Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

The role of antibody testing for anti-natalizumab and anti-aquaporin-4 antibodies in demyelinating disorders Fronda, Anna Grace 2014

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata


24-ubc_2014_spring_fronda_anna.pdf [ 3.53MB ]
JSON: 24-1.0103422.json
JSON-LD: 24-1.0103422-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0103422-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0103422-rdf.json
Turtle: 24-1.0103422-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0103422-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0103422-source.json
Full Text

Full Text

	  The	  Role	  of	  Antibody	  Testing	  for	  Anti-­‐Natalizumab	  and	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  in	  Demyelinating	  Disorders	  	  by	  	  Anna	  Grace	  Fronda	  B.Sc.,	  The	  University	  of	  British	  Columbia,	  2010	  	  A	  THESIS	  SUBMITTED	  IN	  PARTIAL	  FULFILLMENT	  OF	  THE	  REQUIREMENTS	  FOR	  THE	  DEGREE	  OF	  	  MASTER	  OF	  SCIENCE	  in	  The	  Faculty	  of	  Graduate	  And	  Postdoctoral	  Studies	  (Experimental	  Medicine)	  	  THE	  UNIVERSITY	  OF	  BRITISH	  COLUMBIA	  	  (Vancouver)	  	  	  April	  2014	  	  	  ©	  Anna	  Grace	  Fronda,	  2014	  	   	  	   ii	  Abstract	  Antibody	  testing	  in	  medicine	  is	  utilized	  for	  diverse	  purposes	  that	  are	  highly	  dependent	  on	  the	  type	  of	  antibody	  and	  the	  disease	  to	  which	  it	  is	  related.	  This	  thesis	  examines	  testing	  for	  antibodies	  in	  relation	  to	  two	  demyelinating	  diseases	  of	  the	  central	  nervous	  system.	  Anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  multiple	  sclerosis	  (MS)	  patients	  treated	  with	  natalizumab,	  a	  therapeutic	  humanized	  monoclonal	  antibody	  against	  a	  cell	  adhesion	  protein,	  are	  associated	  with	  increased	  infusion-­‐related	  reactions	  and	  reduced	  treatment	  efficacy.	  While	  initial	  testing	  for	  this	  anti-­‐biological	  antibody	  is	  recommended	  before	  24	  weeks	  of	  treatment,	  a	  seropositive	  result	  warrants	  multiple	  testing	  throughout	  the	  treatment	  duration	  to	  distinguish	  transient	  from	  persistent	  antibody	  responses.	  This	  is	  significant	  because	  patients	  with	  a	  transient	  antibody	  response	  may	  still	  benefit	  from	  natalizumab	  treatment	  in	  the	  long	  term	  whereas	  patients	  with	  persistent	  antibodies	  will	  not	  and,	  therefore,	  should	  discontinue	  treatment.	  A	  Biacore	  assay	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  that	  uses	  surface	  plasmon	  technology	  is	  suitable	  for	  a	  large	  amount	  of	  samples	  and	  to	  study	  antibody	  affinity.	  As	  such,	  this	  assay	  was	  used	  to	  demonstrate	  that	  in	  a	  single	  patient	  with	  a	  transient	  antibody	  response,	  seroconversion	  to	  antibody	  negative	  is	  indicative	  of	  immune	  tolerance	  to	  natalizumab.	  The	  second	  antibody	  under	  investigation	  is	  the	  pathological	  autoantibody,	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody.	  It	  is	  the	  most	  specific	  and	  sensitive	  serum	  biomarker	  for	  neuromyelitis	  optica	  (NMO)	  and	  NMO	  spectrum	  disorders.	  However,	  there	  is,	  at	  present,	  a	  lack	  of	  standardization	  with	  the	  currently	  available	  methods	  to	  measure	  this	  antibody.	  This	  is	  seen	  in	  the	  varying	  assay	  senstitivity	  and	  specificities	  between	  labs	  even	  with	  commercial	  assays,	  as	  well	  as	  the	  differing	  results	  with	  repeat	  testing	  of	  samples.	  Along	  with	  the	  formulation	  of	  diagnostic	  criteria	  that	  better	  distinguishes	  NMO	  from	  MS,	  an	  effort	  	   iii	  should	  be	  made	  to	  improve	  current	  immunoassays	  and	  to	  development	  more	  sensitive	  techniques	  to	  measure	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  in	  patient	  serum.	  	  	   	  	   iv	  Preface	  This	  thesis	  is	  an	  original	  intellectual	  product	  of	  the	  author,	  A.	  Fronda.	  All	  of	  the	  work	  presented	  henceforth	  was	  conducted	  in	  the	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratory	  at	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  (UBC)	  Hospital	  on	  the	  Point	  Grey	  Campus.	  The	  Biacore	  assay	  protocols	  in	  Chapters	  2	  and	  3	  are	  based	  on	  methods	  developed	  by	  Ebrima	  Gibbs,	  PhD,	  of	  the	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratory.	  All	  Biacore	  work	  was	  performed	  by	  me	  under	  the	  supervision	  and	  guidance	  of	  Dr.	  E.	  Gibbs.	  A	  version	  of	  Chapter	  2	  has	  been	  presented	  as	  a	  poster	  at	  the	  2014	  American	  Academy	  of	  Neurology	  in	  Philadelphia,	  PA,	  USA	  with	  co-­‐authors	  Oger,	  J,	  MD,	  FRCPC,	  FAAN,	  Gibbs,	  E,	  PhD,	  and	  Aziz,	  T,	  BSc.	  While	  Dr.	  J.	  Oger	  and	  E.	  Gibbs	  contributed	  to	  the	  overall	  conceptualization	  of	  Chapter	  2,	  all	  data	  generation	  and	  analysis	  was	  executed	  by	  me.	  The	  use	  of	  serum	  samples	  associated	  with	  work	  in	  Chapter	  2	  is	  covered	  by	  UBC	  Human	  Ethics	  Certificate	  number	  H13-­‐00912.	  A	  version	  of	  a	  part	  of	  Chapter	  3	  (described	  in	  Section	  3.1.2)	  has	  been	  presented	  as	  a	  poster	  at	  the	  2012	  World	  Congress	  of	  Neurology	  in	  Marrakesh,	  Morocco,	  and	  at	  the	  2012	  American	  Academy	  of	  Neurology	  in	  New	  Orleans,	  LA,	  USA,	  with	  co-­‐authors	  Oger,	  J,	  MD,	  FRCPC,	  FAAN,	  Fritzler,	  M,	  PhD,	  MD,	  Fujihara,	  K,	  MD,	  Takahashi,	  T,	  MD,	  and	  Traboulsee,	  A,	  MD.	  For	  this	  section,	  I	  did	  the	  assays	  at	  UBC,	  as	  well	  as	  analyzed	  and	  interpreted	  the	  data.	  Dr.	  J.	  Oger	  contributed	  to	  the	  to	  the	  design	  and	  conceptualization	  of	  the	  study,	  interpretation	  of	  the	  data	  and	  the	  drafting	  and	  revising	  of	  intellectual	  content.	  Dr.	  A.	  Traboulsee	  generated	  the	  clinical	  database,	  contributed	  to	  the	  design	  and	  conceptualization	  of	  the	  study	  and	  revising	  of	  intellectual	  content.	  Drs.	  M.	  Fritzler,	  K.	  Fujihara,	  and	  T.	  Takahashi	  contributed	  to	  the	  revising	  of	  intellectual	  content	  and	  	   v	  contributed	  the	  results	  of	  their	  assays.	  Funding	  for	  this	  portion	  was	  provided	  by	  the	  Vancouver	  Hospital	  Foundation.	  	  The	  use	  of	  serum	  samples	  associated	  with	  work	  in	  Chapter	  3	  is	  covered	  by	  UBC	  Human	  Ethics	  Certificate	  number	  H09-­‐02157.	  	   	  	   vi	  Table	  of	  Contents	  Abstract	  ...................................................................................................................................................	  ii	  Preface	  ....................................................................................................................................................	  iv	  Table	  of	  Contents	  ................................................................................................................................	  vi	  List	  of	  Tables	  .......................................................................................................................................	  viii	  List	  of	  Figures	  .......................................................................................................................................	  ix	  Acknowledgements	  ..............................................................................................................................	  x	  Dedication	  ............................................................................................................................................	  xii	  CHAPTER	  1:	  Introduction	  ..................................................................................................................	  1	  1.1	   Multiple	  Sclerosis	  ..................................................................................................................	  2	  1.1.1	   Clinical	  ...................................................................................................................................................	  3	  1.1.2	   Pathology	  ..............................................................................................................................................	  5	   Experimental	  Autoimmune	  Encephalomyelitis	  .............................................................	  8	  1.1.3	   Genetics	  ..............................................................................................................................................	  10	  1.1.4	   Epidemiology	  ...................................................................................................................................	  11	  1.1.5	   Current	  treatments	  and	  therapies	  ..........................................................................................	  12	   Beta	  Interferons	  ........................................................................................................................	  13	   Glatiramer	  Acetate	  ...................................................................................................................	  14	   Mitoxantrone	  ..............................................................................................................................	  16	   Fingolimod	  ...................................................................................................................................	  16	   Natalizumab	  ................................................................................................................................	  17	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibodies	  ...........................................................................................	  19	  1.2	   Neuromyelitis	  Optica	  ..........................................................................................................	  21	  1.2.1	   History	  ................................................................................................................................................	  22	  1.2.2	   Clinical	  ................................................................................................................................................	  24	   Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  ..............................................................................................	  26	   Assays	  Detecting	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  .......................................................	  28	  1.2.3	   Pathology	  and	  Pathogenesis	  ......................................................................................................	  31	  1.2.4	   Diagnosis	  ............................................................................................................................................	  32	  1.2.5	   Epidemiology	  &	  Genetics	  ............................................................................................................	  33	  1.2.6	   Treatment	  ..........................................................................................................................................	  34	  1.3	   Surface	  Plasmon	  Resonance	  and	  Biacore™	  Technology	  .........................................	  35	  CHAPTER	  2:	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Measurement	  .......................................................	  38	  2.1	   Methods	  ...................................................................................................................................	  39	  2.1.1	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  ELISA	  .........................................................................................	  39	  2.1.2	   Detecting	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform	  .........................	  42	  2.1.3	   Biacore™	  In-­‐Solution	  Competition	  Studies	  for	  the	  Determination	  of	  Relative	  Antibody	  Affinities	  .........................................................................................................................	  45	  2.2	   Results	  .....................................................................................................................................	  47	  2.2.1	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  ELISA	  .........................................................................................	  47	  2.2.2	   Detecting	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform	  .........................	  50	  	   vii	  2.2.3	   Inhibition	  (Affinity)	  Studies	  on	  the	  Biacore™	  ....................................................................	  56	  2.3	   Conclusions	  ............................................................................................................................	  61	  CHAPTER	  3:	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  ................................................................................	  62	  3.1	   Methods	  ...................................................................................................................................	  63	  3.1.1	   Detecting	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform	  .........................	  63	  3.1.2	   Experience	  with	  commercial	  assays	  and	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  other	  laboratories	  .........................................................................................................................................	  64	  3.2	   Results	  .....................................................................................................................................	  66	  3.2.1	   Detecting	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform	  .........................	  66	  3.2.2	   Experience	  with	  commercial	  assays	  and	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  other	  laboratories	  ..........................................................................................................................	  69	  3.3	   Conclusions	  ............................................................................................................................	  74	  CHAPTER	  4:	  General	  Discussion	  ...................................................................................................	  76	  4.1	   Significance	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  testing	  in	  multiple	  sclerosis	  ..........	  76	  4.2	   Significance	  of	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  neuromyelitis	  optica	  ....	  81	  CHAPTER	  5:	  General	  Conclusions	  .................................................................................................	  86	  References	  ............................................................................................................................................	  88	  Appendix	  A:	  Optimized	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  Enzyme-­‐Linked	  Immunosorbent	  Assay	  (ELISA)	  Protocol	  .................................................................................	  107	  	  	   	  	   viii	  List	  of	  Tables	  Table	  2.1.	   IC50	  values	  for	  12C4	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  run	  on	  different	  density	  surfaces…………………………………………………………………	  58	  	  Table	  2.2.	   IC50	  values	  for	  serial	  seropositive	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  serum	  from	  a	  single	  patient	  run	  on	  a	  different	  density	  surfaces………………………...	  59	  	  Table	  3.1.	   Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  antibody	  results	  per	  lab	  technique:	  NMO	  versus	  other	  neurological	  disorders	  …………………………………………………………………………	  71	   	  	   ix	  List	  of	  Figures	  Figure	  2.1.	  	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA…………………………………………….	  41	  	  Figure	  2.2.	  	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA	  –	  Varying	  Natalizumab-­‐Biotin	  and	  SA-­‐HRP……………………………………………………………………………………………	  48	  	  Figure	  2.3.	  	   Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA	  –	  Varying	  OPD………………………	  48	  	  Figure	  2.4.	  	   Confirmatory	  competition	  assay	  using	  the	  optimized	  ELISA	  protocol……….	  49	  	  Figure	  2.5.	  	   Immobilization	  of	  Natalizumab	  onto	  a	  CM5	  Sensor	  Chip…………………………..	  51	  	  Figure	  2.6.	  	   Biacore	  binding	  response	  and	  ELISA	  OD	  for	  blinded	  12C4	  monoclonal	  samples,	  untreated	  MS	  patient	  serum,	  and	  healthy	  control	  serum…………….	  52	  	  Figure	  2.7.	  	   12C4	  monoclonal	  antibody	  response	  by	  Biacore	  and	  ELISA……………………...	  53	  	  Figure	  2.8.	  	   Correlation	  between	  12C4	  monoclonal	  antibody	  concentrations	  and	  a)	  Biacore	  response,	  b)	  and	  ELISA	  OD	  value…………………………………………….	  54	  	  Figure	  2.9.	  	   Anti-­‐Natalizumab	  antibody	  levels	  over	  time	  in	  one	  seropositive	  patient…...	  54	  	  	  Figure	  2.10.	  	   Anti-­‐natalizumab	  antibody	  levels	  of	  serum	  pre-­‐incubated	  with	  excess	  natalizumab…………………………………………………………………………………………...	  55	  	  Figure	  2.11.	  	   Inhibition	  curves	  for	  12C4	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody………………………………………………………………………………………………...	  57	  	  Figure	  2.12.	  	   Inhibition	  curves	  for	  anti-­‐natalizumab	  seropositive	  serum	  on	  a	  high	  density	  surface……………………………………………………………………………………….	  58	  	  Figure	  2.13.	  	   Change	  in	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Levels	  and	  IC50	  Over	  Time……………	  60	  	  Figure	  3.1.	  	   Immobilization	  of	  Aquaporin-­‐4	  onto	  a	  CM3	  Sensor	  Chip…………………………..	  67	  	  Figure	  3.2.	   	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  Binding	  Response	  of	  Kronus®	  ELISA	  Kit	  Controls	  as	  Measured	  by	  Biacore™…………………………………………………………..	  68	  	  Figure	  3.3.	   Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  Binding	  Response	  of	  Seropositive,	  Seronegative,	  and	  Healthy	  Control	  Samples	  as	  Measured	  by	  Biacore™……...	  69	  	  Figure	  3.4.	  	   Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  results	  as	  per	  the	  number	  of	  testing	  sites………	  72	  	  Figure	  3.5.	  	   Results	  from	  re-­‐assaying	  discrepant	  samples…………………………………………..	  73	  	   	  	   x	  Acknowledgements	  There	  are	  a	  number	  of	  people	  without	  whom	  this	  thesis	  might	  not	  have	  been	  written,	  and	  to	  whom	  I	  am	  greatly	  indebted.	  First	  and	  foremost,	  I	  would	  like	  to	  express	  my	  gratitude	  to	  Dr.	  Oger,	  my	  supervisor,	  for	  the	  patient	  guidance,	  encouragement,	  and	  advice	  he	  has	  provided	  throughout	  my	  time	  as	  his	  student.	  As	  well,	  I	  thank	  Dr.	  Traboulsee	  and	  Dr.	  Quandt	  for	  serving	  as	  my	  supervisory	  committee	  and	  for	  their	  comments	  and	  suggestions.	  To	  the	  other	  members	  of	  the	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratory,	  for	  their	  help	  and	  support	  over	  the	  years.	  I	  am	  grateful	  to	  Dr.	  Gibbs	  and	  Tariq	  Aziz	  for	  their	  help	  and	  encouragement	  with	  my	  project	  and	  for	  always	  making	  time	  for	  me	  when	  I	  have	  questions	  and	  for	  their	  efforts	  to	  make	  things	  easier	  for	  me.	  For	  the	  other	  students	  in	  the	  lab,	  especially	  Zahra	  Pakzad	  and	  Jenah	  Alibhai,	  thank	  you	  for	  the	  moral	  and	  emotional	  support	  and	  never	  failing	  to	  put	  a	  smile	  on	  my	  face	  when	  times	  were	  tough.	  To	  my	  parents,	  for	  their	  love	  and	  support,	  both	  financial	  and	  moral,	  and	  especially	  for	  stressing	  the	  value	  of	  education	  and	  not	  pressuring	  me	  to	  be	  anyone	  other	  than	  myself.	  I	  particularly	  want	  to	  thank	  my	  dad	  for	  his	  undying	  love	  and	  countless	  rides	  to	  school	  especially	  on	  those	  mornings	  when	  getting	  out	  of	  bed	  and	  getting	  ready	  for	  the	  day	  was	  the	  hardest	  thing	  in	  the	  world.	  To	  my	  brother,	  Richard,	  for	  frequently	  telling	  me	  that	  “school	  is	  for	  losers”	  during	  the	  course	  of	  my	  undergrad,	  and	  still	  attending	  my	  graduation	  and	  enthusiastically	  taking	  pictures.	  Thank	  you	  for	  firing	  up	  the	  sibling	  rivalry	  in	  me	  and	  motivating	  me	  to	  prove	  you	  wrong	  and,	  ultimately,	  do	  better	  than	  I	  ever	  expected.	  	   xi	  To	  Eric	  Cruz,	  for	  the	  emotional	  and	  moral	  support	  throughout	  my	  post-­‐secondary	  education,	  as	  well	  as	  the	  rides	  home	  and	  being	  the	  only	  one	  I	  can	  “talk	  science”	  with	  outside	  of	  school.	  I	  would	  also	  like	  to	  thank	  my	  sister-­‐in-­‐law,	  Charlene	  Fronda,	  for	  being	  an	  incredibly	  good	  friend	  over	  the	  years	  and	  for	  just	  being	  there	  especially	  during	  hardships.	  And	  lastly,	  I’d	  like	  to	  thank	  the	  endMS	  Research	  and	  Training	  Network	  for	  giving	  me	  an	  avenue	  to	  improve	  as	  a	  student	  and	  researcher	  through	  the	  Summer	  School,	  journal	  clubs,	  and	  presentations.	  	  	   	  	   xii	  Dedication	  	  	  	   To my parents	   1	  CHAPTER	  1:	  Introduction	  Antibody	  testing	  is	  widely	  used	  in	  medicine.	  Natural	  antibody	  production	  and	  targeting	  of	  antigen	  is	  dependent	  on	  the	  body's	  capability	  to	  differentiate	  self	  from	  foreign	  antigens	  and	  to	  correctly	  recognize	  foreign	  substances	  that	  represent	  threats.	  In	  the	  case	  of	  autoimmune	  diseases,	  there	  is	  a	  breakdown	  of	  the	  physiological	  mechanisms	  that	  maintain	  tolerance	  to	  self-­‐antigens	  and	  appearance	  of	  antibodies	  directed	  against	  self-­‐antigens.	  Depending	  on	  the	  function	  of	  the	  antibody,	  testing	  can	  be	  done	  for	  various	  reasons.	  For	  example,	  the	  detection	  of	  certain	  autoantibodies	  can	  be	  used	  for	  diagnostic	  purposes.	  Testing	  for	  antibodies	  against	  certain	  viral	  or	  bacterial	  antigens	  can	  reveal	  previous	  exposure	  through	  infection	  or	  vaccination.	  As	  well,	  assaying	  for	  antibodies	  against	  therapeutic	  biologicals	  in	  treated	  patients	  is	  significant	  as	  these	  antibodies	  can	  potentially	  lead	  to	  allergic	  reactions,	  altered	  pharmacokinetics,	  and	  decreased	  efficacy.	  The	  hypothesis	  of	  this	  thesis	  is	  that	  in	  order	  to	  effectively	  discuss	  testing	  for	  a	  particular	  antibody,	  one	  must	  consider	  the	  function	  of	  the	  antibody,	  as	  well	  as	  the	  assay(s)	  used	  to	  detect	  it	  and	  its	  role	  in	  the	  context	  of	  the	  disorder	  it	  is	  associated	  with.	  The	  goal	  of	  this	  thesis	  is	  to	  examine	  antibody	  testing	  in	  the	  context	  of	  two	  demyelinating	  disorders	  of	  the	  central	  nervous	  system	  (CNS),	  multiple	  sclerosis	  (MS;	  anti-­‐natalizumab	  antibody,	  an	  anti-­‐biological)	  and	  neuromyelitis	  optica	  (NMO;	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  (AQP4-­‐Ab),	  a	  pathological	  autoantibody).	  The	  specific	  aims	  in	  discussing	  clinical	  relevance	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  MS	  were	  the	  following:	  i)	  to	  optimize	  an	  in-­‐house	  ELISA	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  based	  on	  the	  Biogen	  Idec	  ELISA,	  ii)	  to	  validate	  an	  assay	  to	  detect	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  based	  on	  surface	  plasmon	  resonance	  	   2	  technology	  (Biacore®),	  and	  iii)	  to	  use	  the	  Biacore	  assay	  to	  characterize	  the	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  response.	  For	  examining	  the	  clinical	  relevance	  of	  AQP4-­‐Ab	  testing	  in	  NMO,	  the	  aim	  was	  to	  compare	  two	  commercial	  assays	  for	  AQP4-­‐Ab	  against	  other	  available	  methods	  at	  other	  laboratories.	  This	  introductory	  chapter	  is	  a	  review	  of	  the	  literature	  regarding	  the	  antibodies	  being	  studied,	  the	  diseases	  in	  which	  these	  antibodies	  are	  relevant,	  and	  the	  scientific	  principles	  behind	  technology	  that	  we	  have	  used	  in	  the	  detection	  of	  these	  antibodies.	  The	  assays	  used	  for	  the	  detection	  of	  the	  antibodies,	  as	  well	  as	  the	  subsequent	  experiments,	  data	  analysis,	  and	  results	  are	  detailed	  in	  the	  research	  chapters	  (Chapters	  2	  and	  3).	  Lastly,	  the	  relevance	  and	  implications	  of	  the	  results	  within	  the	  framework	  of	  current	  knowledge	  in	  the	  fields,	  and	  the	  overall	  thesis	  conclusions	  are	  also	  discussed	  (Chapters	  4	  and	  5,	  respectively).	  	  1.1 Multiple	  Sclerosis	  Multiple	  sclerosis	  (MS)	  is	  a	  chronic	  inflammatory,	  demyelinating,	  and	  degenerative	  disease	  of	  the	  CNS	  that	  results	  in	  injury	  to	  oligodendrocytes	  and	  demyelination	  of	  axons.1-­‐3	  As	  a	  result,	  the	  transmission	  of	  nerve	  impulses	  becomes	  impaired,	  particularly	  in	  pathways	  involved	  with	  vision,	  sensation,	  and	  movement.	  The	  main	  pathological	  feature	  is	  the	  “MS	  plaque”,	  a	  zone	  of	  damaged	  myelin	  in	  the	  brain	  or	  spinal	  cord,	  that	  is	  unique	  from	  other	  inflammatory	  diseases.4	  The	  disease	  is	  primarily	  diagnosed	  on	  the	  basis	  of	  clinical	  findings	  and	  supporting	  evidence	  from	  auxiliary	  assessments,	  such	  as	  magnetic	  resonance	  imaging	  (MRI)	  of	  the	  brain	  and	  analysis	  of	  cerebrospinal	  fluid	  (CSF).5	  Patients	  are	  grouped	  into	  major	  categories	  based	  on	  their	  disease	  course:6	  	   3	  • Relapsing-­‐remitting	  MS	  (RRMS):	  affects	  approximately	  85%	  of	  MS	  patients.	  It	  is	  characterized	  by	  exacerbations	  or	  relapses	  of	  symptoms	  followed	  by	  periods	  where	  symptoms	  would	  improve	  or	  disappear	  completely,	  i.e.	  remissions.	  • Secondary	  progressive	  MS	  (SPMS):	  approximately	  50%	  of	  patients	  with	  RRMS	  may	  develop	  this	  disease	  course	  when	  symptoms	  continue	  to	  worsen	  with	  minor	  or	  no	  remissions	  or	  plateaus	  of	  symptom	  severity.	  • Primary	  progressive	  MS	  (PPMS):	  affects	  about	  10%	  of	  MS	  patients.	  Symptoms	  worsen	  gradually	  from	  onset	  without	  relapses	  or	  remissions,	  but	  may	  sometimes	  have	  plateaus.	  PPMS	  is	  generally	  resistant	  to	  the	  therapies	  typically	  used	  for	  treatment	  of	  the	  disease.	  • Progressive-­‐relapsing	  MS:	  affects	  less	  than	  5%	  of	  MS	  patients.	  It	  is	  progressive	  from	  the	  beginning	  with	  occasional	  relapses	  and	  no	  periods	  of	  remission.	  Though	  the	  cause	  of	  the	  disease	  is	  unknown,	  a	  combination	  of	  genetic	  susceptibility	  and	  a	  nongenetic	  trigger,	  such	  as	  a	  virus	  or	  other	  environmental	  factors	  like	  vitamin	  D,	  appear	  to	  be	  associated.5	  Persons	  of	  Northern	  European	  origin	  appear	  to	  be	  at	  higher	  risk	  for	  MS;	  as	  well,	  women	  are	  more	  frequently	  (2:1)	  affected	  more	  often	  than	  men.5,	  6	  Furthermore,	  it	  is	  typically	  adults	  of	  age	  range	  between	  20	  to	  45	  years	  that	  present	  with	  MS,	  although	  it	  can	  also	  present	  in	  late	  middle	  age	  or	  childhood.5	  1.1.1 Clinical	  The	  onset	  of	  MS	  may	  be	  subtle	  or	  sudden.1	  Often,	  initial	  clinical	  symptoms	  in	  MS	  patients	  are	  sensory	  disturbances,	  the	  most	  common	  of	  which	  are	  paresthesias	  (numbness	  and	  tingling),	  dysesthesias	  (burning	  and	  “pins	  and	  needles”),	  diplopia,	  ataxia,	  vertigo,	  and	  bladder	  (urinary	  sphincter)	  disturbances.	  Sensory	  disturbances	  typically	  dissipate	  but	  	   4	  sometimes	  it	  becomes	  chronic	  neuropathic	  pain.	  A	  common	  presentation	  is	  unilateral	  numbness	  affecting	  one	  leg	  that	  spreads	  to	  involve	  the	  other	  leg	  and	  rises	  to	  the	  pelvis,	  abdomen,	  or	  thorax.	  More	  than	  30%	  of	  MS	  patients	  have	  moderate-­‐to-­‐severe	  spasticity,	  mostly	  in	  the	  legs.	  Trigeminal	  neuralgia	  can	  also	  occurs.	  Another	  common	  manifestation	  of	  MS	  is	  optic	  neuritis,	  highlighted	  by	  complete	  or	  partial	  loss	  of	  vision.6	  More	  than	  90%	  of	  MS	  patients	  have	  bladder	  dysfunction	  resulting	  in	  weekly	  or	  more	  frequent	  episodes	  of	  incontinence	  in	  one-­‐third	  of	  patients,	  while	  at	  least	  30%	  of	  patients	  experience	  constipation.6	  Fatigue,	  the	  most	  common	  work-­‐related	  disability	  associated	  with	  MS,	  occurs	  in	  90%	  of	  patients.6	  Sexual	  problems	  are	  often	  experienced	  as	  well.5	  Since	  there	  is	  no	  single	  diagnostic	  test	  for	  MS,	  diagnosis	  relies	  on	  clinical	  features	  supplemented	  by	  radiological	  and	  laboratory	  tests.1	  The	  diagnosis	  of	  MS	  is	  based	  on	  evidence	  of	  i)	  at	  least	  two	  different	  lesions	  (plaques	  or	  scars)	  in	  the	  white	  matter	  of	  the	  CNS	  (dissemination	  in	  space),	  ii)	  at	  least	  two	  different	  episodes	  in	  the	  disease	  course	  (dissemination	  in	  time),	  and	  iii)	  chronic	  inflammation	  of	  the	  CNS,	  as	  determined	  by	  the	  analysis	  of	  the	  CSF	  (the	  inflammatory	  criterion).6	  Although	  the	  diagnosis	  can	  be	  made	  on	  clinical	  grounds	  alone,	  MRI	  of	  the	  CNS	  can	  support,	  supplement,	  or	  even	  replace	  some	  clinical	  criteria,7-­‐13	  as	  stressed	  by	  the	  McDonald	  Criteria	  of	  the	  International	  Panel	  on	  Diagnosis	  of	  MS.9,	  10	  For	  example,	  it	  is	  suggested	  that	  the	  dissemination	  in	  space	  and	  time	  criteria	  should	  be	  confirmed	  on	  MRI,	  i.e.	  the	  presence	  of	  lesions	  that	  occur	  in	  different	  parts	  of	  the	  CNS	  at	  least	  3	  months	  apart.9	  As	  a	  variety	  of	  conditions	  can	  mimic	  MS,	  it	  is	  also	  important	  to	  exclude	  alternative	  diagnoses.	  	   MRI	  of	  the	  brain	  has	  been	  shown	  to	  be	  the	  most	  useful	  test	  for	  confirming	  a	  diagnosis	  of	  MS	  as	  almost	  all	  patients	  with	  clinically	  definite	  MS	  will	  have	  abnormal	  scans	  	   5	  when	  performed	  with	  a	  high-­‐field	  magnet	  of	  1.5	  tesla	  or	  greater.9,	  14	  Lesions	  characteristic	  of	  MS	  appear	  as	  areas	  of	  high	  signal	  on	  T2-­‐weighted	  and	  FLAIR	  MRIs	  predominantly	  in	  the	  cerebral	  white	  matter	  or	  spinal	  cord.9	  Lesions	  in	  the	  brain	  are	  often	  found	  juxtacortically	  (i.e.	  at	  the	  gray-­‐white	  matter	  junction),	  and	  adjacent	  to	  ventricles.	  Involvement	  of	  the	  brainstem,	  corpus	  callosum,	  or	  cerebellum	  is	  also	  seen.	  On	  the	  other	  hand,	  spinal	  cord	  lesions	  are	  one	  or	  two	  vertebral	  segments	  in	  length	  and	  present	  with	  incomplete	  cross-­‐sectional	  involvement	  with	  no	  cord	  swelling.	  Gadolinium	  contrast	  enhances	  actively	  inflamed	  brain	  lesions,	  though	  is	  less	  likely	  to	  enhance	  lesions	  of	  the	  spinal	  cord.	  	   On	  top	  of	  MRI,	  there	  are	  other	  tools	  when	  diagnosing	  MS.	  Sensory	  evoked	  potential	  testing	  is	  useful	  in	  detecting	  the	  presence	  of	  subclinical	  lesions	  in	  sensory	  pathways,	  such	  as	  in	  the	  optic	  nerve,	  and	  provide	  objective	  evidence	  on	  the	  basis	  of	  subjective	  complaints	  from	  patients	  when	  lesions	  may	  not	  be	  evident	  on	  MRI	  scans.15	  Furthermore,	  it	  has	  been	  demonstrated	  that	  approximately	  90%	  of	  patients	  with	  definite	  MS	  have	  an	  increased	  CSF	  immunoglobulin	  G	  (IgG)	  concentration	  relative	  to	  other	  CSF	  proteins,	  such	  as	  albumin,	  and	  that	  CSF	  gel	  electrophoresis	  shows	  oligoclonal	  bands	  not	  present	  in	  matched	  serum	  samples.16	  Though	  oligoclonal	  banding	  in	  CSF	  is	  not	  specific	  for	  MS,	  CSF	  analysis	  is	  valuable	  in	  its	  ability	  to	  rule	  out	  infections	  or	  neoplastic	  conditions	  that	  may	  mimic	  MS.	  Similarly,	  since	  there	  is	  no	  serological	  marker	  for	  MS,	  testing	  of	  peripheral	  blood	  is	  more	  helpful	  in	  excluding	  other	  disease	  processes	  than	  actually	  revealing	  indicators	  MS.	  	  1.1.2 Pathology	  MS	  is	  largely	  a	  disease	  of	  the	  white	  matter	  with	  lesions	  appearing	  mainly	  in	  a	  peri-­‐ventricular	  distribution,	  i.e.	  clustered	  around	  the	  ventricles	  of	  the	  brain,	  but	  also	  in	  the	  	   6	  cortex	  and	  deep	  gray	  matter	  nuclei,	  together	  with	  diffuse	  injury	  of	  the	  normal-­‐appearing	  white	  matter	  (NAWM).17	  Gray	  matter	  atrophy	  is	  independent	  of	  MS	  lesions	  and	  is	  associated	  with	  physical	  disability,	  fatigue,	  and	  cognitive	  impairment	  in	  MS.18	  MS	  lesions	  can	  be	  described	  as	  active	  or	  inactive.19	  Active	  lesions	  appear	  as	  cheesy	  pink	  or	  gray,	  soft,	  irregular	  areas.	  Ongoing	  demyelination	  is	  marked	  by	  activation	  of	  macrophages	  and	  phagocytosis	  of	  myelin	  proteins	  in	  the	  lesions.20,	  21	  Active	  lesions	  have	  infiltrates	  consisting	  of	  macrophages	  containing	  myelin	  debris	  that	  are	  often	  closely	  associated	  with	  the	  damaged	  myelin	  sheath,	  and	  evenly	  distributed	  hypertrophic	  reactive	  astrocytes	  with	  prominent	  eosinophilic	  cytoplasms	  and	  somewhat	  polymorphic	  nuclei.	  While	  an	  active	  MS	  lesion	  is	  one	  in	  which	  there	  is	  ongoing	  inflammation	  around	  the	  blood	  vessels	  throughout	  the	  lesion,	  with	  impairment	  of	  the	  blood-­‐brain	  barrier	  (BBB),	  as	  indicated	  by	  enhancement	  of	  the	  lesion	  on	  brain	  MRI	  with	  gadolinium	  contrast,22	  a	  plaque	  is	  an	  area	  of	  damaged	  myelin	  in	  the	  CNS.	  Recent	  plaques	  are	  usually	  active	  for	  up	  to	  a	  few	  weeks	  and	  can	  subsequently	  enlarge	  with	  active	  inflammation	  around	  its	  periphery.23	  The	  demyelinated	  MS	  plaque	  consists	  of	  a	  distinct	  hypocellular	  area	  characterized	  by	  BBB	  leakage,	  destruction	  of	  myelin	  sheaths,	  oligodendrocyte	  damage	  and	  cell	  death,	  along	  with	  axonal	  damage	  and	  loss,	  the	  formation	  of	  astrocytic	  scars,	  and	  the	  presence	  of	  mononuclear	  infiltrates.	  These	  infiltrates,	  which	  are	  concentrated	  in	  perivascular	  spaces	  and	  mainly	  comprised	  of	  autoreactive	  T	  cells	  (CD8	  and	  CD4),	  B	  lymphocytes,	  macrophages,	  microglial	  cells,	  ependymal	  cells,	  astrocytes,	  and	  mast	  cells,	  actuate	  a	  proinflammatory	  response	  that	  ultimately	  results	  in	  local	  tissue	  injury.24-­‐26	  The	  chronic	  inactive	  plaque	  is	  one	  that	  is	  a	  sharply	  circumscribed	  hypocellular	  area	  with	  no	  evidence	  of	  active	  myelin	  breakdown	  with	  prominent	  fibrillary	  gliosis	  with	  reduced	  oligodendrocyte	  and	  axonal	  density.	  	   7	  	   The	  extent	  of	  remyelination	  during	  the	  early	  stages	  if	  the	  disease	  appears	  to	  be	  dependent	  on	  the	  availability	  of	  oligodendrocytes	  or	  their	  progenitor	  cells	  in	  the	  lesions.	  Lucchinetti	  et	  al.	  found	  that	  oligodendrocytes	  were	  variably	  reduced	  during	  active	  stages	  of	  myelin	  destruction	  but	  reemerged	  within	  inactive	  lesions	  that	  displayed	  prominent	  remyelination.27	  The	  presence	  of	  cells	  expressing	  phospholipid	  protein	  mRNA,	  but	  not	  myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein	  (MOG),	  suggested	  that	  these	  oligodendrocytes	  may	  have	  been	  derived	  from	  the	  progenitor	  pool.	  They	  also	  found	  that	  in	  30%	  of	  cases,	  there	  was	  major	  loss	  of	  oligodendrocytes	  in	  areas	  of	  active	  demyelination	  in	  the	  absence	  of	  progenitor	  cell	  recruitment.	  These	  sites	  were	  associated	  with	  inactive	  plaque	  areas	  where	  remyelination	  was	  sparse	  or	  nonexistent.	  	   Remyelination	  is	  also	  present	  in	  chronic	  MS	  lesions	  though	  it	  has	  been	  found	  to	  be	  incomplete	  and	  limited	  to	  the	  edges	  of	  the	  demyelinated	  plaque.	  Shadow	  plaques	  are	  sometimes	  seen	  in	  chronic	  cases	  where	  lesions	  can	  display	  extensive	  remyelination	  and	  are	  sharply	  demarcated	  areas	  of	  myelin	  pallor	  and	  gliosis.20,	  28	  Furthermore,	  completely	  demyelinated	  plaques	  without	  mature	  oligodendrocytes	  have	  been	  found	  to	  have	  cells	  in	  very	  early	  stages	  of	  oligodendrocyte	  development	  suggesting	  a	  significant	  role	  in	  remyelination.29	  	   Inflammatory	  infiltrates	  in	  MS	  lesions	  include	  T-­‐lymphocytes	  (CD8	  and	  CD4),	  few	  B	  lymphocytes	  and	  plasma	  cells,	  and	  extensive	  activation	  of	  macrophages	  and	  microglial.20	  The	  inflammatory	  response	  in	  MS	  lesions	  is	  associated	  with	  the	  up-­‐regulation	  of	  a	  variety	  of	  Th1	  cytokines.	  These	  include	  interleukin	  (IL)-­‐1,	  IL-­‐2,	  IL-­‐12,	  interferon	  (IFN)-­‐γ,	  and	  tumor	  necrosis	  factor	  (TNF)-­‐α,	  which	  are	  also	  found	  in	  the	  CSF	  of	  MS	  patients	  with	  active	  disease.30,	  31	  Moreover,	  active	  MS	  lesions	  contain	  activated	  endothelial	  cells	  that	  express	  	   8	  adhesion	  molecules,	  fibronectin,	  urokinase	  plasmin	  activator	  receptor,	  major	  histocompatibility	  complex	  (MHC)	  class	  II	  molecules,	  chemokines,	  and	  their	  receptors,	  as	  well	  as	  stress	  proteins.32	  Though	  the	  pathogenic	  role	  of	  the	  inflammatory	  reaction	  in	  MS	  is	  uncertain,	  there	  is	  evidence	  to	  support	  both	  concepts	  that	  the	  inflammatory	  response	  is	  a	  prerequisite	  for	  demyelination,	  and	  that	  it	  may	  occur	  independently	  of	  demyelination.	  	   Besides	  the	  focal	  demyelinated	  plaques,	  MS	  patients	  also	  display	  a	  diffuse	  global	  injury	  of	  the	  NAWM.33	  Neuroimaging	  studies	  suggest	  that	  while	  MS	  patients	  exhibit	  diffuse	  pathology	  within	  the	  NAWM,	  the	  extent	  of	  inflammation	  and	  axonal	  injury	  in	  the	  NAWM	  does	  not	  correlate	  with	  the	  number,	  distribution,	  activity,	  or	  destructiveness	  of	  focal	  white-­‐matter	  lesions.33 Experimental	  Autoimmune	  Encephalomyelitis	  Traditionally,	  MS	  has	  been	  considered	  an	  autoimmune	  disorder	  consisting	  of	  myelin	  autoreactive	  T	  cells	  that	  drive	  the	  inflammatory	  process,	  leading	  to	  secondary	  macrophage	  recruitment	  and	  subsequent	  myelin	  destruction	  and	  axonal	  injury.	  This	  view	  of	  MS	  as	  a	  T-­‐cell-­‐mediated	  autoimmune	  disease	  is	  derived	  primarily	  from	  studies	  on	  experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis	  (EAE),	  the	  oldest	  and	  most	  widely	  used	  animal	  model	  for	  MS.26	  Since	  the	  1930s,	  EAE	  has	  been	  elicited	  in	  many	  different	  species,	  including	  mice,	  rats,	  rabbits,	  guinea	  pigs,	  and	  non-­‐human	  primates.	  It	  became	  evident	  from	  these	  animal	  studies	  that	  EAE	  can	  reproduce	  many	  of	  the	  clinical,	  neuropathological	  and	  immunological	  features	  of	  MS.34	  This	  led	  to	  the	  belief	  that	  once	  the	  pathogenesis	  of	  EAE	  is	  explained,	  so	  will	  MS,	  and	  that	  new	  therapeutic	  strategies	  developed	  in	  EAE	  should	  be	  automatically	  beneficial	  in	  MS	  patients.35	  However,	  research	  in	  the	  past	  decade	  has	  revealed	  evidence	  that	  the	  simplistic	  	   9	  view	  of	  the	  immunopathogenesis	  of	  MS,	  which	  was	  greatly	  derived	  from	  EAE	  studies,	  cannot	  encompass	  all	  that	  is	  covered	  by	  “multiple	  sclerosis”,	  which	  is	  now	  known	  to	  be	  a	  complex	  disease	  with	  a	  wide	  spectrum	  of	  clinical	  and	  pathological	  phenotypes.26,	  35	  	   MS	  and	  EAE	  have	  some	  fundamental	  differences,	  the	  most	  apparent	  being	  that	  while	  MS	  is	  a	  spontaneous	  disease,	  EAE	  is	  induced	  in	  different	  animal	  models	  by	  active	  sensitization	  with	  various	  brain	  tissue	  antigens	  (active	  induction)	  or	  by	  adoptive	  transfer	  of	  activated	  T	  cells	  from	  animals	  immunized	  with	  myelin	  antigens.	  The	  most	  commonly	  used	  antigens	  in	  rodents	  are	  spinal	  cord	  homogenate	  (SCH),	  purified	  myelin,	  myelin	  protein	  such	  as	  myelin	  basic	  protein,	  phospholipid	  protein,	  and	  myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein	  (MOG),	  or	  peptides	  of	  these	  proteins,	  all	  resulting	  in	  distinct	  models	  with	  different	  disease	  characteristics	  regarding	  both	  immunology	  and	  pathology.36,	  37	  The	  use	  of	  strong	  immune	  adjuvants	  required	  to	  induce	  disease	  is	  quite	  unlike	  physiological	  conditions	  even	  in	  infectious	  diseases.35	  Spontaneous	  EAE	  has	  been	  developed	  in	  certain	  mouse	  models	  that	  have	  been	  engineered	  to	  express	  myelin-­‐specific,	  transgenic	  T	  cell	  receptor.38,	  39	  These	  models,	  however,	  are	  still	  reliant	  on	  transgenic	  methods	  to	  override	  the	  intrinsic	  regulatory	  mechanisms	  that	  suppress	  tissue-­‐specific	  autoaggression.40-­‐42	  As	  well,	  EAE	  is	  mainly	  studied	  in	  genetically	  homogeneous	  populations	  or	  inbred	  animals,	  which	  cannot	  compare	  to	  the	  genetic	  heterogeneity	  of	  the	  MS	  population	  even	  when	  studying	  different	  EAE	  models	  in	  parallel.	  Despite	  the	  limitations,	  multiple	  EAE	  animal	  models	  have	  been	  essential	  in	  deciphering	  clinical	  course,	  pathology,	  and	  inflammatory	  patterns	  in	  MS.	  Collectively,	  these	  models	  reveal	  a	  balance	  between	  pathogenic	  and	  regulatory	  CD4+	  T	  cells,	  CD8+	  T	  cells,	  and	  B	  cells	  that	  influences	  the	  incidence,	  timing,	  and	  severity	  of	  CNS	  autoimmunity.43	  This	  knowledge	  comprises	  a	  large	  part	  our	  currently	  	   10	  knowledge	  regarding	  principal	  mechanisms	  of	  brain	  inflammation	  and	  has	  paved	  the	  way	  to	  a	  better	  understanding	  of	  the	  pathogenesis	  of	  MS	  and	  the	  development	  of	  new	  therapies.	  	  1.1.3 Genetics	  Epidemiological	  data	  strongly	  suggests	  that	  a	  genetic	  predisposition	  exists	  in	  MS,	  though	  the	  rates	  vary	  depending	  on	  age	  and	  gender.44	  As	  such,	  the	  risk	  of	  developing	  MS	  is	  increased	  if	  a	  first-­‐degree	  relative	  has	  the	  disease.	  While	  the	  lifetime	  incidence	  of	  MS	  is	  0.1	  %	  in	  the	  normal	  population,	  the	  siblings	  of	  MS	  patients	  have	  a	  lifetime	  risk	  of	  3%,	  or	  25%	  if	  they	  are	  twins.44	  	   It	  is	  now	  recognized	  that	  MS	  is	  a	  complex	  genetic	  disease,	  clustering	  with	  other	  disorders	  that	  are	  marked	  by	  a	  modest	  disease	  risk	  heritability	  driven	  largely	  by	  allelic	  variants	  that	  are	  relatively	  common	  in	  the	  population.45	  Thus,	  enormous	  efforts	  have	  been	  undertaken	  to	  pinpoint	  potential	  risk	  alleles	  that	  predispose	  for	  MS.	  The	  strongest	  susceptibility	  is	  seen	  with	  the	  HLA-­‐DRB1	  gene	  in	  the	  class	  II	  region	  of	  the	  major	  histocompatibility	  complex	  (MHC),	  which	  explains	  up	  to	  10.5%	  of	  genetic	  variance	  underlying	  risk.	  This	  association	  to	  HLA	  further	  suggests	  MS	  is	  fundamentally	  an	  antigen-­‐specific	  autoimmune	  disease.45	  However,	  genome-­‐wide	  association	  studies	  have	  identified	  close	  to	  110	  non-­‐MHC	  polymorphisms	  that,	  together,	  explain	  roughly	  20%	  of	  MS	  risk.46	  Despite	  efforts,	  a	  large	  part	  of	  heritability	  in	  MS	  is	  still	  unsolved,	  and	  proposed	  explanations	  for	  this	  portion	  include	  gene-­‐by-­‐gene	  and	  gene-­‐by	  environment	  interactions,	  cis/trans	  regulators	  of	  allelic	  expression,	  population	  and/or	  disease	  heterogeneity,	  and	  hidden	  epigenetic	  effects.45	  	  	   11	  1.1.4 Epidemiology	  Epidemiological	  risk	  factors	  that	  have	  been	  established	  for	  MS	  include	  vitamin	  D	  deficiency,	  exposure	  to	  the	  Epstein-­‐Barr	  virus	  (EBV)	  after	  childhood	  and	  subsequent	  development	  of	  infectious	  mononucleosis,	  and	  cigarette	  smoking.47,	  48	  	   Due	  to	  avoidance	  of	  exposure	  to	  direct	  sunlight	  and	  diminished	  consumption	  of	  deep	  sea	  fish,	  vitamin	  D	  deficiency	  is	  widespread	  in	  the	  Western	  world	  and	  also	  has	  a	  well-­‐defined	  effect	  on	  MS	  risk.	  47,	  48	  Vitamin	  D	  has	  been	  tied	  to	  positive	  effects	  on	  the	  immune	  system,	  especially	  antigen-­‐presenting	  cell	  activity.	  Additionally,	  there	  are	  suggestive	  observations	  that	  vitamin	  D	  deficiency	  could	  increase	  the	  severity	  or	  occurrence	  inflammatory	  episodes	  in	  RRMS.	  	   Exposure	  to	  EBV	  is	  also	  clearly	  associated	  with	  MS	  risk.	  Great	  efforts	  to	  isolate	  an	  infectious	  pathogen	  that	  could	  trigger	  cross-­‐reactive	  autoimmune	  demyelination	  have	  led	  to	  reports	  of	  immune	  responses	  in	  CSF	  oligoclonal	  bands	  that	  might	  be	  directed	  to	  EBV	  antigens	  in	  MS.49	  Unfortunately,	  these	  observations	  remain	  unsubstantiated.50,	  51	  On	  the	  other	  hand,	  acute	  EBV	  infections	  often	  result	  in	  a	  life-­‐long	  carrier	  state	  in	  B	  cells,	  and	  clinical	  studies	  have	  demonstrated	  that	  inflammatory	  disease	  activity	  in	  MS	  essentially	  stops	  when	  B	  cells	  are	  depleted.	  	  	   Hedstrom	  et	  al.	  showed	  that	  smoking	  cigarettes,	  but	  not	  chewing	  tobacco,	  related	  to	  MS	  risk	  and	  progression	  proposing	  that	  how	  the	  lung	  handles	  cigarette	  smoke	  could	  be	  significant	  in	  MS.52	  This	  matches	  reports	  from	  animal	  studies	  that	  indicate	  the	  lung	  to	  be	  the	  site	  for	  disease-­‐inducing	  T	  cell	  activation.53	  	  	   12	  1.1.5 Current	  treatments	  and	  therapies	  As	  there	  is	  currently	  no	  cure	  for	  MS,	  disease-­‐modifying	  therapies	  have	  been	  developed	  with	  goals	  to	  decrease	  the	  frequency	  and	  severity	  of	  clinical	  relapses,	  reduce	  new	  T2	  and	  gadolinium-­‐enhancing	  lesions,	  provide	  symptomatic	  relief,	  and	  halt	  the	  progression	  of	  the	  disease.5	  	   The	  purpose	  of	  symptomatic	  treatments	  is	  to	  maintain	  function	  and	  to	  improve	  quality	  of	  life	  of	  MS	  patients.54	  Acute	  exacerbations	  of	  MS	  are	  often	  treated	  with	  a	  3	  to	  5	  day	  course	  of	  fast-­‐acting	  corticosteroids	  that	  have	  few	  adverse	  events,	  such	  as	  intravenous	  (IV)	  dexamethasone	  or	  methylprednisolone.5,	  54-­‐56	  Brief	  courses	  of	  oral	  or	  IV	  corticosteroids	  can	  also	  be	  used	  to	  treat	  acute	  attacks	  and	  to	  shorten	  the	  duration	  of	  relapses.6,	  57	  	   While	  symptomatic	  treatments	  are	  used	  for	  the	  treatment	  of	  acute	  relapses	  and	  exacerbations,	  disease-­‐modifying	  drugs	  (DMDs)	  are	  long-­‐term	  treatments	  to	  modify	  the	  natural	  disease	  course	  with	  an	  attempt	  to	  slow	  its	  progression.	  There	  are	  currently	  a	  total	  of	  eight	  Health	  Canada	  and	  US	  Food	  and	  Drug	  Administration	  (FDA)-­‐approved	  DMDs	  for	  the	  treatment	  of	  RRMS,	  as	  well	  as	  SPMS	  patients	  who	  continue	  to	  have	  relapses.	  These	  include	  four	  beta	  interferons,	  glatiramer	  acetate,	  mitoxantrone,	  natalizumab,	  and	  fingolimod,	  the	  only	  oral	  therapy.	  All	  first-­‐line	  injectable	  agents	  have	  been	  studied	  in	  clinically	  isolated	  syndrome	  (CIS)	  and	  have	  shown	  a	  decreased	  risk	  of	  conversion	  to	  clinically	  definite	  MS.58-­‐60	  However,	  there	  is,	  at	  present,	  no	  successful	  therapy	  to	  halt	  disease	  progression	  and	  reduce	  disability	  in	  PPMS.	  	  	  	   13 Beta	  Interferons	  There	  are	  four	  beta	  interferons	  (IFN-­‐β)	  currently	  on	  the	  market	  for	  treatment	  of	  MS:	  Avonex®	  (IFN-­‐β1a;	  Biogen	  Idec),	  Rebif®	  (IFN-­‐β1a;	  Pfizer),	  Betaseron®	  (IFN-­‐β1b;	  Bayer),	  and	  Extavia®	  (IFN-­‐β1b;	  Novartis).	  All	  are	  injected	  subcutaneously	  except	  for	  Avonex®,	  which	  is	  administered	  intramuscularly.	  	  	   The	  interferon	  family	  of	  cytokines	  naturally	  function	  as	  part	  of	  the	  body’s	  defense	  against	  microbial,	  neoplastic	  and	  viral	  agents	  and	  play	  a	  role	  in	  the	  regulation	  of	  the	  immune	  response.	  IFN-­‐β	  in	  particular	  has	  an	  overall	  anti-­‐inflammatory	  effect,	  as	  it	  decreases	  the	  expression	  of	  MHC	  class	  II,	  upregulates	  IL-­‐10	  production,	  and	  decreases	  Th1	  and	  Th17	  production.61,	  62	  Though	  the	  mechanisms	  of	  action	  of	  IFN-­‐βs	  in	  MS	  is	  unknown,	  IFN-­‐βs	  have	  been	  shown	  to	  reduce	  the	  incidence	  of	  attacks	  by	  about	  one-­‐third	  and,	  together	  with	  glatiramer	  acetate,	  are	  considered	  first-­‐line	  medications	  in	  RRMS.63,	  64	  In	  randomized,	  double-­‐blind,	  placebo	  controlled	  trials,	  IFN-­‐βs	  have	  reduced	  active	  lesions	  by	  50	  to	  80%	  in	  brain	  MRIs	  of	  MS	  patients.65-­‐67	  There	  is	  also	  data	  supporting	  the	  improvement	  of	  quality	  of	  life	  and	  cognitive	  function	  in	  MS	  patients	  taking	  IFN-­‐βs.66,	  68,	  69	  	   Adverse	  events	  of	  IFN-­‐β	  include	  flu-­‐like	  symptoms	  (e.g.	  chills,	  malaise,	  fatigue,	  and	  muscle	  aches),	  which	  present	  in	  roughly	  60%	  of	  MS	  patients	  taking	  IFN-­‐β1a	  or	  IFN-­‐β1b.6	  Injection-­‐site	  reactions	  and	  worsening	  of	  pre-­‐existing	  spasticity	  are	  common	  adverse	  events	  that	  are	  also	  connected	  with	  IFN-­‐β.	  6	  And	  because	  patients	  treated	  with	  IFN-­‐β1a	  or	  IFN-­‐β1b	  are	  at	  risk	  for	  abnormalities	  in	  liver	  function,	  leukopenia,	  and	  thyroid	  disease,	  liver	  enzymes	  and	  white	  blood	  cell	  count	  are	  periodically	  monitored.5	  	   IFN-­‐βs,	  like	  other	  therapeutic	  proteins,	  are	  immunogenic	  and	  may	  result	  in	  the	  development	  of	  binding	  and	  neutralizing	  antibodies	  (NAbs).	  NAbs	  have	  been	  shown	  to	  	   14	  develop	  with	  all	  the	  IFN-­‐β	  formulations,	  although	  long-­‐term	  importance	  of	  these	  antibodies	  is	  unknown.70	  The	  issue	  of	  IFN-­‐β	  NAbs	  are	  controversial.	  A	  group	  of	  experts	  at	  the	  Neutralizing	  Antibodies	  on	  Interferon	  Beta	  in	  Multiple	  Sclerosis	  (NABINMS)	  consortium	  2009	  recommended	  that	  both	  clinical	  status	  and	  NAb	  titer	  should	  be	  taken	  into	  consideration	  when	  making	  decisions	  to	  change	  drug	  therapy	  due	  to	  the	  presence	  of	  NAbs	  to	  IFN-­‐β.71 Glatiramer	  Acetate	  Glatiramer	  acetate	  (GA;	  Copaxone®;	  Teva	  Pharmaceuticals),	  a	  first-­‐line	  therapy	  for	  RRMS	  and	  CIS,	  is	  a	  synthesized	  copolymer	  polypeptide	  mixture	  composed	  randomly	  of	  four	  amino	  acids,	  namely	  L-­‐glutamic	  acid,	  L-­‐lysine,	  L-­‐alanine,	  and	  L-­‐tyrosine.	  Also	  known	  as	  Copolymer	  1,	  or	  Cop-­‐1,	  it	  is	  was	  originally	  intended	  to	  mimic	  and	  compete	  with	  myelin	  basic	  protein	  (MBP)	  as	  a	  decoy	  for	  the	  immune	  system.5	  Taken	  subcutaneously,	  20	  mg/day,	  GA	  has	  been	  shown	  to	  reduce	  relapse	  rate	  in	  RRMS.5	  	   The	  mechanism	  of	  action	  of	  GA	  is	  not	  precisely	  known,	  but	  involves	  the	  induction	  and	  activation	  of	  a	  unique	  population	  of	  GA-­‐specific	  suppressor	  T	  cells	  that	  circulate	  in	  the	  periphery	  and	  can	  migrate	  into	  the	  CNS	  by	  crossing	  the	  BBB,	  in	  turn	  inhibiting	  the	  multiplication	  of	  MBP-­‐specific	  lymphocytes.72	  When	  these	  cells	  encounter	  fragments	  of	  myelin	  proteins	  in	  the	  CNS,	  they	  are	  stimulated	  to	  multiply	  and	  secrete	  anti-­‐inflammatory	  cytokines.	  This	  process	  is	  called	  bystander	  suppression	  because	  GA	  suppresses	  inflammation	  that	  is	  already	  occurring	  in	  diseased	  tissue	  of	  the	  CNS.73	  Recent	  data	  suggests	  that	  treatment	  with	  GA	  is	  associated	  with	  a	  wider	  immunomodulatory	  effect	  on	  the	  cells	  of	  	   15	  both	  the	  innate	  and	  adaptive	  immune	  systems,	  and	  may	  stimulate	  regulatory	  B	  cell	  properties	  as	  well.74	  	   GA	  has	  less	  adverse	  events	  in	  comparison	  to	  the	  beta	  interferons.5	  The	  most	  frequent	  adverse	  events	  include	  injection-­‐site	  reactions	  and	  itch	  or	  rash.	  This	  appears	  to	  be	  a	  local	  lupus-­‐like	  reaction,	  which	  can	  persist	  despite	  discontinuation	  of	  the	  GA	  injections.	  A	  transient	  reaction,	  called	  immediate	  post-­‐injection	  reaction,	  includes	  chest	  tightness,	  flushing	  and	  dyspnea	  immediately	  after	  injection.	  	  Patients	  are	  reassured	  that	  a	  reaction	  such	  as	  this	  is	  benign	  if	  they	  have	  no	  prior	  history	  or	  evidence	  of	  coronary	  artery	  disease.75	  Furthermore,	  there	  have	  not	  been	  any	  reports	  of	  safety	  problems	  with	  long-­‐term	  GA	  treatment.76	  	   GA,	  like	  IFN-­‐β,	  induces	  an	  antibody	  response	  in	  patients.	  However,	  GA	  is	  a	  peptide	  antigen	  that	  lacks	  the	  biological	  activity	  of	  IFN-­‐β.	  GA-­‐reactive	  antibodies	  are	  not	  neutralizing	  in	  vitro	  or	  in	  vivo	  and	  do	  not	  appear	  to	  effect	  the	  immunological	  effects	  of	  GA.77	  As	  well,	  higher	  antibody	  titres	  are	  not	  associated	  with	  a	  deterioration	  in	  clinical	  endpoints,	  such	  as	  relapse	  rate,	  EDSS	  progression	  or	  the	  occurrence	  of	  adverse	  effects.	  The	  GA-­‐reactive	  antibodies	  are	  thought	  to	  enhance	  the	  immunological	  and	  clinical	  effects	  of	  GA,	  indicating	  that	  they	  may	  be	  part	  of	  mechanism	  of	  action	  of	  GA.	  	   Multicenter	  clinical	  trials	  with	  GA	  have	  shown	  statistically	  significant	  decreases	  in	  mean	  annualized	  relapse	  rate	  that	  are	  similar	  to	  those	  of	  IFN-­‐βs.75	  The	  REGARD	  and	  BEYOND	  trials	  both	  demonstrated	  no	  significant	  difference	  between	  IFN-­‐β	  and	  GA	  in	  the	  primary	  or	  any	  clinical	  endpoints,	  although	  they	  have	  claimed	  some	  differences	  in	  MRI	  measures	  of	  disease	  activity.78,	  79	  	  	   16 Mitoxantrone	  Before	  its	  approval	  for	  treatment	  of	  MS,	  mitoxantrone	  (Novantrone®;	  EMD	  Serono)	  was	  used	  as	  an	  anti-­‐neoplastic	  agent	  that	  reduces	  lymphocyte	  proliferation.72	  In	  MS,	  mitoxantrone	  suppresses	  T	  cell,	  B	  cell,	  and	  macrophage	  activity	  that	  are	  thought	  to	  lead	  the	  attack	  on	  myelin.80	  As	  a	  synthetic	  anthracenedione,	  mitoxantrone	  intercalates	  into	  DNA,	  inducing	  strand	  breakage	  and	  inhibition	  of	  topoisomerase	  II,	  a	  DNA	  repair	  enzyme.81	  It	  is	  a	  second-­‐line	  therapy	  for	  worsening	  RRMS	  and	  SPMS.	  	   Mitoxantrone	  has	  been	  reported	  to	  reduce	  relapses	  and	  number	  of	  gadolinium-­‐enhancing	  lesions	  on	  MRI,	  and	  appears	  to	  have	  effects	  on	  disease	  course	  up	  to	  5	  years	  after	  discontinuing	  treatment.82,	  83	  Common	  side	  effects	  include	  nausea	  and	  vomiting,	  alopecia,	  amenorrhea,	  urinary	  tract	  infections,	  and	  upper	  respiratory	  tract	  infections.84	  Mitoxantrone	  is	  a	  second-­‐line	  therapy	  because	  of	  its	  more	  serious	  adverse	  events,	  namely	  cardiotoxicity,	  myelosuppression,	  and,	  rarely,	  leukemia.	  Therefore,	  it	  is	  recommended	  to	  regularly	  monitor	  left	  ventricular	  ejection	  fraction	  (LVEF)	  and	  complete	  blood	  cell	  counts.	  As	  well,	  due	  to	  the	  serious	  possible	  side	  effects,	  the	  lifetime	  cumulative	  dose	  of	  mitoxantrone	  is	  strictly	  limited	  to	  2	  to	  3	  years	  of	  treatment	  or	  140	  mg/m2. Fingolimod	  Fingolimod	  (Gilenya®;	  Novartis)	  is	  the	  first	  oral	  disease-­‐modifying	  drug	  approved	  by	  the	  FDA	  to	  reduce	  relapses	  and	  delay	  progression	  of	  disability	  in	  RRMS	  as	  shown	  by	  the	  FREEDOMS	  and	  TRANSFORMS	  pivotal	  trials	  when	  compared	  to	  placebo	  and	  IFN-­‐β1a,	  respectively.85,	  86	  The	  drug,	  a	  sphingosine	  analogue,	  prevents	  the	  egression	  of	  lymphocytes	  from	  the	  lymph	  node	  by	  binding	  to	  the	  sphingosine-­‐1	  phosphate	  (S1P)	  receptor	  on	  	   17	  lymphocytes	  leading	  to	  the	  internalization	  and	  downregulation	  of	  expression	  of	  the	  receptors.	  In	  EAE	  studies,	  Fingolimod	  has	  also	  been	  shown	  to	  potentially	  have	  neuroprotective	  effects	  through	  interaction	  with	  S1P	  receptors	  on	  neural	  cells.	  87-­‐89	  The	  mechanism	  of	  how	  the	  therapeutic	  effect	  of	  fingolimod	  is	  achieved	  in	  MS	  is	  unclear,	  though	  it	  is	  thought	  to	  be	  associated	  with	  the	  reduction	  of	  lymphocyte	  migration	  into	  the	  CNS.90	  	  	   From	  the	  pivotal	  trials,	  the	  most	  common	  side	  effects	  of	  taking	  fingolimod	  include	  headache,	  elevated	  liver	  enzyme	  levels,	  diarrhea,	  back	  pain,	  cough,	  and	  influenza	  viral	  infections.90	  Data	  also	  showed	  an	  increased	  risk	  of	  infections,	  cardiovascular	  effects,	  including	  bradycardia	  and	  atrioventricular	  black,	  as	  well	  as	  macular	  edema.85	  There	  were	  two	  deaths	  of	  patients	  receiving	  1.25	  mg	  of	  fingolimod	  in	  the	  TRANSFORMS	  study.	  One	  death	  was	  secondary	  to	  a	  disseminated	  varicella	  zoster	  infection,	  while	  the	  other	  was	  attributed	  to	  herpes	  simplex	  encephalitis.85 Natalizumab	  Natalizumab	  (Tysabri®;	  Biogen	  Idec	  &	  Elan	  Pharmaceuticals)	  is	  a	  recombinant	  humanized	  monoclonal	  antibody	  that	  is	  targeted	  against	  α4-­‐integrin	  (also	  known	  as	  very	  late	  antigen-­‐4;	  VLA-­‐4),	  an	  adhesion	  molecule	  on	  the	  surface	  of	  monocytes	  and	  lymphocytes.	  Natalizumab	  was	  formed	  by	  engineering	  the	  complementarity-­‐determining	  regions	  of	  a	  murine	  monoclonal	  antibody	  into	  the	  most	  homologous	  naturally	  occurring	  heavy	  and	  light	  chains	  of	  immunoglobulin	  G4	  (IgG4).	  91	  At	  present,	  it	  is	  approved	  for	  use	  in	  North	  America	  and	  European	  Union	  as	  a	  monotherapy	  treatment	  for	  RRMS	  and	  is	  generally	  recommended	  for	  patients	  who	  do	  not	  respond	  to	  conventional	  therapies	  to	  delay	  accumulation	  of	  physical	  disability	  and	  decrease	  the	  occurrence	  of	  relapses.92	  	   18	  	   There	  have	  been	  several	  mechanisms	  of	  action	  that	  have	  been	  proposed	  for	  natalizumab	  in	  MS.	  By	  effectively	  binding	  the	  interaction	  of	  α4-­‐integrin	  with	  their	  cognate	  receptors,	  vascular	  cell	  adhesion	  molecule-­‐1	  (VCAM-­‐1),	  natalizumab	  blocks	  the	  adhesion	  of	  leukocytes	  to	  endothelium,	  i.e.	  prevents	  the	  migration	  of	  activated	  T	  lymphocytes	  across	  the	  BBB	  and	  into	  the	  CNS,	  and	  subsequently	  reduces	  the	  release	  of	  proinflammatory	  cytokines.91	  It	  has	  also	  been	  hypothesized	  that	  natalizumab	  impedes	  T	  cell	  effector	  function	  by	  blocking	  T	  cell	  interactions	  with	  antigen	  presenting	  cells	  in	  the	  CNS	  through	  interactions	  with	  osteopontin,	  another	  ligand	  for	  α4-­‐integrin,93	  and	  VCAM-­‐1	  on	  microglial	  cells	  and	  monocytes.91	  Also,	  as	  natalizumab	  blocks	  the	  interaction	  of	  α4-­‐integrin	  with	  leukocytes	  and	  extracellular	  matrix	  proteins,	  it	  may	  also	  induce	  effector	  T	  cell	  apoptosis.91	  All	  these	  suggest	  that	  natalizumab	  may	  have	  anti-­‐inflammatory	  effects	  that	  include	  the	  inhibition	  of	  immune	  cell	  recruitment	  into	  actively	  inflamed	  tissue	  and	  suppression	  of	  current	  inflammatory	  activity	  at	  diseased	  areas.	  	   The	  drug	  product	  itself	  is	  a	  sterile,	  clear	  liquid	  concentrate	  for	  IV	  infusion,	  packaged	  in	  15ml	  vials	  containing	  300	  mg	  natalizumab,	  and	  is	  diluted	  to	  100	  ml	  in	  saline.92	  It	  is	  then	  infused	  intravenously	  over	  one	  hour	  every	  4	  weeks.	  Natalizumab	  is	  also	  used	  as	  a	  treatment	  in	  Crohn’s	  disease.	  	   Natalizumab	  was	  evaluated	  for	  treatment	  of	  RRMS	  in	  the	  two	  randomized,	  double-­‐blind,	  placebo-­‐controlled	  clinical	  trials,	  AFFIRM	  and	  SENTINEL,	  and	  was	  shown	  to	  reduce	  the	  annualized	  relapse	  rate	  over	  two	  years	  by	  68%	  (p	  <	  0.001)	  as	  a	  monotherapy	  when	  compared	  with	  placebo,94	  and	  by	  55%	  (p<	  0.001)	  as	  an	  add-­‐on	  therapy	  when	  compared	  with	  IFN-­‐β1a	  alone.95	  Furthermore,	  there	  was	  92%	  fewer	  gadolinium-­‐enhancing	  lesions	  in	  natalizumab-­‐treated	  patients	  compared	  to	  the	  placebo	  group.94	  	   19	  	   Treatment	  with	  natalizumab	  has	  some	  serious	  potential	  side	  effects,	  the	  most	  serious	  of	  which	  is	  progressive	  multifocal	  leukoencephalopathy	  (PML),	  a	  rare	  demyelinating	  disease	  of	  the	  brain	  caused	  by	  the	  opportunistic	  viral	  infection	  with	  the	  John	  Cunningham	  (JC)	  virus	  that	  can	  lead	  to	  death	  or	  severe	  disability.	  The	  risk	  of	  PML	  increases	  with	  the	  duration	  of	  treatment,	  and	  even	  more	  so	  if	  the	  patient	  had	  previous	  immunosuppressant	  use	  and	  is	  seropositive	  for	  JC	  virus	  antibodies.	  Patients	  who	  were	  JC	  virus	  antibody	  positive,	  had	  prior	  immunosuppressant	  therapy,	  and	  had	  received	  more	  than	  24	  doses	  of	  natalizumab	  have	  an	  estimated	  risk	  of	  9-­‐11	  per	  1000	  for	  developing	  PML,	  while	  those	  without	  these	  risk	  factors	  have	  a	  risk	  of	  less	  than	  0.1	  per	  1000.96	  Because	  of	  the	  potential	  risk	  of	  PML	  and	  other	  opportunistic	  infections,	  natalizumab	  is	  usually	  recommended	  for	  patients	  with	  clinically	  or	  radiographically	  extremely	  active	  disease	  or	  when	  other	  treatments	  are	  ineffectual	  or	  poorly	  tolerated.	  Other	  adverse	  events	  associated	  with	  the	  use	  of	  natalizumab	  include	  transient	  headaches,	  fatigue,	  recurrent	  urinary	  tract	  infections,	  and	  infusion	  reactions,	  hypersensitivity	  reactions,	  such	  as	  fever,	  rash,	  and	  anaphylaxis.94,	  95,	  97	  Patients	  that	  experienced	  infusion	  reactions	  were	  found	  to	  be	  more	  likely	  to	  develop	  persistent	  neutralizing	  antibodies	  (NAbs)	  to	  natalizumab.97 Anti-­‐Natalizumab	  Antibodies	  As	  with	  other	  protein-­‐based	  therapies,	  natalizumab	  has	  been	  associated	  with	  some	  level	  of	  immunogenicity,	  i.e.	  the	  development	  of	  neutralizing	  antibodies	  towards	  the	  therapeutic	  protein.98,	  99	  The	  humanization	  of	  natalizumab	  has	  probably	  decreased	  its	  immunogenicity	  compared	  to	  other	  protein	  therapeutics.100	  Nonetheless,	  a	  small	  percentage	  of	  treated	  patients	  have	  been	  found	  to	  develop	  antibodies	  against	  natalizumab.	  	  	   20	  	   There	  are	  two	  bioanalytical	  assays	  to	  detect	  anti-­‐natalizumab	  antibodies.	  The	  current	  standard	  is	  a	  bridging	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  (ELISA)	  that	  was	  used	  in	  pre-­‐clinical	  animal	  studies	  and	  in	  clinical	  trials	  to	  measure	  serum	  antibody	  concentrations.101	  In	  this	  assay,	  serum	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  are	  captured	  by	  natalizumab	  coated	  on	  microtiter	  plates	  and	  detected	  using	  biotinylated	  natalizumab	  and	  a	  streptavidin-­‐conjugated	  enzyme	  with	  its	  respective	  colorimetric	  or	  fluorescent	  substrate.	  Furthermore,	  binding	  specificity	  of	  the	  detected	  antibodies	  was	  verified	  with	  a	  confirmation	  assay	  where	  serum	  is	  pre-­‐incubated	  with	  100	  μg/ml	  natalizumab	  and	  subsequently	  assayed	  by	  ELISA	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies.	  The	  assay	  sensitivity	  for	  the	  bridging	  ELISA,	  as	  defined	  using	  the	  12C4	  murine	  monoclonal	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  in	  whole	  serum	  that	  is	  used	  as	  a	  positive	  control	  and	  to	  generate	  a	  standard	  curve,	  is	  5	  μg/ml	  and	  0.5	  μg/ml	  for	  the	  fluorescent	  and	  colorimetric	  assays,	  respectively.	  	  The	  clinical	  trials	  also	  utilized	  a	  blocking	  assay	  that	  measured	  the	  ability	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  serum	  negative	  for	  detectable	  natalizumab	  concentrations	  (<0.25	  μg/ml)	  to	  block	  the	  binding	  of	  biotinylated	  natalizumab	  to	  K562	  cells	  transfected	  with	  α4-­‐integrin.101	  The	  format	  of	  this	  flow	  cytometry	  based	  assay	  mirrors	  the	  proposed	  mechanism	  of	  action	  of	  natalizumab	  to	  bind	  α4-­‐integrin.	  Serum	  samples	  and	  controls	  were	  incubated	  with	  biotinylated	  natalizumab	  and	  then	  with	  transfected	  K562	  cells.	  Washed	  and	  resuspended	  cells	  were	  incubated	  with	  streptavidin-­‐phycoerytherin	  conjugate	  and	  cell-­‐bound	  biotinylated	  natalizumab	  was	  quantified	  by	  flow	  cytometry.	  The	  sensitivity	  of	  the	  blocking	  assay	  to	  detect	  anti-­‐natalizumab	  blocking	  antibodies	  is	  0.5	  μg/ml	  as	  determined	  with	  the	  12C4	  monoclonal	  antibody	  in	  neat	  serum.	  Results	  from	  ELISA	  and	  flow	  cytometry	  assays	  were	  highly	  correspondent	  in	  clinical	  studies.101	  	   21	  In	  clinical	  trials,	  9	  to	  12%	  of	  treated	  patients	  developed	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  while	  6%	  became	  persistently	  positive.94,	  95	  Other	  studies	  have	  reported	  the	  incidence	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  to	  be	  4.5%	  of	  treated	  patients,	  with	  1.6	  to	  3.5%	  remaining	  persistently	  positive.102,	  103	  The	  presence	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  had	  an	  adverse	  effect	  on	  treatment	  response	  and	  reduced	  serum	  natalizumab	  concentrations	  and	  antibody	  persistency	  was	  found	  to	  decrease	  clinical	  effect	  of	  natalizumab	  treatment	  (as	  measured	  by	  EDSS	  and/or	  MS	  Functional	  Composite)	  when	  compared	  to	  antibody-­‐negative	  patients,	  with	  increased	  relapse	  rate	  in	  comparison	  to	  transiently	  positive	  and	  antibody-­‐negative	  patients,	  produced	  less	  favourable	  MRI	  outcomes,	  and	  resulted	  in	  a	  higher	  incidence	  of	  infusion-­‐related	  AEs,	  such	  as	  allergic,	  hypersensitivity	  and	  anaphylactic	  reactions.94,	  95,	  101,	  104	  In	  transiently	  antibody-­‐positive	  patients,	  the	  antibodies	  did	  not	  seem	  to	  produce	  a	  sustained	  loss	  of	  therapeutic	  efficacy	  compared	  with	  antibody	  negative	  patients.101	  A	  Danish	  study	  suggested	  that	  antibody	  persistency	  could	  be	  predicted	  after	  3	  months	  of	  natalizumab	  treatment	  as	  persistently	  positive	  patients	  had	  higher	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  titers	  than	  transiently	  positive	  ones.105	  Consequently,	  they	  recommend	  that	  testing	  at	  3	  months	  may	  be	  helpful	  in	  selecting	  patients	  who	  should	  discontinue	  natalizumab	  infusions.	  Halting	  natalizumab	  treatment	  is	  advised	  only	  for	  patients	  with	  two	  or	  more	  consecutive	  antibody	  positive	  samples	  taken	  at	  least	  six	  weeks	  apart.	  94,	  101	  	  1.2 Neuromyelitis	  Optica	  Neuromyelitis	  optica	  (NMO),	  or	  Devic’s	  disease,	  is	  an	  idiopathic	  inflammatory	  disease	  of	  the	  CNS	  that	  is	  characterized	  by	  severe	  optic	  neuritis	  (ON)	  and	  transverse	  myelitis	  (TM).106-­‐109	  NMO	  was	  first	  described	  in	  the	  19th	  century	  and	  was	  considered	  a	  clinical	  variant	  of	  	   22	  MS.110	  NMO	  can	  present	  as	  a	  monophasic	  disease,	  though	  it	  usually	  follows	  a	  relapsing	  course	  without	  marked	  remissions	  between	  relapses.108,	  111	  Hence,	  there	  typically	  is	  a	  rapid	  progression	  of	  disability	  due	  to	  the	  accumulation	  of	  irreversible	  deficits.	  Additional	  characteristics	  of	  NMO	  include	  definite	  female	  predominance,	  longitudinally	  extensive	  spinal	  cord	  lesions	  by	  MRI,	  prevalent	  polymorphonuclear	  pleocytosis	  in	  CSF,	  and	  absence	  of	  oligoclonal	  IgG	  bands,	  which	  are	  dissimilar	  from	  MS.	  Since	  the	  discovery	  of	  the	  disease-­‐specific	  serum	  autoantibody,	  NMO-­‐IgG,	  and	  the	  subsequent	  identification	  of	  the	  target	  antigen	  to	  NMO-­‐IgG	  as	  aquaporin-­‐4	  (AQP4),	  the	  main	  water	  channel	  in	  the	  CNS	  expressed	  on	  astrocyte	  end-­‐feet	  at	  the	  BBB,	  NMO	  has	  been	  considered	  a	  separate	  clinical	  entity	  from	  MS.112,	  113	  The	  discovery	  of	  NMO-­‐IgG,	  or	  the	  anti-­‐AQP4	  antibody,	  as	  well	  as	  the	  improvement	  of	  MRI	  technology	  over	  time,	  has	  greatly	  influenced	  the	  diagnostic	  criteria	  for	  the	  disease	  as	  seen	  by	  its	  continual	  revision	  over	  the	  years.	  Current	  research	  on	  NMO	  continues	  to	  reveal	  more	  aspects	  of	  disease	  not	  previously	  recognized,	  further	  distinguishing	  it	  from	  MS	  and,	  in	  the	  future,	  may	  contribute	  to	  better	  defining	  NMO	  diagnostic	  criteria.	  	  1.2.1 History	  In	  1870,	  Sir	  Thomas	  Clifford	  Allbutt	  first	  identified	  an	  association	  between	  myelitis	  and	  optic	  nerve	  disorder	  occurring	  simultaneously	  or	  within	  a	  few	  weeks	  apart	  resulting	  in	  paraplegia	  and	  blindness.114	  Several	  decades	  later,	  Eugene	  Devic	  and	  his	  PhD	  student,	  Fernand	  Gault	  described	  17	  patients	  who	  had	  lost	  their	  vision	  in	  one	  or	  both	  eyes	  and,	  within	  weeks,	  presented	  with	  severe	  spastic	  weakness	  of	  the	  limbs,	  numbness,	  and	  commonly	  loss	  of	  bladder	  control.	  They	  attributed	  these	  symptoms	  to	  the	  inflammation	  of	  	   23	  the	  optic	  nerve	  and	  spinal	  cord.	  Furthermore,	  they	  included	  relapsing	  and	  monophasic	  NMO,	  as	  well	  as	  those	  with	  brain	  symptoms.	  Later	  misperceptions	  about	  the	  concept	  of	  NMO	  might	  have	  originated	  from	  these	  descriptions.115	  Traditionally,	  the	  diagnosis	  of	  the	  NMO	  variant	  of	  MS	  was	  distinguished	  from	  “conventional”	  MS	  based	  on	  the	  acuteness	  and	  severity	  of	  the	  optic	  and	  spinal	  symptoms.116	  In	  the	  1950s,	  MS	  was	  gradually	  recognized	  in	  Japan,	  though	  the	  concept	  of	  NMO	  as	  a	  disease	  entity	  was	  not	  formed.115	  Up	  until	  this	  point	  in	  Japan,	  neurologists	  believed	  that	  MS	  did	  not	  exist	  in	  the	  country	  despite	  reports	  of	  cases	  with	  features	  similar	  to	  the	  cases	  that	  Devic	  had	  described.	  Such	  cases	  were	  identified	  as	  optic-­‐spinal	  MS	  (OSMS),	  which	  has	  been	  described	  as	  a	  unique	  type	  of	  MS	  in	  Asia	  largely	  due	  to	  the	  low	  prevalence	  of	  classical	  MS	  in	  Japan	  in	  comparison	  to	  Western	  countries.116	  However,	  OSMS	  were	  fundamentally	  similar	  to	  NMO	  diagnosed	  by	  the	  criteria	  of	  Mandler	  et	  al.106	  and	  Wingerchuk	  et	  al.108	  in	  Western	  populations	  in	  1990s.	  	  The	  1980s	  marked	  the	  beginning	  of	  cerebrospinal	  fluid	  (CSF)	  examination	  and	  the	  utilization	  of	  MRI,	  which	  gave	  the	  opportunity	  to	  revisit	  and	  clarify	  the	  clinical	  criteria.	  In	  1993,	  Mandler	  et	  al.	  included	  the	  absence	  of	  brain	  MRI	  changes,	  and	  the	  presence	  of	  signs	  of	  cavitation	  in	  the	  spinal	  cord	  as	  part	  of	  NMO	  diagnostic	  criteria.106	  Moreover,	  CSF	  analysis	  showed	  increased	  CSF/serum	  albumin	  ratio	  in	  the	  absence	  of	  CSF	  oligoclonal	  bands,	  which	  is	  not	  consistent	  with	  MS.	  In	  1996,	  O’Riordan	  et	  al.	  revised	  the	  definition	  of	  the	  disease	  as	  an	  acute	  and	  severe	  transverse	  myelitis	  associated	  with	  acute	  unilateral	  or	  bilateral	  ON	  and	  no	  signs	  of	  brain	  involvement	  beyond	  the	  optic	  nerves	  and	  could	  follow	  a	  monophasic	  or	  relapsing	  course,	  though	  most	  were	  shown	  to	  be	  relapsing.107	  NMO	  was	  not	  truly	  considered	  to	  be	  a	  separate	  entity	  from	  MS	  until	  the	  discovery	  of	  the	  NMO-­‐IgG	  and	  its	  target,	  aquaporin-­‐4	  (AQP4).112,	  113	  	   24	  NMO-­‐IgG	  serological	  status	  was	  included	  in	  revised	  NMO	  diagnostic	  criteria	  along	  with	  brain	  and	  spinal	  cord	  MRI	  in	  2006.117	  	  1.2.2 Clinical	  NMO	  is	  defined	  by	  the	  association	  of	  myelitis	  and	  ON.	  It	  has	  either	  a	  monophasic	  or	  polyphasic	  course.	  Multiple,	  recurrent	  episodes	  of	  ON	  and/or	  myelitis	  can	  be	  separated	  by	  months	  to	  years	  in	  the	  polyphasic,	  i.e.	  relapsing,	  form	  of	  NMO.107,	  108	  The	  monophasic	  form	  usually	  has	  more	  severe	  neurologic	  impairment	  than	  the	  relapsing	  form	  at	  the	  beginning	  of	  the	  disease	  while	  prognosis	  is	  poorer	  in	  the	  long-­‐term	  for	  relapsing	  NMO.108	  The	  relapsing	  course	  is	  more	  commonly	  associated	  with	  an	  older	  age	  at	  onset,	  longer	  time	  interval	  between	  exacerbations,	  less	  severe	  motor	  impairment	  with	  the	  first	  myelitis	  attack,	  and	  the	  presence	  of	  systemic	  autoimmunity.	  Relapses	  tend	  to	  be	  clustered,	  occur	  early	  and	  at	  unpredictable	  intervals,	  and	  are	  usually	  moderate	  to	  severe.	  There	  is	  generally	  poor	  recovery	  and	  disability	  rapidly	  accumulates	  in	  a	  step-­‐wise	  fashion.	  However,	  disease	  course	  can	  vary	  greatly	  between	  individual	  patients.	  Some	  relapsing	  NMO	  patients	  may	  not	  show	  symptoms	  for	  long	  periods	  of	  time,	  and,	  in	  others,	  the	  recovery	  following	  relapses	  is	  nearly	  complete.108,	  118	  In	  rare	  cases	  viral	  illnesses	  or	  immunizations	  precede	  the	  clinical	  onset.	  The	  main	  symptoms	  that	  NMO	  patients	  experience	  are	  loss	  of	  vision	  and	  spinal	  cord	  function.	  ON	  may	  manifest	  as	  visual	  field	  defects	  and/or	  reduced	  visual	  acuity.	  In	  addition,	  patients	  commonly	  experience	  acute	  and	  severe	  spastic	  weakness	  of	  the	  legs	  (paraparesis)	  or	  all	  four	  limbs	  (tetraparesis)	  with	  sensory	  signs,	  frequently	  accompanied	  by	  loss	  of	  bladder	  control,	  which	  are	  all	  typical	  manifestations	  of	  the	  myelitis.	  	  	   25	  Symptoms	  suggesting	  disease	  outside	  spinal	  cord	  and	  optic	  nerve	  are	  also	  reported	  in	  about	  15%	  of	  patients.119	  Neurologic	  symptoms	  indicating	  disease	  outside	  the	  optic	  nerves	  and	  spinal	  cord	  include	  symptoms	  of	  encephalopathy,	  brainstem	  dysfunction	  and	  hypothalamic	  defects,	  and	  have	  been	  observed	  in	  about	  15%	  of	  patients.108	  In	  10%	  of	  NMO	  cases,	  the	  disease	  affects	  the	  hypothalamus	  and	  brainstem,	  particularly	  the	  region	  surrounding	  the	  fourth	  ventricle,	  nucleus	  tractus	  solitarius,	  area	  postrema	  and	  the	  subependymal	  regions.122	  Brainstem	  symptoms	  include	  vomiting,	  vertigo,	  hearing	  loss,	  facial	  weakness,	  trigeminal	  neuralgia,	  diplopia,	  ptosis	  and	  nystagmus.108,	  117,	  122	  As	  well,	  some	  patients	  experience	  nausea	  and	  intractable	  hiccups.123	  Mortality	  after	  5	  years	  is	  17-­‐32%	  and	  is	  highest	  in	  individuals	  of	  African	  descent.108,	  120,	  121	  NMO	  has	  been	  associated	  with	  many	  other	  autoimmune	  disorders,	  such	  as	  systemic	  lupus	  erythemaosus,	  Sjögren’s	  syndrome,	  and	  myasthenia	  gravis.	  Studies	  have	  found	  autoimmune	  diseases	  in	  36%	  of	  patients	  with	  relapsing	  NMO.124	  Moreover,	  it	  has	  been	  observed	  that	  patients	  with	  systemic	  lupus	  erythematosus	  or	  Sjögren’s	  syndrome	  who	  never	  developed	  ON	  or	  myelitis	  are	  NMO-­‐IgG	  seronegative	  whereas	  those	  with	  ON	  or	  myelitis	  are	  usually	  seropositive.125	  Myasthenia	  gravis	  patients	  may	  also	  develop	  NMO	  after	  thymectomy.126	  	   CSF	  analysis	  of	  NMO	  patients	  revealed	  characteristically	  elevated	  total	  protein	  levels	  and	  prominent	  pleocytosis	  greater	  than	  50	  x	  106	  WBC/L,	  with	  a	  high	  percentage	  of	  eosinophils	  and/or	  neutrophils.108,	  127	  Furthermore,	  protein	  content	  and	  some	  inflammatory	  cytokines,	  such	  IL-­‐17,	  IL-­‐6,	  IL-­‐5,	  BAFF	  and	  eosinophil	  cationic	  protein,	  as	  well	  as	  IgG	  and	  IgM	  secreting	  cells	  may	  be	  increased.128,	  129	  And	  unlike	  MS,	  intrathecal	  synthesis	  of	  IgG,	  as	  well	  as	  oligoclonal	  bands,	  is	  only	  rarely	  seen.	  	   26	  In	  MRI,	  spinal	  cord	  lesions	  associated	  with	  NMO	  are	  typically	  gadolinium-­‐enhanced	  and	  are	  greater	  than	  three	  vertebral	  segments	  long.107,	  130,	  131	  Studies	  have	  shown	  that	  lesions	  of	  the	  spinal	  cord	  in	  NMO	  are	  typically	  large	  and	  extend	  over	  three	  vertebral	  segments	  in	  85-­‐90%	  of	  patients,	  with	  a	  mean	  of	  5.5	  vertebral	  segments,	  and	  are	  predominantly	  located	  in	  the	  cervical	  and	  upper	  thoracic	  regions	  (Wingerchuk	  et	  al.	  2006;	  Collongues	  et	  al.	  2010;	  Matsushita	  et	  al.	  2010;	  Krampla	  et	  al.	  2009).117,	  132-­‐134	  The	  acute	  phase	  is	  marked	  by	  swelling	  of	  the	  cord,	  and	  in	  cases	  of	  severe	  disease,	  cavity-­‐like	  longitudinally	  extensive	  lesions	  can	  occur,	  as	  well	  as	  extension	  of	  cervical	  lesions	  into	  the	  lower	  medulla.135	  Moreover,	  atrophy	  of	  the	  spinal	  cord	  can	  ensue	  in	  late	  stages	  of	  the	  disease.	  In	  contrast,	  spinal	  cord	  lesions	  in	  MS	  patients	  do	  not	  extend	  over	  two	  vertebral	  segments,	  do	  not	  cover	  the	  entire	  cord	  transverse	  area,	  and	  are	  not	  associated	  with	  cord	  swelling	  or	  atrophy.8,	  136,	  137	  Cerebral	  MRI	  abnormalities	  are	  found	  in	  60%	  of	  NMO	  patients.117	  Most	  of	  the	  lesions	  are	  small	  and	  nonspecific,	  not	  fulfilling	  the	  Barkof’s	  diagnostic	  criteria	  for	  MS.	  Lesions	  that	  were	  hemispheric	  and	  coalescent	  extending	  to	  subcortical	  areas	  were	  also	  found.	  The	  hypothalamus,	  thalamus,	  region	  around	  the	  fourth	  ventricle,	  and	  the	  cerebral	  peduncle	  or	  cerebellum	  have	  also	  been	  found	  to	  present	  with	  lesions. Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  In	  2004,	  a	  serum	  IgG	  autoantibody	  was	  recognized	  in	  patients	  with	  NMO,	  but	  was	  absent	  in	  those	  with	  classical	  MS.113	  The	  same	  group	  that	  made	  this	  discovery	  identified	  the	  target	  of	  the	  disease-­‐specific	  antibody,	  called	  NMO-­‐IgG,	  as	  aquaporin-­‐4	  (AQP4),	  which	  is	  a	  water	  channel	  that	  is	  predominantly	  expressed	  in	  the	  brain	  at	  astrocyte	  end	  feet.112	  	   27	  	   AQP4	  is	  the	  most	  abundant	  water	  channel	  protein	  in	  the	  CNS	  and	  is	  located	  in	  the	  astrocyte	  foot	  processes	  at	  the	  BBB,	  surrounding	  CNS	  synapses	  and	  nodes	  of	  Ranvier.138	  Along	  with	  AQP1,	  which	  is	  densely	  packed	  in	  the	  choroid	  plexus	  cells	  lining	  the	  ventricles,	  AQP4	  is	  a	  major	  contributor	  to	  the	  production	  and	  the	  removal	  processes	  of	  brain	  volume	  homeostasis.139	  Outside	  the	  CNS,	  AQP4	  is	  found	  in	  the	  kidneys,	  stomach,	  lung,	  heart	  and	  bladder.140	  Similar	  to	  other	  aquaporins,	  the	  x-­‐ray	  structure	  of	  AQP4	  monomers	  shows	  that	  it	  is	  has	  six	  helical,	  transmembrane	  domains	  and	  two	  short	  helical	  segments	  surrounding	  an	  aqueous	  pore.141	  AQP4	  monomers	  assemble	  as	  tetramers,	  which	  can	  further	  aggregate	  in	  cell	  membranes	  to	  form	  orthogonal	  array	  of	  particles	  (OAPs).	  Antibodies	  against	  AQP4	  have	  been	  found	  to	  preferentially	  bind	  OAPs,	  which	  seems	  to	  be	  critical	  for	  complement-­‐dependent	  cytotoxicity	  by	  means	  of	  multivalent	  C1q	  interaction	  with	  clustered	  AQP4	  antibodies.142-­‐144	  AQP4	  has	  two	  major	  isoforms	  that	  are	  produced	  by	  alternative	  splicing:	  M1,	  which	  has	  323	  amino	  acids	  coded	  from	  5	  exons,	  and	  M23,	  which	  has	  301	  amino	  acids	  coded	  from	  4	  exons.	  They	  differ	  by	  22	  N-­‐terminal	  amino	  acids,	  which	  are	  found	  only	  in	  the	  M1	  isoform.	  The	  M23-­‐AQP4	  configure	  into	  OAPs,	  while	  the	  M1	  isoform	  does	  not	  and	  can	  restrict	  the	  size	  of	  OAPs	  when	  coexpressed	  with	  the	  M23	  isoform.144,	  145	  	   While	  the	  terms	  NMO-­‐IgG	  and	  anti-­‐AQP4	  antibody	  (AQP4-­‐Ab)	  are	  mostly	  used	  interchangeably,	  NMO-­‐IgG	  is	  used	  to	  describe	  the	  antibody	  as	  it	  was	  originally	  measured	  by	  tissue-­‐based	  immunohistochemistry,	  while	  AQP4-­‐Ab	  is	  the	  common	  term	  for	  the	  antibody	  that	  is	  measured	  by	  various	  immunoassays	  that	  utilize	  the	  AQP4	  protein	  as	  a	  whole	  or	  part	  of	  the	  protein	  as	  the	  target	  antigen.	  Regardless	  of	  how	  it	  is	  named,	  this	  disease-­‐specific	  autoantibody	  is	  detectable	  in	  60	  -­‐	  90%	  of	  patients	  with	  NMO	  and,	  with	  lower	  frequency,	  in	  patients	  with	  limited	  forms	  of	  NMO,	  referred	  to	  as	  ‘NMO	  spectrum	  disorders	  (NMOsd)’.146	  	   28	  AQP4-­‐Ab	  titers	  may	  reflect	  disease	  activity	  as	  the	  increase	  in	  antibody	  levels	  appears	  during	  relapses.147,	  148	  As	  well,	  the	  presence	  of	  AQP4-­‐Ab	  seems	  to	  be	  predictive	  of	  later	  conversion	  of	  NMOsd	  to	  definite	  NMO.	  Studies	  have	  also	  demonstrated	  that	  serum	  AQP4-­‐Ab	  concentrations	  decrease	  in	  response	  to	  various	  immunosuppressive	  therapies149-­‐151	  and	  following	  plasma	  exchange.152	  Though	  AQP4-­‐Ab	  is	  detectable	  in	  CSF	  of	  approximately	  70%	  of	  seropositive	  NMOsd	  patients,	  there	  is	  little	  to	  no	  intrathecal	  production	  of	  the	  antibody.153	  This	  suggests	  that	  the	  AQP4-­‐Ab-­‐producing	  B	  cells	  reside	  in	  the	  periphery	  and	  that	  any	  AQP4-­‐Ab	  in	  CSF	  is	  from	  passive	  diffusion. Assays	  Detecting	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  As	  of	  August	  2013,	  there	  have	  been	  almost	  60	  studies	  that	  described	  more	  than	  40	  different	  immunoassays,	  both	  commercially-­‐available	  kits	  and	  in-­‐house	  assays,	  for	  the	  detection	  of	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab.154	  While	  almost	  all	  the	  assays	  display	  a	  high	  specificity	  for	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab,	  the	  sensitivities	  vary	  greatly.	  Depending	  on	  the	  substrate	  that	  is	  utilized,	  assays	  can	  be	  categorized	  as	  tissue-­‐based,	  cell-­‐based,	  of	  protein-­‐based	  assays. Tissue-­‐Based	  Assays	  NMO-­‐IgG	  was	  first	  discovered	  with	  an	  indirect	  immunofluorescence	  assay	  that	  used	  adult	  mouse	  brain	  tissue	  and	  showed	  distinctive	  antibody	  binding	  to	  Virchow-­‐Robin	  spaces,	  pia	  mater	  of	  the	  cerebellum,	  and	  around	  microvasculature	  when	  tissue	  sections	  were	  incubated	  with	  NMO	  patient	  sera	  but	  not	  with	  MS	  sera.113	  Although	  this	  was	  replicated	  and	  confirmed	  early	  on	  by	  other	  groups	  to	  be	  a	  useful	  technique	  in	  detecting	  NMO	  	   29	  antibodies,155-­‐157	  this	  assay	  can	  also	  pick	  up	  other	  autoantibodies,	  such	  as	  paraneoplastic	  and	  connective-­‐tissue	  disorder	  antibodies,	  that	  may	  indicate	  an	  alternative	  diagnosis	  to	  NMO.158	  Other	  limitations	  of	  tissue-­‐based	  immunohistochemical	  assays	  are	  that	  results	  are	  observer-­‐dependent,	  i.e.	  subjective,	  and	  only	  semi-­‐quantitative,	  which	  are	  obtained	  by	  titrating	  serum.	  Sensitivities	  and	  specificities,	  based	  on	  diagnosis,	  for	  this	  assay	  have	  been	  reported	  to	  be	  37.5	  –	  95%,	  and	  93.3	  –	  100%,	  respectively.154	  Cell-­‐Based	  Assays	  Cell-­‐based	  assays	  (CBA)	  detecting	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  make	  use	  of	  cell	  lines,	  such	  as	  human	  embryonic	  kidney	  cells,	  and	  Chinese	  hamster	  ovary	  cells,	  that	  have	  been	  either	  stably	  or	  transiently	  transfected	  with	  one	  or	  both	  of	  the	  AQP4	  isomers,	  or	  a	  segment	  of	  the	  protein.	  These	  cells	  can	  be	  used	  for	  immunocytochemical	  assays	  where,	  similar	  to	  tissue-­‐based	  immunohistochemical	  assays,	  cells	  are	  adhered	  to	  microscopy	  slides,	  fixed	  and/or	  permeabilized,	  blocked	  to	  reduce	  non-­‐specific	  binding,	  and	  subsequently	  incubated	  with	  varying	  dilutions	  of	  patient	  serum.	  Antibodies	  bound	  to	  the	  mounted	  cells	  are	  then	  visualized	  using	  fluorescent-­‐secondary	  antibodies.	  Mock	  transfected	  and/or	  non-­‐transfected	  cells	  of	  the	  same	  cell	  line	  are	  used	  as	  controls	  for	  this	  assay.	  Though	  these	  assays	  are	  generally	  more	  specific	  and	  sensitive	  than	  tissue-­‐based	  assay,	  with	  reported	  sensitivities	  of	  50	  –	  100%	  and	  specificities	  of	  95.5	  –	  100%	  based	  on	  clinical	  diagnosis,	  results	  are	  also	  semi-­‐quantitative	  and	  observer-­‐dependent.154	  	   Fluorescence	  can	  also	  be	  measured	  with	  flow	  cytometry.	  Published	  studies,	  using	  various	  cell	  lines	  and	  secondary	  antibodies,	  have	  reported	  assay	  sensitivities	  and	  specificities,	  based	  on	  clinical	  diagnosis,	  of	  30.3	  –	  81.8%	  and	  66.7	  –	  100%,	  respectively.154	  	   30	  This	  assay	  type	  is	  advantageous	  in	  its	  potential	  for	  large-­‐scale	  analysis.	  However,	  as	  antibody	  binding	  to	  transfected	  cells	  is	  corrected	  for	  background	  binding	  to	  mock-­‐transfected	  cells,	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  titers	  can	  be	  underestimated	  when	  there	  is	  a	  large	  amount	  of	  non-­‐specific	  binding	  to	  transfected	  and	  mock-­‐transfected	  cells.	  Cell-­‐based	  assays	  are	  greatly	  limited	  by	  the	  expression	  of	  the	  transfected,	  i.e.	  target,	  protein,	  and	  the	  upkeep	  of	  the	  cell	  lines.	  For	  examples,	  the	  expression	  rate	  of	  “stably”	  transfected	  cell	  lines	  can	  decline	  over	  time.	  As	  well,	  assays	  that	  choose	  to	  employ	  transiently	  transfected	  cell	  lines	  can	  have	  varying	  transfection	  efficiencies	  between	  experiments.	  However,	  large-­‐scale	  productions	  of	  slides	  with	  AQP4-­‐trasnfected	  cells,	  and	  the	  use	  of	  commercial	  kits	  overcome	  some	  of	  these	  complications.	  Also,	  the	  ratio	  of	  expression	  of	  the	  M1	  and	  M23	  isoforms	  of	  AQP4,	  as	  well	  as	  the	  ability	  of	  the	  cells	  to	  form	  OAPs,	  can	  factor	  in	  the	  ability	  of	  an	  assay	  to	  detect	  AQP4-­‐Ab. Protein-­‐Based	  Assays	  Protein-­‐based	  assays	  use	  purified	  recombinant	  AQP4	  protein	  or	  cell	  lysates.	  Reported	  techniques	  include	  radioimmunoprecipitation	  assays,	  fluoroimmunoprecipitation	  assays	  (FIPA),	  western	  blot,	  and	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  (ELISA).	  Apart	  from	  the	  obvious	  differences	  of	  these	  techniques,	  a	  factor	  that	  can	  greatly	  influence	  the	  detection	  of	  NMO-­‐IgG/AQP4	  in	  protein-­‐based	  assays	  is	  the	  substrate.	  For	  example,	  western	  blot	  uses	  denatured	  AQP4	  monomers	  when	  it	  has	  been	  show	  that	  AQP4	  tetramers	  and	  cell-­‐bound	  AQP4	  display	  more	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  binding.	  As	  well,	  in	  FIPAs,	  the	  large	  size	  of	  fluorochromes,	  such	  as	  EGFP,	  could	  prevent	  AQP4	  molecules	  from	  assembling	  into	  OAPs	  to	  which	  antibodies	  to	  AQP4	  have	  been	  reported	  to	  preferentially	  bind.142,	  143	  In	  general,	  	   31	  protein-­‐based	  assays	  have	  generated	  higher	  sensitivity	  than	  tissue-­‐based	  assays,	  though	  some	  studies	  have	  reported	  sensitivities	  lower	  than	  CBAs.154	  	  1.2.3 Pathology	  and	  Pathogenesis	  In	  NMO,	  focal	  lesions	  in	  the	  optic	  nerve	  and	  spinal	  cord	  display	  inflammation	  and	  demyelination.159	  Both	  the	  gray	  and	  white	  matter	  are	  usually	  involved	  in	  the	  spinal	  cord,	  sometimes	  presenting	  with	  necrosis	  and	  cavitation.	  In	  contrast	  to	  MS	  lesions,	  inflammatory	  infiltrates	  of	  active	  NMO	  lesions	  are	  largely	  made	  up	  of	  eosinophils	  and	  neutrophils,	  and	  penetrating	  spinal	  vessels	  are	  sometimes	  thickened	  and	  hyalinized.	  Active	  NMO	  lesions	  characteristically	  display	  a	  “rim”	  and	  “rosette”	  pattern	  due	  to	  the	  vasculocentric	  deposition	  of	  immunoglobulin	  and	  complement.160	  Loss	  of	  AQP4	  staining	  in	  NMO	  lesions	  regardless	  of	  the	  stage	  of	  demyelination	  activity	  or	  magnitude	  of	  tissue	  necrosis,	  together	  with	  the	  depletion	  of	  astrocytes,	  suggesting	  that	  AQP4	  or	  astrocytes	  may	  be	  intimately	  involved	  in	  the	  pathogenesis	  of	  NMO.161	  Actively	  demyelinating	  MS	  lesions,	  on	  the	  other	  hand,	  have	  increased	  expression	  of	  AQP4.	  	   An	  antibody-­‐mediated	  pathogenesis	  for	  NMO	  is	  supported	  by	  observations,	  such	  as	  lesional	  immunoglobulin	  and	  complement	  deposition,	  in	  addition	  to	  loss	  of	  AQP4	  from	  spinal	  cord	  lesions.160,	  161	  Moreover,	  the	  distribution	  of	  lesions	  in	  NMO	  is	  in	  areas	  with	  high	  AQP4	  concentration.	  Observations	  that	  plasma	  exchange	  and	  the	  therapeutic	  targeting	  of	  B	  cells	  are	  more	  effective	  treatments	  than	  the	  conventional	  disease-­‐modifying	  drugs	  used	  for	  MS,	  as	  well	  as	  the	  association	  of	  NMO	  with	  other	  autoimmune	  disorders	  and	  serum	  provide	  evidence	  of	  a	  prominent	  role	  for	  humoral	  autoimmune	  mechanisms.	  In	  vitro	  experiments	  have	  shown	  that	  NMO-­‐IgG	  binds	  specifically	  to	  human	  astrocytes	  inducing	  reversible	  AQP4	  	   32	  internalization.162,	  163	  This	  is	  consistent	  with	  observations	  that	  loss	  of	  AQP4	  even	  in	  the	  absence	  of	  astrocyte	  morphology	  changes,	  demyelination,	  or	  tissue	  destruction,	  and	  with	  the	  MRI	  data	  showing	  the	  reversibility	  of	  brain	  changes	  once	  the	  patients	  have	  been	  treated	  with	  corticosteroids	  or	  plasma	  exchange.161	  Furthermore,	  NMO-­‐IgG	  in	  the	  presence	  of	  complement	  has	  been	  shown	  to	  initiate	  cell	  membrane	  injury,	  cell	  death,	  BBB	  disruption,	  and	  increase	  granulocyte	  recruitment.164,	  165	  Saadoun	  et	  al.	  have	  demonstrated	  NMO-­‐IgG	  dose-­‐dependent	  astrocytic	  cytotoxicity	  in	  mice.166	  NMO-­‐IgG	  has	  also	  been	  shown	  to	  regulate	  EAAT2,	  the	  glutamate	  transporter,	  and	  decrease	  glutamate	  uptake.163	  Thus,	  there	  is	  mounting	  evidence	  to	  support	  the	  hypothesis	  that	  NMO-­‐IgG,	  or	  AQP4-­‐Ab,	  can	  directly	  cause	  tissue	  injury	  through	  complement-­‐initiated	  excitotoxic	  pathways	  and	  inflammatory	  mechanisms.	  	  1.2.4 Diagnosis	  According	  to	  the	  2006	  Wingerchuk	  criteria,	  a	  definite	  diagnosis	  of	  NMO	  requires	  optic	  neuritis	  (ON),	  transverse	  myelitis,	  and	  at	  least	  two	  of	  three	  supportive	  criteria:	  MRI	  evidence	  of	  a	  contiguous	  spinal	  cord	  lesion	  extending	  over	  three	  or	  more	  vertebral	  segments,	  onset	  brain	  MRI	  that	  is	  nondiagnostic	  for	  MS,	  or	  NMO-­‐IgG	  seropositivity.117	  The	  limited	  forms	  of	  NMO,	  i.e.	  NMOsd,	  include	  recurrent	  or	  simultaneous	  bilateral	  ON,	  and	  “idiopathic”	  single	  or	  recurrent	  events	  of	  longitudinally	  extensive	  transverse	  myelitis,	  i.e.	  MRI	  spinal	  cord	  lesion	  greater	  than	  three	  segments.109	  	  	   33	  1.2.5 Epidemiology	  &	  Genetics	  NMO	  is	  a	  rare	  disorder	  and	  few	  studies	  have	  estimated	  incidence	  and	  prevalence.	  A	  retrospective	  cross-­‐sectional	  population-­‐based	  study	  in	  the	  French	  West	  Indies	  and	  Martinique	  reported	  NMO	  prevalence	  of	  2.5	  per	  100,000	  and	  annualized	  incidence	  of	  0.1	  per	  100,000	  individuals.167	  Furthermore,	  all	  their	  cases	  of	  NMO	  were	  in	  individuals	  of	  Afro-­‐Caribbean	  decent.	  A	  Cuban	  study	  estimated	  a	  prevalence	  of	  0.52	  per	  100,000	  individuals	  and	  an	  annualized	  incidence	  rate	  of	  0.52	  per	  million	  with	  comparable	  rates	  in	  their	  defined	  racial	  groups	  (white,	  black,	  mixed,	  and	  non-­‐white).168	  These	  estimates	  from	  population-­‐based	  investigations	  are	  similar	  to	  ones	  reported	  in	  non-­‐population-­‐based	  studies.	  These	  studies	  include	  ones	  done	  in	  Mexico,	  where	  prevalence	  was	  1.3	  per	  100,000	  individuals	  of	  Mestizo	  ancestry,	  and	  the	  United	  Kingdom,	  where	  prevalence	  was	  0.44	  per	  100,000	  and	  annualized	  incidence	  of	  0.05	  per	  100,000	  with	  reported	  NMO	  cases	  in	  Caucasians.169	  	  	   AQP4-­‐Ab	  seropositivity	  is	  more	  frequent	  in	  patients	  with	  the	  relapsing	  form	  of	  NMO,	  ON	  or	  longitudinally	  extensive	  transverse	  myelitis	  than	  in	  the	  monophasic	  NMO.109,	  117,	  143	  As	  well,	  20	  –	  48%	  of	  people	  from	  the	  West	  Indies	  and	  Asia,	  compared	  to	  1	  –	  2%	  of	  Caucasians	  from	  Europe,	  North	  America,	  or	  Australia,	  with	  demyelinating	  disease	  fulfill	  the	  2006	  diagnostic	  criteria	  for	  definite	  NMO.109	  However,	  prevalence	  estimates	  for	  NMO	  are	  likely	  increase	  with	  the	  availability	  of	  more	  sensitive	  AQP4-­‐Ab	  testing.	  The	  incidence	  rate	  peaks	  at	  a	  median	  age	  of	  39	  years,	  although	  NMO	  can	  present	  at	  any	  age.109	  NMO	  is	  also	  widely	  recognized	  to	  have	  a	  female	  predominance	  with	  reports	  of	  female:male	  ratios	  from	  2:1	  to	  10:1,	  and	  women	  accounting	  for	  approximately	  85%	  of	  reported	  cases.109,	  170	  	   Transmission	  of	  disease	  from	  mother	  to	  fetus	  has	  not	  been	  reported	  in	  NMO,	  likely	  because	  there	  is	  very	  little	  AQP4	  expression	  in	  the	  fetal	  CNS	  before	  BBB	  formation.171	  	   34	  Moreover,	  only	  roughly	  3%	  of	  NMO	  patients	  have	  relatives	  with	  the	  disease	  compared	  to	  the	  10	  to	  20%	  in	  MS.172	  	  Like	  MS,	  the	  underlying	  genetic	  susceptibility	  of	  the	  disorder	  is	  complex.	  There	  have	  been	  studies	  showing	  various	  HLA	  associations	  in	  different	  ethnic	  groups,	  though	  these	  are	  different	  from	  those	  in	  MS.173,	  174	  Lastly,	  genetic	  analysis	  of	  AQP4	  revealed	  that	  variations	  in	  the	  gene	  sequence	  do	  not	  significantly	  account	  for	  susceptibility	  for	  NMO.175,	  176	  	  	  1.2.6 Treatment	  Treatment	  for	  NMO	  aims	  to	  prevent	  clinical	  attacks	  in	  the	  relapsing	  disease	  and	  delay	  disease	  progression	  and	  disability.	  However,	  there	  have	  been	  observations	  that	  standard	  disease-­‐modifying	  drugs	  used	  in	  MS,	  such	  as	  IFN-­‐βs	  and	  glatiramer	  acetate,	  are	  not	  effective	  in	  NMO	  and	  can	  even	  possibly	  aggravate	  the	  disease,	  in	  the	  case	  of	  IFN-­‐βs.159	  Rather,	  it	  is	  immunosuppressive	  therapy,	  such	  as	  oral	  regimens	  of	  azathioprine,	  prednisone,	  or	  mycophenolate	  mofetil,	  and	  B	  cell	  depletion	  therapies,	  namely	  the	  chimeric	  anti-­‐CD20	  monoclonal	  antibody	  rituximab	  (Rituxan;	  IDEC	  Pharmaceuticals)	  that	  appear	  to	  reduce	  attack	  frequency.177	  Additional	  immunosuppressive	  therapies	  include	  cyclophosphamide,	  mitoxantrone,	  and	  intravenous	  immunoglobulin.159	  	  The	  first-­‐line	  therapy	  for	  acute	  clinical	  attacks	  is	  a	  course	  of	  intravenous	  corticosteroids.	  However,	  therapeutic	  plasma	  exchange	  (TPE)	  can	  be	  used	  as	  an	  add-­‐on	  therapy,	  often	  for	  those	  who	  do	  not	  respond	  to	  intravenous	  steroids,	  or	  if	  they	  progress	  after	  steroid	  treatment.	  TPE	  in	  NMO	  is	  believed	  to	  remove	  anti-­‐AQP4	  antibodies,	  complement	  and	  other	  immune	  complexes,	  as	  well	  as	  inflammatory	  mediators.160,	  178	  	  Keegan	  et	  al.	  179	  retrospectively	  reviewed	  Mayo	  Clinic	  patients	  who	  received	  TPE	  between	  	   35	  1984	  and	  2000,	  which	  included	  ten	  NMO	  patients,	  and	  found	  that	  six	  of	  the	  NMO	  patients	  showed	  improvement	  within	  days	  and	  a	  sustained	  improvement	  of	  myelitis	  symptoms.	  Furthermore,	  they	  found	  factors	  that	  were	  associated	  with	  moderate-­‐to-­‐marked	  improvement	  from	  TPE	  included	  being	  male,	  having	  preserved	  reflexes,	  and	  initiating	  treatment	  early.	  Another	  study	  demonstrated	  that	  three	  of	  six	  NMO-­‐IgG	  positive	  patients	  that	  were	  unresponsive	  to	  high-­‐dose	  methylprednisone	  showed	  functional	  improvement	  after	  TPE.180	  Moreover,	  in	  a	  study	  that	  compared	  the	  outcome	  to	  TPE	  treatment	  of	  steroid-­‐only	  treated	  versus	  steroid	  plus	  TPE	  treated	  spinal	  attacks	  in	  NMO	  and	  extensive	  transverse	  myelitis	  concluded	  that	  TPE	  is	  effective	  regardless	  of	  AQP4-­‐Ab	  status.181	  There	  have	  also	  been	  observations	  to	  support	  the	  use	  of	  TPE	  for	  the	  treatment	  of	  refractory	  myelitis	  and	  ON	  attacks	  associated	  with	  NMO.181	  	   	  1.3 Surface	  Plasmon	  Resonance	  and	  Biacore™	  Technology	  Surface	  plasmon	  resonance	  (SPR)	  is	  a	  phenomenon	  that	  occurs	  at	  the	  interface	  of	  two	  different	  media	  when	  polarized	  light	  hits	  an	  electrically	  conducting	  surface	  producing	  electron	  charge	  density	  waves	  called	  plasmons.	  This	  lessens	  the	  intensity	  of	  reflected	  light	  at	  a	  specific	  angle,	  called	  the	  resonance	  angle,	  in	  proportion	  to	  the	  mass	  on	  the	  surface.	  BIAcore™	  is	  a	  label-­‐free	  biosensor	  that	  detects	  biomolecular	  interactions	  in	  real	  time	  using	  SPR	  technology.	  In	  Biacore	  systems,	  the	  media	  that	  are	  struck	  with	  light	  are	  the	  glass	  of	  the	  sensor	  chip	  and	  the	  sample	  solution,	  while	  the	  conducting	  surface	  is	  a	  thin	  layer	  of	  gold	  on	  the	  sensor	  surface.	  Light	  of	  a	  fixed	  wavelength	  is	  directed	  at	  the	  sensor	  surface	  through	  a	  prism	  and	  SPR	  mass	  changes	  in	  the	  aqueous	  layer	  close	  to	  the	  sensor	  surface	  are	  detected	  by	  measuring	  shifts	  in	  refractive	  index.	  These	  shifts	  are	  translated	  into	  SPR	  response	  values	  	   36	  called	  resonance	  units	  (RU),	  where	  one	  RU	  is	  an	  angle	  change	  of	  0.0001°	  or	  a	  change	  in	  concentration	  of	  1	  pg/mm2	  on	  the	  sensor	  surface	  for	  most	  proteins.	  Biacore	  systems	  have	  a	  continuous	  flow	  of	  running	  buffer	  within	  the	  instrument	  microfluidics.	  Samples	  are	  injected	  into	  the	  system,	  run	  over	  the	  sensor	  surface,	  and	  analyzed	  to	  produce	  a	  sensogram	  that	  plots	  response	  against	  time	  that	  shows	  the	  progress	  of	  real-­‐time	  surface	  biomolecular	  interactions.	  	   Biacore	  biosensors	  utilize	  sensor	  chips	  to	  immobilize	  a	  binding	  molecule,	  i.e.	  a	  ligand,	  that	  will	  interact	  with	  an	  analyte	  in	  solution	  that	  is	  run	  over	  the	  chip	  surface.	  Ligands	  can	  be	  bound	  directly	  to	  the	  chip	  surface,	  e.g.	  through	  amine	  or	  thiol	  coupling,	  or	  indirectly	  via	  an	  immobilized	  capture	  molecule,	  e.g.	  streptavidin	  to	  bind	  biotinylated	  molecules.	  A	  commonly	  used	  sensor	  chip	  is	  one	  with	  a	  gold	  surface	  that	  has	  a	  carboxymethyl	  dextran	  hydrogel	  layer	  that	  forms	  a	  hydrophilic	  environment	  for	  attached	  biomolecules,	  such	  as	  proteins,	  lipids,	  carbohydrates,	  and	  nucleic	  acids,	  preserving	  them	  in	  a	  non-­‐denatured	  state.	  The	  most	  widely	  used	  method	  for	  coupling	  is	  amine	  coupling.	  This	  is	  done	  by	  activating	  the	  carboxymethyl	  dextran	  matrix	  with	  a	  1:1	  mixture	  of	  N-­‐hydroxysuccinimide	  (NHS)	  and	  1-­‐Ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)	  carbodiimide	  hydrochloride	  (EDC)	  to	  give	  succinimide	  esters	  that	  can	  react	  with	  amino	  groups	  in	  the	  ligand	  to	  be	  immobilized	  when	  it	  is	  subsequently	  run	  over	  the	  chip	  surface.	  Sensor	  chips	  are	  reusable	  due	  to	  the	  regeneration	  process	  that	  removes	  bound	  analyte	  from	  the	  surface	  after	  analysis	  while	  leaving	  the	  ligand,	  allowing	  for	  the	  analysis	  of	  another	  sample.	  	   Biacore	  technology	  can	  be	  used	  to	  examine	  interactions	  between	  the	  immobilized	  ligand	  and	  the	  analyte	  in	  solution	  producing	  sensograms	  that	  can	  be	  used	  to	  analyze	  not	  only	  surface	  or	  bulk	  concentration	  of	  the	  analyte	  and	  binding	  specificity	  to	  the	  ligand,	  but	  	   37	  also	  affinity	  and	  kinetics.	  Thus,	  Biacore	  technology	  has	  many	  potential	  applications,	  especially	  in	  immunology	  and	  drug	  research.	  	   	  	   Our	  work	  has	  focused	  on	  two	  areas:	  the	  measure	  of	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  and	  reproducibility	  of	  antibody	  testing	  with	  commonly	  used	  immunoassays	  and	  Biacore	  technology	  as	  it	  applies	  to	  anti-­‐natalizumab	  antibodies.	  The	  subsequent	  chapters	  detail	  the	  experiments	  done	  and	  discuss	  what	  the	  results	  tell	  of	  the	  relevance	  and	  usefulness	  of	  antibody	  testing	  for	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  and	  anti-­‐natalizumab	  antibodies.	  	  	   38	  CHAPTER	  2:	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Measurement	  Natalizumab	  (Tysabri®;	  Biogen	  Idec	  and	  Elan	  Pharmaceuticals),	  a	  therapeutic	  humanized	  monoclonal	  antibody	  against	  α4-­‐integrin,	  blocks	  the	  migration	  of	  leukocytes	  across	  the	  blood-­‐brain	  barrier	  into	  the	  central	  nervous	  system	  and	  suppresses	  the	  inflammatory	  response	  in	  the	  relapsing-­‐remitting	  forms	  of	  multiple	  sclerosis	  (MS).	  182,	  183	  Natalizumab	  was	  shown	  to	  reduce	  the	  annualized	  relapse	  rate	  over	  two	  years	  by	  68%	  (p	  <	  0.001)	  as	  a	  monotherapy	  when	  compared	  with	  placebo,94	  and	  by	  55%	  (p<	  0.001)	  as	  an	  add-­‐on	  therapy	  when	  compared	  with	  interferon-­‐β1	  alone.95	  However,	  like	  other	  biologicals,100	  natalizumab	  can	  induce	  antibodies	  during	  treatment.	  These	  antibodies	  may	  decrease	  efficacy	  by	  increasing	  drug	  clearance	  or	  preventing	  the	  binding	  of	  the	  drug	  to	  α4-­‐integrin.101	  Persistent	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  are	  associated	  with	  increased	  infusion-­‐related	  adverse	  events	  and	  loss	  of	  treatment	  efficacy.101	  	  This	  chapter	  will	  describe	  an	  assay	  that	  has	  been	  widely	  used	  for	  the	  detection	  and	  measurement	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  human	  serum	  and	  compare	  it	  with	  a	  novel	  method	  we	  have	  developed	  to	  detect	  this	  antibody	  on	  a	  BIAcore™	  platform.	  In	  addition,	  we	  proceeded	  with	  inhibition	  studies	  utilizing	  a	  solution	  competition	  protocol	  to	  examine	  the	  antibody	  affinity	  over	  time	  in	  serial	  serum	  samples.	  	  	  	   39	  2.1 Methods	  2.1.1 Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  ELISA	  The	  presence	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  was	  screened	  for	  in	  human	  serum	  using	  a	  bridging	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  (ELISA)	  that	  was	  modified	  from	  a	  protocol	  that	  was	  previously	  described.101	  Biotinylation	  of	  Natalizumab	  Natalizumab	  was	  biotinylated	  as	  per	  instructions	  of	  the	  commercially	  available	  EZ-­‐Link	  Sulfo-­‐NHS-­‐Biotin	  and	  Biotinylation	  Kit	  (Pierce,	  Rockford,	  IL,	  USA).	  Briefly,	  800	  μl	  of	  2	  mg/ml	  natalizumab	  was	  incubated	  with	  20-­‐fold	  molar	  excess	  of	  Sulfo-­‐NHS-­‐LC-­‐biotin	  for	  2	  hours	  on	  ice	  and	  excess	  biotin	  was	  removed	  from	  solution	  with	  desalting	  spin	  columns.	  	  	   A	  BCA	  (bicinchoninic	  acid)	  protein	  assay	  (Pierce,	  Rockford,	  IL,	  USA)	  was	  performed	  on	  the	  final	  product	  to	  determine	  the	  concentration	  of	  biotinylated	  natalizumab	  in	  solution.	  The	  biotinylated	  natalizumab	  was	  used	  for	  in	  the	  bridging	  ELISA	  (described	  below). Optimization	  of	  the	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA.	  Figure	  2.1	  is	  a	  pictorial	  representation	  of	  the	  bridging	  ELISA.	  Microtitre	  plates	  were	  coated	  with	  100	  μl/well	  of	  natalizumab	  diluted	  to	  0.25	  μg/ml	  in	  0.1M	  sodium	  phosphate	  2μg/ml	  bovine	  serum	  albumin	  (BSA;	  final	  concentration),	  pH	  8.5,	  coating	  buffer	  at	  4°C	  overnight.	  Plates	  were	  then	  blocked	  with	  0.1M	  Tris,	  pH	  7.7,	  20%	  sucrose	  blocking	  buffer	  for	  1	  hour	  at	  room	  temperature,	  during	  which	  samples	  to	  be	  assayed	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  	   40	  were	  diluted	  1:10	  in	  assay	  buffer	  (1x	  phosphate-­‐buffered	  saline	  (PBS),	  1%	  w/v	  BSA,	  pH	  7.2).	  Diluted	  samples	  were	  plated	  100	  μl/well	  and	  incubated	  at	  room	  temperature	  for	  1	  hour.	  The	  reagents	  for	  subsequent	  ELISA	  steps	  were	  optimized	  by	  testing	  combinations	  of	  different	  concentrations	  of	  each	  reagent	  diluted	  in	  assay	  buffer	  and	  plated	  100	  μl/well	  at	  varying	  concentrations,	  unless	  otherwise	  stated,	  and	  performed	  at	  room	  temperature.	  The	  next	  steps	  are	  1	  hour	  incubations	  with	  100	  μl/well	  of	  natalizumab-­‐biotin	  and	  secondary	  antibody,	  Pierce®	  High	  Sensitivity	  streptavidin-­‐horseradish	  peroxidase	  (SA-­‐HRP;	  Thermo	  Scientific,	  Rockford,	  IL,	  USA).	  o-­‐Phenylenediamine	  (OPD;	  Sigma-­‐Aldrich,	  St.	  Louis,	  MO,	  USA)	  tablets	  were	  used	  as	  substrate	  and	  diluted	  in	  citrate/phosphate	  buffer,	  pH	  5.0,	  as	  per	  the	  OPD	  product	  sheet	  at	  varying	  concentrations	  and	  plated	  200	  μl/well.	  Plates	  were	  left	  to	  develop	  for	  25	  minutes	  in	  the	  dark	  and	  read	  with	  a	  colorimeter	  at	  405	  nm.	  Raw	  optical	  density	  (OD)	  values	  were	  used	  to	  compare	  samples	  within	  the	  same	  plate.	  	  	   41	  Figure	  2.1.	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA Competition	  Assay.	  Once	  the	  ELISA	  was	  optimized	  (see	  section,	  a	  competition	  assay	  was	  performed	  to	  confirm	  that	  the	  presence	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  the	  samples	  produces	  a	  response,	  i.e.	  an	  increased	  OD	  value.	  Samples	  were	  pre-­‐incubated	  with	  excess	  natalizumab	  (100	  μg/ml	  final	  concentration)	  before	  assaying	  using	  the	  optimized	  bridging	  ELISA	  protocol	  on	  the	  principle	  that	  the	  high	  concentration	  of	  natalizumab	  will	  bind	  the	  anti-­‐	   42	  natalizumab	  antibodies	  before	  being	  added	  to	  the	  ELISA	  plates	  effectively	  blocking	  the	  coated	  natalizumab/antibody	  complex	  needed	  for	  the	  ELISA	  and	  producing	  a	  decreased	  or	  abrogating	  signal. Inter-­‐	  and	  Intra-­‐Assay	  Variability.	  As	  an	  expression	  of	  precision	  and	  repeatability	  of	  the	  bridging	  ELISA,	  inter-­‐	  and	  intra-­‐assay	  coefficients	  of	  variability	  (CVs)	  were	  calculated	  for	  a	  three-­‐plate	  experiment	  that	  assayed	  blinded	  samples	  (see	  Test	  Samples	  and	  Detection	  of	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibodies	  in	  Section	  2.1.2)	  and	  repeated	  positive,	  negative	  and	  healthy	  controls	  on	  each	  plate.	  As	  CV	  is	  simply	  the	  standard	  deviation	  of	  a	  set	  of	  measurements	  divided	  by	  the	  mean	  multiplied	  by	  100%,	  inter-­‐assay	  CV	  is	  the	  average	  CV	  of	  the	  control	  samples	  repeated	  on	  each	  plate,	  while	  intra-­‐assay	  CV	  is	  an	  average	  value	  calculated	  from	  individual	  CVs	  for	  all	  the	  duplicates	  on	  a	  plate	  or	  for	  the	  entire	  experiment,	  i.e.	  all	  plates.	  	  2.1.2 Detecting	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform Test	  Samples.	  Ten	  control	  samples	  of	  varying	  concentrations	  of	  a	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  (clone	  12C4;	  Biogen	  Idec),	  22	  untreated	  MS	  patient	  sera,	  two	  positive	  control	  sera,	  normal	  healthy	  individuals	  (n=20),	  as	  well	  as	  serial	  samples	  (n=75)	  from	  5	  patients	  treated	  with	  natalizumab	  and	  2	  patients	  on	  placebo	  for	  up	  to	  30	  months,	  were	  blindly	  analyzed.	  Serum	  samples	  were	  clarified	  before	  use	  by	  centrifuging	  at	  16,000	  x	  g	  for	  12	  minutes	  at	  4°C.	  	   43 Immobilization	  of	  Natalizumab	  on	  the	  Biacore	  Sensor	  Chip	  Surface.	  With	  a	  Biacore	  3000	  Biosensor	  (GE	  Healthcare	  Europe,	  Munich,	  Germany)	  equipped	  with	  a	  CM5	  sensor	  chip,	  natalizumab	  was	  covalently	  immobilized	  to	  the	  sensor	  chip	  surface	  through	  amine	  coupling.	  This	  was	  done	  by	  first	  activating	  the	  flow	  cells	  of	  the	  sensor	  chip	  with	  a	  1:1	  mixture	  of	  0.1M	  N-­‐hydroxysuccinimide	  (NHS)	  and	  0.4M	  1-­‐Ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)	  carbodiimide	  hydrochloride	  (EDC)	  at	  a	  flow	  rate	  of	  5	  μl/min	  for	  7	  minutes.	  Natalizumab	  diluted	  to	  100	  μg/ml	  in	  acetate	  pH	  5.0	  was	  injected	  in	  one	  flow	  cell	  for	  7	  minutes	  at	  5	  μl/min	  and	  unreacted	  sites	  on	  the	  surface	  were	  blocked	  with	  1.0	  M	  ethanolamine	  hydrochloride-­‐NaOH	  pH	  8.5	  for	  7	  minutes	  at	  5	  μl/min.	  The	  reference	  surface	  was	  generated	  by	  activating	  and	  blocking	  an	  adjacent	  flow	  cell.	  Finally,	  the	  surfaces	  were	  conditioned	  by	  the	  sequential	  injection	  of	  10	  μl	  pulses	  of	  glycine-­‐HCl	  pH	  1.7,	  50	  mM	  NaOH,	  60	  mM	  H3PO4,	  and	  0.5%	  w/v	  SDS	  at	  a	  flow	  rate	  of	  100	  μl/min. Detection	  of	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibodies.	  Levels	  of	  antibody	  binding	  to	  the	  surface	  of	  the	  sensor	  chip	  with	  immobilized	  natalizumab	  versus	  a	  blank	  reference	  surface	  were	  determined	  in	  samples	  diluted	  1:10	  in	  sample/running	  buffer	  consisting	  of	  HEPES-­‐buffered-­‐saline-­‐EP	  (HBS-­‐EP;	  0.01	  M	  HEPES	  pH	  7.4,	  0.15	  M	  NaCl,	  3	  mM	  EDTA,	  0.005%	  v/v	  surfactant	  P20)	  with	  0.02%	  (w/v)	  BSA.	  Diluted	  samples	  were	  injected	  over	  both	  the	  surface	  with	  immobilized	  natalizumab	  and	  the	  reference	  surface	  at	  20	  μl/min	  for	  3	  minutes	  followed	  by	  a	  dissociation	  phase	  of	  2.5	  minutes	  during	  which	  sample	  injection	  ceased	  and	  running	  buffer	  flowed	  over	  the	  surfaces.	  	   44	  Regeneration	  of	  the	  surface	  was	  achieved	  by	  injecting	  10	  mM	  HCl	  for	  50	  seconds	  at	  a	  flow	  rate	  of	  20	  μl/min.	  All	  steps	  were	  performed	  at	  room	  temperature.	  Antibody	  binding	  levels	  were	  collected	  1	  minute	  before	  the	  end	  of	  the	  dissociation	  phase,	  and	  double-­‐referenced	  by	  subtracting	  out	  buffer	  blanks	  and	  binding	  to	  the	  reference	  surface.	  Cutoff	  for	  positivity	  was	  defined	  as	  a	  response	  greater	  than	  the	  mean	  +	  3	  standard	  deviations	  (SD)	  of	  healthy	  controls.	  All	  samples	  were	  also	  assayed	  with	  the	  optimized	  in-­‐house	  bridging	  ELISA	  (See	  Section	  2.2.1).	  Antibody	  positivity	  was	  further	  confirmed	  by	  pre-­‐incubating	  samples	  diluted	  1:10	  in	  sample/running	  buffer	  with	  excess	  natalizumab	  (final	  concentration	  of	  100μg/ml)	  and	  incubating	  at	  37°C	  for	  1	  hour	  prior	  to	  injection	  over	  the	  chip	  surfaces. Data	  Analysis.	  Biacore	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  response	  was	  calculated	  by	  subtracting	  the	  binding	  response	  of	  the	  reference	  surface	  from	  that	  of	  the	  surface	  with	  immobilized	  natalizumab.	  Due	  to	  the	  limited	  amound	  of	  12C4	  monoclonal	  antibody,	  a	  standard	  curve	  was	  not	  run	  and,	  therefore,	  Biacore	  response	  units	  (RU)	  and	  the	  raw	  ELISA	  optical	  densities	  (OD)	  were	  used	  to	  compare	  samples.	  	  	   45	  2.1.3 Biacore™	  In-­‐Solution	  Competition	  Studies	  for	  the	  Determination	  of	  Relative	  Antibody	  Affinities Test	  Samples.	  The	  12C4	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  was	  used	  at	  concentration	  of	  1	  μg/ml.	  Samples	  from	  the	  single	  natalizumab-­‐treated	  patient	  that	  was	  found	  to	  be	  seropositive	  for	  the	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  (see	  section	  2.2.2)	  were	  used	  in	  this	  study.	  Only	  the	  samples	  from	  treatment	  weeks	  that	  were	  found	  to	  be	  seropositive	  were	  used,	  i.e.	  weeks	  4,	  12,	  24,	  36,	  48,	  and	  60.	  The	  sera	  were	  clarified	  by	  centrifuging	  at	  16,000	  x	  g	  for	  12	  minutes	  at	  4°C.	  All	  test	  samples	  were	  diluted	  1:10	  in	  HBS-­‐EP	  0.02%	  (w/v)	  BSA	  sample/running	  buffer	  without	  natalizumab	  and	  with	  final	  concentrations	  of	  natalizumab	  ranging	  between	  0.381	  ng/ml	  and	  200μg/ml,	  and	  incubated	  at	  37°C	  for	  1	  hour	  prior	  to	  use. Immobilization	  of	  Natalizumab	  on	  the	  Biacore	  Sensor	  Chip	  Surface	  at	  Different	  Densities.	  A	  CM5	  sensor	  chip	  was	  immobilized	  with	  natalizumab	  as	  in	  section	  2.1.2	  except	  the	  sensor	  chip	  had	  three	  flow	  cells	  with	  the	  immobilized	  drug,	  instead	  of	  one,	  at	  three	  different	  target	  densities:	  High	  (~10,000	  response	  units	  (RU)),	  medium	  (~2000	  RU),	  and	  low	  density	  (~500	  RU)	  surfaces.	  The	  remaining	  flow	  cell	  served	  as	  the	  reference	  surface	  that	  was	  simply	  activated	  and	  blocked.	  	  	  	   46 Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Detection	  by	  Biacore.	  Levels	  of	  antibody	  binding	  to	  the	  different	  surfaces	  were	  measured	  on	  the	  Biacore	  3000	  biosensor	  as	  in	  section	  2.1.2. Data	  Analysis.	  Biacore	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  response	  was	  calculated	  by	  subtracting	  the	  reference	  surface	  response	  from	  that	  of	  the	  surfaces	  with	  immobilized	  natalizumab.	  	   Statistical	  analysis	  was	  performed	  using	  Prism	  5	  for	  MacOS	  X	  (GraphPad	  Software,	  San	  Diego,	  CA,	  USA).	  Percent	  inhibition	  was	  calculated	  by	  taking	  the	  antibody	  binding	  response	  at	  response	  point	  2	  of	  different	  pre-­‐incubated	  natalizumab	  concentrations	  for	  each	  test	  sample	  and	  subtracting	  it	  from	  the	  response	  for	  the	  respective	  sample	  without	  natalizumab,	  dividing	  the	  difference	  by	  the	  sample	  response	  without	  natalizumab,	  and	  multiplying	  by	  100%.	  Inhibition	  curves	  for	  each	  treatment	  week	  and	  for	  the	  12C4	  monoclonal	  antibody	  on	  the	  three	  different	  surface	  densities	  of	  natalizumab	  were	  plotted	  against	  the	  logarithm	  of	  the	  pre-­‐incubation	  (inhibitory)	  concentration	  of	  natalizumab.	  Non-­‐linear	  regression	  was	  used	  to	  fit	  curves	  to	  each	  graph	  and	  calculate	  the	  half	  maximal	  inhibitory	  concentration,	  IC50,	  i.e.	  the	  concentration	  of	  antibody	  needed	  to	  get	  50%	  inhibition	  or	  binding.	  	  	   47	  2.2 Results	  2.2.1 Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  ELISA Biotinylation	  of	  Natalizumab.	  The	  BCA	  assay	  measured	  the	  desalted	  solution	  to	  have	  a	  protein	  concentration	  of	  1.7	  mg/ml	  in	  922	  μl.	  Assuming	  that	  all	  the	  free	  biotin	  was	  removed,	  there	  was	  a	  97.96%	  recovery	  from	  the	  original	  product	  of	  800	  μl	  of	  2	  mg/ml	  natalizumab. Optimization	  of	  the	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA.	  With	  an	  OPD	  concentration	  of	  0.5	  mg/ml,	  increasing	  the	  concentration	  of	  natalizumab-­‐biotin	  also	  increases	  the	  signal	  of	  the	  blank	  wells,	  i.e.	  non-­‐specific	  background	  binding	  (Figure	  2.2).	  Moreover,	  changing	  the	  SA-­‐HRP	  dilution	  did	  not	  appear	  to	  have	  a	  noticeable	  effect	  except	  on	  Positive	  Control	  1.	  With	  SA-­‐HRP	  diluted	  1:6000	  and	  natalizumab-­‐biotin	  at	  a	  concentration	  of	  1.5	  μg/ml,	  increasing	  concentration	  of	  OPD	  substrate	  increases	  the	  OD	  of	  positive	  controls	  without	  significantly	  increasing	  the	  blanks	  (Figure	  2.3).	  Thus,	  for	  increasing	  the	  signal	  of	  positive	  samples	  without	  increasing	  negative	  and	  background	  ODs,	  and	  for	  the	  ease	  of	  pipetting	  and	  diluting,	  especially	  with	  the	  OPD	  substrate	  tablets,	  as	  well	  to	  minimize	  the	  disposal	  of	  excess	  reagents,	  the	  optimized	  ELISA	  protocol	  uses	  1.5	  μg/ml	  natalizumab-­‐biotin,	  SA-­‐HRP	  diluted	  1:6000,	  and	  1.0	  mg/ml	  OPD.	  For	  the	  full	  optimized	  protocol	  for	  the	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  bridging	  ELISA,	  see	  Appendix	  A.	  	  	   48	  Figure	  2.2.	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA	  –	  Varying	  Natalizumab-­‐Biotin	  and	  SA-­‐HRP	  Abbreviations:	  NHPS,	  normal	  human	  pool	  serum;	  OPD,	  o-­‐Phenylenediamine,	  SA-­‐HRP,	  streptavidin-­‐horseradish	  peroxidase.	  	  Figure	  2.3.	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  ELISA	  –	  Varying	  OPD	  Abbreviations:	  NHPS,	  normal	  human	  pool	  serum;	  OPD,	  o-­‐Phenylenediamine,	  SA-­‐HRP,	  streptavidin-­‐horseradish	  peroxidase.	  	   49 Competition	  Assay.	  Using	  the	  optimized	  reagent	  concentrations,	  it	  was	  confirmed	  that	  a	  signal	  from	  the	  bridging	  ELISA	  is	  a	  result	  of	  the	  presence	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  as	  pre-­‐incubation	  with	  excess	  natalizumab	  diminished	  the	  OD	  to	  background	  levels	  in	  seropositive	  samples	  while	  levels	  for	  negative	  and	  healthy	  controls	  remained	  comparable	  to	  the	  blanks	  with	  or	  without	  excess	  natalizumab	  (Figure	  2.4)	  	  Figure	  2.4.	  Confirmatory	  competition	  assay	  using	  the	  optimized	  ELISA	  protocol	  Abbreviations:	  HC,	  healthy	  control;	  NHPS,	  normal	  human	  pool	  serum.	  	  	   50 Inter-­‐	  and	  Intra-­‐Assay	  Variability.	  The	  inter-­‐assay	  CV,	  i.e.	  the	  average	  CV	  of	  the	  control	  samples	  that	  were	  run	  on	  all	  plates,	  was	  calculated	  to	  be	  9.46%.	  The	  intra-­‐assay	  CV,	  the	  average	  CV	  for	  the	  duplicates	  on	  a	  single	  plate	  or	  for	  all	  duplicates	  in	  an	  experiment,	  was	  6.0,	  6.9,	  and	  4.9%	  for	  individual	  plates	  or	  6.3%	  for	  all	  plates.	  	  2.2.2 Detecting	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform Immobilization	  of	  Natalizumab	  on	  the	  Biacore	  Sensor	  Chip	  Surface.	  Natalizumab	  was	  immobilized	  at	  a	  density	  of	  9956	  response	  units	  (RU;	  Figure	  2.5). Detection	  of	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibodies.	  Figure	  2.6	  shows	  the	  binding	  response	  and	  OD	  values	  for	  the	  blinded	  12C4	  monoclonal	  samples,	  as	  well	  as	  the	  untreated	  MS	  patients	  and	  healthy	  controls.	  For	  Biacore,	  healthy	  controls	  ranged	  from	  -­‐30	  to	  58	  RU	  with	  a	  mean	  ±	  standard	  deviation	  of	  31±	  21,	  with	  a	  positivity	  cutoff	  of	  93	  RU.	  For	  ELISA,	  healthy	  controls	  ranged	  from	  OD	  values	  of	  0.081	  to	  0.173	  with	  a	  mean	  ±	  standard	  deviation	  of	  0.097	  ±	  0.024,	  with	  a	  positivity	  cutoff	  of	  0.167.	  The	  untreated	  MS	  patient	  sera	  were	  all	  found	  to	  be	  antibody-­‐negative	  by	  both	  assays.	  	  	  	   	  	   51	  Figure	  2.5.	  Immobilization	  of	  Natalizumab	  onto	  a	  CM5	  Sensor	  Chip	  	  Figure	  2.5.	  A)	  Antigen	  preconcentration	  (where	  a	  small	  amount	  of	  the	  ligand	  is	  injected	  to	  test	  electrostatic	  attraction	  between	  the	  antigen	  and	  the	  surface),	  B)	  Surface	  activation	  with	  EDC/NHS,	  C)	  Antigen	  immobilization	  via	  amine	  coupling,	  D)	  Blocking	  of	  unreacted	  sites	  with	  ethanolamine,	  and	  E)	  Immobilization	  level	  (~9000	  RU).	  	  Abbreviations:	  EDC,	  1-­‐Ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)	  carbodiimide	  hydrochloride;	  NHS,	  N-­‐hydroxysuccinimide;	  RU,	  response	  units	  	  	   52	  Figure	  2.6.	  Biacore	  binding	  response	  and	  ELISA	  OD	  for	  blinded	  12C4	  monoclonal	  samples,	  untreated	  MS	  patient	  serum,	  and	  healthy	  control	  serum	  	  	  Abbreviations:	  MS,	  multiple	  sclerosis;	  OD,	  optical	  density;	  SD,	  standard	  deviation.	  	  	  	   	  	   53	  Both	  Biacore	  and	  ELISA	  found	  eight	  of	  the	  ten	  12C4	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  samples	  to	  be	  positive	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies,	  corresponding	  to	  antibody	  concentration	  between	  0.65	  and	  2.50	  μg/ml,	  and	  two	  were	  antibody-­‐negative	  (0	  μg/ml;	  Figure	  2.7).	  	  	  Figure	  2.7.	  12C4	  monoclonal	  antibody	  response	  by	  Biacore	  and	  ELISA	  	  	  Abbreviations:	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay;	  SD,	  standard	  deviation;	  RU,	  response	  units.	  	   When	  the	  Biacore	  binding	  responses	  and	  ELISA	  OD	  values	  were	  plotted	  against	  the	  12C4	  concentrations,	  strong	  correlations,	  R-­‐squared	  values	  of	  0.98	  and	  0.99,	  respectively,	  with	  actual	  monoclonal	  antibody	  concentrations	  were	  seen	  (Figure	  2.8).	  	   54	  Figure	  2.8.	  Correlation	  between	  12C4	  monoclonal	  antibody	  concentrations	  and	  a)	  Biacore	  response,	  b)	  and	  ELISA	  OD	  value	  	   	   	  	  Abbreviations:	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay;	  OD,	  optical	  density.	  	  Figure	  2.9.	  Anti-­‐Natalizumab	  antibody	  levels	  over	  time	  in	  one	  seropositive	  patient	  	  Abbreviations:	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay;	  RU,	  response	  unit;	  SD,	  standard	  deviation.	  	   Among	  the	  serial	  samples,	  4	  of	  5	  natalizumab-­‐treated	  and	  all	  placebo	  patients	  did	  not	  have	  detectable	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  by	  either	  method	  (Data	  not	  shown).	  One	  	   55	  patient	  was	  found	  to	  have	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  peaking	  by	  week	  24	  and	  seroconverting	  to	  antibody	  negative	  by	  week	  84	  (Figure	  2.9).	  To	  confirm	  positivity,	  the	  serial	  samples	  from	  this	  patient	  were	  pre-­‐incubated	  with	  excess	  natalizumab,	  resulting	  in	  decreased	  binding	  levels	  (Figure	  2.10).	  This	  patient’s	  seropositive	  samples,	  i.e.	  weeks	  12	  to	  64,	  were	  further	  used	  for	  the	  inhibition	  (affinity)	  studies	  detailed	  in	  section	  2.1.3.	  	  Figure	  2.10.	  Anti-­‐natalizumab	  antibody	  levels	  of	  serum	  pre-­‐incubated	  with	  excess	  natalizumab	  	  	  Abbreviations:	  HC,	  healthy	  control;	  NHPS,	  normal	  human	  pool	  serum;	  SD,	  standard	  deviation.	  	  	   56	  2.2.3 Inhibition	  (Affinity)	  Studies	  on	  the	  Biacore™ Immobilization	  of	  Natalizumab	  on	  the	  Biacore	  Sensor	  Chip	  Surface	  at	  Different	  Densities.	  Natalizumab	  was	  immobilized	  in	  three	  different	  flow	  cells	  at	  high	  (10269	  RU),	  medium	  (2051	  RU),	  and	  low	  (488	  RU)	  density. Inhibition	  studies	  on	  12C4	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  on	  Biacore.	  Figure	  2.11	  shows	  the	  percent	  inhibition	  curves	  for	  1	  μg/ml	  12C4	  monoclonal	  antibody	  pre-­‐incubated	  with	  different	  concentrations	  of	  natalizumab	  and	  Table	  2.1	  displays	  the	  accompanying	  IC50s.	  The	  calculated	  IC50	  values	  from	  the	  three	  surfaces	  were	  all	  about	  0.035	  μg/ml	  (or	  0.22nM),	  as	  demonstrated	  by	  the	  overlapping	  95%	  confidence	  intervals.	  	  	   57	  Figure	  2.11.	  Inhibition	  curves	  for	  12C4	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  Abbreviations:	  RU,	  response	  units. Inhibition	  studies	  on	  serial	  seropositive	  patient	  serum	  on	  Biacore.	  The	  inhibition	  curves	  for	  the	  serial	  seropositive	  serum	  incubated	  with	  different	  concentrations	  of	  natalizumab	  and	  were	  run	  over	  the	  high	  density	  surface	  are	  shown	  in	  Figure	  2.12.	  The	  inhibition	  curves	  for	  all	  three	  surfaces	  looked	  very	  similar.	  	   	  12C4 % Inhibition vs. Log [Pre-Incubated Natalizumab]-4 -3 -2 -1 002040608010012014010000 RU2000 RU500 RULog [Natalizumab] (µg/ml)% Inhibition	   58	  Table	  2.1.	  IC50	  values	  for	  12C4	  murine	  anti-­‐natalizumab	  monoclonal	  antibody	  run	  on	  different	  density	  surfaces	  	   Natalizumab	  Surface	  Density	  	   10000	  RU	   2000	  RU	   500	  RU	  IC50	  (μg/ml)	   0.03517	   0.03439	   0.03528	  IC50	  95%	  CI	  (μg/ml)	   0.02896	  to	  0.04272	   0.02082	  to	  0.05682	   0.02702	  to	  0.04605	  R²	   0.9837	   0.9268	   0.9348	  Abbreviations:	  CI,	  confidence	  interval;	  IC50,	  half	  maximal	  inhibitory	  concentration;	  RU,	  response	  units.	  	  Figure	  2.12.	  Inhibition	  curves	  for	  anti-­‐natalizumab	  seropositive	  serum	  on	  a	  high	  density	  surface	  	  	  	   Unlike	  the	  12C4	  monoclonal	  antibody,	  the	  IC50	  values	  of	  the	  serum	  samples	  were	  not	  generally	  consistent	  between	  the	  three	  different	  surfaces,	  though	  there	  is	  some	  overlap	  between	  confidence	  intervals	  within	  the	  same	  sample,	  i.e.	  treatment	  week	  (Table	  2.2).	  	  % Inhibition vs. Log [Pre-incubated Natalizumab]-4 -2 0 2-100102030405060708090100110120130Week 4Week 12Week 24Week 36Week 48Week 60Log [Natalizumab] (µg/ml)% Inhibition	   59	  Table	  2.2.	  IC50	  values	  for	  serial	  seropositive	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  serum	  from	  a	  single	  patient	  run	  on	  a	  different	  density	  surfaces	  	   	   Week	  4	   Week	  12	   Week	  24	   Week	  36	   Week	  48	   Week	  60	  High	  Density	  Surface	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  (10000	  RU)	  IC50	  (μg/ml)	   8.712	   5.726	   5.919	   1.781	   0.1181	   0.03036	  (95%	  CI)	   (7.713	  to	  9.841)	   (5.050	  to	  6.493)	   (4.830	  to	  7.252)	   (1.479	  to	  2.144)	   (0.1018	  to	  0.1370)	   (0.02501	  to	  0.03685)	  R²	   0.9993	   0.9972	   0.9912	   0.9928	   0.9947	   0.9959	  Medium	  	  	  	  	  	  	  	  	  Density	  Surface	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  (2000	  RU)	  IC50	  (μg/ml)	   6.855	   4.896	   5.597	   1.600	   0.09986	   0.01945	  (95%	  CI)	   (6.128	  to	  7.668)	   (4.389	  to	  5.461)	   (4.680	  to	  6.694)	   (1.318	  to	  1.943)	   (0.08775	  to	  0.1136)	   (0.0133	  to	  0.0285)	  R²	   0.9991	   0.9977	   0.9927	   0.9920	   0.9942	   0.9788	  Low	  Density	  Surface	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  (500	  RU)	  IC50	  (μg/ml)	   5.093	   4.284	   5.061	   1.494	   0.07705	   0.01704*	  (95%	  CI)	   (4.192	  to	  6.187)	   (3.896	  to	  4.710)	   (4.207	  to	  6.090)	   (1.210	  to	  1.845)	   (0.05490	  to	  0.1081)	   (0.0071	  to	  0.04107)	  R²	   0.9976	   0.9983	   0.9929	   0.9911	   0.9446	   0.8113	  *	  All	  points	  are	  “negative”	  Abbreviations:	  CI,	  confidence	  intervals;	  IC50,	  half	  maximal	  inhibitory	  concentration;	  RU,	  response	  units.	  	   60	  	   As	  the	  higher	  density	  surfaces	  may	  allow	  for	  rebinding	  and	  multiple	  binding	  events,	  and,	  may	  therefore	  be	  measuring	  avidity	  instead	  of	  affinity,	  the	  IC50s	  calculated	  from	  the	  low	  density	  surface	  are	  likely	  a	  more	  accurate	  measure	  of	  affinity.	  However,	  for	  the	  Week	  60	  serum	  sample	  where	  antibody	  binding	  was	  not	  detectable	  with	  the	  low	  density	  surface,	  the	  medium	  density	  surface	  should	  serve	  as	  the	  more	  accurate	  IC50	  measurement.	  Hence,	  taking	  the	  most	  accurate	  IC50	  values	  for	  each	  serum	  sample	  and	  plotting	  it	  with	  antibody	  levels	  (Figure	  2.13),	  it	  appears	  that	  IC50	  is	  stable	  up	  to	  24	  weeks,	  after	  which	  it	  declines	  with	  antibody	  levels,	  i.e.	  affinity	  increases	  after	  week	  24	  of	  treatment	  for	  this	  particular	  patient.	  	  	  	  Figure	  2.13.	  Change	  in	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Levels	  and	  IC50	  Over	  Time	  	  Abbreviations:	  IC50,	  half	  maximal	  inhibitory	  concentration.	  	  	  Increasing	  affinity	  with	  decreasing	  IC50	  	   61	  2.3 Conclusions	  Results	  of	  the	  Biacore	  assay	  for	  the	  detection	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  human	  serum	  concur	  with	  the	  widely	  used	  and	  robust	  bridging	  ELISA.	  Furthermore,	  we	  have	  shown	  it	  to	  be	  reproducible	  and	  specific.	  As	  well,	  since	  the	  Biacore	  machine	  itself	  is	  automated,	  it	  has	  the	  capability	  to	  run	  larger	  batches	  of	  samples	  and,	  unlike	  an	  ELISA,	  does	  not	  need	  to	  completely	  fill	  a	  microtiter	  plate	  with	  samples,	  thus,	  minimizing	  the	  reagent	  waste	  and	  cost	  per	  sample.	  	   The	  IC50	  of	  the	  12C4	  anti-­‐natalizumab	  murine	  monoclonal	  antibody	  suggests	  that	  it	  has	  a	  high	  affinity	  as	  mentioned	  reported	  in	  literature.	  The	  decreasing	  IC50,	  i.e.	  increasing	  affinity	  overtime,	  of	  the	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  in	  the	  natalizumab-­‐treated	  patient	  serum	  is	  consistent	  with	  the	  principle	  of	  affinity	  maturation,	  or	  the	  overall	  improvement	  of	  affinity	  over	  time.	  	   62	  CHAPTER	  3:	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies	  Neuromyelitis	  optica	  (NMO)	  is	  an	  autoimmune,	  inflammatory	  disorder	  that	  affects	  the	  optic	  nerves	  and	  spinal	  cord.	  NMO	  is	  usually	  a	  relapsing	  disease	  with	  progressive	  impairment	  due	  to	  the	  incomplete	  recovery,	  leaving	  residual	  deficits,	  after	  each	  relapse	  and	  is	  generally	  more	  aggressive	  than	  multiple	  sclerosis	  (MS)	  and	  has	  a	  worse	  prognosis.	  The	  presence	  of	  disease-­‐specific	  antibody,	  NMO-­‐IgG,	  in	  NMO	  patients	  but	  not	  in	  ones	  diagnosed	  with	  “classical”	  MS,	  and	  the	  identification	  of	  the	  target	  as	  aquaporin-­‐4	  (AQP4)	  distinguishes	  it	  from	  other	  neurological	  disorders	  such	  as	  multiple	  sclerosis	  (MS).184	  NMO-­‐IgG,	  or	  the	  anti-­‐AQP4	  antibody	  (AQP4-­‐Ab),	  is	  found	  in	  a	  significant	  proportion	  of	  patients	  with	  NMO	  and,	  to	  a	  lesser	  extent,	  its	  spectrum	  disorders	  (NMOSD),	  which	  include	  optic	  neuritis	  (ON)	  and	  transverse	  myelitis	  (TM).185	  Accurate	  and	  reliable	  AQP4-­‐Ab	  testing	  is	  critical	  not	  only	  to	  recognize	  NMO	  as	  a	  clinical	  entity	  but	  to	  also	  segregate	  it	  from	  optic	  neuropathies,	  MS	  and	  TM.185	  Commercial	  kits	  measuring	  AQP4-­‐Ab	  are	  widely	  available	  and	  utilized	  by	  some	  diagnostic	  laboratories	  but	  should	  be	  validated	  clinically.	  This	  chapter	  details	  an	  assay	  we	  have	  created	  in	  the	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratory	  to	  detect	  AQP4-­‐Ab	  utilizing	  a	  Biacore™	  platform.	  Also,	  a	  study	  comparing	  AQP4-­‐Ab	  in	  serum	  samples	  from	  patients	  with	  ON	  and/or	  TM	  using	  multiple	  laboratories	  and	  techniques,	  including	  several	  commercial	  kits,	  will	  be	  described.	  This	  study	  compares	  the	  sensitivity	  and	  specificities	  of	  the	  individual	  assays	  based	  on	  clinical	  diagnosis,	  as	  well	  as	  examine	  the	  concordance	  of	  multiple	  lab	  antibody	  testing.	  	  	   63	  3.1 Methods	  3.1.1 Detecting	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform Test	  Samples.	  The	  system	  was	  initially	  set	  up	  using	  the	  Kronus®	  Aquaporin-­‐4	  Autoantibody	  Enzyme-­‐linked	  Immunosorbent	  Assay	  (ELISA)	  Kit	  (Star,	  ID,	  USA)	  Calibrators	  undiluted.	  Sera	  that	  was	  tested	  by	  multiple	  labs	  using	  multiple	  assays	  (see	  Section	  3.1.3)	  that	  were	  found	  to	  be	  concurrently	  positive	  (n=10)	  or	  negative	  (n=22),	  and	  healthy	  controls	  (n=19)	  were	  also	  used. Immobilization	  of	  Aquaporin-­‐4	  on	  the	  Biacore	  Sensor	  Chip	  Surface.	  Through	  amine	  coupling,	  recombinant	  human	  AQP4	  protein	  (Kronus®)	  was	  covalently	  immobilized	  to	  a	  CM3	  sensor	  chip	  with	  a	  Biacore	  3000	  Biosensor	  (GE	  Healthcare	  Europe,	  Munich,	  Germany).	  The	  flow	  cells	  are	  activated	  with	  a	  1:1	  mixture	  of	  0.1M	  N-­‐hydroxysuccinimide	  (NHS)	  and	  0.4M	  1-­‐Ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)	  carbodiimide	  hydrochloride	  (EDC)	  at	  a	  flow	  rate	  of	  5	  μl/min	  for	  7	  minutes.	  AQP4	  was	  diluted	  to	  100	  μg/ml	  in	  sodium	  acetate	  (pH	  5.0)	  and	  injected	  in	  one	  flow	  cell	  for	  7	  minutes	  at	  5	  μl/min.	  Blocking	  of	  unreacted	  sites	  on	  the	  surface	  was	  achieved	  with	  1.0	  M	  ethanolamine	  hydrochloride-­‐NaOH	  pH	  8.5	  for	  7	  minutes	  at	  5	  μl/min.	  Aside	  from	  the	  flow	  cell	  with	  AQP4,	  another	  flow	  cell	  was	  immobilized	  with	  bovine	  serum	  albumin	  (BSA)	  while	  a	  blank	  flow	  cell	  was	  merely	  activated	  and	  blocked.	  Finally,	  the	  surfaces	  were	  conditioned	  by	  sequential	  	   64	  injections	  of	  10	  μl	  pulses	  of	  glycine-­‐HCl	  pH	  1.7,	  50	  mM	  NaOH,	  60	  mM	  H3PO4,	  and	  0.5%	  w/v	  SDS	  twice	  each	  at	  100	  μl/min. Detection	  of	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibodies.	  Antibody	  binding	  to	  the	  sensor	  chip	  surfaces	  were	  determined	  in	  undiluted	  ELISA	  kit	  calibrators,	  and	  serum	  samples	  diluted	  1:10	  in	  sample/running	  buffer	  HEPES-­‐buffered-­‐saline-­‐EP	  (HBS-­‐EP;	  0.01	  M	  HEPES	  pH	  7.4,	  0.15	  M	  NaCl,	  3	  mM	  EDTA,	  0.005%	  v/v	  surfactant	  P20)	  with	  0.02%	  (w/v)	  BSA.	  Samples	  were	  injected	  and	  run	  over	  the	  surface	  with	  immobilized	  AQP4	  and	  both	  reference	  surfaces	  at	  20	  μl/min	  for	  3	  minutes.	  A	  dissociation	  phase	  followed	  for	  2.5	  minutes	  where	  sample	  injection	  ceased	  and	  running	  buffer	  flowed	  over	  the	  sensor	  chip	  surfaces.	  Regeneration	  of	  the	  surface	  was	  performed	  by	  injecting	  10	  mM	  HCl	  for	  50	  seconds	  at	  20	  μl/min	  before	  injection	  of	  the	  next	  sample.	  All	  steps	  were	  performed	  at	  room	  temperature.	  Antibody	  binding	  levels	  were	  registered	  1	  minute	  before	  the	  end	  of	  the	  dissociation	  phase,	  and	  double-­‐referenced	  by	  subtracting	  out	  buffer	  blanks	  and	  binding	  to	  either	  the	  blank	  or	  BSA	  reference	  surface.	  	  3.1.2 Experience	  with	  commercial	  assays	  and	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  other	  laboratories Patients.	  151	  patients	  (103	  female,	  48	  male,	  median	  age	  of	  43)	  were	  recruited	  between	  February	  2009	  and	  September	  2011	  from	  the	  UBC	  Hospital	  MS	  Clinic.	  These	  patients	  were	  referred	  	   65	  for	  clinical	  suspicion	  of	  NMO	  and	  their	  sera	  tested	  in	  at	  least	  one	  of	  the	  laboratories	  mentioned	  below.	  As	  well,	  some	  patients	  had	  paraclinical	  test	  done,	  namely	  visual	  evoked	  potential	  (VEP)	  (n=66)	  or	  spinal	  cord	  MRI	  (n=50),	  to	  confirm	  26	  instances	  of	  TM	  and	  36	  of	  ON,	  respectively,	  among	  those	  who	  present	  clinically	  with	  these	  symptoms. Aquaporin-­‐4	  Antibody	  Testing.	  Testing	  for	  serum	  AQP4-­‐Ab	  in	  sera	  was	  performed	  at	  one	  or	  more	  of	  the	  following	  laboratories:	  1)	  the	  Mayo	  Clinic	  (Rochester,	  Minnesota),	  with	  immunohistochemistry	  (IHC)	  on	  mouse	  brain	  sections	  as	  described	  by	  Lennon	  et	  al.,113	  2)	  the	  Mitogen	  Advanced	  Diagnostics	  Laboratory	  (MADL;	  Calgary,	  AB,	  Canada),	  which	  used	  an	  indirect	  immunofluorescence	  (IIF)	  assay	  with	  AQP4-­‐transfected	  normal	  rat	  kidney	  epithelial	  cells	  (Euroimmun,	  Germany),	  and	  a	  commercial	  anti-­‐AQP4	  antibody	  ELISA	  kit	  (Kronus)	  3)	  the	  MS	  Therapeutics	  Department	  of	  Tohoku	  University	  Graduate	  School	  of	  Medicine	  (Sendai,	  Japan),	  which	  employed	  an	  IIF	  cell-­‐based	  assay	  (CBA)	  with	  AQP4-­‐transfected	  human	  embryonic	  kidney	  cells,186	  and	  4)	  the	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratories	  (University	  of	  British	  Columbia	  (UBC),	  Vancouver,	  BC,	  Canada),	  which	  used	  the	  Euroimmun	  IIF	  kit	  with	  AQP4-­‐transfected	  cells,	  and	  the	  Kronus	  ELISA.	  The	  sensitivities	  and	  specificities	  of	  all	  sites	  and	  techniques	  were	  calculated	  based	  on	  clinical	  diagnosis,	  when	  available:	  NMO	  and	  NMOSD,	  defined	  as	  patients	  with	  recurrent	  ON	  or	  TM,	  or	  fulfill	  the	  absolute	  2006	  Wingerchuk	  criteria117	  (events	  of	  optic	  neuritis	  and	  acute	  myelitis)	  and	  at	  least	  one	  the	  supportive	  criteria	  (brain	  MRA	  not	  meeting	  MS	  criteria	  or	  spinal	  cord	  MRI	  with	  contiguous	  T2-­‐weighted	  signal	  abnormality	  extending	  over	  three	  or	  more	  vertebral	  segments)	  excluding	  NMO-­‐IgG	  seropositivity,	  versus	  patients	  diagnosed	  	   66	  with	  MS	  or	  other	  diseases,	  which	  included	  acute	  disseminated	  encephalomyelitis,	  myeloradiculitis,	  Leber's	  hereditary	  optic	  neuropathy,	  sarcoid	  myelopathy,	  partial	  focal	  myelitis,	  chronic	  progressive	  myelopathy,	  sclerosis,	  pachymeningitis,	  retinal	  disease,	  and	  blindness.	  	  Nine	  samples	  with	  discrepant	  results	  among	  the	  labs	  were	  retested	  blindly	  by	  UBC,	  MADL,	  and	  Tohoku.	  We	  examined	  concordance	  of	  antibody	  results	  among	  the	  labs	  by	  plotting	  antibody	  status	  as	  a	  function	  of	  the	  number	  of	  testing	  sites	  where	  a	  sample	  had	  been	  tested. Clinical.	  Results	  were	  collated	  and	  percent	  AQP4-­‐Ab	  positive	  was	  calculated	  for	  combinations	  of	  ON	  and	  TM. Ethics.	  Ethics	  approval	  from	  the	  UBC	  clinical	  ethics	  board	  was	  obtained	  for	  use	  of	  patient	  sera	  and	  for	  chart	  review.	  	  	  3.2 Results	  3.2.1 Detecting	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  using	  a	  Biacore™	  Platform	  AQP4	  and	  BSA	  were	  immobilized	  at	  a	  level	  of	  ~4000	  response	  units	  (RU),	  specifically	  4162.4	  RU	  and	  4184.4	  RU,	  respectively	  (Figure	  3.1).	   	  	   67	  Figure	  3.1.	  Immobilization	  of	  Aquaporin-­‐4	  onto	  a	  CM3	  Sensor	  Chip	  	  	  	   	  	  	  Abbreviations:	  EDC,	  1-­‐Ethyl-­‐3-­‐(3-­‐dimethylaminopropyl)	  carbodiimide	  hydrochloride;	  NHS,	  N-­‐hydroxysuccinimide;	  RU,	  response	  units	   	  Figure	  3.1.	  A)	  Antigen	  preconcentration	  (where	  a	  small	  amount	  of	  the	  ligand	  is	  injected	  to	  test	  electrostatic	  attraction	  between	  the	  antigen	  and	  the	  surface),	  B)	  Surface	  activation	  with	  EDC/NHS,	  C)	  Antigen	  immobilization	  via	  amine	  coupling,	  D)	  Blocking	  of	  unreacted	  sites	  with	  ethanolamine,	  and	  E)	  Immobilization	  level.	  	  	   68	  	   Figure	  3.2	  shows	  that	  the	  ELISA	  kit	  controls	  and	  calibrators	  demonstrate	  a	  dose	  response	  as	  measured	  by	  the	  amount	  of	  bound	  antibody	  on	  the	  surface	  during	  dissociation	  phase,	  as	  well	  as	  the	  sensograms	  that	  shows	  real-­‐time	  data,	  with	  a	  BSA	  reference	  surface.	  In	  contrast,	  the	  AQP4-­‐Ab	  binding	  levels	  of	  the	  serum	  samples,	  when	  separated	  into	  seropositive,	  seronegative,	  and	  healthy	  control	  groups,	  were	  not	  statistically	  significant	  as	  measured	  by	  the	  Kruskall	  Wallis	  Test	  regardless	  of	  the	  reference	  surface	  type	  (p=0.5386	  and	  p=0.9271	  for	  the	  blank	  and	  BSA	  reference	  surfaces,	  respectively;	  Figure	  3.3).	  	  Figure	  3.2.	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  Binding	  Response	  of	  Kronus®	  ELISA	  Kit	  Controls	  as	  Measured	  by	  Biacore™	  	  	  	  	  	  	  	  A)	  AQP4-­‐Ab	  binding	  levels	  and	  B)	  sensogram	  of	  Kronus®	  ELISA	  Kit	  calibrators	  and	  controls	  Abbreviations:	  AQP4-­‐Ab,	  Anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody;	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay.	  	  	   	  A)	   	  B)	  	   69	  Figure	  3.3.	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  Binding	  Response	  of	  Seropositive,	  Seronegative,	  and	  Healthy	  Control	  Samples	  as	  Measured	  by	  Biacore™	  	  	  	  	  	  	  	  	  AQP4-­‐Ab	  binding	  levels	  for	  seronegative	  and	  seropositive	  serum	  samples,	  as	  measured	  by	  other	  immunoassays,	  as	  well	  as	  healthy	  controls,	  with	  a	  A)	  blank,	  and	  B)	  BSA	  reference	  surface.	  Abbreviations:	  AQP4-­‐Ab,	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody;	  BSA,	  bovine	  serum	  albumin.	  	  3.2.2 Experience	  with	  commercial	  assays	  and	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  other	  laboratories Anti-­‐AQP4	  Antibody	  Assays	  and	  Testing.	  	  Table	  3.1	  shows	  AQP4-­‐Ab	  results	  per	  lab	  assay	  for	  NMO	  and	  NMOSD	  versus	  MS	  and	  other	  neurological	  diseases.	  Of	  the	  total	  number	  of	  samples	  that	  each	  lab	  assayed	  with	  a	  specific	  technique,	  on	  average	  10.33	  (±2.3;	  standard	  deviation)	  percent	  were	  found	  to	  be	  AQP4-­‐Ab	  positive	  and	  have	  NMO	  or	  NMOSD	  while	  67.0	  (±7.1)	  percent	  were	  antibody	  negative	  and	  did	  not	  have	  NMO.	  The	  calculated	  sensitivities	  based	  on	  clinical	  diagnosis	  for	  Tohoku	  CBA	  (n=56),	  MADL	  ELISA	  (n=44),	  MADL	  IIF	  (n=45),	  the	  UBC	  ELISA	  (n=78),	  UBC	  IIF	  (n=92),	  and	  AQP4 4000RU Surface, BSA Reference SurfaceNegative Positive Healthy Control050100Response UnitsAQP4 4000RU Surface, Blank ReferenceNegative Positive Healthy Control-50050100Response Units	  A)	   	   	   	   	   	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  B)	  	   70	  Mayo	  IHC	  (n=101)	  were	  47%,	  33%,	  55%,	  50%,	  32%,	  and	  35%	  respectively,	  while	  their	  specificities	  were	  85%,	  100%,	  88%,	  88%	  93%	  and	  94%,	  respectively.	  Reporting	  antibody	  status	  as	  a	  function	  of	  the	  number	  of	  sites	  a	  sample	  was	  tested	  (Figure	  3.4),	  we	  see	  a	  mean	  (±	  standard	  deviation)	  of	  8.7	  (±5.9)	  percent	  AQP4-­‐Ab	  positive	  between	  all	  numbers	  of	  testing	  sites.	  Furthermore,	  it	  appeared	  that	  the	  proportion	  of	  discrepant	  results	  increased	  with	  the	  number	  of	  labs	  testing	  a	  single	  sample.	  	   	  	   71	  Table	  3.1.	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  antibody	  results	  per	  lab	  technique:	  NMO	  versus	  other	  neurological	  disorders	  	   MAYO	  IHC	   UBC	  ELISA	   UBC	  IIF	   MADL	  ELISA	   MADL	  IIF	   Tohoku	  CBA	  	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   +	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	   -­‐	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  n	  (%)	  NMO	  &	  NMOsd	   8	  (8)	   15	  (15)	   10	  (13)	   10	  (13)	   7	  (8)	   15	  (16)	   4	  (9)	   8	  (18)	   6	  (13)	   5	  (11)	   7	  (11)	   8	  (12)	  MS	  &	  OND	   5	  (5)	   73	  (72)	   7	  (9)	   51	  (65)	   5	  (5)	   65	  (71)	   0	  (0)	   32	  (73)	   4	  (9)	   30	  (67)	   6	  (9)	   35	  (54)	  Total	  (N)	   101	   78	   92	   44	   45	   56	  	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	   	  	  Sensitivity	   35%	   50%	   32%	   33%	   55%	   47%	  Specificity	   94%	   88%	   93%	   88%	   88%	   85%	  	  Abbreviations:	  CBA,	  cell-­‐based	  assay;	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay;	  IHC,	  immunohistochemistry;	  IIF,	  indirect	  immunofluorescence;	  MADL,	  Mitogen	  Advanced	  Diagnostics	  Lab;	  MS,	  multiple	  sclerosis;	  NMO,	  neuromyelitis	  optica;	  NMOsd,	  neuromyelitis	  optica	  spectrum	  disorder;	  OND,	  other	  neurological	  disorders;	  UBC,	  University	  of	  British	  Columbia	  	   72	  Figure	  3.4.	  Anti-­‐Aquaporin-­‐4	  Antibody	  results	  as	  per	  the	  number	  of	  testing	  sites	  	  There	  is	  a	  mean	  (±SD)	  of	  8.7	  (±5.9)	  percent	  AQP4-­‐Ab	  positive	  between	  all	  numbers	  of	  testing	  sites.	  Furthermore,	  we	  observe	  an	  increasing	  proportion	  of	  discrepant	  samples	  from	  12%	  to	  23%	  with	  increasing	  number	  of	  testing	  sites.	  Abbreviations:	  AQP4,	  aquaporin-­‐4;	  AQP4-­‐Ab,	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody;	  SD,	  standard	  deviation.	  	  	   73	  Results	  from	  re-­‐assaying	  the	  nine	  discrepant	  samples	  (Figure	  3.5)	  showed	  that	  Tohoku	  CBA	  identified	  7	  AQP4-­‐Ab	  positives,	  UBC	  ELISA	  and	  MADL	  IIF	  identified	  four,	  while	  UBC	  IIF	  was	  the	  least	  sensitive,	  identifying	  only	  one	  positive	  sample.	  Mayo	  did	  not	  participate	  in	  the	  re-­‐testing.	  Anecdotally,	  it	  was	  observed	  that	  the	  discrepant	  samples	  were	  “low	  positive”	  for	  AQP4-­‐Ab.	  	  	  Figure	  3.5.	  Results	  from	  re-­‐assaying	  discrepant	  samples	  	  	  Abbreviations:	  AQP4,	  aquaporin-­‐4;	  ELISA,	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay;	  IHC,	  immunohistochemistry;	  IIF,	  indirect	  immunofluorescence;	  MADL,	  Mitogen	  Advanced	  Diagnostics	  Laboratory;	  UBC,	  University	  of	  British	  Columbia	  9"samples""re*assayed"with"Tohoku"CBA,"MADL"IIF"and"UBC"IIF"and"ELISA"3"concordant*"AQP4*anHbody"results:!1!posi've!2!nega've!1/1!Mayo!IHC**!posi've!6"discrepant"AQP4*anHbody"results:"6!Tohoku!CBA!posi've!3!UBC!ELISA!posi've!3!MADL!IIF!posi've!0!UBC!IIF!posi've!2/5!Mayo!IHC**!posi've!* Agreeing results between UBC, Tohoku, and MADL assays ** Original results 	   74 Clinical.	  The	  frequency	  of	  AQP4-­‐Ab	  positive	  in	  the	  group	  with	  clinical	  TM	  without	  clinical	  ON	  was	  10.2%	  (5/49),	  which	  was	  nearly	  twice	  that	  of	  the	  group	  with	  clinical	  ON	  without	  clinical	  TM	  (5.6%;	  2/36).	  Patients	  with	  clinical	  ON	  and	  clinical	  TM,	  the	  group	  that	  would	  encompass	  those	  with	  complete	  NMO,	  had	  the	  highest	  rate	  of	  positivity	  with	  18.2%	  (12/66)	  AQP4-­‐Ab	  positive.	  	  	  3.3 Conclusions	  The	  Biacore	  assay	  for	  the	  detection	  of	  AQP4-­‐Ab	  demonstrated	  a	  dose	  response	  with	  the	  Kronus®	  ELISA	  kit	  control	  samples,	  but	  was	  not	  able	  to	  differentiate	  between	  healthy	  control	  and	  serum	  samples	  that	  have	  been	  found	  to	  be	  seropositive	  or	  seronegative	  by	  other	  immunoassays.	  It	  is	  possible	  that	  this	  assay	  was	  measuring	  a	  different	  antibody	  or	  phenomenon	  in	  the	  serum.	  	   The	  calculated	  specificities,	  and	  especially	  the	  sensitivities,	  for	  the	  different	  assays	  from	  different	  labs	  are	  low	  in	  comparison	  to	  those	  reported	  for	  the	  same	  techniques	  in	  the	  literature.	  It	  is	  possible	  that	  this	  is	  a	  product	  of	  small	  sample	  size	  leading	  to	  an	  unintended	  selection	  bias	  or	  more	  likely	  a	  result	  of	  the	  study’s	  approximate	  definitions	  and	  classification	  of	  the	  disease	  in	  the	  patients	  whose	  serum	  samples	  were	  used.	  Indeed	  during	  the	  span	  of	  this	  work	  clinical	  definitions	  changed	  and	  patients	  belonging	  to	  a	  different	  era	  of	  diagnosis	  from	  NMO	  to	  NMOSD	  were	  not	  reclassified	  backward.	  The	  repeat	  testing	  of	  discrepant	  samples	  as	  well	  as	  the	  increasing	  proportion	  of	  discrepant	  samples	  with	  increasing	  number	  of	  assays/labs	  testing	  a	  single	  samples	  shows	  	   75	  that	  there	  is	  much	  variation	  in	  antibody	  testing	  between	  labs,	  even	  with	  the	  use	  of	  commercial	  assays.	  These	  results	  may	  reflect	  the	  different	  sensitivities	  of	  the	  immunoassays	  as	  well	  as	  the	  varying	  forms	  of	  AQP4	  that	  is	  used	  in	  the	  different	  assays	  further	  demonstrating	  the	  lack	  of	  standardization	  and	  a	  gold	  standard	  in	  AQP4-­‐Ab	  testing.	  	   76	  CHAPTER	  4:	  General	  Discussion	  Antibodies,	  or	  immunoglobulins,	  are	  proteins	  produced	  by	  B	  lymphocytes	  as	  part	  of	  the	  body’s	  adaptive	  immune	  response.	  They	  circulate	  in	  the	  bloodstream	  and	  bind	  to	  substances,	  or	  antigens,	  that	  the	  body	  deems	  as	  ‘foreign’.	  Testing	  for	  antibodies	  to	  specific	  antigens	  in	  the	  blood	  has	  different	  purposes,	  including	  detecting	  the	  presence	  or	  past	  exposure	  to	  infectious	  agents,	  monitoring	  the	  body’s	  immune	  response	  to	  treatments	  or	  biological	  products,	  as	  well	  as	  diagnosing	  autoimmune	  disorders,	  certain	  cancers,	  and	  allergies.	  However,	  laboratory	  tests	  for	  antibodies	  are	  rarely	  perfect	  and	  many	  factors	  can	  modify	  results.	  Moreover,	  the	  presence	  of	  antibodies	  that	  are	  ‘diagnostic’	  does	  not	  always	  lead	  to	  the	  diagnosis	  of	  a	  disease	  but	  rather	  indicates	  that	  it	  is	  more	  likely	  that	  a	  patient	  has	  a	  certain	  disorder.	  As	  such,	  the	  usefulness	  of	  antibody	  testing,	  as	  well	  as	  the	  significance	  of	  an	  antibody	  itself,	  varies	  from	  one	  disorder	  to	  the	  next,	  and	  thus,	  must	  be	  assessed	  differently.	  This	  work	  has	  taken	  place	  at	  a	  time	  where	  the	  definition	  of	  NMO	  antigens,	  the	  diseases	  linked	  to	  them,	  and	  the	  assays	  used	  to	  mesure	  them	  were	  fluctuating.	  This	  chapter	  discusses	  the	  relevance	  and	  use	  of	  testing	  for	  antibodies	  to	  natalizumab	  and	  aquaporin-­‐4	  (AQP4)	  in	  multiple	  sclerosis	  (MS)	  and	  neuromyelitis	  optica	  (NMO),	  respectively.	  	  4.1 Significance	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  testing	  in	  multiple	  sclerosis	  Antibodies	  to	  different	  therapeutic	  biologicals	  vary	  between	  products	  and	  laboratory	  techniques	  used	  as	  seen	  with	  natalizumab	  with	  reports	  of	  frequency	  of	  positivity	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  varying	  between	  4.5	  and	  14.1%	  of	  patients.101,	  103,	  187	  As	  such,	  each	  	   77	  type	  of	  immunoassay	  has	  its	  limitations.	  Free	  circulating	  natalizumab	  and	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  patient	  serum	  will	  mutually	  interfere	  in	  their	  respective	  detection	  assay	  leading	  to	  the	  underestimation	  of	  quantities	  of	  either	  analyte.	  The	  formation	  of	  natalizumab/antibody	  immune	  complexes	  may	  prevent	  the	  quantification	  of	  either	  individual	  analyte	  in	  their	  respective	  detection	  assays.	  However,	  it	  is	  difficult	  to	  evaluate	  the	  level	  of	  interference	  because	  the	  positive	  control	  antibody,	  i.e.	  the	  12C4	  murine	  monoclonal	  anti-­‐natalizumab	  antibody,	  can	  be	  different	  from	  the	  polyclonal	  immune	  response	  with	  varying	  isotypes,	  affinities,	  and	  epitope	  specificities	  between	  patients	  and	  within	  the	  same	  patient	  over	  time.	  Specifically,	  the	  bridging	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  (ELISA)	  that	  is	  widely	  used	  to	  detect	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  can	  produce	  a	  false	  positive	  result	  in	  the	  presence	  of	  heterophilic	  antibodies,188	  non-­‐specific	  hinge	  antibodies,189	  or	  antibodies	  against	  carbohydrates.190	  Also,	  monovalent	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  would	  not	  be	  detected	  using	  a	  bridging	  ELISA.	  Biosensor	  technologies,	  such	  as	  the	  Biacore	  3000,	  have	  emerged	  in	  recent	  years	  and	  have	  been	  established	  as	  useful	  analytical	  tools	  to	  measure	  antibody-­‐antigen	  interactions.	  As	  we	  have	  developed	  de	  novo	  a	  new	  assay	  for	  the	  detection	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies,	  we	  have	  taken	  along	  its	  development	  to	  ensure	  its	  validation.	  These	  steps	  include	  optimization,	  defining	  positivity	  cutoff,	  and	  analyzing	  the	  assay	  repeatability,	  stability,	  reproducibility,	  and	  specificity	  for	  its	  intended	  target.	  Buffer	  only	  injection	  spread	  out	  intermittently	  throughout	  runs	  monitor	  the	  baseline	  stability,	  detecting	  incomplete	  removal	  of	  bound	  ligand	  on	  a	  surface	  after	  regeneration,	  or	  even	  the	  removal	  of	  immobilized	  analyte	  by	  the	  regeneration	  buffer.	  Repeatability	  is	  inspected	  during	  each	  assay	  by	  running	  multiples	  of	  the	  same	  sample	  spread	  out	  throughout	  a	  run	  to	  pick	  up	  	   78	  potential	  drift	  effects	  and	  large	  discrepancies	  between	  multiples.	  Furthermore,	  reproducibility	  was	  examined	  by	  comparing	  the	  same	  samples	  in	  multiple	  runs,	  as	  well	  as	  in	  comparison	  to	  the	  bridging	  ELISA.	  Positivity	  threshold	  was	  determined	  for	  each	  run	  by	  assaying	  healthy	  control	  samples	  and	  defining	  the	  cut-­‐off	  as	  the	  mean	  response	  of	  healthy	  controls	  plus	  three	  standard	  deviations.	  Lastly,	  specificity	  of	  the	  assay	  in	  detecting	  antibodies	  to	  natalizumab	  was	  confirmed	  with	  the	  in-­‐solution	  competition	  assay,	  i.e.	  pre-­‐incubating	  antibody	  positive	  serum	  samples	  with	  an	  excess	  amount	  of	  natalizumab.	  As	  such,	  we	  have	  determined	  that	  the	  results	  of	  our	  Biacore	  assay	  are	  equivalent	  to	  those	  of	  the	  bridging	  ELISA	  and	  shown	  to	  be	  specific	  and	  reliable.	  The	  automated	  biosensor	  machine	  also	  has	  the	  advantage	  of	  running	  a	  large	  number	  of	  samples	  and	  shorten	  experiments	  that	  would	  span	  days.	  The	  Biacore	  assay	  was	  further	  utilized	  to	  measure	  the	  relative	  antibody	  affinity	  (avidity)	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  serial	  serum	  samples.	  Traditionally,	  affinities	  can	  be	  estimated	  on	  Biacore	  from	  dissociation	  constants	  (koff),	  which	  can	  be	  obtained	  during	  the	  dissociation	  phase,	  on	  the	  principle	  that	  higher	  affinities	  produce	  slower	  dissociation	  rates.191	  Instead,	  the	  in-­‐solution	  competition	  assay	  was	  employed	  to	  calculate	  the	  concentration	  of	  natalizumab	  where	  the	  response	  (or	  binding)	  is	  reduced	  by	  half,	  i.e.	  the	  relative	  IC50.	  In	  this	  case,	  the	  higher	  the	  affinity,	  the	  lower	  the	  concentration	  of	  natalizumab	  needed	  to	  inhibit	  the	  response	  by	  50%	  and,	  therefore,	  a	  lower	  IC50	  value.	  Anti-­‐natalizumab	  antibodies	  associated	  with	  loss	  of	  treatment	  efficacy	  and	  infusion-­‐related	  hypersensitivity	  reactions,	  as	  well	  as	  decreased	  serum	  natalizumab	  concentration.	  Persistent	  antibody	  positivity	  has	  been	  reported	  by	  the	  Biogen	  Idec	  in	  double-­‐blind,	  placebo-­‐controlled	  randomized	  trials	  to	  be	  associated	  with	  reduced	  effectiveness	  as	  	   79	  measured	  by	  EDSS,	  relapse	  rate,	  and	  disease	  activity	  measured	  by	  magnetic	  resonance	  imaging	  (MRI)	  when	  comparing	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  positive	  patients	  to	  those	  who	  are	  antibody	  negative.101	  Increased	  allergic	  responses	  have	  also	  been	  reported.	  In	  transiently	  positive	  patients,	  it	  appears	  that	  the	  presence	  of	  antibodies	  reduces	  the	  full	  therapeutic	  response	  of	  natalizumab,	  which	  is	  restored	  if	  patients	  seroconvert	  to	  antibody	  negative	  levels.	  There	  is	  a	  similar	  affect	  seen	  in	  rheumatoid	  arthritis	  with	  the	  therapeutic	  monoclonal	  antibody	  infliximab	  where	  antibodies	  against	  the	  drug	  has	  been	  associated	  with	  the	  reduction	  in	  treatment	  efficacy	  and	  increase	  in	  infusion-­‐related	  reactions.192,	  193	  As	  well,	  persistently	  high	  titers	  of	  neutralizing	  antibodies	  (NAbs)	  to	  interferon-­‐β	  (IFN-­‐β)	  have	  been	  known	  to	  significantly	  decrease	  beneficial	  effects	  of	  the	  treatment	  as	  measured	  by	  clinical	  and	  MRI	  outcomes.191,	  194-­‐197	  However,	  unlike	  antibodies	  to	  natalizumab,	  the	  presence	  of	  NAbs	  to	  IFN-­‐β	  does	  not	  appear	  to	  be	  linked	  with	  significant	  alterations	  in	  drug	  safety,	  such	  as	  an	  increase	  in	  injection-­‐related	  hypersensitivity	  events.	  It	  is	  not	  fully	  understood	  why	  some	  patients	  develop	  transient	  antibodies,	  i.e.	  ones	  that	  are	  no	  longer	  detectable	  after	  a	  certain	  amount	  of	  time,	  and	  why	  some	  patients,	  mainly	  those	  with	  high	  antibody	  titers,	  have	  antibodies	  that	  persist.	  It	  is	  speculated	  that	  in	  patients	  who	  have	  a	  transient	  antibody	  response	  to	  natalizumab,	  the	  lack	  of	  antibody	  titers	  high	  enough	  to	  cause	  loss	  of	  treatment	  efficacy	  may	  be	  due	  to	  tolerance	  rather	  than	  a	  failure	  of	  the	  immune	  system.	  Perhaps,	  a	  combination	  of	  low	  affinity	  antibodies	  and	  low	  antibody	  titer	  is	  insufficient	  to	  significantly	  decrease	  the	  serum	  natalizumab	  concentration	  to	  levels	  that	  will	  lead	  to	  a	  loss	  of	  clinical	  efficacy.	  This	  would	  also	  explain	  why	  the	  bridging	  ELISA	  would	  not	  be	  able	  to	  detect	  antibodies	  after	  a	  certain	  point	  in	  treatment	  as	  the	  patient	  seemingly	  seroconverts	  to	  antibody	  negative	  when	  it	  is	  actually	  an	  effect	  of	  the	  	   80	  immunoassay	  not	  being	  sensitive	  enough	  to	  pick	  up	  a	  small	  amount	  of	  low	  affinity	  antibodies.	  In	  our	  one	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  positive	  patient	  with	  serial	  samples	  studied	  in	  section	  2.1.3,	  however,	  we	  see	  a	  trend	  of	  increasing	  relative	  affinity	  with	  decreasing	  titer	  over	  time,	  suggesting	  that	  the	  seroconvertion	  to	  antibody	  negative	  between	  weeks	  60	  and	  84	  is	  a	  true	  event,	  and	  not	  an	  artifact	  from	  using	  the	  Biacore	  assay,	  further	  stressing	  the	  principle	  of	  immune	  tolerance.	  	  Cases	  in	  the	  literature	  on	  anti-­‐natalizumab	  positive	  patients	  indicate	  that	  antibodies	  develop	  early	  following	  the	  initiation	  of	  treatment,	  no	  later	  than	  week	  24.101,	  103,	  187,	  198	  This	  is	  consistent	  with	  our	  single	  seropositive	  patient	  with	  serial	  samples	  spanning	  7	  years	  where	  we	  see	  the	  appearance	  of	  antibodies	  between	  weeks	  0	  and	  4.	  Therefore,	  antibody	  testing	  may	  not	  be	  useful	  after	  24	  weeks	  of	  treatment	  unless	  there	  are	  delayed	  adverse	  reactions.	  Lundkvist	  et	  al.	  also	  found	  a	  significant	  difference	  in	  anti-­‐natalizumab	  antibody	  titers	  by	  month	  3	  of	  initiation	  of	  treatment	  between	  patients	  that	  had	  persistent	  antibodies	  and	  those	  who	  showed	  a	  transient	  antibody	  response.199	  They	  further	  claimed	  that	  antibody	  titer	  at	  this	  point	  might	  predict	  which	  patients	  will	  have	  persistent	  antibodies	  and,	  therefore,	  should	  discontinue	  natalizumab	  treatment.	  	   Altogether,	  testing	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  is	  significant	  when	  making	  the	  decision	  to	  discontinue	  a	  treatment	  with	  some	  potentially	  serious	  adverse	  effects	  that	  may	  no	  longer	  provide	  any	  benefits	  clinically.	  However,	  it	  is	  important	  to	  distinguish	  between	  patients	  with	  a	  transient	  antibody	  response	  from	  those	  ones	  who	  develop	  persistent	  antibodies	  to	  natalizumab	  as	  transiently	  positive	  patients	  may	  still	  benefit	  from	  natalizumab	  treatment	  and	  may	  have	  a	  delayed	  response	  to	  treatment.	  Patients	  who	  develop	  persistent	  anti-­‐natalizumab	  antibodies,	  on	  the	  other	  hand,	  have	  been	  shown	  to	  	   81	  have	  increased	  infusion-­‐related	  reactions	  with	  significantly	  reduced	  treatment	  efficacy	  and	  are,	  therefore,	  recommended	  to	  discontinue	  treatment.	  Furthermore,	  antibody	  testing	  should	  be	  done	  before	  24	  weeks	  of	  natalizumab	  treatment	  unless	  there	  are	  adverse	  effects	  or	  late	  hypersensitivity	  reactions.	  While	  our	  data	  generated	  using	  the	  Biacore	  assay	  indicated	  that	  the	  transiently	  positive	  patient	  truly	  seroconverted	  to	  antibody	  negative,	  further	  affinity	  studies	  on	  seropositive	  patients	  need	  to	  be	  done	  to	  investigate	  differences	  and	  possible	  predictive	  ability	  of	  antibody	  affinity	  in	  persistent	  and	  transient	  antibody	  responses.	  	  4.2 Significance	  of	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  testing	  in	  neuromyelitis	  optica	  Antibodies	  to	  aquaporin-­‐4	  (AQP4-­‐Ab)	  as	  measured	  by	  immunoassays	  that	  utilize	  the	  aquaporin-­‐4	  protein	  as	  the	  target	  antigen,	  or	  NMO-­‐IgG	  as	  it	  called	  specifically	  in	  relation	  to	  tissue-­‐based	  immunohistochemistry,	  constitute	  a	  sensitive	  and	  highly	  specific	  serum	  biomarker	  for	  neuromyelitis	  optica	  (NMO).	  A	  seropositive	  status	  has	  significant	  prognostic	  and	  therapeutic	  implications	  in	  patients	  with	  the	  limited	  forms	  of	  NMO,	  i.e.	  the	  NMO	  spectrum	  disorders	  (NMOSD),	  specifically	  optic	  neuritis	  (ON)	  and	  longitudinally	  extensive	  transverse	  myelitis	  (TM).	  There	  is	  growing	  evidence	  that	  AQP4-­‐Ab	  titers	  may	  reflect	  disease	  activity	  as	  clinical	  attacks	  have	  been	  shown	  to	  be	  preceded	  by	  a	  rise	  in	  AQP4-­‐Ab	  levels	  but	  not	  of	  other	  autoantibodies.149	  Moreover,	  a	  decrease	  in	  serum	  AQP4-­‐Ab	  concentration	  has	  been	  noted	  in	  response	  to	  various	  immunosuppressive	  therapies,149,	  151,	  200	  as	  well	  as	  following	  plasma	  exchange.152	  However,	  there	  is	  no	  threshold	  value	  of	  AQP4-­‐Ab	  levels	  for	  triggering	  clinical	  relapse	  and	  not	  all	  increases	  in	  AQP4-­‐Ab	  levels	  lead	  to	  relapse.	  This	  suggests	  that	  on	  top	  of	  the	  AQP4-­‐Ab,	  other	  factors,	  such	  as	  blood-­‐brain	  barrier	  	   82	  damage,	  cytokine	  profiles,	  or	  T-­‐cell	  activation,	  likely	  play	  important	  roles	  in	  the	  disease	  process	  of	  NMO.	  	   According	  to	  the	  2006	  Wingerchuk	  criteria,	  seropositivity	  for	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  is	  not	  required	  for	  a	  diagnosis	  of	  NMO.	  However,	  it	  appears	  that	  autoantibodies	  also	  play	  a	  role	  in	  “seronegative”	  NMO	  as	  it	  was	  demonstrated	  that	  serum	  from	  seronegative	  NMO	  patients	  induced	  complement-­‐dependent	  astrocyte	  death	  in	  vitro.201	  As	  well,	  some	  seronegative	  patients	  have	  shown	  to	  improve	  after	  plasma	  exchange.202	  It	  is	  unknown	  if	  “seronegative”	  NMO	  is	  associated	  with	  low	  affinity	  and/or	  low	  titer	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  not	  detectable	  with	  currently	  available	  immunoassays,	  or	  the	  presence	  of	  a	  yet	  unidentified	  antibody.	  Antibodies	  to	  myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein	  (MOG)	  as	  well	  as	  paraneoplastic	  antibodies,	  such	  as	  CV2/CMRP5,	  have	  been	  found	  in	  a	  small	  subset	  of	  seronegative	  patients	  with	  NMOSD	  and	  NMO-­‐like	  disease.158,	  203-­‐208	  Additionally,	  in	  myasthenia	  gravis,	  an	  autoimmune	  disease	  with	  proven	  humoral	  pathogenesis,	  it	  took	  nearly	  25	  years	  to	  develop	  a	  more	  sensitive	  immunoassay.	  This	  was	  demonstrated	  in	  a	  study	  that	  detected	  low	  affinity	  acetylcholine	  receptor	  antibodies	  in	  the	  serum	  of	  25	  out	  of	  38	  patients	  that	  were	  previously	  labeled	  as	  “seronegative”.209	  	   AQP4-­‐Ab	  seropositivity	  has	  been	  found	  to	  be	  more	  frequent	  in	  patients	  that	  present	  with	  either	  TM	  or	  ON	  at	  onset	  than	  those	  that	  present	  with	  TM	  and	  ON	  simultaneously	  at	  onset.111	  In	  this	  study,	  however,	  we	  see	  evidence	  that	  patients	  with	  both	  clinical	  ON	  and	  clinical	  TM	  have	  a	  higher	  frequency	  of	  AQP4-­‐Ab	  than	  patients	  with	  only	  clinical	  ON	  or	  clinical	  TM.	  This	  is	  consistent	  with	  the	  literature	  showing	  that	  AQP4-­‐Ab	  seropositivity	  is	  associated	  with	  a	  poorer	  prognosis	  and	  predicts	  subsequent	  relapse	  and	  development	  of	  NMO.117,	  147,	  210	  Limitations	  of	  this	  study	  include	  pooling	  results	  from	  patients	  with	  	   83	  recurrent	  and	  single	  episode	  ON	  and/or	  TM,	  as	  it	  has	  been	  shown	  that	  patients	  with	  a	  single	  episode	  of	  longitudinally	  extensive	  TM	  have	  a	  30	  –	  40%	  less	  frequent	  AQP4-­‐Ab	  compared	  to	  recurrent	  TM	  patients.113	  	  There	  are	  approximately	  60	  published	  studies	  to	  date	  that	  report	  the	  frequency	  of	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  in	  NMO.154	  The	  accuracy	  of	  assays	  for	  NMO-­‐IgG/AQP4-­‐Ab	  are	  gauged	  by	  their	  sensitivities	  and	  specificities.	  These	  two	  measures	  are	  highly	  dependent	  on	  distinguishing	  NMO	  and	  NMOSD	  patients	  from	  those	  without	  the	  disease.	  As	  NMO	  sample	  sizes	  within	  studies	  are	  generally	  small,	  misdiagnoses	  can	  greatly	  affect	  sensitivity	  and	  specificity.	  A	  North	  American	  study	  reported	  a	  false	  diagnosis	  rate	  of	  roughly	  30%	  which	  authors	  attributed	  to	  the	  lack	  of	  awareness	  of	  NMO	  as	  it	  is	  a	  rare	  disease,	  and	  the	  partial	  overlap	  of	  clinical	  and	  radiological	  features	  of	  NMO	  and	  MS,	  as	  well	  as	  commonality	  in	  diagnostic	  criteria	  with	  MS.211	  For	  example,	  a	  study	  that	  used	  quantitative	  assays	  for	  AQP4-­‐Ab	  found	  that	  17	  of	  26	  seropositive	  patients	  that	  were	  initially	  diagnosed	  with	  MS	  fulfill	  both	  the	  McDonald	  criteria	  for	  MS	  and	  the	  2006	  Wingerchuk	  criteria	  for	  NMO.212	  With	  all	  this	  in	  mind,	  the	  criteria	  for	  NMO	  and	  NMOSD	  for	  our	  study	  described	  in	  section	  can	  be	  considered	  as	  too	  liberal	  leading	  to	  the	  possibility	  of	  an	  overestimate	  of	  false	  negative	  results.	  Consequently,	  this	  could	  have	  lowered	  the	  calculated	  sensitivities.	  Furthermore,	  variance	  in	  the	  calculated	  sensitivities	  between	  laboratories	  and	  methods	  may	  reflect	  not	  only	  the	  differences	  among	  the	  varying	  immunoassays	  but	  also	  an	  unintentional	  selection	  bias	  due	  to	  the	  small	  sample	  size	  of	  the	  NMO	  and	  NMOSD	  group.	  As	  well,	  like	  with	  other	  retrospective	  studies,	  accurate	  record	  keeping	  is	  assumed	  when	  in	  reality,	  the	  information	  gathered	  from	  chart	  review	  can	  vary	  in	  accuracy	  and	  the	  amount	  of	  detail	  as	  the	  information	  was	  not	  collected	  for	  the	  purpose	  of	  this	  study	  specifically	  and	  record	  keeping	  	   84	  was	  performed	  by	  different	  neurologists.	  Another	  limitation	  is	  that	  not	  all	  patients	  had	  a	  brain	  and/or	  spinal	  cord	  MRI	  done	  resulting	  in	  missing	  data.	  Furthermore,	  it	  is	  unknown	  if	  serum	  samples	  were	  taken	  during	  a	  relapse	  or	  not,	  or	  the	  type	  of	  treatment	  regimen	  patients	  had,	  e.g.	  immunosuppressive	  drugs	  or	  plasma	  exchange,	  during	  blood	  draw.	  	  	  	   The	  repeat	  testing	  of	  discrepant	  samples	  revealed	  that	  not	  only	  the	  in-­‐house	  cell-­‐based	  indirect	  immunofluorescence	  (IIF)	  assay	  from	  Tohoku	  appeared	  to	  be	  most	  sensitive,	  but	  that	  results	  from	  commercial	  assays	  varied	  between	  labs.	  As	  it	  was	  the	  Euroimmun	  IIF	  kit	  with	  AQP4-­‐transfected	  cells	  that	  was	  used	  to	  retest	  the	  samples	  at	  the	  Mitogen	  Advanced	  Diagnostics	  Laboratory	  and	  at	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  Neuro-­‐Immunology	  Laboratory,	  the	  dissimilarity	  in	  the	  outcome	  could	  be	  due	  to	  different	  kit	  (and,	  therefore,	  transfected	  cell	  line)	  lots	  or	  could	  be	  observer-­‐dependent,	  i.e.	  subjective,	  interpretation	  of	  results.	  Regardless,	  with	  the	  increase	  in	  percentage	  of	  discrepant	  results	  with	  increasing	  number	  of	  assays	  and/or	  laboratories	  to	  test	  a	  single	  sample	  (Fig.	  3.4),	  it	  is	  clear	  that	  there	  is	  no	  standard	  assay	  for	  AQP4-­‐Ab/NMO-­‐IgG	  and	  that	  there	  is	  much	  variation	  in	  AQP4-­‐Ab	  testing	  between	  labs	  and	  available	  immunoassays.	  Moreover,	  the	  current	  techniques	  used	  for	  the	  detection	  of	  AQP4-­‐Ab	  still	  leave	  much	  to	  be	  desired	  and,	  therefore,	  assay	  improvement	  is	  still	  necessary.	  	   The	  Biacore	  assay	  for	  AQP4-­‐Ab	  was	  not	  able	  to	  distinguish	  between	  healthy	  controls,	  seropositive	  patients,	  and	  seronegative	  patients.	  Though	  the	  assay	  was	  successful	  in	  demonstrating	  a	  dose	  response	  with	  the	  Kronus®	  ELISA	  kit	  controls	  and	  calibrators,	  there	  are	  other	  factors	  affecting	  AQP4-­‐Ab	  binding	  with	  serum	  samples,	  and	  perhaps,	  another	  antibody	  or	  phenomenon	  is	  being	  measured.	  Generally,	  protein-­‐based	  assays	  for	  AQP4-­‐Ab	  have	  been	  reported	  to	  have	  lower	  sensitivity	  than	  cell-­‐based	  assays.154,	  213	  	   85	  Ultimately,	  it	  is	  difficult	  to	  directly	  compare	  any	  one	  assay	  for	  AQP4-­‐Ab	  to	  another	  due	  to	  the	  use	  of	  different	  sources	  and	  applications	  of	  the	  AQP4	  protein.	  This	  is	  further	  complicated	  by	  diagnostic	  criteria,	  which	  were	  fluctuating	  during	  the	  work	  of	  this	  thesis.	  Emerging	  discoveries	  of	  other	  autoantibodies	  associated	  with	  NMO	  may,	  in	  the	  future,	  downplay	  the	  diagnostic	  relevance	  of	  AQP4-­‐Ab/NMO-­‐IgG.	  However,	  at	  present,	  AQP4-­‐Ab	  remains	  the	  most	  specific	  and	  sensitive	  serum	  biomarker	  for	  NMO	  and	  NMOSD.	  With	  the	  overlapping	  features	  of	  MS	  and	  NMO,	  as	  well	  as	  the	  knowledge	  that	  some	  treatments	  for	  MS,	  such	  as	  interferon	  beta	  and	  natalizumab,	  have	  been	  found	  to	  be	  harmful	  to	  NMO	  patients,	  proper	  diagnosis	  and	  especially	  reliable	  and	  highly	  accurate	  AQP4-­‐Ab	  testing	  is	  critical.	  With	  our	  experience	  with	  antibody	  testing	  at	  multiple	  laboratories,	  as	  well	  as	  literature	  on	  anti-­‐AQP4antibody	  immunoassays,	  there	  is	  a	  need	  for	  a	  standardized	  assay	  that	  can	  be	  implemented	  in	  various	  diagnostic	  labs.	  Improvement	  of	  current	  immunoassays	  and	  the	  development	  of	  better,	  more	  sensitive	  techniques	  should	  remain	  an	  important	  goal,	  as	  well	  as	  the	  formulation	  of	  diagnostic	  criteria	  that	  better	  distinguishes	  between	  MS	  and	  NMO.	   86	  CHAPTER	  5:	  General	  Conclusions	  	   As	  an	  anti-­‐biological	  antibody,	  testing	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  multiple	  sclerosis	  (MS)	  is	  significant	  when	  making	  the	  decision	  to	  discontinue	  treatment	  as	  antibody	  persistency	  has	  been	  shown	  to	  be	  associated	  with	  increased	  infusion-­‐related	  reactions	  and	  significantly	  reduced	  treatment	  efficacy.	  It	  is	  recommended	  that	  antibody	  testing	  be	  done	  before	  24	  weeks	  of	  natalizumab	  treatment	  as	  the	  majority	  of	  antibody	  positive	  cases	  occur	  before	  this	  point.	  However,	  antibody	  testing	  after	  24	  weeks	  of	  treatment	  is	  warranted	  in	  the	  event	  of	  late	  hypersensitivity	  reactions	  or	  adverse	  effects.	  As	  well,	  differentiating	  between	  patients	  with	  a	  transient	  antibody	  response	  with	  ones	  who	  develop	  antibodies	  persistently	  to	  natalizumab	  is	  significant	  as	  transiently	  positive	  patients	  may	  still	  benefit	  from	  natalizumab	  treatment	  and	  may	  have	  a	  delayed	  response	  to	  treatment	  and,	  therefore,	  should	  not	  discontinue	  treatment.	  Thus,	  antibody	  testing	  should	  be	  done	  multiple	  times	  during	  the	  course	  of	  natalizumab	  treatment.	  The	  Biacore	  assay	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  is	  replicable	  and,	  with	  its	  automation,	  is	  able	  to	  handle	  large	  number	  of	  samples.	  As	  well,	  the	  Biacore	  is	  a	  suitable	  platform	  to	  further	  investigate	  the	  possible	  predictive	  ability	  of	  antibody	  affinity	  to	  differentiate	  persistent	  and	  transient	  antibody	  responses.	  	   The	  pathological	  autoantibody,	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  (AQP4-­‐Ab),	  is	  currently	  the	  most	  specific	  and	  sensitive	  serum	  biomarker	  for	  neuromyelitis	  optica	  (NMO)	  and	  its	  spectrum	  disorders	  despite	  recent	  discoveries	  of	  other	  autoantibodies	  associated	  with	  the	  disease.	  Though	  the	  overlapping	  features	  of	  NMO	  and	  MS	  make	  it	  difficult	  to	  differentiate	  between	  the	  two	  diseases,	  proper	  diagnosis	  is	  important	  due	  to	  significantly	  different	  treatment	  regimens.	  Therefore,	  reliable	  and	  highly	  accurate	  AQP4-­‐Ab	  testing	  is	  critical	  to	  	   87	  aid	  in	  the	  process	  of	  diagnosis.	  Current	  literature	  and	  our	  experience	  with	  AQP4-­‐Ab	  testing	  at	  multiple	  laboratories	  and	  with	  various	  immunoassays,	  including	  two	  commercially	  available	  kits,	  have	  demonstrated	  the	  need	  for	  a	  standardized	  assay	  that	  can	  be	  implemented	  in	  different	  diagnostic	  laboratories.	  Though	  the	  formulation	  of	  diagnostic	  criteria	  that	  better	  discriminates	  between	  MS	  and	  NMO	  is	  a	  current	  and	  important	  venture	  among	  researchers	  and	  clinicians,	  the	  improvement	  of	  current	  immunoassays	  and	  the	  development	  of	  better,	  more	  sensitive	  techniques	  should	  also	  continue	  to	  be	  a	  main	  effort.	   88	  References	  1.	   Calabresi	  PA.	  Diagnosis	  and	  management	  of	  multiple	  sclerosis.	  American	  family	  physician	  2004;70:1935-­‐1944.	  2.	   Olek	  M.	  Epidemiology,	  risk	  factors	  and	  clinical	  features	  of	  multiple	  sclerosis	  in	  adults.	  UpToDate,	  Gonzalez-­‐Scarano,	  F	  (Ed),	  UpToDate,	  Waltham,	  MA	  2010.	  3.	   Weinshenker	  BG.	  Epidemiology	  of	  multiple	  sclerosis.	  Neurologic	  clinics	  1996;14:291-­‐308.	  4.	   Lumsden	  C.	  The	  immunogenesis	  of	  the	  multiple	  sclerosis	  plaque.	  Brain	  research	  1971;28:365-­‐390.	  5.	   Cree	  BAC.	  Multiple	  sclerosis.	  In:	  Brust	  JCM,	  ed.	  Current	  Diagnosis	  and	  Treatment	  in	  Neurology.	  New	  York:	  Lange	  Medical	  Books/McGraw-­‐Hill	  Medical,	  2007.	  6.	   Hauser	  SLG,	  D.	  S.	  Multiple	  sclerosis	  and	  other	  demyelinating	  diseases.	  In:	  Fauci	  ASB,	  E.;	  Kasper,	  D.	  L.;	  Hauser,	  S.	  L.,	  ed.	  Harrison's	  Principles	  of	  Internal	  Medicine,	  17th	  ed.	  New	  York:	  McGraw-­‐Hill	  Medical,	  2008:	  2611-­‐2621.	  7.	   Barkhof	  F,	  Filippi	  M,	  Miller	  DH,	  et	  al.	  Comparison	  of	  MRI	  criteria	  at	  first	  presentation	  to	  predict	  conversion	  to	  clinically	  definite	  multiple	  sclerosis.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  1997;120:2059-­‐2069.	  8.	   Fazekas	  F,	  Offenbacher	  H,	  Fuchs	  S,	  et	  al.	  Criteria	  for	  an	  increased	  specificity	  of	  MRI	  interpretation	  in	  elderly	  subjects	  with	  suspected	  multiple	  sclerosis.	  Neurology	  1988;38:1822-­‐1822.	  9.	   McDonald	  WI,	  Compston	  A,	  Edan	  G,	  et	  al.	  Recommended	  diagnostic	  criteria	  for	  multiple	  sclerosis:	  guidelines	  from	  the	  International	  Panel	  on	  the	  diagnosis	  of	  multiple	  sclerosis.	  Annals	  of	  neurology	  2001;50:121-­‐127.	  10.	   Polman	  CH,	  Reingold	  SC,	  Edan	  G,	  et	  al.	  Diagnostic	  criteria	  for	  multiple	  sclerosis:	  2005	  revisions	  to	  the	  "McDonald	  Criteria".	  Annals	  of	  neurology	  2005;58:840-­‐846.	  11.	   Thompson	  A,	  Montalban	  X,	  Barkhof	  F,	  et	  al.	  Diagnostic	  criteria	  for	  primary	  progressive	  multiple	  sclerosis:	  a	  position	  paper.	  Annals	  of	  neurology	  2000;47:831-­‐835.	  	   89	  12.	   Tintoré	  M,	  Rovira	  A,	  Martínez	  MJ,	  et	  al.	  Isolated	  demyelinating	  syndromes:	  comparison	  of	  different	  MR	  imaging	  criteria	  to	  predict	  conversion	  to	  clinically	  definite	  multiple	  sclerosis.	  American	  Journal	  of	  Neuroradiology	  2000;21:702-­‐706.	  13.	   Paty	  D,	  Oger	  J,	  Kastrukoff	  L,	  et	  al.	  MRI	  in	  the	  diagnosis	  of	  MS	  A	  prospective	  study	  with	  comparison	  of	  clinical	  evaluation,	  evoked	  potentials,	  oligoclonal	  banding,	  and	  CT.	  Neurology	  1988;38:180-­‐180.	  14.	   Arnold	  DL,	  Matthews	  P.	  MRI	  in	  the	  diagnosis	  and	  management	  of	  multiple	  sclerosis.	  Neurology	  2002;58:S23-­‐S31.	  15.	   Chiappa	  KH.	  Pattern‐Shift	  Visual,	  Brainstem	  Auditory	  and	  Short‐Latency	  Somatosensory	  Evoked	  Potentials	  in	  Multiple	  Sclerosis.	  Annals	  of	  the	  New	  York	  Academy	  of	  Sciences	  1984;436:315-­‐326.	  16.	   Cole	  S,	  Beck	  R,	  Moke	  P,	  Kaufman	  D,	  Tourtellotte	  W.	  The	  predictive	  value	  of	  CSF	  oligoclonal	  banding	  for	  MS	  5	  years	  after	  optic	  neuritis.	  Neurology	  1998;51:885-­‐887.	  17.	   Lassmann	  H,	  Brück	  W,	  Lucchinetti	  CF.	  The	  Immunopathology	  of	  Multiple	  Sclerosis:	  An	  Overview.	  Brain	  Pathology	  2007;17:210-­‐218.	  18.	   Pirko	  I,	  Lucchinetti	  CF,	  Sriram	  S,	  Bakshi	  R.	  Gray	  matter	  involvement	  in	  multiple	  sclerosis.	  Neurology	  2007;68:634-­‐642.	  19.	   Lassmann	  H,	  Raine	  C,	  Antel	  J,	  Prineas	  J.	  Immunopathology	  of	  multiple	  sclerosis:	  report	  on	  an	  international	  meeting	  held	  at	  the	  Institute	  of	  Neurology	  of	  the	  University	  of	  Vienna.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  1998;86:213-­‐217.	  20.	   Prineas	  JW,	  McDonald	  W,	  Franklin	  R.	  Demyelinating	  diseases.	  Greenfield’s	  neuropathology	  1997;2:471-­‐550.	  21.	   Brück	  W,	  Porada	  P,	  Poser	  S,	  et	  al.	  Monocyte/macrophage	  differentiation	  in	  early	  multiple	  sclerosis	  lesions.	  Annals	  of	  neurology	  1995;38:788-­‐796.	  22.	   Koopmans	  R,	  Li	  D,	  Oger	  J,	  Mayo	  J,	  Paty	  D.	  The	  lesion	  of	  multiple	  sclerosis	  Imaging	  of	  acute	  and	  chronic	  stages.	  Neurology	  1989;39:959-­‐959.	  23.	   Frohman	  EM,	  Racke	  MK,	  Raine	  CS.	  Multiple	  sclerosis—the	  plaque	  and	  its	  pathogenesis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2006;354:942-­‐955.	  24.	   Bar-­‐Or	  A.	  The	  immunology	  of	  multiple	  sclerosis.	  	  Seminars	  in	  neurology;	  2008:	  ©	  Thieme	  Medical	  Publishers:	  029-­‐045.	  	   90	  25.	   Morales	  Y,	  Parisi	  JE,	  Lucchinetti	  CF.	  The	  pathology	  of	  multiple	  sclerosis:	  evidence	  for	  heterogeneity.	  Advances	  in	  neurology	  2006;14:27-­‐46.	  26.	   Pittock	  SJ,	  Lucchinetti	  CF.	  The	  pathology	  of	  MS:	  new	  insights	  and	  potential	  clinical	  applications.	  The	  neurologist	  2007;13:45-­‐56.	  27.	   Lucchinetti	  C,	  Brück	  W,	  Parisi	  J,	  Scheithauer	  B,	  Rodriguez	  M,	  Lassmann	  H.	  A	  quantitative	  analysis	  of	  oligodendrocytes	  in	  multiple	  sclerosis	  lesions	  A	  study	  of	  113	  cases.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  1999;122:2279-­‐2295.	  28.	   Brück	  W,	  Kuhlmann	  T,	  Stadelmann	  C.	  Remyelination	  in	  multiple	  sclerosis.	  Journal	  of	  the	  neurological	  sciences	  2003;206:181-­‐185.	  29.	   Wolswijk	  G.	  Chronic	  stage	  multiple	  sclerosis	  lesions	  contain	  a	  relatively	  quiescent	  population	  of	  oligodendrocyte	  precursor	  cells.	  The	  Journal	  of	  neuroscience	  1998;18:601-­‐609.	  30.	   Cannella	  B,	  Raine	  CS.	  The	  adhesion	  molecule	  and	  cytokine	  profile	  of	  multiple	  sclerosis	  lesions.	  Annals	  of	  neurology	  1995;37:424-­‐435.	  31.	   Navikas	  V,	  Link	  H.	  Review:	  cytokines	  and	  the	  pathogenesis	  of	  multiple	  sclerosis.	  Journal	  of	  neuroscience	  research	  1996;45:322-­‐333.	  32.	   Lucchinetti	  CF,	  Brueck	  W,	  Rodriguez	  M,	  Lassmann	  H.	  Multiple	  sclerosis:	  lessons	  from	  neuropathology.	  	  Seminars	  in	  neurology;	  1998:	  ©	  1998	  by	  Thieme	  Medical	  Publishers,	  Inc.:	  337-­‐349.	  33.	   Kutzelnigg	  A,	  Lucchinetti	  CF,	  Stadelmann	  C,	  et	  al.	  Cortical	  demyelination	  and	  diffuse	  white	  matter	  injury	  in	  multiple	  sclerosis.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2005;128:2705-­‐2712.	  34.	   Hohlfeld	  R,	  Wekerle	  H.	  Immunological	  update	  on	  multiple	  sclerosis.	  Current	  opinion	  in	  neurology	  2001;14:299-­‐304.	  35.	   Gold	  R,	  Linington	  C,	  Lassmann	  H.	  Understanding	  pathogenesis	  and	  therapy	  of	  multiple	  sclerosis	  via	  animal	  models:	  70	  years	  of	  merits	  and	  culprits	  in	  experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis	  research.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2006;129:1953-­‐1971.	  36.	   Miller	  SD,	  Karpus	  WJ,	  Davidson	  TS.	  Experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis	  in	  the	  mouse.	  Current	  Protocols	  in	  Immunology	  2010:15.11.	  11-­‐15.11.	  20.	  	   91	  37.	   Swanborg	  RH,	  Stepaniak	  JA.	  Experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis	  in	  the	  rat.	  Current	  Protocols	  in	  Immunology	  1996:15.12.	  11-­‐15.12.	  14.	  38.	   Goverman	  J.	  Tolerance	  and	  autoimmunity	  in	  TCR	  transgenic	  mice	  specific	  for	  myelin	  basic	  protein.	  Immunological	  Reviews	  1999;169:147-­‐159.	  39.	   Krishnamoorthy	  G,	  Holz	  A,	  Wekerle	  H.	  Experimental	  models	  of	  spontaneous	  autoimmune	  disease	  in	  the	  central	  nervous	  system.	  J	  Mol	  Med	  2007;85:1161-­‐1173.	  40.	   Waldner	  H,	  Whitters	  MJ,	  Sobel	  RA,	  Collins	  M,	  Kuchroo	  VK.	  Fulminant	  spontaneous	  autoimmunity	  of	  the	  central	  nervous	  system	  in	  mice	  transgenic	  for	  the	  myelin	  proteolipid	  protein-­‐specific	  T	  cell	  receptor.	  Proceedings	  of	  the	  National	  Academy	  of	  Sciences	  2000;97:3412-­‐3417.	  41.	   Zehntner	  SP,	  Brisebois	  M,	  Tran	  E,	  Owens	  T,	  Fournier	  S.	  Constitutive	  expression	  of	  a	  costimulatory	  ligand	  on	  antigen-­‐presenting	  cells	  in	  the	  nervous	  system	  drives	  demyelinating	  disease.	  The	  FASEB	  journal	  2003;17:1910-­‐1912.	  42.	   Bettelli	  E,	  Pagany	  M,	  Weiner	  HL,	  Linington	  C,	  Sobel	  RA,	  Kuchroo	  VK.	  Myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein–specific	  T	  cell	  receptor	  transgenic	  mice	  develop	  spontaneous	  autoimmune	  optic	  neuritis.	  The	  Journal	  of	  experimental	  medicine	  2003;197:1073-­‐1081.	  43.	   Simmons	  SB,	  Pierson	  ER,	  Lee	  SY,	  Goverman	  JM.	  Modeling	  the	  heterogeneity	  of	  multiple	  sclerosis	  in	  animals.	  Trends	  in	  immunology	  2013.	  44.	   Sadovnick	  A,	  Yee	  I,	  Ebers	  G.	  Factors	  influencing	  sib	  risks	  for	  multiple	  sclerosis.	  Clinical	  genetics	  2000;58:431-­‐435.	  45.	   Hauser	  SL,	  Chan	  JR,	  Oksenberg	  JR.	  Multiple	  sclerosis:	  Prospects	  and	  promise.	  Annals	  of	  neurology	  2013;74:317-­‐327.	  46.	   Sawcer	  S,	  Hellenthal	  G,	  Pirinen	  M,	  et	  al.	  Genetic	  risk	  and	  a	  primary	  role	  for	  cell-­‐mediated	  immune	  mechanisms	  in	  multiple	  sclerosis.	  Nature	  2011;476:214.	  47.	   Ascherio	  A,	  Munger	  KL.	  Environmental	  risk	  factors	  for	  multiple	  sclerosis.	  Part	  II:	  Noninfectious	  factors.	  Annals	  of	  neurology	  2007;61:504-­‐513.	  48.	   Ascherio	  A,	  Munger	  KL.	  Environmental	  risk	  factors	  for	  multiple	  sclerosis.	  Part	  I:	  the	  role	  of	  infection.	  Annals	  of	  neurology	  2007;61:288-­‐299.	  	   92	  49.	   Cepok	  S,	  Zhou	  D,	  Srivastava	  R,	  et	  al.	  Identification	  of	  Epstein-­‐Barr	  virus	  proteins	  as	  putative	  targets	  of	  the	  immune	  response	  in	  multiple	  sclerosis.	  Journal	  of	  Clinical	  Investigation	  2005;115:1352-­‐1360.	  50.	   Franciotta	  D,	  Di	  Stefano	  AL,	  Jarius	  S,	  et	  al.	  Cerebrospinal	  BAFF	  and	  Epstein–Barr	  virus-­‐specific	  oligoclonal	  bands	  in	  multiple	  sclerosis	  and	  other	  inflammatory	  demyelinating	  neurological	  diseases.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2011;230:160-­‐163.	  51.	   Jafari	  N,	  van	  Nierop	  GP,	  Verjans	  GM,	  Osterhaus	  AD,	  Middeldorp	  JM,	  Hintzen	  RQ.	  No	  evidence	  for	  intrathecal	  IgG	  synthesis	  to	  Epstein	  Barr	  virus	  nuclear	  antigen-­‐1	  in	  multiple	  sclerosis.	  Journal	  of	  Clinical	  Virology	  2010;49:26-­‐31.	  52.	   Hedström	  A,	  Bäärnhielm	  M,	  Olsson	  T,	  Alfredsson	  L.	  Exposure	  to	  environmental	  tobacco	  smoke	  is	  associated	  with	  increased	  risk	  for	  multiple	  sclerosis.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2011;17:788-­‐793.	  53.	   Odoardi	  F,	  Sie	  C,	  Streyl	  K,	  et	  al.	  T	  cells	  become	  licensed	  in	  the	  lung	  to	  enter	  the	  central	  nervous	  system.	  Nature	  2012;488:675-­‐679.	  54.	   Brunton	  LL,	  Lazo	  JS,	  Parker	  KL.	  Goodman	  &	  Gilman’s	  the	  pharmacological	  basis	  of	  therapeutics.	  McGrawHill,	  New	  York	  2006;11:737-­‐738.	  55.	   Beck	  RW,	  Cleary	  PA,	  Trobe	  JD,	  et	  al.	  The	  effect	  of	  corticosteroids	  for	  acute	  optic	  neuritis	  on	  the	  subsequent	  development	  of	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  1993;329:1764-­‐1769.	  56.	   La	  Mantia	  L,	  Eoli	  M,	  Milanese	  C,	  Salmaggi	  A,	  Dufour	  A,	  Torri	  V.	  Double-­‐blind	  trial	  of	  dexamethasone	  versus	  methylprednisolone	  in	  multiple	  sclerosis	  acute	  relapses.	  European	  neurology	  1994;34:199-­‐203.	  57.	   Milligan	  N,	  Newcombe	  R,	  Compston	  D.	  A	  double-­‐blind	  controlled	  trial	  of	  high	  dose	  methylprednisolone	  in	  patients	  with	  multiple	  sclerosis:	  1.	  Clinical	  effects.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  1987;50:511-­‐516.	  58.	   Jacobs	  LD,	  Beck	  RW,	  Simon	  JH,	  et	  al.	  Intramuscular	  interferon	  beta-­‐1a	  therapy	  initiated	  during	  a	  first	  demyelinating	  event	  in	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2000;343:898-­‐904.	  	   93	  59.	   Kappos	  L,	  Polman	  C,	  Freedman	  M,	  et	  al.	  Treatment	  with	  interferon	  beta-­‐1b	  delays	  conversion	  to	  clinically	  definite	  and	  McDonald	  MS	  in	  patients	  with	  clinically	  isolated	  syndromes.	  Neurology	  2006;67:1242-­‐1249.	  60.	   Comi	  G,	  Jeffery	  D,	  Kappos	  L,	  et	  al.	  Placebo-­‐controlled	  trial	  of	  oral	  laquinimod	  for	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2012;366:1000-­‐1009.	  61.	   Kappos	  L,	  Lindberg	  RL.	  Interferons	  in	  relapsing–remitting	  multiple	  sclerosis.	  Multiple	  Sclerosis	  Therapeutics	  (3rd	  edition)	  London,	  UK:	  Informa	  Healthcare	  2007:373-­‐402.	  62.	   Kieseier	  BC.	  The	  mechanism	  of	  action	  of	  interferon-­‐β	  in	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  CNS	  drugs	  2011;25:491-­‐502.	  63.	   Paty	  D,	  Li	  DB.	  Interferon	  beta‐1b	  is	  effective	  in	  relapsing‐remitting	  multiple	  sclerosis	  II.	  MRI	  analysis	  results	  of	  a	  multicenter,	  randomized,	  double‐blind,	  placebo‐controlled	  trial.	  Neurology	  1993;43:662-­‐662.	  64.	   Francis	  G,	  Hughes	  R,	  King	  J,	  et	  al.	  PRISMS-­‐4:	  Long-­‐term	  efficacy	  of	  interferon-­‐beta-­‐1a	  in	  relapsing	  MS.	  2001.	  65.	   Li	  DK,	  Paty	  DW.	  Magnetic	  resonance	  imaging	  results	  of	  the	  PRISMS	  trial:	  A	  randomized,	  double‐blind,	  placebo‐controlled	  study	  of	  interferon‐β1a	  in	  relapsing‐remitting	  multiple	  sclerosis.	  Annals	  of	  neurology	  1999;46:197-­‐206.	  66.	   Rice	  G,	  Oger	  J,	  Duquette	  P,	  et	  al.	  Treatment	  with	  interferon	  beta-­‐1b	  improves	  quality	  of	  life	  in	  multiple	  sclerosis.	  The	  Canadian	  Journal	  of	  Neurological	  Sciences	  1999;26:276-­‐282.	  67.	   Simon	  JH,	  Jacobs	  LD,	  Campion	  M,	  et	  al.	  Magnetic	  resonance	  studies	  of	  intramuscular	  interferon	  beta-­‐1a	  for	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  The	  Multiple	  Sclerosis	  Collaborative	  Research	  Group.	  Annals	  of	  neurology	  1998;43:79-­‐87.	  68.	   Fischer	  JS,	  Priore	  RL,	  Jacobs	  LD,	  et	  al.	  Neuropsychological	  effects	  of	  interferon	  beta-­‐1a	  in	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  Multiple	  Sclerosis	  Collaborative	  Research	  Group.	  Annals	  of	  neurology	  2000;48:885-­‐892.	  69.	   Panitch	  H,	  Goodin	  D,	  Francis	  G,	  et	  al.	  Randomized,	  comparative	  study	  of	  interferon	  β-­‐1a	  treatment	  regimens	  in	  MS	  The	  EVIDENCE	  Trial.	  Neurology	  2002;59:1496-­‐1506.	  70.	   Bertolotto	  A,	  Malucchi	  S,	  Sala	  A,	  et	  al.	  Differential	  effects	  of	  three	  interferon	  betas	  on	  neutralising	  antibodies	  in	  patients	  with	  multiple	  sclerosis:	  a	  follow	  up	  study	  in	  an	  	   94	  independent	  laboratory.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  2002;73:148-­‐153.	  71.	   Polman	  CH,	  Bertolotto	  A,	  Deisenhammer	  F,	  et	  al.	  Recommendations	  for	  clinical	  use	  of	  data	  on	  neutralising	  antibodies	  to	  interferon-­‐beta	  therapy	  in	  multiple	  sclerosis.	  The	  Lancet	  Neurology	  2010;9:740-­‐750.	  72.	   Castro-­‐Borrero	  W,	  Graves	  D,	  Frohman	  TC,	  et	  al.	  Current	  and	  emerging	  therapies	  in	  multiple	  sclerosis:	  a	  systematic	  review.	  Therapeutic	  advances	  in	  neurological	  disorders	  2012;5:205-­‐220.	  73.	   Johnson	  K.	  The	  Remarkable	  Story	  of	  Copaxone.	  New	  York:	  Diamedica	  2010:70-­‐73.	  74.	   Lalive	  PH,	  Neuhaus	  O,	  Benkhoucha	  M,	  et	  al.	  Glatiramer	  acetate	  in	  the	  treatment	  of	  multiple	  sclerosis:	  emerging	  concepts	  regarding	  its	  mechanism	  of	  action.	  CNS	  Drugs	  2011;25:401-­‐414.	  75.	   DiPiro	  JT,	  Talbert	  RL,	  Yee	  GC,	  et	  al.	  Pharmacotherapy:	  a	  pathophysiologic	  approach:	  McGraw-­‐Hill	  New	  York,	  NY,	  2005.	  76.	   Ford	  C,	  Goodman	  A,	  Johnson	  K,	  et	  al.	  Continuous	  long-­‐term	  immunomodulatory	  therapy	  in	  relapsing	  multiple	  sclerosis:	  results	  from	  the	  15-­‐year	  analysis	  of	  the	  US	  prospective	  open-­‐label	  study	  of	  glatiramer	  acetate.	  Multiple	  Sclerosis	  2010;16:342-­‐350.	  77.	   Blanchette	  F.	  Clinical	  significance	  of	  glatiramer	  acetate	  antibodies.	  Multiple	  Sclerosis	  2007;13:28-­‐35.	  78.	   O'Connor	  P,	  Filippi	  M,	  Arnason	  B,	  et	  al.	  250	  microg	  or	  500	  microg	  interferon	  beta-­‐1b	  versus	  20	  mg	  glatiramer	  acetate	  in	  relapsing-­‐remitting	  multiple	  sclerosis:	  a	  prospective,	  randomised,	  multicentre	  study.	  Lancet	  neurology	  2009;8:889-­‐897.	  79.	   Mikol	  DD,	  Barkhof	  F,	  Chang	  P,	  et	  al.	  Comparison	  of	  subcutaneous	  interferon	  beta-­‐1a	  with	  glatiramer	  acetate	  in	  patients	  with	  relapsing	  multiple	  sclerosis	  (the	  REbif	  vs	  Glatiramer	  Acetate	  in	  Relapsing	  MS	  Disease	  [REGARD]	  study):	  a	  multicentre,	  randomised,	  parallel,	  open-­‐label	  trial.	  The	  Lancet	  Neurology	  2008;7:903-­‐914.	  80.	   Goldenberg	  MM.	  Multiple	  sclerosis	  review.	  Pharmacy	  and	  Therapeutics	  2012;37:175.	  81.	   Serono	  E.	  Novantrone®	  (mitoxantrone	  for	  injection	  concentrate).	  Rockland,	  MA,	  USA2008.	  	   95	  82.	   Goodin	  D,	  Arnason	  B,	  Coyle	  P,	  Frohman	  E,	  Paty	  D.	  The	  use	  of	  mitoxantrone	  (Novantrone)	  for	  the	  treatment	  of	  multiple	  sclerosis	  Report	  of	  the	  Therapeutics	  and	  Technology	  Assessment	  Subcommittee	  of	  the	  American	  Academy	  of	  Neurology.	  Neurology	  2003;61:1332-­‐1338.	  83.	   Martinelli	  V,	  Radaelli	  M,	  Straffi	  L,	  Rodegher	  M,	  Comi	  G.	  Mitoxantrone:	  benefits	  and	  risks	  in	  multiple	  sclerosis	  patients.	  Neurological	  sciences	  2009;30:167-­‐170.	  84.	   Fox	  EJ.	  Management	  of	  worsening	  multiple	  sclerosis	  with	  mitoxantrone:	  a	  review.	  Clinical	  therapeutics	  2006;28:461-­‐474.	  85.	   Cohen	  JA,	  Barkhof	  F,	  Comi	  G,	  et	  al.	  Oral	  fingolimod	  or	  intramuscular	  interferon	  for	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2010;362:402-­‐415.	  86.	   Kappos	  L,	  Radue	  E-­‐W,	  O'Connor	  P,	  et	  al.	  A	  placebo-­‐controlled	  trial	  of	  oral	  fingolimod	  in	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2010;362:387-­‐401.	  87.	   Coelho	  RP,	  Payne	  SG,	  Bittman	  R,	  Spiegel	  S,	  Sato-­‐Bigbee	  C.	  The	  immunomodulator	  FTY720	  has	  a	  direct	  cytoprotective	  effect	  in	  oligodendrocyte	  progenitors.	  Journal	  of	  Pharmacology	  and	  Experimental	  Therapeutics	  2007;323:626-­‐635.	  88.	   Foster	  CA,	  Howard	  LM,	  Schweitzer	  A,	  et	  al.	  Brain	  penetration	  of	  the	  oral	  immunomodulatory	  drug	  FTY720	  and	  its	  phosphorylation	  in	  the	  central	  nervous	  system	  during	  experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis:	  consequences	  for	  mode	  of	  action	  in	  multiple	  sclerosis.	  Journal	  of	  Pharmacology	  and	  Experimental	  Therapeutics	  2007;323:469-­‐475.	  89.	   Miron	  VE,	  Jung	  CG,	  Kim	  HJ,	  Kennedy	  TE,	  Soliven	  B,	  Antel	  JP.	  FTY720	  modulates	  human	  oligodendrocyte	  progenitor	  process	  extension	  and	  survival.	  Annals	  of	  neurology	  2008;63:61-­‐71.	  90.	   AG	  N.	  Gilenya®	  (fingolimod)	  Prescribing	  Information.	  September	  2010.	  East	  Hanover,	  NJ,	  USA2010.	  91.	   Rudick	  RA,	  Sandrock	  A.	  Natalizumab:	  α4-­‐integrin	  antagonist	  selective	  adhesion	  molecule	  inhibitors	  for	  MS.	  Expert	  review	  of	  neurotherapeutics	  2004;4:571-­‐580.	  92.	   Idec	  B.	  Tysabri	  (natalizumab)	  injection:	  full	  prescribing	  information.	  Revised:	  08/2012.	  93.	   Bayless	  KJ,	  Meininger	  GA,	  Scholtz	  JM,	  Davis	  GE.	  Osteopontin	  is	  a	  ligand	  for	  the	  alpha4beta1	  integrin.	  Journal	  of	  Cell	  Science	  1998;111:1165-­‐1174.	  	   96	  94.	   Polman	  CH,	  O'Connor	  PW,	  Havrdova	  E,	  et	  al.	  A	  randomized,	  placebo-­‐controlled	  trial	  of	  natalizumab	  for	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  The	  New	  England	  journal	  of	  medicine	  2006;354:899-­‐910.	  95.	   Rudick	  RA,	  Stuart	  WH,	  Calabresi	  PA,	  et	  al.	  Natalizumab	  plus	  interferon	  beta-­‐1a	  for	  relapsing	  multiple	  sclerosis.	  The	  New	  England	  journal	  of	  medicine	  2006;354:911-­‐923.	  96.	   Sørensen	  PS,	  Bertolotto	  A,	  Edan	  G,	  et	  al.	  Risk	  stratification	  for	  progressive	  multifocal	  leukoencephalopathy	  in	  patients	  treated	  with	  natalizumab.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2012;18:143-­‐152.	  97.	   Ransohoff	  RM.	  Natalizumab	  for	  multiple	  sclerosis.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2007;356:2622-­‐2629.	  98.	   De	  Groot	  AS,	  Scott	  DW.	  Immunogenicity	  of	  protein	  therapeutics.	  Trends	  in	  immunology	  2007;28:482-­‐490.	  99.	   Porter	  S.	  Human	  immune	  response	  to	  recombinant	  human	  proteins.	  Journal	  of	  pharmaceutical	  sciences	  2001;90:1-­‐11.	  100.	   Schellekens	  H.	  Bioequivalence	  and	  the	  immunogenicity	  of	  biopharmaceuticals.	  Nature	  reviews	  Drug	  discovery	  2002;1:457-­‐462.	  101.	   Calabresi	  PA,	  Giovannoni	  G,	  Confavreux	  C,	  et	  al.	  The	  incidence	  and	  significance	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies:	  results	  from	  AFFIRM	  and	  SENTINEL.	  Neurology	  2007;69:1391-­‐1403.	  102.	   Holmén	  C,	  Piehl	  F,	  Hillert	  J,	  et	  al.	  A	  Swedish	  national	  post-­‐marketing	  surveillance	  study	  of	  natalizumab	  treatment	  in	  multiple	  sclerosis.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2011;17:708-­‐719.	  103.	   Sørensen	  PS,	  Jensen	  PEH,	  Haghikia	  A,	  et	  al.	  Occurrence	  of	  antibodies	  against	  natalizumab	  in	  relapsing	  multiple	  sclerosis	  patients	  treated	  with	  natalizumab.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2011;17:1074-­‐1078.	  104.	   Krumbholz	  M,	  Pellkofer	  H,	  Gold	  R,	  Hoffmann	  LA,	  Hohlfeld	  R,	  Kümpfel	  T.	  Delayed	  allergic	  reaction	  to	  natalizumab	  associated	  with	  early	  formation	  of	  neutralizing	  antibodies.	  Archives	  of	  neurology	  2007;64:1331-­‐1333.	  105.	   Jensen	  PEH,	  Koch-­‐Henriksen	  N,	  Sellebjerg	  F,	  Sørensen	  PS.	  Prediction	  of	  antibody	  persistency	  from	  antibody	  titres	  to	  natalizumab.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2012;18:1493-­‐1499.	  	   97	  106.	   Mandler	  RN,	  Davis	  LE,	  Jeffery	  DR,	  Kornfeld	  M.	  Devic's	  neuromyelitis	  optica:	  a	  clinicopathological	  study	  of	  8	  patients.	  Annals	  of	  neurology	  1993;34:162-­‐168.	  107.	   O'Riordan	  J,	  Gallagher	  H,	  Thompson	  A,	  et	  al.	  Clinical,	  CSF,	  and	  MRI	  findings	  in	  Devic's	  neuromyelitis	  optica.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  1996;60:382-­‐387.	  108.	   Wingerchuk	  DM,	  Hogancamp	  WF,	  O’Brien	  PC,	  Weinshenker	  BG.	  The	  clinical	  course	  of	  neuromyelitis	  optica	  (Devic’s	  syndrome).	  Neurology	  1999;53:1107-­‐1107.	  109.	   Wingerchuk	  DM,	  Lennon	  VA,	  Lucchinetti	  CF,	  Pittock	  SJ,	  Weinshenker	  BG.	  The	  spectrum	  of	  neuromyelitis	  optica.	  The	  Lancet	  Neurology	  2007;6:805-­‐815.	  110.	   Jarius	  S,	  Wildemann	  B.	  The	  history	  of	  neuromyelitis	  optica.	  J	  Neuroinflammation	  2013;10.	  111.	   Jarius	  S,	  Ruprecht	  K,	  Wildemann	  B,	  et	  al.	  Contrasting	  disease	  patterns	  in	  seropositive	  and	  seronegative	  neuromyelitis	  optica:	  a	  multicentre	  study	  of	  175	  patients.	  Journal	  of	  neuroinflammation	  2012;9:14.	  112.	   Lennon	  VA,	  Kryzer	  TJ,	  Pittock	  SJ,	  Verkman	  AS,	  Hinson	  SR.	  IgG	  marker	  of	  optic-­‐spinal	  multiple	  sclerosis	  binds	  to	  the	  aquaporin-­‐4	  water	  channel.	  The	  Journal	  of	  experimental	  medicine	  2005;202:473-­‐477.	  113.	   Lennon	  VA,	  Wingerchuk	  DM,	  Kryzer	  TJ,	  et	  al.	  A	  serum	  autoantibody	  marker	  of	  neuromyelitis	  optica:	  distinction	  from	  multiple	  sclerosis.	  Lancet	  2004;364:2106-­‐2112.	  114.	   Devic	  E.	  Myélite	  subaiguë	  compliquée	  de	  névrite	  optique.	  Bull	  Med	  1894;8:1033-­‐1034.	  115.	   Fujihara	  K.	  Neuromyelitis	  optica	  and	  astrocytic	  damage	  in	  its	  pathogenesis.	  Journal	  of	  the	  neurological	  sciences	  2011;306:183-­‐187.	  116.	   Kuroiwa	  Y.	  Neuromyelitis	  optica	  (Devic’s	  disease,	  Devic’s	  syndrome).	  Handbook	  of	  clinical	  neurology	  1985;3:397-­‐408.	  117.	   Wingerchuk	  DM,	  Lennon	  VA,	  Pittock	  SJ,	  Lucchinetti	  CF,	  Weinshenker	  BG.	  Revised	  diagnostic	  criteria	  for	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2006;66:1485-­‐1489.	  118.	   Bergamaschi	  R,	  Ghezzi	  A.	  Devic’s	  neuromyelitis	  optica:	  clinical	  features	  and	  prognostic	  factors.	  Neurological	  Sciences	  2004;25:s364-­‐s367.	  	   98	  119.	   Lana-­‐Peixoto	  MA.	  Devic’s	  neuromyelitis	  optica:	  a	  critical	  review.	  Arquivos	  de	  neuro-­‐psiquiatria	  2008;66:120-­‐138.	  120.	   Cabre	  P,	  Gonzalez-­‐Quevedo	  A,	  Bonnan	  M,	  et	  al.	  Relapsing	  neuromyelitis	  optica:	  long	  term	  history	  and	  clinical	  predictors	  of	  death.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  2009;80:1162-­‐1164.	  121.	   Papais-­‐Alvarenga	  RM,	  Carellos	  SC,	  Alvarenga	  MP,	  Holander	  C,	  Bichara	  RP,	  Thuler	  LCS.	  Clinical	  course	  of	  optic	  neuritis	  in	  patients	  with	  relapsing	  neuromyelitis	  optica.	  Archives	  of	  ophthalmology	  2008;126:12-­‐16.	  122.	   Pittock	  SJ,	  Lennon	  VA,	  Krecke	  K,	  Wingerchuk	  DM,	  Lucchinetti	  CF,	  Weinshenker	  BG.	  Brain	  abnormalities	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Archives	  of	  neurology	  2006;63:390-­‐396.	  123.	   Misu	  T,	  Fujihara	  K,	  Nakashima	  I,	  Sato	  S,	  Itoyama	  Y.	  Intractable	  hiccup	  and	  nausea	  with	  periaqueductal	  lesions	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2005;65:1479-­‐1482.	  124.	   Wingerchuk	  DM,	  Weinshenker	  BG.	  Neuromyelitis	  optica	  Clinical	  predictors	  of	  a	  relapsing	  course	  and	  survival.	  Neurology	  2003;60:848-­‐853.	  125.	   Jacob	  A,	  Matiello	  M,	  Wingerchuk	  DM,	  Lucchinetti	  CF,	  Pittock	  SJ,	  Weinshenker	  BG.	  Neuromyelitis	  optica:	  changing	  concepts.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2007;187:126-­‐138.	  126.	   Kister	  I,	  Gulati	  S,	  Boz	  C,	  et	  al.	  Neuromyelitis	  optica	  in	  patients	  with	  myasthenia	  gravis	  who	  underwent	  thymectomy.	  Archives	  of	  neurology	  2006;63:851-­‐856.	  127.	   Leys	  D,	  Petit	  H,	  Block	  AM,	  Docx	  B,	  Basin	  B,	  Hache	  JC.	  [Devic's	  optic	  neuromyelitis.	  4	  cases].	  Revue	  neurologique	  1987;143:722-­‐728.	  128.	   Correale	  J,	  Fiol	  M.	  Activation	  of	  humoral	  immunity	  and	  eosinophils	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2004;63:2363-­‐2370.	  129.	   Ishizu	  T,	  Osoegawa	  M,	  Mei	  F-­‐J,	  et	  al.	  Intrathecal	  activation	  of	  the	  IL-­‐17/IL-­‐8	  axis	  in	  opticospinal	  multiple	  sclerosis.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2005;128:988-­‐1002.	  130.	   Filippi	  M,	  Rocca	  M,	  Moiola	  L,	  et	  al.	  MRI	  and	  magnetization	  transfer	  imaging	  changes	  in	  the	  brain	  and	  cervical	  cord	  of	  patients	  with	  Devic’s	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  1999;53:1705-­‐1705.	  131.	   Nakashima	  I,	  Fujihara	  K,	  Miyazawa	  I,	  et	  al.	  Clinical	  and	  MRI	  features	  of	  Japanese	  patients	  with	  multiple	  sclerosis	  positive	  for	  NMO-­‐IgG.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  2006;77:1073-­‐1075.	  	   99	  132.	   Collongues	  N,	  Marignier	  R,	  Zephir	  H,	  et	  al.	  Neuromyelitis	  optica	  in	  France	  A	  multicenter	  study	  of	  125	  patients.	  Neurology	  2010;74:736-­‐742.	  133.	   Krampla	  W,	  Aboul-­‐Enein	  F,	  Jecel	  J,	  et	  al.	  Spinal	  cord	  lesions	  in	  patients	  with	  neuromyelitis	  optica:	  a	  retrospective	  long-­‐term	  MRI	  follow-­‐up	  study.	  European	  radiology	  2009;19:2535-­‐2543.	  134.	   Matsushita	  T,	  Isobe	  N,	  Piao	  H,	  et	  al.	  Reappraisal	  of	  brain	  MRI	  features	  in	  patients	  with	  multiple	  sclerosis	  and	  neuromyelitis	  optica	  according	  to	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  status.	  Journal	  of	  the	  neurological	  sciences	  2010;291:37-­‐43.	  135.	   Misu	  T,	  Fujihara	  K,	  Nakashima	  I,	  et	  al.	  Pure	  optic‐spinal	  form	  of	  multiple	  sclerosis	  in	  Japan.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2002;125:2460-­‐2468.	  136.	   Campi	  A,	  Filippi	  M,	  Comi	  G,	  et	  al.	  Acute	  transverse	  myelopathy:	  spinal	  and	  cranial	  MR	  study	  with	  clinical	  follow-­‐up.	  American	  journal	  of	  neuroradiology	  1995;16:115-­‐123.	  137.	   Tartaglino	  LM,	  Friedman	  DP,	  Flanders	  AE,	  Lublin	  FD,	  Knobler	  RL,	  Liem	  M.	  Multiple	  sclerosis	  in	  the	  spinal	  cord:	  MR	  appearance	  and	  correlation	  with	  clinical	  parameters.	  Radiology	  1995;195:725-­‐732.	  138.	   Rash	  J,	  Davidson	  K,	  Yasumura	  T,	  Furman	  C.	  Freeze-­‐fracture	  and	  immunogold	  analysis	  of	  aquaporin-­‐4	  (AQP4)	  square	  arrays,	  with	  models	  of	  AQP4	  lattice	  assembly.	  Neuroscience	  2004;129:915-­‐934.	  139.	   Yool	  AJ.	  Aquaporins:	  multiple	  roles	  in	  the	  central	  nervous	  system.	  The	  Neuroscientist	  2007;13:470-­‐485.	  140.	   Verkman	  A.	  Aquaporins	  in	  clinical	  medicine.	  Annual	  review	  of	  medicine	  2012;63:303.	  141.	   Ho	  JD,	  Yeh	  R,	  Sandstrom	  A,	  et	  al.	  Crystal	  structure	  of	  human	  aquaporin	  4	  at	  1.8	  Å	  and	  its	  mechanism	  of	  conductance.	  Proceedings	  of	  the	  National	  Academy	  of	  Sciences	  2009;106:7437-­‐7442.	  142.	   Crane	  JM,	  Lam	  C,	  Rossi	  A,	  Gupta	  T,	  Bennett	  JL,	  Verkman	  A.	  Binding	  affinity	  and	  specificity	  of	  neuromyelitis	  optica	  autoantibodies	  to	  aquaporin-­‐4	  M1/M23	  isoforms	  and	  orthogonal	  arrays.	  Journal	  of	  Biological	  Chemistry	  2011;286:16516-­‐16524.	  143.	   Mader	  S,	  Lutterotti	  A,	  Di	  Pauli	  F,	  et	  al.	  Patterns	  of	  antibody	  binding	  to	  aquaporin-­‐4	  isoforms	  in	  neuromyelitis	  optica.	  PloS	  one	  2010;5:e10455.	  	   100	  144.	   Phuan	  P-­‐W,	  Ratelade	  J,	  Rossi	  A,	  Tradtrantip	  L,	  Verkman	  AS.	  Complement-­‐dependent	  cytotoxicity	  in	  neuromyelitis	  optica	  requires	  aquaporin-­‐4	  protein	  assembly	  in	  orthogonal	  arrays.	  Journal	  of	  Biological	  Chemistry	  2012;287:13829-­‐13839.	  145.	   Crane	  JM,	  Van	  Hoek	  AN,	  Skach	  WR,	  Verkman	  A.	  Aquaporin-­‐4	  dynamics	  in	  orthogonal	  arrays	  in	  live	  cells	  visualized	  by	  quantum	  dot	  single	  particle	  tracking.	  Molecular	  biology	  of	  the	  cell	  2008;19:3369-­‐3378.	  146.	   Jarius	  S,	  Wildemann	  B.	  AQP4	  antibodies	  in	  neuromyelitis	  optica:	  diagnostic	  and	  pathogenetic	  relevance.	  Nature	  Reviews	  Neurology	  2010;6:383-­‐392.	  147.	   Matiello	  M,	  Lennon	  VA,	  Jacob	  A,	  et	  al.	  NMO-­‐IgG	  predicts	  the	  outcome	  of	  recurrent	  optic	  neuritis.	  Neurology	  2008;70:2197-­‐2200.	  148.	   Weinshenker	  BG,	  Wingerchuk	  DM,	  Vukusic	  S,	  et	  al.	  Neuromyelitis	  optica	  IgG	  predicts	  relapse	  after	  longitudinally	  extensive	  transverse	  myelitis.	  Annals	  of	  neurology	  2006;59:566-­‐569.	  149.	   Jarius	  S,	  Aboul-­‐Enein	  F,	  Waters	  P,	  et	  al.	  Antibody	  to	  aquaporin-­‐4	  in	  the	  long-­‐term	  course	  of	  neuromyelitis	  optica.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2008;131:3072-­‐3080.	  150.	   Kim	  W,	  Lee	  J-­‐E,	  Li	  XF,	  et	  al.	  Quantitative	  measurement	  of	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  by	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay	  using	  purified	  recombinant	  human	  aquaporin-­‐4.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2012;18:578-­‐586.	  151.	   Takahashi	  T,	  Fujihara	  K,	  Nakashima	  I,	  et	  al.	  Anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  is	  involved	  in	  the	  pathogenesis	  of	  NMO:	  a	  study	  on	  antibody	  titre.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2007;130:1235-­‐1243.	  152.	   Kim	  S-­‐H,	  Kim	  W,	  Huh	  S-­‐Y,	  Lee	  KY,	  Jung	  IJ,	  Kim	  HJ.	  Clinical	  efficacy	  of	  plasmapheresis	  in	  patients	  with	  neuromyelitis	  optica	  spectrum	  disorder	  and	  effects	  on	  circulating	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  levels.	  Journal	  of	  Clinical	  Neurology	  2013;9:36-­‐42.	  153.	   Jarius	  S,	  Franciotta	  D,	  Paul	  F,	  et	  al.	  Cerebrospinal	  fluid	  antibodies	  to	  aquaporin-­‐4	  in	  neuromyelitis	  optica	  and	  related	  disorders:	  frequency,	  origin,	  and	  diagnostic	  relevance.	  J	  Neuroinflammation	  2010;7:52.	  154.	   Jarius	  S,	  Wildemann	  B.	  Aquaporin‐4	  Antibodies	  (NMO‐IgG)	  as	  a	  Serological	  Marker	  of	  Neuromyelitis	  Optica:	  A	  Critical	  Review	  of	  the	  Literature.	  Brain	  Pathology	  2013;23:661-­‐683.	  	   101	  155.	   Adoni	  T,	  Lino	  AMM,	  Marchiori	  PE,	  Kok	  F,	  Callegaro	  D.	  Seroprevalence	  of	  NMO-­‐IgG	  antibody	  in	  Brazilian	  patients	  with	  neuromyelitis	  optica.	  Arquivos	  de	  neuro-­‐psiquiatria	  2008;66:295-­‐297.	  156.	   Jarius	  S,	  Franciotta	  D,	  Bergamaschi	  R,	  et	  al.	  NMO-­‐IgG	  in	  the	  diagnosis	  of	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2007;68:1076-­‐1077.	  157.	   Marignier	  R,	  De	  Sèze	  J,	  Vukusic	  S,	  et	  al.	  NMO-­‐IgG	  and	  Devic's	  neuromyelitis	  optica:	  a	  French	  experience.	  Multiple	  Sclerosis	  2008;14:440-­‐445.	  158.	   Jarius	  S,	  Wandinger	  K,	  Borowski	  K,	  Stoecker	  W,	  Wildemann	  B.	  Antibodies	  to	  CV2/CRMP5	  in	  neuromyelitis	  optica-­‐like	  disease:	  case	  report	  and	  review	  of	  the	  literature.	  Clinical	  neurology	  and	  neurosurgery	  2012;114:331-­‐335.	  159.	   Wingerchuk	  DM.	  NEUROMYELITIS	  OPTICA	  SPECTRUM	  DISORDERS:	  DIAGNOSIS	  AND	  TREATMENT.	  160.	   Lucchinetti	  CF,	  Mandler	  RN,	  McGavern	  D,	  et	  al.	  A	  role	  for	  humoral	  mechanisms	  in	  the	  pathogenesis	  of	  Devic's	  neuromyelitis	  optica.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2002;125:1450-­‐1461.	  161.	   Roemer	  SF,	  Parisi	  JE,	  Lennon	  VA,	  et	  al.	  Pattern-­‐specific	  loss	  of	  aquaporin-­‐4	  immunoreactivity	  distinguishes	  neuromyelitis	  optica	  from	  multiple	  sclerosis.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2007;130:1194-­‐1205.	  162.	   Cayrol	  R,	  Saikali	  P,	  Vincent	  T.	  Effector	  Functions	  of	  Antiaquaporin‐4	  Autoantibodies	  in	  Neuromyelitis	  Optica.	  Annals	  of	  the	  New	  York	  Academy	  of	  Sciences	  2009;1173:478-­‐486.	  163.	   Hinson	  SR,	  Roemer	  SF,	  Lucchinetti	  CF,	  et	  al.	  Aquaporin-­‐4–binding	  autoantibodies	  in	  patients	  with	  neuromyelitis	  optica	  impair	  glutamate	  transport	  by	  down-­‐regulating	  EAAT2.	  The	  Journal	  of	  experimental	  medicine	  2008;205:2473-­‐2481.	  164.	   Hinson	  S,	  Pittock	  S,	  Lucchinetti	  C,	  et	  al.	  Pathogenic	  potential	  of	  IgG	  binding	  to	  water	  channel	  extracellular	  domain	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2007;69:2221-­‐2231.	  165.	   Vincent	  T,	  Saikali	  P,	  Cayrol	  R,	  et	  al.	  Functional	  consequences	  of	  neuromyelitis	  optica-­‐IgG	  astrocyte	  interactions	  on	  blood-­‐brain	  barrier	  permeability	  and	  granulocyte	  recruitment.	  The	  Journal	  of	  Immunology	  2008;181:5730-­‐5737.	  	   102	  166.	   Saadoun	  S,	  Waters	  P,	  Bell	  BA,	  Vincent	  A,	  Verkman	  A,	  Papadopoulos	  MC.	  Intra-­‐cerebral	  injection	  of	  neuromyelitis	  optica	  immunoglobulin	  G	  and	  human	  complement	  produces	  neuromyelitis	  optica	  lesions	  in	  mice.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2010;133:349-­‐361.	  167.	   Cabre	  P,	  Heinzlef	  O,	  Merle	  H,	  et	  al.	  MS	  and	  neuromyelitis	  optica	  in	  Martinique	  (French	  West	  Indies).	  Neurology	  2001;56:507-­‐514.	  168.	   Cabrera-­‐Gómez	  JA,	  Kurtzke	  JF,	  González-­‐Quevedo	  A,	  Lara-­‐Rodriguez	  R.	  An	  epidemiological	  study	  of	  neuromyelitis	  optica	  in	  Cuba.	  Journal	  of	  neurology	  2009;256:35-­‐44.	  169.	   Rivera	  JF,	  Kurtzke	  JF,	  Booth	  VJA.	  Characteristics	  of	  Devic's	  disease	  (neuromyelitis	  optica)	  in	  Mexico.	  Journal	  of	  neurology	  2008;255:710-­‐715.	  170.	   Wingerchuk	  DM.	  Neuromyelitis	  optica:	  effect	  of	  gender.	  Journal	  of	  the	  neurological	  sciences	  2009;286:18-­‐23.	  171.	   Gömöri	  É,	  Pál	  J,	  Ábrahám	  H,	  et	  al.	  Fetal	  development	  of	  membrane	  water	  channel	  proteins	  aquaporin-­‐1	  and	  aquaporin-­‐4	  in	  the	  human	  brain.	  International	  journal	  of	  developmental	  neuroscience	  2006;24:295-­‐305.	  172.	   Matiello	  M,	  Kim	  H,	  Kim	  W,	  et	  al.	  Familial	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2010;75:310-­‐315.	  173.	   Wang	  H,	  Dai	  Y,	  Qiu	  W,	  et	  al.	  HLA-­‐DPB1*	  0501	  is	  associated	  with	  susceptibility	  to	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  positive	  neuromyelitis	  optica	  in	  Southern	  Han	  Chinese.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2011;233:181-­‐184.	  174.	   Zephir	  H,	  Fajardy	  I,	  Outteryck	  O,	  et	  al.	  Is	  neuromyelitis	  optica	  associated	  with	  human	  leukocyte	  antigen?	  Multiple	  Sclerosis	  2009;15:571-­‐579.	  175.	   Crane	  JM,	  Rossi	  A,	  Gupta	  T,	  Bennett	  JL,	  Verkman	  A.	  Orthogonal	  array	  formation	  by	  human	  aquaporin-­‐4:	  Examination	  of	  neuromyelitis	  optica-­‐associated	  aquaporin-­‐4	  polymorphisms.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2011;236:93-­‐98.	  176.	   Matiello	  M,	  Schaefer-­‐Klein	  J,	  Hebrink	  D,	  Kingsbury	  D,	  Atkinson	  E,	  Weinshenker	  B.	  Genetic	  analysis	  of	  aquaporin-­‐4	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Neurology	  2011;77:1149-­‐1155.	  177.	   Papeix	  C,	  Vidal	  J,	  De	  Seze	  J,	  et	  al.	  Immunosuppressive	  therapy	  is	  more	  effective	  than	  interferon	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Multiple	  Sclerosis	  2007;13:256-­‐259.	  	   103	  178.	   Argyriou	  AA,	  Makris	  N.	  Neuromyelitis	  optica:	  a	  distinct	  demyelinating	  disease	  of	  the	  central	  nervous	  system.	  Acta	  neurologica	  Scandinavica	  2008;118:209-­‐217.	  179.	   Keegan	  M,	  Pineda	  AA,	  McClelland	  RL,	  Darby	  CH,	  Rodriguez	  M,	  Weinshenker	  BG.	  Plasma	  exchange	  for	  severe	  attacks	  of	  CNS	  demyelination:	  predictors	  of	  response.	  Neurology	  2002;58:143-­‐146.	  180.	   Watanabe	  S,	  Nakashima	  I,	  Misu	  T,	  et	  al.	  Therapeutic	  efficacy	  of	  plasma	  exchange	  in	  NMO-­‐IgG-­‐positive	  patients	  with	  neuromyelitis	  optica.	  Multiple	  sclerosis	  (Houndmills,	  Basingstoke,	  England)	  2007;13:128-­‐132.	  181.	   Bonnan	  M,	  Valentino	  R,	  Olindo	  S,	  Mehdaoui	  H,	  Smadja	  D,	  Cabre	  P.	  Plasma	  exchange	  in	  severe	  spinal	  attacks	  associated	  with	  neuromyelitis	  optica	  spectrum	  disorder.	  Multiple	  sclerosis	  (Houndmills,	  Basingstoke,	  England)	  2009;15:487-­‐492.	  182.	   Yednock	  TA,	  Cannon	  C,	  Fritz	  LC,	  Sanchez-­‐Madrid	  F,	  Steinman	  L,	  Karin	  N.	  Prevention	  of	  experimental	  autoimmune	  encephalomyelitis	  by	  antibodies	  against	  alpha	  4	  beta	  1	  integrin.	  Nature	  1992;356:63-­‐66.	  183.	   Stuve	  O,	  Bennett	  JL.	  Pharmacological	  properties,	  toxicology	  and	  scientific	  rationale	  for	  the	  use	  of	  natalizumab	  (Tysabri)	  in	  inflammatory	  diseases.	  CNS	  drug	  reviews	  2007;13:79-­‐95.	  184.	   Jarius	  S,	  Paul	  F,	  Franciotta	  D,	  et	  al.	  Mechanisms	  of	  disease:	  aquaporin-­‐4	  antibodies	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Nature	  clinical	  practice	  Neurology	  2008;4:202-­‐214.	  185.	   Waters	  P,	  Jarius	  S,	  Littleton	  E,	  et	  al.	  Aquaporin-­‐4	  antibodies	  in	  neuromyelitis	  optica	  and	  longitudinally	  extensive	  transverse	  myelitis.	  Archives	  of	  neurology	  2008;65:913-­‐919.	  186.	   Takahashi	  T,	  Fujihara	  K,	  Nakashima	  I,	  et	  al.	  Establishment	  of	  a	  new	  sensitive	  assay	  for	  anti-­‐human	  aquaporin-­‐4	  antibody	  in	  neuromyelitis	  optica.	  The	  Tohoku	  journal	  of	  experimental	  medicine	  2006;210:307-­‐313.	  187.	   Oliver	  B,	  Fernandez	  O,	  Orpez	  T,	  et	  al.	  Kinetics	  and	  incidence	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  multiple	  sclerosis	  patients	  on	  treatment	  for	  18	  months.	  Multiple	  sclerosis	  (Houndmills,	  Basingstoke,	  England)	  2011;17:368-­‐371.	  188.	   Jones	  AM,	  Honour	  JW.	  Unusual	  results	  from	  immunoassays	  and	  the	  role	  of	  the	  clinical	  endocrinologist.	  Clinical	  endocrinology	  2006;64:234-­‐244.	  	   104	  189.	   Rispens	  T,	  de	  Vrieze	  H,	  de	  Groot	  E,	  et	  al.	  Antibodies	  to	  constant	  domains	  of	  therapeutic	  monoclonal	  antibodies:	  anti-­‐hinge	  antibodies	  in	  immunogenicity	  testing.	  Journal	  of	  immunological	  methods	  2012;375:93-­‐99.	  190.	   Chung	  CH,	  Mirakhur	  B,	  Chan	  E,	  et	  al.	  Cetuximab-­‐induced	  anaphylaxis	  and	  IgE	  specific	  for	  galactose-­‐α-­‐1,	  3-­‐galactose.	  New	  England	  Journal	  of	  Medicine	  2008;358:1109-­‐1117.	  191.	   Takacs	  MA,	  Jacobs	  SJ,	  Bordens	  RM,	  Swanson	  SJ.	  Detection	  and	  characterization	  of	  antibodies	  to	  PEG-­‐IFN-­‐alpha2b	  using	  surface	  plasmon	  resonance.	  Journal	  of	  interferon	  &	  cytokine	  research	  1999;19:781-­‐789.	  192.	   Haraoui	  B,	  Cameron	  L,	  Ouellet	  M,	  White	  B.	  Anti-­‐infliximab	  antibodies	  in	  patients	  with	  rheumatoid	  arthritis	  who	  require	  higher	  doses	  of	  infliximab	  to	  achieve	  or	  maintain	  a	  clinical	  response.	  The	  Journal	  of	  rheumatology	  2006;33:31-­‐36.	  193.	   Wolbink	  GJ,	  Vis	  M,	  Lems	  W,	  et	  al.	  Development	  of	  antiinfliximab	  antibodies	  and	  relationship	  to	  clinical	  response	  in	  patients	  with	  rheumatoid	  arthritis.	  Arthritis	  &	  Rheumatism	  2006;54:711-­‐715.	  194.	   Kappos	  L,	  Clanet	  M,	  Sandberg-­‐Wollheim	  M,	  et	  al.	  Neutralizing	  antibodies	  and	  efficacy	  of	  interferon	  β-­‐1a	  A	  4-­‐year	  controlled	  study.	  Neurology	  2005;65:40-­‐47.	  195.	   PRISMS	  S.	  PRISMS-­‐4:	  Long-­‐term	  efficacy	  of	  interferon-­‐beta-­‐1a	  in	  relapsing	  MS.	  Neurology	  2001;56:1628.	  196.	   Sorensen	  PS,	  Ross	  C,	  Clemmesen	  KM,	  et	  al.	  Clinical	  importance	  of	  neutralising	  antibodies	  against	  interferon	  beta	  in	  patients	  with	  relapsing-­‐remitting	  multiple	  sclerosis.	  The	  Lancet	  2003;362:1184-­‐1191.	  197.	   The	  IFNB	  Multiple	  Sclerosis	  Study	  Group	  tUoBCMMAG.	  Neutralizing	  antibodies	  during	  treatment	  of	  multiple	  sclerosis	  with	  interferon	  beta-­‐1b:	  experience	  during	  the	  first	  three	  years.	  The	  IFNB	  Multiple	  Sclerosis	  Study	  Group	  and	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  MS/MRI	  Analysis	  Group.	  Neurology	  1996;47:889-­‐894.	  198.	   Vennegoor	  A,	  Rispens	  T,	  Strijbis	  EM,	  et	  al.	  Clinical	  relevance	  of	  serum	  natalizumab	  concentration	  and	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  multiple	  sclerosis.	  Multiple	  sclerosis	  (Houndmills,	  Basingstoke,	  England)	  2013;19:593-­‐600.	  	   105	  199.	   Lundkvist	  M,	  Engdahl	  E,	  Holmen	  C,	  et	  al.	  Characterization	  of	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  in	  multiple	  sclerosis	  patients.	  Multiple	  sclerosis	  (Houndmills,	  Basingstoke,	  England)	  2013;19:757-­‐764.	  200.	   Hayakawa	  S,	  Mori	  M,	  Okuta	  A,	  et	  al.	  Neuromyelitis	  optica	  and	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibodies	  measured	  by	  an	  enzyme-­‐linked	  immunosorbent	  assay.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2008;196:181-­‐187.	  201.	   Sabater	  L,	  Giralt	  A,	  Boronat	  A,	  et	  al.	  Cytotoxic	  effect	  of	  neuromyelitis	  optica	  antibody	  (NMO-­‐IgG)	  to	  astrocytes:	  An<	  i>	  in	  vitro</i>	  study.	  Journal	  of	  neuroimmunology	  2009;215:31-­‐35.	  202.	   Bonnan	  M,	  Brasme	  H,	  Diaby	  M,	  Vlaicu	  M,	  Le	  Guern	  V,	  Zuber	  M.	  [Severe	  bouts	  of	  neuromyelitis	  optica:	  dramatic	  improvement	  after	  plasma	  exchanges].	  Revue	  neurologique	  2009;165:479-­‐481.	  203.	   Ducray	  F,	  Roos-­‐Weil	  R,	  Garcia	  PY,	  et	  al.	  Devic’s	  syndrome-­‐like	  phenotype	  associated	  with	  thymoma	  and	  anti-­‐CV2/CRMP5	  antibodies.	  Journal	  of	  Neurology,	  Neurosurgery	  &	  Psychiatry	  2007;78:325-­‐327.	  204.	   Jarius	  S,	  Warth	  A,	  Wandinger	  K,	  et	  al.	  Antibodies	  to	  aquaporin-­‐4	  in	  non-­‐small	  cell	  lung	  cancer:	  a	  study	  on	  50	  patients.	  Neurological	  sciences	  2010;31:871-­‐872.	  205.	   Kitley	  J,	  Woodhall	  M,	  Waters	  P,	  et	  al.	  Myelin-­‐oligodendrocyte	  glycoprotein	  antibodies	  in	  adults	  with	  a	  neuromyelitis	  optica	  phenotype.	  Neurology	  2012;79:1273-­‐1277.	  206.	   Mader	  S,	  Gredler	  V,	  Schanda	  K,	  et	  al.	  Complement	  activating	  antibodies	  to	  myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein	  in	  neuromyelitis	  optica	  and	  related	  disorders.	  J	  Neuroinflammation	  2011;8:184.	  207.	   Rostásy	  K,	  Mader	  S,	  Hennes	  E,	  et	  al.	  Persisting	  myelin	  oligodendrocyte	  glycoprotein	  antibodies	  in	  aquaporin-­‐4	  antibody	  negative	  pediatric	  neuromyelitis	  optica.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2013;19:1052-­‐1059.	  208.	   Rostásy	  K,	  Mader	  S,	  Schanda	  K,	  et	  al.	  Anti–Myelin	  Oligodendrocyte	  Glycoprotein	  Antibodies	  in	  Pediatric	  Patients	  With	  Optic	  Neuritis.	  Archives	  of	  neurology	  2012;69:752-­‐756.	  209.	   Leite	  MI,	  Jacob	  S,	  Viegas	  S,	  et	  al.	  IgG1	  antibodies	  to	  acetylcholine	  receptors	  in	  ‘seronegative’myasthenia	  gravis.	  Brain	  :	  a	  journal	  of	  neurology	  2008;131:1940-­‐1952.	  	   106	  210.	   Weinshenker	  BG.	  Neuromyelitis	  optica	  is	  distinct	  from	  multiple	  sclerosis.	  Archives	  of	  neurology	  2007;64:899-­‐901.	  211.	   Mealy	  MA,	  Wingerchuk	  DM,	  Greenberg	  BM,	  Levy	  M.	  Epidemiology	  of	  neuromyelitis	  optica	  in	  the	  United	  States:	  a	  multicenter	  analysis.	  Archives	  of	  neurology	  2012;69:1176-­‐1180.	  212.	   Isobe	  N,	  Yonekawa	  T,	  Matsushita	  T,	  et	  al.	  Quantitative	  assays	  for	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  with	  subclass	  analysis	  in	  neuromyelitis	  optica.	  Multiple	  Sclerosis	  Journal	  2012;18:1541-­‐1551.	  213.	   Fujihara	  K.	  Comment:	  Sensitivity	  and	  clinical	  relevance	  of	  available	  anti-­‐aquaporin-­‐4	  antibody	  assays.	  Neurology	  2012;78:669-­‐669.	  	   107	  Appendix	  A:	  Optimized	  Anti-­‐Natalizumab	  Antibody	  Bridging	  Enzyme-­‐Linked	  Immunosorbent	  Assay	  (ELISA)	  Protocol	  	  MATERIALS:	  Natalizumab	  (Tysabri®)	  • 300	  mg/15ml	  =	  20	  mg/ml	  stock	  • 146kDa	  (146,000	  g/mol)	  • Stored	  at	  2-­‐8°C	  o To	  make	  a	  2mg/ml	  working	  stock	  solution:	  180μl	  PBS	  +	  20μl	  20	  mg/ml	  natalizumab	  =	  200μl	  2	  mg/ml	  natalizumab	  	  Biotinylated	  Natalizumab	  • 1.7	  mg/ml	  as	  measured	  by	  BCA	  Protein	  assay	  	  Streptavidin-­‐Horseradish	  Peroxidase	  (Pierce®	  High	  Sensitivity	  Streptavidin-­‐HRP)	  • Dilution:	  1:6000	  Assay	  buffer	  • Avoid	  addition	  of	  sodium	  azide	  to	  HRP	  diluent	  • Recommended	  diluent:	  1%	  bovine	  serum	  albumin	  (BSA),	  protease	  free,	  in	  1x	  phosphate-­‐buffered	  saline	  (PBS),	  pH	  7.2	  –	  7.4	  	  Substrate	  –	  o-­‐phenylenediamine	  dihydroxhloride	  (OPD),	  pH	  5.0	  • Working	  Concentration:	  1.0	  mg/ml	  in	  citrate/phosphate	  buffer	  • 10mg	  OPD	  tablets	  stored	  at	  4°C	  	   108	  • For	  2	  mg/ml	  OPD,	  dissolve	  two	  10mg	  OPD	  tablets	  in	  20ml	  citric/phosphate	  buffer	  • Prior	  to	  use,	  add	  10μl	  of	  30%	  (w/w)	  hydrogen	  peroxide	  (H2O2)	  	  Serum	  samples	  • For	  testing	  for	  anti-­‐natalizumab	  antibodies	  • Diluted	  1:10	  in	  assay	  buffer	  for	  ELISA	  	  ELISA	  Buffers:	  Coating	  buffer:	  • Sodium	  phosphate/BSA	  buffer	  –	  pH	  8.5	  o 0.1M	  Sodium	  phosphate,	  2ug/ml	  BSA	  (final	  concentration)	  o For	  500ml:	  7.098g	  Na2HPO4	  (sodium	  phosphate	  dibasic,	  anhydrous)	  +	  0.001g	  BSA	  in	  dH20	  (or	  10μl	  10%	  (w/v)	  BSA	  stock	  solution)	  	  Blocking	  buffer:	  • 0.1M	  Tris	  20%	  Sucrose	  –	  pH	  7.7	  o For	  100ml:	  1g	  sucrose	  +	  1.211g	  Tris	  base	  (or	  1.576g	  Tris-­‐HCl)	  in	  dH2O	  	  	  Assay	  Buffer	  • 1x	  PBS	  1%	  BSA	  –	  pH	  7.2	  o Made	  fresh	  before	  ELISA	  (Day	  2)	  o Dilute	  10%	  (w/v)	  BSA	  stock	  solution	  1:10	  in	  1x	  PBS	  o For	  40ml:	  36ml	  1x	  PBS	  (or	  3.6ml	  10x	  PBS	  +	  32.4ml	  dH2O)	  +	  4ml	  10%	  BSA	  	   109	  	  Wash	  Buffer	  • 1x	  PBS	  0.005%	  Tween	  20	  –	  pH7.2	  o For	  2.0L:	  1L	  1x	  PBS	  (200ml	  10x	  dPBS	  +	  1.8L	  dH2O)	  +	  1.0ml	  Tween	  20	  (added	  right	  before	  use)	  	  OPD	  Substrate	  Buffer	  • Citric/phosphate	  buffer,	  pH	  5.0	  o Citric	  Acid	  solution	  (0.1M):	  Dissolve	  1.921g	  in	  100ml	  dH2O	  o Sodium	  Phosphate	  dibasic	  solution	  (0.2M):	  Dissolve	  2.84g	  in	  100	  ml	  dH2O	  o For	  20ml	  citric/phosphate	  buffer:	  4.86ml	  citric	  acid	  solution	  +	  5.14ml	  phosphate	  solution	  +	  10ml	  dH2O	  § Add	  8μl	  H2O2	  to	  OPD-­‐buffer	  solution	  before	  use	  	  	  METHODS:	  	   SUMMARY:	  	   Coating:	  100μl/well	  0.25μg/ml	  natalizumab	  in	  coating	  buffer	  	   Blocking:	  200μl/well	  0.1M	  Tris	  20%	  sucrose	  	   Samples:	  100μl/well	  diluted	  1:10	  serum	  in	  assay	  buffer	  	   Biotinylated	  Protein:	  100μl/well	  1.5μg/ml	  natalizumab-­‐biotin	  in	  assay	  buffer	  	   SA-­‐HRP:	  100μl/well	  1:6000	  diluted	  enzyme	  in	  assay	  buffer	  	   OPD:	  200ul/well	  1.0mg/ml	  OPD	  in	  citrate/phosphate	  buffer	  	  	   110	  ELISA	  Day	  1	  1. Coat	  plate	  with	  natalizumab	  diluted	  in	  coating	  buffer	  (0.25μg/ml).	  Add	  100	  μl/well	  and	  incubate	  the	  plate	  (placed	  in	  a	  container	  with	  a	  moist	  paper	  towel)	  overnight	  at	  4°C.	  a. For	  15ml	  diluted	  antibody:	  15ml	  coating	  buffer	  +	  1.88μl	  natalizumab	  (2mg/ml	  stock)	  	  ELISA	  Day	  2	  2. Wash	  the	  plate	  4x	  with	  wash	  buffer	  (1x	  PBS-­‐Tween).	  3. Block	  plate	  200	  μl/well,	  for	  1	  hour	  at	  room	  temperature.	  4. Dilute	  patient	  sera	  1:10	  in	  assay	  buffer.	  5. Wash	  the	  plate	  4x	  with	  wash	  buffer.	  6. Add	  100μl	  of	  assay	  buffer	  or	  diluted	  sera	  as	  per	  the	  plate	  setup.	  Incubate	  at	  room	  temperature	  for	  1	  hour.	  	  7. Dilute	  biotinylated	  natalizumab	  to	  1.5	  μg/ml	  in	  assay	  buffer.	  a. For	  12	  ml/plate	  diluted	  natalizumab-­‐biotin:	  12ml	  assay	  buffer	  +	  10.6μl	  1.7	  mg/ml	  natalizumab-­‐biotin	  8. Wash	  the	  plate	  for	  30	  seconds	  4x	  with	  wash	  buffer.	  9. Add	  100	  μl/well	  diluted	  biotinylated	  natalizumab	  or	  assay	  buffer	  as	  indicated	  in	  plate	  setup.	  Incubate	  for	  1	  hour	  at	  room	  temperature.	  10. Dilute	  streptavidin-­‐horseradish	  peroxidase	  (SA-­‐HRP)	  1:6000	  in	  assay	  buffer.	  a. For	  12	  ml/plate	  diluted	  SA-­‐HRP:	  12ml	  assay	  buffer	  +	  2μl	  SA-­‐HRP	  11. Wash	  the	  plate	  for	  30	  seconds	  4x	  with	  wash	  buffer.	  	   111	  12. Add	  100	  μl/well	  diluted	  SA-­‐HRP	  or	  assay	  buffer	  as	  indicated	  in	  plate	  setup.	  Incubate	  for	  1	  hour	  at	  room	  temperature.	  13. Dilute	  OPD	  substrate	  tablets	  in	  citrate/phosphate	  buffer	  (1.0	  mg/ml	  OPD)	  and	  store	  in	  the	  dark.	  • Dissolve	  two	  10mg	  OPD	  tablet	  in	  20ml	  citric/phosphate	  buffer	  (4.86ml	  citric	  acid	  solution,	  5.14ml	  phosphate	  solution,	  and	  10ml	  dH2O)	  14. Wash	  the	  plate	  for	  30	  seconds	  4x	  with	  wash	  buffer.	  15. Before	  use,	  add	  8μl	  30%	  (w/v)	  H2O2	  to	  diluted	  OPD	  solution.	  Add	  200	  μl/well	  diluted	  OPD.	  Incubate	  for	  25	  minutes	  at	  room	  temperature	  in	  the	  dark.	  16. Read	  plate	  with	  colorimeter	  at	  405nm.	  	  	  	  


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items