Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

The effects of strain and ploidy on the physiological responses of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)… Thompson, William Andrew 2014

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Notice for Google Chrome users:
If you are having trouble viewing or searching the PDF with Google Chrome, please download it here instead.

Item Metadata


24-ubc_2014_spring_thompson_william.pdf [ 11.39MB ]
JSON: 24-1.0166926.json
JSON-LD: 24-1.0166926-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0166926-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0166926-rdf.json
Turtle: 24-1.0166926-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0166926-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0166926-source.json
Full Text

Full Text

The	  effects	  of	  strain	  and	  ploidy	  on	  the	  physiological	  responses	  of	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  to	  pH	  9.5	  exposure	  	  	  	  by	  	  	   William	  Andrew	  Thompson	  	  	  B.Sc.,	  The	  University	  of	  British	  Columbia,	  2010	  	  	  	  	  	  	  A	  THESIS	  SUBMITTED	  IN	  PARTIAL	  FULFILLMENT	  OF	  THE	  REQUIREMENTS	  FOR	  THE	  DEGREE	  OF	  	  MASTER	  OF	  SCIENCE	  	  in	  	  THE	  FACULTY	  OF	  GRADUATE	  AND	  POSTDOCTORAL	  STUDIES	  	  (Zoology)	  	  	  	  	  	  The	  University	  of	  British	  Columbia	  (Vancouver)	  	  	  April	  2014	  	  	  	  	  	  ©William	  Andrew	  Thompson	  2014	  	   ii	  Abstract	  	  	   British	  Columba	  (BC)	  has	  a	  well-­‐established	  lake-­‐stocking	  program	  that	  relies	  on	  hatchery-­‐reared	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  from	  multiple	  wild	  and	  domesticated	  strains.	  These	  strains	  are	  stocked	  into	  BC	  lakes	  as	  diploids	  and	  triploids	  and,	  in	  general,	  high	  mortality	  rates	  are	  common	  after	  lake	  stocking	  due	  to	  environmental	  conditions.	  Of	  particular	  concern	  is	  that	  some	  lakes	  in	  BC	  are	  approaching	  a	  pH	  of	  9.5,	  and	  it	  is	  not	  known	  if	  strain	  and	  ploidy	  affects	  the	  physiological	  responses	  of	  trout	  to	  high	  pH	  exposure.	  	  The	  goal	  of	  this	  thesis	  is	  to	  understand	  the	  effects	  of	  pH	  exposure,	  in	  both	  soft	  and	  hard	  water,	  on	  wild	  and	  domestic	  strains	  of	  trout	  as	  diploids	  and	  triploids.	  In	  soft	  water,	  high	  pH	  exposure	  resulted	  in	  more	  than	  40%	  loss	  of	  equilibrium	  in	  the	  wild	  strains	  of	  trout	  while	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  had	  fewer	  than	  10%	  of	  individuals	  lose	  equilibrium	  overall.	  There	  were	  no	  clear	  differences	  between	  ploidies	  in	  loss	  of	  equilibrium.	  High	  pH	  exposure	  caused	  significant	  increases	  in	  plasma	  and	  tissue	  ammonia,	  with	  no	  differences	  between	  strains	  or	  ploidies	  in	  ammonia	  accumulation.	  In	  the	  brain,	  glutamine	  increased	  in	  response	  to	  high	  pH	  exposure	  and	  glutamate	  decreased	  suggesting	  a	  protective	  mechanism	  of	  glutamine	  production	  in	  high	  pH.	  Plasma	  lactate	  accumulated	  in	  all	  groups,	  suggesting	  an	  increase	  in	  anaerobic	  metabolism	  as	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure.	  There	  were	  no	  physiological	  differences	  between	  high	  pH	  exposure	  in	  hard	  and	  soft	  water	  among	  the	  strains	  tested.	  However,	  triploid	  rainbow	  trout	  suffered	  a	  greater	  loss	  of	  equilibrium	  than	  diploid	  trout,	  occurring	  in	  conjunction	  with	  a	  significant	  elevation	  of	  brain	  ammonia	  in	  triploid	  rainbow	  trout	  when	  compared	  to	  diploid	  trout	  in	  high	  pH	  water.	  Overall,	  the	  	   iii	  results	  of	  this	  thesis	  demonstrate	  an	  effect	  of	  strain	  on	  high	  pH	  tolerance	  in	  trout,	  but	  the	  differences	  in	  tolerance	  appear	  to	  not	  be	  explained	  by	  differences	  in	  ion	  regulation	  and	  ammonia	  balance.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   iv	  Preface	  	  	   Chapters	  2	  and	  3	  of	  this	  thesis	  are	  co-­‐authored	  by	  William	  A.	  Thompson,	  Tammy	  Rodela,	  and	  Jeffrey	  G.	  Richards.	  I	  conducted	  the	  research	  in	  both	  chapters	  under	  the	  supervision	  of	  Dr.	  Jeffrey	  G.	  Richards,	  with	  the	  exception	  of	  the	  measurements	  of	  plasma	  cortisol	  and	  brain	  composition	  percentages	  in	  Chapter	  3,	  which	  were	  collected	  by	  Tammy	  Rodela	  (UBC)	  and	  an	  undergraduate	  volunteer,	  Amir	  Pourghardiri	  (UBC),	  respectively.	  I	  wrote	  all	  4	  chapters	  of	  this	  thesis	  and	  I	  received	  editorial	  feedback	  from	  Drs.	  Jeffrey	  G.	  Richards,	  Patricia	  Schulte,	  and	  Colin	  J.	  Brauner.	  	  	   All	  procedures	  involving	  animals	  were	  performed	  using	  protocols	  approved	  by	  the	  Animal	  Care	  Committee,	  certificate	  A13-­‐0024.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   v	  Table	  of	  contents	  	  	  Abstract…..…………………………………………………………………………………………………………...ii	  	  Preface…………………………………………………………………..……………………………………………iv	  	  Table	  of	  contents………………………………………………………..………………………………………..v	  	  List	  of	  figures………………………………………………………………..………………………….............vii	  	  Acknowledgments……………………………………………………………..…………………………….....ix	  	  Dedication……………………………………………………………………………..…………………………….x	  	  [1]	   	  	  	  General	  introduction…………………………………….…….………………………………….1	  	   1.1 Rainbow	  trout……………………………………………….…..…………………………………...1	  	  	  	  	  	  	  	  1.2	  	  	  	  	  Aquaculture……….…………………………………...………...…………………………………...2	  	   	  	  	  	  	  	  	  1.3	  	  	  	  	  Provincial	  fish	  stocking	  program………………………………..…………………….......3	  	  	  	  	  	  	  	  1.4	  	  	  	  	  The	  environmental	  parameters	  of	  stocked	  lakes	  in	  British	  Columbia......7	  	  	  	  	  	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  1.5	  	  	  	  	  Morphological	  and	  physiological	  responses	  to	  elevated	  ambient	  pH……8	  	   	  	  	  	  1.5.1	  Ionoregulation	  in	  high	  pH…………………………………………………………….…….9	  	   	  	  	  	  1.5.2	  Nitrogen	  balance	  in	  high	  pH……………………………………………………………...11	  	   	  	  	  	  1.5.3	  Blood	  parameters	  in	  high	  pH…………………………………………………………….13	  	   	  	  	  	  1.5.4	  Hard	  water	  and	  high	  pH…..…………………………………………………………….…14	  	  	  	  	  	  	  	  1.6	  	  	  	  	  Objectives…………………………………………………………………………………………….15	  	  [2]	  	   	  	  	  The	  physiological	  effects	  of	  high	  pH	  (9.5)	  exposure	  on	  various	  strains	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   	  	  	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)……..……..16	  	  	  	  	  	  	  	  	  2.1	  	  	  	  	  Introduction……………………………………………………………………...…...……………16	  	  	  	  	  	  	  	  2.2	  	  	  	  	  Materials	  and	  methods…………………..………………………………………...……….…18	  	   	  	  	  	  2.2.1	  Experimental	  animals………………………………………………………………...……..18	  	   	  	  	  	  2.2.2	  Experimental	  protocol…………………………………………………………………...….19	  	   	  	  	  	  2.2.3	  Analytical	  techniques………………………………………………………………….........22	  	   	  	  	  	  2.2.4	  Statistical	  analysis…………………………………………………………………………….25	  	  	  	  	  	  	  	  2.3	  	  	  	  	  Results………………………………………………………………………………………………….25	  	   	  	  	  	  2.3.1	  Loss	  of	  equilibrium	  2011	  study………………………………………………………….25	  	   vi	  	   	  	  	  	  2.3.2	  Haematology…………………………………………………………………………..………..26	  	   	  	  	  	  2.3.3	  Nitrogen	  balance………………………………………………………………………..…….27	  	   	  	  	  	  2.3.4	  Loss	  of	  equilibrium	  2012	  study………………………………………………………….28	  	   	  	  	  	  2.3.5	  Brain	  metabolites…………………………………………………………………………..…28	  	   	  	  	  	  2.3.6	  Plasma	  ions………………………………………………………………………………………29	  	   	  	  	  	  2.3.7	  Plasma	  lactate………………………………………………………………………………….30	  	   	  	  	  	  	  	  	  2.4	  	  	  	  	  Discussion………………………………………………………………………………………….…31	  	  	  	  	  	  	  	  2.5	  	  	  	  	  Conclusion………………………………………………………………………………....…………36	  	  [3]	  	   	  	  	  The	  physiological	  response	  of	  wild	  and	  domestic	  strains	  of	  diploid	  and	  	   	  	  	  	  	  	  	   	  	  	  triploid	  Rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  in	  hard	  and	  soft	  high	  	   	  	  	  	  	  	   	  	  	  pH	  (9.5)	  water…………………………………………………….…………………..………….…43	  	  	  	  	  	  	  	  3.1	  	  	  	  	  Introduction…………………………………………………………………………………………43	  	  	  	  	  	  	  	  3.2	  	  	  	  	  Materials	  and	  methods………………………………………………………..……………….45	  	   	  	  	  	  3.2.1	  Experimental	  animals……………………………………………………..…….…………..45	  	   	  	  	  	  3.2.2	  Experimental	  protocol………………………………………………………..….………….46	  	   	  	  	  	  3.2.3	  Analytical	  techniques……………………………………………………………..…………48	  	   	  	  	  	  3.2.4	  Statistical	  analysis………………………………………………………………….….……..50	  	  	  	  	  	  	  	  3.3	  	  	  	  	  Results……………………………………………………………………………………….……..….51	  	   	  	  	  	  3.3.1	  Loss	  of	  equilibrium………………………………………………………………….………..51	  	   	  	  	  	  3.3.2	  Plasma	  ions…………………………………………………………………………….………..51	  	   	  	  	  	  3.3.3	  Plasma	  cortisol………………………………………………………………….…….……….52	  	   	  	  	  	  3.3.4	  Ammonia	  and	  brain	  weights…………………………………………………….………53	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  3.4	  	  	  	  	  Discussion………………...………………………………………….…………………......……….54	  	  	  	  	  	  	  	  3.5	  	  	  	  	  Conclusion…………………………………………………………….……………………...………58	  	  [4]	  	   	  	  	  General	  discussion	  and	  conclusions……………………….……………………….……65	  	  	  	  	  	  	  	  4.1	  	  	  	  The	  effects	  of	  strain	  and	  ploidy	  on	  the	  physiological	  response	  of	  trout	  to	  pH	  	  	  	   	  	  	  	  	   	  	  9.5	  water…………………………………………………………………….………………………………65	  	  	  	  	  	  	  	  4.2	  	  	  	  The	  effects	  of	  water	  hardness	  on	  the	  physiological	  response	  to	  high	  pH	  	  	  	  	   	  	  	   	  	  water	  of	  various	  strains	  and	  ploidies	  of	  rainbow	  trout….…………………….………..67	  	  	  	  	  	  	  	  4.3	  	  	  	  Recommendations	  and	  future	  research………………..………………………………..…….68	  	  References………………………………………………………………………………………………………….71	  	  	  	   vii	  List	  of	  figures	  	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.1	  	  	  	  	  Loss	  of	  equilibrium	  data	  from	  2011	  of	  four	  strains	  of	  diploid	  and	  	  	   	   	  	  	  triploid	  rainbow	  trout	  losing	  equilibrium	  in	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  	  	   	   	  	  	  48	  hours..…………………………………………………………………………………..37	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.2	  	  	  	  	  Hemoglobin,	  hematocrit,	  and	  mean	  cell	  hemoglobin	  concentration	  	  	   	   	  	  	  of	  four	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  in	  high	  pH	  (9.5)	  	  	   	   	  	  	  water	  for	  48	  hours….………………………………………………………………….38	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.3	  	  	  	  	  Total	  plasma	  ammonia,	  plasma	  urea,	  and	  white	  muscle	  ammonia	  of	  	  	   	   	  	  	  four	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  in	  high	  pH	  (9.5)	  	  	   	   	  	  	  water	  for	  48	  hours……………………………………………………………………...39	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.4	  	  	  	  	  Loss	  of	  equilibrium	  data	  from	  2012	  of	  five	  strains	  of	  diploid	  and	  	  	   	   	  	  	  triploid	  rainbow	  trout	  losing	  equilibrium	  in	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  	   	  	  	  	   	   	  	  	  72	  hours………………………………………………….…………………………………40	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.5	  	  	  	  	  Total	  brain	  ammonia,	  brain	  glutamate,	  and	  brain	  glutamine	  of	  five	  	  	   	   	  	  	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  in	  high	  pH	  (9.5)	  water	  	  	   	   	  	  	  for	  72	  hours…........................................................................................................…41	  	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.6	  	  	  	  	  	  Plasma	  sodium,	  plasma	  chloride,	  and	  plasma	  lactate	  of	  five	  strains	  	  	   	   	  	  	  	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  in	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  72	  	   	  	   	   	  	  	  	  hours…………………………………………………………………………………..…….42	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  3.1	  	  	  	  	  	  Number	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  from	  four	  strains	  	  	   	   	  	  	  	  showing	  a	  loss	  of	  equilibrium	  after	  24	  hours	  of	  exposure	  to	  control,	  	  	   	   	  	  	  	  soft	  high	  pH	  (9.5),	  and	  hard	  high	  pH	  (9.5)	  water……….…………...……60	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  3.2	  	  	  	  	  	  Plasma	  sodium	  and	  plasma	  chloride	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  trout	  from	  four	  strains	  exposed	  to	  control,	  soft	  high	  pH	  (9.5),	  and	  	  	   	   	  	  	  	  hard	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  24	  hours………………...……………..……….61	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  3.3	  	  	  	  	  	  Plasma	  cortisol	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  from	  four	  	  	   	   	  	  	  	  strains	  exposed	  to	  control,	  soft	  high	  pH	  (9.5),	  and	  hard	  high	  pH	  (9.5)	  	   	   	  	  	  	  water	  for	  24	  hours..……………………………………………………………..…….62	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  Figure	  3.4	  	  	  	  	  	  Plasma	  ammonia,	  liver	  ammonia,	  and	  brain	  ammonia	  of	  diploid	  and	  	  	   	   	  	  	  	  triploid	  rainbow	  trout	  from	  four	  strains	  exposed	  to	  control,	  soft	  	  	   	   	  	  	  	  high	  pH	  (9.5),	  and	  hard	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  24	  hours…….……...63	  	  	  	  	  	   viii	  	  	  	  	  	  	  Figure	  3.5	  	  	  	  	  	  Percent	  water,	  and	  percent	  dry	  mass	  of	  the	  brains	  of	  diploid	  and	  	  	   	   	  	  	  	  triploid	  rainbow	  trout	  from	  four	  strains	  exposed	  to	  control,	  soft	  	  	   	   	  	  	  	  high	  pH	  (9.5),	  and	  hard	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  24	  hours	  …...……….64	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   ix	  Acknowledgements	  	   I	  first	  need	  to	  thank	  my	  supervisor	  Dr.	  Jeff	  Richards	  for	  all	  he	  has	  done	  for	  me.	  For	  giving	  me	  an	  opportunity	  to	  prove	  myself	  in	  his	  lab,	  and	  all	  the	  time	  he	  has	  invested	  in	  me	  to	  be	  where	  I	  am	  today.	  To	  say	  I	  couldn’t	  have	  done	  it	  without	  him	  would	  be	  the	  largest	  understatement	  of	  my	  life.	  I	  also	  must	  thank	  my	  committee	  members	  Dr.	  Trish	  Schulte	  and	  Dr.	  Colin	  Brauner	  for	  their	  guidance	  throughout	  my	  masters.	  I	  am	  indebted	  to	  Dr.	  Rush	  Dhillon	  for	  “breaking	  me	  down	  and	  building	  me	  back	  up	  correctly”,	  and	  Dr.	  Tammy	  Rodela	  for	  attempting	  to	  “keep	  me	  focused	  on	  the	  goal”.	  To	  my	  lab	  mates,	  Gigi	  Lau,	  Milica	  Mandic,	  Matt	  Regan,	  Dave	  Allen,	  Mark	  Scott,	  Ben	  Speers-­‐Roesch,	  Lili	  Yao,	  Joshua	  Emerman,	  Cris	  Gomez,	  and	  Tara	  McBryan,	  thank	  you	  for	  fighting	  the	  good	  fight	  with	  me.	  Long	  hours	  in	  the	  lab	  were	  only	  possible	  because	  of	  you.	  	  	   The	  times	  I	  had	  with	  the	  “Comphy”	  crew	  were	  incredible.	  Words	  cannot	  express	  how	  amazing	  the	  individuals	  in	  the	  department	  are,	  with	  special	  mention	  to	  Mike	  Sackville,	  Yvonne	  Dzal,	  Georgie	  Cox,	  Till	  Harter,	  Emily	  Gallagher,	  Jonathon	  Wong,	  Katelyn	  Tovey,	  Michelle	  Ou,	  and	  Ryan	  Shartau.	  They	  were	  always	  willing	  to	  talk	  science,	  celebrate	  the	  good	  times,	  and	  keep	  you	  going	  during	  the	  bad.	  I	  have	  to	  thank	  Betty	  Hsu,	  for	  her	  support	  and	  patience	  throughout	  the	  long	  hours	  and	  my	  bouts	  of	  madness.	  Thank	  you	  to	  my	  friends,	  James	  Chan,	  Kris	  Odulio,	  Anthony	  Chu,	  Terence	  Ng,	  MJ	  Labao,	  Will	  Chan,	  Conrad	  Nisperos,	  and	  Jamie	  Yuen,	  because	  I	  told	  you	  I	  would	  mention	  you	  at	  some	  point	  in	  this	  thesis.	  Finally,	  I	  have	  to	  thank	  Subway™	  and	  Fresh	  Slice™,	  for	  being	  my	  number	  one	  source	  of	  nutrition	  and	  the	  downfall	  of	  my	  physique.	  	  	   x	  	  	  	  	  	  	  	   For	  my	  grandmother	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   1	  [1]	  General	  introduction	  	  General	  overview	  	   Given	  the	  rainbow	  trout’s	  importance	  to	  sport	  fishing	  in	  British	  Columbia,	  experimentally	  addressing	  their	  abilities	  and	  limitations	  will	  be	  of	  great	  financial	  benefit	  to	  the	  province.	  In	  this	  thesis	  I	  assess	  the	  physiological	  response	  of	  diploid	  and	  triploid	  stains	  of	  rainbow	  trout	  to	  a	  high	  pH	  environment.	  I	  focus	  primarily	  on	  physiological	  changes	  related	  to	  ammonia	  balance,	  ionoregulation,	  and	  markers	  of	  stress.	  	  1.1	  Rainbow	  trout	  	   Rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  are	  members	  of	  the	  family	  Salmonidae	  and	  genus	  Oncorhynchus	  and	  are	  closely	  related	  to	  Pacific	  Salmon	  (Benhke,	  2010).	  Rainbow	  trout	  are	  not	  to	  be	  confused	  with	  the	  anadromous	  form	  of	  Oncorhynchus	  mykiss,	  the	  Steelhead	  trout,	  as	  the	  rainbow	  trout	  possess	  a	  different	  life	  history	  in	  which	  all	  life	  stages	  live	  in	  a	  freshwater	  environment	  (McCusker	  et	  al.	  2000).	  The	  body	  of	  work	  presented	  in	  this	  thesis	  solely	  focuses	  on	  the	  physiology	  and	  biochemistry	  of	  rainbow	  trout.	  The	  rainbow	  trout	  is	  native	  to	  the	  areas	  around	  the	  Pacific	  Ocean,	  extending	  from	  the	  coastline	  of	  California	  to	  Eastern	  Russia	  (McCusker	  et	  al.	  2000).	  Geographical	  distributions	  across	  a	  variety	  of	  organisms	  have	  led	  to	  the	  theory	  that	  in	  the	  Pleistocene	  era,	  a	  path	  was	  formed	  from	  the	  Columbia	  River	  that	  allowed	  the	  radiation	  of	  the	  rainbow	  trout	  to	  previously	  unpopulated	  areas	  in	  California	  (Benhke,	  1979).	  Rainbow	  trout	  have	  been	  	   2	  introduced	  to	  a	  wide	  range	  of	  locales	  including	  Europe,	  Asia,	  Australia,	  Africa,	  South	  America,	  and	  are	  prominent	  on	  the	  Western	  and	  Eastern	  coasts	  of	  North	  America	  (MacCrimmon,	  1972;	  Benhke,	  1979).	  Rainbow	  trout	  prefer	  temperatures	  ranging	  from	  13°C	  to	  18°C,	  and	  can	  tolerate	  variations	  of	  water	  quality,	  and	  other	  environmental	  variables	  (Hardy,	  2002).	  Their	  range	  of	  tolerance	  of	  varied	  environments	  further	  advanced	  their	  propagation	  around	  the	  world	  (Keeley	  et	  al.	  2005;	  Keeley	  et	  al.	  2007).	  They	  are	  a	  major	  food	  source	  across	  the	  globe	  and	  as	  a	  result	  many	  countries	  have	  developed	  rainbow	  trout	  hatcheries	  to	  meet	  this	  demand	  (MacCrimmon,	  1971;	  Benhke,	  1979).	  	  	  1.2	  Aquaculture	  	  	   The	  successful	  growth	  of	  fish	  in	  hatcheries	  allowed	  the	  development	  of	  lake	  stocking	  programs	  to	  supplement	  a	  growing	  recreational	  fishing	  industry.	  The	  first	  report	  of	  hatchery-­‐reared	  rainbow	  trout	  was	  in	  the	  1870’s	  by	  the	  California	  Acclimatization	  Society	  (Benhke,	  1979).	  The	  success	  of	  the	  hatchery	  allowed	  the	  introduction	  of	  rainbow	  trout	  to	  new	  regions	  throughout	  the	  United	  States	  and	  the	  world	  (MacCrimmon,	  1972).	  Rainbow	  trout	  currently	  comprise	  nearly	  half	  of	  the	  8	  million	  fish	  stocked	  in	  BC,	  and	  the	  system	  that	  handles	  stocking	  began	  to	  develop	  in	  the	  late	  1880’s	  (GSGislason	  and	  Associates	  Ltd,	  2009).	  At	  that	  time,	  BC	  had	  17	  government	  run	  hatcheries	  primarily	  culturing	  sockeye	  salmon	  (Robson,	  2004).	  These	  hatcheries	  discontinued	  salmon	  production	  by	  1941	  and	  shifted	  their	  focus	  to	  managing	  freshwater	  species	  through	  a	  provincial	  effort	  coordinated	  by	  the	  Ministry	  of	  Fisheries	  to	  supervise	  all	  aquaculture	  sites	  (Robson,	  2004).	  Today,	  the	  	   3	  culturing	  of	  freshwater	  fish	  is	  largely	  managed	  by	  a	  non-­‐profit	  organization,	  the	  Freshwater	  Fishery	  Society	  of	  British	  Columbia	  (FFSBC),	  who	  play	  an	  integral	  role	  in	  maintaining	  a	  provincial	  fish	  stocking	  program	  that	  supports	  sport	  fishing	  (Robson,	  2004).	  	  1.3	  Provincial	  fish	  stocking	  program	  	   The	  sport	  fishing	  industry	  in	  BC	  generates	  over	  400	  million	  dollars	  in	  revenue	  from	  approximately	  300	  thousand	  anglers	  per	  year	  (Clarke,	  2012).	  To	  meet	  this	  incredible	  demand	  from	  tourism	  for	  this	  activity,	  the	  FFSBC	  supplements	  high	  traffic	  lakes	  with	  fish	  raised	  in	  local	  hatcheries.	  Between	  2004	  and	  2009	  nearly	  8	  million	  fish	  were	  stocked	  annually	  into	  837	  lakes	  across	  BC,	  and	  of	  these	  stocked	  fish	  nearly	  4	  million	  were	  rainbow	  trout	  (GSGislason	  and	  Associates	  Ltd,	  2009).	  	  	   To	  accommodate	  the	  variety	  of	  environment	  conditions	  present	  in	  BC	  lakes,	  the	  FFSBC	  stock	  lakes	  using	  a	  variety	  of	  wild	  and	  domesticated	  strains.	  A	  strain	  is	  defined	  as	  a	  population	  of	  rainbow	  trout	  that	  is	  geographically	  isolated	  and	  has	  adapted	  to	  its	  local	  environment.	  It	  is	  believed	  that	  many	  of	  the	  adaptations	  are	  genetically	  based	  and	  therefore	  heritable	  (FFSBC,	  2004).	  As	  a	  result,	  the	  FFSBC	  attempts	  to	  match	  appropriate	  strains	  to	  specific	  environments	  to	  optimize	  fish	  survival	  (Clarke,	  2012).	  There	  are	  six	  strains	  that	  are	  commonly	  stocked	  in	  BC	  including	  four	  wild	  strains	  in	  this	  thesis	  (Blackwater,	  Tzenzaicut,	  Pennask,	  and	  Carp	  Lake),	  and	  one	  domesticated	  strain	  (Fraser	  Valley).	  Wild	  strains	  are	  kept	  in	  a	  number	  of	  broodstock	  lakes	  across	  BC	  that	  are	  maintained	  by	  the	  FFSBC	  in	  order	  to	  limit	  the	  number	  of	  fish	  removed	  from	  the	  original	  wild	  populations	  (FFSBC,	  2004).	  	  	   4	  These	  wild	  strains	  show	  differences	  in	  growth	  rates	  and	  display	  diverse	  preferences	  in	  diet	  and	  within	  lake	  habitat	  use.	  The	  Blackwater	  strain	  originates	  from	  Blackwater	  River,	  and	  is	  a	  fast	  growing,	  piscivore	  commonly	  stocked	  in	  lakes	  with	  large	  shallow	  shoal	  areas	  with	  a	  non-­‐salmonid	  fish	  community	  (FFSBC,	  2004).	  The	  Tzenzaicut	  strain	  originates	  from	  Tzenzaicut	  Lake,	  and	  is	  a	  piscivore	  as	  well,	  preferring	  colder,	  pelagic	  regions	  (FFSBC,	  2004).	  The	  Pennask	  strain	  originates	  from	  Pennask	  Lake,	  and	  is	  a	  slow	  growing	  insectivore,	  preferring	  pelagic	  regions	  (FFSBC,	  2004).	  The	  Carp	  Lake	  strain	  is	  a	  recent	  addition	  to	  the	  lake	  stocking	  program,	  and	  originates	  from	  Carp	  Lake,	  BC	  (Clarke,	  2012).	  The	  Fraser	  Valley	  strain	  is	  the	  only	  domesticated	  strain	  that	  is	  currently	  stocked	  in	  BC.	  	  Its	  genetic	  roots	  originate	  from	  the	  McCleary	  strain	  of	  rainbow	  trout	  from	  the	  trout	  lodge	  hatchery	  in	  Washington,	  USA,	  and	  it	  is	  considered	  to	  have	  a	  fast	  growth	  rate	  (FFSBC,	  2004).	  	  	   A	  serious	  concern	  with	  stocking	  of	  hatchery-­‐reared	  fish	  in	  a	  natural	  environment	  is	  the	  gene	  flow	  of	  domesticated	  genes	  into	  the	  indigenous	  gene	  pool.	  The	  combination	  of	  reversed	  sex	  rainbow	  trout	  in	  conjunction	  with	  a	  shock	  technique	  to	  induce	  triploidy	  creates	  a	  sterile	  triploid	  female	  population	  to	  be	  introduced	  for	  sport	  fishing.	  Triploidy	  is	  a	  condition	  that	  occurs	  naturally	  in	  some	  vertebrates	  with	  cells	  containing	  a	  third	  set	  of	  chromosomes	  as	  opposed	  to	  the	  normal	  two.	  Triploidy	  is	  typically	  lethal	  in	  mammals	  (Beatty,	  1970),	  with	  few	  species	  capable	  of	  forming	  individuals	  that	  can	  reach	  an	  adult	  age	  with	  triploid	  cells	  (Jones	  et	  al.	  1969;	  Dunn	  et	  al.	  1970;	  Fechheimer	  et	  al.	  1983;	  Lamborot	  and	  Vasquez,	  1998).	  In	  rainbow	  trout	  the	  rate	  of	  spontaneous	  triplody	  generation	  is	  small	  (Thorgaard	  et	  al.	  1982),	  yet	  triploid	  rainbow	  trout	  are	  typically	  able	  to	  survive	  to	  	   5	  adults	  (Cuellar	  and	  Uyeno,	  1972;	  Thorgaard	  and	  Gall,	  1979).	  It	  is	  hypothesized	  that	  the	  natural	  mechanism	  for	  spontaneous	  triploidy	  in	  rainbow	  trout	  is	  the	  fertilization	  of	  an	  unreduced	  oocyte	  combined	  with	  the	  suppression	  of	  the	  second	  meiotic	  division	  (Cuellar	  and	  Uyeno,	  1972).	  	  Artificially,	  triploidy	  has	  been	  induced	  by	  suppressing	  the	  second	  meiotic	  division	  through	  a	  number	  of	  different	  means	  including	  pressure	  shock	  and	  temperature.	  The	  prevention	  of	  the	  second	  meiotic	  division	  occurs	  immediately	  after	  fertilization	  of	  the	  egg	  by	  a	  sperm,	  caused	  by	  applying	  a	  shock	  to	  prevent	  the	  extrusion	  of	  the	  second	  polar	  body	  from	  the	  fertilized	  egg.	  The	  effectiveness	  of	  the	  shock	  in	  different	  species	  is	  highly	  dependent	  on	  the	  time	  of	  exposure	  and	  the	  type	  of	  shock	  being	  used	  (Gillet	  et	  al.	  2001;	  Komen	  and	  Thorgaard,	  2007;	  Filep	  et	  al.	  2009).	  Chemical	  induction	  by	  cytostatic	  chemicals	  has	  shown	  some	  success	  in	  Atlantic	  salmon	  for	  the	  induction	  of	  triploidy,	  but	  has	  also	  resulted	  in	  the	  production	  of	  tetraploid	  individuals	  (Allen	  and	  Stanley,	  1979).	  When	  chemicals	  such	  as	  cytochalasin	  B	  have	  been	  used	  to	  induce	  triploidy	  in	  rainbow	  trout,	  high	  mortality	  rates	  have	  occurred	  (Refstie,	  1981;	  Pawson,	  2003).	  More	  successful	  methodology	  has	  since	  been	  found	  in	  exposure	  to	  high-­‐heat	  or	  high-­‐pressure	  environments	  to	  suppress	  the	  second	  meiotic	  division.	  Triploidy	  rates	  of	  77-­‐100%	  have	  been	  reported	  in	  Brown	  trout	  by	  applying	  different	  temperatures	  (26°C-­‐32°C)	  to	  recently	  fertilized	  eggs	  for	  a	  variable	  time	  course.	  In	  rainbow	  trout,	  Lincoln	  and	  Scott	  (1983)	  saw	  varying	  success	  with	  different	  strains	  receiving	  the	  same	  heat	  shock.	  However,	  heat	  shock	  may	  induce	  the	  purging	  of	  the	  sperm	  from	  the	  egg	  therefore	  eliminating	  the	  induction	  of	  triploidy	  (Thoorgard	  et	  al.	  1995).	  The	  most	  consistent	  technique	  	   6	  used	  in	  aquaculture	  to	  induce	  triploidy	  in	  rainbow	  trout	  has	  been	  the	  implementation	  of	  a	  hydrostatic	  pressure	  shock	  to	  recently	  fertilized	  eggs.	  The	  pressure	  can	  range	  from	  7,000	  to	  12,000psi	  (Chourrout,	  1984;	  Luo	  and	  Purdom,	  1984;	  Lincoln,	  1989;	  Yesaki	  et	  al.	  1996)	  but	  produces	  near	  100%	  effectiveness	  in	  triploidy	  induction.	  Although	  this	  process	  does	  cause	  some	  mortality	  its	  effectiveness	  makes	  it	  the	  current	  mechanism	  of	  choice.	  At	  the	  FFSBC	  the	  treatment	  is	  strain	  specific	  and	  can	  be	  either	  a	  heat	  shock	  or	  a	  hydrostatic	  pressure	  shock	  (FFSBC,	  2004).	  	  Stocking	  only	  female	  fish	  in	  lakes	  is	  another	  important	  measure	  to	  prevent	  gene	  flow	  to	  natural	  lake	  populations	  of	  rainbow	  trout.	  The	  generation	  of	  an	  all-­‐female	  population	  starts	  with	  the	  production	  of	  sex	  reversed	  female	  rainbow	  trout.	  Reversed	  sex	  rainbow	  trout	  are	  normal	  fry	  females	  that	  have	  been	  introduced	  to	  a	  testosterone-­‐based	  chemical,	  such	  as	  17α-­‐methyltestosterone,	  that	  causes	  the	  cessation	  of	  ovary	  development	  and	  the	  production	  of	  normal	  testes	  resulting	  in	  a	  modified	  male	  phenotype	  (Kuzminksi	  and	  Dobosz,	  2010).	  As	  the	  rainbow	  trout	  are	  females,	  they	  are	  of	  an	  XX	  genetic	  background	  and	  subsequently	  will	  only	  be	  capable	  of	  passing	  on	  an	  X	  chromosome	  to	  their	  offspring,	  viably	  producing	  a	  sterile	  triploid	  all	  female	  population.	  	  The	  combination	  of	  the	  reversed	  sex	  rainbow	  trout	  in	  conjunction	  with	  the	  shock	  technique	  creates	  a	  sterile	  female	  population	  to	  be	  introduced	  for	  sport	  fishing.	  The	  benefits	  of	  sterility	  appear	  to	  be	  dependent	  on	  the	  sex	  of	  the	  fish	  made	  sterile.	  For	  females,	  sterility	  is	  believed	  to	  divert	  energy	  that	  would	  normally	  be	  used	  for	  gonadal	  development	  towards	  somatic	  growth	  (FFSBC,	  2004).	  However,	  	   7	  sterile	  triploid	  male	  rainbow	  trout	  still	  produce	  reproductive	  hormones,	  which	  are	  believed	  to	  reduce	  flesh	  quality	  due	  to	  the	  onset	  of	  secondary	  sexual	  characteristics	  (FFSBC,	  2004).	  	  In	  the	  wild,	  stocked	  triploid	  fish	  have	  been	  shown	  to	  have	  variable	  success	  in	  terms	  of	  survival.	  Studies	  have	  reported	  reduced	  triploid	  returns	  (Blanc	  et	  al.	  1992;	  Simon	  et	  al.	  1993;	  Dillon	  et	  al.	  2000),	  while	  others	  report	  no	  difference	  between	  ploidies	  (Guo	  et	  al.	  1990;	  Wagner	  et	  al.	  2006).	  In	  BC,	  gillnetting	  assessments	  have	  reported	  reduced	  returns	  of	  triploid	  fish	  after	  stocking,	  and	  the	  exact	  cause	  of	  this	  increased	  mortality	  is	  unknown.	  There	  appears	  to	  be	  no	  real	  difference	  in	  growth,	  haematological,	  and	  biochemical	  parameters	  between	  ploidies	  when	  exposed	  to	  stress	  (Galbearth	  et	  al.	  1994;	  Sadler	  et	  al.	  2000),	  however,	  Scott	  (2012),	  reported	  reduced	  time	  to	  loss	  of	  equilibrium	  of	  triploid	  rainbow	  trout	  in	  hypoxia.	  	  No	  work	  has	  been	  done	  to	  explore	  the	  physiological	  response	  of	  triploid	  fish	  to	  high	  pH	  water.	  	  	  1.4	  The	  environmental	  parameters	  of	  stocked	  lakes	  in	  British	  Columbia	  	  In	  addition	  to	  stocking	  BC’s	  lakes,	  the	  FFSBC	  regularly	  records	  water	  parameters	  of	  various	  lakes	  across	  the	  province.	  The	  society	  has	  reported	  increasing	  water	  pH	  in	  many	  lakes.	  Records	  have	  shown	  that	  lakes,	  such	  as	  Green	  Lake,	  have	  increased	  to	  a	  pH	  of	  almost	  9.5,	  and	  are	  expected	  to	  continue	  to	  increase	  to	  a	  pH	  of	  10.0	  in	  the	  coming	  decade.	  	  	   The	  pH	  of	  an	  aqueous	  environment	  is	  a	  measure	  of	  hydrogen	  concentration	  and	  is	  calculated	  by:	  	  	   8	  pH	  =	  	  –log10[Hydrogen]	  and	  can	  vary	  due	  to	  a	  variety	  of	  physical	  and	  chemical	  factors.	  In	  the	  natural	  environment,	  water	  pH	  can	  be	  greatly	  influenced	  by	  photosynthesis	  and	  respiration	  of	  aquatic	  plants	  (Jones	  et	  al.	  1998;	  Hansen,	  2002),	  human	  eutrophication	  (Jones	  et	  al.	  1998),	  and	  basic	  bedrock	  geology	  of	  the	  aquatic	  environments	  (Sutcliffe	  and	  Carrick,	  1973;	  Krueger	  and	  Water,	  1983).	  In	  BC,	  bedrock	  geology	  releases	  high	  levels	  of	  carbonates	  resulting	  in	  lakes	  with	  high	  pH.	  The	  pH	  tolerance	  of	  hatchery-­‐reared	  trout	  in	  BC	  has	  seen	  limited	  investigation	  despite	  the	  great	  range	  in	  lake	  water	  pH	  that	  these	  fish	  may	  be	  introduced	  to.	  	  	  	  1.5	  Morphological	  and	  physiological	  responses	  to	  elevated	  ambient	  pH	  Growth	  and	  survival	  are	  reduced	  upon	  exposure	  to	  high	  pH	  water.	  Studies	  on	  carp	  (Cyprinus	  carpio	  L.)	  have	  reported	  a	  decrease	  in	  growth	  rate	  at	  the	  larval	  stage	  in	  high	  pH	  to	  almost	  a	  third	  of	  that	  seen	  in	  more	  neutral	  waters	  (Korwin-­‐Kossakowski,	  1992).	  Mortality	  studies	  have	  reported	  relative	  tolerances	  of	  trout,	  with	  the	  upper	  limits	  of	  brook	  trout	  survival	  occurring	  at	  a	  pH	  of	  11.0	  (Daye	  and	  Garside,	  1975).	  Jordan	  and	  Lloyd	  (1964)	  reported	  up	  to	  50%	  mortality	  in	  rainbow	  trout	  at	  a	  pH	  of	  9.8	  after	  24h,	  and	  Daye	  and	  Garside	  (1975)	  noted	  histological	  damage	  of	  the	  skin	  at	  a	  pH	  of	  10.	  	  	   High	  water	  pH	  impacts	  gill	  function,	  which	  ultimately	  leads	  to	  mortality.	  Daye	  and	  Garside	  (1976)	  noted	  superficial	  damage	  to	  the	  gill	  and	  operculum	  after	  brook	  trout	  were	  exposed	  to	  an	  ambient	  pH	  of	  9.0,	  far	  below	  the	  levels	  reported	  for	  mortality	  (Daye	  and	  Garside,	  1975;	  Daye	  and	  Garside,	  1976).	  Damage	  to	  the	  gill	  was	  	   9	  primarily	  attributed	  to	  degradation	  of	  the	  connective	  tissue	  between	  epithelial	  cells	  and	  the	  hypertrophy	  of	  mucous	  secreting	  cells	  and	  their	  subsequent	  release	  of	  excess	  mucous	  (Daye	  and	  Garside,	  1976).	  Moreover,	  high	  pH	  significantly	  affects	  the	  tight	  junction	  proteins	  in	  the	  gill.	  Tight	  junctions	  are	  multifunctional	  apical	  proteins	  comprised	  of	  claudins,	  that	  act	  as	  junctions	  of	  cells	  that	  are	  present	  at	  the	  apical	  side	  of	  the	  gill	  membrane,	  and	  that	  are	  directly	  responsible	  for	  regulating	  paracellular	  solute	  movement	  and	  water	  flux	  in	  epithelial	  cells	  (Schneeberger	  and	  Lynch,	  2004;	  Sandbichler	  et	  al.	  2011).	  Low	  water	  pH	  causes	  enhanced	  permeability	  of	  the	  gill	  through	  the	  disruption	  of	  tight	  junctions	  (Tang	  and	  Goodenough,	  2003)	  and	  the	  same	  may	  be	  true	  of	  high	  pH.	  	  1.5.1.	  Ionoregulation	  in	  high	  pH	  Under	  normal	  conditions,	  freshwater	  fish	  have	  to	  actively	  maintain	  the	  ionic	  composition	  of	  their	  body	  fluids,	  due	  to	  their	  hypo-­‐osmotic	  environment	  (Evans	  et	  al.	  1999).	  The	  exchange	  of	  electrolytes	  in	  the	  rainbow	  trout	  is	  tightly	  controlled	  by	  the	  chloride	  cells,	  or	  mitochondria	  rich	  cells,	  and	  to	  a	  lesser	  extent	  the	  pavement	  cells	  of	  the	  gill	  in	  adult	  fish	  (Avella	  et	  al.	  1987;	  Perry	  and	  Laurent,	  1989;	  Perry,	  1997;	  Evans	  et	  al.	  2005).	  Sodium	  levels	  within	  the	  body	  are	  maintained	  by	  an	  electrochemical	  gradient	  with	  a	  basolateral	  sodium-­‐potassium	  ATPase	  (NKA),	  and	  with	  exchange	  of	  sodium	  and	  protons	  across	  the	  apical	  membrane	  (NHE)	  (Evans,	  2011).	  An	  apical	  bicarbonate	  exchanger	  transports	  chloride,	  and	  chloride	  channels	  carry	  chloride	  ions	  across	  the	  basolateral	  membrane	  into	  the	  blood	  (Evans,	  2011).	  	  	   10	  The	  gill	  is	  the	  major	  ion	  regulatory	  organ	  in	  fish	  and	  it	  is	  susceptible	  to	  damage	  during	  high	  pH	  exposure,	  and	  various	  studies	  have	  reported	  severe	  ion	  loss	  of	  sodium	  (Na+)	  and	  chloride	  (Cl-­‐)	  and	  large	  histological	  changes	  in	  rainbow	  trout	  exposed	  to	  high	  pH	  water	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Yesaki	  and	  Iwama,	  1992;	  WIlkie	  and	  Wood,	  1995;	  Laurent	  et	  al.	  2000).	  Sodium	  and	  chloride	  are	  the	  dominant	  ions	  in	  plasma	  and	  consequently	  are	  primary	  determinants	  of	  osmolality	  (Wood	  and	  Randall,	  1973).	  Both	  of	  these	  ions	  play	  a	  large	  role	  in	  acid/base	  balance	  (McDonald	  and	  Wood,	  1981;	  Goss	  and	  Wood,	  1990;	  Perry	  et	  al.	  1992;	  Goss	  et	  al.	  1998),	  particularly	  in	  exchange	  for	  their	  acidic	  and	  basic	  equivalents,	  H+	  and	  HCO3-­‐	  (Eddy,	  1976;	  Goss	  et	  al.	  1998).	  Exposure	  to	  high	  pH	  water	  in	  rainbow	  trout	  results	  in	  an	  immediate	  loss	  of	  sodium	  to	  the	  environment,	  presumably	  due	  to	  gill	  damage	  (Wilkie	  et	  al.	  1996;	  McGeer	  and	  Eddy,	  1998;	  Laurent	  et	  al.	  2000),	  despite	  a	  maintained	  unidirectional	  sodium	  uptake	  rate.	  High	  pH	  water	  is	  associated	  with	  increases	  to	  chloride	  cell	  surface	  area	  and	  their	  surface	  area	  to	  volume	  ratio,	  increases	  in	  the	  amount	  of	  surface	  area	  available	  for	  pavement	  cells,	  and	  a	  reduction	  of	  the	  lamellar	  thickness	  of	  cells	  at	  the	  gill	  (Laurent	  et	  al.	  2000).	  Furthermore,	  increased	  secretion	  of	  mucus	  from	  epithelial	  cells	  under	  high	  pH	  conditions,	  as	  reported	  by	  Daye	  and	  Garside	  (1976),	  may	  provide	  a	  charged	  microenvironment,	  which	  can	  be	  expected	  to	  act	  as	  a	  trap	  for	  cations	  and	  anions	  such	  as	  chloride	  and	  sodium.	  Mucus	  is	  comprised	  of	  water,	  ions,	  and	  cationic	  glycoproteins	  that	  are	  secreted	  in	  high	  stress	  situations	  by	  hypertrophy	  of	  mucosal	  cells	  (Handy,	  1989).	  	  	  	   11	  1.5.2	  Nitrogen	  balance	  in	  high	  pH	  Ammonia	  (referred	  to	  as	  the	  sum	  of	  NH3	  and	  NH4+)	  is	  a	  by-­‐product	  of	  amino	  acid	  catabolism	  and	  is	  either	  readily	  excreted	  across	  the	  gills,	  converted	  to	  another	  molecule	  for	  reuse,	  or	  converted	  to	  urea	  for	  release	  from	  the	  body	  (Wilkie,	  2002;	  Randall,	  2011).	  Rainbow	  trout	  typically	  excrete	  most	  of	  their	  wastes	  as	  ammonia	  across	  the	  gill	  (Wilson	  et	  al.	  1994).	  At	  a	  normal	  physiological	  pH	  (7.4	  to	  7.8),	  approximately	  95%	  of	  the	  ammonia	  exists	  as	  NH4+.	  In	  vertebrates,	  if	  NH3	  accumulates	  within	  the	  body	  it	  may	  lead	  to	  seizures,	  convulsions,	  and	  even	  death	  through	  disruption	  of	  the	  central	  nervous	  system	  (Randall	  and	  Tsui,	  2002;	  Monfort	  et	  al.	  2002;	  Randall,	  2011).	  The	  toxicity	  of	  ammonia	  is	  directly	  related	  to	  the	  concentration	  of	  the	  un-­‐ionized	  form	  (NH3)	  in	  the	  body	  (Smart,	  1978).	  The	  proportion	  of	  NH3	  compared	  to	  the	  ionized	  ammonium	  ion	  (NH4+)	  is	  directly	  determined	  by	  the	  pKa	  (~9.3)	  of	  ammonia,	  which	  is	  influenced	  by	  both	  temperature	  and	  pH	  (Emerson	  et	  al.	  1975;	  Smart,	  1978).	  Ammonia	  is	  typically	  excreted	  across	  the	  gill	  as	  NH3	  by	  simple	  diffusion	  down	  its	  concentration	  gradient	  through	  rhesus	  glycoproteins	  (Nawata	  et	  al.	  2007;	  Hung	  et	  al.	  2008).	  The	  gill	  creates	  an	  acidic	  microenvironment	  by	  pumping	  H+	  across	  the	  apical	  gill	  creating	  a	  boundary	  layer	  or	  “pocket”	  for	  NH3	  to	  interact	  with	  H+	  and	  to	  be	  converted	  to	  NH4+,	  keeping	  NH3	  levels	  low	  and	  promoting	  further	  ammonia	  diffusion	  (Randall	  and	  Wright,	  1989;	  Wilson	  et	  al.	  1994).	  Sodium	  can	  also	  be	  exchanged	  for	  H+	  by	  the	  NHE	  to	  maintain	  this	  acidic	  “pocket”	  for	  ammonia	  conversion	  (Wright	  and	  Wood,	  2009;	  Wright	  and	  Wood,	  2012).	  	  	   12	  Environmental	  NH3	  increases	  in	  high	  pH	  water	  impairing	  ammonia	  excretion,	  and	  leading	  to	  an	  elevation	  in	  whole	  body	  ammonia	  	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilkie,	  1997).	  The	  retention	  of	  ammonia	  within	  the	  body	  increases	  the	  amount	  of	  unionized	  ammonia	  within	  the	  tissues,	  and	  it	  can	  interact	  with	  free	  H+	  to	  raise	  the	  intracellular	  pH	  of	  the	  tissues	  that	  can,	  in	  turn,	  affect	  cellular	  mechanisms	  (Randall,	  2011).	  Studies	  have	  demonstrated	  that	  white	  muscle	  tissue	  increases	  its	  ammonia	  content	  2-­‐fold	  when	  exposed	  to	  a	  prolonged	  alkaline	  environment	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994).	  Under	  conditions	  where	  excretion	  is	  inhibited,	  ammonia	  can	  be	  shuttled	  to	  metabolite	  production.	  Sanderson	  et	  al.	  (2010)	  reported	  that	  rainbow	  trout	  could	  convert	  ammonia	  to	  less	  harmful	  metabolites	  such	  as	  glutamate	  and	  glutamine	  in	  their	  high	  external	  ammonia	  exposure.	  The	  production	  of	  glutamine	  is	  expected	  to	  be	  a	  protective	  response	  to	  ammonia	  accumulation	  in	  the	  brain,	  which	  is	  sensitive	  to	  ammonia	  (Sanderson	  et	  al.	  2010;	  Randall,	  2011)	  Ammonia	  can	  also	  be	  sequestered	  as	  another	  metabolite,	  urea,	  through	  the	  ornithine-­‐urea	  cycle	  (OUC;	  Huggins	  et	  al.	  1969;	  Depeche	  et	  al.	  1979;	  Anderson,	  2001).	  Lake	  Magadi	  tilapia	  (Oreochromis	  alcalicus	  grahami)	  live	  in	  an	  extremely	  alkaline	  environment	  (pH	  >10.0)	  and	  have	  adapted	  their	  metabolism	  to	  synthesize	  and	  excrete	  their	  nitrogen	  wastes	  as	  urea	  (Wood	  et	  al.	  1989).	  While	  the	  early	  life	  stages	  of	  rainbow	  trout	  are	  able	  to	  synthesize	  urea	  due	  to	  the	  expression	  of	  OUC	  enzymes	  (Wright	  et	  al.	  1995;	  Pilley	  and	  Wright,	  2000),	  these	  same	  enzymes	  are	  not	  highly	  expressed	  in	  adult	  stages	  and	  urea	  is	  not	  readily	  used	  by	  adult	  rainbow	  trout	  to	  sequester	  and	  excrete	  ammonia	  from	  the	  body	  (Wright,	  1995;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  McGeer	  and	  Eddy,	  1998).	  	  	   13	  	  1.5.3	  Blood	  parameters	  in	  high	  pH	  	  	   Disturbances	  to	  haematology,	  changes	  in	  the	  hormone	  cortisol,	  and	  the	  production	  of	  lactate	  often	  indicate	  organismal	  stress.	  A	  change	  in	  the	  osmolarity	  of	  the	  plasma	  affects	  hematocrit,	  and	  this	  can	  adversely	  affect	  the	  viscosity	  of	  the	  blood	  (Leray	  et	  al.	  1981).	  Hematocrit	  can	  be	  highly	  variable	  in	  blood	  due	  to	  stress	  (Wells	  and	  Weber,	  1991)	  and	  measurements	  of	  hematocrit	  have	  been	  used	  as	  a	  proxy	  for	  stress	  in	  humans	  (Ring	  et	  al.	  2008),	  and	  may	  potentially	  act	  as	  a	  measure	  of	  the	  stress	  response	  to	  high	  pH.	  	  	   Upon	  exposure	  to	  a	  stressful	  event,	  fish	  respond	  with	  rapid	  increases	  in	  the	  production	  of	  lactate	  and	  the	  stress	  hormone	  cortisol.	  Cortisol	  promotes	  energy	  metabolism	  in	  organisms	  (DiBattista	  et	  al.	  2005)	  prompting	  the	  release	  of	  ammonia	  as	  a	  by-­‐product	  of	  protein	  catabolism	  (Leach	  and	  Taylor,	  1982;	  Mortimore	  and	  Poso,	  1987;	  Van	  Der	  Booon	  et	  al.	  1991).	  Cortisol	  significantly	  upregulates	  the	  amount	  of	  chloride	  cells	  at	  the	  gill	  (Laurent	  and	  Perry,	  1990;	  Laurent	  et	  al.	  1994)	  and	  can	  produce	  rapid	  changes	  in	  in	  the	  activity	  of	  Na+/K+	  ATPase	  expression	  (Shrimpton	  et	  al.	  1994;	  Shrimpton	  and	  McCormick,	  1999;	  Seidelin	  et	  al.	  1999).	  	  The	  presence	  of	  high	  cortisol	  levels	  in	  the	  plasma	  is	  thought	  of	  as	  an	  indicator	  of	  stress	  (Weil	  et	  al.	  2001;	  Jentoft	  et	  al.	  2005);	  lower	  cortisol	  levels	  in	  the	  plasma	  may	  be	  representative	  of	  an	  organism	  that	  is	  more	  tolerant	  of	  high	  pH.	  Lactate	  is	  produced	  during	  anaerobic	  metabolism	  (Huckabee	  1958;	  Skinner	  and	  McLellan,	  1980;	  Milligan	  and	  Girard,	  1993;	  Juel,	  1997),	  increasing	  in	  response	  to	  stress	  (Turner	  et	  al.	  1983).	  In	  	   14	  high	  pH	  experiments,	  lactate	  significantly	  increases	  immediately	  after	  exposure	  and	  returns	  to	  control	  levels	  after	  a	  few	  days	  (Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilson	  et	  al.	  1998)	  	  1.5.4	  Hard	  water	  and	  high	  pH	  	   Lakes	  that	  are	  near	  a	  pH	  of	  9.5	  often	  have	  hardness	  levels	  (measured	  as	  concentration	  of	  CaCO3)	  above	  500mg/L,	  which	  are	  considerably	  higher	  than	  their	  rearing	  conditions	  at	  the	  hatchery	  (Intermediate	  hardness	  of	  70-­‐180mg/L).	  Dissolved	  calcium	  in	  the	  environment	  assists	  in	  maintenance	  of	  the	  gill,	  presumably	  by	  tightening	  leaky	  junctions	  through	  direct	  binding	  to	  the	  gill	  (Hunn,	  1985;	  Perry	  and	  Wood,	  1985).	  The	  “shoring”	  up	  of	  leaky	  channels	  is	  confirmed	  in	  other	  studies	  where	  the	  efflux	  of	  ions	  is	  often	  reduced	  upon	  the	  addition	  of	  calcium	  to	  the	  ambient	  environment	  (Eddy,	  1975;	  Hunn,	  1985),	  which	  also	  increased	  activity	  of	  the	  H+	  ATPase	  at	  the	  gill	  (Lin	  and	  Randall,	  1995).	  If	  increased	  hardness	  assists	  in	  reducing	  the	  normal	  efflux	  of	  ions	  across	  the	  gill,	  then	  the	  natural	  environment	  may	  play	  a	  role	  in	  maintaining	  ionic	  levels	  in	  a	  high	  pH	  environment.	  However,	  the	  reduced	  flux	  across	  the	  gill	  may	  prevent	  the	  formation	  of	  the	  acidic	  boundary	  layer,	  which	  could	  abolish	  ammonia	  trapping	  and	  the	  re-­‐establishment	  of	  ammonia	  excretion	  after	  the	  ammonia	  load.	  The	  buffer	  capacity	  of	  hard	  water	  may	  also	  prove	  to	  be	  detrimental,	  as	  exposure	  to	  water	  buffered	  with	  glycine	  resulted	  in	  rainbow	  trout	  losing	  a	  significant	  amount	  of	  ions	  (McGeer	  and	  Eddy,	  1998).	  Whether	  or	  not	  calcium	  and	  hardness	  in	  general	  will	  provide	  an	  advantage	  to	  our	  fish	  remains	  to	  be	  seen.	  	  	  	   15	  1.6	  Objectives	  	   The	  goal	  of	  this	  thesis	  was	  to	  explore	  the	  physiological	  responses	  to	  high	  pH	  exposure	  in	  four	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout.	  Each	  of	  the	  strains	  used	  in	  this	  study	  had	  varied	  genetic	  origins	  and	  one	  strain	  may	  have	  exhibited	  an	  advantageous	  physiological	  response	  to	  high	  pH	  water.	  Given	  the	  prevalence	  of	  triploidy	  in	  stocking	  lakes	  in	  British	  Columbia,	  assessing	  the	  physiological	  change	  of	  triploid	  trout	  compared	  to	  diploid	  trout	  is	  essential	  for	  appropriate	  stocking	  efforts.	  Therefore,	  for	  my	  first	  objective,	  I	  explored:	  the	  effects	  of	  strain	  and	  ploidy	  on	  the	  physiological	  responses	  of	  trout	  to	  pH	  9.5	  water	  	  	  	   For	  the	  second	  objective,	  I	  was	  aware	  that	  high	  pH	  environments	  are	  complex,	  and	  that	  lake	  settings	  can	  affect	  the	  response	  of	  an	  organism	  with	  its	  environment.	  Therefore,	  for	  my	  second	  objective,	  I	  investigated:	  the	  effects	  of	  water	  hardness	  on	  the	  physiological	  response	  to	  high	  pH	  water	  of	  various	  strains	  and	  ploidies	  of	  rainbow	  trout	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   16	  [2]	  The	  physiological	  effects	  of	  high	  pH	  (9.5)	  exposure	  on	  various	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  Rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  	  2.1	  Introduction	  Increases	  in	  water	  pH	  are	  known	  to	  have	  profound	  physiological	  effects	  on	  fish.	  In	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss),	  exposure	  to	  pH	  above	  9.5	  can	  impair	  ionoregulation	  and	  result	  in	  an	  accumulation	  of	  ammonia	  in	  blood	  and	  tissues,	  which	  if	  uncorrected,	  can	  result	  in	  death.	  Disturbances	  in	  ionoregulation	  occur	  because	  exposure	  to	  high	  pH	  causes	  gill	  damage	  (Daye	  and	  Garside,	  1976;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1994),	  which	  increases	  mucous	  production,	  tight	  junction	  loosening,	  and	  degradation	  of	  the	  secondary	  lamellae	  (Daye	  and	  Garside,	  1976;	  Heisler,	  1989;	  Tang	  and	  Goodenough,	  2003).	  	  These	  changes	  in	  gill	  structure	  lead	  to	  increased	  gill	  permeability	  and	  increased	  ion	  efflux	  across	  the	  gill	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  et	  al.	  1997).	  In	  response	  to	  the	  high-­‐pH	  induced	  increase	  in	  gill	  permeability,	  rainbow	  trout	  up-­‐regulate	  gill	  chloride	  cell	  density	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Laurent	  et	  al.	  2000)	  in	  an	  attempt	  to	  balance	  ions,	  but	  these	  mechanisms	  are	  not	  entirely	  effective	  as	  high	  pH	  has	  been	  shown	  to	  directly	  inhibit	  ion	  influx	  (Wilkie	  et	  al.	  1999).	  Trout	  exposed	  to	  pH	  9.5	  also	  accumulate	  endogenously	  produced	  ammonia	  in	  their	  blood	  and	  tissues,	  increasing	  more	  than	  3-­‐fold	  in	  plasma	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1994)	  due	  to	  a	  pH-­‐dependent	  decrease	  in	  ammonia	  efflux	  across	  the	  gills	  (Wright	  and	  Wood,	  1985).	  At	  physiological	  pH,	  the	  ammonium	  ion	  (NH4+)	  is	  the	  predominant	  form	  of	  ammonia	  in	  the	  blood	  and	  tissues	  (Ip	  et	  al.	  2001;	  Randall	  and	  Tsui,	  2002);	  when	  water	  pH	  is	  above	  the	  pKa	  for	  NH4+/NH3	  (pKa=9.3),	  	   17	  NH4+	  shifts	  towards	  NH3	  (Cameron	  and	  Heisler,	  1983).	  This	  alters	  the	  concentration	  gradient	  that	  normally	  allows	  the	  passive	  diffusion	  of	  ammonia,	  causing	  an	  ammonia	  accumulation	  in	  the	  blood	  and	  tissues	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilkie	  et	  al.	  1997).	  Ammonia	  is	  lethal	  at	  high	  concentrations	  (Randall	  and	  Tsui,	  2002;	  Monfort	  et	  al.	  2002;	  Ip	  and	  Chew,	  2010;	  Randall,	  2011),	  causing	  over	  activation	  of	  NMDA	  receptors	  (Xu	  and	  Tao,	  2004;	  Ip	  and	  Chew,	  2010).	  These	  physiological	  effects	  combined	  with	  ion	  loss	  are	  thought	  to	  be	  the	  primary	  mechanisms	  associated	  with	  mortality	  in	  fish	  exposed	  to	  high	  environmental	  pH	  (Yesaki	  and	  Iwama,	  1992;	  McGeer	  and	  Eddy,	  1998).	  	  Over	  the	  past	  several	  decades	  there	  has	  been	  a	  gradual	  increase	  in	  pH	  of	  many	  freshwater	  lakes	  across	  British	  Columbia	  (BC)	  such	  that	  pH	  is	  presently	  approaching	  9.5	  and	  is	  expected	  to	  exceed	  10	  in	  the	  coming	  decade.	  	  The	  primary	  cause	  of	  the	  increasing	  pH	  is	  unknown,	  but	  bedrock	  geology	  and	  low	  flushing	  rates	  are	  thought	  to	  be	  the	  primary	  reason	  (Krueger	  and	  Water,	  1983;	  Jones	  et	  al.	  1998).	  BC	  has	  maintained	  an	  active	  lake-­‐stocking	  program	  for	  decades	  with	  more	  than	  4-­‐million	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  stocked	  annually	  into	  837	  lakes.	  BC’s	  lake	  stocking	  program	  uses	  trout	  from	  at	  least	  6	  different	  strains	  of	  which	  roughly	  half	  are	  stocked	  as	  triploids,	  and	  generates	  more	  than	  $400	  million	  annually.	  	  Rising	  pH	  in	  many	  of	  these	  lakes,	  particularly	  popular	  fishing	  lakes	  such	  as	  Green	  Lake	  that	  has	  already	  reached	  pH	  ~9.3,	  puts	  continued	  stocking	  efforts	  in	  jeopardy.	  In	  order	  to	  continue	  a	  successful	  lake-­‐stocking	  program	  in	  British	  Columbia	  it	  is	  essential	  to	  characterize	  the	  effects	  of	  high	  pH	  exposure	  on	  the	  various	  strains	  and	  ploidies	  of	  	   18	  trout	  used	  by	  the	  Freshwater	  Fishery	  Society	  of	  British	  Columbia	  (FFSBC),	  in	  hopes	  of	  identifying	  the	  most	  high	  pH	  tolerant	  trout	  strain	  for	  future	  stocking	  efforts.	  	  The	  objective	  of	  this	  study	  was	  to	  compare	  the	  physiological	  responses	  of	  exposure	  to	  pH	  9.5	  among	  five	  strains	  of	  juvenile	  rainbow	  trout,	  four	  wild	  and	  one	  domesticated,	  as	  diploid	  and	  triploid,	  all	  of	  which	  are	  currently	  used	  by	  the	  FFSBC	  for	  stocking.	  In	  this	  study	  I	  exposed	  rainbow	  trout	  to	  pH	  9.5	  in	  soft	  water	  and	  sampled	  blood	  and	  tissues	  for	  up	  to	  72h	  and	  analyzed	  aspects	  of	  ion	  regulation	  and	  ammonia	  balance.	  My	  goal	  was	  to	  determine	  whether	  there	  is	  an	  affect	  of	  strain	  or	  ploidy	  on	  the	  physiological	  effects	  of	  pH	  9.5	  exposure.	  	  2.2	  Materials	  and	  methods	  	  2.2.1	  Experimental	  animals	  This	  study	  used	  four	  wild	  strains	  and	  one	  domesticated	  strain	  of	  rainbow	  trout.	  	  The	  fish	  were	  obtained	  from	  the	  Fraser	  Valley	  freshwater	  trout	  hatchery	  in	  Abbottsford,	  British	  Columbia.	  Wild	  strains	  were	  named	  after	  their	  site	  of	  origin,	  and	  included	  strains	  from	  Blackwater	  River	  (named	  Blackwater),	  Tzenzaicut	  Lake	  (named	  Tzenzaicut),	  Pennask	  Lake	  (named	  Pennask),	  and	  Carp	  Lake	  (named	  Carp	  lake).	  	  Each	  spring,	  FFSBC	  staff	  collected	  breeding	  pairs	  of	  each	  strain	  from	  their	  native	  environment	  and	  bred	  three	  families	  at	  the	  Fraser	  Valley	  trout	  hatchery.	  	  The	  progeny	  of	  each	  family	  were	  divided,	  and	  half	  were	  allowed	  to	  develop	  as	  diploids	  and	  the	  fertilized	  eggs	  of	  the	  other	  half	  underwent	  hydrostatic	  pressure	  shock	  to	  induce	  triploidy,	  creating	  full	  siblings	  that	  differed	  only	  by	  ploidy.	  Three	  families	  of	  	   19	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  were	  also	  bred	  and	  diploid	  and	  triploid	  siblings	  were	  generated	  using	  the	  same	  strategy	  as	  used	  in	  the	  four	  wild	  strains.	  Strains	  used	  each	  year	  were	  based	  on	  availability.	  Fish	  were	  reared	  at	  the	  Fraser	  Valley	  trout	  hatchery	  until	  December	  of	  each	  year	  when	  fish	  were	  tagged	  with	  visible	  implant	  elastomere	  tags	  to	  distinguish	  between	  strains,	  ploidies,	  and	  families.	  In	  January,	  the	  wild	  strains	  were	  transferred	  to	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  (UBC)	  and	  were	  housed	  in	  a	  common	  garden	  flow	  through	  system	  separated	  by	  strain.	  The	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  grows	  faster	  than	  the	  wild	  strains,	  therefore	  they	  were	  bred	  later	  and	  tagged	  in	  March	  of	  each	  year,	  transferred	  to	  the	  UBC	  in	  early	  April,	  and	  subsequently	  housed	  in	  the	  same	  system.	  	  At	  the	  UBC,	  the	  fish	  were	  reared	  for	  6	  months	  in	  flow	  through	  de-­‐chlorinated	  Vancouver	  city	  tap	  water	  (pH	  ~6.7,	  hardness	  as	  [CaCO3]	  <17.9mg/L)	  and	  were	  held	  at	  10°C-­‐15°C	  in	  2011,	  and	  8°C-­‐12°C	  in	  2012.	  Hardness	  was	  measured	  with	  a	  colourmetric	  assay	  (API	  General	  hardness	  test	  kit).	  Fish	  were	  fed	  twice	  daily	  with	  2%	  bodyweight	  of	  Bitovita	  fry	  food.	  All	  holding	  and	  experimental	  conditions	  were	  conducted	  according	  to	  the	  guidelines	  of	  the	  Canadian	  Council	  on	  Animal	  Care.	  	  2.2.2	  Experimental	  protocol	  	  	   To	  examine	  the	  effects	  of	  pH	  9.5	  exposure	  on	  diploid	  and	  triploid	  trout	  strains,	  two	  studies	  were	  conducted,	  with	  minor	  differences	  in	  protocol	  and	  the	  number	  of	  strains	  used.	  In	  2011,	  I	  exposed	  diploid	  and	  triploid	  Blackwater,	  Tzenzaicut,	  Pennask	  and	  Fraser	  Valley	  trout	  to	  pH	  9.5	  for	  48h.	  	  All	  trout	  were	  fasted	  for	  24h	  in	  their	  stock	  tank	  before	  12	  size-­‐matched	  individuals	  of	  each	  stain	  and	  	   20	  ploidy	  were	  transferred	  to	  a	  randomly	  chosen	  compartment	  of	  a	  160L	  exposure	  tank.	  Equal	  numbers	  of	  each	  family	  (4	  individuals/family)	  were	  included	  in	  the	  compartment.	  Trout	  were	  allowed	  to	  recover	  from	  the	  transfer	  under	  flow-­‐through	  conditions	  for	  24h.	  	  Water	  was	  circulated	  from	  the	  tank	  to	  a	  header	  tank	  using	  two	  submersible	  pumps	  and	  this	  water	  circulation	  facilitated	  mixing	  within	  the	  exposure	  system.	  	  After	  the	  24h	  recovery	  period,	  two	  fish	  of	  each	  group	  were	  sampled	  for	  plasma,	  muscle,	  brain,	  and	  gill	  and	  this	  sampling	  served	  as	  the	  control.	  Fish	  were	  removed	  by	  netting	  and	  transferred	  into	  a	  bucket	  containing	  250mg/L	  benzocaine.	  Once	  the	  fish	  showed	  loss	  of	  equilibrium	  (defined	  as	  an	  inability	  to	  maintain	  dorso-­‐ventral	  orientation)	  and	  ceased	  ventilating,	  they	  were	  removed	  from	  the	  anaesthetic	  and	  sampled.	  Whole	  blood	  was	  drawn	  into	  heparinized	  capillary	  tubes	  after	  caudal	  severance.	  Capillary	  tubes	  were	  centrifuged	  at	  9200g	  to	  separate	  plasma	  from	  red	  blood	  cells.	  Plasma	  was	  then	  removed	  and	  placed	  into	  a	  micro-­‐centrifuge	  tube,	  frozen	  in	  liquid	  nitrogen,	  and	  stored	  at	  -­‐80°C.	  I	  pipetted	  5µL	  of	  whole	  blood	  from	  the	  exposed	  caudal	  vein	  and	  mixed	  in	  125µL	  of	  propidium	  iodide	  solution	  (125µL	  Citrate	  acid	  dextrose	  (2.088%	  trisodium	  citrate,	  2.45%	  glucose,	  0.693%	  citric	  acid	  of	  total	  volume),	  0.025mg	  propidium	  iodide,	  5µL	  IGEPAC	  detergent,	  and	  0.00425mg	  ribonuclease	  A)	  and	  used	  it	  for	  ploidy	  verification	  (details	  below).	  An	  additional	  10µL	  of	  whole	  blood	  was	  taken	  from	  the	  caudal	  vein	  and	  mixed	  with	  2mL	  of	  Drabkin’s	  reagent	  (Sigma	  #D5941)	  for	  the	  spectrophotometric	  determination	  of	  hemoglobin	  concentration.	  Following	  blood	  sampling,	  a	  1cm	  segment	  of	  caudal	  muscle	  was	  excised,	  brain	  and	  the	  entire	  gill	  basket	  were	  excised	  and	  all	  tissues	  were	  immediately	  frozen	  in	  liquid	  N2	  and	  stored	  at	  -­‐80°C.	  Following	  control	  	   21	  sampling,	  pH	  was	  adjusted	  from	  a	  pH	  of	  6.7	  to	  9.5	  over	  6h	  with	  the	  addition	  of	  0.2M	  NaOH	  directly	  to	  the	  header	  tank.	  Once	  pH	  9.5	  was	  achieved	  it	  was	  maintained	  using	  a	  pH	  electrode	  (Cole-­‐Parmer)	  connected	  to	  an	  alpha-­‐560	  Eutech	  instruments	  pH	  regulator.	  This	  controlled	  a	  peristaltic	  pump	  that	  delivered	  0.2M	  NaOH	  when	  measured	  pH	  deviated	  from	  the	  set	  point	  by	  0.01	  pH	  units.	  	  The	  regulator	  was	  calibrated	  every	  12h	  and	  I	  verified	  water	  pH	  using	  a	  Fisher	  Scientific	  hand-­‐held	  pH	  meter	  to	  ensure	  that	  pH	  remained	  at	  9.5.	  Dissolved	  oxygen	  and	  water	  ammonia	  were	  measured	  every	  hour	  by	  a	  handheld-­‐oxygen	  probe	  (Oakton	  Acorn	  Series	  DO6)	  and	  colourmetric	  assay	  (API	  Ammonia	  test	  kit),	  to	  ensure	  oxygen	  levels	  remained	  above	  90%	  air	  saturation	  and	  ammonia	  levels	  remained	  below	  0.25mg/L.	  	  Water	  changes	  were	  performed	  immediately	  after	  sampling,	  with	  pH	  9.5	  water	  at	  6,	  12,	  24,	  and	  36h.	  	  Two	  more	  fish	  from	  each	  compartment	  were	  sampled	  at	  6,	  12,	  24,	  and	  48h	  using	  the	  same	  protocol	  as	  outlined	  above.	  	  Fish	  were	  assessed	  for	  loss	  of	  equilibrium	  (LOE)	  throughout	  the	  study.	  LOE	  was	  established	  when	  the	  fish	  lost	  the	  ability	  to	  maintain	  normal	  dorso-­‐ventral	  orientation	  and	  did	  not	  correct	  orientation	  when	  gently	  prodded	  with	  a	  fish	  net.	  If	  upon	  prodding,	  the	  fish	  could	  not	  re-­‐establish	  equilibrium,	  it	  was	  removed	  and	  the	  time	  was	  recorded.	  No	  fish	  that	  lost	  equilibrium	  were	  sampled	  for	  tissue	  analysis.	  This	  experiment	  was	  replicated	  four	  times,	  using	  diploid	  Blackwater	  of	  15.49±1.1g	  (mean±SEM;	  n=29),	  triploid	  Blackwater	  of	  15.62±1.28g	  (n=25),	  diploid	  Tzenzaicut	  of	  24.48±1.72g	  (n=26),	  triploid	  Tzenzaicut	  of	  19.25±1.09g	  (n=22),	  diploid	  Pennask	  of	  16.72±2.89g	  (n=26),	  triploid	  Pennask	  of	  10.97±1.19g	  (n=26),	  diploid	  Fraser	  Valley	  of	  20.02±0.79g	  (n=40),	  and	  triploid	  Fraser	  Valley	  18.05±.65g	  (n=40)	  for	  a	  total	  of	  96	  fish	  per	  	   22	  replicate.	  Two-­‐way	  ANOVA	  and	  post-­‐hoc	  analysis	  of	  main	  effects	  showed	  a	  significant	  difference	  between	  strains	  (p<0.0001),	  but	  no	  significant	  difference	  in	  size	  between	  ploidies	  of	  a	  strain.	  This	  study	  was	  carried	  out	  in	  June	  of	  2011.	  	  	   I	  repeated	  the	  above	  experiment	  in	  2012	  with	  minor	  modifications.	  This	  study	  was	  repeated	  in	  order	  to	  collect	  more	  tissue	  samples	  for	  analysis	  and	  because	  a	  new	  trout	  strain,	  the	  Carp	  Lake	  strain,	  had	  become	  available.	  	  This	  experiment	  consisted	  of	  3	  replicates,	  with	  diploid	  Blackwater	  of	  6.49±0.51g	  (n=36),	  triploid	  Blackwater	  of	  5.92±0.41g	  (n=36),	  diploid	  Tzenzaicut	  of	  4.91±0.26g	  (n=36),	  triploid	  Tzenzaicut	  of	  4.41±0.12g	  (n=35),	  diploid	  Pennask	  of	  3.78±0.2g	  (n=35),	  triploid	  Pennask	  of	  3.47±0.19g	  (n=34),	  diploid	  Fraser	  Valley	  5.31±0.32g	  (n=36),	  triploid	  Fraser	  Valley	  of	  4.49±0.13g	  (n=36),	  diploid	  Carp	  Lake	  of	  5.37±0.37g	  (n=36),	  and	  triploid	  Carp	  lake	  of	  3.99±0.18g	  (n=36).	  Two-­‐way	  ANOVA	  and	  post-­‐hoc	  analysis	  of	  main	  effects	  showed	  a	  significant	  difference	  between	  strains	  (p<0.0001),	  but	  no	  significant	  difference	  in	  size	  between	  ploidies	  of	  a	  strain.	  A	  160L	  tank	  was	  divided	  into	  10	  separate	  compartments	  with	  a	  total	  of	  15	  fish	  of	  each	  strain	  and	  ploidy	  in	  each	  compartment.	  Three	  fish	  were	  removed	  for	  sampling	  at	  0	  (control),	  12,	  24,	  and	  72h	  in	  the	  2012	  study	  using	  the	  protocol	  described	  above.	  Water	  changes	  were	  performed	  at	  6h,	  12h,	  18h,	  24h,	  36h,	  48h,	  and	  60h	  with	  pH	  9.5	  water.	  	  	  2.2.3	  Analytical	  techniques	  In	  2011,	  plasma	  hemoglobin,	  hematocrit,	  mean	  cellular	  hemoglobin	  concentration,	  ammonia,	  urea,	  and	  white	  muscle	  ammonia	  was	  measured.	  In	  2012,	  plasma	  sodium,	  chloride,	  lactate,	  brain	  ammonia,	  brain	  glutamate,	  and	  brain	  	   23	  glutamine	  was	  measured.	  Capillary	  tubes	  were	  centrifuged	  at	  9200g	  to	  separate	  plasma	  and	  red	  blood	  cells	  and	  hematocrit	  was	  determined	  as	  the	  percent	  of	  total	  blood	  occupied	  by	  red	  blood	  cells.	  	  Hemoglobin	  measurements	  were	  divided	  by	  hematocrit	  values	  to	  give	  MCHC	  content.	  Separated	  plasma	  was	  removed	  from	  the	  capillary	  tubes,	  and	  placed	  into	  a	  micro-­‐centrifuge	  tube	  and	  frozen	  in	  liquid	  nitrogen.	  Ploidy	  was	  confirmed	  in	  all	  fish	  using	  the	  protocol	  established	  by	  Arumuganathan	  and	  Earle	  (1991).	  Briefly,	  whole	  blood	  samples	  stored	  in	  the	  propidium	  iodide	  solution	  were	  analyzed	  for	  cell	  size	  using	  a	  FACSCalibur	  bench	  flow	  cytometer	  (BD	  Biosciences,	  California,	  USA).	  Triploidy	  was	  confirmed	  to	  be	  94%	  effective	  in	  2011	  and	  96%	  effective	  in	  2012.	  Hemoglobin	  concentration	  was	  obtained	  spectrophotometrically	  by	  the	  methods	  described	  by	  Blaxhall	  and	  Daisley	  (1973).	  	  Plasma	  was	  used	  for	  the	  analysis	  of	  total	  ammonia,	  urea,	  chloride,	  sodium,	  and	  lactate.	  Metabolite	  plasma	  samples	  were	  diluted	  in	  8%	  perchloric	  acid	  and	  the	  homogenate	  was	  centrifuged	  at	  18000g	  for	  10	  minutes.	  The	  supernatant	  from	  the	  centrifuged	  sample	  was	  removed	  and	  neutralized	  in	  2M	  KHCO3,	  and	  centrifuged	  again	  at	  18000g	  for	  10	  minutes.	  The	  supernatant	  from	  the	  neutralized	  plasma	  sample	  was	  removed	  for	  analysis.	  Ammonia	  values	  were	  obtained	  with	  a	  commercial	  kit	  (SIGMA	  Cat#A0100),	  using	  glutamate	  dehydrogenase	  and	  the	  extinction	  coefficient	  of	  NADH	  at	  340nm	  of	  6,220L/molŸcm.	  Plasma	  urea	  values	  were	  obtained	  by	  using	  the	  protocol	  of	  Rahmatullah	  and	  Boyde	  (1980).	  For	  sodium	  and	  chloride	  measurements,	  frozen	  plasma	  was	  thawed	  and	  5µL	  of	  plasma	  was	  diluted	  200-­‐fold	  in	  dH2O.	  The	  diluted	  plasma	  sample	  was	  aliquoted	  into	  two	  	   24	  separate	  tubes:	  (1)	  the	  aliquot	  was	  diluted	  an	  additional	  6-­‐fold	  and	  run	  through	  a	  flame	  photometer	  (Varian	  AA240FS)	  (2)	  the	  aliquot	  of	  the	  200-­‐fold	  diluted	  plasma	  sample	  was	  mixed	  with	  13mM	  mercuric	  thiocyanate	  and	  0.5M	  ferric	  nitrate	  and	  was	  immediately	  read	  at	  480nm	  by	  spectrophotometer	  for	  the	  determination	  of	  plasma	  chloride.	  Plasma	  lactate	  was	  measured	  using	  the	  methods	  outlined	  in	  Bergmeyer	  (1983).	  	  	  White	  muscle	  was	  used	  for	  the	  analysis	  of	  total	  ammonia,	  and	  brain	  tissue	  was	  used	  to	  obtain	  total	  ammonia,	  glutamine,	  and	  glutamate	  values.	  Brain	  and	  white	  muscle	  ammonia	  were	  measured	  using	  the	  same	  protocol	  used	  for	  determination	  of	  plasma	  ammonia.	  For	  the	  determination	  of	  white	  muscle	  ammonia,	  briefly,	  white	  muscle	  tissue	  was	  isolated	  and	  ground	  under	  liquid	  nitrogen,	  pre-­‐weighed,	  sonicated	  with	  8%	  perchloric	  acid	  using	  a	  micro	  ultrasonic	  cell	  disrupter	  (Kontes),	  and	  neutralized	  with	  2m	  KHCO3.	  The	  neutralized	  sample	  was	  centrifuged	  at	  18000g	  for	  10	  min,	  and	  the	  supernatant	  was	  removed.	  Brain	  samples	  were	  weighed,	  sonicated	  with	  the	  same	  protocol	  as	  white	  muscle	  tissue,	  and	  neutralized.	  5M	  TRIS	  was	  used	  to	  neutralize	  brain	  samples	  instead	  of	  KHCO3	  to	  help	  buffer	  the	  neutralization	  reaction.	  Brain	  glutamate	  and	  glutamine	  concentrations	  were	  determined	  using	  a	  modifying	  version	  of	  the	  protocol	  described	  in	  Lund	  (1970).	  Neutralized	  homogenates	  were	  aliquoted	  into	  two	  separate	  tubes.	  One	  aliquot	  was	  subjected	  to	  an	  additional	  hydrolysis	  reaction,	  being	  mixed	  with	  0.5M	  acetate	  buffer	  and	  2mM	  glutaminase	  solution	  and	  incubated	  at	  38°C	  for	  1	  h	  to	  convert	  all	  glutamine	  in	  the	  homogenate	  to	  glutamate.	  Both	  aliquots	  were	  then	  mixed	  with	  0.5M	  Tris/Hydrazine	  buffer,	  30mM	  NAD+	  solution,	  100mM	  ADP	  solution,	  and	  	   25	  glutamate	  dehydrogenase	  (1200kU/L)	  and	  incubated	  at	  room	  temperature	  for	  40	  minutes	  prior	  to	  being	  read	  on	  the	  spectrophotometer	  at	  340nm.	  Both	  samples	  were	  read	  against	  a	  standard	  curve	  for	  glutamate,	  and	  taking	  the	  total	  glutamate	  from	  the	  hydrolysis	  reaction	  and	  subtracting	  the	  glutamate	  from	  the	  aliquot	  that	  did	  not	  undergo	  a	  hydrolysis	  reaction,	  I	  calculated	  glutamine.	  I	  assumed	  that	  glutamine	  converts	  to	  glutamate	  stoichiometrically.	  	  	  2.2.4	  Statistical	  analysis	  	   All	  data	  are	  reported	  as	  mean	  values±SEM.	  Family	  was	  collapsed	  in	  the	  statistical	  analysis	  to	  focus	  on	  the	  effects	  of	  time/treatment,	  strain,	  and	  ploidy.	  Three-­‐way	  analysis	  of	  variance	  (ANOVA)	  was	  performed	  on	  all	  data	  sets	  with	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  as	  fixed	  variables.	  	  When	  interaction	  terms	  were	  significant,	  a	  two-­‐way	  ANOVA	  was	  performed	  followed	  by	  a	  Tukey	  post-­‐hoc	  analysis,	  with	  data	  sets	  collapsed	  by	  strain	  or	  ploidy	  where	  appropriate.	  LOE	  data	  was	  analyzed	  using	  a	  Kruskal-­‐Wallis	  chi-­‐squared	  test.	  All	  data	  was	  analyzed	  using	  R	  version	  2.15.1.	  	  	  2.3	  Results	  	  2.3.1	  Loss	  of	  Equilibrium	  2011	  study	  In	  2011,	  a	  Krusakal-­‐Wallis	  chi-­‐squared	  test	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  strain	  on	  LOE	  (p<0.0001).	  Trout	  began	  losing	  equilibrium	  as	  pH	  reached	  9.5	  at	  6h,	  with	  the	  Pennask	  triploid	  trout	  showing	  the	  greatest	  loss	  of	  equilibrium	  (Figure	  2.1).	  	  By	  12h	  exposure	  to	  pH	  9.5,	  all	  diploid	  and	  triploid	  wild	  strains	  had	  a	  greater	  	   26	  loss	  of	  equilibrium	  than	  the	  Fraser	  Valley	  domestic	  strain,	  which	  had	  no	  individuals	  suffering	  a	  LOE.	  By	  24h,	  pH	  9.5	  exposure	  caused	  more	  triploids	  to	  lose	  equilibrium	  than	  the	  diploids	  within	  the	  same	  strain.	  The	  Fraser	  Valley	  domestic	  strain	  only	  began	  to	  show	  loss	  of	  equilibrium	  at	  24h,	  with	  triploid	  Fraser	  Valley	  domestic	  trout	  showing	  a	  greater	  loss	  of	  equilibrium	  compared	  with	  their	  diploid	  counterparts.	  Even	  at	  48h	  exposure	  to	  pH	  9.5,	  greater	  than	  70%	  of	  the	  Fraser	  Valley	  domestic	  trout	  remained,	  whereas	  no	  wild	  strains	  were	  available	  to	  sample.	  	   	   	   	   	   	   	   	   	   	   	   	  	  	  	  	  2.3.2	  Haematology	  Three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p=0.033)	  and	  strain	  (p=0.0002)	  on	  blood	  hemoglobin	  concentration	  with	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.302)	  and	  no	  significant	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.459),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.372),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.537),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.627)	  (Figure	  2.2A).	  Three-­‐way	  ANOVA	  determined	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001),	  strain	  (p<0.0001),	  and	  ploidy	  (p<0.0001)	  for	  hematocrit	  (%)	  following	  exposure	  to	  pH	  9.5	  and	  there	  was	  no	  significant	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.075),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.836),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.713),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.673)	  (Figure	  2.2B).	  A	  post-­‐hoc	  analysis	  showed	  a	  significant	  decrease	  in	  all	  time	  points	  compared	  with	  controls,	  a	  significant	  increase	  of	  hematocrit	  in	  diploid	  trout,	  and	  that	  the	  Blackwater	  strain	  was	  significantly	  decreased	  from	  the	  Tzenzaicut	  (p=0.0005)	  and	  Pennask	  (p=0.0001)	  strains.	  There	  was	  no	  significant	  effect	  of	  time	  (p=0.0502),	  strain	  (p=0.144),	  or	  ploidy	  (p=0.098)	  on	  mean	  cellular	  hemoglobin	  concentration	  (MCHC).	  There	  were	  also	  no	  significant	  	   27	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.253),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.503),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.222),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.88)	  for	  MCHC	  (Figure	  2.2C).	  	  	  2.3.3	  Nitrogen	  balance	  	   There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001),	  but	  no	  effect	  of	  strain	  (p=0.891)	  or	  ploidy	  (p=0.477)	  on	  plasma	  ammonia	  (Figure	  2.3A).	  	  There	  were	  no	  significant	  interactions	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.829),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.984),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.906),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.741).	  Plasma	  ammonia	  increased	  significantly	  by	  6h	  exposure	  to	  pH	  9.5	  compared	  with	  controls,	  but	  by	  12h	  exposure	  to	  pH	  9.5,	  plasma	  ammonia	  decreased	  and	  was	  no	  longer	  significantly	  elevated	  relative	  to	  controls.	  Three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p=0.004),	  but	  no	  effect	  of	  stain	  (p=0.262)	  or	  ploidy	  (p=0.897)	  on	  plasma	  urea	  (Figure	  2.3B).	  	  There	  was	  also	  no	  significant	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.812),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.503),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.909),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.903)	  between	  main	  effects	  for	  plasma	  urea.	  	  Post-­‐hoc	  analysis	  of	  the	  time	  effect	  indicated	  that	  plasma	  urea	  was	  significantly	  lower	  at	  48h	  exposure	  compared	  with	  control	  values	  (p=0.001;	  Figure	  2.3B).	  	   Three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001),	  and	  no	  significant	  effect	  of	  strain	  (p=0.3443)	  and	  ploidy	  (p=0.788)	  on	  white	  muscle	  ammonia	  concentration	  (Figure	  2.3C).	  There	  were	  no	  significant	  interactions	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.189),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.645),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.275),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.802)	  between	  main	  effects	  for	  white	  	   28	  muscle	  ammonia.	  White	  muscle	  ammonia	  increased	  3-­‐fold	  over	  control	  values	  after	  6h	  exposure	  to	  pH	  9.5	  and	  remained	  at	  this	  elevated	  level	  for	  the	  duration	  of	  the	  experiment.	  	  2.3.4	  Loss	  of	  equilibrium	  2012	  study	  	  	   In	  2012,	  a	  Krusakal-­‐Wallis	  chi-­‐squared	  test	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  strain	  on	  LOE	  (p=0.04).	  Fewer	  trout	  showed	  a	  LOE	  in	  response	  to	  pH	  9.5	  exposure	  in	  2012	  (Figure	  2.4)	  than	  in	  2011	  (Figure	  2.1).	  Similar	  to	  the	  2011	  study,	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  had	  the	  least	  number	  of	  individuals	  showing	  limited	  LOE	  throughout	  the	  exposure	  with	  only	  1	  individual	  of	  the	  Fraser	  Valley	  triploid	  group	  losing	  equilibrium.	  Among	  the	  wild	  strains	  of	  trout,	  loss	  of	  equilibrium	  was	  noted	  in	  all	  strains	  by	  24h	  and	  at	  72h	  the	  greatest	  total	  loss	  of	  equilibrium	  occurred	  in	  the	  Carp	  Lake	  diploid	  and	  Pennask	  triploid	  trout,	  with	  the	  least	  in	  the	  Fraser	  Valley	  diploid	  strain.	  	  	  2.3.5	  Brain	  metabolites	  	   There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001)	  and	  strain	  (p=0.001),	  but	  no	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.241)	  or	  significant	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.113),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.806),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.762),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.598)	  on	  brain	  ammonia.	  	  All	  trout	  exposed	  to	  pH	  9.5	  had	  significantly	  higher	  brain	  ammonia	  than	  controls	  (p<0.00001)	  (Figure	  2.5A).	  Within	  strains,	  tukey	  post-­‐hoc	  analysis	  showed	  that	  the	  Blackwater	  individuals	  had	  significantly	  lower	  brain	  ammonia	  concentrations	  than	  the	  Fraser	  Valley	  (p=0.003)	  	   29	  and	  Pennask	  (p=0.002)	  strains.	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001)	  but	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy,	  strain	  or	  interactions	  on	  brain	  glutamate.	  Fish	  exposed	  to	  elevated	  pH	  had	  significantly	  lower	  brain	  glutamate	  compared	  to	  the	  control	  values	  (p<0.0001)(Figure	  2.5B).	  All	  strains,	  except	  for	  the	  Tzenzaicut	  strain,	  showed	  a	  significant	  decrease	  in	  brain	  glutamate	  at	  24h,	  and	  concentrations	  remained	  at	  this	  level	  for	  the	  duration	  of	  the	  exposure.	  The	  analysis	  reveals	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001)	  and	  strain	  (p<0.0001)	  on	  brain	  glutamine.	  A	  post-­‐hoc	  test	  revealed	  that	  pH	  exposed	  fish	  had	  significantly	  higher	  brain	  glutamine	  at	  all	  time	  points	  compared	  to	  the	  control	  group;	  the	  12h	  time	  point	  increased	  tissue	  glutamine	  2.5	  fold	  at	  12h,	  and	  continued	  to	  increase	  to	  up	  to	  3-­‐fold	  higher	  than	  control	  values	  at	  24h	  (Figure	  2.5C).	  	  Among	  strains,	  there	  was	  a	  significant	  difference	  between	  the	  Pennask,	  and	  Blackwater	  (p=0.007),	  and	  Carp	  Lake	  (p=0.001)	  strains,	  with	  the	  Pennask	  strain	  having	  significantly	  higher	  brain	  glutamine.	  	  	  	  	  2.3.6	  Plasma	  ions	  	   There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p=0.003)	  and	  strain	  (p=0.008),	  but	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.459)	  or	  interaction	  between	  time	  and	  ploidy	  (p=0.331),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.409)	  for	  plasma	  sodium.	  There	  was	  a	  significant	  interaction	  between	  strain	  and	  time	  in	  this	  experiment	  (p=0.007),	  with	  a	  post-­‐hoc	  analysis	  revealing	  that	  plasma	  sodium	  was	  significantly	  higher	  following	  high	  pH	  exposure	  at	  the	  12h	  (p=0.007)	  and	  72h	  (p=0.011)	  compared	  with	  control	  fish	  (Figure	  2.6A).	  At	  the	  strain	  level,	  Fraser	  valley	  domestics	  had	  plasma	  sodium	  levels	  	   30	  that	  were	  significant	  lowers	  than	  Blackwater	  (p=0.028)	  and	  Tzenzaicut	  (p=0.011)	  strains.	  	  	   There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001)	  on	  plasma	  chloride,	  however,	  there	  was	  no	  significant	  of	  strain	  (p=0.449)	  and	  ploidy	  (p=0.455)	  or	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.829),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.785),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.81),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.441).	  A	  post-­‐hoc	  analysis	  revealed	  that	  the	  24h	  time	  point	  was	  significantly	  decreased	  from	  all	  other	  time	  points	  (Figure	  2.6B).	  	  	  2.3.7	  Plasma	  lactate	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (p<0.0001)	  and	  strain	  (p<0.0001)	  on	  plasma	  lactate	  and	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.274).	  There	  was	  a	  significant	  interaction	  between	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.02),	  and	  no	  significant	  interaction	  between	  time	  and	  strain	  (p=0.503),	  time	  and	  ploidy	  (p=0.372),	  and	  time,	  strain,	  and	  ploidy	  (p=0.463)	  on	  plasma	  lactate.	  All	  plasma	  lactate	  values	  were	  significantly	  higher	  following	  high	  pH	  exposure	  compared	  to	  control	  individuals,	  with	  the	  12	  and	  24h	  time	  points	  showing	  a	  2-­‐fold	  increase	  and	  1.5-­‐fold	  increase	  at	  72h	  (Figure	  2.6C).	  Pennask	  trout	  had	  significantly	  higher	  plasma	  lactate	  than	  the	  Carp	  Lake	  and	  Fraser	  Valley	  groups	  (p=0.001).	  The	  Pennask	  triploid	  group	  was	  significantly	  different	  from	  the	  diploid	  Blackwater	  group	  (p=0.027),	  the	  Tzenzaicut	  diploids	  (p=0.004),	  the	  Carp	  Lake	  diploids	  (p=0.026),	  the	  Carp	  Lake	  triploids	  (p=0.0001),	  the	  Fraser	  Valley	  diploids	  (p=0.003),	  and	  the	  Fraser	  Valley	  triploids	  (p=0.0005)	  (Figure	  2.6C).	  	  	  	   31	  2.4	  Discussion	   	  	   The	  most	  striking	  outcome	  of	  the	  present	  study	  was	  that	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  of	  rainbow	  trout	  were	  more	  tolerant	  of	  pH	  9.5	  exposure	  than	  the	  four	  wild	  stains	  used	  in	  this	  study,	  and	  this	  was	  observed	  over	  two	  consecutive	  years	  of	  analysis	  (2011	  Figure	  2.1	  and	  2012	  Figure	  2.4).	  This	  is	  consistent	  with	  previous	  work	  comparing	  the	  responses	  of	  various	  trout	  strains	  to	  an	  environmental	  challenge,	  where	  Scott	  (2012)	  demonstrated	  that	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  trout	  strains	  were	  more	  tolerant	  of	  low	  oxygen	  stress	  compared	  with	  wild	  strains.	  This	  suggests	  that,	  in	  general,	  domestication	  may	  improve	  how	  animals	  perform	  under	  stressful	  conditions.	  	  Indeed,	  it	  has	  been	  shown	  that	  domesticated	  strains	  of	  trout	  and	  salmon	  handle	  stress	  far	  better	  than	  their	  wild	  strains,	  and	  this	  better	  stress	  tolerance	  has	  been	  associated	  with	  a	  blunted	  cortisol	  response	  (Woodward	  and	  Strange	  1987;	  Fevolden	  et	  al.	  1991).	  	  	   There	  was	  considerable	  variation	  in	  the	  time	  to	  loss	  of	  equilibrium	  at	  pH	  9.5	  in	  the	  wild	  strains.	  	  In	  2011,	  no	  wild	  strain	  was	  capable	  of	  surviving	  past	  24h	  of	  the	  high	  pH	  exposure,	  however,	  in	  2012,	  all	  strains	  survived	  to	  72h.	  The	  reason	  for	  the	  year-­‐to-­‐year	  variation	  in	  high	  pH	  tolerance	  is	  unknown,	  but	  may	  be	  associated	  with	  differences	  in	  size.	  The	  wild	  strains	  used	  in	  2012	  were	  significantly	  smaller	  than	  the	  trout	  used	  in	  2011	  (see	  section	  2.3.2	  of	  the	  methods	  section),	  however	  unpublished	  FFSBC	  results	  suggest	  that	  larger	  fish	  should	  be	  advantageous	  in	  high	  pH.	  The	  role	  of	  size	  in	  high	  pH	  should	  be	  explored	  in	  future	  work.	  	  	   Although	  the	  present	  study	  suggests	  a	  large	  effect	  of	  strain	  and	  year	  on	  high	  pH	  tolerance,	  all	  of	  the	  trout	  used	  in	  the	  present	  study	  appear	  to	  be	  far	  more	  	   32	  sensitive	  to	  a	  high	  pH	  exposure	  compared	  with	  other	  studies	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilson	  et	  al.	  1998).	  Wilkie	  and	  Wood	  (1991)	  reported	  that	  free-­‐swimming	  rainbow	  trout	  survived	  up	  to	  5	  weeks	  of	  exposure	  to	  pH	  9.5	  water.	  There	  are	  several	  possible	  explanations	  for	  lower	  survival	  in	  this	  study	  compared	  with	  previously	  published	  studies.	  	  For	  example,	  the	  increased	  sensitivity	  in	  my	  fish	  may	  be	  due	  to	  the	  greater	  magnitude	  of	  change	  in	  pH	  from	  6.7	  to	  9.5,	  whereas	  most	  other	  studies	  only	  change	  pH	  from	  a	  control	  value	  of	  8.0	  to	  9.5	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Laurent	  et	  al.	  2000).	  Murray	  and	  Ziebell	  (1984)	  increased	  pH	  to	  9.5	  from	  7.2	  over	  6h	  and	  reported	  50%	  mortality,	  but	  improved	  survival	  by	  gradually	  increasing	  pH	  to	  9.8	  over	  5	  days	  demonstrating	  the	  benefit	  of	  a	  gradual	  pH	  increase.	  However,	  experiments	  by	  Wilson	  et	  al.	  (1998)	  and	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992),	  were	  conducted	  in	  similar	  conditions	  to	  this	  study,	  and	  only	  the	  latter	  reported	  losses	  in	  their	  soft	  water	  high	  pH	  (10.1)	  condition.	  The	  underlying	  cause	  of	  sensitivity	  may	  be	  again	  based	  in	  size	  of	  the	  fish,	  as	  both	  previous	  studies	  used	  adult	  rainbow	  trout	  (approximately	  200	  and	  400g	  respectively)	  compared	  to	  the	  juvenile	  fish	  used	  in	  this	  study.	  Other	  studies	  have	  shown	  an	  effect	  of	  size	  on	  metabolite	  storage	  in	  rainbow	  trout	  (Ferguson	  et	  al.	  1993).	  Larger	  fish	  may	  able	  to	  regulate	  a	  physiological	  disturbance	  better,	  as	  has	  been	  shown	  in	  larger	  brook	  trout	  that	  maintain	  lower	  blood	  osmolarity	  after	  transfer	  to	  seawater,	  than	  smaller	  trout	  (McCormick	  and	  Naiman,	  1984).	  Water	  hardness	  varies	  between	  experiments	  as	  well,	  with	  many	  studies	  conducted	  in	  water	  of	  intermediate	  to	  high	  levels	  of	  hardness	  ([CaCO3]>140mg/L)	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  et	  al.	  1996),	  in	  comparison	  to	  the	  soft	  water	  used	  at	  the	  UBC	  ([CaCO3]<17.9mg/L).	  	  	   33	  	   Despite	  the	  significant	  effects	  of	  strain	  on	  LOE	  at	  pH	  9.5,	  there	  were	  no	  apparent	  differences	  in	  the	  physiological	  responses	  of	  the	  different	  strains	  to	  high	  pH	  exposure.	  	  This	  may,	  in	  part,	  be	  due	  to	  the	  fact	  that	  I	  sampled	  surviving	  fish	  for	  physiological	  analysis,	  which	  may	  preclude	  me	  from	  defining	  the	  physiological	  basis	  for	  differences	  in	  loss	  of	  equilibrium	  between	  strains.	  In	  addition,	  it	  is	  possible	  that	  other	  physiological	  or	  biochemical	  factors,	  besides	  the	  ones	  measured	  here,	  may	  differ	  between	  the	  strains	  and	  account	  for	  the	  differences	  in	  high	  pH	  tolerance.	  	  High	  pH	  exposure	  is	  well	  known	  to	  affect	  ammonia	  excretion	  and	  ionregulation	  in	  trout	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Randall	  and	  Tsui,	  2002).	  In	  particular,	  it	  has	  been	  shown	  previously	  that	  ammonia	  excretion	  is	  greatly	  reduced	  upon	  exposure	  to	  a	  high	  pH	  environment	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1995;	  McGeer	  and	  Eddy,	  1998;	  Wilson	  et	  al.	  1998)	  due	  to	  the	  difficulty	  of	  maintaining	  the	  blood	  to	  water	  ammonia	  excretion	  gradient	  facilitated	  by	  the	  acidification	  of	  the	  gill	  boundary	  layer	  (Weihrauch	  et	  al.	  2009;	  Wright	  and	  Wood,	  2009).	  Ammonia	  accumulation	  in	  tissues,	  like	  the	  brain,	  has	  been	  proposed	  to	  cause	  the	  production	  of	  reactive	  oxygen	  species	  that	  ultimately	  lead	  to	  death	  (Norenberg,	  2004).	  The	  results	  from	  the	  present	  study	  show	  a	  2-­‐fold	  increase	  in	  plasma	  ammonia	  after	  6h	  exposure	  to	  pH	  9.5	  (Figure	  2.3A).	  This	  was	  accompanied	  by	  a	  2-­‐fold	  increase	  in	  brain	  ammonia	  (Figure	  2.5A).	  Sanderson	  et	  al.	  (2010)	  showed	  two-­‐fold	  higher	  brain	  ammonia	  than	  values	  presented	  in	  the	  rainbow	  trout	  in	  the	  present	  study,	  which	  suggests	  that	  ammonia	  could	  accumulate	  to	  higher	  levels	  in	  the	  brains	  before	  resulting	  in	  toxicity.	  As	  ammonia	  can	  readily	  be	  incorporated	  into	  citric-­‐acid	  cycle	  metabolites	  such	  as	  α-­‐ketoglutarate	  and	  oxaloacetate,	  I	  expected	  to	  	   34	  see	  an	  increase	  in	  the	  production	  of	  glutamine	  to	  deter	  the	  amount	  of	  ammonia	  present	  in	  the	  body	  (Randall,	  2011).	  This	  is	  supported	  by	  the	  3-­‐fold	  increase	  in	  brain	  glutamine	  levels	  and	  the	  reduced	  levels	  of	  brain	  glutamate	  upon	  the	  onset	  of	  high	  pH	  (Figure	  2.5B	  and	  2.5C).	  It	  also	  could	  be	  expected	  that	  ammonia	  could	  be	  accumulated	  in	  other,	  ammonia	  insensitive	  cellular	  compartments	  (i.e.	  muscle)	  in	  order	  to	  keep	  plasma	  levels	  low	  and	  minimize	  accumulation	  in	  the	  brain	  or	  other	  more	  ammonia	  sensitive	  tissues.	  Wilkie	  and	  Wood	  (1995)	  showed	  that	  trout	  white	  muscle	  had	  a	  large	  capacity	  to	  store	  ammonia	  because	  it	  comprises	  up	  to	  65%	  of	  the	  body	  mass	  (Stevens,	  1968).	  The	  data	  collected	  in	  the	  present	  study	  on	  white	  muscle	  ammonia	  shows	  an	  accumulation	  of	  ammonia	  that	  is	  rapid	  and	  to	  a	  concentration	  that	  is	  7.5	  times	  greater	  than	  observed	  in	  the	  blood	  (assuming	  0.8ml	  water/g	  of	  tissue	  for	  muscle),	  demonstrating	  the	  capacity	  of	  the	  white	  muscle	  to	  store	  ammonia	  during	  an	  accumulation.	  	  Exposure	  to	  high	  pH	  had	  a	  small,	  but	  significant	  effect	  on	  plasma	  sodium	  and	  chloride	  concentrations.	  Greater	  plasma	  ion	  loss	  following	  elevated	  pH	  exposure	  was	  expected	  as	  a	  consequence	  of	  the	  weakening	  of	  the	  tight	  junctions	  at	  the	  gill	  and	  general	  hypertrophy	  that	  occurs	  in	  fish,	  like	  the	  Brook	  trout,	  exposed	  to	  high	  pH	  (Gaye	  and	  Darside,	  1976;	  Laurent	  et	  al.	  2000).	  The	  present	  data	  shows	  a	  significant	  decrease	  in	  plasma	  chloride	  at	  24h	  (Figure	  2.6B).	  The	  subsequent	  removal	  of	  HCO3-­‐	  may	  account	  for	  the	  recovery	  of	  chloride	  by	  72h	  (Figure	  2.6B),	  via	  the	  Cl-­‐/HCO3-­‐	  exchanger	  at	  the	  gills.	  This	  is	  speculative,	  as	  I	  did	  not	  measure	  HCO3-­‐,	  however	  soft	  water	  high	  pH	  studies	  have	  shown	  increases	  in	  HCO3-­‐	  as	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure	  (Heming	  and	  Blumhagen,	  1988;	  Yesaki	  and	  Iwama	  1992,	  McGeer	  and	  	   35	  Eddy,	  1998)	  suggesting	  the	  presence	  of	  HCO3-­‐	  reserves	  for	  exchange.	  I	  expected	  sodium	  levels	  to	  drop	  as	  reported	  in	  other	  studies	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1993;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1995),	  but	  rather	  saw	  limited	  change	  in	  sodium	  much	  like	  the	  study	  by	  Wilkie	  et	  al.	  (1996).	  The	  additional	  0.01M	  sodium	  from	  the	  NaOH	  used	  to	  adjust	  the	  pH	  may	  have	  assisted	  in	  maintaining	  plasma	  sodium	  values.	  The	  limited	  change	  in	  plasma	  sodium	  and	  chloride	  suggest	  that	  osmoregulation	  was	  generally	  maintained	  in	  the	  trout	  strains	  during	  exposure	  to	  pH	  9.5,	  which	  is	  further	  supported	  by	  the	  relatively	  stable	  effect	  of	  pH	  9.5	  exposure	  on	  blood	  hemoglobin,	  hematocrit,	  and	  MCHC	  (Figure	  2.2A;	  2.2B;	  2.2C).	  The	  results	  indicate	  a	  significant	  increase	  in	  lactate	  initially,	  followed	  by	  a	  return	  to	  control	  values	  by	  72h.	  This	  transient	  increase	  is	  similar	  to	  the	  one	  reported	  by	  Wilson	  et	  al.	  (1998),	  where	  lactate	  remained	  significant	  elevated	  at	  72h	  in	  high	  pH	  (9.5)	  exposed	  fish,	  but	  returned	  to	  control	  values	  by	  96h.	  The	  increase	  in	  lactate	  reported	  in	  this	  study	  suggests	  that	  my	  fish	  use	  anaerobic	  metabolism	  upon	  exposure	  to	  high	  pH,	  although	  the	  cause	  of	  the	  increase	  in	  lactate	  is	  unknown.	  	   There	  is	  no	  clear	  and	  consistent	  effect	  of	  ploidy	  on	  any	  of	  the	  responses	  of	  the	  trout	  to	  high	  pH	  exposure.	  The	  lack	  of	  an	  effect	  of	  ploidy	  is	  consistent	  with	  other	  studies	  that	  have	  seen	  similar	  results	  with	  no	  real	  difference	  in	  growth,	  hematological	  and	  biochemical	  parameters	  between	  ploidies	  when	  exposed	  to	  stress	  (Galbearth	  et	  al.	  1994;	  Sadler	  et	  al.	  2000).	  Gillnetting	  returns	  by	  the	  FFSBC	  and	  other	  studies	  have	  shown	  reduced	  triploid	  returns	  in	  the	  wild	  (Blanc	  et	  al.	  1992;	  Simon	  et	  al.	  1993;	  Dillon	  et	  al.	  2000),	  however	  others	  report	  no	  difference	  between	  ploidies	  (Guo	  et	  al.	  1990;	  Wagner	  et	  al.	  2006).	  The	  data	  does	  not	  support	  triploid	  	   36	  sensitivity	  to	  high	  pH	  water,	  but	  an	  in-­‐lake	  study	  would	  need	  to	  be	  run	  to	  confirm	  if	  ploidy	  adversely	  affects	  high	  pH	  tolerance.	  	  	  2.5	  Conclusion	  The	  results	  of	  this	  study	  demonstrate	  that	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  of	  trout	  is	  more	  tolerant	  of	  pH	  9.5	  compared	  with	  4	  wild	  strains;	  however,	  I	  did	  not	  discover	  a	  physiological	  explanation	  for	  this	  greater	  high	  pH	  tolerance.	  The	  Fraser	  Valley	  strain	  was	  visibly	  sessile	  throughout	  the	  exposure	  (personal	  observation),	  which	  may	  minimize	  energy	  expenditure	  and	  contribute	  to	  their	  greater	  high	  pH	  tolerance.	  Future	  studies	  should	  examine	  aspects	  of	  energy	  balance	  in	  trout	  exposed	  to	  high	  pH	  and	  determine	  if	  some	  form	  of	  metabolic	  rate	  suppression	  is	  responsible	  for	  the	  enhanced	  tolerance	  of	  the	  Fraser	  Valley	  trout.	  The	  natural	  environments	  of	  the	  wild	  strains	  used	  in	  this	  study	  are	  typically	  found	  in	  mountainous	  regions	  where	  water	  has	  a	  relatively	  high	  level	  of	  CaCO3.	  Measuring	  tolerance	  in	  a	  high	  pH	  environment	  more	  similar	  to	  a	  natural	  environment	  of	  the	  brood	  stocks	  may	  give	  a	  better	  representation	  of	  each	  strains	  actual	  level	  of	  tolerance	  in	  a	  high	  pH	  setting	  which	  is	  the	  focus	  of	  the	  next	  chapter.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   37	  Figures	  	  	  	  Figure	  2.1.	  LOE	  data	  from	  2011	  showing	  the	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  48h	  (n=4	  for	  all	  data	  points).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	  	  	   38	  	  	  Figure	  2.2.	  Hemoglobin	  concentration	  (A),	  hematocrit	  %	  (B),	  and	  Mean	  Cell	  Hemoglobin	  concentration	  in	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds),	  Carp	  lake	  (upward	  triangles)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  48h(n=2-­‐5	  for	  all	  groups	  except	  Fraser	  Valley	  (n=8)	  at	  24h	  mark).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	   39	  	  	  Figure	  2.3.	  Total	  plasma	  ammonia	  (A),	  plasma	  urea	  (B),	  and	  white	  muscle	  ammonia	  (C)	  in	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds),	  Carp	  lake	  (upward	  triangles)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  48h(n=2-­‐5	  for	  all	  groups	  except	  Fraser	  Valley	  (n=8)	  at	  24h	  mark	  for	  A	  and	  C;	  n=1-­‐2	  for	  all	  groups	  except	  Fraser	  Valley	  (n=8)	  at	  24h	  mark	  for	  B).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	   40	  	  	  	  	  	  	  Figure	  2.4.	  LOE	  data	  from	  2012	  showing	  the	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds),	  Carp	  lake	  (upward	  triangles)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  (n=3	  for	  all	  data	  points).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	  	   41	  	  	  Figure	  2.5.	  Total	  brain	  ammonia	  (A),	  brain	  glutamate	  (B),	  and	  brain	  glutamine	  (C)	  in	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds),	  Carp	  lake	  (upward	  triangles)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  72h	  (n=5-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  at	  72h;	  n=3-­‐8	  for	  all	  groups	  at	  72h).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	   42	  	  	  Figure	  2.6.	  	  Plasma	  sodium	  (A),	  plasma	  chloride	  (B),	  and	  plasma	  lactate	  (C)	  in	  Blackwater	  (circles),	  Tzenzaicut	  (downward	  triangles),	  Pennask	  (squares),	  Fraser	  Valley	  (diamonds),	  Carp	  lake	  (upward	  triangles)	  strains	  and	  their	  diploid	  (filled	  symbols)	  and	  triploid	  (open	  symbols)	  conditions	  exposed	  to	  high	  pH	  (9.5)	  water	  for	  72h	  (n=5-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  at	  72h;	  n=3-­‐8	  for	  all	  groups	  at	  72h).	  All	  groups	  have	  been	  staggered	  at	  their	  respective	  time	  points	  for	  clarity	  of	  viewing.	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  and	  interactions	  are	  denoted	  on	  figure.	  	   43	  [3]	  The	  physiological	  response	  of	  wild	  and	  domestic	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  in	  hard	  and	  soft	  high	  pH	  (9.5)	  water	  	  3.1	  Introduction	  	   British	  Columbia	  (BC)	  has	  a	  rich	  history	  of	  stocking	  lakes	  with	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  to	  support	  recreational	  fishing.	  At	  least	  6	  different	  strains	  originating	  from	  lakes,	  rivers,	  and	  hatcheries	  are	  stocked	  across	  BC	  every	  year,	  resulting	  in	  the	  addition	  of	  over	  4	  million	  trout	  to	  freshwater	  lakes	  (GSGislason	  and	  Associates	  Ltd,	  2009).	  	  To	  mitigate	  the	  genetic	  influence	  this	  addition	  would	  have	  on	  indigenous	  populations	  of	  trout,	  hatcheries	  commonly	  stock	  sterile	  triploid	  trout	  to	  prevent	  genetic	  mixing	  between	  stocked	  and	  native	  trout	  populations.	  However,	  numerous	  published	  reports	  have	  shown	  a	  reduced	  survival	  of	  triploid	  trout	  in	  natural	  settings	  compared	  with	  their	  diploid	  counterparts	  (Blanc	  et	  al.	  1992;	  Simon	  et	  al.	  1993;	  Dillon	  et	  al.	  2000).	  	  The	  Freshwater	  Fishery	  Society	  of	  BC	  (FFSBC)	  is	  also	  facing	  the	  startling	  trend	  of	  increasing	  pH	  in	  freshwater	  lakes	  in	  BC,	  with	  lakes	  increasing	  to	  a	  pH	  near	  9.5	  as	  a	  result	  of	  their	  bedrock	  geology	  and	  low	  flushing	  rates	  (Krueger	  and	  Water,	  1983;	  Jones	  et	  al.	  1998).	  The	  FFSBC	  and	  other	  agencies	  have	  reported	  reduced	  returns	  and	  survival	  of	  stocked	  trout	  in	  high	  pH	  lakes	  (Yesaki	  and	  Tsumura,	  1992;	  Mathias	  et	  al.	  1996;	  Wagner	  et	  al.	  1997),	  and	  a	  pH	  of	  9.5	  has	  been	  reported	  to	  result	  in	  severe	  physiological	  responses	  in	  rainbow	  trout	  used	  for	  stocking	  (Chapter	  2).	  	  	   44	  	   Previous	  work	  demonstrated	  that	  there	  is	  an	  effect	  of	  strain	  on	  high	  pH	  tolerance	  in	  trout,	  with	  the	  Fraser	  Valley	  domestic	  strain	  being	  more	  tolerant	  of	  pH	  9.5	  exposures	  than	  four	  wild	  strains	  (Chapter	  2).	  However,	  despite	  large	  differences	  in	  tolerance,	  there	  were	  no	  significant	  differences	  between	  domestic	  and	  wild	  strains	  in	  ammonia	  and	  ion	  balance	  (Chapter	  2).	  My	  previous	  study	  was	  conducted	  using	  de-­‐chlorinated	  Vancouver	  City	  tap	  water,	  which	  is	  considered	  to	  be	  soft	  ([CaCO3]<17.9mg/L)	  and	  does	  not	  reflect	  the	  water	  hardness	  seen	  in	  many	  of	  BC’s	  lakes	  (Unpublished	  FFSBC	  data).	  	  	   A	  high	  level	  of	  water	  hardness	  ([CaCO3]=320mg/L)	  enhances	  survival	  in	  rainbow	  trout	  exposed	  to	  high	  pH	  (Yesaki	  and	  Iwama,	  1992).	  Hard	  water	  is	  expected	  to	  strengthen	  tight	  junctions	  at	  the	  gill,	  which	  results	  in	  less	  ion	  loss	  from	  the	  plasma	  to	  the	  freshwater	  environment	  (Hunn,	  1985;	  Tang	  and	  Goodenough,	  2003).	  Furthermore,	  increases	  in	  water	  hardness	  affects	  ammonia	  excretion	  in	  trout	  exposed	  to	  high	  pH.	  	  In	  soft	  water,	  high	  pH	  exposure	  results	  in	  an	  accumulation	  of	  ammonia	  in	  plasma	  and	  tissues	  due	  to	  an	  inhibition	  of	  ammonia	  efflux	  across	  the	  gills	  (Wilkie	  and	  Wood	  1994;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilkie,	  1997),	  which	  is	  partially	  alleviated	  in	  hard	  water	  (Yesaki	  and	  Iwama,	  1992;	  Iwama	  et	  al.	  1997;	  Wilson	  et	  al.	  1998).	  	  	   The	  goals	  of	  this	  study	  were	  to	  compare	  the	  short-­‐term	  physiological	  response	  of	  diploid	  and	  triploid	  trout	  from	  one	  domestic	  and	  three	  wild	  strains	  to	  pH	  9.5	  exposure	  in	  both	  soft	  water	  ([CaCO3]<17.9mg/L)	  and	  hard-­‐water	  ([CaCO3]=320mg/L).	  To	  accomplish	  this,	  I	  measured	  the	  changes	  in	  plasma	  ions,	  cortisol,	  and	  levels	  of	  ammonia	  in	  the	  plasma,	  liver,	  and	  brain	  as	  well	  as	  brain	  water	  	   45	  content	  after	  24h	  exposure.	  Fish	  were	  abruptly	  transferred	  from	  soft	  water	  control	  conditions	  (pH	  6.7)	  to	  soft	  water	  controls,	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  and	  I	  recorded	  any	  loss	  of	  equilibrium	  (LOE)	  of	  trout	  in	  each	  condition.	  	  3.2	  Materials	  and	  methods	  	  3.2.1	  Experimental	  animals	  	   Strains	  were	  obtained	  based	  on	  their	  availability,	  and	  in	  this	  study	  I	  used	  three	  wild	  strains	  and	  one	  domesticated	  strain	  of	  rainbow	  trout.	  	  For	  the	  wild	  strains,	  three	  breeding	  pairs	  were	  taken	  from	  their	  natural	  environment	  and	  crossed	  at	  the	  hatchery.	  Wild	  strains	  were	  obtained	  from	  Blackwater	  River	  (named	  Blackwater),	  Pennask	  Lake	  (named	  Pennask)	  and	  Carp	  Lake	  (named	  Carp	  lake).	  Half	  of	  the	  progeny	  from	  each	  pair	  were	  allowed	  to	  develop	  as	  diploid	  fish,	  while	  the	  remainder	  was	  exposed	  to	  a	  hydrostatic	  pressure	  shock	  during	  development	  to	  induce	  triploidy.	  This	  created	  full	  siblings	  from	  three	  families	  that	  differed	  only	  by	  ploidy.	  The	  domestic	  Fraser	  Valley	  strain	  (named	  Fraser	  Valley)	  was	  crossed	  several	  months	  after	  the	  wild	  strains,	  producing	  diploid	  and	  triploid	  full	  siblings	  by	  the	  same	  protocol	  described	  above.	  Fish	  were	  reared	  at	  the	  Fraser	  Valley	  fish	  hatchery	  until	  December	  of	  2012,	  when	  the	  fish	  were	  tagged	  with	  visible	  implant	  elastomere	  tags	  to	  distinguish	  strain,	  ploidy,	  and	  family	  prior	  to	  transfer	  from	  Abbotsford	  to	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  (UBC)	  in	  January	  of	  2013.	  Fraser	  Valley	  domestics	  were	  tagged	  in	  March	  of	  2013,	  and	  brought	  to	  the	  UBC	  in	  early	  April	  of	  the	  same	  year.	  At	  the	  UBC,	  all	  trout	  were	  held	  in	  a	  partially	  re-­‐circulated	  common	  garden	  	   46	  system	  using	  de-­‐chlorinated	  Vancouver	  city	  tap	  water	  (pH	  ~6.7;	  [CaCO3]<17.9mg/L).	  The	  fish	  were	  reared	  until	  June	  of	  2013	  at	  the	  UBC	  and	  fed	  twice	  daily	  Monday	  to	  Friday,	  and	  once	  daily	  on	  weekends	  for	  a	  total	  of	  2%	  bodyweight	  of	  Bitovita	  1.2mm	  fry	  food.	  All	  holding	  and	  experimental	  conditions	  were	  conduced	  until	  the	  guidelines	  of	  the	  Canadian	  Council	  on	  Animal	  Care.	  	  	  3.2.2	  Experimental	  protocol	  	   Fish	  were	  fasted	  24h	  before	  being	  sorted	  and	  size	  matched.	  	  For	  this	  experiment,	  diploid	  Blackwater	  trout	  were	  9.68±0.16g	  (n=24)(Mean±S.E.M),	  the	  triploid	  Blackwater	  were	  9.56±0.19g	  (n=22),	  the	  diploid	  Pennask	  were	  9.08±0.16g	  (n=24),	  the	  triploid	  Pennask	  were	  8.21±0.16g	  (n=24),	  the	  diploid	  Carp	  lake	  were	  10.09±0.3g	  (n=24),	  the	  triploid	  Carp	  lake	  were	  9.58±0.48g	  (n=21),	  the	  diploid	  Fraser	  valley	  were	  5.34±0.3g	  (n=24),	  and	  the	  triploid	  Fraser	  Valley	  strain	  weighed	  5.28±0.18g	  (n=24).	  Two-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  difference	  between	  strains	  (p<0.0001),	  but	  not	  between	  ploidies	  or	  treatments	  within	  a	  strain	  for	  size.	  	  Four	  trout	  from	  each	  strain	  and	  ploidy	  were	  placed	  into	  4L	  opaque	  plastic	  jars	  that	  had	  4	  square	  sections	  of	  the	  sides	  replaced	  with	  mesh	  and	  was	  covered	  with	  transparent	  plastic	  to	  allow	  observations	  of	  specimens	  throughout	  the	  exposure.	  After	  fish	  were	  placed	  into	  each	  plastic	  container,	  they	  were	  put	  back	  into	  the	  stock	  tank.	  Polyethylene	  foam	  was	  used	  for	  flotation	  of	  each	  container.	  	  The	  fish	  were	  allowed	  to	  acclimate	  to	  the	  container	  for	  24h,	  before	  being	  placed	  into	  a	  mobile	  150L	  tank	  for	  transport	  to	  the	  experimental	  chamber,	  where	  they	  were	  moved	  into	  the	  experimental	  exposure	  system.	  	  	   47	  	   Three,	  blue	  150L	  oval	  experimental	  tanks	  were	  set	  up	  at	  least	  24h	  before	  exposures,	  consisting	  of	  a	  soft	  water	  control	  condition	  (pH=6.7;	  [CaCO3]<17.9mg/L),	  a	  soft	  water	  high	  pH	  (pH=9.5;	  [CaCO3]<17.9mg/L)	  condition,	  and	  a	  hard	  water	  high	  pH	  (pH	  9.5;	  [CaCO3]=320mg/L)	  condition.	  The	  soft	  water	  treatment	  used	  de-­‐chlorinated	  Vancouver	  city	  tap	  water	  with	  the	  addition	  of	  0.2M	  NaOH	  to	  maintain	  a	  pH	  of	  9.5.	  Two	  pumps	  circulated	  water	  to	  a	  header	  tank	  where	  NaOH	  was	  added	  and	  mixed	  via	  heavy	  aeration	  before	  being	  returned	  to	  the	  exposure	  tank.	  The	  control	  tanks	  followed	  the	  same	  protocol	  without	  the	  addition	  of	  NaOH.	  The	  hard	  water	  condition	  consisted	  of	  38.5g	  CaCl2Ÿ2H2O,	  3.2g	  CaCO3,	  and	  34.6g	  MgCl2Ÿ6H2O	  addition	  to	  the	  tank	  (150L)	  for	  a	  final	  hardness	  of	  320mg/L	  as	  CaCO3.	  The	  pH	  of	  9.5	  was	  maintained	  by	  addition	  of	  0.2M	  NaOH.	  NaOH	  addition	  for	  the	  alkaline	  soft/hard	  treatments	  was	  controlled	  by	  use	  of	  a	  Cole-­‐Parmer	  electrode	  connected	  to	  an	  alpha-­‐560	  Eutech	  instruments	  pH	  regulator	  that	  electrically	  manipulated	  a	  peristaltic	  pump.	  Tanks	  were	  observed	  every	  hour	  and	  pH	  was	  maintained	  at	  9.5.	  	  To	  ensure	  proper	  mixing	  in	  the	  hard	  water	  exposure,	  a	  total	  of	  four	  circulating	  pumps	  were	  placed	  in	  the	  bottom	  of	  the	  tank	  to	  create	  circular	  flow,	  and	  agitation	  was	  supplemented	  with	  heavy	  aeration.	  Hardness	  was	  measured	  with	  a	  colourmetric	  assay	  (API	  General	  hardness	  test	  kit).	  Each	  tank	  was	  covered	  with	  opaque	  plastic	  sheeting.	  This	  set	  up	  was	  identical	  for	  each	  condition.	  	  	   Fish	  were	  exposed	  to	  each	  treatment	  for	  24h.	  To	  sample	  the	  fish,	  a	  container	  with	  four	  fish	  was	  removed	  and	  fish	  were	  anesthetized	  by	  the	  addition	  of	  MS-­‐222	  (buffered	  with	  sodium	  bicarbonate)	  to	  a	  final	  concentration	  of	  0.1g/L	  directly	  into	  the	  container.	  All	  4	  fish	  were	  removed	  and	  fork	  length,	  weight,	  and	  elastomere	  tag	  	   48	  position	  were	  recorded.	  The	  collection	  of	  blood	  and	  tissue	  samples	  was	  identical	  to	  the	  protocol	  described	  in	  the	  previous	  chapter	  (Chapter	  2).	  Briefly,	  whole	  blood	  was	  drawn	  into	  heparinized	  capillary	  tubes	  after	  caudal	  severance,	  and	  an	  additional	  5µL	  of	  whole	  blood	  was	  pipetted	  from	  the	  exposed	  caudal	  vein	  to	  be	  mixed	  with	  125µL	  of	  propidium	  iodide	  solution	  for	  determination	  of	  ploidy.	  I	  then	  excised	  a	  posterior	  1cm	  segment	  of	  caudal	  muscle,	  sliced	  open	  the	  cranial	  cavity	  to	  extract	  brain	  tissue,	  and	  dissected	  the	  entire	  gill	  basket	  out.	  Samples	  were	  wrapped	  in	  aluminum	  foil,	  flash	  frozen	  in	  liquid	  nitrogen,	  and	  stored	  at	  -­‐80°C.	  Capillary	  tubes	  were	  centrifuged	  at	  9200g	  to	  separate	  plasma	  from	  red	  blood	  cells.	  Plasma	  was	  removed	  and	  placed	  into	  a	  micro-­‐centrifuge	  tube,	  frozen	  in	  liquid	  nitrogen,	  and	  stored	  at	  -­‐80°C.	  	  This	  protocol	  was	  used	  for	  all	  3	  experimental	  conditions	  and	  groups.	  Fish	  were	  also	  assessed	  for	  LOE	  throughout	  the	  study.	  Any	  fish	  that	  lost	  equilibrium	  was	  prodded	  with	  a	  net,	  and	  if	  they	  could	  not	  re-­‐establish	  normal	  dorso-­‐ventral	  orientation,	  it	  was	  removed	  and	  the	  time	  of	  LOE	  was	  recorded.	  	  	  3.2.3	  Analytical	  techniques	  	   Ploidy	  was	  confirmed	  following	  the	  protocol	  outlined	  in	  Arumuganathan	  and	  Earle	  (1991)	  by	  using	  a	  FACSCalibur	  bench	  flow	  cytometer	  (BD	  Biosciences,	  California,	  USA).	  The	  triploidy	  induction	  protocol	  was	  98%	  efficient.	  	  Plasma	  was	  used	  for	  analysis	  of	  ammonia,	  cortisol,	  sodium,	  and	  chloride.	  Frozen	  plasma	  was	  thawed	  and	  10µL	  was	  removed	  for	  the	  analysis	  of	  ammonia.	  For	  all	  plasma	  ammonia	  samples,	  perchloric	  acid	  (8%)	  was	  used	  to	  dilute	  the	  thawed	  plasma	  sample,	  and	  the	  sample	  was	  spun	  for	  10	  minutes	  at	  18000g.	  The	  supernatant	  was	  	   49	  removed	  and	  neutralized	  using	  2M	  KHCO3;	  the	  neutralized	  sample	  was	  spun	  again	  to	  remove	  the	  supernatant.	  Ammonia	  values	  were	  obtained	  using	  commercial	  kits	  (Sigma;	  Cat#A0100),	  and	  use	  of	  the	  extinction	  coefficient	  of	  NADH	  at	  340nm	  of	  6,220L/molŸcm.	  For	  sodium	  and	  chloride	  measurements,	  frozen	  plasma	  was	  thawed	  and	  5µL	  of	  plasma	  was	  diluted	  200-­‐fold	  in	  dH2O.	  The	  diluted	  plasma	  sample	  was	  aliquoted	  into	  two	  separate	  tubes:	  (1)	  the	  aliquot	  was	  diluted	  an	  additional	  6-­‐fold	  followed	  by	  being	  run	  through	  a	  flame	  photometer	  (Varian	  AA240FS)	  (2)	  the	  aliquot	  of	  200-­‐fold	  diluted	  plasma	  sample	  was	  mixed	  with	  13mM	  mercuric	  thiocyanate	  and	  0.5M	  ferric	  nitrate	  and	  was	  immediately	  read	  at	  480nm	  by	  spectrophotometer	  for	  the	  determination	  of	  plasma	  chloride.	  Plasma	  cortisol	  concentration	  was	  measured	  using	  a	  commercial	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  (ELISA)	  kit	  from	  Neogen	  Corporation	  (Lexington,	  KY).	  Due	  to	  the	  small	  size	  of	  fish	  used	  in	  this	  study	  only	  10ul	  of	  plasma	  was	  available	  for	  steroid	  analysis.	  As	  a	  result,	  the	  initial	  step	  of	  the	  extraction	  process	  was	  modified	  and	  scaled	  down	  to	  use	  only	  10µl	  of	  plasma	  dissolved	  in	  100ul	  of	  ethyl	  ether.	  The	  rest	  of	  the	  protocol	  was	  carried	  out	  according	  to	  the	  manufacturer’s	  specifications.	  	  	   Liver	  and	  brain	  tissue	  was	  assessed	  for	  total	  ammonia.	  Briefly,	  sections	  of	  liver	  were	  weighed	  in	  micro-­‐centrifuge	  tubes	  and	  sonicated	  in	  8%	  perchloric	  acid	  using	  a	  micro	  ultrasonic	  cell	  disrupter	  (Kontes).	  	  The	  liver	  suspension	  was	  centrifuged	  at	  18000g	  for	  10	  minutes,	  and	  the	  supernatant	  was	  removed	  and	  neutralized	  in	  2M	  KHCO3.	  The	  neutralized	  sample	  was	  centrifuged	  again	  for	  the	  removal	  of	  the	  final	  neutralized	  supernatant.	  Brain	  samples	  were	  handled	  identically	  to	  liver	  samples	  with	  the	  exception	  of	  the	  neutralizing	  solution.	  To	  assist	  	   50	  in	  buffering	  of	  the	  neutralization,	  5M	  TRIS	  was	  used.	  To	  determine	  water	  content	  of	  the	  brain,	  portions	  of	  frozen	  brain	  tissue	  were	  allowed	  to	  thaw	  for	  3	  minutes	  before	  being	  placed	  on	  the	  scale	  for	  wet	  weights.	  After	  wet	  weights	  were	  recorded,	  samples	  were	  placed	  in	  an	  incubator	  at	  55°C.	  Dry	  weights	  were	  obtained	  after	  24h	  in	  the	  incubator,	  and	  the	  percent	  water	  and	  percent	  dry	  mass	  are	  presented	  here.	  	  3.2.4	  Statistical	  analysis	  	   All	  data	  reported	  are	  mean	  values±SEM.	  Family	  was	  collapsed	  in	  the	  statistical	  analysis	  to	  focus	  on	  the	  effects	  of	  treatment,	  strain,	  and	  ploidy.	  In	  order	  to	  test	  for	  a	  significant	  effect	  of	  ploidy	  on	  time	  to	  LOE,	  I	  collapsed	  treatment	  and	  strain	  and	  perform	  an	  independent	  2-­‐group	  Mann-­‐Whitney-­‐U	  test.	  	  	  A	  three-­‐way	  analysis	  of	  variance	  (ANOVA)	  was	  used	  on	  all	  physiological	  and	  biochemical	  measurements	  and	  treatment,	  ploidy,	  and	  strain	  were	  used	  as	  the	  fixed	  variables.	  If	  an	  interaction	  between	  fixed	  variables	  was	  seen	  to	  be	  significant,	  I	  collapsed	  non-­‐significant	  variables,	  and	  performed	  two-­‐way	  ANOVA,	  one-­‐way	  ANOVA,	  and	  Tukey-­‐post	  hoc	  tests.	  In	  the	  case	  of	  significant	  three-­‐way	  interactions,	  a	  main	  effect	  was	  isolated	  and	  a	  two-­‐way	  ANOVA	  was	  performed	  using	  the	  remaining	  main	  effects.	  Data	  was	  analyzed	  using	  R	  version	  2.15.1.	  	  	  	  	  	  	  	   51	  3.3	  Results	  	  3.3.1	  Loss	  of	  equilibrium	  	   A	  total	  of	  eight	  rainbow	  trout	  lost	  equilibrium	  in	  this	  study	  and	  they	  were	  all	  triploid	  (Figure	  3.1).	  A	  Mann-­‐Whitney-­‐U	  test	  reveled	  a	  significant	  effect	  of	  ploidy	  on	  time	  to	  loss	  of	  equilibrium	  (p=0.037).	  The	  soft	  water	  high	  pH	  treatment	  resulted	  in	  two	  fish	  losing	  equilibrium,	  one	  Blackwater	  triploid	  and	  one	  Fraser	  Valley	  triploid.	  Half	  of	  the	  Carp	  Lake	  triploid	  fish	  lost	  equilibrium	  in	  the	  hard	  water	  high	  pH	  treatment.	  	  3.3.2	  Plasma	  ions	  	   Three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p=0.0002),	  but	  no	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.135),	  strain	  (p=0.155),	  and	  no	  interaction	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.11),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.972),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.645),	  or	  strain,	  ploidy	  and	  treatment	  (p=0.789)	  on	  plasma	  sodium	  (Figure	  3.2A).	  Compared	  with	  the	  soft	  water	  controls	  (pH	  6.7),	  exposure	  to	  pH	  9.5	  resulted	  in	  a	  significant	  decrease	  in	  plasma	  sodium	  in	  both	  soft	  water	  (p=0.0002)	  and	  hard	  water	  (p=0.0003).	  	   Three-­‐way	  ANOVA	  yielded	  a	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p<0.0001),	  and	  a	  strain	  effect	  (p=0.047),	  but	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.145)	  on	  plasma	  chloride	  (Figure	  3.2B).	  There	  was	  a	  significant	  interaction	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.02),	  and	  no	  significant	  interaction	  between	  treatment	  and	  strain	  (p=0.07),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.476),	  and	  strain,	  ploidy,	  and	  treatment	  (p=0.437).	  A	  	   52	  tukey	  post-­‐hoc	  test	  showed	  that	  the	  control	  diploid	  group	  was	  significantly	  elevated	  from	  the	  soft	  water	  diploid	  (p=0.03),	  triploid	  (p<0.0001),	  and	  the	  hard	  water	  diploid	  (p<0.0001),	  and	  triploid	  (p=0.001)	  high	  pH	  groups.	  The	  control	  triploid	  group	  was	  significantly	  elevated	  from	  the	  soft	  water	  triploid	  (p<0.0001),	  and	  the	  hard	  water	  diploid	  (p<0.0001),	  and	  triploid	  (p=0.025)	  high	  pH	  groups.	  	  	  3.3.3	  Plasma	  cortisol	  	   The	  three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p<0.0001),	  and	  strain	  (p=0.0005),	  with	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.917)	  on	  plasma	  cortisol	  (Figure	  3.3).	  There	  was	  a	  significant	  interaction	  between	  treatment	  with	  ploidy	  and	  strain	  (p=0.034),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.04),	  and	  no	  significant	  interaction	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.788),	  and	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.74)	  with	  cortisol	  as	  well.	  Isolating	  the	  diploid	  groups,	  there	  is	  a	  significant	  increase	  in	  soft	  high	  pH	  Blackwater	  plasma	  cortisol	  compared	  to	  the	  control	  Blackwater	  group	  (p=0.018),	  Carp	  Lake	  group	  (p=0.0006),	  Fraser	  Valley	  group	  (p=0.0007),	  the	  soft	  water	  high	  pH	  Pennask	  (p=0.025),	  and	  the	  hard	  water	  high	  pH	  Fraser	  valley	  group	  (p=0.02).	  Isolating	  the	  triploid	  groups,	  a	  significant	  increase	  of	  plasma	  cortisol	  occurs	  in	  the	  hard	  water	  high	  pH	  Blackwater	  group	  compared	  to	  the	  control	  Blackwater	  (p=0.01),	  Carp	  Lake	  (p=0.025),	  and	  the	  hard	  water	  high	  pH	  Pennask	  group	  (p=0.011).	  	  	   	  	  	  	  	   53	  3.3.4	  Ammonia	  and	  brain	  weights	   	  	   Three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  high	  pH	  treatment	  (p<0.0001),	  and	  no	  significant	  effect	  of	  ploidy	  (p=0.316),	  and	  strain	  (p=0.086)	  on	  plasma	  ammonia	  in	  the	  rainbow	  trout.	  There	  was	  no	  significant	  interaction	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.666),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.448),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.803),	  and	  strain,	  ploidy	  and	  treatment	  (p=0.39).	  All	  groups	  experienced	  a	  4-­‐fold	  increase	  in	  plasma	  ammonia	  in	  both	  the	  hard	  water	  and	  soft	  water	  treatment	  (Figure	  3.4A).	  	  	   Three-­‐way	  ANOVA	  demonstrated	  that	  there	  was	  no	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p=0.1459),	  ploidy	  (p=0.399),	  and	  strain	  (p=0.318)	  on	  liver	  ammonia.	  There	  were	  no	  significant	  interactions	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.839),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.95),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.179),	  and	  strain,	  ploidy,	  and	  treatment	  (p=0.788)	  on	  liver	  ammonia.	  Liver	  ammonia	  was	  stable	  throughout	  all	  groups	  regardless	  of	  exposure	  treatment	  (Figure	  3.4B).	  	  	   	  A	  three-­‐way	  ANOVA	  revealed	  a	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p<0.0001),	  ploidy	  (p=0.035),	  and	  strain	  (p=0.013)	  on	  brain	  ammonia.	  There	  were	  no	  significant	  interactions	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.06),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.179),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.36),	  and	  strain,	  ploidy	  and	  treatment	  (p=0.954).	  High	  pH	  produced	  a	  2.5	  fold	  increase	  in	  brain	  ammonia	  from	  control	  values	  (Figure	  3.4C).	  	  	  	   Brain	  dry	  weights	  and	  water	  content	  did	  not	  vary	  across	  conditions	  with	  a	  three	  way	  ANOVA	  showing	  no	  significant	  effect	  of	  treatment	  (p=0.776),	  ploidy	  (p=0.21),	  and	  strain	  (p=0.31)	  (Figure	  3.5A	  and	  3.5B).	  There	  were	  no	  significant	  	   54	  interactions	  between	  treatment	  and	  ploidy	  (p=0.11),	  treatment	  and	  strain	  (p=0.971),	  strain	  and	  ploidy	  (p=0.645),	  and	  strain,	  ploidy,	  and	  treatment	  (p=0.789).	  	  	  3.4	  Discussion	  	   The	  results	  of	  this	  study	  suggest	  that	  water	  hardness	  does	  not	  affect	  the	  physiological	  responses	  of	  trout	  to	  pH	  9.5	  exposures.	  A	  total	  of	  8	  trout	  showed	  LOE	  over	  the	  24h	  of	  exposure	  to	  high	  pH	  water	  (Figure	  3.1)	  and	  6	  of	  the	  8	  fish	  that	  lost	  equilibrium	  were	  exposed	  to	  pH	  9.5	  in	  hard	  water.	  	  These	  results	  are	  in	  contrast	  to	  those	  of	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992)	  who	  observed	  no	  deaths	  during	  24h	  exposure	  to	  pH	  10.1	  in	  hard	  water	  ([CaCO3]=	  320mg/L),	  but	  had	  28.5%	  mortality	  in	  the	  trout	  exposed	  to	  pH	  10.1	  in	  soft	  water.	  Also,	  Wilson	  et	  al.	  (1998)	  did	  not	  observe	  any	  mortality	  in	  trout	  exposed	  to	  pH	  10.0	  for	  15	  days	  in	  soft	  ([CaCO3]=	  4mg/L)	  or	  hard	  ([CaCO3]=	  320mg/L)	  water.	  Clearly	  there	  is	  large	  study-­‐to-­‐study	  variation	  in	  high	  pH	  tolerance	  in	  trout.	  	  Fish	  size	  may	  be	  one	  factor	  contributing	  to	  the	  variation	  in	  high	  pH	  tolerance	  among	  studies.	  	  Compared	  to	  this	  study,	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992)	  and	  Wilson	  et	  al.	  (1998)	  used	  trout	  weighing	  over	  400g	  and	  200g,	  respectively,	  while	  I	  used	  juvenile	  trout	  weighing	  no	  more	  than	  12g.	  Weight	  has	  been	  shown	  to	  be	  an	  advantage	  as	  larger	  fish	  have	  been	  shown	  to	  have	  less	  stress-­‐induced	  sodium	  loss	  as	  shown	  following	  injection	  of	  adrenaline	  (McDonald	  and	  Milligan,	  1997),	  and	  have	  shown	  a	  greater	  capacity	  to	  adjust	  to	  seawater	  transfer	  (McCormick	  and	  Naiman,	  1984).	  Smaller	  fish	  are	  expected	  to	  experience	  greater	  osmotic	  stress	  as	  a	  result	  of	  their	  larger	  gill	  surface	  area	  to	  total	  body	  mass	  (McDonald	  and	  Milligan,	  1997).	  	   55	  Clearly,	  future	  studies	  should	  focus	  on	  the	  effects	  of	  body	  mass	  on	  high	  pH	  tolerance	  in	  trout.	  	  	   Apart	  from	  increasing	  survival	  in	  high	  pH	  water,	  the	  addition	  of	  divalent	  ions	  to	  the	  water	  was	  expected	  to	  limit	  ion	  loss	  across	  the	  gill.	  In	  the	  study	  by	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992)	  exposure	  of	  trout	  to	  hard	  ([CaCO3]=320mg/L)	  pH	  10.1	  water	  resulted	  in	  fewer	  ionic	  disturbances	  than	  in	  trout	  exposed	  to	  pH	  10.1	  in	  soft	  water	  ([CaCO3]=	  4mg/L).	  	  Plasma	  sodium	  and	  chloride	  concentrations	  significantly	  decrease	  as	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure	  (Figure	  3.2A	  and	  3.2B),	  but	  there	  was	  no	  affect	  of	  water	  hardness	  on	  plasma	  ion	  concentrations.	  Remodeling	  of	  the	  gill	  to	  a	  soft	  water	  environment	  in	  fish	  has	  been	  shown	  to	  take	  numerous	  days	  (McDonald	  and	  Rogano,	  1986;	  Greco	  et	  al.	  1996),	  and	  24h	  may	  not	  be	  sufficient	  time	  for	  the	  rainbow	  trout	  to	  interact	  with	  hard	  water	  as	  long-­‐term	  exposure	  to	  hard	  water	  has	  been	  shown	  to	  limit	  ion	  loss	  to	  the	  environment	  (McDonald	  and	  Robinson,	  1993;	  McDonald	  and	  Milligan,	  1997).	  	  	   Cortisol	  is	  a	  stress	  hormone	  that	  has	  been	  shown	  to	  increase	  the	  capacity	  for	  gill	  ion	  regulation	  by	  proliferating	  gill	  chloride	  cells	  (Laurent	  and	  Perry,	  1990;	  Laurent	  et	  al.	  1994),	  and	  increasing	  the	  activity	  of	  Na+/K+	  ATPase	  in	  trout	  (Seidelin	  et	  al.	  1999)	  and	  salmon	  (Shrimpton	  et	  al.	  1994;	  Shrimpton	  and	  McCormick,	  1999).	  Overall,	  a	  significant	  increase	  in	  plasma	  cortisol	  occurs	  as	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure,	  which	  correlates	  with	  the	  ionoregulatory	  challenge	  the	  trout	  experienced.	  The	  change	  in	  cortisol	  in	  this	  study	  is	  not	  consistent	  across	  treatments,	  with	  no	  decreased	  production	  of	  plasma	  cortisol	  as	  a	  result	  of	  exposure	  to	  hard	  high	  pH	  water	  (Figure	  3.3).	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992)	  showed	  that	  there	  was	  a	  doubling	  of	  	   56	  plasma	  cortisol	  by	  96h	  in	  their	  soft	  water	  high	  pH	  exposure	  compared	  to	  a	  stable	  level	  of	  cortisol	  in	  hard	  water	  high	  pH	  exposed	  fish.	  The	  continued	  increase	  in	  plasma	  cortisol	  was	  most	  likely	  exacerbated	  by	  the	  continuing	  decrease	  of	  plasma	  ions	  in	  their	  soft	  water	  trout	  (Yesaki	  and	  Iwama,	  1992).	  However,	  their	  results	  showed	  no	  significant	  difference	  between	  treatments	  at	  the	  24h	  time	  point,	  similar	  to	  the	  results	  presented	  here.	  	   My	  study	  showed	  no	  differences	  between	  soft	  and	  hard	  water	  in	  terms	  of	  ammonia	  accumulation	  in	  high	  pH.	  Hard	  water	  has	  been	  shown	  to	  improve	  the	  excretion	  rate	  of	  ammonia	  across	  the	  gill	  (Yesaki	  and	  Iwama,	  1992;	  Wilson	  et	  al.	  1998),	  and	  was	  expected	  to	  limit	  ammonia	  accumulation	  in	  the	  plasma,	  liver,	  and	  brain	  tissue.	  Plasma	  ammonia,	  however,	  increases	  3-­‐fold	  after	  24h	  in	  both	  high	  pH	  conditions	  (Figure	  3.4A).	  	  This	  is	  consistent	  with	  other	  studies	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  et	  al.	  1994;	  Wilson	  et	  al.	  1994;	  McGeer	  and	  Eddy,	  1998),	  but	  does	  not	  demonstrate	  a	  benefit	  of	  hard	  water.	  Liver	  ammonia	  also	  did	  not	  change	  in	  any	  condition	  during	  the	  exposure	  (Figure	  3.4B),	  which	  is	  in	  contrast	  to	  the	  result	  obtained	  by	  Wilson	  et	  al.	  (1998),	  who	  demonstrated	  a	  significant	  doubling	  of	  liver	  ammonia	  in	  soft	  water	  (pH	  10).	  Wilson	  et	  al.	  (1998)	  reported	  that	  their	  rainbow	  trout	  were	  capable	  of	  maintaining	  control	  levels	  of	  brain	  ammonia	  throughout	  their	  high	  pH	  exposure.	  The	  3-­‐fold	  increase	  in	  brain	  ammonia	  I	  report	  in	  this	  study	  is	  consistent	  with	  the	  trend	  presented	  in	  the	  previous	  experiment	  (Chapter	  2).	  The	  significant	  3-­‐fold	  increase	  in	  brain	  ammonia	  (Figure	  3.4C)	  as	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure	  indirectly	  suggests	  that	  protective	  metabolites	  such	  as	  glutamine	  are	  being	  produced.	  An	  immediate	  increase	  in	  brain	  glutamine	  occurs	  in	  conjunction	  with	  an	  	   57	  increase	  in	  ammonia	  (Sanderson	  et	  al.	  2010;	  Chapter	  2),	  in	  an	  apparent	  attempt	  to	  protect	  the	  brain	  from	  a	  lethal	  ammonia	  load.	  The	  brain	  water	  content	  suggests	  that	  while	  the	  metabolite	  concentration	  rises	  the	  organism	  maintains	  the	  osmolarity	  of	  the	  brain	  (Figure	  3.5A).	  Rainbow	  trout	  have	  been	  shown	  to	  accumulate	  water	  in	  response	  to	  a	  high	  level	  of	  external	  ammonia	  (Sidhu,	  2012),	  and	  increased	  water	  content	  may	  have	  resulted	  in	  increased	  cranial	  pressure	  and	  mortality.	  However,	  water	  content	  of	  the	  brain	  does	  not	  increase	  with	  high	  pH	  exposure,	  suggesting	  that	  the	  brain	  does	  not	  swell	  in	  response	  to	  high	  pH	  water	  (Figure	  3.5A).	  	  	   There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  ploidy	  on	  LOE	  during	  high	  pH	  exposure	  (both	  soft	  water	  and	  hard	  water	  combined;	  Figure	  3.1).	  Across	  all	  measurements,	  only	  brain	  ammonia	  accumulation	  at	  high	  pH	  showed	  a	  ploidy	  effect	  with	  diploid	  trout	  having	  lower	  brain	  ammonia	  than	  triploid	  trout	  (Figure	  3.4C),	  suggesting,	  albeit	  tentatively,	  a	  link	  between	  the	  increased	  LOE	  in	  triploid	  trout	  at	  high	  pH	  and	  brain	  ammonia	  accumulation.	  	  However,	  the	  levels	  of	  ammonia	  in	  the	  brain	  tissue	  of	  triploids	  are	  lower	  than	  the	  values	  obtained	  from	  my	  previous	  study	  (Chapter	  2)	  and	  those	  obtained	  during	  exposure	  to	  high	  external	  ammonia	  (Sanderson	  et	  al.	  2010),	  suggesting	  that	  despite	  the	  difference	  brain	  ammonia	  results	  are	  within	  physiologically	  manageable	  levels.	  	  	   Comparing	  this	  study	  to	  my	  previous	  work	  shows	  that	  there	  is	  great	  year-­‐to-­‐year	  variation	  in	  high	  pH	  tolerance,	  as	  we	  did	  not	  observe	  a	  significant	  strain	  effect	  in	  the	  present	  study	  yet	  a	  significant	  ploidy	  effect	  is	  obtained	  that	  was	  absent	  in	  previous	  experiments	  (Chapter	  2).	  The	  previous	  study	  demonstrated	  a	  pronounced	  sensitivity	  of	  rainbow	  trout	  to	  high	  pH	  water,	  with	  the	  domesticated	  Fraser	  Valley	  	   58	  strain	  outperforming	  wild	  strains	  in	  terms	  of	  duration	  to	  high	  pH	  exposure	  (Chapter	  2).	  The	  Fraser	  Valley	  strain	  saw	  limited	  LOE	  in	  a	  multi-­‐day	  high	  pH	  (9.5)	  exposure	  over	  consecutive	  years,	  while	  all	  wild	  strains	  began	  to	  lose	  equilibrium	  hours	  into	  each	  assessment	  (Chapter	  2).	  Individual	  trout	  begin	  to	  lose	  equilibrium	  within	  24h	  into	  this	  study,	  but	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  does	  not	  exhibit	  the	  same	  tolerance	  I	  noted	  in	  previous	  years.	  Domestication	  has	  been	  shown	  to	  benefit	  trout	  in	  terms	  of	  limiting	  cortisol	  production	  in	  high	  stress	  environments	  (Woodward	  and	  Strange,	  1987),	  and	  although	  I	  report	  a	  significant	  strain	  effect	  in	  my	  fish	  in	  regards	  to	  plasma	  cortisol,	  only	  the	  Blackwater	  strain	  is	  significantly	  elevated	  from	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  in	  the	  soft	  water	  high	  pH	  treatment.	  	  	  3.5	  Conclusions	  	  	   Hard	  water	  did	  not	  significantly	  reduce	  ammonia	  accumulation,	  the	  production	  of	  cortisol,	  or	  limit	  ion	  loss	  to	  the	  environment.	  Furthermore,	  hard	  water	  provided	  no	  benefit	  in	  terms	  of	  time	  to	  LOE	  amongst	  the	  rainbow	  trout	  used	  in	  this	  study.	  Given	  the	  immediate	  exposure	  of	  the	  trout	  to	  the	  environment,	  an	  adjustment	  period	  may	  be	  required	  to	  fully	  take	  advantage	  of	  the	  water	  chemistry.	  However,	  this	  is	  similar	  to	  what	  the	  trout	  would	  experience	  during	  lake	  stocking,	  suggesting	  that	  the	  immediate	  exposure	  may	  be	  lethal.	  A	  longer-­‐term	  study	  would	  be	  required	  for	  the	  effect	  that	  hard	  water	  evokes	  on	  the	  survival	  of	  the	  trout,	  and	  is	  warranted,	  as	  many	  lakes	  in	  BC	  possess	  nearly	  double	  the	  hardness	  (as	  CaCO3)	  used	  in	  this	  study.	  I	  note	  that	  there	  is	  a	  ploidy	  effect	  of	  high	  pH	  water	  in	  my	  trout,	  one	  that	  was	  not	  present	  in	  previous	  years.	  The	  outright	  cause	  of	  increased	  LOE	  in	  triploid	  fish	  is	  	   59	  unknown,	  but	  is	  unlikely	  to	  be	  a	  result	  of	  the	  physiological	  measurements	  made	  here.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   60	  Figures	  	   	  	  Figure	  3.1:	  Number	  of	  fish	  showing	  a	  loss	  of	  equilibrium	  over	  24h	  exposure	  to	  soft	  water	  at	  pH	  6.7	  (control;	  black	  bars),	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  (soft	  pH	  9.5;	  grey	  bars)	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  (hard	  pH	  9.5;	  open	  bars).	  	  Blackwater	  (Bw),	  Pennask	  (Pn),	  Carp	  Lake	  (CL),	  and	  Fraser	  Valley	  (FV)	  strains	  as	  both	  diploids	  (2n)	  and	  triploids	  (3n).	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   61	  	  	  Figure	  3.2:	  Plasma	  sodium	  (A)	  and	  chloride	  (B)	  in	  the	  Blackwater	  (Bw),	  Pennask	  (Pn),	  Carp	  Lake	  (CL),	  and	  Fraser	  Valley	  (FV)	  strains,	  as	  both	  diploid	  (2n)	  and	  triploid	  (3n),	  exposed	  for	  24h	  to	  soft	  water	  at	  pH	  6.7	  (controls;	  black	  bars),	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  (grey	  bars),	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  (open	  bars)	  (n=6-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  for	  the	  CL	  3n	  (n=4)	  and	  FV	  groups	  (n=1-­‐4)).	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  and	  interactions	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	  	   62	  	  	  Figure	  3.3:	  Total	  plasma	  cortisol	  in	  the	  Blackwater	  (Bw),	  Pennask	  (Pn),	  Carp	  Lake	  (CL),	  and	  Fraser	  Valley	  (FV)	  strains,	  as	  both	  diploid	  (2n)	  and	  triploid	  (3n),	  exposed	  for	  24h	  to	  soft	  water	  at	  pH	  6.7	  (controls;	  black	  bars),	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  (grey	  bars),	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  (open	  bars)	  (n=6-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  for	  the	  CL	  3n	  (n=4)	  and	  FV	  groups	  (n=2-­‐4)).	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  and	  interactions	  are	  denoted	  on	  figure.	  	  	  	  	  	  	  	  	   63	  	  	  Figure	  3.4:	  Total	  ammonia	  in	  the	  plasma	  (A),	  liver	  (B),	  and	  brain	  (C)	  in	  the	  Blackwater	  (Bw),	  Pennask	  (Pn),	  Carp	  Lake	  (CL),	  and	  Fraser	  Valley	  (FV)	  strains,	  as	  both	  diploid	  (2n)	  and	  triploid	  (3n),	  exposed	  for	  24h	  to	  soft	  water	  at	  pH	  6.7	  (controls;	  black	  bars),	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  (grey	  bars),	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  (open	  bars)	  (n=6-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  for	  the	  CL	  3n	  (n=4)).	  P	  values	  from	  significant	  main	  effects	  and	  interactions	  are	  denoted	  on	  figure.	  	   64	  	  	  	  Figure	  3.5:	  Percent	  composition	  of	  the	  brain	  in	  terms	  of	  water	  (A)	  and	  dry	  mass	  (B)	  in	  the	  Blackwater	  (Bw),	  Pennask	  (Pn),	  Carp	  Lake	  (CL),	  and	  Fraser	  Valley	  (FV)	  strains,	  as	  both	  diploid	  (2n)	  and	  triploid	  (3n),	  exposed	  for	  24h	  to	  soft	  water	  at	  pH	  6.7	  (controls;	  black	  bars),	  soft	  water	  at	  pH	  9.5	  (grey	  bars),	  and	  hard	  water	  at	  pH	  9.5	  (open	  bars)	  (n=6-­‐8	  for	  all	  groups	  except	  for	  the	  CL	  3n	  (n=4)).	  	  	  	   65	  [4]	  General	  Discussion	  	  4.1	  The	  effects	  of	  strain	  and	  ploidy	  on	  the	  physiological	  response	  of	  trout	  to	  pH	  9.5	  water	  	   The	  results	  suggest	  that	  among	  all	  the	  trout	  strains	  examined	  in	  this	  study,	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  is	  best	  suited	  for	  stocking	  to	  high	  pH	  lakes.	  In	  2011	  and	  2012	  the	  Fraser	  Valley	  domesticated	  strain	  showed	  significantly	  less	  LOE	  in	  pH	  9.5	  water	  (Figure	  2.1;	  Figure	  2.3)	  compared	  with	  the	  wild	  strains	  of	  trout	  investigated	  in	  this	  study.	  The	  most	  dramatic	  difference	  between	  strains	  occurred	  in	  my	  first	  experiment	  in	  2011	  (Figure	  2.1),	  with	  more	  than	  30%	  of	  wild	  strains	  losing	  equilibrium	  within	  the	  first	  12h	  exposure	  to	  pH	  9.5	  and	  over	  80%	  of	  wild	  strains	  losing	  equilibrium	  by	  24h.	  Due	  to	  the	  variation	  in	  the	  results	  between	  years	  I	  cannot	  conclusively	  state	  whether	  ploidy	  affects	  high	  pH	  tolerance.	  In	  the	  2013	  study,	  all	  fish	  that	  lost	  equilibrium	  were	  triploid,	  with	  no	  diploid	  fish	  succumbing	  to	  high	  pH	  in	  the	  24h	  experiment.	  However,	  the	  2011	  and	  2012	  studies	  showed	  no	  difference	  in	  loss	  of	  equilibrium	  between	  the	  ploidies.	  	  	   Each	  year	  used	  a	  slightly	  different	  exposure	  protocol	  to	  increase	  pH	  to	  9.5	  (2011	  6h	  gradual	  increase	  in	  pH;	  2012	  1h	  gradual	  increase	  in	  pH;	  2013	  immediate	  transfer),	  but	  the	  trout	  consistently	  exhibited	  sensitivity	  to	  high	  pH.	  My	  finding	  that	  high	  pH	  elicits	  an	  extreme	  response	  is	  in	  contrast	  to	  various	  other	  studies	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1991;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilson	  et	  al.	  1998),	  which	  instead	  show	  that	  rainbow	  trout	  are	  capable	  of	  prolonged	  survival	  in	  high	  pH.	  As	  discussed	  in	  chapter	  2,	  various	  other	  factors	  play	  a	  role	  in	  determining	  tolerance	  in	  a	  high	  pH	  medium.	  	   66	  Very	  few	  conditions	  overlap	  across	  studies	  as	  many	  use	  larger	  organisms,	  performed	  their	  experiments	  in	  different	  seasons,	  had	  remarkably	  different	  rearing	  conditions,	  and	  used	  brood	  stocks	  of	  rainbow	  trout	  from	  very	  different	  environments	  (Wright	  and	  Wood,	  1985;	  Yesaki	  and	  Iwama,	  1992;	  Wilson	  et	  al.	  1994;	  Wilkie	  et	  al.	  1996;	  Wilson	  et	  al.	  1998;	  Laurent	  et	  al.	  2000;	  Wood	  and	  Nawata,	  2011).	  	  	  	   The	  exposure	  to	  a	  high	  pH	  environment	  caused	  the	  retention	  of	  ammonia	  in	  various	  tissues	  across	  the	  body,	  and	  changes	  in	  ion	  levels	  of	  the	  rainbow	  trout,	  but	  there	  were	  no	  physiological	  disturbances	  that	  were	  different	  between	  domestic	  and	  wild	  fish.	  All	  fish	  experienced	  increases	  in	  plasma	  ammonia	  (Figure	  2.3A;	  Figure	  3.4A),	  brain	  ammonia	  	  (Figure	  2.5A;	  Figure	  3.4C)	  brain	  glutamine	  (Figure	  2.5C),	  and	  plasma	  lactate	  (Figure	  2.6C),	  with	  decreases	  in	  brain	  glutamate	  (Figure	  2.5B),	  plasma	  sodium	  (Figure	  3.2A),	  and	  plasma	  chloride	  (Figure	  2.6B;	  Figure	  3.2A).	  All	  these	  changes	  are	  within	  physiological	  levels	  that	  have	  previously	  been	  reported.	  My	  values	  for	  ammonia	  accumulation	  in	  plasma	  and	  tissues	  are	  similar	  to	  those	  seen	  in	  the	  literature	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1995;	  Wilson	  et	  al.	  1998;	  Wang	  et	  al.	  2003;	  Zimmer	  et	  al.	  2013),	  with	  glutamate,	  and	  glutamine	  levels	  well	  within	  those	  reported	  in	  high	  ammonia	  studies	  (Arillo	  et	  al.	  1981;	  Sanderson	  et	  al.	  2010).	  There	  is	  a	  significant	  increase	  in	  brain	  ammonia	  across	  triploids	  coinciding	  with	  the	  increased	  LOE	  of	  triploid	  fish	  in	  the	  2013	  study,	  but	  the	  values	  measured	  were	  lower	  than	  those	  collected	  in	  groups	  from	  the	  2012	  study	  and	  are	  half	  of	  what	  has	  been	  noted	  in	  high	  external	  ammonia	  studies	  (Sanderson	  et	  al.	  2010).	  It	  should	  be	  noted	  that	  the	  ion	  levels	  presented	  in	  this	  study	  are	  below	  what	  	   67	  is	  commonly	  seen	  in	  literature	  (Wood	  and	  Randall,	  1973;	  Wilkie	  et	  al.	  1999).	  Given	  the	  remarkably	  soft	  water	  used	  in	  the	  rearing	  conditions	  (<17.9mg/L)	  a	  loss	  of	  plasma	  ions	  is	  not	  surprising	  as	  a	  result	  of	  ions	  leaking	  out	  across	  the	  gill	  to	  the	  hypo-­‐osmotic	  environment	  (Mcdonald	  and	  Rogano,	  1986).	  This	  could	  result	  in	  the	  subsequent	  establishment	  of	  a	  lower	  steady-­‐state	  condition.	  The	  physiological	  measurements	  made	  in	  chapters	  2	  and	  3	  were	  chosen	  because	  previous	  studies	  had	  indicated	  that	  they	  were	  most	  affected	  by	  high	  pH	  exposures.	  The	  results	  suggest	  that	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  is	  more	  tolerant	  of	  high	  pH,	  and	  that	  the	  wild	  strains	  are	  more	  sensitive	  to	  high	  pH	  water,	  but	  no	  physiological	  measurement	  yielded	  a	  clear	  difference	  between	  domestic	  and	  wild	  fish.	  As	  I	  only	  sampled	  surviving	  fish,	  my	  measurements	  cannot	  elucidate	  the	  underlying	  cause	  of	  LOE	  in	  high	  pH.	  	   	  4.2	  The	  effects	  of	  water	  hardness	  on	  the	  physiological	  response	  to	  high	  pH	  water	  of	  various	  strains	  and	  ploidies	  of	  rainbow	  trout	  	   	  	   Exposure	  to	  hard	  water	  did	  not	  change	  the	  physiological	  response	  of	  any	  strain	  or	  ploidy	  to	  high	  pH	  water.	  All	  groups	  experienced	  significant	  increases	  in	  plasma	  and	  brain	  ammonia,	  and	  significant	  decreases	  in	  plasma	  sodium	  and	  chloride.	  The	  most	  notable	  outcome	  of	  the	  hard	  water	  exposure	  was	  the	  significant	  effect	  of	  ploidy	  on	  high	  pH,	  as	  presented	  in	  the	  LOE	  data.	  The	  only	  trout	  to	  lose	  equilibrium	  throughout	  the	  high	  pH	  exposure	  were	  triploid,	  and	  this	  corresponded	  to	  a	  significant	  accumulation	  of	  brain	  ammonia.	  Originally	  I	  assumed	  that	  hard	  water	  exposed	  fish	  would	  exhibit	  an	  advantage	  over	  soft	  water	  exposed	  fish	  during	  high	  pH	  exposure	  because	  of	  the	  previous	  work	  done	  by	  Yesaki	  and	  Iwama	  (1992).	  	   68	  However,	  the	  results	  presented	  here	  suggest	  that	  all	  physiological	  changes	  are	  a	  result	  of	  high	  pH	  exposure	  rather	  than	  hard	  water.	  	  	   	  	  4.3	  Recommendations	  and	  future	  research	  	   Despite	  the	  results	  suggesting	  that	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  show	  greater	  pH	  tolerance,	  I	  do	  not	  believe	  they	  would	  be	  an	  effective	  strain	  to	  stock	  in	  the	  wild.	  While	  the	  Fraser	  Valley	  have	  proven	  to	  be	  rather	  successful	  in	  lab	  trials	  (Scott,	  2012;	  Chapter	  2)	  the	  translation	  to	  high	  performance	  in	  the	  wild	  setting	  has	  been	  disappointing.	  As	  mentioned	  earlier,	  domestication	  has	  been	  shown	  to	  be	  advantageous	  in	  exposures	  to	  abiotic	  stressors	  in	  trout	  (Woodword	  and	  Strange,	  1987;	  Lepage	  et	  al.	  2001;	  Scott,	  2012),	  theorized	  to	  be	  due	  to	  a	  reduced	  cortisol	  response	  post-­‐stress	  (Woodward	  and	  Strange,	  1987;	  Pottinger	  and	  Carrick,	  1999).	  Domestication	  selects	  for	  growth	  rate	  and	  size	  and	  often	  performs	  poorly	  in	  the	  wild	  (Brauhn	  and	  Kincaid,	  1982;	  Huntingford,	  2004;	  Araki	  et	  al.	  2008)	  as	  a	  result	  of	  their	  increased	  aggression	  and	  risk	  taking	  behavior	  (Vincent,	  1960;	  Johnsson	  and	  Abrahams,	  1991;	  Biro	  et	  al.	  2004).	  The	  domesticated	  strain	  performance	  in	  this	  study	  may	  be	  an	  artifact	  of	  generations	  in	  aquaculture,	  adjusting	  to	  confined	  quarters,	  multiple	  handlings,	  and	  sudden	  changes	  in	  water	  parameters.	  	  Crosses	  with	  the	  Fraser	  Valley	  strain	  may	  potentially	  enhance	  the	  capability	  of	  wild	  strains	  to	  environmental	  extremes,	  or	  reduce	  their	  survival	  by	  alteration	  of	  a	  phenotype	  that	  has	  been	  selected	  for	  by	  nature.	  	  	   I	  would	  recommend	  the	  implementation	  of	  a	  process	  that	  selects	  individuals	  amongst	  the	  wild	  strains	  that	  exhibit	  greater	  tolerance	  of	  a	  high	  pH	  environment.	  	   69	  My	  LOE	  observations	  demonstrate	  that	  there	  are	  individuals	  that	  are	  capable	  of	  surviving	  for	  extended	  periods	  of	  time	  in	  high	  pH,	  and	  selecting	  for	  these	  organisms	  may	  yield	  offspring	  that	  are	  also	  high	  pH	  tolerant.	  However,	  this	  warrants	  future	  work	  in	  determining	  if	  pH	  tolerance	  is	  genetically	  heritable.	  Another	  facet	  of	  tolerance	  may	  be	  exposure	  time,	  or	  acclimation	  time.	  Pre-­‐exposure	  to	  reasonably	  high	  pH	  (8.0	  and	  above)	  may	  allow	  the	  organism	  time	  to	  adjust	  physiologically	  to	  a	  pH	  a	  magnitude	  higher	  in	  lake	  settings	  (Wilkie	  and	  Wood,	  1994;	  Wilkie	  and	  Wood,	  1995;	  Wilkie	  et	  al.	  1996).	  The	  change	  from	  the	  holding	  conditions	  (pH	  6.7)	  to	  the	  experimental	  pH	  (9.5)	  may	  have	  been	  the	  cause	  of	  fish	  losing	  equilibrium	  in	  my	  study.	  	   Future	  studies	  should	  be	  geared	  towards	  studying	  the	  effects	  of	  long-­‐term	  exposure	  to	  high	  pH.	  All	  the	  studies	  presented	  in	  this	  thesis	  are	  limited	  in	  duration,	  with	  the	  longest	  exposure	  lasting	  72h.	  With	  lakes	  in	  BC	  expected	  to	  reach	  a	  pH	  of	  9.5,	  exploring	  whether	  or	  not	  stocked	  strains	  are	  capable	  of	  adjusting	  to	  a	  high	  pH	  in	  the	  long-­‐term	  is	  paramount.	  Lahontan	  cutthroat	  trout	  exposed	  to	  highly	  alkaline	  lake	  water	  (pH	  9.4)	  for	  two	  years	  experienced	  a	  suite	  of	  changes	  to	  adjust	  long-­‐term,	  with	  increases	  in	  chloride	  cell	  density,	  plasma	  ammonia,	  and	  internal	  pH	  (Wilkie	  et	  al.	  1994).	  In	  the	  2012	  study,	  the	  number	  of	  fish	  losing	  equilibrium	  is	  limited	  after	  24h,	  suggesting	  that	  there	  is	  a	  critical	  period	  of	  adjustment,	  and	  that	  there	  are	  individuals	  in	  these	  stocks	  capable	  of	  greater	  high	  pH	  tolerance.	  A	  potential	  experiment	  would	  be	  to	  run	  a	  larger	  group	  of	  trout	  in	  a	  high	  pH	  exposure	  over	  6	  months,	  with	  measurements	  directed	  to	  ammonia	  and	  ion	  balance.	  One	  could	  hypothesize	  that	  fish	  capable	  of	  surviving	  longer	  in	  a	  high	  pH	  environment	  would	  	   70	  have	  similar	  histological	  and	  physiological	  changes	  as	  those	  seen	  in	  Lahontan	  cutthroat	  trout.	  	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   71	  References	  	  Allen,	  S.	  K.,	  &	  Stanley,	  J.	  G.	  (1979).	  Polyploid	  Mosaics	  Induced	  by	  Cytochalasin	  B	  in	  Landlocked	  Atlantic	  Salmon,	  Salmo	  salar.	  Transactions	  of	  the	  American	  Fisheries	  Society,	  108(5),	  462–466.	  Anderson,	  P.	  M.	  (2001).	  Urea	  and	  glutamine	  synthesis:	  environmental	  influences	  on	  nitrogen	  excretion.	  Fish	  Physiology,	  20,	  239–277.	  Araki,	  H.,	  Berejikian,	  B.	  A.,	  Ford,	  M.	  J.,	  &	  Blouin,	  M.	  S.	  (2008).	  Fitness	  of	  hatchery-­‐	   reared	  salmonids	  in	  the	  wild.	  Evolutionary	  Applications,	  1(2),	  342-­‐355.	  Arillo,	  A.,	  Margiocco,	  C.,	  Melodia,	  F.,	  Mensi,	  P.,	  &	  Schenone,	  G.	  (1981).	  Ammonia	  Toxicity	  Mechanism	  in	  Fish:	  Studies	  on	  Rainbow	  Trout	  (Salmo	  gairdneri	  rich.).	  Exotoxicology	  and	  Environmental	  Safety,	  5,	  316–328.	  Arumuganathan,	  E.,	  &	  Earle,	  E.	  D.	  (1991).	  Nuclear	  DNA	  content	  of	  some	  important	  plant	  species.	  Plant	  Molecular	  Biology	  Reporter,	  9(3),	  208–218.	  Avella,	  M.,	  Masoni,	  A.,	  Bornancin,	  M.,	  &	  Mayer-­‐Gostan,	  N.	  (1987).	  Gill	  morphology	  and	  sodium	  influx	  in	  the	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri)	  acclimated	  to	  artificial	  freshwater	  environments.	  Journal	  of	  Experimental	  Zoology,	  241(2),	  159–169.	  Beatty,	  R.	  A.	  (1970).	  The	  Genetics	  of	  the	  Mammalian	  gamete.	  Biological	  Reviews,	  45(1),	  73–117.	  Behnke,	  R.	  J.	  (1972).	  The	  rationale	  for	  preserving	  genetic	  diversity:	  examples	  of	  the	  utilisation	  of	  intraspecific	  races	  of	  salmonid	  fishes	  in	  fisheries	  management.	  Proceedings	  of	  the	  Annual	  Conference	  Western	  Association	  of	  State	  Game	  and	  	   72	  Fish	  Commissioners,	  52,	  559–561.	  Behnke,	  R.	  J.	  (1979).	  The	  native	  trouts	  of	  the	  genus	  Salmo	  of	  western	  North	  America.	  Report	  to	  US	  Fish	  and	  Wildlife	  Service,	  Denver,	  Colorado.	  Benhke,	  R.	  J.	  (2010).	  Trout	  and	  salmon	  of	  North	  America.	  Simon	  and	  Schuster.	  Bergmeyer,	  H.	  U.	  (1983).	  Methods	  of	  Enzymatic	  Analysis.	  New	  York:	  Academic	  Press.	  Biro,	  P.	  A.,	  Abrahams,	  M.	  V.,	  Post,	  J.	  R.,	  &	  Parkinson,	  E.	  A.	  (2004).	  Predators	  select	  against	  high	  growth	  rates	  and	  risk–taking	  behaviour	  in	  domestic	  trout	  populations.	  Proceedings	  of	  the	  Royal	  Society	  of	  London	  B:	  Biological	  Sciences,	  271(1554),	  2233–2237.	  Blanc,	  J.	  M.,	  Poisson,	  H.,	  &	  Vallee,	  F.	  (1992).	  Survival,	  growth	  and	  sexual	  maturation	  of	  the	  triploid	  hybrid	  between	  rainbow	  trout	  and	  arctic	  char.	  Aquatic	  Living	  Resource,	  5,	  15–21.	  Blaxhall,	  P.	  C.,	  &	  Daisley,	  K.	  W.	  (1973).	  Routine	  haematological	  methods	  for	  use	  with	  	   fish	  blood.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  5(6),	  771-­‐781.	  Brauhn,	  J.	  L.,	  &	  Kincaid,	  H.	  (1982).	  Survival,	  Growth,	  and	  Catchability	  of	  Rainbow	  Trout	  of	  Four	  Strains.	  North	  American	  Journal	  of	  Fisheries	  Management,	  2(1),	  1–10.	  Cameron,	  J.	  N.,	  &	  Heisler,	  N.	  (1983).	  Studies	  of	  ammonia	  in	  the	  rainbow	  trout:	  	   physio-­‐chemical	  parameters,	  acid-­‐base	  behaviour	  and	  respiratory	  	   clearance.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  105(1),	  107-­‐125.	  Chourrout,	  D.	  (1984).	  Pressure-­‐induced	  retention	  of	  second	  polar	  body	  and	  suppression	  of	  first	  cleavage	  in	  rainbow	  trout:	  Production	  of	  all-­‐triploids,	  all-­‐tetraploids,	  and	  heterozygous	  and	  homozygous	  diploid	  gynogenetics.	  	   73	  Aquaculture,	  36(1-­‐2),	  111–126.	  Clarke,	  A.	  2012.	  Rainbow	  trouts	  strains	  stocked	  in	  British	  Columbia:	  matching	  fish	  charateristics	  with	  habitat	  to	  maximize	  fishing	  quality.	  BCO	  Sport	  Fishing.	  69:	  20-­‐26	  Cuellar,	  O.,	  &	  Uyeno,	  T.	  (1972).	  Triploidy	  in	  rainbow	  trout.	  Cytogenetics,	  11,	  508–515.	  Daye,	  P.	  G.,	  &	  Garside,	  E.	  T.	  (1975).	  Lethal	  levels	  of	  pH	  for	  brook	  trout,	  Salvelinus	  fontinalis	  (Mitchill).	  Canadian	  Journal	  of	  Zoology,	  53,	  639–641.	  Daye,	  P.	  G.,	  &	  Garside,	  E.	  T.	  (1976).	  Histopathologic	  changes	  in	  surficial	  tissues	  of	  brook	  trout,	  Salvelinus	  fontinalis	  (Mitchill),	  exposed	  to	  acute	  and	  chronic	  levels	  of	  pH.	  Canadian	  Journal	  of	  Zoology,	  54,	  2140–2155.	  Depeche,	  J.,	  Gilles,	  R.,	  Daufresne,	  S.,	  &	  Chiapello,	  H.	  (1979).	  Urea	  content	  and	  urea	  production	  via	  the	  ornithine-­‐urea	  cycle	  pathway	  during	  the	  ontogenic	  development	  of	  two	  teleost	  fishes.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology	  Part	  A:	  Physiology,	  63(1),	  51–56.	  DiBattista,	  J.	  D.,	  Anisma,	  H.,	  Whitehead,	  M.,	  &	  Gilmour,	  K.	  M.	  (2005).	  The	  effects	  of	  cortisol	  administration	  on	  social	  status	  and	  brain	  monoaminergic	  activity	  in	  rainbow	  trout,	  Oncorhynchus	  mykiss.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  208,	  2707–2718.	  Dillon,	  J.	  C.,	  Schill,	  D.	  J.,	  &	  Teuscher,	  D.	  M.	  (2000).	  Relative	  Return	  to	  Creel	  of	  Triploid	  and	  Diploid	  Rainbow	  Trout	  Stocked	  in	  Eighteen	  Idaho	  Streams.	  North	  American	  Journal	  of	  Fisheries	  Management,	  20,	  1–9.	  Dunn,	  H.	  O.,	  McEntee,	  K.,	  &	  Hansel,	  W.	  (1970).	  Diploid-­‐triploid	  chimerism	  in	  a	  bovine	  	   74	  true	  hermaphrodite.	  Cytogenetic	  and	  Genome	  Research,	  9(4),	  245–259.	  Eddy,	  F.	  B.	  (1975).	  The	  effect	  of	  calcium	  on	  gill	  potentials	  and	  on	  sodium	  and	  chloride	  fluxes	  in	  the	  goldfish,	  Carassius	  auratus.	  Journal	  of	  Comparative	  Physiology,	  96(2),	  131–142.	  Eddy,	  F.	  B.	  (1976).	  Acid-­‐base	  balance	  in	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri)	  subjected	  to	  acid	  stresses.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  64,	  159–171.	  Emerson,	  K.,	  Russo,	  R.	  C.,	  Lund,	  R.	  E.,	  &	  Thurston,	  R.	  V.	  (1975).	  Aqueous	  Ammonia	  Equilibrium	  Calculations:	  Effect	  of	  pH	  and	  Temperature.	  Journal	  of	  the	  Fisheries	  Research	  Board	  of	  Canada,	  32(12),	  2379–2383.	  Evans,	  D.	  H.	  (2011).	  Freshwater	  Fish	  Gill	  Ion	  Transport:	  August	  Krogh	  to	  morpholinos	  and	  microprobes.	  Acta	  Physiologica,	  202,	  349–359.	  Evans,	  D.	  H.,	  Piermarini,	  P.	  M.,	  &	  Choe,	  K.	  P.	  (2005).	  The	  Multifunctional	  Fish	  Gill:	  Dominant	  Site	  of	  Gas	  Exchange,	  Osmoregulation,	  Acid-­‐Base	  Regulation,	  and	  Excretion	  of	  Nitrogenous	  Waste.	  Physiological	  Review,	  85,	  97–177.	  Evans,	  D.	  H.,	  Piermarini,	  P.	  M.,	  &	  Potts,	  W.	  T.	  W.	  (1999).	  Ionic	  Transport	  in	  the	  Fish	  Gill	  Epithelium.	  Journal	  of	  Experimental	  Zoology,	  283,	  641–652.	  Fechheimer,	  N.	  S.,	  Isakova,	  G.	  K.,	  &	  Belyaev,	  D.	  K.	  (1983).	  Mechanisms	  involved	  in	  the	  spontaneous	  occurrence	  of	  diploid-­‐triploid	  chimerism	  in	  the	  mink	  (Mustela	  vison)	  and	  chicken	  (Gallus	  domesticus).	  Cytogenetic	  and	  Genome	  Research,	  35(4),	  238–243.	  Felip,	  A.,	  Carrillo,	  M.,	  Herraez,	  M.	  P.,	  Zanuy,	  S.,	  &	  Basurco,	  B.	  (2009).	  Protocol	  F	  -­‐	  Induction	  of	  triploidy	  by	  cold	  shock	  [Pratical	  guide	  of	  protocols:	  chromosome	  set	  manipulation].	  Mediterranean	  Options:	  Series	  B.	  Studies	  and	  Research,	  63,	  	   75	  43–48.	  Ferguson,	  R.	  A.,	  Kieffer,	  J.	  D.,	  &	  Tufts,	  B.	  L.	  (1993).	  The	  effects	  of	  Body	  Size	  on	  the	  Acid-­‐Base	  and	  Metabolite	  Status	  in	  the	  white	  Muscle	  of	  Rainbow	  trout	  before	  and	  after	  exhaustive	  exercise.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  180,	  195–207.	  Fevolden,	  S.	  E.,	  Refstie,	  T.,	  &	  Roed,	  K.	  H.	  (1991).	  Selection	  for	  high	  and	  low	  cortisol	  stress	  response	  in	  Atlantic	  salmon	  (Salmo	  salar)	  and	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  Aquaculture,	  95(1-­‐2),	  53–65.	  Freshwater	  Fisheries	  Society	  of	  British	  Columbia.	  2004.	  Rainbow	  trout	  strains	  currently	  stocked	  in	  BC	  waters.	  	  Galbreath,	  P.	  F.,	  St.	  Jean,	  W.,	  Anderson,	  V.,	  &	  Thorgaard,	  G.	  H.	  (1994).	  Freshwater	  performance	  of	  all-­‐female	  diploid	  and	  triploid	  Atlantic	  salmon.	  Aquaculture,	  128,	  41–49.	  Gillet,	  C.,	  Vauchez,	  C.,	  &	  Haffray,	  P.	  (2001).	  Triploidy	  induced	  by	  pressure	  shock	  in	  Arctic	  char	  (Salvelinus	  alpinus):	  growth,	  survival	  and	  maturation	  until	  the	  third	  year.	  Aquatic	  Living	  Resources,	  14(5),	  327–334.	  Goss,	  G.	  G.,	  Perry,	  S.	  F.,	  Fryer,	  J.	  N.,	  &	  Laurent,	  P.	  (1998).	  Gill	  Morphology	  and	  Acid-­‐Base	  Regulation	  in	  Freshwater	  Fishes.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  119(1),	  107–115.	  Goss,	  G.	  G.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1990).	  Na+	  and	  Cl-­‐	  Uptake	  Kinetics,	  Diffusive	  Effluxes	  and	  Acidic	  Equivalent	  Fluxes	  Across	  the	  Gills	  of	  Rainbow	  Trout:	  1.	  Responses	  to	  Environmental	  Hyperoxia.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  152,	  521–547.	  Greco,	  A.	  M.,	  Fenwick,	  J.	  C.,	  &	  Perry,	  S.	  F.	  (1996).	  The	  effects	  of	  soft-­‐water	  acclimation	  on	  gill	  structure	  in	  the	  rainbow	  trout	  Oncorhynchus	  mykiss.	  Cell	  and	  Tissue	  	   76	  Research,	  285,	  75–82.	  GSGislason	  &	  Associates	  Ltd.	  2009.	  Freshwater	  Sport	  Fishing	  in	  British	  Columbia:	  Sending	  Ripples	  through	  the	  Provincial	  Economy.	  	  Guo,	  X.,	  Hershberger,	  K.	  M.,	  &	  Myers,	  J.	  M.	  (1990).	  Growth	  and	  Survival	  of	  Intrastrain	  and	  Interstrain	  Rainbow	  Trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  Triploids.	  Journal	  of	  the	  World	  Aquaculture	  Society,	  21(4),	  250–256.	  Handy,	  R.	  D.	  (1989).	  The	  ionic	  composition	  of	  Rainbow	  trout	  body	  mucus.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  93A(3),	  571–575.	  Hansen,	  P.	  J.	  (2002).	  Effect	  of	  high	  pH	  on	  the	  growth	  and	  survival	  of	  marine	  phytoplankton:	  implications	  for	  species	  succession.	  Aquatic	  Microbial	  Ecology,	  28(3),	  279–288.	  Hardy,	  R.	  W.	  (2002).	  Rainbow	  trout,	  Oncorhynchus	  mykiss.	  Heisler,	  N.	  (1989).	  Acid-­‐Base	  regulation	  in	  fishes.	  1.	  Mechanisms.	  Acid	  Toxicity	  and	  Aquatic	  Animals,	  85–97.	  Heming,	  T.	  A.,	  &	  Blumhagen,	  K.	  A.	  (1988).	  Plasma	  acid-­‐base	  and	  electrolyte	  states	  of	  	   rainbow	  trout	  exposed	  to	  alum	  (aluminum	  sulphate)	  in	  acidic	  and	  alkaline	  	   environments.	  Aquatic	  toxicology,	  12(2),	  125-­‐139.	  Huckabee,	  W.	  E.	  (1958).	  Relationships	  of	  Pyruvate	  and	  Lactate	  during	  anaerobic	  metabolism.	  1.	  Effects	  of	  infusion	  of	  pyruvate	  or	  glucose	  and	  of	  hyperventilation.	  The	  Journal	  of	  Clinical	  Investigation,	  37(2),	  244–254.	  Huggins,	  A.	  K.,	  Skutsch,	  G.,	  &	  Baldwin,	  E.	  (1969).	  Ornithine-­‐urea	  cycle	  enzymes	  in	  teleostean	  fish.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  28(2),	  587–602.	  Hunn,	  J.	  B.	  (1985).	  Role	  of	  Calcium	  in	  Gill	  function	  in	  Freshwater	  Fishes.	  Comparative	  	   77	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  82(3),	  543–547.	  Hung,	  C.	  C.,	  Nawata,	  C.	  M.,	  Wood,	  C.	  M.,	  &	  Wright,	  P.	  A.	  (2008).	  Rhesus	  glycoprotein	  	   and	  urea	  transporter	  genes	  are	  expressed	  in	  early	  stages	  of	  development	  of	  	   rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  Journal	  of	  Experimental	  Zoology	  Part	  	   A:	  Ecological	  Genetics	  and	  Physiology,	  309(5),	  262-­‐268.	  Huntingford,	  F.	  A.	  (2004).	  Implications	  of	  domestication	  and	  rearing	  conditions	  for	  	   the	  behaviour	  of	  cultivated	  fishes.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  65	  (1),	  122-­‐142.	  Ip,	  Y.	  K.,	  &	  Chew,	  S.	  F.	  (2010).	  Ammonia	  production,	  excretion,	  toxicity,	  and	  defense	  in	  fish:	  a	  review.	  Frontiers	  in	  Physiology,	  1,	  1–20.	  Ip,	  Y.	  K.,	  Chew,	  S.	  F.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (2001).	  Ammonia	  toxicity,	  tolerance	  and	  excretion.	  Fish	  Physiology,	  19,	  109–148.	  Iwama,	  G.	  K.,	  McGeer,	  J.	  C.,	  Wright,	  P.	  A.,	  Wilkie,	  M.	  P.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1997).	  Divalent	  cations	  enhance	  ammonia	  excretion	  in	  Lahontan	  cutthroat	  trout	  in	  highly	  alkaline	  water.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  50,	  1061–1073.	  Jentoft,	  S.,	  Aastveit,	  A.	  H.,	  Torjesen,	  P.	  A.,	  &	  Andersen,	  Ø.	  (2005).	  Effects	  of	  stress	  on	  	   growth,	  cortisol	  and	  glucose	  levels	  in	  non-­‐domesticated	  Eurasian	  perch	  (<	  i>	  	   Perca	  fluviatilis</i>)	  and	  domesticated	  rainbow	  trout	  (<	  i>	  Oncorhynchus	  	   mykiss</i>).	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology	  Part	  A:	  Molecular	  &	  	   Integrative	  Physiology,	  141(3),	  353-­‐358.	  Johnsson,	  J.	  I.,	  &	  Abrahams,	  M.	  V.	  (1991).	  Interbreeding	  with	  Domestic	  Strain	  Increases	  Foraging	  under	  Threat	  of	  Predation	  in	  Juvenile	  Steelhead	  Trout	  (Oncorhynchus	  mykiss):	  An	  Experimental	  Study.	  Canadian	  Journal	  of	  Fisheries	  and	  Aquatic	  Sciences,	  48(2),	  243–247.	  	   78	  Jones,	  A.	  W.,	  &	  Mackiewicz,	  J.	  S.	  (1969).	  Naturally	  Occurring	  Triploidy	  and	  Parthenogenesis	  in	  Atractolytocestus	  huronensis	  Anthony	  (Cestoidea:	  Caryophyllidea)	  from	  Cyprinus	  carpio	  L.	  in	  North	  America.	  The	  Journal	  of	  Parasitology,	  55(6),	  1105–1118.	  Jones,	  B.	  E.,	  Grant,	  W.	  D.,	  Duckworth,	  A.	  W.,	  &	  Owenson,	  G.	  G.	  (1998).	  Microbial	  diversity	  of	  soda	  lakes.	  Extremophiles,	  2,	  191–200.	  Jordan,	  H.	  M.,	  &	  Lloyd,	  R.	  (1964).	  The	  Resistance	  of	  Rainbow	  Trout	  (Salmo	  Gairdnerii	  Richardson)	  and	  Road	  (Rutilus	  Rutilus	  (L.))	  to	  Alkaline	  Solutions.	  International	  Journal	  of	  Air	  and	  Water	  Pollution,	  8,	  405–409.	  Juel,	  C.	  (1997).	  Lactate-­‐proton	  cotransport	  in	  skeletal	  muscle.	  Physiological	  Review,	  77(2),	  321–358.	  Keeley,	  E.	  R.,	  Parkinson,	  E.	  A.,	  &	  Taylor,	  E.	  B.	  (2005).	  Ecotypic	  differentiation	  of	  native	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  populations	  from	  British	  Columbia.	  Canadian	  Journal	  of	  Fish	  Aquatic	  Science,	  62,	  1523–1539.	  Keeley,	  E.	  R.,	  Parkinson,	  E.	  A.,	  &	  Taylor,	  E.	  B.	  (2007).	  The	  origins	  of	  ecotypic	  variation	  of	  rainbow	  trout:	  a	  test	  of	  environmental	  vs.	  genetically	  based	  differences	  in	  morphology.	  Journal	  of	  Evolutionary	  Biology,	  20(2),	  725–736.	  Komen,	  H.,	  &	  Thorgaard,	  G.	  H.	  (2007).	  Androgenesis,	  gynogenesis	  and	  the	  production	  of	  clones	  in	  fishes:	  A	  review.	  Aquaculture,	  269(1-­‐4),	  150–173.	  Korwin-­‐Kossakowski,	  M.	  (1992).	  Growth	  and	  survival	  of	  carp	  (Cyprinus	  carpio	  L.)	  larvae	  in	  alkaline	  water.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  40(6),	  981–982.	  Krueger,	  C.	  C.,	  &	  Waters,	  T.	  F.	  (1983).	  Annual	  Production	  of	  Macroinvertebrates	  in	  three	  streams	  of	  different	  water	  quality.	  Ecology,	  64(4),	  840–850.	  	   79	  Kuzminski,	  H.,	  &	  Dobosz,	  S.	  (2010).	  Effect	  of	  sex	  reversal	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss	  Walbaum)	  using	  17—-­‐methyltestosterone	  and	  116-­‐hydroxyandrostenedione.	  Archives	  of	  Polish	  Fisheries,	  18,	  45–49.	  Lamborot,	  M.,	  &	  Vasquez,	  M.	  (1998).	  A	  Triploid	  Lizard	  (Liolaemus	  gravenhorsti)	  from	  Chile.	  Journal	  of	  Herpetology,	  32(4),	  617–620.	  Laurent,	  P.,	  Dunel-­‐Erb,	  S.,	  Chevalier,	  C.,	  &	  Lignon,	  J.	  (1994).	  Gill	  epithelial	  cells	  	   kinetics	  in	  a	  freshwater	  teleost,	  Oncorhynchus	  mykiss	  during	  adaptation	  to	  	   ion-­‐poor	  water	  and	  hormonal	  treatments.	  Fish	  physiology	  and	  	   biochemistry,	  13(5),	  353-­‐370.	  Laurent,	  P.,	  &	  Perry,	  S.	  F.	  (1990).	  Effects	  of	  cortisol	  on	  gill	  chloride	  cell	  morphology	  	   and	  ionic	  uptake	  in	  the	  freshwater	  trout,	  Salmo	  gairdneri.	  Cell	  and	  Tissue	  	   Research,	  259(3),	  429-­‐442.	  Laurent,	  P.,	  Wilkie,	  M.	  P.,	  Chevalier,	  C.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (2000).	  The	  effect	  of	  highly	  alkaline	  water	  (pH	  9.5)	  on	  the	  morphology	  and	  morphometry	  of	  chloride	  cells	  and	  pavement	  cells	  in	  the	  gills	  of	  the	  freshwater	  rainbow	  trout:	  relationship	  to	  ionic	  transport	  and	  ammonia	  excretion.	  Canadian	  Journal	  of	  Zoology,	  78,	  307–319.	  Leach,	  G.	  J.,	  &	  Taylor,	  M.	  H.	  (1982).	  The	  Effects	  of	  Cortisol	  Treatment	  on	  Carbohydrate	  and	  Protein	  Metabolism	  in	  Fundulus	  heteroclitus.	  General	  and	  Comparative	  Endocrinology,	  48,	  76–83.	  Lepage,	  O.,	  Øverli,	  Ø.,	  Petersson,	  E.,	  Järvi,	  T.,	  &	  Winberg,	  S.	  (2001).	  Differential	  stress	  	   coping	  in	  wild	  and	  domesticated	  sea	  trout.	  Brain,	  behavior	  and	  	   evolution,	  56(5),	  259-­‐268.	  	   80	  Leray,	  C.,	  Colin,	  D.	  A.,	  &	  Florentz,	  A.	  (1981).	  Time	  Course	  of	  Osmotic	  Adaptation	  and	  Gill	  Energetics	  of	  Rainbow	  Trout	  (Salmo	  gairdneri	  R.)	  Following	  Abrupt	  Changes	  in	  External	  Salinity.	  Journal	  of	  Comparative	  Physiology,	  144,	  175–181.	  Lin,	  H.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (1995).	  9	  Proton	  Pumps	  in	  Fish	  Gills.	  Fish	  Physiology,	  14,	  229–255.	  Lincoln,	  D.	  (1989).	  Triploid	  induction	  in	  rainbow	  trout	  using	  hydrostatic	  pressure.	  Trout	  News,	  8,	  8–10.	  Lincoln,	  R.	  F.,	  &	  Scott,	  A.	  P.	  (1983).	  Production	  of	  all-­‐female	  triploid	  rainbow	  trout.	  Aquaculture,	  30(1-­‐4),	  375–380.	  Lou,	  Y.	  D.,	  &	  Purdom,	  C.	  E.	  (1984).	  Polyploidy	  induced	  by	  hydrostatic	  pressure	  in	  rainbow	  trout,	  Salmo	  gairdneri	  Richardson.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  25(3),	  345–351.	  Lund,	  P.	  (1970).	  A	  Radiochemical	  Assay	  for	  Glutamine	  Synthetase,	  and	  Activity	  of	  the	  Enzyme	  in	  Rat	  Tissue.	  Biochemical	  Journal,	  118,	  35–39.	  MacCrimmon,	  H.	  R.	  (1971).	  World	  Distribution	  of	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri).	  Journal	  of	  Fisheries	  Research	  Board	  of	  Canada,	  28,	  663–704.	  MacCrimmon,	  H.	  R.	  (1972).	  World	  Distribution	  of	  Rainbow	  Trout	  (Salmo	  gairdneri):	  Further	  Observations.	  Journal	  of	  Fisheries	  Research	  Board	  of	  Canada,	  29(12),	  1788–1791.	  Mathias,	  K.	  L.,	  Tsumura,	  K.,	  &	  Godin,	  T.	  I.	  (1996).	  Alkaline	  Lakes	  Enhancement.	  Habitat	  Conservation	  Fund	  Final	  Report	  British	  Columbia	  Ministry	  of	  Environment,	  Lands	  and	  Parks.	  	   81	  McCormick,	  S.	  D.,	  &	  Naiman,	  R.	  J.	  (1984).	  Osmoregulation	  in	  the	  brook	  trout,	  Salvelinus	  fontinalis—II.	  Effects	  of	  size,	  age	  and	  photoperiod	  on	  seawater	  survival	  and	  ionic	  regulation.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology	  Part	  A:	  Physiology,	  79(1),	  17–28.	  McCusker,	  M.	  R.,	  Parkinson,	  E.,	  &	  Taylor,	  E.	  B.	  (2000).	  Mitochondrial	  DNA	  variation	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  across	  its	  native	  range:	  testing	  biogeographical	  hypotheses	  and	  their	  relevance	  to	  conservation.	  Molecular	  Ecology,	  9,	  2089–2108.	  McDonald,	  G.,	  &	  Milligan,	  L.	  (1997).	  Ionic,	  osmotic	  and	  acid-­‐base	  regulation	  in	  	   stress.	  Fish	  stress	  and	  health	  in	  aquaculture,	  62,	  119-­‐145.	  McDonald,	  D.	  G.,	  &	  Robinson,	  J.	  G.	  (1993).	  Physiological	  responses	  of	  lake	  trout	  to	  	   stress:	  effects	  of	  water	  hardness	  and	  genotype.	  Transactions	  of	  the	  American	  	   Fisheries	  Society,	  122(6),	  1146-­‐1155.	  McDonald,	  D.	  G.,	  &	  Rogano,	  M.	  S.	  (1986).	  Ion	  Regulation	  by	  the	  Rainbow	  Trout,	  Salmo	  gairdneri,	  in	  Ion-­‐Poor	  Water.	  Physiological	  Zoology,	  59(3),	  318–331.	  McDonald,	  D.	  G.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1981).	  Branchial	  and	  renal	  acid	  and	  ion	  fluxes	  in	  the	  rainbow	  trout,	  Salmo	  gairdneri,	  at	  low	  environmental	  pH.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  93,	  101–118.	  McGeer,	  J.,	  &	  Eddy,	  F.	  B.	  (1998).	  Ionic	  Regulation	  and	  Nitrogenous	  Excretion	  in	  Rainbow	  Trout	  Exposed	  to	  Buffered	  and	  Unbuffered	  Freshwater	  of	  pH	  10.5.	  Physiological	  Zoology,	  71(2),	  179–190.	  Milligan,	  C.	  L.,	  &	  Girard,	  S.	  S.	  (1993).	  Lactate	  metabolism	  in	  rainbow	  trout.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  180,	  175–193.	  	   82	  Monfort,	  P.,	  Kosenko,	  E.,	  Erceg,	  S.,	  Canales,	  J.	  J.,	  &	  Felipo,	  V.	  (2002).	  Molecular	  mechanism	  of	  acute	  ammonia	  toxicity:	  role	  of	  NMDA	  receptors.	  Neurochemistry	  International,	  41,	  95–102.	  Mortimore,	  G.	  E.,	  &	  Poso,	  A.	  R.	  (1987).	  Intracellular	  Protein	  Catabolism	  and	  its	  control	  during	  nutrient	  deprivation	  and	  supply.	  Annual	  Review	  of	  Nutrition,	  7,	  539–564.	  Murray,	  C.	  A.,	  &	  Ziebell,	  C.	  D.	  (1984).	  Acclimation	  of	  rainbow	  trout	  to	  high	  pH	  to	  prevent	  stocking	  mortality	  in	  summer.	  The	  Progressive	  Fish-­‐Culturist,	  46(3),	  176–179.	  Nawata,	  C.	  M.,	  Hung,	  C.	  C.	  Y.,	  Tsui,	  T.	  K.	  N.,	  Wilson,	  J.	  M.,	  Wright,	  P.	  A.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (2007).	  Ammonia	  excretion	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss):	  evidence	  for	  Rh	  glycoprotein	  and	  H+-­‐ATPase	  involvement.	  Physiological	  Genomics,	  31,	  463–474.	  Norenberg,	  M.	  D.,	  Rama	  Rao,	  K.	  V.,	  &	  Jayakumar,	  A.	  R.	  (2004).	  Ammonia	  Neurotoxicity	  and	  the	  Mitochondrial	  Permeability	  Transition.	  Journal	  of	  Bioenergetics	  and	  Biomembranes,	  36(4),	  303–307.	  Pawson,	  M.	  G.	  (2003).	  Triploid	  Trout	  in	  Native	  Trout	  Waters:	  Phase	  1	  (Technical	  Report	  No.	  W2-­‐078/TR1).	  Perry,	  S.	  F.	  (1997).	  THE	  CHLORIDE	  CELL:	  Structure	  and	  Function	  in	  the	  Gills	  of	  Freshwater	  Fishes.	  Annual	  Review	  of	  Physiology,	  59,	  325–347.	  Perry,	  S.	  F.,	  Goss,	  G.	  G.,	  &	  Laurent,	  P.	  (1992).	  The	  interrelationships	  between	  gill	  chloride	  cell	  morphology	  and	  ionic	  uptake	  in	  four	  freshwater	  teleosts.	  Canadian	  Journal	  of	  Zoology,	  70,	  1775–1786.	  	   83	  Perry,	  S.	  F.,	  &	  Laurent,	  P.	  (1989).	  Adaptational	  responses	  of	  Rainbow	  trout	  to	  lowered	  external	  NaCl	  concentration:	  Contribution	  of	  the	  branchial	  chloride	  cell.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  147,	  147–168.	  Perry,	  S.	  F.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1985).	  Kinetics	  of	  Branchial	  Calcium	  uptake	  in	  the	  Rainbow	  Trout:	  effects	  of	  acclimation	  to	  various	  external	  calcium	  levels.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  116,	  411–433.	  Pilley,	  C.	  M.,	  &	  Wright,	  P.	  A.	  (2000).	  The	  mechanisms	  of	  urea	  transport	  by	  early	  life	  stages	  of	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  203,	  3199–3207.	  Pottinger,	  T.	  G.,	  &	  Carrick,	  T.	  R.	  (1999).	  Modification	  of	  the	  plasma	  cortisol	  response	  	   to	  stress	  in	  rainbow	  trout	  by	  selective	  breeding.	  General	  and	  comparative	  	   endocrinology,	  116(1),	  122-­‐132.	   Rahmatullah,	  M.,	  &	  Boyde,	  T.	  R.	  (1980).	  Improvements	  in	  the	  determination	  of	  urea	  using	  diacetyl	  monoxime;	  methods	  with	  and	  without	  deproteinisation.	  Clinica	  Chimica	  Acta,	  107(1-­‐2),	  3–9.	  Randall,	  D.	  J.	  (2011).	  Nitrogenous-­‐Waste	  Balance.	  Excretion	  of	  Ammonia,	  1437–1443.	  Randall,	  D.	  J.,	  &	  Tsui,	  T.	  K.	  N.	  (2002).	  Ammonia	  toxicity	  in	  fish.	  Marine	  Pollution	  Bulletin,	  45,	  17–23.	  Randall,	  D.	  J.,	  &	  Wright,	  P.	  A.	  (1989).	  The	  interaction	  between	  carbon	  dioxide	  and	  	   ammonia	  excretion	  and	  water	  pH	  in	  fish.	  Canadian	  Journal	  of	  Zoology,	  67(12),	  	   2936-­‐2942.	  Refstie,	  T.	  (1981).	  Tetraploid	  Rainbow	  trout	  produced	  by	  Cytochalasin	  B.	  Aquaculture,	  25,	  51–58.	  	   84	  Ring,	  C.,	  Patterson,	  S.	  M.,	  Bacon,	  S.	  L.,	  Veldhijzen	  van	  Zanten,	  J.	  J.,	  Willemsen,	  G.,	  &	  Carroll,	  D.	  (2008).	  Reliability	  of	  hematocrit	  during	  rest	  and	  stress	  in	  healthy	  adults.	  Biological	  Psychology,	  77(1),	  63–68.	  Robson,	  P.	  A.	  (2004).	  Fish	  Hatcheries.	  Retrieved	  January	  16,	  2014,	  from­‐of-­‐BC/F/Fish-­‐Hatcheries	  Sadler,	  J.,	  Pankhurst,	  N.	  W.,	  Pankhurst,	  P.	  M.,	  &	  King,	  H.	  (2000).	  Physiological	  stress	  responses	  to	  confinement	  in	  diploid	  and	  triploid	  Atlantic	  salmon.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  56(3),	  506–518.	  Sadler,	  J.,	  Pankhurst,	  P.	  M.,	  &	  King,	  H.	  R.	  (2001).	  High	  prevalence	  of	  skeletal	  deformity	  and	  reduced	  gill	  surface	  area	  in	  triploid	  Atlantic	  salmon	  (Salmo	  salar	  L.).	  Aquaculture,	  198(3-­‐4),	  369–385.	  Sadler,	  J.,	  Wells,	  R.	  M.	  G.,	  Pankhurst,	  P.	  M.,	  &	  Pankhurst,	  N.	  W.	  (2000).	  Blood	  oxygen	  transport,	  rheology	  and	  haematological	  responses	  to	  confinement	  stress	  in	  diploid	  and	  triploid	  Atlantic	  salmon,	  Salmo	  salar.	  Aquaculture,	  184,	  349–361.	  Sandbichler,	  A.	  M.,	  Egg,	  M.,	  Schwerte,	  T.,	  &	  Pelster,	  B.	  (2011).	  Claudin	  28b	  and	  F-­‐actin	  are	  involved	  in	  rainbow	  trout	  gill	  pavement	  cell	  tight	  junction	  remodeling	  under	  osmotic	  stress.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  214,	  1473–1487.	  Sanderson,	  L.	  A.,	  Wright,	  P.	  A.,	  Robinson,	  J.	  W.,	  Ballantyne,	  J.	  S.,	  &	  Bernier,	  N.	  J.	  (2010).	  Inhibition	  of	  glutamine	  synthetase	  during	  ammonia	  exposure	  in	  rainbow	  trout	  indicates	  a	  high	  reserve	  capacity	  to	  prevent	  brain	  ammonia	  toxicity.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  213,	  2343–2353.	  Schneeberger,	  E.	  E.,	  &	  Lynch,	  R.	  D.	  (2004).	  The	  tight	  junction:	  a	  multifunctional	  	   85	  complex.	  American	  Journal	  of	  Physiology-­‐	  Cell	  Physiology,	  286,	  1213–1228.	  Scott,	  M.	  A.	  (2012).	  Performance	  of	  wild	  and	  domestic	  strains	  of	  diploid	  and	  triploid	  	  	   rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  in	  response	  to	  environmental	  	   challenges.	  Seidelin,	  M.,	  Madsen,	  S.	  S.,	  Byrialsen,	  A.,	  &	  Kristiansen,	  K.	  (1999).	  Effects	  of	  Insulin-­‐	   like	  Growth	  Factor-­‐I	  and	  Cortisol	  on	  Na+,	  K+-­‐ATPase	  Expression	  in	  	   Osmoregulatory	  Tissues	  of	  Brown	  Trout	  (Salmo	  trutta).	  General	  and	  	   comparative	  endocrinology,	  113(3),	  331-­‐342.	  Shrimpton,	  J.	  M.,	  Bernier,	  N.	  J.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (1994).	  Changes	  in	  cortisol	  dynamics	  	   in	  wild	  and	  hatchery-­‐reared	  juvenile	  coho	  salmon	  (Oncorhynchus	  kisutch)	  	   during	  smoltification.	  Canadian	  Journal	  of	  Fisheries	  and	  Aquatic	  	   Sciences,	  51(10),	  2179-­‐2187.	  Shrimpton,	  J.	  M.,	  &	  Mccormick,	  S.	  D.	  (1999).	  Responsiveness	  of	  gill	  Na+/K+-­‐ATPase	  	   to	  cortisol	  is	  related	  to	  gill	  corticosteroid	  receptor	  concentration	  in	  juvenile	  	   rainbow	  trout.	  Journal	  of	  experimental	  biology,	  202(8),	  987-­‐995.	  Sidhu,	  S.	  (2012).	  Physiological	  &	  Cellular	  Mechanisms	  of	  Ammonia	  Tolerance	  in	  the	  Goldfish	  (Carassius	  auratus).	  Wilfrid	  Laurier	  University.	  Simon,	  D.	  C.,	  Scalet,	  C.	  G.,	  &	  Dillon,	  J.	  C.	  (1993).	  Field	  Performance	  of	  Triploid	  and	  Diploid	  Rainbow	  Trout	  in	  South	  Dakota	  Ponds.	  North	  American	  Journal	  of	  Fisheries	  Management,	  13(1),	  134–140.	  Skinner,	  J.	  S.,	  &	  McLellan,	  T.	  H.	  (1980).	  The	  Transition	  from	  Aerobic	  to	  Anaerobic	  Metabolism.	  Research	  Quarterly	  for	  Exercise	  and	  Sport,	  51(1),	  234–248.	  Small,	  S.	  A.,	  &	  Benfey,	  T.	  J.	  (1987).	  Cell	  size	  in	  triploid	  salmon.	  Journal	  of	  	   86	  Experimental	  Zoology,	  241(3),	  339–342.	  Smart,	  G.	  (1976).	  The	  effect	  of	  ammonia	  exposure	  on	  gill	  structure	  of	  the	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri).	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  8,	  471–475.	  Smart,	  G.	  R.	  (1978).	  Investigations	  of	  the	  toxic	  mechanisms	  of	  ammonia	  to	  fish-­‐gas	  exchange	  in	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri)	  exposed	  to	  acutely	  lethal	  concentrations.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  12,	  93–104.	  Stevens,	  E.	  D.	  (1968).	  The	  effect	  of	  exercise	  on	  the	  distribution	  of	  blood	  to	  various	  organs	  in	  rainbow	  trout.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  25(2),	  615–625.	  Sutcliffe,	  D.	  W.,	  &	  Carrick,	  T.	  R.	  (1973).	  Studies	  on	  mountain	  streams	  in	  the	  English	  Lake	  District.	  Freshwater	  Biology,	  3,	  437–462.	  Tang,	  V.	  W.,	  &	  Goodenough,	  D.	  A.	  (2003).	  Paracellular	  Ion	  Channel	  at	  the	  Tight	  Junction.	  Biophysical	  Journal,	  84,	  1660–1673.	  Thorgaard,	  G.	  H.,	  &	  Gall,	  G.	  A.	  (1979).	  Adult	  triploids	  in	  a	  rainbow	  trout	  family.	  Genetics,	  93,	  961–973.	  Thorgaard,	  G.	  H.,	  Rabinovitch,	  P.	  S.,	  Wentang	  Shen,	  M.,	  Gall,	  G.,	  Propp,	  J.,	  &	  Utter,	  F.	  (1982).	  Triploid	  Rainbow	  trout	  identified	  by	  flow	  cytometry.	  Aquaculture,	  29,	  305–309.	  Thorgaard,	  G.	  H.,	  Spruell,	  P.,	  Wheeler,	  P.	  A.,	  Scheerer,	  P.	  D.,	  Peek,	  A.	  S.,	  Valentine,	  J.	  J.,	  &	  Hilton,	  B.	  (1995).	  Incidence	  of	  albinos	  as	  a	  monitor	  for	  induced	  triploidy	  in	  rainbow	  trout.	  Aquaculture,	  137(1-­‐4),	  121–130.	  	   87	  Turner,	  J.	  D.,	  Wood,	  C.	  M.,	  &	  Clark,	  D.	  (1983).	  Lactate	  and	  proton	  dynamics	  in	  the	  	   rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri).	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  104(1),	  	   247-­‐268.	  Van	  Der	  Boon,	  J.,	  Van	  Den	  Thillart,	  G.	  E.,	  &	  Addink,	  A.	  D.	  F.	  (1991).	  The	  Effects	  of	  Cortisol	  Administration	  on	  intermediary	  metabolism	  in	  teleost	  fish.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  100(1),	  47–53.	  Vincent,	  R.	  E.	  (1960).	  Some	  Influences	  of	  Domestication	  upon	  Three	  Stocks	  of	  Brook	  Trout	  (Salvelinus	  fontinalis	  Mitchill).	  Transactions	  of	  the	  American	  Fisheries	  Society,	  89(1),	  35–52.	  Wagner,	  E.	  J.,	  Arndt,	  R.	  E.,	  Routledge,	  M.	  D.,	  Latremouille,	  D.,	  &	  Mellenthin,	  R.	  F.	  (2006).	  Comparison	  of	  Hatchery	  Performance,	  Agonistic	  Behavior,	  and	  Poststocking	  Survival	  between	  Diploid	  and	  Triploid	  Rainbow	  Trout	  of	  Three	  Different	  Utah	  Strains.	  North	  American	  Journal	  of	  Aquaculture,	  68,	  63–73.	  Wagner,	  E.	  J.,	  Bosakowski,	  T.,	  &	  Intelmann,	  S.	  (1997).	  Mortality	  and	  the	  Stress	  Response	  of	  Rainbow	  Trout	  after	  Stocking.	  Transactions	  of	  the	  American	  Fisheries	  Society,	  126(6),	  985–998.	  Wang,	  Y.	  S.,	  Gonzalez,	  R.	  J.,	  Patrick,	  M.	  L.,	  Grosell,	  M.,	  Zhang,	  C.,	  Feng,	  Q.,	  …	  Wood,	  C.	  M.	  (2003).	  Unusual	  physiology	  of	  scale-­‐less	  carp,	  Gymnocypris	  przewalskii,	  in	  Lake	  Qinghai:	  a	  high	  altitude	  alkaline	  saline	  lake.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology	  Part	  A:	  Molecular	  &	  Integrative	  Physiology,	  134(2),	  409–421.	  Weil,	  L.	  S.,	  Barry,	  T.	  P.,	  &	  Malison,	  J.	  A.	  (2001).	  Fast	  growth	  in	  rainbow	  trout	  is	  	  	  	   correlated	  with	  a	  rapid	  decrease	  in	  post-­‐stress	  cortisol	  	   concentrations.	  	   Aquaculture,	  193(3),	  373-­‐380.	  	   88	  Weihrauch,	  D.,	  Wilkie,	  M.	  P.,	  &	  Walsh,	  P.	  J.	  (2009).	  Ammonia	  and	  urea	  transporters	  in	  gills	  of	  fish	  and	  aquatic	  crustaceans.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  212,	  1716–1730.	  Wells,	  R.	  M.	  G.,	  Tetens,	  V.,	  &	  Devries,	  A.	  L.	  (1984).	  Recovery	  from	  stress	  following	  capture	  and	  anaesthesia	  of	  antarctice	  fish:	  haematology	  and	  blood	  chemistry.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  25,	  567–576.	  Wells,	  R.	  M.	  G.,	  &	  Weber,	  R.	  E.	  (1991).	  Is	  there	  an	  optimal	  haematocrit	  for	  rainbow	  trout,	  Oncorhynchus	  mykiss	  (Walbaum)?	  An	  interpretation	  of	  recent	  data	  based	  on	  blood	  viscosity	  measurements.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  38,	  53–65.	  Wilkie,	  M.	  P.	  (1997).	  Mechanisms	  of	  Ammonia	  Excretion	  Across	  Fish	  Gills.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  118(1),	  39–50.	  Wilkie,	  M.	  P.	  (2002).	  Ammonia	  Excretion	  and	  Urea	  Handling	  by	  Fish	  Gills:	  Present	  Understanding	  and	  Future	  Research	  Challenges.	  Journal	  of	  Experimental	  Zoology,	  293,	  284–301.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  Laurent,	  P.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1999).	  The	  Physiological	  Basis	  for	  Altered	  Na+	  and	  Cl-­‐	  Movements	  across	  the	  Gills	  of	  Rainbow	  Trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  in	  Alkaline	  (pH=9.5)	  Water.	  Physiological	  and	  Biochemical	  Zoology,	  72(3),	  360–368.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  Simmons,	  H.	  E.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1996).	  Physiological	  Adaptations	  of	  Rainbow	  Trout	  to	  Chronically	  Elevated	  Water	  pH	  (pH	  =	  9.5).	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Zoology,	  274,	  1–14.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1991).	  Nitrogenous	  Waste	  Excretion,	  Acid-­‐Base	  Regulation,	  and	  Ionoregulation	  in	  Rainbow	  Trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  	   89	  Exposed	  to	  Extremely	  Alkaline	  Water.	  Physiological	  Zoology,	  64(4),	  1069–1086.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1994).	  The	  effects	  of	  extremely	  alkaline	  water	  (pH	  9.5)	  on	  rainbow	  trout	  gill	  function	  and	  morphology.	  Journal	  of	  Fish	  Biology,	  45,	  87–98.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1995).	  Recovery	  from	  High	  pH	  Exposure	  in	  the	  Rainbow	  Trout:	  White	  Muscle	  Ammonia	  Storage,	  Ammonia	  Washout,	  and	  the	  Restoration	  of	  Blood	  Chemistry.	  Physiological	  Zoology,	  68(3),	  379–401.	  Wilkie,	  M.	  P.,	  Wright,	  P.	  A.,	  Iwama,	  G.	  K.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1994).	  The	  of	  the	  Lahontan	  Physiological	  Aldaptations	  Cutthroat	  trout	  (Oncorhynchus	  clarki	  henshawl)	  following	  Transfer	  from	  Well	  Water	  to	  the	  Highly	  Alkaline	  Waters	  of	  Pyramid	  Lake,	  Nevada	  (pH9.4).	  Physiological	  Zoology,	  67(2),	  355–380.	  Wilson,	  J.	  M.,	  Iwata,	  K.,	  Iwama,	  G.	  K.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (1998).	  Inhibition	  of	  ammonia	  excretion	  and	  production	  in	  rainbow	  trout	  during	  severe	  alkaline	  exposure.	  Comparative	  Biochemistry	  and	  Physiology,	  121,	  99–109.	  Wilson,	  R.	  W.,	  Wright,	  P.	  A.,	  Munger,	  S.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1994).	  Ammonia	  Excretion	  in	  freshwater	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  and	  the	  importance	  of	  gill	  boundary	  layer	  acidification:	  Lack	  of	  evidence	  for	  Na+/NH4+	  exchange.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  191,	  37–58.	  Wood,	  C.	  M.,	  &	  Nawata,	  C.	  M.	  (2011).	  A	  nose-­‐to-­‐nose	  comparison	  of	  the	  physiological	  and	  molecular	  responses	  of	  rainbow	  trout	  to	  high	  environmental	  ammonia	  in	  seawater	  versus	  freshwater.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  214,	  3557–3569.	  	   90	  Wood,	  C.	  M.,	  Perry,	  S.	  F.,	  Wright,	  P.	  A.,	  Bergman,	  H.	  L.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (1989).	  Ammonia	  and	  urea	  dynamics	  in	  the	  Lake	  Magadi	  tilapia,	  a	  ureotelic	  teleost	  fish	  adapted	  to	  an	  extremely	  alkaline	  environment.	  Respiration	  Physiology,	  77,	  1–20.	  Wood,	  C.	  M.,	  &	  Randall,	  D.	  J.	  (1973).	  Sodium	  Balance	  in	  the	  Rainbow	  Trout	  (Salmo	  gairdneri)	  during	  extended	  exercise.	  Journal	  of	  Comparative	  Physiology,	  82,	  235–256.	  Woodward,	  C.	  C.,	  &	  Strange,	  R.	  J.	  (1987).	  Physiological	  Stress	  Responses	  in	  Wild	  and	  Hatchery-­‐Reared	  Rainbow	  Trout.	  Transactions	  of	  the	  American	  Fisheries	  Society,	  116(4),	  574–579.	  Wright,	  P.	  A.	  (1995).	  Nitrogen	  Excretion:	  Three	  end	  products,	  many	  physiological	  roles.	  The	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  198,	  273–281.	  Wright,	  P.	  A.,	  Felskie,	  A.,	  &	  Anderson,	  P.	  M.	  (1995).	  Induction	  of	  ornithine-­‐urea	  cycle	  enzymes	  and	  nitrogen	  metabolism	  and	  excretion	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  during	  early	  life	  stages.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  198,	  127–135.	  Wright,	  P.	  A.,	  Iwama,	  G.	  K.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1993).	  Ammonia	  and	  Urea	  excretion	  in	  Lahontan	  cutthroat	  trout	  (Oncorhynchus	  clarki	  henshawi)	  adapted	  to	  the	  highly	  pyramid	  lake	  (pH	  9.4).	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  175,	  153–172.	  Wright,	  P.	  A.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (1985).	  An	  analysis	  of	  branchial	  ammonia	  excretion	  in	  the	  freshwater	  rainbow	  trout:	  Effects	  of	  environmental	  pH	  change	  and	  sodium	  uptake	  blockade.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  114,	  329–353.	  Wright,	  P.	  A.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (2009).	  A	  new	  paradigm	  for	  ammonia	  excretion	  in	  	   91	  aquatic	  animals:	  role	  of	  Rhesus	  (Rh)	  glycoproteins.	  Journal	  of	  Experimental	  Biology,	  212,	  2303–2312.	  Wright,	  P.	  A.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (2012).	  Seven	  things	  fish	  know	  about	  ammonia	  and	  we	  	   don’t.	  Respiratory	  physiology	  &	  neurobiology,	  184(3),	  231-­‐240.	  Xu,	  Y.,	  &	  Tao,	  Y.	  X.	  (2004).	  Involvement	  of	  the	  NMDA	  receptor/nitric	  oxide	  signal	  pathway	  in	  platelet-­‐activating	  factor-­‐induced	  neurotoxicity.	  Neuroreport,	  15(2),	  263–266.	  Yesaki,	  T.	  Y.,	  &	  Iwama,	  G.	  K.	  (1992).	  Survival,	  Regulation,	  Regulation,	  and	  Ammonia	  Excretion	  in	  Rainbow	  Trout	  in	  Highly	  Alkaline	  Hard	  Water.	  Physiological	  Zoology,	  65(4),	  763–787.	  Yesaki,	  T.	  Y.,	  Scheer,	  K.	  W.,	  &	  Greiner,	  D.	  L.	  (1996).	  Production-­‐scale	  pressure	  shocking	  of	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  in	  British	  Columba.	  Proceedings	  of	  the	  47th	  Annual	  Northwest	  Fish	  Culture	  Conference,	  170,	  173.	  Yesaki,	  T.	  Y.,	  Tsumura,	  K.	  (1992).	  Alkaline	  Lakes	  Enhancement:	  Habitat	  	   Conservation	  Fund	  Progress	  Report	  (1991-­‐1992)	  Zimmer,	  A.	  M.,	  Brauner,	  C.	  J.,	  &	  Wood,	  C.	  M.	  (2014).	  Ammonia	  transport	  across	  the	  	   skin	  of	  adult	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  exposed	  to	  high	  	   environmental	  ammonia	  (HEA).	  Journal	  of	  Comparative	  Physiology	  B,	  184(1),	  	   77–90.	  	  


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items