrating	  increased	  plasma	  cortisol	  concentrations	  in	  animals	  with	  naturally	  occurring	  mastitis	  (Huszenicza	  et	  al.,	  2004),	  retained	  placenta	  (Kaczmarowski	  et	  al.,	  2006;	  Peter	  and	  Bosu,	  1987),	  hypocalcaemia	  (Horst	  and	  Jorgensen,	  1982)	  and	  parturient	  paresis	  (Horst	  and	  Jorgensen,	  1982;	  Forslund	  et	  al.,	  2010),	  but	  not	  in	  animals	  with	  puerperal	  	   53	  metritis	  (Kaczmarowski	  et	  al.,	  2006).	  	  In	  contrast,	  Forslund	  et	  al.	  (2010)	  reported	  no	  evidence	  to	  support	  increased	  serum	  cortisol	  concentration	  as	  a	  result	  of	  clinical	  metritis,	  suggesting	  that	  specific	  illnesses	  may	  elicit	  different	  HPA	  responses.	  The	  use	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  as	  a	  biomarker	  for	  health	  status	  appears	  to	  be	  ideal	  for	  chronic	  health	  conditions	  found	  in	  cows,	  as	  it	  removes	  the	  short	  temporal	  changes	  that	  may	  affect	  cortisol	  concentrations	  found	  in	  plasma	  analysis	  (e.g.:	  circadian	  rhythms,	  specific	  time	  of	  start	  and	  end	  of	  the	  clinical	  disease,	  degree	  of	  HPA	  response,	  etc.).	  The	  diagnosis	  of	  subclinical	  endometritis	  does	  not	  describe	  the	  severity	  of	  the	  inflammation	  over	  time.	  Although	  animals	  with	  clinical	  metritis	  are	  more	  likely	  to	  be	  diagnosed	  with	  subclinical	  endometritis	  (Rutigliano	  et	  al.,	  2008;	  Galvão	  et	  al.,	  2010),	  not	  every	  animal	  diagnosed	  with	  subclinical	  endometritis	  has	  had	  clinical	  metritis.	  In	  Experiment	  2	  we	  did	  not	  find	  an	  increase	  in	  hair	  cortisol,	  plasma	  haptoglobin,	  or	  plasma	  ceruloplasmin	  concentration	  in	  cows	  diagnosed	  with	  subclinical	  endometritis	  diagnosis.	  Furthermore,	  we	  found	  limited	  evidence	  that	  uterine	  health	  factors	  that	  are	  correlated	  with	  subclinical	  endometritis	  (cervix	  diameter	  and	  endometrial	  asymmetry	  between	  both	  uterine	  horns)	  affected	  hair	  cortisol	  concentrations.	  Although	  there	  has	  been	  a	  disagreement	  in	  the	  literature	  with	  respect	  to	  HPA	  axis	  activation	  caused	  by	  subclinical	  and	  clinical	  uterine	  infection,	  some	  reports	  suggest	  that	  there	  is	  no	  HPA	  axis	  activation,	  with	  no	  significant	  increase	  in	  plasma	  cortisol	  concentrations	  in	  animals	  with	  metritis	  (Forslund	  et	  al.,	  2010;	  Galvão	  et	  al.,	  2010).	  Kaczmarowski	  et	  al.	  (2006)	  also	  reported	  that	  animals	  with	  puerperal	  metritis	  did	  not	  have	  increased	  plasma	  cortisol	  concentrations.	  This	  is,	  to	  our	  knowledge,	  the	  first	  publication	  to	  demonstrate	  that	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  are	  not	  different	  between	  cows	  with	  or	  without	  subclinical	  endometritis.	  	  	   54	  In	  agreement	  with	  the	  current	  study,	  Galvão	  et	  al.	  (2010)	  reported	  that	  animals	  with	  subclinical	  endometritis	  did	  not	  have	  significantly	  different	  haptoglobin	  concentrations	  compared	  to	  healthy	  animals	  between	  parturition	  and	  42	  DIM.	  On	  the	  contrary,	  Huzzey	  et	  al.	  (2009)	  reported	  that	  even	  animals	  with	  mild	  metritis	  had	  significantly	  higher	  haptoglobin	  concentrations	  than	  healthy	  animals;	  mild	  metritis	  was	  defined	  as	  either	  having	  a	  vaginal	  discharge	  score	  of	  4	  without	  fever,	  or	  a	  vaginal	  discharge	  of	  2	  or	  3	  with	  or	  without	  fever).	  Huzzey	  et	  al.	  (2009)	  reported	  that	  animals	  with	  metritis	  (both	  mild	  and	  severe)	  had	  increased	  serum	  haptoglobin	  concentrations	  until	  12	  days	  postpartum.	  	  The	  detrimental	  effects	  of	  chronic	  stress	  on	  fertility	  were	  demonstrated	  in	  this	  study	  by	  an	  increase	  in	  days	  open	  found	  in	  multiparous	  animals	  that	  had	  higher	  hair	  cortisol	  concentrations	  at	  42	  and	  84	  DIM.	  The	  causes	  for	  delayed	  pregnancy	  may	  be	  due	  to	  the	  adverse	  effects	  stress	  and	  stress	  mediators	  have	  on	  the	  HPA	  axis,	  specifically	  on	  ovulation	  and	  embryonic	  loss;	  especially	  since	  samples	  at	  42	  and	  84	  DIM	  represent	  the	  critical	  time	  of	  first	  artificial	  insemination.	  Chronic	  stress	  has	  a	  negative	  impact	  on	  GnRH,	  resulting	  in	  a	  postponed	  LH	  surge	  (Dobson	  and	  Smith,	  2000)	  and	  delayed	  ovulation	  times	  (Walker	  et	  al.,	  2008);	  during	  chronic	  stress,	  the	  impact	  can	  be	  so	  severe	  that	  the	  animal	  may	  enter	  anestrous	  (Dobson	  and	  Smith,	  2000).	  Ovulation	  times	  are	  especially	  important	  in	  modern	  dairy	  farming	  systems	  where	  the	  use	  of	  artificial	  insemination	  is	  relied	  upon.	  Delays	  of	  the	  LH	  surge	  also	  impacts	  embryonic	  development	  by	  depriving	  the	  ovarian	  follicles	  of	  gonadotropin	  support	  resulting	  in	  reduced	  estradiol	  production	  and	  thus	  decreasing	  the	  quality	  and	  fertility	  of	  oocytes	  (von	  Borell	  et	  al.,	  2007).	  	  	   55	  Furthermore,	  increased	  cortisol	  concentrations	  found	  at	  42	  and	  84	  DIM	  may	  be	  indicative	  of	  increased	  disease	  during	  the	  transition	  period.	  As	  each	  sample	  represents	  a	  3	  wk	  period	  of	  hair	  growth	  prior	  to	  the	  sample	  date,	  it	  may	  be	  concluded	  that	  hair	  samples	  from	  42	  and	  84	  DIM	  represent	  circulating	  cortisol	  concentrations	  from	  very	  early	  in	  lactation.	  Since	  animals	  that	  were	  non-­‐pregnant	  at	  100	  DIM	  had	  a	  higher	  prevalence	  of	  clinical	  disease,	  in	  addition	  to	  increase	  cortisol	  concentrations,	  it	  may	  be	  symptomatic	  of	  transition	  diseases.	  Transition	  diseases,	  such	  as	  metritis	  and	  retained	  placenta,	  have	  been	  associated	  with	  reduced	  pregnancy	  rates	  and	  a	  longer	  calving	  to	  pregnancy	  interval	  (Dobson	  and	  Esslemont,	  2002;	  LeBlanc,	  2010).	  	  The	  current	  experiment	  demonstrated	  an	  effect	  of	  parity	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair.	  In	  both	  experiments	  of	  this	  study,	  multiparous	  animals	  had	  greater	  hair	  cortisol	  concentrations	  than	  primiparous	  animals;	  there	  was	  a	  relative	  bias	  in	  our	  analysis	  as	  multiparous	  cows	  had	  greater	  prevalence	  of	  clinical	  disorders	  (Exp	  1:	  54.6%	  [24/44];	  Exp	  2:	  36.7%	  [11/30])	  than	  primiparous	  cows	  (Exp1:	  5.0%	  [1/20];	  Exp	  2:	  12.5	  [3/24]),	  thus	  only	  animals	  absent	  of	  clinical	  disease	  were	  used	  in	  the	  analysis	  for	  parity.	  Using	  milk	  cortisol	  concentrations,	  Fukasawa	  et	  al.	  (2008)	  observed	  no	  difference	  in	  cortisol	  concentrations	  between	  primiparous	  and	  multiparous	  cows	  and	  found	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  early	  lactation	  (7	  –	  90	  DIM)	  than	  in	  mid-­‐	  and	  late-­‐lactation.	  When	  compared	  with	  other	  studies	  that	  used	  plasma	  samples,	  these	  results	  are	  conflicting.	  Galvão	  et	  al.	  (2010)	  reported	  that	  primiparous	  cows	  tended	  to	  have	  greater	  cortisol	  concentrations	  in	  plasma,	  but	  samples	  were	  collected	  only	  until	  42	  DIM.	  One	  report	  suggested	  that	  cortisol	  concentrations	  in	  plasma	  peak	  at	  parturition	  and	  return	  to	  baseline	  after	  10	  d	  postpartum	  (Forslund	  et	  al.,	  2010),	  while	  a	  different	  study	  reported	  increases	  in	  	   56	  cortisol	  only	  last	  from	  1	  d	  prior	  to	  parturition	  until	  3	  d	  after	  (Goff	  et	  al.,	  1989).	  The	  different	  results	  observed	  in	  studies	  using	  plasma,	  milk	  and	  saliva	  samples	  as	  the	  medium	  to	  measure	  HPA	  axis	  activation	  are	  another	  example	  of	  how	  different	  methodologies	  and	  experimental	  designs	  between	  studies	  play	  a	  vital	  role	  in	  the	  interpretation	  of	  results.	  In	  this	  study,	  during	  the	  transition	  period,	  multiparous	  animals	  that	  were	  classified	  as	  clinically	  diseased	  had	  greater	  glucose	  concentrations	  than	  healthy	  multiparous	  animals,	  and	  hair	  cortisol	  concentration	  had	  a	  positive	  relationship	  with	  plasma	  glucose.	  Galvão	  et	  al.	  (2010)	  also	  found	  that	  there	  was	  a	  positive	  association	  between	  plasma	  cortisol	  and	  plasma	  glucose,	  but	  similar	  with	  this	  study,	  the	  association	  only	  explained	  7%	  of	  the	  variation.	  Previous	  research	  has	  shown	  that	  plasma	  glucose	  concentration	  decreases	  rapidly	  during	  the	  first	  wk	  postpartum,	  but	  begins	  to	  recover	  during	  the	  second	  wk	  postpartum	  (Vazquez-­‐Añon	  et	  al.,	  1994;	  Galvão	  et	  al.,	  2010).	  The	  samples	  for	  this	  study	  were	  collected	  at	  21	  and	  42	  DIM,	  which	  could	  explain	  the	  absence	  of	  an	  effect	  of	  DIM	  in	  this	  study.	  	  	  Even	  though	  it	  has	  been	  reported	  that	  daily	  milk	  production	  and	  milk	  cortisol	  concentration	  are	  not	  well	  correlated	  (Fukasawa	  et	  al.,	  2008),	  in	  Experiment	  2,	  we	  found	  that	  cows	  with	  greater	  lactation	  milk	  yields	  had	  lower	  hair	  concentrations	  of	  cortisol	  at	  33	  DIM.	  The	  relationship	  of	  cortisol	  with	  respect	  to	  the	  daily	  milk	  production	  might	  be	  different	  than	  with	  the	  whole	  lactation	  yield	  (Fukasawa	  et	  al.,	  2008).	  Another	  study	  reported	  that	  animals	  with	  greater	  milk	  production	  have	  decreased	  adrenocortisol	  reactivity,	  but	  suggested	  these	  differences	  may	  be	  more	  related	  to	  factors	  contributing	  to	  negative	  energy	  balance	  than	  specifically	  milk	  production;	  overall,	  in	  that	  study,	  baseline	  	   57	  levels	  of	  cortisol	  were	  similar	  between	  high	  and	  low	  milk	  producing	  animals	  (Beerda	  et	  al.,	  2004).	  The	  measurement	  of	  cortisol	  concentrations	  in	  hair	  can	  detect	  significant	  differences	  when	  comparing	  healthy	  with	  diseased	  lactating	  cows,	  and	  can	  detect	  a	  difference	  in	  hair	  cortisol	  of	  multiparous	  cows	  that	  are	  pregnant	  by	  100	  DIM.	  We	  were	  unable	  to	  find	  any	  associations	  between	  hair	  cortisol	  and	  some	  important	  markers	  found	  in	  blood.	  Furthermore,	  when	  subclinical	  endometritis	  was	  evaluated,	  hair	  cortisol	  concentrations	  were	  unaffected.	  The	  measurement	  of	  cortisol	  in	  hair	  can	  offer	  advantages	  over	  the	  traditional	  methods	  as	  a	  surveillance	  method	  for	  chronic	  stress.	  The	  measurements	  appear	  to	  be	  associated	  with	  clinical	  disorders	  and	  have	  a	  direct	  association	  with	  pregnancy	  outcomes;	  however	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  may	  not	  be	  suited	  to	  differentiate	  situations	  with	  disorders	  of	  lower	  magnitude,	  such	  as	  subclinical	  disease.	  	  	  	   	  	   58	  Table	  3.1:	  Comparative	  statistics	  (Geometric	  Mean	  [95%	  CI])	  for	  the	  Subclinical	  endometritis	  (Endo)	  and	  Control	  groups	  of	  Experiment	  2.	  Milk	  production	  is	  represented	  as	  the	  305-­‐d	  mature-­‐equivalent	  yield,	  concentrations	  of	  cortisol	  were	  measured	  from	  hair	  samples,	  whereas	  concentrations	  of	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  were	  measured	  in	  plasma	  samples.	  	   Control	  Mean	  [95%	  CI]	   Endo	  Mean	  [95%	  CI]	   	   P	   	  Neutrophils	  (%)	   4.2	  [2.6,	  7.0]	   56.2	  [47.4,	  65.8]	   <0.001	   	  Milk	  Production	  (kg)	   11265	  [9950,	  12580]	   11325	  [10370,	  12280]	   0.94	   	  Cortisol	  (pg/mg)	   11.5	  [9.7,	  13.7]	   11.3	  [9.6,	  13.3]	   0.84	   	  Haptoglobin	  (mg/ml)	   0.70	  [0.59,	  0.82]	   0.72	  [0.64,	  0.81]	   0.74	   	  Ceruloplasmin	  (mg/dl)	   9.67	  [7.83,	  11.51]	   9.66	  [8.34,	  10.98]	   0.95	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   59	  Table	  3.2:	  Pearson	  correlation	  coefficients	  found	  between	  hair	  cortisol,	  plasma	  haptoglobin,	  plasma	  ceruloplasmin,	  percent	  neutrophils1,	  milk	  yield2	  and	  cervix	  endometrium	  diameter	  in	  Holstein	  dairy	  cows	  (Experiment	  2).	  	   Cortisol	  (pg/mg)	   Haptoglobin	  (mg/ml)	   Ceruloplasmin	  (mg/dl)	   Neutrophils	  (%)	   Milk	  Yield	  (kg)	  Cervix	  Diameter	  (mm)	  Cortisol	  (pg/mg)	   1.00	  	   -­‐	  0.13	  P	  =	  0.36	   0.04	  P	  =	  0.78	   0.06	  P	  =	  0.66	   -­‐	  0.27	  P	  =	  0.04	   0.03	  P	  =	  0.84	  Haptoglobin	  (mg/ml)	   	   1.00	  	   0.71	  P	  <	  0.01	   0.42	  P	  <	  0.01	   -­‐	  0.40	  P	  <	  0.01	   0.39	  P	  <	  0.01	  Ceruloplasmin	  (mg/dl)	   	   	   1.00	  	   0.33	  P	  =	  0.02	   -­‐	  0.30	  P	  =	  0.03	   0.24	  P	  =	  0.09	  Neutrophils	  (%)	   	   	   	   1.00	  	   -­‐	  0.35	  P	  =	  0.01	   0.54	  P	  <	  0.01	  Milk	  Yield	  	  (kg)	   	   	   	   	   1.00	  	   -­‐	  0.15	  P	  =	  0.27	  Cervix	  Diameter	  (mm)	  	   	   	   	   	   1.00	  	  1Percent	  neutrophils	  were	  measured	  as	  the	  percent	  neutrophil	  cells	  out	  of	  total	  neutrophil	  and	  epithelial	  cells	  found	  from	  a	  uterine	  cytology	  smear.	  2Milk	  yield	  was	  measured	  as	  the	  305-­‐d	  mature-­‐equivalent	  yield.	  	  	  	  	  	  	   	  	   60	  Figure	  3.1:	  Schematic	  of	  the	  experimental	  and	  sampling	  design	  of	  Experiment	  1	  and	  Experiment	  2.	  Hair	  samples	  were	  collected	  every	  21	  d,	  but	  were	  only	  analyzed	  for	  days	  indicated	  with	  “Hair	  Analysis”	  for	  Experiment	  1.	  Hair	  was	  only	  sampled	  and	  analyzed	  on	  d30	  for	  Experiment	  2.	  Plasma	  and	  cytology	  samples	  were	  collected	  and	  analyzed	  for	  the	  days	  indicated	  with	  “Plasma”	  and	  “Cytology”,	  respectively.	  Calving	  is	  indicated	  on	  the	  schematic	  as	  “d0”	  for	  both	  experiments.	  	  	  d0# d21# d42# d63# d84# d105# d126## ## # #Experiment#1### ###!# !# !# !# !#" " "#!#"★ Cytology#Sample#Plasma#Sample#and#Analysis#Hair#Analysis#Hair#Sample#Health#Record#Collection#Pregnancy#Diagnosis#d0# d30#Experiment#2##!#"★Health#Record#Collection#	   61	  Figure	  3.2:	  Effect	  of	  DIM	  on	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  extracted	  from	  hair	  samples	  collected	  at	  0,	  21,	  42,	  84	  and	  126	  DIM	  from	  all	  cows	  in	  Experiment	  1.	  Increased	  DIM	  significantly	  reduced	  concentrations	  of	  hair	  cortisol	  (P	  <	  0.001);	  hair	  samples	  collected	  at	  21	  DIM	  had	  greater	  concentrations	  of	  cortisol	  compared	  with	  postpartum	  collections	  but	  were	  not	  different	  from	  collection	  at	  calving	  (0	  DIM).	  	  	  	  	   	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  0	   21	   42	   84	   126	  Cortisol	  Concentration	  	  (pg/mg)	  Days	  in	  Milk	  Multiparous	  Primiparous	  	   62	  Figure	  3.3:	  Effect	  of	  disease	  on	  concentrations	  of	  cortisol	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  extracted	  from	  hair	  samples	  from	  multiparous	  animals	  in	  Experiment	  1.	  Disease	  significantly	  increased	  concentrations	  of	  hair	  cortisol	  (panel	  A;	  P	  =	  0.02).	  Animals	  with	  more	  than	  one	  disease	  bout	  were	  found	  to	  have	  more	  hair	  cortisol	  than	  healthy	  animals,	  but	  not	  from	  animals	  with	  only	  one	  disease	  bout	  (panel	  B;	  P	  =	  0.03).	  	  Different	  superscripts	  (a,b)	  indicate	  significant	  differences	  (P	  <	  0.05).	  	  	   A)	  	  B)	  	  0	  2	  4	  6	  8	  10	  12	  Healthy	   Diseased	  Cortisol	  Concentation	  	  (pg/mg)	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  a	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  b	  0	  2	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  Healthy	   1	  Disease	  Bout	   ≥	  2	  Disease	  Bouts	  Cortisol	  Concentation	  	  (pg/mg)	  	  	  	  	  	  	  a	  	  	  	  	  	  ab	  	  	  	  	  	  	  b	  	  	   63	  Figure	  3.4:	  Hair	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  of	  multiparous	  cows	  that	  were	  diagnosed	  as	  clinically	  diseased	  or	  clinically	  healthy	  by	  126	  DIM.	  Healthy	  animals	  had	  less	  hair	  cortisol	  at	  21	  (P	  =	  0.05),	  84	  (P	  =	  0.05),	  and	  126	  (P	  =	  0.07)	  DIM	  than	  animals	  that	  were	  diagnosed	  with	  clinical	  disease	  within	  the	  experimental	  period	  in	  Experiment	  1.	  	  *	  P	  <	  0.05	  	  †	  P	  <	  0.10	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  0	  2	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  0	   21	   42	   84	   126	  Cortisol	  Concentration	  	  (pg/mg)	  Days	  in	  Milk	  Disease	  Healthy	  †   *     * 	   64	  Figure	  3.5.	  	  Scatter	  plots	  representing	  Pearson	  correlations	  between	  hair	  cortisol	  and	  blood	  BHBA	  (r	  =	  0.10;	  P	  =	  0.46),	  hair	  cortisol	  and	  blood	  glucose	  (r	  =	  0.26;	  P	  =	  0.07)	  and	  glucose	  and	  BHBA	  (r	  =	  -­‐0.26;	  P	  =	  0.07)	  concentrations	  at	  21	  DIM	  in	  Experiment	  1.	  	   A)	  	  	   	  	   B)	  	  	   	  	   C)	  	   	  y	  =	  -­‐0.058x	  +	  2.361	  R²	  =	  0.010	  0	  1	  2	  3	  4	  -­‐1.75	   -­‐1.25	   -­‐0.75	   -­‐0.25	   0.25	   0.75	   1.25	   1.75	  Hair	  Cortisol	  	  (pg/mg;	  ln	  transformed)	  Blood	  BHBA	  (mmol/l;	  ln	  transformed	  )	  	  y	  =	  0.114x	  +	  2.007	  R²	  =	  0.070	  0	  1	  2	  3	  4	  0	   1	   2	   3	   4	   5	  Hair	  Cortisol	  (pg/mg;	  ln	  transformed)	  Blood	  Glucose	  (mmol/l)	  	  y	  =	  -­‐0.346x	  +	  3.095	  R²	  =	  0.068	  0	  1	  2	  3	  4	  5	  -­‐1.75	   -­‐1.25	   -­‐0.75	   -­‐0.25	   0.25	   0.75	   1.25	   1.75	  Blood	  Glucose	  	  (mmol/l)	  Blood	  BHBA	  (mmol/l;	  ln	  transformed)	  	  	   65	  Figure	  3.6:	  	  Hair	  cortisol	  concentrations	  (Geometric	  Mean	  ±	  SEM)	  of	  multiparous	  (panel	  A)	  and	  primiparous	  cows	  (panel	  B)	  that	  were	  diagnosed	  non-­‐pregnant	  or	  pregnant	  by	  100	  DIM.	  Within	  each	  panel,	  the	  asterisk	  (*)	  denotes	  difference	  between	  hair	  cortisol	  concentrations	  (P	  <	  0.05).	  	   A)	  	  	   B)	  	   	  0	  2	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  0	   21	   42	   84	   126	  Cortisol	  Concentration	  	  (pg/mg)	  Days	  in	  Milk	  Non-­‐pregnant	  Pregnant	     *    * 0	  2	  4	  6	  8	  10	  12	  14	  0	   21	   42	   84	   126	  Cortisol	  Concentration	  	  (pg/mg)	  Days	  in	  Milk	  Non-­‐pregnant	  Pregnant	  	   66	  Chapter	  4:	  General	  Discussion	  4.1	  Summary	  Lactating	  dairy	  cows	  in	  intensive	  systems	  are	  often	  challenged	  with	  practices	  and	  conditions	  that	  are	  metabolically,	  immunologically	  and	  physically	  challenging	  (i.e.:	  production	  of	  copious	  amounts	  of	  milk	  immediately	  after	  parturition,	  immunosuppression,	  concrete	  floors,	  clinical	  and	  subclinical	  diseases),	  all	  of	  which	  can	  lead	  to	  reduced	  production,	  health,	  fertility,	  and	  overall	  welfare	  of	  the	  animal.	  Some	  management	  procedures	  cause	  short-­‐term	  stress	  responses	  (e.g.:	  dehorning,	  transport),	  while	  other	  challenges,	  individually	  or	  in	  combination,	  may	  cause	  longer-­‐term	  stress	  responses	  (e.g.:	  lameness,	  frequent	  regrouping).	  	  To	  detect	  the	  stress	  response	  in	  animals,	  including	  dairy	  cattle,	  the	  use	  of	  cortisol	  as	  a	  biomarker	  of	  stress	  has	  been	  studied	  in-­‐depth	  for	  many	  years.	  However,	  the	  increasing	  need	  for	  a	  reliable	  measure	  of	  long-­‐term	  stress	  has	  pushed	  the	  development	  of	  new	  methodologies	  for	  monitoring	  cortisol.	  The	  most	  common	  media	  for	  the	  analysis	  of	  cortisol	  is	  blood,	  saliva,	  and	  faeces,	  but	  their	  limitations	  include	  confounds	  due	  to	  handling	  (Cook	  et	  al.,	  2000),	  natural	  circadian	  rhythms	  of	  cortisol	  secretion	  (Thun	  et	  al.,	  1981).	  One	  promising	  medium	  for	  monitoring	  cortisol	  is	  hair.	  The	  use	  of	  hair	  enables	  a	  feedback-­‐free	  method	  that	  represents	  cortisol	  concentrations	  over	  longer	  periods	  of	  time	  (weeks	  or	  even	  months).	  Due	  to	  the	  novelty	  of	  the	  procedure,	  standard	  protocols	  have	  yet	  to	  be	  developed,	  leaving	  it	  difficult	  to	  compare	  results	  between	  studies	  and	  even	  within	  a	  single	  study.	  Furthermore,	  little	  research	  has	  been	  made	  to	  determine	  which	  cow-­‐level	  factors	  may	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations,	  such	  as	  parity,	  stage	  of	  lactation,	  and	  health	  status,	  or	  what	  consequences	  may	  be	  associated	  with	  hair	  cortisol	  concentrations.	  	  	   67	  The	  aim	  of	  this	  thesis	  was	  to	  determine	  (a)	  the	  effects	  of	  specific	  sampling	  methods	  that	  may	  affect	  the	  concentrations	  of	  hair	  cortisol	  measured	  from	  hair	  samples	  of	  black	  and	  white	  Holstein	  cows,	  and	  (b)	  to	  use	  these	  methods	  to	  determine	  the	  associations	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  health	  and	  fertility	  during	  early	  lactation.	  In	  this	  study,	  hair	  colour,	  body	  location,	  and	  processing	  method	  all	  had	  significant	  effects	  on	  the	  concentration	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  samples.	  Additionally,	  hair	  growth	  rates	  were	  found	  to	  differ	  between	  body	  locations.	  White	  hair	  had	  approximately	  twice	  the	  concentration	  of	  cortisol	  than	  black	  hair,	  and	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  had	  the	  highest	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  comparison	  with	  the	  shoulder,	  hip,	  and	  top	  line.	  The	  use	  of	  a	  ball	  mill	  to	  process	  the	  hair	  samples	  also	  resulted	  in	  over	  twice	  the	  amount	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  in	  comparison	  with	  using	  surgical	  scissors	  to	  mince	  hair	  samples.	  Furthermore,	  the	  hair	  on	  the	  tail	  switch	  grew	  approximately	  10	  times	  faster	  than	  hair	  found	  at	  the	  shoulder	  and	  hip.	  	  Using	  these	  results	  in	  conjunction	  with	  the	  fact	  that	  Holstein	  dairy	  cattle	  only	  have	  white	  hair	  on	  the	  tail	  switch,	  we	  concluded	  that	  the	  tail	  switch	  may	  be	  the	  most	  ideal	  location	  to	  sample	  hair	  for	  cortisol	  analysis	  because	  it:	  (a)	  eliminates	  variation	  caused	  by	  hair	  colour,	  (b)	  eliminates	  variation	  caused	  by	  body	  location,	  and	  (c)	  allows	  for	  more	  frequent	  sampling	  because	  of	  its	  faster	  hair	  growth	  rate.	  Additionally,	  we	  concluded	  that	  all	  hair	  samples	  should	  be	  processed	  using	  a	  ball	  mill	  instead	  of	  surgical	  scissors	  such	  that	  particle	  sizes	  of	  the	  ground	  sample	  can	  be	  smaller	  and	  consistent	  between	  samples,	  as	  higher	  concentrations	  of	  cortisol	  are	  extracted	  from	  samples	  with	  smaller	  particle	  sizes.	  This	  study	  will	  support	  the	  standardization	  of	  sampling	  methodologies	  for	  the	  collection	  of	  hair	  for	  cortisol	  analysis	  in	  dairy	  cattle.	  Improvements	  within	  the	  hair	  cortisol	  field	  can	  be	  achieved	  such	  that	  future	  studies	  can	  produce	  more	  	   68	  consistent	  and	  reliable	  results	  that	  will	  not	  only	  make	  individual	  studies	  more	  accurate	  but	  will	  also	  facilitate	  comparisons	  between	  studies.	  	  Using	  the	  sampling	  methodologies	  outlined	  in	  Chapter	  2	  we	  were	  able	  to	  determine	  associations	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  clinical	  and	  subclinical	  disease,	  plasma	  metabolites	  and	  reproductive	  parameters.	  In	  this	  study	  we	  found	  that	  multiparous	  cows	  that	  suffered	  from	  clinical	  disease,	  such	  as	  mastitis	  and	  metritis,	  had	  increased	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  comparison	  to	  clinically	  healthy	  multiparous	  cows.	  However,	  no	  difference	  was	  found	  when	  comparing	  hair	  cortisol	  concentrations	  of	  cows	  with	  subclinical	  disease	  with	  healthy	  counterparts;	  the	  model	  of	  subclinical	  disease	  used	  for	  this	  study	  was	  subclinical	  endometritis.	  Possible	  reasons	  for	  this	  lack	  of	  positive	  association	  were:	  (a)	  subclinical	  disease	  does	  not	  elicit	  a	  chronic	  stress	  response,	  or	  more	  likely,	  (b)	  hair	  is	  not	  a	  sensitive	  enough	  medium	  to	  detect	  changes	  in	  circulating	  cortisol	  concentrations	  associated	  with	  subclinical	  disease.	  The	  latter	  rationale	  is	  further	  supported	  by	  our	  results	  demonstrating	  the	  frequency	  of	  clinical	  disease	  is	  associated	  with	  hair	  cortisol	  concentrations:	  multiparous	  cows	  with	  only	  one	  clinical	  disease	  event	  did	  not	  differ	  in	  hair	  cortisol	  concentrations	  compared	  to	  healthy	  animals,	  but	  multiparous	  cows	  with	  two	  or	  more	  clinical	  disease	  events	  had	  higher	  hair	  cortisol	  concentrations	  than	  healthy	  animals.	  This	  suggests	  that	  hair	  may	  not	  be	  suitable	  to	  detect	  certain	  types	  of	  disease,	  or	  certain	  stress	  responses	  of	  a	  lesser	  magnitude	  that	  may	  be	  associated	  with	  singular	  disease	  bouts	  or	  subclinical	  disease.	  Furthermore,	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  concentrations,	  two	  acute	  phase	  proteins	  indicative	  of	  inflammation,	  were	  not	  different	  between	  healthy	  cows	  and	  cows	  with	  subclinical	  endometritis,	  which	  may	  also	  suggest	  that	  our	  model	  of	  	   69	  subclinical	  disease	  may	  have	  been	  too	  mild	  to	  be	  measured	  through	  the	  use	  of	  hair	  cortisol	  concentrations.	  Multiparous	  cows	  with	  compromised	  fertility	  had	  increased	  hair	  cortisol	  concentrations	  at	  specific	  sampling	  times;	  we	  found	  that	  animals	  that	  were	  diagnosed	  as	  non-­‐pregnant	  at	  100	  DIM	  had	  higher	  hair	  cortisol	  concentrations	  at	  42	  and	  84	  DIM.	  Assuming	  it	  takes	  approximately	  2	  wk	  for	  hair	  to	  grow	  from	  the	  follicle	  to	  the	  surface	  of	  the	  skin	  and	  each	  hair	  sample	  represents	  a	  3	  wk	  period	  of	  hair	  growth,	  the	  42	  and	  84	  DIM	  samples	  together	  represent	  circulating	  cortisol	  concentrations	  from	  roughly	  10	  to	  70	  DIM.	  This	  period	  is	  biologically	  relevant	  because	  it	  comprises	  both	  the	  transition	  period	  and	  the	  beginning	  of	  the	  breeding	  period.	  Increased	  hair	  cortisol	  concentrations	  found	  during	  the	  transition	  period	  may	  suggest	  that	  the	  animals	  were	  afflicted	  with	  transition	  diseases,	  such	  as	  metritis	  and	  mastitis.	  Common	  health	  disorders	  of	  the	  transition	  period	  have	  been	  associated	  with	  reduced	  pregnancy	  rates	  and	  a	  longer	  calving	  to	  pregnancy	  interval	  (Dobson	  and	  Esslemont,	  2002;	  LeBlanc,	  2010).	  This	  is	  supported	  by	  the	  increased	  proportion	  of	  non-­‐pregnant	  multiparous	  cows	  that	  were	  diagnosed	  with	  clinical	  disease	  when	  compared	  to	  multiparous	  cows	  that	  were	  pregnant	  by	  100	  DIM.	  Furthermore,	  increased	  hair	  cortisol	  concentrations	  surrounding	  the	  time	  of	  first	  artificial	  insemination	  may	  have	  interfered	  with	  both	  ovulation	  and	  the	  quality	  of	  the	  embryo	  (von	  Borell	  et	  al.,	  2007).	  There	  was	  no	  association	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  pregnancy	  outcomes	  primiparous	  cows	  by	  100	  DIM.	  The	  lack	  of	  effect	  on	  pregnancy	  outcomes	  of	  primiparous	  cows	  may	  be	  explained	  by	  the	  low	  prevalence	  of	  clinical	  disease	  in	  primiparous	  animals	  in	  this	  study,	  thus	  circulating	  cortisol	  concentrations	  may	  not	  have	  reached	  high	  enough	  concentrations	  to	  have	  any	  long	  lasting	  effects	  on	  fertility.	  	  	   70	  Cortisol	  concentrations	  in	  hair	  were	  not	  strongly	  associated	  with	  metabolites	  measured	  in	  blood.	  At	  21	  DIM,	  there	  was	  a	  tendency	  for	  hair	  cortisol	  concentrations	  to	  have	  a	  positive	  correlation	  with	  blood	  glucose	  concentrations;	  however,	  only	  7%	  of	  the	  variation	  in	  cortisol	  was	  explained	  by	  glucose.	  There	  were	  no	  associations	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  BHBA	  concentrations	  in	  blood	  at	  21	  DIM,	  or	  with	  haptoglobin	  or	  ceruloplasmin	  concentrations	  at	  33	  DIM.	  Since	  cortisol	  is	  known	  to	  stimulate	  gluconeogenesis,	  the	  positive	  correlation	  between	  cortisol	  and	  glucose	  was	  expected;	  however,	  it	  was	  very	  weak.	  The	  lack	  of	  correlation	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  may	  be	  associated	  with	  the	  lack	  of	  difference	  of	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  found	  between	  healthy	  cows	  and	  cows	  with	  subclinical	  endometritis.	  Although	  there	  were	  no	  correlation	  found	  between	  hair	  cortisol	  concentrations	  and	  milk	  production	  in	  Chapter	  3:	  Experiment	  1,	  Chapter	  3:	  Experiment	  2	  demonstrated	  a	  negative	  correlation	  between	  milk	  yield	  and	  hair	  cortisol	  concentrations,	  suggesting	  that	  animals	  that	  are	  less	  stressed	  may	  be	  able	  to	  produce	  more	  milk.	  This	  thesis	  demonstrates	  that	  (a)	  hair	  can	  be	  used	  as	  a	  medium	  to	  measure	  cortisol	  concentrations,	  (b)	  hair	  is	  able	  to	  detect	  differences	  in	  cortisol	  concentrations	  associated	  with	  clinical	  disease,	  but	  not	  for	  subclinical	  endometritis,	  and	  (c)	  sampling	  concerns	  may	  be	  alleviated	  by	  using	  white	  hair	  from	  the	  tail	  switch	  of	  Holstein	  dairy	  cows	  ground	  using	  a	  ball	  mill.	  	  	  	   71	  4.2	  Limitations	  	  Cortisol	  is	  a	  hormone	  that	  is	  produced	  for	  many	  natural	  processes	  of	  the	  body,	  such	  as	  the	  hormonal	  cascade	  that	  causes	  parturition	  (Möstl	  and	  Palme,	  2002).	  Thus	  it	  cannot	  be	  assumed	  that	  increases	  in	  cortisol	  concentrations	  always	  equate	  to	  increased	  distress.	  Colborn	  et	  al.	  (1991)	  found	  that	  stallions	  secreted	  similar	  cortisol	  concentrations	  whether	  they	  were	  restrained,	  exercised	  or	  mating.	  Therefore,	  design	  of	  an	  experiment	  investigating	  changes	  in	  cortisol	  should	  ensure	  that	  these	  activities	  do	  not	  confound	  the	  results.	  Care	  needs	  to	  be	  taken	  when	  using	  measurements	  aiming	  for	  long-­‐term	  interpretation,	  such	  as	  hair	  cortisol	  concentrations,	  as	  many	  events	  have	  the	  potential	  to	  elicit	  changes	  in	  circulating	  cortisol	  concentrations;	  thus	  a	  detailed	  history	  of	  the	  animal’s	  management	  is	  essential	  to	  interpreting	  the	  results	  	  Recent	  research	  has	  focused	  on	  the	  origin	  of	  cortisol	  concentrations	  measured	  from	  hair.	  Studies	  in	  mice	  and	  humans	  have	  suggested	  that	  local	  cortisol	  production	  at	  the	  hair	  follicle	  may	  contribute	  to	  the	  cortisol	  concentrations	  that	  are	  measured	  in	  mammalian	  hair	  (Ito	  et	  al.,	  2005;	  Russell	  et	  al.,	  2012).	  This	  local	  production	  is	  thought	  to	  be	  independent	  from	  the	  HPA	  axis	  and	  in	  response	  to	  local	  stressors	  at	  the	  hair	  follicle	  level	  (Sharpley	  et	  al.,	  2011).	  The	  peripheral	  production	  of	  cortisol	  has	  been	  demonstrated	  in	  human	  melanocytes	  and	  dermal	  fibroblasts	  (Sharpley	  et	  al.,	  2011),	  and	  has	  been	  suggested	  to	  have	  a	  function	  in	  wound	  healing	  (Vukelic	  et	  al.,	  2011).	  The	  amount	  of	  cortisol	  that	  is	  produced	  in	  the	  skin	  is	  much	  less	  than	  the	  amount	  that	  is	  produced	  from	  the	  adrenal	  gland.	  It	  is	  predicted	  that	  cortisol	  from	  the	  periphery	  does	  not	  have	  a	  substantial	  role	  in	  disorders	  that	  are	  derived	  from	  chronic	  stress	  (Slominski	  et	  al.,	  2005)	  and	  there	  is	  no	  evidence	  that	  cortisol	  produced	  at	  the	  periphery	  enters	  the	  blood	  stream	  (Sharpley	  et	  al.,	  2011).	  	   72	  Although	  there	  is	  evidence	  that	  the	  skin	  of	  humans	  and	  mice	  have	  a	  functional	  equivalent	  of	  the	  HPA	  axis,	  very	  little	  research	  has	  been	  performed	  to	  determine	  the	  relationships	  between	  this	  ‘peripheral	  HPA-­‐like	  axis’	  and	  health	  status,	  how	  it	  functions,	  or	  if	  it	  is	  present	  in	  all	  animals	  (Sharpley	  et	  al.,	  2011).	  There	  is	  no	  research,	  to	  my	  knowledge,	  confirming	  or	  rejecting	  the	  presence	  of	  a	  peripheral	  HPA-­‐like	  axis	  within	  the	  skin	  of	  cattle.	  The	  uncertainty	  about	  the	  origin	  of	  cortisol	  concentrations	  found	  in	  hair	  does	  not	  invalidate	  the	  current	  findings,	  but	  suggests	  caution	  regarding	  interpretation	  of	  results	  and	  careful	  experimental	  design.	  There	  is	  strong	  evidence	  that	  hair	  cortisol	  concentrations	  represent	  circulating	  cortisol	  concentrations	  as	  hair	  cortisol	  concentrations	  have	  been	  correlated	  with	  other	  measures	  of	  cortisol,	  such	  as	  from	  saliva	  and	  faeces	  (Davenport	  et	  al.,	  2006;	  Accorsi	  et	  al.,	  2008;	  Moya	  et	  al.,	  2013),	  and	  have	  been	  shown	  to	  increase	  as	  a	  result	  of	  an	  ACTH	  challenge	  (Gonzalez-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.,	  2011).	  However,	  stressors	  that	  may	  cause	  local	  cortisol	  production	  at	  the	  hair	  follicle,	  such	  as	  tissue	  damage	  or	  extreme	  temperature,	  should	  be	  controlled.	  	  Another	  limitation	  of	  this	  study	  is	  that	  the	  lag	  between	  the	  stress	  response	  and	  hair	  collection	  has	  not	  been	  well	  defined.	  In	  humans,	  an	  average	  hair	  growth	  rate	  of	  approximately	  1	  cm	  per	  month	  has	  been	  generally	  accepted	  (Wennig,	  2000);	  however,	  growth	  rates	  have	  been	  shown	  to	  differ	  due	  to	  race,	  sex,	  age	  and	  location	  on	  the	  body	  (Stalder	  and	  Kirschbaum,	  2012).	  Researchers	  have	  speculated	  that	  the	  lag	  time	  between	  when	  the	  stressor	  occurred	  to	  when	  the	  hair	  reaches	  the	  surface	  of	  the	  skin	  for	  humans	  is	  approximately	  1	  –	  2	  wk	  based	  upon	  the	  growth	  rate	  of	  hair	  (Stalder	  and	  Kirschbaum,	  2012).	  The	  lag	  time	  for	  dairy	  cattle	  has	  not	  yet	  been	  published;	  however,	  the	  growth	  rate	  data	  from	  Chapter	  2	  of	  this	  thesis	  suggests	  that	  there	  may	  be	  a	  lag	  time	  of	  approximately	  2	  	   73	  wk	  due	  to	  approximately	  7.5	  mm	  between	  the	  skin	  and	  the	  follicle	  at	  the	  tail	  switch.	  Gonzalez-­‐de-­‐la-­‐Vara	  et	  al.	  (2011)	  performed	  an	  ACTH	  challenge	  on	  pregnant	  Holstein	  heifers	  by	  administering	  three	  ACTH	  injections,	  1	  wk	  apart	  (at	  d	  0,	  d	  7	  and	  d	  14),	  and	  collected	  hair	  samples	  from	  the	  ribs	  every	  2	  wk	  (at	  d	  0,	  d	  14,	  d	  28	  and	  d	  44).	  The	  authors	  found	  increased	  hair	  cortisol	  concentrations	  at	  collections	  on	  d	  14	  and	  d	  28	  suggesting	  a	  lag	  time	  for	  hair	  at	  the	  ribs	  to	  be	  anywhere	  from	  1	  to	  2	  wk	  after	  ACTH	  administration.	  Further	  research	  is	  needed	  to	  accurately	  quantify	  the	  lag	  time	  on	  other	  parts	  of	  the	  body	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  Moreover,	  it	  has	  been	  suggested	  that	  season	  may	  affect	  hair	  cortisol	  concentrations	  by	  changing	  the	  rate	  of	  hair	  growth	  (Comin	  et	  al.,	  2011)	  and	  the	  hair	  growth	  cycle	  (Courtois	  et	  al.,	  1996),	  but	  the	  effects	  of	  photoperiod	  and	  temperature	  have	  not	  been	  demonstrated	  in	  dairy	  cows.	  The	  use	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  for	  measuring	  chronic	  stress	  seems	  to	  be	  a	  suitable	  tool	  for	  research	  purposes.	  Careful	  experimental	  design,	  as	  well	  as	  a	  complete	  set	  of	  information	  about	  the	  animal	  is	  needed	  to	  have	  a	  sound	  interpretation	  of	  the	  results.	  This	  method	  may	  be	  best	  for	  well-­‐designed	  studies	  researching	  the	  effects	  of	  different	  conditions,	  whether	  they	  are	  environmental	  (Comin	  et	  al.,	  2011)	  or	  health	  (Comin	  et	  al.,	  2013)	  related,	  particularly	  those	  hypothesized	  to	  create	  stress	  responses	  of	  a	  higher	  magnitude.	  Due	  to	  the	  complexity	  of	  the	  stress	  response,	  and	  the	  ability	  of	  animals	  to	  achieve	  an	  alternative	  form	  of	  stasis	  (i.e.:	  allostasis;	  Moberg	  and	  Mench,	  2000),	  it	  may	  be	  difficult	  to	  create	  a	  threshold	  (such	  as	  those	  outlined	  for	  BHBA	  concentrations	  for	  subclinical	  ketosis,	  and	  IgG	  concentrations	  for	  passive	  immune	  transfer	  in	  calves)	  that	  can	  confidently	  characterize	  an	  animal	  as	  being	  in	  distress.	  However,	  the	  use	  of	  hair	  to	  measure	  stress	  is	  quite	  new	  to	  the	  study	  of	  dairy	  cattle,	  and	  with	  more	  research	  has	  a	  lot	  of	  potential.	  	   74	  4.3	  Future	  directions	  	   Although	  literature	  on	  ideal	  methodologies	  and	  the	  use	  of	  hair	  cortisol	  as	  a	  measure	  of	  chronic	  stress	  is	  growing	  quickly,	  there	  are	  still	  many	  gaps	  of	  knowledge	  that	  need	  to	  be	  addressed,	  especially	  for	  dairy	  cattle.	  As	  mentioned	  in	  the	  limitations	  section	  of	  this	  thesis,	  one	  crucial	  area	  of	  research	  for	  investigation	  of	  hair	  cortisol	  is	  to	  determine	  the	  exact	  length	  of	  time	  it	  takes	  between	  the	  stress	  response	  and	  the	  appearance	  of	  cortisol	  in	  the	  harvested	  hair.	  To	  investigate	  this,	  animals	  could	  be	  exposed	  to	  a	  stressor,	  hypothesized	  to	  create	  a	  sustained	  stress	  response,	  such	  as	  a	  change	  from	  indoor	  housing	  to	  summer	  pasture	  grazing,	  repeated	  regrouping,	  or	  an	  ACTH	  challenge.	  	  Hair	  samples	  could	  be	  collected	  every	  two	  wk,	  or	  as	  frequently	  as	  possible,	  from	  the	  tail	  switch	  and	  analysed	  for	  cortisol	  concentrations;	  at	  the	  same	  time,	  faecal	  samples	  could	  be	  collected	  to	  validate	  and	  quantify	  the	  stress	  response.	  There	  has	  been	  some	  debate	  about	  the	  possibility	  that	  hair	  cortisol	  concentrations	  may	  be	  leached	  along	  the	  length	  of	  the	  hair	  shaft.	  Kirschbaum	  et	  al.	  (2009)	  reported	  that	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  humans	  decreased	  by	  30	  -­‐	  40%	  with	  each	  segment	  farther	  from	  the	  scalp,	  until	  reaching	  an	  asymptotic	  level	  in	  the	  final	  two	  segments;	  however,	  this	  study	  used	  hair	  samples	  of	  approximately	  18	  months	  of	  growth.	  It	  was	  suggested	  that	  the	  depletion	  of	  hair	  cortisol	  along	  the	  length	  of	  the	  hair	  might	  be	  due	  to	  cortisol	  leaching	  from	  damaged	  hair,	  but	  it	  may	  also	  be	  due	  to	  continuous	  washing	  with	  shampoo	  (Kirschbaum	  et	  al.,	  2009).	  In	  contrast	  to	  these	  findings,	  different	  reports	  in	  humans	  (Thomson	  et	  al.,	  2010),	  rhesus	  macaques	  (Davenport	  et	  al.,	  2010),	  and	  dogs	  (Bennett	  and	  Hayssen,	  2010)	  reported	  no	  changes	  in	  cortisol	  concentrations	  along	  the	  length	  of	  the	  hair	  shaft.	  There	  has	  been	  no	  	   75	  research	  in	  dairy	  cattle	  to	  determine	  if	  cortisol	  concentrations	  vary	  along	  the	  length	  of	  the	  hair	  and	  if	  there	  is	  a	  leaching	  effect	  on	  longer	  hairs.	  Moreover,	  once	  the	  effect	  of	  leaching	  is	  elucidated,	  further	  research	  could	  be	  carried	  out	  to	  determine	  the	  extent	  to	  which	  hair	  can	  be	  used	  as	  a	  retrospective	  endocrinological	  map.	  	  Another	  follow-­‐up	  study	  could	  focus	  on	  how	  hair	  cortisol	  concentrations	  differ	  depending	  on	  the	  type	  of	  clinical	  disease.	  Forsund	  et	  al.	  (2010)	  found	  that	  animals	  with	  parturient	  paresis	  and	  recumbency	  had	  increased	  plasma	  cortisol	  concentrations	  compared	  with	  animals	  with	  clinical	  metritis	  and	  mastitis;	  however,	  there	  has	  been	  no	  work	  published	  showing	  changes	  in	  hair	  cortisol	  concentrations	  due	  to	  different	  types	  of	  clinical	  diseases.	  In	  addition	  to	  clinical	  disease,	  different	  types	  of	  subclinical	  diseases	  (e.g.:	  subclinical	  ketosis),	  management	  (e.g.:	  regrouping),	  environments	  (e.g.:	  heat	  or	  cold	  stress),	  and	  psychological	  stressors	  (e.g.:	  social	  isolation)	  could	  be	  tested	  for	  effects	  on	  hair	  cortisol	  concentrations.	  Furthermore,	  the	  association	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  acute	  phase	  proteins,	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin,	  could	  be	  determined	  with	  more	  severe	  diseases	  such	  as	  clinical	  metritis	  or	  mastitis	  in	  order	  to	  determine	  if	  the	  lack	  of	  relationship	  of	  hair	  cortisol	  concentrations	  with	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin	  found	  in	  Chapter	  3:	  Experiment	  2	  was	  due	  to	  the	  severity	  of	  the	  model	  disease.	  Additionally,	  the	  determination	  of	  a	  threshold	  at	  which	  the	  stress	  response	  can	  be	  detected	  in	  hair	  could	  be	  useful.	  To	  accomplish	  this,	  an	  experiment	  could	  be	  designed	  in	  such	  a	  way	  that	  stressful	  stimuli	  are	  additive.	  Examples	  of	  possible	  stressors	  that	  could	  be	  used	  are	  repeated	  regrouping,	  increasing	  increments	  of	  social	  isolation,	  or	  increasing	  percentage	  of	  overstocking.	  	  	   76	  Chapter	  5:	  Conclusions	  	  Hair	  can	  be	  used	  to	  determine	  chronic	  changes	  in	  circulating	  cortisol	  concentrations.	  Consistent	  sampling	  methodology	  must	  be	  taken	  into	  consideration,	  as	  hair	  colour,	  body	  location	  and	  sample	  preparation	  were	  found	  to	  have	  marked	  effects	  on	  the	  concentration	  of	  cortisol	  extracted	  from	  hair	  samples.	  Clinical	  disease	  increased	  the	  concentrations	  of	  cortisol	  found	  in	  hair	  when	  two	  or	  more	  disease	  events	  were	  recorded	  within	  the	  experimental	  period;	  however,	  subclinical	  disease	  did	  not.	  Animals	  that	  became	  pregnant	  by	  100	  DIM	  had	  lower	  hair	  cortisol	  concentrations	  surrounding	  the	  time	  of	  first	  postpartum	  AI,	  suggesting	  an	  association	  between	  increased	  cortisol	  concentrations	  and	  a	  lower	  rate	  of	  conception.	  Parity	  and	  stage	  of	  lactation	  also	  affected	  hair	  cortisol	  concentrations,	  although	  associations	  between	  hair	  cortisol	  concentrations	  and	  the	  blood	  metabolites	  measured	  (BHBA,	  glucose,	  haptoglobin	  and	  ceruloplasmin)	  were	  mostly	  weak.	  	  The	  measurement	  of	  cortisol	  in	  hair	  can	  offer	  advantages	  over	  the	  traditional	  methods	  as	  a	  surveillance	  method	  for	  chronic	  stress	  due	  to	  its	  feedback-­‐free	  nature	  and	  long-­‐term	  interpretation	  of	  cortisol	  concentrations.	  The	  measurements	  appear	  to	  be	  associated	  with	  clinical	  disorders	  and	  have	  a	  direct	  association	  with	  pregnancy	  outcomes;	  however	  concentrations	  of	  cortisol	  in	  hair	  may	  not	  be	  suited	  to	  differentiate	  less	  stressful	  situations	  such	  as	  subclinical	  disease.	  	  	   	  	   77	  References	  	  Accorsi,	  P.A.,	  E.	  Carloni,	  P.	  Valsecchi,	  R.	  Viggiani,	  M.	  Gamberoni,	  C.	  Tamanini,	  and	  E.	  Seren.	  2008.	  Cortisol	  determination	  in	  hair	  and	  faeces	  from	  domestic	  cats	  and	  dogs.	  Gen.	  Comp.	  Endocrinol.	  155:398-­‐402.	  Aguilera,	  G.	  1998.	  Corticotropin	  releasing	  hormone,	  receptor	  regulation	  and	  the	  stress	  response.	  Trends	  Endocrinol.	  Metab.	  9:329-­‐336.	  Aoyama,	  M.,	  A.	  Negishi,	  A.	  Abe,	  R.	  Yokoyama,	  T.	  Ichimaru,	  and	  S.	  Sugita.	  2008.	  Physiological	  and	  behavioural	  effects	  of	  an	  intracerebroventricular	  injection	  of	  corticotropin	  releasing	  hormone	  in	  goats.	  Vet	  J.	  177:116–123.	  Beerda,	  B.,	  J.E.	  Kornalijnslijper,	  J.T.N.	  van	  der	  Werf,	  E.N.	  Noordhuizen-­‐Stassen,	  and	  H.	  Hopster.	  2004.	  Effects	  of	  milk	  production	  capacity	  and	  metabolic	  status	  on	  HPA	  function	  in	  early	  postpartum	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  87:2094-­‐2102.	  Bennett,	  A.	  and	  V.	  Hayssen.	  2010.	  Measuring	  cortisol	  in	  hair	  and	  saliva	  from	  dogs:	  coat	  color	  and	  pigment.	  Domest.	  Anim.	  Endocrinol.	  30:171-­‐180.	  	  Broom,	  D.M.	  and	  K.	  G.	  Johnson.	  1993.	  Stress	  and	  Animal	  Welfare.	  London:	  Chapman	  and	  Hall,	  T.J.	  Press.	  211pp.	  Burnett,	  T.A.,	  A.M.L.	  Madureira,	  B.F.	  Silper,	  A.	  Nadalin,	  A.M.	  Tahmasbi,	  D.M.	  Veira,	  and	  R.L.A	  Cerri.	  Short	  communication:	  Factors	  affecting	  hair	  cortisol	  concentration	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  In	  Press.	  Cerri,	  R.L.A.,	  D.M.	  Veira,	  A.M.	  Tabmasbi,	  A.M.L.	  Madureira,	  S.A.	  Balios,	  A.H.	  Souza,	  and	  J.L.M	  Vasconcelos.	  2012.	  Effect	  of	  method	  of	  detection	  and	  uterine	  dimensions	  in	  the	  diagnosis	  of	  endometritis	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  Proceedings	  of	  ADSA-­‐ASAS	  Joint	  Annual	  Meeting,	  July	  15-­‐19,	  2012,	  Phoenix,	  Arizona.J.	  Dairy	  Sci.	  95	  (Suppl.	  2):260.	  Charmandari,	  E.,	  C.	  Tsigos,	  and	  G.	  Chrousos.	  2005.	  Endocrinology	  of	  the	  stress	  response.	  Annu.	  Rev.	  Physiol.	  67:259-­‐284.	  Christison,	  G.I.	  and	  H.D.	  Johnson.	  1972.	  Cortisol	  turnover	  in	  heat-­‐stressed	  cows.	  J.	  Anim.	  Sci.	  35:1005–1010.	  Chrousos,	  G.P	  and	  P.W.	  Gold.	  1992.	  The	  concepts	  of	  stress	  and	  stress	  system	  disorders:	  overview	  of	  physical	  and	  behavioural	  homeostasis.	  JAMA.	  267:1244-­‐1252.	  Chrousos,	  G.P,	  D.	  Torpy,	  and	  P.W.	  Gold.	  1998.	  Interactions	  between	  the	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  and	  the	  female	  reproductive	  system:	  clinical	  implications.	  Ann.	  Intern.	  Med.	  129:229-­‐240.	  Chrousos,	  G.P.	  2009.	  Stress	  and	  disorders	  of	  the	  stress	  system.	  Nat.	  Rev.	  Endocrinol.	  5:374-­‐381.	  Chung	  S,	  G.H.	  Son,	  and	  K.	  Kim.	  2011.	  Circadian	  rhythm	  of	  adrenal	  glucocorticoid:	  its	  regulation	  and	  clinical	  implications.	  Biochem.	  Biophys.	  Acta.	  1812:581-­‐591.	  	   78	  Comin,	  A.,	  T.	  Peric,	  M.	  Corazzin,	  M.C.	  Veronesi,	  T.	  Meloni,	  V.	  Zufferli,	  G.	  Cornacchia,	  and	  A.	  Prandi.	  2013.	  Hair	  cortisol	  as	  a	  marker	  of	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  activation	  in	  Friesian	  dairy	  cows	  clinically	  or	  physiologically	  compromised.	  Livest.	  Sci.	  152:36-­‐41.	  Comin,	  A.,	  A.	  Prandi,	  T.	  Peric,	  M.	  Corazzin,	  S.	  Dovier,	  and	  S.	  Bovolenta.	  2011.	  Hair	  cortisol	  levels	  in	  dairy	  cows	  from	  winter	  housing	  to	  summer	  highland	  grazing.	  Livest.	  Sci.	  138:69-­‐73.	  Cook,	  C.J.,	  D.J.	  Mellor,	  P.J.	  Harris,	  J.R.	  Ingram,	  and	  L.R.	  Matthews.	  2000.	  Hands-­‐on	  and	  hands-­‐off	  measurement	  of	  stress.	  G.P.	  Moberg,	  J.A.	  Mench	  (Eds.),	  The	  Biology	  of	  Animal	  Stress,	  CABI	  Publishing,	  Wallingford,	  UK	  (2000),	  pp.	  123–146.	  Courtois,	  M.,	  G.	  Loussouarn,	  S.	  Hourseau,	  and	  J.F.	  Grollier.	  1996.	  Periodicity	  in	  the	  growth	  and	  shedding	  of	  hair.	  British	  J.	  Derm.	  134:47-­‐54.	  Dhabhar,	  F.S.	  and	  B.S.	  McEwen.	  1997.	  Acute	  stress	  enhances	  while	  chronic	  stress	  suppresses	  cell-­‐mediated	  immunity	  in	  vivo:	  a	  potential	  role	  for	  leukocyte	  trafficking.	  Brain	  Behav.	  Immun.	  11:286-­‐306.	  Davenport,	  M.D.,	  C.K.	  Lutz,	  S.	  Tiefenbacher,	  M.A.	  Novak,	  and	  J.S.	  Meyer.	  2008.	  A	  Rhesus	  monkey	  model	  of	  self-­‐injury:	  Effects	  of	  relocation	  stress	  on	  behavior	  and	  neuroendocrine	  function.	  Biol.	  Psychiatry.	  63:990–996.	  Davenport,	  M.D.,	  S.	  Tiefenbacher,	  C.	  K.	  Lutz,	  M.	  A.	  Novak,	  and	  J.	  S.	  Meyer.	  2006.	  Analysis	  of	  endogenous	  cortisol	  concentrations	  in	  the	  hair	  of	  rhesus	  macaques.	  Gen.	  Comp.	  Endocrinol.	  147:255-­‐261.	  Demetriou,	  J.A.,	  P.A.	  Drewes,	  and	  J.B.	  Gin.	  1974.	  Ceruloplasmin.	  Pages	  857-­‐864	  in	  Clinical	  Chemistry:	  Principles	  and	  Techniques.	  2nd	  ed.	  Harper	  and	  Row,	  Hagerstown,	  MD.	  Dobson,	  H.	  and	  R.	  J.	  Esslemont.	  2002.	  Stress	  and	  its	  effects	  on	  fertility	  in	  dairy	  cows.	  Adv.	  Dairy	  Tech.	  14:193-­‐206.	  Dobson,	  H.,	  S.	  Ghuman,	  S.	  Prabhakar,	  and	  R.	  Smith.	  2003.	  A	  conceptual	  model	  of	  the	  influence	  of	  stress	  on	  female	  reproduction.	  Reprod.	  125:151–163.	  Dobson,	  H.,	  A.Y.	  Ribadu,	  K.M.	  Noble,	  J.E.	  Tebble,	  and	  W.R.	  Ward.	  2000.	  Ultrasonography	  and	  hormone	  profiles	  of	  adrenocorticotrophic	  hormone	  (ACTH)-­‐induce	  persistent	  ovarian	  follicles	  (cysts)	  in	  cattle.	  Reprod.	  120:405-­‐410.	  Dobson,	  H.	  and	  R.F.	  Smith.	  2000.	  What	  is	  stress,	  and	  how	  does	  it	  affect	  reproduction?	  Anim.	  Reprod.	  Sci.	  61-­‐62:743-­‐752.	  Dunn,	  A.J.	  1988.	  Stress-­‐related	  changes	  in	  cerebral	  catecholamine	  and	  indoleamine	  metabolism:	  lack	  of	  effect	  of	  adrenalectomy	  and	  corticosterone.	  J.	  Neurochem.	  5:406-­‐412.	  Edmonson,	  A.J.,	  I.J.	  Lean,	  L.D.	  Weaver,	  T.	  Farver,	  and	  G.	  Webster.	  1989.	  A	  body	  condition	  scoring	  chart	  for	  Holstein	  dairy	  cow.	  J.	  Dairy	  Sci.	  72:68–78.	  Fisher,	  D.D,	  L.L	  Wilson,	  R.M	  Leach,	  and	  R.W.	  Scholz.	  1985.	  Switch	  hair	  as	  an	  indicator	  of	  magnesium	  and	  copper	  status	  of	  beef	  cows.	  Amer.	  J.	  Vet.	  Res.	  46:2235-­‐2240.	  	   79	  Forslund,	  K.B.,	  Ö.A.	  Ljungvall,	  and	  B.V.	  Jones.	  2010.	  Case	  report	  low	  cortisol	  levels	  in	  blood	  from	  dairy	  cows	  with	  ketosis:	  a	  field	  study.	  Acta	  Vet.	  Scand.	  52:31.	  Friend,	  T.H.,	  F.C.	  Gwazdauskas,	  and	  C.E.	  Polan.	  1979.	  Change	  in	  adrenal	  response	  from	  free	  stall	  competition.	  J.	  Dairy	  Sci.	  62:768–771.	  Friend,	  T.H.,	  C.E.	  Polan,	  F.C.	  Gwazdauskas,	  and	  C.W.	  Heald.	  1977.	  Adrenal	  glucocorticoid	  response	  to	  exogenous	  adrenocorticotropin	  mediated	  by	  density	  and	  social	  disruption	  in	  lactating	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  60:1958–1963.	  Fukasawa,	  M.,	  H.	  Tsukada,	  T.	  Kosako,	  and	  A.	  Yamada.	  2008.	  Effect	  of	  lactation	  stage,	  season	  and	  parity	  on	  milk	  cortisol	  concentration	  in	  Holstein	  cows.	  Livest.	  Sci.	  113:280-­‐284.	  Galvão,	  K.N.,	  M.J.	  Flaminio,	  S.B.	  Brittin,	  R.	  Sper,	  M.	  Fraga,	  L.	  Caixeta,	  A.	  Ricci,	  C.L.	  Guard,	  W.R.	  Butler,	  and	  R.O.	  Gilbert.	  2010.	  Association	  between	  uterine	  disease	  and	  indicators	  of	  neutrophil	  and	  systemic	  energy	  status	  in	  lactating	  Holstein	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  93:2926-­‐2937.	  Goff,	  J.P,	  M.E.	  Kehrli	  Jr.,	  and	  R.L.	  Horst.	  1989.	  Periparturient	  hypocalcemia	  in	  cows:	  Prevention	  using	  intramuscular	  parathyroid	  hormone.	  J.	  Dairy	  Sci.	  72:1182-­‐1187.	  Gonzalez-­‐de-­‐la-­‐Vara,	  M.R.,	  R.A.	  Valdez,	  V.	  Lemus-­‐Ramirez,	  J.C.	  Vazquez-­‐Chagoyan,	  A.	  Villa-­‐Godoy,	  and	  M.C.	  Romano.	  2011.	  Effects	  of	  adrenocorticotropic	  hormone	  challenge	  and	  age	  on	  hair	  cortisol	  concentrations	  in	  dairy	  cattle.	  Can.	  J.	  Vet.	  Res.	  75:216-­‐221.	  Hammon,	  D.S.,	  I.M.	  Evjen,	  T.R.	  Dhiman,	  J.P.	  Goff	  ,	  and	  J.L.	  Walters.	  2006.	  Neutrophil	  function	  and	  energy	  status	  in	  Holstein	  cows	  with	  uterine	  health	  disorders.	  Vet.	  Immunol.	  Immunopathol.	  113:21–29.	  Hopster,	  H,	  J.T.N.	  van	  der	  Werf,	  and	  H.J.	  Blokhuis.	  1998.	  Stress	  enhanced	  reduction	  in	  peripheral	  blood	  lymphocyte	  numbers	  in	  dairy	  cows	  during	  endotoxin-­‐induced	  mastitis.	  Vet.	  Immunol.	  Immunopathol.	  66:83–97.	  Hopster,	  H.,	  J.T.N.	  Van	  der	  Werf,	  J.H.F	  Erkens,	  and	  H.J	  Blokhuis.	  1999.	  Effects	  of	  repeated	  jugular	  puncture	  on	  plasma	  cortisol	  concentrations	  in	  loose-­‐housed	  dairy	  cows.	  J.	  Anim.	  Sci.	  77:708-­‐714.	  Horst,	  R.L.	  and	  N.A.	  Jorgensen.	  1982.	  Elevated	  plasma	  cortisol	  during	  induced	  and	  spontaneous	  hypecalcemia	  in	  ruminants.	  J.	  Dairy	  Sci.	  65:2331-­‐2337.	  Huszenicza,	  G.,	  S.	  Jánosi,	  A.	  Gáspárdy,	  and	  M.	  Kulcsár.	  2004.	  Endocrine	  aspects	  in	  pathogenesis	  of	  mastitis	  in	  postpartum	  dairy	  cows.	  Anim.	  Reprod.	  Sci.	  82:389-­‐400.	  Huzzey,	  J.M.,	  T.F.	  Duffield,	  S.J.	  LeBlanc,	  D.M.	  Veira,	  D.M.	  Weary,	  and	  M.A.G.	  von	  Keyserlingk.	  2009.	  Short	  communication:	  Haptoglobin	  as	  an	  early	  indicator	  of	  metritis.	  J.	  Dairy	  Sci.	  92:621–625.	  Huzzey,	  J.M.,	  D.V	  Nydam,	  R.J.	  Grant,	  and	  T.R.	  Overton.	  2011.	  Associations	  of	  prepartum	  plasma	  cortisol,	  haptoglobin,	  fecal	  cortisol	  metabolites,	  and	  nonesterified	  fatty	  acids	  with	  postpartum	  health	  status	  in	  Holstein	  dairy	  cows.	  Dom.	  Anim.	  Endocrinol.	  23:67-­‐74.	  	   80	  Ito,	  N.,	  T.	  Ito,	  A.	  Kromminga,	  A.	  Bettermann,	  M.	  Takigawa,	  F.	  Kees,	  R.H.	  Staub,	  and	  R.	  Paus.	  2005.	  Human	  hair	  follicles	  display	  a	  functional	  equivalent	  of	  the	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  and	  synthesize	  cortisol.	  FASEB	  J.	  19:1332-­‐1334.	  Iwersen,	  M.,	  U.	  Falkenberg,	  R.	  Voigtsberger,	  D.	  Forderung,	  and	  W.	  Heuwieser.	  2009.	  Evaluation	  of	  an	  electronic	  cowside	  test	  to	  detect	  subclinical	  ketosis	  in	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  92:2618–2624.	  Kaczmarowski,	  M.,	  E.	  Malinowski,	  and	  H.	  Markiewicz.	  2006.	  Some	  hormonal	  and	  biochemical	  blood	  indices	  in	  cows	  with	  retained	  placenta	  and	  puerperal	  metritis.	  Bull	  Vet.	  Inst.	  Pulawy.	  50:89-­‐92.	  Kasimanickam,	  R.,	  T.F.,	  Duffield,	  R.A.	  Foster,	  C.J.	  Gartley,	  K.E.	  Leslie,	  J.S.	  Walton,	  and	  W.H.	  Johnson.	  2004.	  Endometrial	  cytology	  and	  ultrasonography	  for	  the	  detection	  of	  subclinical	  endometritis	  in	  postpartum	  dairy	  cows.	  Theriogenology.	  62:9-­‐23.	  Kirschbaum,	  C.,	  A.	  Tietze,	  N.	  Skoluda,	  and	  L.	  Dettenborn.	  2009.	  Hair	  as	  a	  retrospective	  calendar	  of	  cortisol	  production	  –	  increased	  cortisol	  incorporation	  into	  hair	  in	  the	  third	  trimester	  of	  pregnancy.	  Psychoneuroendocrinology.	  34:32-­‐37.	  Koren,	  L.,	  O.	  Mokady,	  and	  E.	  Geffen.	  2008.	  Social	  status	  and	  cortisol	  levels	  in	  singing	  rock	  hyraxes.	  Horm.	  Behav.	  54:212-­‐216.	  Koren,	  L.,	  O.	  Mokady,	  T.	  Karaskov,	  J.	  Klein,	  G.	  Koren,	  and	  E.	  Geffen.	  2002.	  A	  novel	  method	  using	  hair	  for	  determining	  hormonal	  levels	  in	  wildlife.	  Anim.	  Behav.	  63:403-­‐406.	  Lavon,	  Y.,	  G.	  Leitner,	  T.	  Goshen,	  R.	  Braw-­‐Tal,	  S.	  Jacoby,	  and	  D.	  Wolfenson.	  2008.	  Exposure	  to	  endotoxin	  during	  estrus	  alters	  the	  timing	  of	  ovulation	  and	  hormonal	  concentrations	  in	  cows.	  Theriogenology.	  70:956-­‐967.	  Lay,	  D.C.,	  T.H.	  Friend,	  R.D.	  Randel,	  O.C.	  Jenkins,	  D.A.	  Neuendorff,	  G.M.	  Kapp,	  and	  D.M.	  Bushong.	  1996.	  Adrenocorticotropic	  hormone	  dose	  response	  and	  some	  physiological	  effects	  of	  transportation	  on	  pregnant	  Brahman	  cattle.	  J.	  Anim.	  Sci.	  74:1806–1811.	  LeBlanc,	  S.	  2010.	  Monitoring	  metabolic	  health	  of	  dairy	  cattle	  in	  the	  transition	  period.	  J.	  Reprod.	  Dev.	  56:S29-­‐S35.	  Lefcourt,	  A.M.,	  J.	  Bitman,	  and	  D.L.	  Wood.	  1993.	  Circadian	  and	  ultradian	  rhythms	  of	  peripheral	  cortisol	  concentrations	  in	  lactating	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  76:2607-­‐2612.	  Lopez-­‐Diaz,	  M.C.	  and	  W.T.K.	  Bosu.	  1992.	  A	  review	  and	  an	  update	  of	  cystic	  ovarian	  degeneration	  in	  ruminants.	  Theriogenology.	  37:1163-­‐1183.	  Macbeth,	  B.J.,	  M.R.L.	  Cattet,	  G.B.	  Stenhouse,	  M.L.	  Gibereau,	  and	  D.M.	  Janz.	  2010.	  Hair	  cortisol	  concentration	  as	  a	  noninvasive	  measure	  of	  long-­‐term	  stress	  in	  free-­‐ranging	  grizzly	  bears	  (Ursus	  arctos):	  considerations	  with	  implications	  for	  other	  wildlife.	  Can.	  J.	  Zool.	  88:935-­‐949.	  Maiero,	  S.,	  E.	  Marchini,	  A.	  Comin,	  B.	  Renaville,	  and	  A.	  Prandi.	  2005.	  Determination	  of	  cortisol	  in	  hair	  as	  an	  indicator	  of	  long-­‐term	  stress	  in	  Simmental	  dairy	  cows.	  Reprod.	  Domest.	  Anim.	  40:396.	  	   81	  Matteri,	  R.L.,	  J.A.	  Carroll,	  and	  C.J.	  Dyer.	  2000.	  Neuroendocrine	  responses	  to	  stress.	  G.P.	  Moberg,	  J.A.	  Mench	  (Eds.),	  The	  Biology	  of	  Animal	  Stress,	  CABI	  Publishing,	  Wallingford,	  UK	  (2000),	  pp	  43-­‐76.	  Meyer,	  J.S.	  and	  M.A.	  Novak.	  2012.	  Minireview:	  Hair	  cortisol:	  A	  novel	  biomarker	  of	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenocortical	  activity.	  Endocrinology.	  153:4120-­‐4127.	  Miller,	  D.B	  and	  J.P.	  O’Callaghan.	  2002.	  Neuroendocrine	  aspects	  of	  the	  response	  to	  stress.	  Metabolism.	  51(Suppl	  1):	  5-­‐10.	  Moberg,	  G.P.	  2000.	  Biological	  response	  to	  stress:	  implications	  for	  animal	  welfare.	  G.P.	  Moberg,	  and	  J.A.	  Mench	  (Eds.),	  The	  Biology	  of	  Animal	  Stress,	  CABI	  Publishing,	  Wallingford,	  UK	  (2000),	  pp	  1-­‐21.	  Moberg	  G.P.	  and	  Mench	  J.A.,	  Eds.	  2000	  .	  The	  Biology	  of	  Animal	  Stress.	  Wallingford,	  UK.:	  CAB	  International.	  pp	  384	  .	  Morin,	  P.A.,	  J.	  Wallis,	  J.J.	  Moore,	  and	  D.S.	  Woodruff.	  1994.	  Paternity	  exclusion	  in	  a	  community	  of	  wild	  chimpanzees	  using	  hypervariable	  simple	  sequence	  repeats.	  Mol.	  Ecol.	  3:469–478.	  Mormède,	  P.,	  S.	  Andanson,	  B.	  Aupérin,	  B.	  Beerda,	  D.	  Guémené,	  J.	  Malmkvist,	  X.	  Manteca,	  G.	  Manteuffel,	  P.	  Prunet,	  C.G.	  van	  Reenen,	  S.	  Richard,	  and	  I.	  Veissier.	  2007.	  Exploration	  of	  the	  hypothalamic–pituitary–adrenal	  function	  as	  a	  tool	  to	  evaluate	  animal	  welfare.	  Physiol.	  Behav.	  92:317-­‐339.	  Möstl,	  E.	  and	  R.	  Palme.	  2002.	  Hormones	  as	  indicators	  of	  stress.	  Dom.	  Anim.	  Endocrinol.	  23:67-­‐74.	  Möstl,	  E.,	  J.L.	  Maggs,	  G.	  Schrötter,	  U.	  Besenfelder,	  and	  R.	  Palme.	  2002.	  Measurement	  of	  cortisol	  metabolites	  in	  faeces	  of	  ruminants.	  Vet.	  Res.	  Commun.	  26:127-­‐139.	  Moya,	  D.,	  K.S.	  Schwartzkopf-­‐Genswein,	  and	  D.M.	  Veira.	  2013.	  Standardization	  of	  a	  non-­‐invasive	  methodology	  to	  measure	  cortisol	  in	  hair	  of	  beef	  cattle.	  Livest.	  Sci.	  158:138-­‐144.	  National	  Research	  Council	  (NRC).	  2001.	  Nutrient	  requirements	  for	  dairy	  cattle.	  Washington,	  DC:	  National	  Academy	  of	  Sciences.	  Negrão,	  J.A.,	  M.A.	  Porcionato,	  A.M.	  de	  Passillé,	  and	  J.	  Rushen.	  2004.	  Cortisol	  in	  saliva	  and	  plasma	  of	  cattle	  after	  ACTH	  administration	  and	  milking.	  J.	  Dairy	  Sci.	  87:1713-­‐1718.	  Pacak,	  K.	  and	  M.	  Palkovits.	  2001.	  Stressor	  specificity	  of	  central	  neuroendocrine	  responses:	  implications	  for	  stress-­‐related	  disorders.	  Endocrinol.	  Rev.	  22:502–548.	  Palme,	  R.,	  P.	  Fischer,	  H.	  Schildorfer,	  and	  M.N.	  Ismail.	  1996.	  Excretion	  of	  infused	  C-­‐steroid	  hormones	  via	  faeces	  and	  urine	  in	  domestic	  livestock.	  Anim.	  Reprod.	  Sci.	  43:43-­‐63.	  Pereg,	  D.,	  R.	  Gow,	  M.	  Mosseri,	  M.	  Lishner,	  M.	  Rieder,	  S.	  Van	  Uum,	  and	  G.	  Koren.	  2011.	  Hair	  cortisol	  and	  the	  risk	  for	  acute	  myocardial	  infarction	  in	  adult	  men.	  Stress.	  14:73-­‐81.	  Peter,	  A.T.	  and	  W.T.K.	  Bosu.	  1987.	  Peripartal	  endocrine	  changes	  associated	  with	  retained	  placenta	  in	  dairy	  cows.	  Theriogenology.	  28:383-­‐394.	  	   82	  Pragst,	  F.	  and	  M.A.	  Balikova.	  2006.	  State	  of	  the	  art	  in	  hair	  analysis	  for	  detection	  of	  drug	  and	  alcohol	  abuse.	  Clin.	  Chim.	  Acta.	  370:17-­‐49.	  Pursley,	  J.R.,	  M.R.	  Kosorok,	  and	  M.C.	  Wiltbank.	  1997.	  Reproductive	  management	  of	  lactating	  dairy	  cows	  using	  synchronization	  of	  ovulation.	  J.	  Dairy.	  Sci.	  80:301-­‐306.	  Rivier,	  C.	  and	  S.	  Rivest.	  1991.	  Effect	  of	  stress	  on	  the	  activity	  of	  the	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐gonadal	  axis:	  peripheral	  and	  central	  mechanisms.	  Biol.	  Reprod.	  45:523-­‐532.	  Romero,	  L.M.	  and	  L.K.	  Butler.	  2007.	  Endocrinology	  of	  stress.	  Int.	  J.	  Comp.	  Psychology.	  20:89-­‐95.	  Roth,	  J.	  1985.	  Cortisol	  as	  mediator	  of	  stress-­‐associated	  immunosuppression	  in	  cattle.	  In	  Animal	  stress	  (Ed.	  Moberg,	  G.	  P.)	  American	  Physiological	  Society,	  Bethesda,	  Maryland.	  pp	  225-­‐242.	  Roulin,	  A.,	  B.	  Almasi,	  A.	  Rossi-­‐Pedruzzi,	  A.L.	  Ducrest,	  K.	  Wakamatsu,	  I.	  Miksik,	  J.D.	  Blount,	  S.	  Jenni-­‐Eiermann,	  and	  L.	  Jenni.	  2008.	  Corticosterone	  mediates	  the	  condition-­‐dependent	  component	  of	  melanin-­‐based	  coloration.	  Anim.	  Behav.	  75:1351–1358.	  Rushen,	  J.,	  A.M.	  de	  Passillé,	  M.A.G.	  von	  Keyserlingk,	  and	  D.M.	  Weary.	  2010.	  The	  welfare	  of	  cattle.	  Dordrecht:	  Springer.	  310pp.	  Russell,	  E.,	  G.	  Koren,	  M.	  Rieder,	  and	  S.	  Van	  Uum.	  2012.	  Hair	  cortisol	  as	  a	  biological	  marker	  of	  chronic	  stress:	  Current	  status,	  future	  directions	  and	  unanswered	  questions.	  Psychoneuroendocrinology.	  37:589-­‐601.	  Rutigliano,	  H.M.,	  F.S.	  Lima,	  R.L.A.	  Cerri,	  L.F.	  Greco,	  J.M.	  Vilela,	  V.	  Magalhães,	  F.T.	  Silvestre,	  W.W.	  Thatcher,	  and	  J.E.P.	  Santos.	  2008.	  Effects	  of	  method	  of	  presynchronization	  and	  source	  of	  selenium	  on	  uterine	  health	  and	  reproduction	  in	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  91:3323–3336.	  Sapolsky,	  R.M.	  2000.	  Stress	  hormones:	  good	  and	  bad.	  Neuro.	  Disease.	  7:540-­‐542.	  Sapolsky,	  R.M.,	  L.M.	  Romero,	  and	  A.U.	  Munck.	  2000.	  How	  do	  glucocorticoids	  influence	  stress	  responses?	  Integrating	  permissive,	  suppressive,	  stimulatory,	  and	  preparative	  actions.	  Endocrinol.	  Rev.	  21:55-­‐89.	  Schwertl,	  M.,	  K.	  Auerswald,	  and	  H.	  Schnyder.	  2003.	  Reconstruction	  of	  the	  isotopic	  history	  of	  animal	  diets	  by	  hair	  segmental	  analysis.	  Rapid	  Commun.	  Mass	  Spectrum.	  17:1312-­‐1318.	  Scott,	  L.V.	  and	  T.G.	  Dinan.	  1998.	  Vasopressin	  and	  the	  regulation	  of	  hypothalamic-­‐pituitary-­‐adrenal	  axis	  function:	  Implications	  for	  the	  pathophysiology	  of	  depression.	  Life	  Sci.	  62:1985-­‐1988.	  Seifi,	  H.A.,	  S.J.	  LeBlanc,	  K.E.	  Leslie,	  and	  T.F.	  Duffield.	  2011.	  Metabolic	  predictors	  of	  post-­‐partum	  disease	  and	  culling	  risk	  in	  dairy	  cattle.	  Vet.	  J.	  188:216-­‐220.	  Sharpley,	  C.F.,	  J.R.	  McFarlane,	  and	  A.	  Slominski.	  2011.	  Stress-­‐linked	  cortisol	  concentrations	  in	  hair:	  what	  we	  know	  and	  what	  we	  need	  to	  know.	  Rev.	  Neurosci.	  23:111-­‐121.	  Sheldon,	  I.M.,	  G.S.	  Lewis,	  S.	  LeBlanc,	  and	  R.O.	  Gilbert.	  2006.	  Defining	  postpartum	  uterine	  disease	  in	  cattle.	  Theriogenology.	  65:1516-­‐1530.	  	   83	  Sheriff,	  M.J.,	  C.J.	  Krebs,	  and	  R.	  Boonstra.	  2010.	  Assessing	  stress	  in	  animal	  populations:	  Do	  fecal	  and	  plasma	  glucocorticoids	  tell	  the	  same	  story?	  Gen.	  Comp.	  Endocrinol.	  166:614-­‐619.	  Slominski,	  A.,	  D.J.	  Tobin,	  S.	  Shibahara,	  and	  J.	  Wortsman.	  2004.	  Melanin	  pigmentation	  in	  mammalian	  skin	  and	  its	  hormonal	  regulation.	  Physiol.	  Rev.	  84:1155–1228.	  Slominski,	  A.,	  B.	  Zbytek,	  A.	  Szczesniewski,	  I.	  Semak,	  J.	  Kaminski,	  T.	  Sweatman,	  and	  J.	  Wortsman.	  2005.	  CRH	  stimulation	  of	  corticosteroids	  production	  in	  melanocytes	  is	  mediated	  by	  ACTH.	  Am.	  J.	  Physiol.	  Endocrinol.	  Metab.	  288:E701-­‐E706.	  Smith,	  R.F.	  and	  H.	  Dobson.	  2002.	  Hormonal	  interactions	  within	  the	  hypothalamus	  and	  pituitary	  with	  respect	  to	  stress	  and	  reproduction	  in	  sheep.	  Domest.	  Anim.	  Endocrinol.	  23:75–85.	  Smith,	  R.F.,	  S.P.	  Ghuman,	  N.P.	  Evans,	  F.J.	  Karsch,	  and	  H.	  Dobson.	  2003.	  Stress	  and	  the	  control	  of	  LH	  secretion	  in	  the	  ewe.	  Reprod.	  Suppl.	  61:267–282.	  Stafford,	  K.J.	  and	  D.J.	  Mellor.	  2005.	  Dehorning	  and	  disbudding	  distress	  and	  its	  alleviation	  in	  calves.	  Vet	  J.	  169:337-­‐349	  Stalder,	  T.	  and	  C.	  Kirschbaum.	  2012.	  Analysis	  of	  cortisol	  in	  hair	  –	  State	  of	  the	  art	  and	  future	  directions.	  Brain	  Behav.	  Immun.	  26:1019-­‐1029.	  Thomson,	  S.,	  G.	  Koren,	  L.A.	  Fraser,	  M.	  Reider,	  T.C.	  Friedman,	  and	  S.H.	  Van	  Uum.	  2010.	  Hair	  analysis	  provides	  a	  historical	  record	  of	  cortisol	  levels	  in	  Cushing’s	  syndrome.	  Exp.	  Clin.	  Endocrinol.	  Diabetes.	  118:133-­‐138.	  Thun,	  R,	  E.	  Eggenberger,	  K.	  Zerobin,	  T.	  Lüscher,	  and	  W.	  Vetter.	  1981.	  Twenty-­‐four-­‐hour	  secretory	  pattern	  of	  cortisol	  in	  the	  bull:	  Evidence	  of	  episodic	  secretion	  and	  circadian	  rhythm.	  Endocrinology.	  109:2208–2212.	  Tilbrook,	  A.J.,	  A.I.	  Turner,	  and	  I.J.	  Clarke.	  2000.	  Effects	  of	  stress	  on	  reproduction	  in	  non-­‐rodent	  mammals:	  the	  role	  of	  glucocorticoids	  and	  sex	  differences.	  Rev.	  Reprod.	  5:105-­‐113.	  Trevisi,	  E.	  and	  G.	  Bertoni.	  2009.	  Some	  physiological	  and	  biochemical	  methods	  for	  acute	  and	  chronic	  stress	  evaluation	  in	  dairy	  cows.	  Ital.	  J.	  Anim.	  Sci.	  8:265-­‐286.	  Tuchscherer,	  M.,	  E.	  Kanitz,	  B.	  Puppe,	  A.	  Tuchscherer,	  and	  B.	  Stabenow.	  2004.	  Effects	  of	  postnatal	  social	  isolation	  on	  hormonal	  and	  immune	  responses	  of	  pigs	  to	  an	  acute	  endotoxin	  challenge.	  Physiol.	  Biol.	  82:503-­‐511.	  Turner,	  A.I.,	  P.H.	  Hemsworth,	  and	  A.J.	  Tilbrook.	  2005.	  Susceptibility	  of	  reproduction	  in	  female	  pigs	  to	  impairment	  by	  stress	  or	  elevation	  of	  cortisol.	  Domest.	  Anim.	  Endocrinol.	  29:398–410.	  Van	  Uum,	  S.H.M,	  B.	  Sauve,	  L.A.	  Fraser,	  P.	  Morley-­‐Foster,	  T.L.	  Paul,	  and	  G.	  Koren.	  2008.	  Elevated	  content	  of	  cortisol	  in	  hair	  of	  patients	  with	  severe	  chronic	  pain:	  A	  novel	  biomarker	  for	  stress.	  Stress.	  11:483–488.	  Vazquez-­‐Añon,	  M.,	  S.	  Bertics,	  M.	  Luck,	  R.R.	  Grummer,	  and	  J.	  Pinheiro.	  1994.	  Peripartum	  liver	  triglyceride	  and	  plasma	  metabolites	  in	  dairy	  cows.	  J.	  Dairy	  Sci.	  77:1521–1528.	  	   84	  Visser,	  E.K.,	  A.D.	  Ellis,	  and	  C.G.	  Van	  Reenen.	  2008.	  The	  effect	  of	  two	  different	  housing	  conditions	  on	  the	  welfare	  of	  young	  horses	  stabled	  for	  the	  first	  time.	  Appl.	  Anim.	  Behav.	  Sci.	  114:521–533.	  von	  Borell,	  E.,	  H.	  Dobson,	  and	  A.	  Prunier.	  2007.	  Stress,	  behaviour	  and	  reproductive	  performance	  in	  female	  cattle	  and	  pigs.	  Horm.	  Behav.	  52:130-­‐138.	  Vukelic,	  S.,	  O.	  Stojadinovic,	  I.	  Pastar,	  M.	  Rabach,	  A.	  Krzyanowska,	  E.	  Lebrun,	  S.C.	  Davis,	  S.	  Resnik,	  H.	  Brem,	  and	  M.	  Tomic-­‐Canic.	  2011.	  Cortisol	  synthesis	  in	  epidermis	  is	  induced	  by	  IL-­‐1	  and	  tissue	  injury.	  J.	  Biol.	  Chem.	  286:10265-­‐10275.	  Walker,	  S.L.,	  R.F.	  Smith,	  D.N.	  Jones,	  J.E.	  Routly,	  and	  H.	  Dobson.	  2008.	  Chronic	  stress,	  hormone	  profiles	  and	  estrus	  intensity	  in	  dairy	  cattle.	  Horm.	  Behav.	  53:493-­‐501.	  Wennig,	  R.	  2000.	  Potential	  problems	  with	  the	  interpretation	  of	  hair	  analysis	  results.	  Forensic	  Sci.	  Int.	  107:5-­‐12.	  Wheeler,	  M.J.,	  Y.B.	  Zhong,	  A.T.	  Kicman,	  and	  S.B.	  Coutts.	  1998.	  The	  measurement	  of	  testosterone	  in	  hair.	  J.	  Endocrin.	  159:R5–R8.	  Wurtman,	  R.J.	  2002.	  Stress	  and	  the	  adrenocortical	  control	  of	  epinephrine	  synthesis.	  Metabolism.	  51(Suppl	  1):11-­‐14.	  Yamada,	  J.,	  B.	  Stevens,	  N.	  de	  Silva	  N,	  S.	  Gibbins,	  J.	  Beyene,	  A.	  Taddio,	  C.	  Newman,	  and	  G.	  Koren.	  2007.	  Hair	  cortisol	  as	  a	  potential	  biologic	  marker	  of	  chronic	  stress	  in	  hospitalized	  neonates.	  Neonatology.	  92:42-­‐49.	  Yates,	  D.,	  L.J.	  Yates,	  R.A.	  Halalsheh,	  R.L.	  Wesley,	  D.M.	  Hallford,	  and	  T.T.	  Ross.	  2010.	  Comparison	  of	  serum	  and	  salivary	  cortisol	  in	  restrained	  ewe	  lambs	  after	  (adrenocorticotropic	  hormone)	  ACTH	  administration.	  J.	  Vet.	  Med.	  Anim.	  Health.	  2:59-­‐61.	  	  


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items