Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

Single channel properties of the slow cardiac potassium current, IKs Werry, Daniel 2011

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata


24-ubc_2012_spring_werry_daniel.pdf [ 3.88MB ]
JSON: 24-1.0072396.json
JSON-LD: 24-1.0072396-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0072396-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0072396-rdf.json
Turtle: 24-1.0072396-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0072396-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0072396-source.json
Full Text

Full Text

SINGLE	CHANNEL	PROPERTIES	OF	THE	SLOW	CARDIAC	POTASSIUM CURRENT,	IKS by Daniel	Werry B.Sc.,	Queen’s	University,	2009  A	THESIS	SUBMITTED	IN	PARTIAL	FULFILLMENT	OF	THE	REQUIREMENTS	FOR	THE DEGREE	OF MASTER	OF	SCIENCE in The	Faculty	of	Graduate	Studies (Pharmacology	and	Therapeutics)  THE	UNIVERSITY	OF	BRITISH	COLUMBIA (Vancouver) November,	2011 ©	Daniel	Werry,	2011        Abstract The slow potassium current, IKs, abbreviates the cardiac action potential by repolarizing the  membrane to a resting state. Mutations in the pore‐forming IKs subunit, KCNQ1, cause long QT  syndrome type 1 (LQT1), which increases risk of fatal arrhythmia.  Despite the physiological and  clinical importance of IKs, little is known about the elementary events that underlie the unique  biophysical properties of the channel, and how these elementary events are altered in the face  of disease. This thesis investigates single channel recordings of IKs with and without mutations  that cause LQT1 using patch clamp electrophysiology. Single channel IKs is described by slow  and fast gating processes. The channel is slow to open, but flickers rapidly between open and  closed states in non‐deactivating bursts. Long latency periods to opening underlie the slow  activation of IKs at depolarized potentials. Channel activity is cyclic with periods of high activity  followed by quiescence, leading to an overall low open probability. The mean single channel  conductance was determined to be 3.2 pS and long‐lived subconductance levels coupled to  activation were observed. Single channel properties of IKs with LQT1 mutations in the S3 helix of  the voltage sensing domain in KCNQ1 were investigated to uncover pathogenic mechanisms at  the single molecule level. Open probability was reduced in loss‐of‐function mutations (D202H,  I204F and V205M) and increased in a unique gain‐of‐function mutation (S209F) that may cause  LQTS from a reduced number of functional channels at the cell surface. The mean duration of  open events correlated well with deactivation rate in all mutants and first latency to opening  determined activation rate.  From these results, we attributed the pathogenic mechanisms of  LQT1 mutations to alterations in the stability of specific channel states.  ii     Preface   In chapter 3, some of the IKs single channel records not shown but included in analysis, were collected by Dr. Z. Wang. Additionally, the endogenous currents were collected by Dr. Z. Wang. A version of this chapter will be submitted for publication.  In chapter 4, the whole cell recordings of S3 mutations, D202H, I204F and S209F were collected by Dr. Z. Wang. In addition, the D202H, I204F and S209F single channel records shown were collected by Dr. Z. Wang. I collected additional single channel records used in the analysis for D202H and I204F, and collected all records for V205M. A version of this chapter will be submitted for publication.  In chapter 4, some of the structural interpretations and conclusions from whole cell data are taken from the following published paper: Eldstrom,J., H.J.Xu, D.Werry, C.B.Kang, M.E.Loewen,  A.Degenhardt, S.Sanatani, G.F.Tibbits, C.Sanders, and D.Fedida. 2010. Mechanistic basis for  LQT1 caused by S3 mutations in the KCNQ1 subunit of I(Ks). J Gen Physiol 135:433‐448.           iii     Table of contents  Abstract ............................................................................................................................................ii  Preface ............................................................................................................................................ iii  Table of contents ............................................................................................................................ iv  List of tables .................................................................................................................................. viii  List of figures ................................................................................................................................... ix  List of abbreviations and symbols................................................................................................... xi  List of equations ............................................................................................................................. xii  Acknowledgements ....................................................................................................................... xiii  1   Introduction ............................................................................................................................. 1  1.1   Overview .......................................................................................................................... 1   1.2   Kv channel structure ......................................................................................................... 2   1.2.1   Topology of Kv channels ............................................................................................ 2   1.2.2   Structure of the pore domain ................................................................................... 4   1.2.3   Voltage sensing ......................................................................................................... 8   1.2.4   Electromechanical coupling .................................................................................... 11   1.3   Determinants of macroscopic current ........................................................................... 14   1.4   Single channel recordings .............................................................................................. 16  iv      1.4.1   Determinants of open probability .......................................................................... 17   1.4.2   Transitions near the open state .............................................................................. 20   1.4.3   Noise variance analysis ........................................................................................... 21   1.5   Kv activation models ....................................................................................................... 23   1.5.1  1.6   Long QT syndrome ......................................................................................................... 29   1.6.1  1.7   Congenital long QT syndrome ................................................................................ 29   The IKs potassium channel .............................................................................................. 32   1.7.1   Discovery of the molecular constituents of IKs ....................................................... 32   1.7.2   Modulation by KCNE1 ............................................................................................. 34   1.7.3   Single channel characterization of IKs so far ........................................................... 38   1.8  2   Modeling subconductance ...................................................................................... 27   Scope of the thesis ......................................................................................................... 40   Methods ................................................................................................................................. 42  2.1   Molecular biology ........................................................................................................... 42   2.2   Cell preparation and transfection .................................................................................. 42   2.3   Electrophysiological recordings ..................................................................................... 42   2.4   Whole cell recordings ..................................................................................................... 44   2.5   Single channel recordings .............................................................................................. 44   v     2.6  3   Single channel properties of wild type IKs .............................................................................. 48  3.1   Identification and characterization of single channel IKs ............................................... 48   3.1.1   Single channel conductance of WT IKs. ................................................................... 51   3.1.2   Voltage and time dependence of single channel Po. ............................................. 55   3.1.3   Long first latencies to opening account for slow activation. .................................. 57   3.1.4   There are multiple open and closed states visited during bursts. ......................... 57   3.1.5   IKs has multiple conductance levels. ........................................................................ 60   3.2  4   Data analysis ................................................................................................................... 45   Discussion of WT IKs single channel properties .............................................................. 62   Single channel IKs with long QT syndrome mutations ........................................................... 67  4.1   Single channel recordings from S3 domain LQTS mutants of KCNQ1 ........................... 71   4.1.1   D202H ..................................................................................................................... 71   4.1.2   I204F ........................................................................................................................ 73   4.1.3   V205M ..................................................................................................................... 75   4.1.4   S209F ....................................................................................................................... 77   4.2   Discussion of LQTS mutations in the S3 region of KCNQ1 ............................................. 79   4.2.1   Mutations in S3 have little impact on single channel conductance ....................... 80   4.2.2   Effect of S3 mutations on open probability ............................................................ 80   vi     5   4.2.3   Channel state stability determines kinetics ............................................................ 81   4.2.4   Structural interpretations ....................................................................................... 82   Concluding chapter ................................................................................................................ 87  5.1   Summary of WT single channel properties .................................................................... 87   5.1.1  5.2   Properties of single channel Iks with LQT1 mutations in the S3 helix ............................ 90   5.2.1  5.3   Implications of subconductance levels ................................................................... 88   Significance and interpretation of results from S3 mutations ............................... 91   Future work .................................................................................................................... 93   References .................................................................................................................................... 97           vii     List of tables  Table 4.1.WT single channel properties ....................................................................................... 70  Table 4.2. Summary of single channel properties of IKs with LQTS mutations. ............................ 79           viii     List of figures   Figure 1.1. Kv channel topology and structural arrangement ........................................................ 3  Figure 1.2. A crystal structure of the potassium channel, KcsA.. ................................................... 6  Figure 1.3. Stereo diagrams of the potassium channel pores and intracellular gates ................... 7  Figure 1.4. Models of voltage sensing. ......................................................................................... 10  Figure 1.5. Electromechanical coupling via the S4‐S5 linker to the activation gate.. .................. 12  Figure 1.6. A single channel recording from the Shaker Kv channel. ............................................ 20  Figure 1.7. A representation of the ZHA Shaker activation scheme. ............................................ 25  Figure 1.8. A representation of the ZHA model of Shaker activation........................................... 26  Figure 1.9. SS Shaker activation schematic. .................................................................................. 26  Figure 1.10. The electrocardiogram and cardiac action potential. .............................................. 31  Figure 1.11. KCNE1 binds to a cleft in KCNQ1 between a voltage sensor and the pore domain..37  Figure 2.1. Patch‐clamp configurations ........................................................................................ 43  Figure 3.1. Macroscopic IKs recorded from the whole‐cell patch clamp configuration. ............... 49  Figure 3.2. Single channel recordings of IKs................................................................................... 52  Figure 3.3. Single channel endogenous activity in mouse ltk‐ cells .............................................. 53  Figure 3.4. Amplitude histograms and single channel conductance ............................................ 54  Figure 3.5. Single channel open probability. ................................................................................ 56  Figure 3.6. Kinetics of channel activation and flickering .............................................................. 59  Figure 3.7. IKs has multiple conductance levels.. .......................................................................... 61  Figure 3.8 A 3 transition gating scheme for IKs ............................................................................. 65  ix     Figure 4.1. A homology model of the voltage sensing domain (S1‐S4) of KCNQ1 in the open state  based on the Kv1.2 structure (Long et al. 2005) ........................................................................... 68  Figure 4.2.  Properties of macroscopic WT and mutant IKs currents ............................................ 70  Figure 4.4. Single‐channel properties of D202H KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels .................. 72  Figure 4.5. Single‐channel I204F KCNQ1/KCNE1 mutant IKs traces and conductance ................. 74  Figure 4.6. Single‐channel properties of V205M KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels ................. 76  Figure 4.7. Single‐channel properties of S209F KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels ................... 78  Figure 4.8. KCNQ1 models predict D202 to form salt‐bridges in both the closed and the open  state .............................................................................................................................................. 83  Figure 4.9. Interactions of I204 and V205 in the closed and open state, respectively ................ 84  Figure 4.10. S209F selectively stabilizes the open state ............................................................... 86           x     List of abbreviations and symbols   g – macroscopic conductance  I – macroscopic current  i – single channel current   IKr – the rapid delayed rectifier potassium current in the heart  IKs – the slow delayed rectifier potassium current in the heart  KCNE1/minK – an obligatory single transmembrane subunit of the IKs channel complex  KCNQ1/ KvLQT/ Kv7.1–a Kv channel that carries IKs along with KCNE1  Kv – voltage‐gated potassium channel  LQT1 – Congenital long QT syndrome type 1, caused by mutations in KCNQ1  LQTS – long QT syndrome  Po – open probability  Q – charge  V – voltage   – single channel conductance    – time constant  xi     List of equations  Equation 1.1. Nernst equation ...................................................................................................... 14  Equation 1.2. Macroscopic Ohm’s Law ......................................................................................... 15  Equation 1.3. Microscopic Ohm’s law .......................................................................................... 15  Equation 1.4. Boltzmann function. ............................................................................................... 18  Equation 1.5. Two‐state Markov model ....................................................................................... 18  Equation 1.6. Transition rates ....................................................................................................... 18  Equation 1.7. Relative rates Po ...................................................................................................... 19  Equation 1.8. Relative time constants Po ...................................................................................... 19  Equation 1.9. Noise variance ........................................................................................................ 22  Equation 1.10. Modified HH Kv channel model ............................................................................ 23          xii     Acknowledgements  I would first like to thank my supervisor, David Fedida, for providing the guidance and tools to  complete this research.  I would also like to thank my fellow lab members who were valuable  resources of experience and expertise.  I owe much of the success of these experiments to  Zhuren Wang, who started the research that forms the foundation of this thesis. Jodene  Eldstrom helped guide my research throughout my Masters and provided valuable and much‐ appreciated intellectual support.  Hongjian Xu was particularly helpful for teaching me the  fundamental experimental methods used in this thesis.  Sam Goodchild was a valuable resource  for understanding and applying theory, as well as troubleshooting methods. And finally, thanks  to my fellow lab‐mates and graduate students for providing a friendly and supportive work  environment.       xiii     1 1.1  Introduction  Overview  Ion channels are integral membrane proteins that open their pores to pass ions across the   lipid bilayer in response to a ligand or voltage stimulus.  A wide array of ion channel types  enables exquisite and coordinated control over electrical signals in neurons, muscle and many  other cell types.  Voltage‐gated potassium (Kv) channels are chiefly responsible for repolarizing  the membrane from an excited state to a resting state, by selectively passing K+ from inside to  outside the cell.  The homo‐tetrameric structure of prototypical Kv channels, with four identical  subunits containing peripheral voltage sensors and a central pore, have been extensively  studied, but many questions remain about how voltage sensing is translated to gating (opening  and closing) of the pore. Compromising Kv channel gating by genetic mutations or  pharmacological agents can lead to many disorders such as epilepsy, episodic ataxia, malignant  hyperthermia, periodic paralysis long, QT syndrome, and sudden cardiac death (Ackerman and  Clapham, 1997).  Mutations in the Kv channel, KCNQ1, which in complex with KCNE1 is  responsible for the slow delayed rectifier current IKs, are the cause of one‐third  of all inherited  cases of long QT syndrome.  Therefore, a detailed understanding of the gating of the IKs channel  is important, and this forms the foundation of this thesis.  The purpose of this chapter is to  review our current understanding of Kv channel structure and gating with particular focus on  single channel recordings and the IKs channel.    1     1.2 1.2.1  Kv channel structure  Topology	of	Kv	channels  Kv channels are comprised of four identical subunits (MacKinnon, 1991), each with six  transmembrane (TM) segments, S1‐S6, flanked by cytosolic N and C termini (Figure 1.1A). The  subunits assemble to form 4 voltage sensors (S1‐S4) situated symmetrically on the periphery  around a central ion conducting pore (S5‐S6)(Figure 1.1B) (Long et al., 2005a). The  transmembrane segments are primarily α‐helices that lie approximately perpendicular to the  plane of the membrane and are each connected by intra and extracellular linkers of generally  disordered structure. The voltage sensors appear as nearly separate modules from the pore  domain, aside from a few critical contact points including the S4‐S5 linker (Lu et al., 2002). The  pore domain is comprised of an outer helix (S5), an inner helix (S6) and a pore helix that is  critical for the selectivity and conduction of ions (Doyle et al., 1998). The TM domains and the  cytoplasmic N and C termini are thought to be compartmentally separated from each other in a  ‘hanging gondola’ arrangement whereby the cytosolic termini hang below the TM domains by  thin 2nm long linkers that likely create ‘windows’ for lateral access of ions to the pore (Sokolova  et al., 2001)(Figure 1.1C).   Both the cytoplasmic and TM domains can complex with auxiliary subunits that can  dramatically alter channel gating (Dai et al., 2009; Pongs and Schwarz, 2010). Auxiliary subunits  are quite diverse, and can be transmembrane or intracellular subunits. In vivo, Kv channels can  exist as heteromultimers of α (pore‐forming) and β(auxiliary) subunits. In addition, α subunits  2     from different Kv channels may heteromultimerize, thus exponentially increasing the  complexity of ion channels (Gutman et al., 2005).     A                                             X4              B  C             Figure 1.1. Kv channel topology and structural arrangement. (A) Schematic of the topology   of a Kv channel α subunit. Each subunit has 6 transmembrane segments, and an intracellular N  and C terminus. (B) Stereoview of a ribbon representation viewed from the extracellular side   of the channel. Each subunit is coloured uniquely. Voltage sensing segments S1‐S4 are in the   periphery and S5 and S6 comprise the pore. The small sphere represents a potassium ion   (from (Long et al., 2005a) with permission). (C) A 3D structure of a Shaker channel generated   using electron microscopy viewed from the side in the plane of the membrane. The upper   module consists of transmembrane segments (S1‐S6) and the lower module, made up of the   N and C termini, hangs below by linkers. The separation between modules creates lateral   windows for possible potassium ion entry (from (Sokolova et al., 2001) with permission).       3     1.2.2  Structure	of	the	pore	domain  Armstrong (1971) provided experimental evidence that potassium channels form pores  by demonstrating blockade of the Shaker Kv channel with TEA+ derivatives (Armstrong, 1971).  Blockade was dependent on whether or not the channel was open to accommodate the large  organic cations.  After nearly 30 more years of functional data to support this hypothesis, in a  landmark study, Doyle et al (1998) presented a crystal structure of a prokaryotic potassium  channel, KcsA, which contains the conserved pore region but lacks the voltage sensors of  eukaryotic Kv channels (Figure 1.2A‐B) (Doyle et al., 1998). The KcsA pore is formed by four  subunits, each with an outer M1 (lipid facing) and inner M2 (pore facing) transmembrane α  helix, corresponding to S5 and S6 in Kv channels, respectively (Figure 1.2A).  Chimeric  substitution of the KcsA pore into the Shaker Kv channel as well as the inwardly‐rectifying Kir2.1  channel, produces functional channels and therefore demonstrates that the prokaryotic pore of  KcsA approximates those of eukaryotes and is broadly applicable to conduction and selectivity  mechanisms of K+ channels in general (Lu et al., 2001b).  Importantly, the KcsA structure helped answer how K+ channels can be so selectively  permeant to K+ versus the slightly smaller Na+ ion (~10,000:1), and yet exhibit a throughput rate  approaching the diffusion limit (Doyle et al., 1998).  The pore lining is mostly hydrophobic,  which limits interactions with the K+ ions and so avoids creating ion trapping energy wells. The  rate limiting step to permeation then, is crossing the selectivity filter, demarcated by the TXGYG  signature sequence towards the extracellular aspect of the inner helices (Figure 1.2B).  Two  dehydrated potassium ions separated by a water molecule can reside in the selectivity filter,  4     and a third K+ lies in a 10 Å diameter cavity in the center of the channel (Morais‐Cabral et al.,  2001). The cavity overcomes the electrostatic destabilization resulting from the low dielectric  bilayer by surrounding the cation with polarizable water.  In addition, the four pore helices  point their carboxyl termini at the cavity centre to stabilize the cation via a negative dipole  (Figure 1.2C) (Roux and MacKinnon, 1999). For the ion to pass through the selectivity filter it  must undergo dehydration, transfer and rehydration, all in about 10 nanoseconds (Morais‐ Cabral et al., 2001).  To accomplish this, at 2 of 4 sites in the selectivity filter, backbone carbonyl  oxygens take the place of the water oxygen atoms, requiring close contact with the ion.  The  filter is held open to prevent it from accommodating a smaller Na+ ion by an external aromatic  cuff of tryptophan and tyrosine residues (Figure 1.2C).  When a third potassium ion enters the  selectivity filter, the repulsive forces between cations overcome the attractive forces with the  carbonyl oxygens, shooting out a potassium ion on the opposite side.  Crystallography can only take snapshots of ion channels in a particular state; so in what  state is the KcsA structure?  The inner helices are tilted with respect to the membrane in an  upside‐down teepee configuration, with the helices converging at the so called ‘bundle‐ crossing’ to constrict the pore to a 4 Å separation with hydrophobic residues that present an  inhospitable environment to potassium ion entry (Figure 1.2B;(Doyle et al., 1998)).            5     A     B       C     D          Figure 1.2. A crystal structure of the potassium channel, KcsA. (A) Sequence conservation   among K+ channels. The pore region containing the TVGYG sequence is highly conserved across  potassium channels. (B) Transmembrane view of inner and outer helices.  Inner helices (S6 in Kv    channels) are tilted in an upside down teepee arrangement to converge at the intracellular  aspect. The pore helices contribute the selectivity filter with the GYG potassium selectivity    signature sequence. (C) Two potassium ions are coordinated by carbonyl groups in the selectivity  filter, while a third ion sits in a water‐filled central cavity. This ion is stabilized by its hydration    shell as well as the negative dipoles from the pore helices. (D) A network of aromatic residues  (the aromatic cuff) surrounds the selectivity filter, possibly providing structural rigidity. A‐D are    all from Doyle et al 1998 with permission.    In contrast, in the crystal structure of the calcium‐activated bacterial channel, MthK, the  inner helices are splayed wide open, with no apparent bundle crossing, and the aqueous central  cavity is accessible to the intracellular medium (Figure 1.3A) (Jiang et al., 2002). Therefore, the  KcsA structure is proposed to have a closed activation gate in contrast to the open MthK  channel. This gives us a structural interpretation of how the activation gate goes from a closed  to an open state (Kurata and Fedida, 2006). In the open MthK structure, the inner helices splay  open at a highly flexible conserved glycine.  It is proposed that the glycine residue functions as a  6     hinge to allow the inner helices comprising the activation gate to splay open upon channel  opening.  Variations of this gating mechanism likely exist among K+ channels like KCNQ1 (Kv7.1),  which has an alanine in place of the glycine.  Furthermore, mammalian Kv channels have a  conserved Pro‐X‐Pro sequence just below the glycine hinge that is missing in bacterial K+  channels such as KcsA and MthK.  The proline sequence introduces helical breaks that curve the  S6 inner helices to run almost parallel to the membrane near the intracellular surface (Figure  1.3B) (Long et al., 2005a), and is predicted to do so in both the closed and open states (Yellen,  2002). The structural divergence from bacterial channels imposed by the Pro‐X‐Pro motif raises  the question if the gating model based on the bacterial MthK and KcsA channels can be  extended to mammalian Kv channels (Swartz, 2004).       Figure 1.3. Stereo diagrams of different potassium channel pores and intracellular gates. (A)  The closed KcsA channel is in red, and the open MthK channel is in black.  The inner helices of  MthK are splayed open at a conserved glycine termed the ‘gating hinge’ (from (Jiang et al.,  2002), with permission. (B) A similar diagram as in A, but here KcsA is in black, KvAP is in blue,  and Kv1.2 is in red. Notice that Kv1.2 appears to have a second kink at the asterisk, attributable  to a Pro‐X‐Pro motif below the conserved glycine. From (Long et al., 2005a), with permission.      7     1.2.3  Voltage	sensing  In 1952, Hodgkin and Huxley were first to suggest that voltage‐sensitive changes in the  ionic permeability to K+ and Na+ depend on the movement of a charged component of the  membrane (Hodgkin and Huxley, 1952). This insightfully predicted the existence of gating  current: charge that is moved across the membrane in response to voltage, first recorded by  Armstrong and Bezanilla from Na+ channels in the squid giant axon (Armstrong and Bezanilla,  1973).  Measurements from gating currents suggest a single channel can move 12‐16 positive  charges outward across the electric field in response to voltage (Bezanilla, 2000). When  voltage‐gated channels were first cloned (Noda et al., 1984; Papazian et al., 1987; Tempel et al.,  1987), the S4 segments, with their positively charged arginine and lysine residues, (Figure 1.1A)  became the most likely candidates for this gating movement. This was supported by the  observation that mutations of positive charges in S4 segments produce a shallower current‐ voltage relation indicating a decrease in voltage sensitivity (Papazian et al., 1991). Further  support for S4 movement came from voltage clamp fluorimetry experiments  that reported on  environment changes around a fluorescent probe at the top of S4 (Mannuzzu et al., 1996; Cha  and Bezanilla, 1997).  The negative resting membrane potential of a cell keeps the voltage‐sensing S4 in the  non‐activated position, and depolarization drives the S4 segment to shuttle its positive charges  across the membrane electric field.  But the mechanism of how these charges are translocated  through the lipid bilayer is still a question of much debate.  From thermodynamic  considerations, moving charged particles through a lipid bilayer is energetically unfavorable.  To  8     reconcile this, models for voltage sensor function, such the ‘sliding helix’ (Catterall, 1986) and  the ‘helical screw’ (Guy and Seetharamulu, 1986) models propose that the S4 segment is  stabilized by forming sequential ion pairs with negatively charged residues in the S1‐S3  segments. Assuming that S4 is α‐helical, an upward screw‐like motion could ratchet the  arginines and lysines from one energetic minimum to another(Hille, 2001; Catterall, 2010)  (Figure 1.4A). It is now appreciated though that the S4 can exist as a 3‐10 helix with all of its  arginines facing one side (Payandeh et al., 2011; Villalba‐Galea et al., 2008) and so a lateral  translation of S4 rather than a screw‐like twist may underlie charge movement. In addition to  proteinacious contacts, aqueous contacts with water crevices formed around S4 (Yang and  Horn, 1995; Starace et al., 1997) likely help stabilize charges.  Water crevices and/or membrane  penetrations have the added benefit of focusing the electric field across a narrower membrane,  limiting the physical distance that the S4 segments need to be translocated for a given charge  movement.   The first crystal structure of a voltage‐gated K+ channel, KvAP, demonstrated that voltage  sensors lie peripheral to the pore and are able to move with respect to the pore because of  flexible linker attachments (Jiang et al., 2003a).  However, this structure suggests a strikingly  different mechanism of voltage sensor movement, termed the ‘paddle model’. The S4 and C‐ terminal half of S3 (S3b) form a putative paddle‐like structure that is suggested to make a >20 Å  movement through lipid, with very little shielding from surrounding segments (Figure 1.4B).   The energetic cost of S4 arginines facing lipid could be reduced by negatively charged  phospholipid head‐groups as well as access to a water penetration through the bilayer (Xu et  9     al., 2008; Moon and Fleming, 2011). However, the arrangement of the voltage domain  segments (S1‐S4) run nearly parallel to the membrane in the KvAP structure, which is at odds  with the canonical transmembrane orientation supported by a large body of experimental  evidence establishing the N terminus and S2‐S3 linker as intracellular, and the S1‐S2, S3‐S4  linkers as extracellular (for a review, see Ahern et al., 2004). It is proposed that the KvAP  structure may have been distorted by the large attached Fab fragments, and is therefore not in  a native conformation. This notion is corroborated by the Kv1.2 structure, crystallized in a  mixture of lipids and detergent, which shows voltage sensing segments in a more  transmembrane orientation (Long et al., 2005a). Therefore, the ‘paddle‐model’ has since been  mostly disregarded and instead the general consensus has converged once again onto the  ‘sliding‐helix’ model, or variants of it (Catterall, 1986; Catterall, 2010).   A    B      Figure 1.4. Models of voltage sensing. (A) In the ‘screw model’, un upward screw‐like    motion of the S4 segment enables basic residues to sequentially pair with acidic residues in  the other voltage sensing segments (From Catterall 2010), with permission. (B) In contrast,  the ‘paddle model’ positions the S4‐S3b (paddle) segments nearly parallel to the membrane,    and requires a large translocation to account for charge movement. From (Jiang et al.,  2003b), with permission.      A recent modification to the ‘sliding‐helix’ model is the idea of a gating charge transfer  center in voltage sensors that facilitates the movement of charge across the membrane field  10     (Tao et al., 2010). X‐ray crystallography and functional data from the Mackinnon lab has  identified the center as a rigid cyclic “cap” and two negatively charged amino acids that interact  with a positive charge.  The cyclic “cap” is formed by a highly conserved Phenylalanine residue  (F233 in Shaker), and is hypothesized to isolate the positively charged lysine in position 5 of S4  (K374 in Shaker) from the external aqueous environment in the open state. K374 is proposed to  interact electrostatically with conserved negative charges in S2 and S3, specifically E293 (S2)  and D316 (S3) in the Shaker channel. The importance of these interactions has been shown by a  strategy similar to intragenic suppression in Shaker. The neutralization mutation K374Q was  specifically rescued by second site neutralization mutations of E293Q and D316N, further  strengthening the case for a network of local electrostatic interactions (Papazian et al., 1995).   However, a recent study by Pless et al questions the electrostatic nature of these interactions  through the use of unnatural amino acid mutagenesis (Pless et al., 2011). Replacement of E293  and D316 with electrically neutral but sterically (or very nearly) equivalent residues had little  impact on the conductance‐voltage relationship. Therefore, the authors conclude, the presence  of a negative charge is not required for the stability of a particular channel state, suggesting  that the traditional ‘helical‐screw’ model awaits modifications.   1.2.4  Electromechanical	coupling  The crystal structure of Kv1.2 reveals that the voltage‐sensing domains make limited  physical contacts with the pore (Long et al., 2005a; Long et al., 2005b). In support of this, a  tryptophan and alanine scan at the interface between voltage‐sensing and pore domains did  11     not disrupt folding or dramatically alter voltage sensor movement (Soler‐Llavina et al., 2006).  However, some physical interaction is necessary to couple the mechanical motions of the  voltage sensor to the pore domain. Scanning mutagenesis and domain swap experiments  suggest an interaction between the S4‐S5 linker and the intracellular ends of the S5 and S6  segments that comprise the ‘activation gate’ (Lu et al., 2002).  The S4‐S5 linkers form a cuff  surrounding the S6‐lined pore and function to transmit the voltage‐sensitive movements of S4  to the inner helix bundle (activation gate) (Long et al., 2005b) (Figure 1.5).       A  B               Figure 1.5. Electromechanical coupling via the S4‐S5 linker to the activation gate. (A)  In the Kv1.2 crystal structure, the S4‐S5 linker is in close proximity with the  intracellular aspect of S6 comprising the activation gate. (B) model of the closed Kv1.2  channel based on the KcsA closed activation gate maintains contacts between the S4‐ S5 linker and lower S6. Both A and B are from (Long et al., 2005b), with permission.    The S4 and S4‐S5 helix may move as a unit and mediate pore opening through a  molecular hinge at the bottom of S5 (Payandeh et al., 2011).  As the S5 and S6 segments from  one subunit splay outward, other subunits may closely follow from tight structural coupling at   12     the pore domain, leading to a concerted opening. A second important interaction between the  voltage sensor domain and the pore domain exists at an interface between the top of S1 and  the pore‐helix (Lee et al., 2009). The S1 – pore helix interface may serve to brace the voltage  sensor against the pore to allow a more efficient transfer of force from the S4‐S5 linker to the  activation gate.  Opening of the activation gate at the intracellular aspect of the channel is  necessary but may not be sufficient to reach a conducting state. In KcsA, it is proposed that the  selectivity filter functions as a second gate in series with the activation gate, and must be in a  permissive conformation for ion conduction (Cordero‐Morales et al., 2006; Blunck et al., 2006).   The selectivity filter is thought to enter a non‐conductive state for instance during slow, or “C‐ type”, inactivation, but it is unclear if such a gating mechanism exists in Kv channels that  demonstrate little evidence of inactivation, such as the IKs channel .      The few available crystal structures of potassium channels provide a structural basis for   interpreting decades of functional data generated from the voltage‐clamp technique, whereby  one measures the ionic current through channels in response to transmembrane voltage. In  their seminal papers, Hodgkin and Huxley employed the voltage‐clamp technique to  characterize how the conductance of selective ions is altered in response to voltage,  forming  the basis of how we characterize the biophysical properties of ion channels today (Hodgkin et  al., 1952).         13     1.3  Determinants of macroscopic current  An ionic basis for membrane excitability was hypothesized by Julius Bernstein who   correctly proposed that the resting potential of a cell is maintained by a selective permeability  to K+ (Hille, 2001).  The direction of ion flow, inward or outward through the channel, is  determined by the sum of thermodynamic and electromagnetic forces on the ion. In  physiological conditions, the concentration gradient of K+, high inside and low outside the cell,  creates a diffusion potential (thermodynamic force) for the outward flow of K+ across the  membrane. When the membrane voltage is not clamped, the efflux of positive potassium ions  makes the inside of the cell more negative relative to the outside of the cell until the  membrane potential (electric field force) is negative enough to counteract the outward flow of  potassium. The membrane potential that exerts an equal and opposite force on the ion as the  diffusion potential, such that the net movement of K+ is zero, is known as the reversal potential.   If the channel of interest is very selective for K+, the reversal potential for known intracellular  and extracellular concentrations of K+ can be calculated by the Nernst equation:  Equation 1.1. Nernst equation  ln     Where EK is the reversal potential for potassium, R is the gas constant, T is temperature, F is  Faraday’s constant, and [K] is the concentration of potassium outside or inside the cell, as  denoted by the subscripts.     14     The membrane potential relative to the K+ reversal potential is the ‘driving force’ for the  flux of K+ (current). Throughout a voltage‐clamp experiment, the intracellular and extracellular  ion concentrations are usually kept constant to maintain a steady reversal potential (E) and  voltage (Vm) is controlled to determine the driving force.   How much current (I) flows for a  given driving force is dependent on the ease of flow of current, known as conductance (g). The  relationship between voltage, current and conductance is dictated by Ohm’s law:   Equation 1.2. Macroscopic Ohm’s Law       where I is current, gK is potassium conductance, Vm is membrane voltage, and EK is the reversal  potential for potassium.     When a channel opens it increases the conductance by creating a passageway for ionic  flux.  The incremental increase in conductance contributed by each open channel depends on  the single channel conductance, γ. Therefore, in a population of channels, the macroscopic  conductance, g, is determined by the number of channels that open with probability, Po, each  with a given γ.  Dissecting g into its single channel components yields a revised version of Ohm’s  law:  Equation 1.3. Microscopic Ohm’s law       Where N is the number of functional channels, Po is the open probability and γK is the single  channel conductance of a K+ channel.  15     By incorporating the contribution of single channels into Ohm’s law, we uncover the  ways in which macroscopic current can be altered. Namely, by changing N (by trafficking or  total protein expression), Po, γ, or driving force (by altering ion selectivity). The microscopic  version of Ohm’s law also illustrates that macroscopic current is the sum of elementary events  from a population of channels. Inherent in this law, is the assumption that the elementary  events arise from a homogenous population of channels that gate independently.  If this is true,  the average activity of a single channel over many recording sweeps, known as the ensemble  average, recapitulates the macroscopic current.      1.4  Single channel recordings  Neher and Sakmann, in their Nobel prize‐winning work, developed the patch‐clamp method   that revolutionized the study of ion channels (Neher and Sakmann, 1976). The formation of a  tight seal between a glass pipette and the cell membrane to electrically isolate a ‘patch’ is  critical to the success of the method (Hamill et al., 1981). Seals up to tens of giga‐ohms (GΩ)  can be achieved (a ‘gigaseal’) which dramatically reduces thermal (Johnson) background noise  to enable detection of small changes in conductance associated with the opening of single  channels.     Single channel recordings have produced several major findings (Hille, 2001). First, single  channels give rise to unitary steps in current (Neher et al., 1976). This observation confirmed  the hypothesis that ion channels open to discrete conductance states and that macroscopic  16     current flow results from the “superposition of elementary events” (Sakmann, 1992). Second,  the elementary events are generally large; converting a current step of several pico‐amps (pA)  corresponds to a throughput rate of approximately 10 million ions per second for a single  channel.  Such a high throughput could only be achieved by an aqueous pore mechanism, not a  carrier mechanism, and so this provided important information about the structural nature of  ion channels (Hille, 2001). Third, transitions between conductance levels are very rapid, beyond  the resolution of most recording systems. And fourth, gating transitions are stochastic; each  event (opening or closing) is random, independent of the previous event, and can be predicted  only in terms of probabilities.     1.4.1  Determinants	of	open	probability  The opening and closing of ion channels is a memoryless, stochastic process dictated by  probability. In Kv channels, the open probability (Po) is a function of time and voltage. Upon a  change in voltage, the Po equilibrates to a new steady state value (over time) determined by the  difference in free energy (G) between the closed and open states. The fraction of open  channels at equilibrium (relative to maximum) is proportional to the fraction of maximal  conductance (g/gmax) and can be predicted by a two‐state Boltzmann function (Equation 1.4).  Steady state values of macroscopic current are commonly fit with Boltzmann functions to  determine the voltage of half‐activation (V1/2).  Mutations that alter the V1/2 change the  energetic stability of channel states relative to each other, since G = zV1/2 (Ledwell and   17     Aldrich, 1999).  Therefore, shifts in the V1/2 provide information about the change in relative  energy (G) between resting (closed) and open states.    Equation 1.4. Boltzmann function.  1 1  ⁄     /  Where g is the conductance, V1/2 is the voltage of half activation, V is the membrane voltage,  and k is the slope factor equal to –zF/RT, where z = charge movement, F is Faraday’s constant, R  is the universal gas constant and T is temperature in Kelvin.           The kinetic stability of a channel state can be quantified from single channel recordings   by measuring the rate of exit from that state. Consider a channel that transitions between one  closed and one open state, with a forward rate constant α and reverse rate constant β.  For  voltage‐dependent transitions in Kv channels, α and β are assumed to be exponentially  dependent on voltage.  Increasing voltage accelerates transitions associated with net outward  positive charge movement and slows transitions associated with net inward positive charge  movement, and this forms the basis for how voltage determines activation and deactivation  kinetics.   Equation 1.5. Two‐state Markov model        O C    Equation 1.6. Transition rates      /     Where αo is the value of α at 0 mV; zα is the equivalent charge movement for the transition, F is  Faraday’s constant, R is the universal gas constant and T is absolute temperature    18     The probability that the channel will be in the open state (ie the Po) is a function of the  rate of entry into the open state α, relative to the rate of exit from the open state, β (Equation  1.9). Rate constants have dimensions of s‐1, and so   yields the mean time spent in the open  state before the next closing, known as the open dwell time constant, open (Colquhoun and  Sigworth, 1995). The frequency of open dwell times (from each open event) binned in discrete  intervals of time are distributed exponentially and can be fitted to determine openEquation 1.7  can then be re‐written as Equation 1.8.  Equation 1.7. Relative rates Po    .   Equation 1.8. Relative time constants Po         A shortening of open dwell time without a concomitant shortening of closed dwell time  causes a decrease in Po.  Note that the above equations are only used to illustrate the  relationship between the relative kinetic stability of channel states and Po. They are not  practically applied to determine Po because the gating of ion channels is considerably more  complex than the two‐state case. Instead, Po is simply measured as the fraction of total time  spent in the open state(s). Therefore, one can directly measure Po from single channel  recordings, in contrast to whole cell recordings.     19     1.4.2  Transitions	near	the	open	state  Single channel recordings give a direct glimpse of states at or near the open state. Upon  opening, many Kv channels rapidly flicker between open states and ‘nearby’ closed states in  what are termed ‘bursts’(Figure 1.6).     Figure 1.6. A single channel recording from the Shaker Kv channel. The recording was obtained  from the cell‐attached patch clamp configuration using ltk‐ cells transiently transfected with  Shaker cDNA. The trace filtered at 2 KHz, and filtered again offline to 500 Hz. The lower dotted  line is the closed level, and the upper dotted line is the open level.    The number of open and closed states visited during bursts can be examined by fitting  exponential functions to dwell time histograms.  The number of exponential functions that best  describe the dwell time distribution approximates the number of kinetically distinguishable  states. Using this method, Hoshi et al distinguished a single open state in the Shaker channel,  and up to 3 closed states that are frequently entered during bursts but which may not be  traversed in the activation of the channel (Hoshi et al., 1994).  The closed states, termed Cf, Ci,  and Cs for fast, intermediate, and slow states, respectively, were not found to significantly  contribute to the voltage and time dependence of activation. However, they still have  important functional consequences since the stability of these closed states relative to the open  20     state(s) determines the Po during bursts. Furthermore, if one or more of the closed states  occurs along a possible deactivation route (Schoppa and Sigworth, 1998a), then occupancy in  these states may influence deactivation rate.   The stability of a state determines its rate of exit, and so we expect open state stability  and open dwell time to underlie deactivation rate. However, open dwell times were found to  be voltage‐independent in Shaker, despite deactivation rate being voltage‐dependent (Hoshi et  al., 1994). Since mean open dwell times are dominated by the most frequent events, it is  possible that a voltage‐dependent transition from the open state exists but is infrequent  relative to other transitions and so was not detected from this analysis. Alternatively, the  voltage‐dependent step to deactivation occurs from a closed state. A destabilized open state  could still accelerate deactivation in this case, by increasing occupancy in the closed state from  which channels deactivate. Importantly, a voltage‐independent open dwell time implies that a  destabilized open state cannot be stabilized by voltage.  Therefore, mutations that destabilize  the open state relative to closed states visited during bursts cause a voltage‐independent  reduction in Po, effectively reducing the Po at all voltages.   1.4.3  Noise	variance	analysis  Attempts at uncovering the conductance of single channels before the advent of the  patch clamp technique relied on estimations of noise variance from populations of channels  (Katz and Miledi, 1971). Because single channels open stochastically, the number of channels  open varies at any given time point, giving rise to variance that is a function of the number of  21     channels (N), the open probability (Po) and the single channel current amplitude, i ( x driving  force).   Since variance depends on the same variables as macroscopic current (Equation 1.3), I  can be substituted for N to give the following expression with measurable quantities:   Equation 1.9. Noise variance  1     Where i is the single channel current, σ2 is the variance, I is the macroscopic current, and Po is  the open probability    When Po approaches zero, i is simply a function of the variance over I. The method of  solving i at a single time point where Po is near zero is known as stationary noise analysis.  Alternatively, one can extrapolate from a parabolic fit of variance versus total current, back to  the origin where Po is equal to zero, and take the slope as i, in the method known as  nonstationary noise variance analysis (Sigworth, 1980). In either case, both methods measure i  indirectly through estimations of variance and Po and therefore can lead to considerable error  and variability in results. In contrast, single channel recordings enable a direct measurement of  i.  Therefore, noise variance analysis is generally only used when single channels are difficult to  isolate in a patch, single channel openings are difficult to distinguish from noise, or in examining  small fluctuations in gating current. Interestingly, unitary conductance measured from single  channel records tend to be larger than when estimated from noise variance analysis. This may  be because in noise variance analysis it is impossible to distinguish between subconductance  levels (conductance levels lower than the ‘main’ conductance level) and the main conductance  22     levels, and larger bandwidths are needed to avoid biases from rapid interruptions of openings  (flickering) that could truncate the peak amplitude (Fenwick et al., 1982).     1.5  Kv activation models  Modern models of Kv channel activation are based on assumptions that there are   multiple kinetic and sequential transitions before opening and that identical transitions  correspond to conformational changes in each of four subunits. Support for multiple kinetic  transitions before opening first came from Hodgkin and Huxley who found that 4 identical  transitions could account for the delay before opening and sigmoidal activation of potassium  current in the squid giant axon (Hodgkin et al., 1952).  The rate constants for each transition  arising from separate subunits in a homotetrameric Kv channel would have to be related to the  number of subunits that have yet to undergo that transition by the following relationship:  Equation 1.10. Modified HH Kv channel model                                Where α is the forward rate constant for one subunit transition, and β is the reverse rate  constant for one subunit transition      The cloning of the Shaker potassium channel facilitated a thorough dissection of gating  transitions.  Zagotta, Hoshi and Aldrich (ZHA) tested a series of models that, based on the  known four‐fold symmetry of Kv channels, assumed independent and identical transitions from   23     each subunit.  The simple 4 transition HH model was discredited by an apparent 6 transition  minimum to account for the sigmoidicity of Shaker activation. Sigmoidicity is the relationship  between delay and rate of rise of current and is a function of the number of transitions and  their relative rates, but does not depend on the absolute rates (Zagotta et al., 1994b). With only  4 subunits, a 6 transition minimum necessitated at least 2 conformations per subunit.   Measurements of gating current provided further evidence for multiple transitions per  subunit, applying the principle that non‐identical transitions are expected to have different  voltage dependencies and associated charge movements. The method employed was to isolate  voltage‐dependent transitions along the activation pathway and measure the charge  contribution of each step, keeping in mind that the total charge movement was expected to be  ~ 13 eo per channel (Schoppa et al., 1992). The following evidence from gating currents points  to multiple types of kinetic transitions in the activation pathway: 1. “ON” and “OFF” gating  currents have a rising phase (only after large depolarizations for the OFF gating current), which  implies that the first kinetic steps in both activation and deactivation are slower or less voltage  dependent than subsequent steps (Bezanilla et al., 1991; Bezanilla et al., 1994). This could only  arise from different types of kinetic transitions because we would expect the first transitions to  be fastest if all transitions were identical (4α, followed by 3α, 2α etc or 4β, 3β etc). 2. The decay  of ON gating currents at intermediate voltages show a fast phase, followed by a slow phase  correlated with channel opening (Bezanilla et al., 1994), and ionic current at these voltages has  a short delay followed by a slow rise (Zagotta et al., 1994b), indicating that channel opening at  these voltages is slower than the rate at which the channel traverses through early closed  states. 3. The voltage dependence of charge movement is shallow at hyperpolarized voltages  24     but is steeper over the voltage range where the channel opens (Stefani et al., 1994); identical  transitions would be expected to have identical voltage dependence of charge movement.  Finally, components of charge in the charge‐voltage (QV) relationship are affected differently by  mutations in the S4 region (Schoppa et al., 1992; Perozo et al., 1994) suggesting different types  of voltage‐dependent conformational changes. All these observations point to multiple types of  kinetic transitions in addition to at least 6 transitions in total. With this in mind, ZHA proposed a  minimal model of 2 transitions per subunit; the transitions are coupled such that the 2nd cannot  occur before the 1st transition in each subunit. In this model, the channel becomes conductive  when all 4 subunits are in an open conformation, as is illustrated in the schematic (scheme ZHA)  (Figure 1.7) and model below (Figure 1.8).     Figure 1.7. A representation of the ZHA Shaker activation scheme. The channel opens after  each subunit undergoes two distinct transitions.         25     If we expand the schematic to view every state, we get the following model:     Figure 1.8. A representation of the ZHA model of Shaker activation. Transitions in the ‘x’ plane  represent the 1st subunit transition, whereas transitions in the ‘y’ plane represent the second  transition. The channel opens after all four subunits reach an open conformation. There is a  minimum of 8 transitions in this model, with a possible 14 kinetic states before opening.    Schoppa and Sigworth (SS) put the ZHA model and other models through rigorous tests  and ultimately proposed a considerably more complex gating scheme (Schoppa and Sigworth,  1998b). Instead of a 2 transition per subunit model, they propose 3 transitions per subunit,  followed by 2 concerted steps (Figure 1.9). The complexity of the SS model requires 3  dimensions to expand into individual states, and so is only represented as a schematic here:     Figure 1.9. SS Shaker activation schematic. A representation of the aptly named 3+2 SS  schematic for three transitions from each subunit followed by two concerted transitions for  channel opening.    26     Schoppa and Sigworth proposed this model from differentiating at least 3 types of  transitions by the magnitude of their charges over a wide voltage range, and from determining  that the final two transitions are qualitatively different from earlier transitions. The final  transition is very fast, and contributes to the fast reactivation time course, measured from the  rate of activation after a brief hyperpolarizing step to close channels from a depolarized state.  Also, the final two transitions have slower reversal rates because of the rising phase and slow  decay of Shaker off gating currents.  Support for a single concerted step to opening comes from  the ILT mutant in Shaker, which isolates the final cooperative step by making it rate‐limiting  (Ledwell et al., 1999; Smith‐Maxwell et al., 1998).  However, the gating charge from this step is  20 mV shifted from ionic current and displays more rapid kinetics, suggesting that the single  ‘concerted step’ isolated by the ILT mutant may be better described by multiple transitions  (Fedida and Hesketh, 2001).   1.5.1  Modeling	subconductance  The simple scenario of a single open state is challenged by observations of  subconductance levels in a variety of ion channels (Fox, 1987). Subconductance levels occur  when an ion channel dwells at amplitudes different (usually lower) from the ‘main’  conductance level. While there are multiple theories for how subconductance levels arise, the  most accepted and rigorously tested theory is based on partial activation of subunits (Liu et al.,  1996). In a homotetrameric Kv channel, opening of some but not all of the four subunits would  lead to a heteromeric pore conformation that is less conductive to potassium than if all the  27     subunits were in a permissive state.  Convincing evidence for this comes from experiments with  chimeric Kv channels composed of tandem dimers that link two K channel subunits with  different activation thresholds. Subconductance levels were seen at thresholds only expected  to activate some of the subunits (Chapman and VanDongen, 2005).   The requirement of cooperative steps to opening contradicts the proposed mechanism  that subconductance levels occur as a consequence of independent openings of subunits. A  likely compromise is partial cooperativity, whereby the 4 subunits can move independently, but  with a certain degree of cooperativity. Such movements have been detected using single  molecule fluorescence detection of KcsA channels labeled at the C‐terminus near the bundle  crossing (Blunck et al., 2008).  For the most part however, cooperative transitions have largely  been ignored in trying to place subconductance levels into canonical gating schemes, because  of the complications they introduce.  Due to the complex nature of the SS model (Figure 1.9),  the ZHA model (Figure 1.8) is more commonly used to interpret mechanisms of  subconductance. The strategy previously employed, has been to assign states within the ZHA  model as subconductance states. Chapman et al proposed that a channel can become  conducting after a single subunit has undergone its second transition (Chapman et al., 1997).   This refers to any state in Figure 1.8 with open circles (subunits).  The disadvantage of such a  model is that it drastically reduces the sigmoidicity of subconductance activation by reducing  the number of states the channel must transition through to open.  Although the sigmoidicity of  subconductance has not been measured in Shaker, it is unlikely to be much different from the  full conductance state since subconductance levels are not seen until immediately before full  28     conductance levels in Shaker and are therefore closely coupled to activation (Zheng and  Sigworth, 1998). With this in mind, Zheng and Sigworth proposed that the channel can conduct  only after all subunits have undergone the 1st transition, and one or more subunits undergo the  second transition to opening. This restricts subconductance states to the far right states in  Figure 1.8. The disadvantage of this model is that it also restricts particular subconductance  levels to single kinetic states. For instance, a subconductance level that has a fast and slow  component is not compatible with the Zheng and Sigworth model.  Therefore, a refinement of  existing gating models is needed to account for subconductance behavior.  Establishing gating models for Kv channels is important for providing a mechanistic basis  for interpreting functional and structural data. An intricate knowledge of each of these  disciplines; structure, function, and modeling greatly aids in our understanding of the  mechanisms behind ion channel pathologies such as long QT syndrome.    1.6 1.6.1  Long QT syndrome   Congenital	long	QT	syndrome  Congenital long QT syndrome (LQTS) is a familial arrhythmogenic disease caused by  mutations that disrupt the function of ion channels or ion channel‐related proteins. There are  13 subtypes of congenital LQTS categorized according to the culprit gene . LQTS type 1 (LQT1) is  caused by mutations in the KCNQ1 gene and is responsible for approximately one‐third of all  cases of congenital LQTS (Dufendach et al., 2011). The incidence of the disease is rare, but  29     affected individuals face a high mortality rate from increased risk of developing a polymorphic  ventricular tachycardia known as torsades de pointes (Ackerman et al., 1997).  LQTS is  diagnosed by a lengthened QT interval (>460 ms in women, and >440 ms in men) on an  electrocardiogram (ECG) (Napolitano et al., 2005)(Figure 1.10A). The ECG is a diagnostic tool  that measures the electrical activity of the whole heart through the placement of multiple  electrodes to the outer surface of the skin. The QRS complex is from depolarization of the  ventricular tissue, whereas the ST segment and T wave are from repolarization. Therefore, the  QT interval is the time for the ventricle to depolarize and repolarize.  Repolarization enables  cardiac muscle relaxation during diastole and prepares ion channels for the next wave of  depolarization.  Prolonging the QT interval, therefore, can create repolarization heterogeneity  within the heart leading to potentially fatal arrhythmia.  The sequence of depolarization and repolarization at the cellular level, that underlies  the electrical activity of the whole heart, is known as the cardiac action potential. The cardiac  action potential is generated by the influx and efflux of ions through several channels that open  and close with distinct timing, ion selectivity, and voltage sensitivity. At rest, pacemaker  channels (known as HCN channels) steadily depolarize the cell. Once the threshold potential for  the Nav1.5 channel opening is reached, Na+ rapidly enters the cell to rapidly depolarize the  membrane beyond 0 mV which sets off a coordinated cascade of activity from other voltage‐ gated channels (Figure 1.10B). A transient outward potassium current is activated (Ito carried by  Kv4.3) along with a sustained outward potassium current (IKur, carried by Kv1.5) that remains  active during inward Ca2+ flux (through Cav1.2); Ca2+ being the critical instigator of muscle  30     contraction. Subsequently, the rapid and slow delayed rectifiers, IKr and IKs, respectively, are  activated to return the membrane potential towards the reversal potential of potassium (Ek~‐ 85mV) and this potential is maintained by inwardly rectifying channels (Kir2.1) during diastole. A  return to the resting membrane potential abbreviates the action potential and is necessary for  recovery of previously inactivated Na+ channels for the generation of the next action potential.  Therefore, IKr and IKs are critical controllers of cellular excitability, and dysfunction in these  currents from mutations or drug blockade can slow repolarization with potentially fatal  consequences (Sanguinetti et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996).     Figure 1.10. The electrocardiogram and cardiac action potential. (A) An electrocardiogram  reports on electrical activity from the whole heart. The QT interval is used to diagnose long QT  syndrome. (B) The cardiomyocyte membrane potential (Vm) (above) changes in response to  ionic currents. The IKs current (below) contributes to repolarization, along with IKr.     31     1.7  The IKs potassium channel  The existence of the IKs current was first hypothesized by Noble and Tsien as a slow   second component to IK (Noble and Tsien, 1969) responsible for repolarization of the cardiac  action potential (Figure 1.10B). 21 years later, the existence of two components to IK was  confirmed by Sanguinetti and Jurkiewicz using the antiarrhythmic agent, E‐4031 to selectively  isolate the rapid component IKr, from the slow component of potassium current, IKs (Sanguinetti  and Jurkiewicz, 1990). The role of IKs as an important contributor to cardiac repolarization was  demonstrated by shortening the refractory period of the cardiac action potential by  Isoproterenol, a β‐receptor agonist that doubles the IKs current (Sanguinetti et al., 1991).   Interestingly, under basal conditions with no β‐adrenergic stimulation, IKs seems to make little  contribution to cardiac repolarization. It is only under two conditions that IKs becomes critical:  sympathetic activity and IKr block (Volders et al., 2003).  During sympathetic activity and/or IKr  blockade, a compromised IKs current substantially increases risk of fatal arrhythmias.   1.7.1  Discovery	of	the	molecular	constituents	of	IKs  The determination of the molecular constituents responsible for the IKs current has an  interesting history. The goal was to find a potassium channel that could recapitulate the  biophysical properties of IKs. The first such candidate came in the unlikely form of the single‐ transmembrane protein, minK, or ‘minimal potassium channel’, encoded by the KCNE1 gene.  Injection of KCNE1 cDNA in oocytes produces a slowly activating current termed ISK, the oocyte  equivalent of IKs (Hausdorff et al., 1991). That mutations in minK altered ion selectivity, open  32     channel blockade, and gating kinetics, further strengthened the hypothesis that minK is a  structural component of a potassium‐selective pore (Goldstein and Miller, 1991; Takumi et al.,  1991).   However, several pieces of evidence strongly argued against minK independently  forming a potassium channel. First, the single transmembrane structure was at complete odds  with what was known of Kv channel topology from other cloned channels. Second, expression  of the protein in many cell types did not result in current (Lesage et al., 1993). And third, the  magnitude of current associated with minK saturated despite increasing levels of the protein  (Blumenthal and Kaczmarek, 1994). Taken together, these data correctly argued that minK  (currently known as KCNE1) is a component of a potassium channel, along with another  subunit.   The complementary subunit to KCNE1 necessary to recapitulate the IKs current was  identified by Sanguinetti et al and Barhanin et al as KCNQ1 (Sanguinetti et al., 1996; Barhanin et  al., 1996). KCNQ1 is a Kv channel with the archetypical topology of 4 identical subunits, each  with six transmembrane segments (S1‐S6) (Figure 1.3).  On its own, KCNQ1 does not closely  recapitulate any known physiological potassium current, but in complex with KCNE1, the  resulting current is almost identical to cardiac IKs.  Importantly, mutations in KCNQ1 (previously  called KvLQT1) cause an inherited form of long‐QT syndrome (LQTS) that increases risk of  sudden death from cardiac arrhythmias (Wang et al., 1996).  Loss of function mutations in  KCNE1 have also been associated with LQTS (Splawski et al., 1997) and gain of function  mutations of KCNE1 and KCNQ1 have both been linked to atrial fibrillation and short‐QT  33     syndrome (Chen et al., 2003b; Ehrlich et al., 2005; Bellocq et al., 2004). The discovery of KCNQ1  and KCNE1 as the molecular constituents of IKs therefore underscores the physiological and  clinical importance of this cardiac current.   The discovery of KCNE1 as an auxiliary subunit to KCNQ1 raised the question of whether  such a partnership is unique to IKs, or whether regulation by similar transmembrane subunits is  common to Kv channels in general (Abbott et al., 2001).  Currently, four other KCNE proteins  have been cloned (KCNE1‐5) and the list of interacting Kv channels appears to be growing  (McCrossan and Abbott, 2004). The KCNE2 protein, for instance, is known to be particularly  promiscuous and has been proposed to interact with hERG (Abbott et al., 1999), Kv4.2 (Zhang et  al., 2001), Kv4.3 (Wu et al., 2010), Kv1.5 (Roepke et al., 2008) and KCNQ1 (Tinel et al., 2000),  with which it forms leak channels that are of particular importance in non‐excitable cells for  regulation of fluid secretion (Roepke et al., 2009; Roepke et al., 2010; Roepke et al., 2011).  KCNE1 has also been shown to interact with hERG (McDonald et al., 1997) but does not have  nearly the same impact on gating as with KCNQ1.    1.7.2  Modulation	by	KCNE1  KCNE1 dramatically slows the activation kinetics of KCNQ1, increases current amplitude,  and shifts the voltage dependence of activation towards more positive potentials to  recapitulate IKs‐like current (Sanguinetti et al., 1996; Barhanin et al., 1996). In addition, KCNE1 is  necessary for KCNQ1 to respond to β‐adrenergic stimulation (Kurokawa et al., 2003).  Specifically, the C‐terminus of KCNE1 is needed to facilitate the functional effects of KCNQ1 N‐ 34     terminus phosphorylation by PKA (Kurokawa et al., 2009). Also, the KCNE1 C‐terminus confers a  100‐fold increase in the sensitivity of KCNQ1 to phosphatidylinositol 4,5‐bisphosphate (PIP2) (Li  et al., 2011), which is an important activator of IKs (Loussouarn et al., 2003). Therefore KCNE1 is  integral to the function and modulation of IKs.  The stoichiometry of KCNE1 and KCNQ1 is still uncertain. Several studies have suggested  a fixed stoichiometry of 2 KCNE1 subunits per 4 KCNQ1 subunits (Wang and Goldstein, 1995),  (Chen et al., 2003a) with particularly convincing evidence coming from using KCNE1 subunits  modified with cysteines and iteratively counting them through chemical modification (Morin  and Kobertz, 2008). Such a stoichiometry could arise if KCNE1 complexes with dimerized KCNQ1  subunits. However, Nakajo et al recently proposed a dynamic stoichiometry of up to 4 KCNE1  subunits per channel from single molecule fluorescence bleaching experiments (Nakajo et al.,  2010). Further evidence for a dynamic stoichiometry comes from pulse‐chase experiments  showing that the KCNE1 turnover rate is faster than for KCNQ1 (Jiang et al., 2009). The four fold  symmetry of the channel (with four KCNQ1 subunits) may support a stoichiometry of up to 1:1,  since each KCNE1 could bind to one of four identical clefts between voltage sensors. However,  the NMR structure of KCNE1 is curved with extracellular α‐helices connected by linkers that  could span over multiple subunits and could therefore prevent binding of additional KCNE1  subunits (Kang et al., 2008).  Whether or not KCNE1 has a dynamic stoichiometry in the IKs  complex is physiologically important since IKs may be regulated by the number of KCNE1  subunits bound.    35     Computational work places the curved α‐helix of KCNE1 at a cleft between the voltage  sensing domains of KCNQ1, in a position expected to restrict movement of the S4‐S5 linker  (Figure 1.11)(Kang et al., 2008). In support for this positioning of KCNE1, several mutations in  KCNQ1 with phenotypes dependent on KCNE1 expression cluster to this cleft (Kang et al., 2008)  and the S4‐S5 linker (Chouabe et al., 2000; Franqueza et al., 1999). Two possible mechanisms  for slowing channel KCNQ1 activation arise from this positioning. KCNE1 either slows voltage  sensor movement, or slows coupling between voltage sensor movement and pore opening.  Support for the latter interpretation comes from recent voltage‐clamp fluorimetry reports on  S4 movement, showing that S4 was not significantly slowed by KCNE1 expression (Osteen et al.,  2010).     36       Figure 1.11. KCNE1 binds to a cleft in KCNQ1 between a voltage sensor and the pore domain.  The KCNE1 protein is shown in red, and each subunit of KCNQ1 is colored differently. The view  is from below, staring up the pore axis. This figure was generated with PYMOL software using  the model coordinates made available by Kang et al., 2008.     In addition to KCNE1 forming contacts with the KCNQ1 voltage‐sensing domain (Nakajo  and Kubo, 2007), experimental evidence employing cysteine mutagenesis supports interactions  with the pore domain and activation gate machinery (Lvov et al., 2010; Tapper and George, Jr.,  2001). For example, after engineering in cysteine residues, a disulphide bond can form between  KCNE1 and KCNQ1 S6 to lock the channel in the open state (Chung et al., 2009). Such  interactions with the KCNQ1 pore raise the interesting question of whether KCNE1 can increase  the single channel conductance of KCNQ1 to partly account for the increase in macroscopic  current.  To test this hypothesis, several groups attempted to characterize the single channel  37     properties of IKs.  In addition to answering how KCNE1 modulates the conductance of KCNQ1,  single channel characterization of IKs would give important information about the gating of this  ion channel complex.    1.7.3  Single	channel	characterization	of	IKs	so	far  Four groups attempted to characterize the single channel properties of IKs almost  immediately after the discovery of its molecular constituents with hopes of determining the  impact of KCNE1 on KCNQ1 single channel conductance.  However, isolating patches with single  channels of Iks or homomeric KCNQ1 proved very difficult because of an apparent tendency for  the channels to cluster together at the cell surface (Yang and Sigworth, 1998) and so noise  variance analysis was used instead (described in section 1.4.3). The first of such reports  proposed that KCNE1 decreases the single channel conductance of KCNQ1 from 7.6 pS to 0.58  pS, while increasing the number of functional channels 60x to account for the overall 4x  increase in macroscopic current (Romey et al., 1997). The following year, two companion  papers in the Journal of General Physiology proposed the exact opposite: KCNE1 increases the  single channel conductance of KCNQ1 4‐5 fold (Yang et al., 1998; Sesti and Goldstein, 1998). Yet  even the latter studies were in disagreement about the actual conductance of IKs; Sigworth’s  group calculated a 4.5 pS conductance for IKs at a 20 KHz bandwidth whereas Goldstein’s group  calculated a 16 pS conductance at 25 KHz.  The same year, another study measured the noise  variance from inward tail currents of IKs, giving a single channel conductance of 5.8 pS (Pusch,  1998). Since IKs shows slight inward rectification (Sesti et al., 1998), the estimate of 5.8 pS from  38     inward currents is in fairly close agreement with Yang and Sigworth’s estimation of 4.5 pS, who  measured the conductance from outward currents. While there are some discrepancies  between the findings from these groups, one consistent conclusion was that IKs exhibits flicker  activity so rapid that high bandwidths may be needed to resolve the true amplitude using noise  variance analysis.    In addition to noise variance analysis of macropatches, Yang and Sigworth were able to  obtain a few patches with a low enough number of channels (~3) to directly observe and  analyze single channel behavior (Yang et al., 1998). In one patch, they recorded putative single  channel activity of human IKs and found the conductance to be approximately 3 pS.  As well,  from a patch with ~ 3 channels of human KCNQ1 coexpressed with rat KCNE1, the 1st latency to  opening (time until first opening) was found to be responsible for the slow activation. However,  with only a few sweeps of putative single channel activity, Yang and Sigworth were unable to  analyze the kinetics of opening and closing during bursts.   The variable results from several groups, and the inability to obtain patches with single  channels, leaves many questions about the single channel properties of IKs. Clearly, additional  studies are needed to investigate the single channel behavior of this important ion channel  complex.        39     1.8     Scope of the thesis  The primary aim of the studies outlined in this thesis was to investigate the behavior of   the IKs current at the single channel level, and to assess how this behavior is altered by  mutations known to cause Long QT Syndrome.  Central to the success of this thesis, was our  ability to collect patches with either single channels of IKs or with a sufficiently low number of  channels to permit single channel analysis.  In the first chapter of the results, we examine the  elementary events that underlie the macroscopic biophysical properties of the channel.  Specifically, we characterize the time to first opening (1st latency), open probability (Po) and the  duration of occupancy in open and closed states during bursts as measures of channel state  stability. We report a similar single channel conductance as Yang and Sigworth (1998) but also  note that IKs nearly always opens first to sub‐amplitudes before reaching full opening, and can  revisit multiple amplitudes through the course of a depolarizing pulse.   Characterization of the single channel properties of the wild type (WT) channel forms the  basis for comparison with mutant channels. We examine four LQTS mutations located in the S3  transmembrane segment of KCNQ1. From whole cell patch clamp, we observe marked changes  in the voltage dependency of opening and the kinetics of activation and deactivation for each  mutation. To test hypotheses that we made from whole cell experiments, we recorded single  channel currents from these mutant channels and assessed the impact of the mutations on Po,  1st latency, and open and closed state occupancy during bursts. We found Po to reflect changes  in the voltage dependency of opening and mutations in the S3 region were capable of altering   40     open and closed state stability, suggesting an important role for the S3 helix in stabilizing  channel conformations.       41     2 2.1  Methods  Molecular biology   KCNQ1  and  KCNE1  genes  were  purchased  from  Origene  Technologies  (Rockville,  MD).   Mutations  within  the  third  transmembrane  (S3)  region  of  the  KCNQ1  gene  were  constructed  using two‐step PCR reactions and sequenced to verify presence of only the desired mutation.      2.2  Cell preparation and transfection   Electrophysiology was carried out on transiently transfected mouse ltk‐ cells grown in Minimal  Essential Medium (MEM) with 10% fetal bovine serum, at 37°C in an air/5% CO2 incubator. DNA  ratios of 1:2.5:1 in g of KCNQ1:KCNE1:GFP were combined with LipofectAMINE 2000 (Gibco‐ BRL) for transfection. One day before transfection, cells were plated onto sterile glass coverslips  in 35 mm Petri dishes with 20‐30% confluence.  On the day of transfection, cells were washed  once  with  MEM  with  10%  fetal  bovine  serum.  Recordings  were  made  48  hours  after  transfection.    2.3  Electrophysiological recordings   Two configurations of the patch clamp technique were used: cell‐attached and whole cell.  In  the  cell‐attached  configuration,  the  pipette  forms  a  giga‐seal  with  the  membrane,  electrically  isolating the patch from the rest of the cell.  This enables the experimenter to record current  42     only from the patch, and thus is necessary for recording from single channels. In the whole cell  configuration, the experimenter goes one step further and ruptures the patch (with suction and  voltage) to gain electrical access to the whole cell.  From this configuration, the experimenter  records from thousands of channels simultaneously. Other patch‐clamp configurations, namely  inside‐out and outside‐in were not used for the experiments in this thesis. Briefly, an inside‐out  configuration results from pulling the patch off from the cell from the cell‐attached mode, and  the  outside‐in  configuration  results  from  pulling  the  patch  off  from  the  whole‐cell  configuration.  For  a  more  detailed  explanation,  see  the  seminal  paper  by  Hamill  et  al  that  introduced  these  techniques  (Hamill  et  al.,  1981).  The  diagram  below  outlines  a  simplified  procedure for obtaining cell‐attached and whole‐cell patch‐clamp configurations:     Figure 2.1. Patch‐clamp configurations. A low resistance seal is formed by pressing the pipette  against the cell. Suction facilitates formation of a high resistance ‘giga‐seal’ from which one can  record single channels. Rupturing the patch with further suction and usually negative voltage  enables electrical access to the whole cell and its plethora of ion channels.          43     2.4   Whole cell recordings  Coverslips  containing  cells  were  removed  from  the  incubator  before  experiments  and   placed in a superfusion chamber (volume of 250 µl) containing the control bath solution at 35°C  and  perfused  continuously  with  bathing  solution  heated  to  35°C  by  an  inline  heater  (Warner  Instruments).  Whole  cell  current  recording  and  data  analysis  were  done  using  an  Axo‐  patch  200B  clamp  amplifier  and  pClamp  8  and  10  software  (MDS  Analytical  Technologies).  Patch  electrodes  were  fabricated  using  thin‐walled  borosilicate  glass  (World  Precision  Instruments,  Inc.).  Electrodes  had  resistances  of  1–2  MΩ  when  filled  with  control  filling  solution.  Capacity  compensation and 80% series resistance compensation were used in all whole cell recordings.  No leak subtraction was used when recording currents, and 0 current levels are denoted by the  dashed  lines  in  the  current  panels.  Data  were  sampled  at  10  kHz  and  filtered  at  2  kHz.  Membrane  potentials  have  not  been  corrected  for  small  liquid  junction  potentials  between  bath  and  pipette  solutions.  Action  potential  (AP)  protocol  was  generated  using  LabHEART  version 4.9.5. Patch pipettes contained (in mM): 130 KCl, 5 EGTA, 1 MgCl, 10 HEPES, 4 Na ATP,  and 0.1 GTP, adjusted to pH 7.2 with KOH. The bath solution contained (in mM): 135 NaCl, 5  KCl, 10 HEPES, 2.8 sodium acetate, 1 MgCl, and 1 CaCl, adjusted to pH 7.4 with NaOH.     2.5  Single channel recordings  Coverslips  containing  cells  were  removed  from  the  incubator  before  experiments  and   placed in a chamber (volume 250 l) containing the control bath solution at room temperature  44     (20‐22C). Single‐channel currents were recorded in the cell‐attached patch configuration with  an Axopatch 200B patch clamp amplifier and pClamp 8 software (Molecular Devices Inc.).  Patch  electrodes  were  fabricated  using  thin‐walled  borosilicate  glass  (World  Precision  Instruments;  FL)  and  coated  with  Sylgard  (Dow  Corning).    Electrodes  had  a  resistance  measured  with  recording  solutions  of  ~10‐25  MΩ.    The  patch  pipettes  contained  (in  mM):  NaCl,  135;  KCl,  5;  HEPES,  10;  MgCl2,  1;  CaCl2,  1;  and  was  adjusted  to  pH  7.4  with  NaOH.    The  bath  solution  contained  (in  mM):  KCl,  135;  MgCl2,  1;  CaCl2,  1;  HEPES,  10;  and  was  adjusted  to  pH  7.4  with  KOH.  The single channel currents were low‐pass filtered at 2 kHz (‐3dB, 4‐pole Bessel filter) and  sampled  at  10  kHz.  No  junction  potential  correction  was  done  on  data  acquired  in  the  cell‐ attached recording.    2.6  Data analysis  The primary disadvantage of single channel recordings is the time it takes to analyze the   results (Colquhoun et al., 1995). One reason for this is the measurable quantities are random  variables and thus many events are needed to determine their underlying distribution. The  analysis technique for analyzing single channel events used in this thesis is the 50% threshold  technique (Colquhoun et al., 1995). For the 50% threshold technique, the experimenter defines  what the perceived full amplitude open level is, and sets the threshold to be 50% of this level.  When the current trace crosses this level, it is perceived as an event. Full amplitude levels can  be determined by all‐points histograms, or in clear cases, by the human eye. All‐points  histograms are useful because they do not plot user‐defined idealized events, but rather they  45     sample ‘points’ from the raw data at some defined interval of time, and plot these in bins.  However, all‐points histograms cannot distinguish between noise and events, and therefore the  resulting histograms may not accurately reflect the underlying unitary events. The 50%  threshold technique can be automated by pClamp software (Molecular Devices Inc.) so single  channel events can be analyzed rapidly. However, the software cannot distinguish between  noise and real events, and so is prone to error.  If the single channel current traces have a low  signal to noise ratio (noisy, small conductance, or both) then automated analysis may be  inappropriate. Such was the case for the single channel recordings in this thesis, and so manual  event detection was used. Aside from the obvious disadvantage of being very time‐consuming,  manual event detection introduces subjectivity to the analysis and so human bias is a concern.  However, the trained human eye is remarkably good at distinguishing noise blips, which tend to  occur in regular patterns, from real events, and so manual analysis is preferred with a low signal  to noise ratio.  Single channel records were analyzed with pClamp 10 software (Molecular Devices Inc.)  after digital filtering at 200 Hz. Capacitive currents were removed by subtracting the average of  sweeps obtained at the same voltage that showed no channel activity (i.e., blank or “null”  sweeps).  Some restrictions were placed on including events in the analysis.  Specifically, events  shorter than twice the rise time (Tr) of the system were ignored for amplitude analysis. The Tr is  defined as the time between the 10% and 90% amplitude points of the transition in the output  of the filter. Therefore, an event must be longer than the Tr to reach its full amplitude, and  twice the Tr is more conservative. Given a combined analogue and digital filter frequency of 199  Hz (fc), the rise time (Tr) of the system was calculated to be 1.7 ms using the formula 0.332/fc.  46     The dead‐time (Td) of the system is also a function of filter frequency, and is defined as the time  between the 0% level and 50% amplitude points of the transition, or in other words, is the time  it takes to reach the threshold line to be considered an event. Events shorter than Td will likely  be missed entirely.  The Td was calculated as 0.54 x Tr = 0.9 ms (Colquhoun et al., 1995) and  events shorter than 2 x Td were not considered for dwell time analysis.  Histograms of dwell time, amplitude, ensemble time courses and first latency to  opening were constructed from events detected from half‐amplitude threshold analysis using  pClamp 10 software (Molecular Devices Inc.). Only openings from single channels were  analyzed for kinetics, but in patches with evidence of more than one channel, corrections were  applied for Po and first latency distributions (Aldrich et al., 1983). The choice of the number of  components used for fitting was based on a maximum likelihood technique, in which the least  number of components with a significant improvement was used (Colquhoun et al., 1995).  To  determine the voltage of half maximal activation (whole cell) and Po (single channel), data was  fit with a single Boltzmann function (Equation 1.4). Data are expressed as mean ± SEM with the  number of the cells (n) equal to three or more, unless otherwise stated. All statistical tests were  performed using GraphPad Prism 4.0. A p value of < 0.05 was used as a threshold for statistical  significance. Molecular structures were generated from published atomic coordinates, using  PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3.        47     3  Single channel properties of wild type IKs  Studies of single channel IKs using noise variance analysis have revealed that KCNE1   increases the unitary conductance of KCNQ1 three to five fold (Yang et al., 1998; Sesti et al.,  1998; Pusch, 1998). However, the reported conductance of IKs varies from 3 pS to 16 pS  depending on the study and experimental conditions, and so remains controversial.  Furthermore, due to the difficulty of obtaining patches with only one IKs channel, these studies  relied on measurements from multi‐channel patches, and therefore much about the kinetics  and gating behavior of the channel remains to be elucidated. Here, we present recordings of IKs  from single channel patches and report on the properties important for recapitulation of the  macroscopic current. In doing so, we provide insight into the gating mechanisms of this  important ion channel complex.   3.1  Identification and characterization of single channel IKs  Identification of patches with single channels of IKs was facilitated by previous   characterization of putative single channel activity (Yang et al., 1998), as well as our  expectations of a channel that slowly activates at positive membrane potentials from the  macroscopic current (Figure 3.1)   48       Figure 3.1. Macroscopic IKs recorded from the whole‐cell patch clamp configuration. (A) The  cell membrane was voltage clamped at a holding potential of ‐80 mV and depolarized from ‐40  mV to +70 mV in 10 mV intervals for 2 seconds, followed by a 1 second repolarization to – 50  mV. (B) An isochronal plot of the peak tail current at ‐50 mV versus the depolarizing pulse  potential, fitted with a single Boltzmann function to yield a voltage of half activation of 23 mV.  Note that this data was recorded at 35 °C whereas subsequent single channel data was  recorded at room temperature.    Under our transfection conditions, approximately 1 in 4 patches contained IKs, but only a  few of the hundreds of patches we recorded from contained a single channel. This supports  previous speculation (Yang et al., 1998) that IKs channels cluster together at the cell surface and  unfortunately makes the collection of single channel records very difficult. In a representative  single channel patch, the IKs channel opened slowly (after a few seconds) at 60 mV and rapidly  flickered in bursts for the remainder of the depolarizing pulse (Figure 3.2). Usually the channels  entered sublevels (0.1 pA‐0.25 pA) subsequent to reaching larger amplitudes around 0.5 pA.  Upon repolarization to – 40mV, small outward current could occasionally be seen (Figure 3.2A,  2nd sweep from bottom), consistent with a reversal potential well below ‐40mV, and in the  range expected for the potassium selectivity of IKs (Sanguinetti et al., 1990).   49     It is likely that the stubbornness of the channel to open initially and then to stop burst  activity once open, underlies the slow continuous activation seen in macroscopic IKs. To test if  the single channel current can recapitulate macroscopic IKs, we averaged together 100 sweeps  from the single channel patch.  The resulting ensemble average current exhibited macroscopic  IKs kinetics, giving strong evidence that the single channel activity is in fact IKs (Figure 3.2B). The  low amplitude of the ensemble average current (maximum 0.06 pA) is a reflection of the large  number of quiet sweeps in this patch (84 blanks).  This was particularly quiescent for IKs activity,  but gives us confidence that there was only one channel in the patch. The combination of  amplitude, flicker kinetics, outward tail current and ensemble average behavior were used to  identify IKs from endogenous channels, which tended to display larger amplitudes, slower  kinetics and inward tail current (Figure 3.3).  As further support that we were recording single channel IKs, the selective blocker  Chromanol 293B eliminated channel activity within seconds of bath application (Figure 3.2C,D).   Kinetic (Seebohm et al., 2001) and structural (Lerche et al., 2007) studies suggest that  Chromanol 293B is an open channel blocker that binds to the IKs inner pore vestibule and the  lower part of the selectivity filter, necessitating that the compound enters from the intracellular  side. Indeed,  50 μM bath applied Chromanol 293B (IC50 of ~5 uM (Busch et al., 1996)) was able  to pass through the cell membrane and completely inhibit a macropatch containing tens of  channels with clear IKs kinetics, externally isolated from the bath solution by the pipette tip  (Figure 3.2C).  Similarly, 50 μM Chromanol 293B completely inhibited any IKs‐ like single channel  activity (Figure 3.2D).  We used a concentration expected to completely abolish IKs channel  50     activity because partial channel block would be difficult to distinguish between stochastic  decreases in Po at the single channel level.    3.1.1  Single	channel	conductance	of	WT	IKs.  Current amplitudes of idealized events collected from setting a single 50% threshold to  opening, showed prominent mean open levels at ~ 0.15 pA and 0.46  0.008 pA at 60 mV  (Figure 3.4A). We were restricted to setting a single threshold to opening because sublevels  could not be reliably distinguished from noise in all but our lowest noise recordings. Therefore,  we only analyzed open events larger than the threshold (0.25 pA) for the majority of our data.  From this analysis, we calculated a mean conductance of 3.2 pS (Figure 3.4B).  This value agrees  closely with that of Yang and Sigworth (Yang et al., 1998), but diverges significantly from other  estimates which range from 0.58 pS (Romey et al., 1997) to 16 pS (Sesti et al., 1998). To test  whether filtering at 200 Hz led to an underestimation of conductance by truncating high  frequency components (Yang et al., 1998), we compared all‐points histograms constructed  from traces recorded at 60 mV and filtered at 200 Hz or 1000 Hz.  The peak amplitude was the  same in each histogram (Figure 3.4C), suggesting that 3.2 pS is a correct estimate of IKs single  channel conductance.   51     Figure 3.2. Single channel recordings of IKs. (A) In response to 60 mV depolarizing pulses, A  single IKs channel had a long latency to opening and flickered until repolarization at ‐40 mV.   Here, we show six out of one‐hundred sweeps from a cell‐attached patch. (B) All one‐hundred  sweeps from the same cell as in A were averaged to yield the ensemble average current, which  has clear IKs kinetics.  The low average amplitude reflects the large proportion of quiet sweeps.  (C,D) Single channel IKs block by Chromanol 293B. (C) Current from a multi‐channel cell‐attached  patch showing clear IKs kinetics was completely inhibited after applying 50 μM Chromanol 293B  to the extracellular bath solution. (D) 50 μM Chromanol blocked single channel activity from a  different patch than in C.          52          Figure 3.3. Single channel endogenous activity in mouse ltk‐ cells. Recordings were performed  on untransfected mouse ltk‐ cells in the cell attached configuration.  A)   Five successive sweeps  from the same patch, with endogenous channel activity elicited from the protocol shown at the  bottom.  The solid and short dashed lines denote the zero current and single channel opening  level, respectively.   Note the long‐lived openings during depolarisations and the inward  channel openings at ‐40 mV repolarization potential.  (B) The ensemble‐averaged currents of  100 successive recordings from the same patch as in A.  (C) Diary plot of the single channel first  latency in the recording.  Latency values of 0 s correspond to the recording in which no channel  opens.  (D) Diary plot of the time‐averaged open probability of the channel.  (E) Open dwell‐ time histogram of endogenous channels.  The superimposed smooth curve is a fitting of a  triple‐exponential function with the time constants indicated.  (F) Closed dwell‐time histogram  of endogenous channels.  A double‐exponential fitting is superimposed with the time constants  indicated.      53       Figure 3.4. Amplitude histograms and single channel conductance. (A) Amplitude histogram of  idealized events from 100 sweeps at 60 mV. There are 3 peaks corresponding to closed (0pA),  sub‐open (~0.1 pA) and full open (0.45 pA) amplitudes. Averaging together full open amplitudes  from 5 different patches yields a mean full open amplitude of 0.46 ± 0.008 pA at 60 mV. (B)  Mean full open open amplitudes for several voltages were plotted and fitted linearly with a  slope conductance (ϒ) of 3.2 pS and an extrapolated reversal potential consistent with  potassium selectivity. n>3 for each voltage. (D) All‐points amplitude histograms of WT IKs  activity at 60 mV filtered at 1000 Hz (black) or 200 Hz (white). Both histograms are constructed  from the same single sweep which showed little evidence of subconductance. The peaks  overlap each other suggesting that filtering to 200 Hz does not change the apparent amplitude  significantly from filtering at 1000 Hz.      54     3.1.2  Voltage	and	time	dependence	of	single	channel	Po.  We measured the voltage dependence of Po, applying the principle that single channel Po  and macroscopic current should share the same voltage dependence if channels gate  independently and are relatively homogenous. Channel openings were rarely seen at 0 mV,  occasionally at 20 mV, became more frequent at 40 mV and reached near maximal activity at  60 and 80 mV (Figure 3.5A). We measured the sweep averaged Po from idealized waveforms at  100 ms time intervals during 4 second pulses to different depolarizing voltages (Figure 3.5B). A  single Boltzmann fitted to the mean Po after 4 s versus voltage, yielded a voltage of half‐ maximal Po of 47 mV (Figure 3.5C).  Although a V1/2 of activation of 47 mV is considerably right‐ shifted from whole cell measurements at 35 ⁰C (Figure 3.1) (Eldstrom et al., 2010), it is  consistent with a strong dependence of IKs activation on temperature (Imredy et al., 2008).   However, our estimate of the voltage dependence of Po is a rough approximation because  traces at each voltage in Figure 3.5A are from different patches and some patches contained  multiple channels. In representative patches, the average Po at 60 and 80 mV reached up to ~  0.15 after 4 seconds and showed no signs of saturating (Figure 3.5B).  While a Po of 0.15 at 4  seconds is quite low, it is consistent with a steady rise in the macroscopic IKs well beyond 4  seconds (Tzounopoulos et al., 1998). The low Po was attributable to the high fraction of  quiescent sweeps at all voltages.  Over the course of 100 sweeps of 60mV pulses for 4 seconds,  it was typical for many successive sweeps to have very little channel activity (Figure 3.5D).   However, in active sweeps, the time‐averaged Po reached up to 0.6 reflecting the relatively  high Po achieved once the channel opens due to sustained burst activity.   55       Figure 3.5. Single channel open probability. (A) Three representative traces for each indicated  voltage, demonstrating increased single channel activity with depolarization. (B) After  idealization, the sweep‐averaged Po of a representative patch at each voltage was plotted  versus time during the depolarizing pulse. The Po’s for 40, 60 and 80 mV were measured from  patches with an estimated 1‐3 channels, but the Po’s for 0 and 20 mV are from patches with >4  channels so enough events could be recorded. For each patch, the number of channels was  estimated by dividing the maximum current reached at 60 mV, by the mean open single  channel amplitude. Po was then corrected by dividing by the number of estimated channels. (C)  The mean Po’s at the end of each depolarizing voltage step were fit with a single Boltzmann  function yielding a voltage of half‐maximal Po of 47 mV (n=1 for 0 mV, 2 for 20 mV, 3 for 40 mV,  4 for 60 mV, and 2 for 80 mV). (D) Representative diary plot of the time‐averaged open  probability during 4 seconds of 60 mV depolarizations. Po values of zero correspond to sweeps  with no activity. Periods of high activity are clustered together and separated by long periods of  low activity. Active sweeps reached up to a mean Po of nearly 0.6.    56     3.1.3  Long	first	latencies	to	opening	account	for	slow	activation.  In active sweeps, the channels opened after long latency periods (typically 1‐3 seconds)  at depolarizations to 60 mV (Figure 3.6A).  The step‐wise cumulative latency distribution scaled  by a factor of 0.75, superimposed well with the ensemble time course of Po (noisy trace)  (Figure 3.6B).  This implies that once the channel opens, it has a ~ 75% chance of staying open.  When we take into consideration that the channel flickers between open and closed states in  bursts, this means the probability of the burst continuing to the end of the depolarizing pulse is  considerably higher than 75%. Note that the initial rising phase of the ensemble Po (1‐2  seconds, Figure 3.6B) is slightly higher than the latency distribution. We suggest that there is  significant sublevel contribution to early activation that was not picked up in our single  threshold idealization analysis to determine first latency. Beyond the initial rising phase, the  cumulative latency distribution fits well with the ensemble time‐course of Po. Therefore we  extend the finding by Yang and Sigworth (Yang et al., 1998), made in a hybrid channel of rat  KCNE1 and human KCNQ1, that the main determinant of slow activation in human IKs (with both  human KCNQ1 and KCNE1) is the  long first latency to opening.    3.1.4  There	are	multiple	open	and	closed	states	visited	during	bursts.  Upon opening, the channels rapidly flickered between open and closed levels. Closed  event durations grouped in 1 ms bins were consistently best fit with fast (Cf), intermediate (Ci)  and slow (Cs) components, corresponding to mean time constants of 1.3 ± 0.3 ms, 7.1 ± 0.8 ms  and 50.9 ± 9.0 ms, respectively (Figure 3.6C). Although infrequently visited, the Cs state can be  57     seen in the recordings as interruptions in burst activity, whereas the Ci and Cf states contribute  to rapid flickering within the bursts (Figure 3.2A). Open events were best fit with two  exponential components which yielded mean time constants of 14.3 ± 2.7 ms and 47.0 ± 8.2 ms  at 60 mV (Figure 3.6D). Given a dead time of 0.9 ms for a 200 Hz bandwidth, many of the Cf  events went undetected, likely leading to a large over‐estimation in the open dwell times  (Colquhoun et al., 1995). Nonetheless, the presence of two components to fit open dwell times  suggests that there are at least two distinct open states. Either the open states are kinetically  different, or fluctuation between open levels without closing is responsible for the apparent  longer component to opening.         58       Figure 3.6. Kinetics of channel activation and flickering.  (A) Diary plot of first latency to  opening in a single channel patch. Latency values of zero correspond to sweeps with no channel  openings. (B) The ensemble mean time course of open probability at 60 mV (noisy trace),  approximated by dividing the ensemble average of 100 sweeps of a single channel recording by  the mean open amplitude to the larger level (0.45pA). The superimposed step‐wise curve is the  first latency distribution, scaled by a factor of 0.75. All data from A and B are from the same  patch, which exhibited relatively low activity but gives us confidence there was only one  channel. (C) Open events were binned in 1 ms intervals according to closed dwell time and fit  with 3 exponential components, giving the mean time constants shown. (D) Open dwell times  were best fit with 2 exponential components, giving mean time constants shown. n=5 for C and  D.        59     3.1.5  IKs	has	multiple	conductance	levels.  Subconductance levels are theorized to be a consequence of heteromeric pore  conformations, whereby only some of the subunits are in a permissive state, resulting in a  partial opening of the pore (Chapman et al., 1997; Chapman et al., 2005).  From nearly all the  traces, it is evident that IKs has at least one open sublevel in addition to the larger ‘main’ level  (Figure 3.2A). However, from our lowest noise recordings, the channel appears to visit up to 5  amplitudes through the course of a single burst (Figure 3.7A). The amplitudes of each putative  open level appear well described by discrete intervals of ~0.13 pA at 60 mV, suggesting that the  fluctuations in amplitude are not just from stochastic variability. To gain evidence for the  number of conductance levels, we constructed amplitude histograms from idealized waveforms  and low noise traces filtered at 200 Hz.  All‐points histograms are limited in their capacity to  distinguish conductance levels because of over‐lapping noise, whereas idealization by setting 5  half‐amplitude thresholds biases amplitudes away from the thresholds and towards predicted  peak amplitudes (Figure 3.7C). From these histograms, we suggest that IKs has 3‐5 conductance  levels. With the caveat in mind that 5 conductance levels is an upper estimate, we proceeded  with event idealization using 5 thresholds to examine the contribution of sublevel(s) and full  level(s) to channel activation and burst behavior. The first opening to the smallest conductance  level nearly always preceded openings to larger levels (Figure 3.7D), with the trace in panel B of  Figure 3.7 as a rare exception.  This indicates that the small sublevel occurs earliest in the  activation pathway. Interestingly the channel frequently re‐entered sublevels from larger open  levels during the course of a burst.  During deactivation, at least 2 open levels could be  60     distinguished (Figure 3.7B), with the smaller level often traversed before complete channel  closure. Therefore, sublevels appeared to occur as part of both activation and deactivation  pathways. We do not exclude the possibility that there are more than two conductance levels  traversed during deactivation because they may have been too similar in amplitude to  distinguish at ‐40 mV.      Figure 3.7. IKs has multiple conductance levels. (A) Low noise traces exhibit up to 5  conductance levels during activation that occur in intervals of 0.13 pA at 60 mV, with the  exception of the largest conductance level. (B) At least 2 conductance levels can be seen during  deactivation at ‐40 mV, as indicated by the arrows. (C) An all‐points amplitude histogram (grey)  with a superimposed amplitude histogram (black) constructed from events idealized by setting  5 separate 50% thresholds corresponding to the amplitudes seen in A. (D) Cumulative first  latency probability distribution for each of 5 putative levels shows that the smallest  conductance level (level 1) occurs earliest, followed by each larger level in turn.       61      3.2  Discussion of WT IKs single channel properties  Single channel recordings of IKs reveal the stochastic behavior underlying the macroscopic   current.  Slow activation can be attributed to single channels accumulating in non‐deactivating  burst states after long latency periods (Figure 3.6A).  Long periods of quiescence in between  sweeps of high activity underlie the low overall Po (Figure 3.5), and suggest that channels can  enter ‘dormant’ closed states particularly resistant to activation. The dormant state may be an  alternative ‘gating mode’ of the channel similar to what is seen for sodium (Zhou et al., 1991),  calcium (Yue et al., 1990) and potassium channels (Chakrapani et al., 2011), and may be  influenced by turnover of molecules that modulate IKs activity, like PIP2 , ATP, PKA or  calmodulin (Loussouarn et al., 2003; Marx et al., 2002; Li et al., 2011; Shamgar et al., 2006).  While necessary for recapitulation of macroscopic IKs, the very low Po and long latency to  opening of IKs seemingly undermine effective repolarization of the cardiac membrane. However,  it is likely that the open probability of the channel, just like the activation rate (Marx et al.,  2002) (and thus first latency to opening), can be dramatically increased in the face of  sympathetic stimulation when IKs function becomes most prominent (Volders et al., 2003).  The burst behavior of IKs is characterized by flickering between multiple open and closed  states (Figure 3.6C,D). From exponential fits of closed dwell times, we see three kinetically  distinct closed states during burst activity  that resemble the fast (Cf), intermediate (Ci) and slow  (Cs) closed states, described in the Shaker channel (Hoshi et al., 1994; Schoppa et al., 1998a). At  present, we do not know if these closed states lie in the activation/deactivation pathway.  The  molecular basis for short closures is not known, but they have been suggested to arise from  62     ions dwelling in the selectivity filter binding sites (VanDongen, 2004; Choe et al., 2001; Cordero‐ Morales et al., 2006). Our measurements of mean open durations were longer (Figure 3.6D)  than anticipated from a channel that rapidly flickers, but we did not correct for missed closed  events. In addition, open levels appeared to transition from one to another without closing,  which may account for the longer of two open dwell time components.   Our report of a mean full conductance level of 3.2 pS (Figure 3.4B) confirms the findings  of Yang and Sigworth, who estimated a conductance of 3 pS at 200 Hz (Yang et al., 1998).  However, attributing a single conductance to IKs does not accurately describe the channel’s  behavior.  There was clear evidence for at least one long‐lived subconductance level, usually  entered prior to the fully open levels (Figure 3.2A, Figure 3.7A). An experimentally supported  mechanistic interpretation for subconductance levels is that partial cooperativity between  pore‐forming subunits enables some, but not all the subunits to reach a conducting  conformation (Chapman et al., 2005).  The partial openings may originate from the bundle  crossing (Blunck et al., 2008) or the selectivity filter (Zheng and Sigworth, 1997; VanDongen,  2004).  Subconductance levels have been observed in a variety of channels (Fox, 1987) but are  generally very short‐lived (Zheng et al., 2001).  It is surprising, then, that the smallest  conductance level in IKs often persisted for hundreds of milliseconds before entering larger  open states (Figure 3.7).  Either there is low cooperativity between subunits in IKs or there is  slow coupling between the final steps of activation.  Support for either of these interpretations  comes from channel hetero‐dimers and a slow‐gating Kv2.1 mutant with long‐lived  subconductance levels (Chapman et al., 2005; Shang et al., 2009; Chapman et al., 1997).  63     From examining low noise traces and amplitude histograms (Figure 3.7A‐C), we suggest  that there are between 3 and 5 conductance levels for IKs.  Up to 5 conductance levels can be  rationalized in a tetrameric channel if the number and arrangement of activated subunits  determines the conductance (Liu et al., 1996; Chapman et al., 1997). The arrangement of  activated subunits may be important in the case of two active subunits that are either adjacent  or opposite to each other (Chapman et al., 1997; Zheng et al., 1998). We would expect the  smaller subconductance levels to occur earliest in the activation pathway if they result from  fewer activated subunits. Indeed, the larger conductance levels had longer latencies to first  opening (Figure 3.7D) and the smallest subconductance level was traversed at least 75% of the  time before reaching the larger levels. We suspect that occasionally subconductance levels  were traversed too quickly to be detected in the analysis. Therefore, our observations of  subconductance levels in IKs are consistent with a subunit‐based mechanism, whereby sublevel  states are coupled to activation and traversed en route to full conductance levels.   The smallest sublevel (~0.1‐0.25 pA) was much longer‐lived before the channel reached  larger open levels than after (142 ± 34 ms vs 12.2 ± 2 ms, respectively).  Therefore, we  hypothesize that the stability of the sublevel is dependent on the activation state of the non‐ conducting subunits.  After large open levels are reached, all the subunits are either in open  conformations or in closed states near opening so the channel dwells only briefly at the  subconductance level when it is revisited in the same burst.   Efforts to place subconductance levels into a canonical 2 transition per subunit gating  scheme (Zagotta et al., 1994a) have differed in whether or not they assume that all four  64     subunits have to undergo the 1st transition, commonly interpreted as voltage sensor  movement, before a single subunit can become permissive to ions (Chapman et al., 1997;  Zheng et al., 1998). That all 4 voltage sensors must move before the IKs channel can open has  recently been suggested from fluorescence reports of KCNQ1 S4 movement when in complex  with KCNE1 (Osteen et al., 2010).  To reconcile the dependence of subconductance stability on  subunit activation state with a requirement for all four voltage sensors to move, a third  transition to opening is required, intermediate to voltage sensor movement and pore opening.  Therefore, we propose the following scheme for opening: a minimum of 3 transitions from each  subunit that can independently lead to opening:     Figure 3.8. A 3 transition gating scheme for IKs. Each subunit undergoes three transitions  before opening. Opening for each subunit can occur independently but there is likely some  cooperativity between subunits. The open amplitude is a function of how many subunits are in  the open conformation.    This gating scheme differs from a previously proposed model of Shaker activation with 3  transitions per subunit (Schoppa et al., 1998b; Schoppa et al., 1998a) (see section 1.4.3) in that  there are no concerted steps to opening because of the prominent display of subconductance  levels.  We cannot rule out that subconductance levels occur as a consequence of successive  concerted transitions through open states. However, we found from empirical modeling that if  65     more than two open states are sequentially transitioned during channel closure, it creates a  delay in deactivation that is not seen experimentally.               66     4  Single channel IKs with long QT syndrome mutations  Of the 13 ion channel or related gene mutations that cause congenital long QT syndrome   (LQTS), mutations in KCNQ1 (LQT1) comprise ~ one‐third of all cases (Dufendach et al.,  2011)(see section 1.6.1). Hundreds of pathogenic mutations have been identified in KCNQ1  through genetic screening, but only a subset of these mutations have been biophysically  characterized to determine their molecular mechanisms of pathogenicity. In particular, the S3  region of KCNQ1 harbors several LQT1 mutations that highlight this region as a functionally  important component of the voltage sensing domain.  The primary function of S3 is to catalyze  the movement of the charge‐carrying S4 helix in response to voltage. However, the interactions  and movements of the S3 segment in KCNQ1 that are critical to achieving this function are not  known.  We have previously characterized the macroscopic biophysical properties of several  naturally occurring LQTS mutations located in the S3 region of KCNQ1 (Eldstrom et al., 2010).  The mutations D202H, I204F and S209F were identified from the Inherited Arrhythmias  Database ( and V205M was recently discovered to be present in  high frequency, ~1:125 (Jackson et al., 2011), in a First Nations founder population located in  Northern British Columbia (Arbour et al., 2008). The sequence homology with other ion  channels is shown and the locations of these mutations  in the S3 helix are mapped to an open  state model of KCNQ1 in Figure 4.1 (Smith et al., 2007). The sequence alignment shows that  each residue shares some level of conservation with other channels. The identity of D202 is  highly conserved, I204 and V205M are in a hydrophobic region and hydroxyl‐containing   67     residues are common at position 209. In the open state model, D202, V205M and S209 all face  S2 whereas I204 faces S4.     Figure 4.1. Sequence alignment and homology model of the voltage sensing domain (S1‐S4) of  KCNQ1 in the open state based on the Kv1.2 structure (Long et al. 2005). (A) Sequence  alignment of S3 region between KCNQ1 and other channels with residues of interest colored  according to B. (B) A homology model with the transmembrane helices each colored differently:  S1 (blue), S2 (green), S3 (yellow) and S4 (orange). Side‐chains in S3 that cause LQTS when  mutated and are discussed in this thesis are shown in stick form. This figure was generated  using PyMOL from coordinates given in Kang et al., 2008.    From whole cell recordings in transiently transfected ltk‐ cells, D202H, I204F and V205M  all demonstrated loss‐of‐function phenotypes with right‐shifted voltage dependencies of  opening and accelerated deactivation (Figure 4.2). However the extent to which activation or  deactivation was altered was unique to each mutant.  D202H deactivated most rapidly but the  time course of activation was accelerated relative to WT, whereas I204F and V205M activated  slowly (Figure 4.3).  S209F had a gain‐of‐function phenotype from a biophysical standpoint; the  conductance‐voltage (gV) relationship was left‐shifted and deactivation was markedly slowed.   68     This mutation is thought to cause LQTS from a reduction in the number of functional channels  expressed at the cell surface, that despite the biophysical gain of function, results in a net  decrease in IKs (Eldstrom et al., 2010).     Figure 4.2.  Properties of macroscopic WT and mutant IKs currents.  Data are from whole cell  recordings at 35⁰C of IKs expressed in ltk‐ cells. (A) WT IKs whole cell current elicited from the  inset voltage step protocol, and the corresponding conductance – voltage relationship. (B)  Macroscopic IKs currents formed from S3 mutant KCNQ1 and WT KCNE1, using the voltage  protocol as shown in A. (C) Conductance – voltage relationships for mutants in B.            69     A summary of the effects of voltage dependence and activation and deactivation rates relative  to WT is provided in Figure 4.3, which is modified from Eldstrom et al., 2010.     Figure 4.3. Summary of whole cell properties of LQT1 mutants relative to WT. Activation and  deactivation time constants are expressed as a fold change from WT. Modified from (Eldstrom  et al., 2010)     Single channel recordings provide a direct view of channel states that are otherwise   hidden in macroscopic currents. Therefore, we sought to extend our study of the S3 domain  mutants in order to establish whether conclusions we made regarding mutational effects on  open and closed state stabilities were supported by behavior at the single channel level.  Here  we report for the first time, single channel recordings from IKs expressed in mammalian cells  made up from KCNQ1 subunits with LQTS mutations in the S3 region.  For comparison with  mutant properties, a summary of the single channel properties of WT IKs is provided in Table  4.1.   Table 4.1.WT single channel properties       70     4.1  Single channel recordings from S3 domain LQTS mutants of KCNQ1   4.1.1  D202H     The aspartate at amino acid position 202 (D202) in KCNQ1, is a highly conserved and   functionally important residue in S3, evidenced by LQTS‐causing mutations with severe  biophysical defects (Eldstrom et al., 2010).  At the macroscopic level, IKs currents from D202H‐ KCNQ1 and KCNE1 have an approximately 30 mV right‐shifted voltage dependence from WT, a  decreased macroscopic current density and very rapid deactivation (Eldstrom et al., 2010)  (Figure 4.2 and Figure 4.3). During a 4 s depolarizing pulse to +60mV, single channels from  D202H IKs opened less frequently than WT (Po = 0.07 ± 0.04 at 4s) (Figure 4.4A, E and F) but to a  similar single channel amplitude (Figure 4.4C), consistent with our expectations of a mutation in  the voltage‐sensing domain that affects Po but not single channel conductance (Planells‐Cases  et al., 1995). Interestingly, D202H did not appear to share the same obligation as WT to  continue in bursts until the end of the depolarizing pulse; bursts were often seen to shut‐off  mid‐depolarization, without re‐opening (Figure 4.4A, 2nd and 5th sweep from top). From active  sweeps, the average first latency to opening was slightly accelerated relative to WT (Fig.6D) and  from both the whole cell current (Figure 4.2B) and the ensemble average (Figure 4.4B), D202H  appeared to activate with less sigmoidicity than WT IKs. There was little evidence of channel  opening at ‐40mV and the ensemble average shows little evidence of tail current, consistent  with the rapid deactivation observed from whole cell recordings.  To test if the rapid  deactivation can be explained by open state destabilization, we measured the duration of open  events and compared these to WT. Indeed, the mean open dwell times for both the short and  71     long‐lived components were reduced to only one‐third of WT (Figure 4.4G, Table 4.2).  Interestingly, all three closed components were about twice as long as WT (Figure 4.4H, Table  4.2).     Figure 4.4. Single‐channel properties of D202H KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels. (A)  Six  successive sweeps from the same patch, showing less frequent openings than the WT channel.   (B) The ensemble‐averaged currents of 100 successive recordings from the same patch as in A,  showing a time course resembling that of macroscopic D202H IKs current.  (C) Idealized  amplitude histogram. The mean amplitude for the larger peaks was 0.45 ± 0.02 pA at 60 mV (D)  Diary plot of the single channel first latency to opening versus sweep number. (E) Diary plot of  the time‐averaged open probability of the channel. (F) Ensemble averaged open probability  from 100 successive sweeps during 4 s depolarizing pulses to 60 mV. Event histograms of open  (G) and closed (H) dwell times best fit with exponential components yielding the time constants  indicated.        72      4.1.2  I204F     The voltage dependence of opening for I204F is right‐shifted ~40 mV from WT, and the   current is very slow to activate (Figure 4.2). Since the channels are only partially activated at  +60 mV, we expected the Po of I204F at 60 mV to be significantly less than WT. Furthermore,  the very slow activation of this channel is suggestive of longer first latencies to opening, since  this is the primary determinant of activation in IKs (Figure 3.6) (Yang et al., 1998).  The single  channel data strongly support both of these assumptions. I204F had a Po five times less than  WT (0.04 ± 0.01 at 4 s), with many quiescent sweeps and long first latencies to opening in active  sweeps (Figure 4.5A, B, D‐F). Interestingly, the open amplitude appeared slightly lower than WT  at 0.43 pA, but any difference was not significant (Figure 4.5C). The open‐dwell times were  reduced to half that of WT (Figure 4.5G), consistent with accelerated deactivation seen at the  whole cell level (Figure 4.3),(Eldstrom et al., 2010).  The closed dwell times were best fit with  only two components (as opposed to three for WT) possibly because channel activity was too  infrequent to detect a significant number of long‐lived closed events. Of the components we  were able to fit, the mean closed dwell times were similar to WT (Figure 4.5H) (p>0.05).   73       Figure 4.5. Single‐channel I204F KCNQ1/KCNE1 mutant IKs traces and conductance.  (A)  Six  successive sweeps from the same patch, showing very long first latencies and lower open  probability than the WT channel.  (B) The ensemble‐averaged currents of 100 successive  recordings from the same patch as in A, showing a time course resembling that of macroscopic  I204F IKs current.  (C) Idealized amplitude histogram. The mean amplitude for the larger peaks  was 0.43 ± 0.03 pA at 60 mV. (D) Diary plot of the single channel first latency to opening versus  sweep number. (E) Diary plot of the time‐averaged open probability of the channel. (F)  Ensemble averaged open probability from 100 successive sweeps during 4 s depolarizing pulses  to 60 mV. Event histograms of open (G) and closed (H) dwell times best fit with exponential  components yielding the time constants indicated. (n=3)     74     4.1.3  V205M     The KCNQ1 V205M mutation is present in high frequency in a remote, northern   Canadian First Nations community, and therefore is of particular clinical interest.  Macroscopically, V205M has a similar phenotype as I204F, with a comparable rate of  deactivation. However the right‐shift in voltage dependence and slowing of activation rate are  less severe for V205M than I204F (Figure 4.2).  The Po for V205M at 60 mV was approximately  half that of WT (0.12 ± 0.05 at 4 s) and the first latency to opening was marginally delayed  (Figure 4.6). Similar to I204F, the single channel amplitude at 60mV was slightly lower than WT  at 0.41 pA (Figure 4.6C). Interestingly, the kinetics of opening and closing during bursts were  also very similar for V205M and I204F.  V205M open dwell times were half as long as WT  (Figure 4.6G) and a long component to the closed dwell times could not be fit (Figure 4.6H).   Since we obtained less noisy records for V205M than the other S3 mutations, the evidence for  subconductance levels is most clear  (see Figure 4.6A, 3rd sweep from top). Subconductance  levels were present in recordings from other mutants as well, but were often masked by the  higher noise levels. We note that for V205M, sublevels were very long lasting and so it is  possible that this mutation slows the coupling between sublevels and fully open levels.   However, we were not able to test this hypothesis from the present data.   75       Figure 4.6. Single‐channel properties of V205M KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels. (A)  Six  successive sweeps from the same patch, showing lower open probability than the WT channel.   (B) The ensemble‐averaged currents of 100 successive recordings from the same patch as in A,  showing a time course resembling that of macroscopic V205M IKs current.  (C) Idealized  amplitude histogram. The mean amplitude for the larger peaks was 0.41 ± 0.004 pA at 60 mV.  (D) Diary plot of the single channel first latency to opening versus sweep number. (E) Diary plot  of the time‐averaged open probability of the channel. (F) Ensemble averaged open probability  from 100 successive sweeps during 4 s depolarizing pulses to 60 mV. Event histograms of open  (G) and closed (H) dwell times best fit with exponential components yielding the time constants  indicated. (n=3)       76     4.1.4  S209F     IKs made up from S209F‐KCNQ1 + KCNE1 has significantly lower current density than WT   (Eldstrom et al., 2010) and yet is kinetically a gain‐of‐function mutation, with channels opening  at more negative potentials and staying open longer during repolarization.  Such a phenotype  could arise from a trafficking deficiency but a proteinase K assay revealed a surface protein to  total protein ratio comparable to WT (Eldstrom et al., 2010). It is possible that the mutation  affects protein stability resulting in less total protein, or renders some channels non‐functional,  and yet able to reach the cell surface. The gain‐of‐function properties are seen at the single  channel level.  At +60 mV the channel had periods of very high activity, giving an overall Po  about twice that of WT (Figure 4.7A,E and F). The ensemble average of single channel currents  had an instantaneous component to activation and exhibited little sigmoidicity (Figure 4.7B).   Upon repolarization to ‐40 mV, the channels continued to flicker, showing little sign of  deactivation.  The very slow deactivation of this channel suggests that the channel is stabilized  in the open conformation, similar to other gain of function mutations described in KCNQ1  (Restier et al., 2008). Indeed, the shorter component of open dwell times was ~ twice as long as  WT (25.9 ± 5.0 ms), and the longer component to opening was ~ 1.5 times longer than WT (69.9  ± 4.8 ms) (Figure 4.7G), confirming this hypothesis.  Interestingly, the duration spent in the fast  and intermediate closed states appeared slightly prolonged in S209F, but the time spent in the  slow closed state was unchanged from WT (Figure 4.7H).     77       Figure 4.7. Single‐channel properties of S209F KCNQ1/KCNE1 mutant IKs channels. (A)  Six  successive sweeps from the same patch, showing high open probability at +60 mV  depolarisations.  (B) The ensemble‐averaged currents of 100 successive recordings from the  same patch as in A, showing a time course resembling that of macroscopic S209F IKs current. (C)  Idealized amplitude histogram. The mean amplitude for the larger peaks was 0.43 ± 0.03 pA at  60 mV. (D) Diary plot of the single channel first latency to opening versus sweep number. (E)  Diary plot of the time‐averaged open probability of the channel. (F) Ensemble averaged open  probability from 100 successive sweeps during 4 s depolarizing pulses to 60 mV. Event  histograms of open (G) and closed (H) dwell times best fit with exponential components  yielding the time constants indicated (n=3).        78     4.2  Discussion of LQTS mutations in the S3 region of KCNQ1  From single channel recordings of IKs with LQT1 mutations, we can identify the properties of   the  underlying  unitary  events  important  for  recapitulation  of  the  macroscopic  biophysical  properties of the mutants.  Open probability was decreased in the loss of function mutations,  D202H,  I204F  and  V205M  and  increased  in  the  gain  of  function  mutation  S209F.  The  first  latency to opening was prolonged in the slow activating mutants, consistent with the time to  opening as the determinant of activation rate in IKs.  Lastly, the mean open event duration as a  measure  of  open  state  stability  was  found  to  account  for  changes  in  deactivation  rate  seen  among the mutants.  A summary of the single channel properties of the S3 mutation and WT  are reported in Table 4.2:  Table 4.2. Summary of single channel properties of IKs with LQTS mutations. Values are  expressed mean ± SEM. N>3.          79     4.2.1  Mutations	in	S3	have	little	impact	on	single	channel	conductance  From setting a single 50% threshold to opening for the event idealization procedure, we  estimated  a  ‘main‐level’  amplitude  of  0.46  pA  in  addition  to  at  least  1  subconductance  level  around  0.1  pA  for  the  WT  channel  (Figure  3.4).  The  S3  mutations  had  only  minor  effects  on  single channel amplitude. Only V205M and I204F had slightly lower ‘main‐level’ amplitudes at  0.43 ± 0.03 pA and 0.41 ± 0.004 pA at 60 mV, respectively, compared to 0.46 ± 0.008 for WT  (Table 4.2). While one would not expect mutations in the voltage sensing domain to alter the  permeation  properties  of  the  pore  (Planells‐Cases  et  al.,  1995),  it  is  possible  that  these  mutations biased the channel towards subconductance levels (see section 3.1.5). However, we  remain  speculative  because  we  were  unable  to  distinguish  more  than  two  open  conductance  levels given the signal to noise ratio of most of our data.    4.2.2  Effect	of	S3	mutations	on	open	probability  The effects of the S3 mutations on single channel Po can partly be explained by the  shifted conductance‐voltage (gV) relationships for these mutants (Figure 4.2).  Since shifts in  the V1/2 of opening are a consequence of changes in the energy difference (G) between  closed and open states, we would expect mutations that stabilize closed states and/or  destabilize open states to cause a right‐shift in the gV relationship and therefore decrease Po at  sub‐maximal voltages.  In addition, a destabilization of the open state may decrease Po at all  voltages because open dwell times may be voltage‐independent, as in the Shaker channel  (Hoshi et al., 1994; Schoppa et al., 1998a). Therefore, the severe effects reported here of the S3  80     mutations on Po at 60 mV may have been from a combination of shifted voltage dependence of  opening and a voltage‐independent change in Po during bursts. Interestingly, a reduction of Po  at all voltages may explain why V205M and D202H were previously found to have lower current  densities than WT and yet express at the membrane (Eldstrom et al., 2010).     4.2.3  Channel	state	stability	determines	kinetics  We  observed  two  kinetically  distinguishable  open  states  and  three  kinetically  distinguishable closed states during bursts (Figure 3.6). The accelerated deactivation of D202H,  I204F and V205M (Figure 4.2) can be explained by reductions in mean open dwell times, as a  measure  of  open  state  stability  (Table  4.2).  Similarly,  the  slow  deactivation  of  S209F  can  be  explained  by  a  stabilization  of  the  open  state.  This  however,  does  not  exclude  a  contribution  from  closed  state  stability  to  deactivation  rate,  if  one  or  more  of  the  closed  states  lie  in  the  deactivation pathway. As a case in point, the D202H mutant had lengthened mean closed dwell  times (Figure 4.4), so closed state stabilization may have acted synergistically with open state  destabilization to confer the unique ability of D202H to deactivate mid‐depolarization.  The  slow  activation  of  I204F  and  V205M  was  accounted  for  by  increased  latencies  to  first  opening  (Figure  4.5D,  Figure  4.6D).  Since  transitions  from  closed  states  during  bursts  remained rapid (Figure 4.5H Figure 4.6H), V205M and I204F must present an energetic barrier  to conformational changes between closed states earlier in the activation pathway. In contrast,  D202H and S209F both activated with a faster and less sigmoidal time course than WT, as seen  from the median first latencies and ensemble averages for these mutants, respectively (Figure  81     4.4B, Figure 4.7B, Table 4.2). Sigmoidicity is decreased by reducing the number of closed states  traversed before opening (Cole and Moore, 1960; Zagotta et al., 1994b), and therefore, D202H  and S209F likely reside in ‘intermediate’ closed conformations at a holding potential of ‐80 mV.  This phenomenon could arise from incomplete deactivation in S209F, but that is clearly not the  case for the rapidly deactivating D202H. The alternative must be that closed states early in the  deactivation pathway are destabilized by D202H in addition to a destabilized open state. Thus  D202 in the WT channel appears to form key energy stabilizing interactions in both the open  and closed channel that are interrupted by substitution with a histidine.    4.2.4  Structural	interpretations  Models of KCNQ1 in the open and closed states (Smith et al., 2007; Kang et al., 2008)  based on the open state crystal structure of Kv1.2 (Long et al., 2005a) and the closed‐state  model (Yarov‐Yarovoy et al., 2006), provide a structural basis to interpret our findings.  In the  KCNQ1 models, the S3 mutations D202, V205, and S209 are all predicted to interact with S2 in  the open state, whereas I204 faces S4.  These predictions markedly diverge from the open state  Kv1.2 structure, where the equivalent aspartate to D202 is predicted to come in close contact  with a basic residue in S4 (Long et al., 2005a; Long et al., 2007; Tao et al., 2010; Papazian et al.,  1995). However, a structure‐refinement study places the S3 aspartate away from S4 in Kv1.2  (Chen et al., 2010).  In the closed state, D202 is predicted to form salt‐bridges with a K183 and R195 in the  S2‐S3 linker. In the open state, D202 forms a salt‐bridge with R174 and possibly accepts a  82     hydrogen bond from Y171 in S2 (Figure 4.8).  Support for a conserved S3 aspartate – S2 arginine  interaction comes from the recent crystal structure of NavAb  (Payandeh et al., 2011).  Substitution of an aspartate with a histidine at position 202 would be expected to disrupt these  electrostatic interactions, and destabilize both the closed state and the open state, which is  supported from the whole cell and single channel records. Interestingly, however, the charge  conserving mutation D202E has a drastic effect on the voltage dependence of opening  (Eldstrom et al., 2010).  This does not rule out the importance of charge, but may suggest that  D202 requires a precise stereochemistry to form its functionally important interactions.      Figure 4.8. KCNQ1 models predict D202 to form salt‐bridges in both the closed and the open  state. (A) D202 is in close proximity to basic residues, K183 and R195 in the S2‐S3 linker. (B) In  the open state, D202 appears positioned for interactions with S2 residues Y171 and R174.  Models were prepared with PyMOL using coordinates from Kang et al. 2008.     83     I204 is in close proximity to R237 in S4 (R4 in Shaker) in the closed state (Figure 4.9).  Interestingly, a phenylalanine in this position could possibly form a cation‐pi interaction with  R237 to stabilize this residue in the closed state. Upon depolarization, the S4 segment would  then have an additional energetic barrier to overcome (ie breaking this interaction) and would  be expected to slow IKs activation, as is seen from whole cell recordings of I204F and supported  by increased first latencies to opening in the single channel records.  Alternatively, the increase  in steric hindrance from a bulky phenylalanine would also be expected to slow activation.     Figure 4.9. Interactions of I204 and V205 in the closed and open state, respectively. (A) I204 is  in close proximity to R237 in S4 in the closed state. (B) V205 lies sandwiched between H240 in  S4 and the highly conserved F167 in S2 in the open state. Models were prepared with PyMOL  using coordinates from Kang et al. 2008.     84     The energetic penalty to activation imposed by V205M is less clear and indeed the  slowed activation of V205M is subtle (Figure 4.3) (Table 4.2). There is an interesting interaction  in the open state, however, that if disrupted could destabilize the open state and explain the  rapid deactivation seen with this mutant. V205 is predicted to lie sandwiched between a highly  conserved phenylalanine in S2 (F167) and H240 in S4 (K5 in Shaker) in the open state (Figure  4.9). In Shaker, this phenylalanine has recently been proposed to provide an ‘occluded binding‐ site’ for K5 and acidic residues in S2 and S3 that facilitate the charge transfer of S4 (Tao et al.,  2010). Therefore, substitution to a methionine at position 205 may impede the function of  F167, to destabilize the open state (Eldstrom et al., 2010).     The predicted position of S209 is consistent with stabilization of the open state by   phenylalanine. In the closed state, S209 is not predicted to have close interactions with the  other voltage sensing segments (Figure 4.10A).  However, in the open conformation, the S3  segment is situated close to S2 and S209 resides in a hydrophobic cleft formed by a trio of  valine, leucine and the conserved phenylalanine in S2 (Figure 4.10B). The hydrophobic residues  present an inhospitable environment to the hydrophilic hydroxyl group of serine at position  209. Substitution to phenylalanine at position 209 may therefore contribute to stabilization of  this cleft through the hydrophobic effect (Eldstrom et al., 2010; Pace et al., 1996). The result  being that the open state is selectively stabilized by the S209F mutation, which explains its gain‐ of‐function phenotype.   85       Figure 4.10. S209F selectively stabilizes the open state. (A) S209 is not predicted to interact  with residues in S2, or other voltage sensing segments in the closed state. (B) In the open state,  S3 sits closed to S2 and S209 resides in a hydrophobic cleft that may be stabilized by a  phenylalanine substitution. This model was prepared with PyMOL using coordinates from Kang  et al. 2008.        86     5 5.1  Concluding chapter  Summary of WT single channel properties  The single channel recordings in this thesis revealed the elementary events that underlie   the unique biophysical properties IKs.  In addition, the first ever single channel recordings of IKs  with long QT type 1 (LQT1) mutations were presented and characterized to elucidate the  pathogenic mechanisms of this disease at the single molecule level.  Long latency periods to first opening were found responsible for slow activation (Figure  3.6B), consistent with previous findings (Yang et al., 1998). Channels often did not open within  4 seconds of 60 mV depolarizations.  Coupled with periods of quiescence in between active  sweeps, the overall Po only approached a mean value of ~0.2 after 4 seconds (Figure 3.5),  consistent with a macroscopic current that continues to activate well beyond 4 seconds.  The  cyclic activity of Po may suggest that channels can enter high Po or low Po (dormant) gating  modes. It is unclear at present if this is related to an activation state of the channel, or if it is  regulated by endogenous factors.  Burst activity was non‐deactivating and consisted of flickering between at least two open  states and 3 kinetically distinguishable closed states. It is unclear whether the closed states  observed during bursts are part of the activation and/or deactivation pathway and may instead  arise from ion dwelling in the selectivity filter (Choe et al., 2001). The combination of low Po,  long latencies to opening, and non‐deactivating bursts were concluded to underlie the slow and   87     steady rise of macroscopic IKs and are therefore critical for the timing and function of IKs late in  the cardiac action potential.  During bursts, the channel had a surprisingly ‘dynamic’ conductance. The channel fluctuated  between multiple conductance levels, starting nearly always with a sublevel ranging from 0.1‐ 0.25 pA at 60 mV.  Larger open levels averaged around ~0.45 pA at 60 mV, and yielded a slope  conductance of 3.2 pS (Figure 3.4), which closely agrees with a previous report (Yang et al.,  1998), but diverges from other studies that employed noise variance analysis (Romey et al.,  1997; Sesti et al., 1998).  The amplitude of the sublevels correlated with first latency to  opening, and so we conclude that they are likely coupled to the activation state of the channel.   This is consistent with the experimentally tested theory that sublevels arise from some but not  all of the subunits reaching an open conformation (Chapman et al., 2005; Zheng et al., 1998).   We suggest from empirical observation that IKs frequently visits between 3‐5 conductance  levels.  It was difficult to precisely determine the number of levels because of small openings,  background noise, and the inherent stochastic variability of single channel amplitude.    5.1.1  Implications	of	subconductance	levels  The behavior of the sublevels has important implications for how the channel gates.  First,  the presence of sublevels argues against a completely concerted transition to opening in favor  of stepwise transitions from each subunit.  Sublevels were very long lived in IKs in contrast to  the fast activating Shaker channel (Zheng et al., 1997) but similar to a slow activating Kv2.1  mutant (Chapman et al., 1997). Therefore, transitions through the final steps in activation of IKs  88     may have been sufficiently slow to observe sublevels.  However, considering that the channel  remains at sublevels about a tenth as long as the first latency period, it is likely that some level  of cooperativity exists.  A conformational change in one subunit may destabilize the  neighboring subunits, making a conformational change for them more likely.  Sublevels in IKs  were long‐lived prior to reaching full open levels, but short‐lived when revisited from full open  levels. This suggests that the stability of the sublevel is dependent on the activation state of the  non‐conducting subunits. From this observation and the previously reported requirement that  all four voltage sensors must move prior to opening (Osteen et al., 2010), we suggest a minimal  gating scheme of 3 transitions per subunit.  It is possible that the third transition reflects  conformational changes at or near the selectivity filter, since Zheng and Sigworth (1997) found  sublevels to have different ion selectivity than the main open level.  Sublevels could arise from  varying affinities for ions in the selectivity filter binding sites (VanDongen, 2004). Taken  together, we can imagine an activation gating scheme where the first transition is voltage  sensor movement, the second is activation gate opening at the bundle crossing, and the third is  the selectivity filter reaching a conductive conformation.  The bundle crossing and the  selectivity filter are each a gate to ion conduction; both must be open to conduct, but only one  must close to prevent conduction (Cordero‐Morales et al., 2006).  A single conformational  change for channel closure would give rise to a mono‐exponential decay in current consistent  with IKs deactivation kinetics, in contrast to sequential transitions through open states en route  to closing.  Therefore, with multiple open states, two gates to ion permeation for IKs is an  attractive hypothesis.   89     5.2  Properties of single channel Iks with LQT1 mutations in the S3 helix  Single channel recordings of IKs channels with LQT1 mutations located in the S3 helix of   KCNQ1 were analyzed to elucidate the pathogenic mechanisms of these mutations at the single  molecule level.  None of the mutations resulted in a significant shift in single channel  conductance, and so their unique biophysical properties originated from changes in Po.  The   Loss of function mutations, D202H, V205M and I204F, required greater depolarizations to open  (Eldstrom et al., 2010) and had significantly lower mean Po’s at 60 mV, suggesting that the  mutant channels were not fully activated at this potential.  In contrast, the WT channel was  likely near maximal activation at 60 mV, as seen from the Po – voltage relationship (Figure 3.5).   The fact that the gain‐of‐function mutation, S209F, had a Po about twice that of WT after 4  seconds, suggests that the WT channel was only approximately half‐activated after 4 seconds,  and much longer depolarizations are needed to saturate the current.  However, another  contributing factor to the change in Po was the fraction of time spent in the open state during  bursts.  Mutations resulting in accelerated deactivation, as seen from whole cell recordings  (Eldstrom et al., 2010), had shorter mean open dwell times than WT, and durations of short  closures during bursts were either similar to WT or prolonged.  Therefore, the Po during bursts  was reduced in these mutants, and this contributed to the overall reduction in Po.   The time to first opening was correlated well with activation rate of the mutants (Eldstrom  et al., 2010), consistent with first latency to opening as the primary determinant of activation  rate in IKs.  Prolonged first latencies to opening were considered a result of closed state   90     stabilization. Changes in rate of deactivation were primarily attributed to open state stability  but the stability of closed states visited during bursts may have been a contributing factor.   5.2.1  Significance	and	interpretation	of	results	from	S3	mutations  To interpret how a decrease in open state stability could accelerate deactivation, we must  first consider how open dwell time is related to gating of the channel.  Single channel activity of  IKs can be described by slow and fast gating processes. Slow gating is responsible for transitions  into (activation) and out of (deactivation) bursts, whereas fast gating is responsible for rapid  flickering within bursts (Bichet et al., 2003). Therefore, our observation that open dwell time  correlates with deactivation rate in the S3 mutations, implies that fast gating is coupled to slow  gating. In other words, the open dwell time may determine the total burst duration.  This is  supported by the D202H mutation that has a mean open dwell time ~ one‐third that of WT and  was seen to frequently stop bursting mid‐depolarization, unlike WT.  Conceivably, the same  energetic destabilization that shortens open dwell time, could promote entry into a closed state  along the deactivation pathway.  Increasing the fraction of time spent in closed states from  which the channel can deactivate may underlie the rapid deactivation seen in D202H, for  example.   How could mutations in the S3 region affect open state stability? Evidence from Kir  channels and KcsA, suggest that properties of fast gating arise from conformational changes  around the selectivity filter (Lu et al., 2001a; Chakrapani et al., 2011). Fast closures may be a  consequence of ion trapping in high affinity energy wells within the filter (Choe et al., 2001;  91     VanDongen, 2004). Therefore, mutations in the S3 region of the voltage sensor may somehow  alter ion coordination within the selectivity filter. From a structural standpoint, there is little  evidence of any direct interaction between the two structures. Thus allosteric effects seem  most probable.  One possibility is that S3 mutations affect the conserved interaction between  S1 and the P‐loop (Lee et al., 2009), and this in turn affects the stability of conformations within  the selectivity filter. Interestingly, the mean open dwell time in Shaker was found to be voltage‐ independent (Hoshi et al., 1994), and this begs the question of how a mutation in the voltage  sensor could affect a voltage‐independent process.  Perhaps the voltage sensor undergoes low  charge bearing conformational changes after bulk charge movement and these are somehow  coupled to open state stability.  Despite a present lack of understanding for how the voltage sensor is coupled to fast gating,  the effects of the S3 mutations on channel state stability are consistent with current open and  closed state models of KCNQ1 (Smith et al., 2007). Mutations predicted to face S2 (S209F,  D202H and V205M) primarily affected open states, supporting structural evidence that these  helices move closer together during activation. I204F faces S4 and affects both activation and  deactivation consistent with a model where S3 is positioned to interact with S4 in both closed  and open states.   Therefore, the work in this thesis may prove useful in guiding future  structural models of the KCNQ1 voltage sensor in open and closed states.     92     5.3  Future work  The success of collecting single channel records opens possibilities for many future   experiments.  The mechanistic basis for increases in macroscopic current by modulators like  PKA (Marx et al., 2002) and PIP2 (Suh et al., 2006; Loussouarn et al., 2003) awaits single channel  studies to be elucidated. Similarly, it would be interesting to test if these modulators recruit  channels to active gating modes from dormant modes as a mechanism to increase Po.  An  alternative hypothesis is that dormant gating modes arise from occupation of a channel state  with a very high energy barrier to activation.  This could be tested by varying interpulse  duration and holding potential to see if entry into this state is voltage‐dependent.    Conductance level occupancy may also be  a target of modulation, similar to the effects of PIP2  on Kir2.1 channels (Xie et al., 2008).   The structural basis for subconductance levels in IKs has yet to be determined. While  individual movements of subunits at the activation gate have been shown in KcsA (Blunck et al.,  2008), altered ion selectivity for subconductance levels in Shaker implicates conformational  changes around the selectivity filter (Zheng et al., 1997).  It would be of great interest to test if  subconductance levels in IKs display different selectivity for permeating ions such as rubidium,  which may offer an explanation for the relatively low potassium selectivity of IKs when  compared to other Kv channels (Sanguinetti et al., 1990).  While our data suggests that  sublevels are coupled to activation, a more rigorous experiment would be to test the voltage‐ dependence of sublevels, to see if they reflect the voltage‐dependence of activation.  To test if  sublevels are coupled to deactivation, high extracellular concentrations of potassium should be  93     used to maximize driving force at negative potentials.  These experiments could shed light on  whether the channel must traverse the same sublevels to fully close as to fully open.  The  answer could have important mechanistic and structural implications for sublevels and gating in  general.  If ion permeation is controlled by a single gate then we would expect the same  sublevels to be transitioned for deactivation as for activation.  If, however, ion permeation is  controlled by two gates in series, whereby both need to open  for conduction but only one  needs to close to stop conduction, we may not see sublevels during deactivation. Ultimately,  this could contribute to the debate of whether the selectivity filter functions as a second gate  to activation in addition to the gate at the intracellular end of S6.  One issue not addressed by the results in this thesis, but of great interest to the IKs field, is  how KCNE1 modulates KCNQ1 at the single channel level.  The key experiment is to obtain  single channel records of homomeric KCNQ1, and compare these to single channel IKs. Since the  predicted single channel amplitude of homomeric KCNQ1 is about five fold lower than IKs, the  discovery of pore mutations in KCNQ1 that increase single channel conductance, similar to the  Shaker‐Kv3.1 chimera (Zheng et al., 1998), would be of great use in this pursuit.  This could open  doors to investigate the role of KCNE1 (if any) in subconductance levels. For instance, it is  possible that KCNE1 causes a breakdown in cooperativity between subunits, or sufficiently  slows coupling of late activation steps to reveal sublevels.    The single channel recordings from S3 mutants of IKs provided evidence for how these  mutations alter the stability of specific channel states but did not test for the side‐chain  interactions underlying the stabilization/destabilization.  Experiments testing interacting  94     partners of S3 residues will clarify the role of these residues in gating, as well as constrict future  structural models of KCNQ1. From single channel measurements and whole cell recordings, we  know that the conserved D202 residue is important for stabilizing interactions in both the  closed and open states.  However, the interacting partners of D202 in IKs are unclear since the  KCNQ1 open state model conflicts with the Kv1.2 crystal structure in the orientation of this  residue.   Double mutant cycle analysis or a method similar to intragenic suppression (Papazian  et al., 1995) could be employed to test electrostatic interactions with D202. Specifically, R195  and K183 in the S2‐S3 linker could be neutralized with and without a concomitant D202N  mutation to test for interactions in the closed state.  The same approach could be taken for  testing an interaction with R174 (S2) in the open state.  The predicted proximity of I204F with  R237 in S4 in the closed state and concurrent stabilization of the closed state suggests a cation‐ pi interaction that could be tested with fluorinated derivatives of phenylalanine (Nowak et al.,  1995). The proximity of V205M with the conserved F167 in the open state and concurrent open  state destabilization suggests an important role for F167 even though its interacting partner in  Shaker, K5, is replaced by histidine (H240) in KCNQ1. If protonated, H240 could serve the same  function as K5 in Shaker, so the importance of charge at this position could be investigated  through mutagenesis.  It is intriguing that both I204 and V205 lie in a region of S3 that contains  a hydrophobic stretch of several residues in most voltage‐gated ion channels.  It is possible that  this region serves to limit the number of energy wells for gating charges to facilitate fast charge  movement, analogous to fast ion conduction through a hydrophobic pore.  This hypothesis  could be investigated by introducing charged mutations into this region.  Finally, the   95     hydrophobic cleft that S209 is thought to reside in could be investigated by substituting the  hydrophobic side‐chains in S2 with charged side‐chains.      The major impediment to future single channel experiments is slow progress from the   inherent difficulty in isolating single IKs channels in a patch.  It is likely that IKs channels cluster  together at the cell surface and so any intervention that limits this clustering would prove very  useful.  Secondly, the analysis of single channel IKs activity is difficult because of the small  conductance and rapid flicker properties of the channel.  More sophisticated types of analysis  than the 50% threshold technique should be considered.  For example, the TRANSIT algorithm,  developed by VanDongen (1996), is specifically designed to analyze data containing multiple  unknown conductance levels (VanDongen, 1996). Another technique, hidden Markov modeling,  provides an advantage for analyzing small currents with fast flicker kinetics and does not  require heavy filtering like the 50% threshold technique (Venkataramanan et al., 1998). Such  techniques can be employed to validate the findings of this thesis, and will further contribute to  understanding the fundamental gating processes underlying the macroscopic properties of IKs.        96     References  Abbott,G.W., S.A.N.Goldstein, and F.Sesti. 2001. Do all voltage‐gated potassium channels use  MiRPs? Circ Res 88:981‐983.  Abbott,G.W., F.Sesti, I.Splawski, M.E.Buck, W.H.Lehmann, K.W.Timothy, M.T.Keating, and  S.A.N.Goldstein. 1999. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated  with cardiac arrhythmia. Cell 97:175‐187.  Ackerman,M.J. and D.E.Clapham. 1997. Ion channels‐‐basic science and clinical disease. N Engl J  Med 336:1575‐1586.  Ahern,C.A. and R.Horn. 2004. Stirring up controversy with a voltage sensor paddle. Trends  Neurosci 27:303‐307.  Aldrich,R.W., D.P.Corey, and C.F.Stevens. 1983. A reinterpretation of mammalian sodium  channel gating based on single channel recording. Nature 306:436‐441.  Arbour,L., S.Rezazadeh, J.Eldstrom, G.Weget‐Simms, R.Rupps, Z.Dyer, G.Tibbits, E.Accili,  B.Casey, A.Kmetic, S.Sanatani, and D.Fedida. 2008. A KCNQ1 V205M missense mutation  causes a high rate of long QT syndrome in a First Nations community of northern British  Columbia: a community‐based approach to understanding the impact. Genet Med  10:545‐550.  Armstrong,C.M. 1971. Interaction of tetraethylammonium ion derivatives with the potassium  channels of giant axon. J Gen Physiol 58:413‐437.  Armstrong,C.M. and F.Bezanilla. 1973. Currents related to movement of the gating particles of  the sodium channels. Nature 242:459‐461.  Barhanin,J., F.Lesage, E.Guillemare, M.Fink, M.Lazdunski, and G.Romey. 1996. KvLQT1 and IsK  (minK) proteins associate to form the IKs cardiac potassium current. Nature 384:78‐80.  Bellocq,C., A.C.van Ginneken, C.R.Bezzina, M.Alders, D.Escande, M.M.Mannens, I.Baro, and  A.A.Wilde. 2004. Mutation in the KCNQ1 gene leading to the short QT‐interval  syndrome. Circulation 109:2394‐2397.  Bezanilla,F. 2000. The voltage sensor in voltage‐dependent ion channels. Physiological Reviews  80:555‐592.  Bezanilla,F., E.Perozo, D.M.Papazian, and E.Stefani. 1991. Molecular basis of gating charge  immobilization in Shaker potassium channels. Science 254:679‐683.   97     Bezanilla,F., E.Perozo, and E.Stefani. 1994. Gating of Shaker K+ channels:  II. The components of  gating currents and a model of channel activation. Biophys J 66:1011‐1021.  Bichet,D., F.A.Haass, and L.Y.Jan. 2003. Merging functional studies with structures of inward‐ rectifier K(+) channels. Nat Rev Neurosci 4:957‐967.  Blumenthal,E.M. and L.K.Kaczmarek. 1994. The minK potassium channel exists in functional and  nonfunctional forms when expressed in the plasma membrane of Xenopus oocytes. J  Neurosci 14:3097‐3105.  Blunck,R., J.F.Cordero‐Morales, L.G.Cuello, E.Perozo, and F.Bezanilla. 2006. Detection of the  opening of the bundle crossing in KcsA with fluorescence lifetime spectroscopy reveals  the existence of two gates for ion conduction. J Gen Physiol 128:569‐581.  Blunck,R., H.McGuire, H.C.Hyde, and F.Bezanilla. 2008. Fluorescence detection of the  movement of single KcsA subunits reveals cooperativity. Proc Natl Acad Sci U S A  105:20263‐20268.  Busch,A.E., H.Suessbrich, S.Waldegger, E.Sailer, R.Greger, H.Lang, F.Lang, K.J.Gibson, and  J.G.Maylie. 1996. Inhibition of IKs in guinea pig cardiac myocytes and guinea pig IsK  channels by the chromanol 293B. Pflugers Arch 432:1094‐1096.  Catterall,W.A. 1986. Molecular properties of voltage‐sensitive sodium channels. Annu Rev  Biochem 55:953‐985.  Catterall,W.A. 2010. Ion Channel Voltage Sensors: Structure, Function, and Pathophysiology.  Neuron 67:915‐928.  Cha,A. and F.Bezanilla. 1997. Characterizing voltage‐dependent conformational changes in the  Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron 19:1127‐1140.  Chakrapani,S., J.F.Cordero‐Morales, V.Jogini, A.C.Pan, D.M.Cortes, B.Roux, and E.Perozo. 2011.  On the structural basis of modal gating behavior in K(+) channels. Nat Struct Mol Biol  18:67‐74.  Chapman,M.L. and A.M.J.VanDongen. 2005. K channel subconductance levels result from  heteromeric pore conformations. J Gen Physiol 126:87‐103.  Chapman,M.L., H.M.A.VanDongen, and A.M.J.VanDongen. 1997. Activation‐dependent  subconductance levels in the drk1 K channel suggest a subunit basis for ion permeation  and gating. Biophys J 72:708‐719.  Chen,H., L.A.Kim, S.Rajan, S.Xu, and S.A.Goldstein. 2003a. Charybdotoxin binding in the I(Ks)  pore demonstrates two MinK subunits in each channel complex. Neuron 40:15‐23.  98     Chen,X., Q.Wang, F.Ni, and J.Ma. 2010. Structure of the full‐length Shaker potassium channel  Kv1.2 by normal‐mode‐based X‐ray crystallographic refinement. Proc Natl Acad Sci U S A  107:11352‐11357.  Chen,Y.H., S.J.Xu, S.Bendahhou, X.L.Wang, Y.Wang, W.Y.Xu, H.W.Jin, H.Sun, X.Y.Su, Q.N.Zhuang,  Y.Q.Yang, Y.B.Li, Y.Liu, H.J.Xu, X.F.Li, N.Ma, C.P.Mou, Z.Chen, J.Barhanin, and W.Huang.  2003b. KCNQ1 gain‐of‐function mutation in familial atrial fibrillation. Science 299:251‐ 254.  Choe,H., H.Sackin, and L.G.Palmer. 2001. Gating properties of inward‐rectifier potassium  channels: effects of permeant ions. J Membrane Biol 184:81‐89.  Chouabe,C., N.Neyroud, P.Richard, I.Denjoy, B.Hainque, G.Romey, M.D.Drici, P.Guicheney, and  J.Barhanin. 2000. Novel mutations in KvLQT1 that affect Iks activation through  interactions with Isk. Cardiovasc Res 45:971‐980.  Chung,D.Y., P.J.Chan, J.R.Bankston, L.Yang, G.Liu, S.O.Marx, A.Karlin, and R.S.Kass. 2009.  Location of KCNE1 relative to KCNQ1 in the I(KS) potassium channel by disulfide cross‐ linking of substituted cysteines. Proc Natl Acad Sci U S A 106:743‐748.  Cole,K.C. and J.W.Moore. 1960. Potassium ion current in the squid giant axon: dynamic  characteristic. Biophys J 1:1‐14.  Colquhoun,D. and F.J.Sigworth. 1995. Fitting and statistical anlysis of single‐channel records. In  Single‐Channel Recording. B.Sakmann and E.Neher, editors. Plenum, New York. 483‐587.  Cordero‐Morales,J.F., L.G.Cuello, Y.Zhao, V.Jogini, D.M.Cortes, B.Roux, and E.Perozo. 2006.  Molecular determinants of gating at the potassium‐channel selectivity filter. Nat Struct  Mol Biol 13:311‐318.  Dai,S., D.D.Hall, and J.W.Hell. 2009. Supramolecular assemblies and localized regulation of  voltage‐gated ion channels. Physiol Rev 89:411‐452.  Doyle,D.A., J.M.Cabral, R.A.Pfuetzner, A.L.Kuo, J.M.Gulbis, S.L.Cohen, B.T.Chait, and  R.MacKinnon. 1998. The structure of the potassium channel:  Molecular basis of K+  conduction and selectivity. Science 280:69‐77.  Dufendach,K.A., J.M.Horner, B.C.Cannon, and M.J.Ackerman. 2011. Congenital Type 1 Long QT  Syndrome Unmasked by a Highly Caffeinated Energy Drink. Heart Rhythm.  Ehrlich,J.R., S.Zicha, P.Coutu, T.E.Hebert, and S.Nattel. 2005. Atrial fibrillation‐associated  minK38G/S polymorphism modulates delayed rectifier current and membrane  localization. Cardiovasc Res 67:520‐528.   99     Eldstrom,J., H.J.Xu, D.Werry, C.B.Kang, M.E.Loewen, A.Degenhardt, S.Sanatani, G.F.Tibbits,  C.Sanders, and D.Fedida. 2010. Mechanistic basis for LQT1 caused by S3 mutations in  the KCNQ1 subunit of I(Ks). J Gen Physiol 135:433‐448.  Fedida,D. and J.C.Hesketh. 2001. Gating of voltage‐dependent potassium channels. Prog  Biophys Molec Biol 75:165‐199.  Fenwick,E.M., A.Marty, and E.Neher. 1982. Sodium and calcium channels in bovine chromaffin  cells. J Physiol (Camb ) 331:599‐635.  Fox,J.A. 1987. Ion channel subconductance states. J Membrane Biol 97:1‐8.  Franqueza,L., M.Lin, I.Splawski, M.T.Keating, and M.C.Sanguinetti. 1999. Long QT syndrome‐ associated mutations in the S4‐S5 linker of KvLQT1 potassium channels modify gating  and interaction with minK subunits. J Biol Chem 274:21063‐21070.  Goldstein,S.A.N. and C.Miller. 1991. Site‐specific mutations in a minimal voltage‐dependent K+  channel alter ion selectivity and open‐channel block. Neuron 7:403‐408.  Gutman,G.A., K.G.Chandy, S.Grissmer, M.Lazdunski, D.McKinnon, L.A.Pardo, G.A.Robertson,  B.Rudy, M.C.Sanguinetti, W.Stuhmer, and X.Wang. 2005. International Union of  Pharmacology. LIII. Nomenclature and molecular relationships of voltage‐gated  potassium channels. Pharmacol Rev 57:473‐508.  Guy,H.R. and P.Seetharamulu. 1986. Molecular model of the sodium channel. Proc Natl Acad Sci  USA 83:508‐512.  Hamill,O.P., A.Marty, E.Neher, B.Sakmann, and F.J.Sigworth. 1981. Improved patch‐clamp  techniques for high‐resolution current recording from cells and cell‐free membrane  patches. Pflugers Arch 391:85‐100.  Hausdorff,S.F., S.A.N.Goldstein, E.E.Rushin, and C.Miller. 1991. Functional characterization of a  minimal K+ channel expressed from a synthetic gene. Biochemistry 30:3341‐3347.  Hille,B. 2001. Ionic channels of excitable membranes. 4 ed. Sinauer Associates Inc., Sunderland,  Massachusetts.  Hodgkin,A.L. and A.F.Huxley. 1952. A quantitative description of membrane current and its  application to conduction and excitation in nerve. J Physiol (Camb ) 117:500‐544.  Hoshi,T., W.N.Zagotta, and R.W.Aldrich. 1994. Shaker potassium channel gating.  I: Transitions  near the open state. J Gen Physiol 103:249‐278.  Imredy,J.P., J.R.Penniman, S.J.Dech, W.D.Irving, and J.J.Salata. 2008. Modeling of the adrenergic  response of the human I‐Ks current (hKCNQ1/hKCNE1) stably expressed in HEK‐293  100     cells. American Journal of Physiology‐Heart and Circulatory Physiology 295:H1867‐ H1881.  Jackson,H., L.A.Huisman, S.Sanatani, and L.T.Arbour. 2011. Long QT syndrome. CMAJ 183:1272‐ 1275.  Jiang,M., X.Xu, Y.Wang, F.Toyoda, X.S.Liu, M.Zhang, R.B.Robinson, and G.N.Tseng. 2009.  Dynamic partnership between KCNQ1 and KCNE1 and influence on cardiac IKs current  amplitude by KCNE2. J Biol Chem 284:16452‐16462.  Jiang,Y., A.Lee, J.Chen, M.Cadene, B.T.Chait, and R.MacKinnon. 2002. The open pore  conformation of potassium channels. Nature 417:523‐526.  Jiang,Y., V.Ruta, J.Chen, A.Lee, and R.MacKinnon. 2003a. The principle of gating charge  movement in a voltage‐dependent K+ channel. Nature 423:42‐48.  Jiang,Y.X., V.Ruta, J.Y.Chen, A.Lee, and R.MacKinnon. 2003b. The principle of gating charge  movement in a voltage‐dependent K+ channel. Nature 423:42‐48.  Kang,C., C.Tian, F.D.Sonnichsen, J.A.Smith, J.Meiler, A.L.George, Jr., C.G.Vanoye, H.J.Kim, and  C.R.Sanders. 2008. Structure of KCNE1 and implications for how it modulates the KCNQ1  potassium channel. Biochemistry 47:7999‐8006.  Katz,B. and R.Miledi. 1971. Further observations on acetylcholine noise. Nat New Biol 232:124‐ 126.  Kurata,H.T. and D.Fedida. 2006. A structural interpretation of voltage‐gated potassium channel  inactivation. Prog Biophys Mol Biol 92:185‐208.  Kurokawa,J., J.R.Bankston, A.Kaihara, L.Chen, T.Furukawa, and R.S.Kass. 2009. KCNE variants  reveal a critical role of the beta subunit carboxyl terminus in PKA‐dependent regulation  of the I(Ks) potassium channel. Channels 3:16‐24.  Kurokawa,J., L.Chen, and R.S.Kass. 2003. Requirement of subunit expression for cAMP‐ mediated regulation of a heart potassium channel. Proc Natl Acad Sci U S A 100:2122‐ 2127.  Ledwell,J.L. and R.W.Aldrich. 1999. Mutations in the S4 region isolate the final voltage‐ dependent cooperative step in potassium channel activation. J Gen Physiol 113:389‐414.  Lee,S.Y., A.Banerjee, and R.MacKinnon. 2009. Two separate interfaces between the voltage  sensor and pore are required for the function of voltage‐dependent K(+) channels. PLoS  Biol 7:e47.   101     Lerche,C., I.Bruhova, H.Lerche, K.Steinmeyer, A.D.Wei, N.Strutz‐Seebohm, F.Lang, A.E.Busch,  B.S.Zhorov, and G.Seebohm. 2007. Chromanol 293B binding in KCNQ1 (Kv7.1) channels  involves electrostatic interactions with a potassium ion in the selectivity filter. Mol  Pharmacol 71:1503‐1511.  Lesage,F., B.Attali, J.Lakey, E.Honore, G.Romey, E.Faurobert, M.Lazdunski, and J.Barhanin. 1993.  Are Xenopus oocytes unique in displaying functional IsK channel heterologous  expression? Receptors Channels 1:143‐152.  Li,Y., M.A.Zaydman, D.Wu, J.Shi, M.Guan, B.Virgin‐Downey, and J.Cui. 2011. KCNE1 enhances  phosphatidylinositol 4,5‐bisphosphate (PIP2) sensitivity of IKs to modulate channel  activity. Proc Natl Acad Sci U S A 108:9095‐9100.  Liu,D.T., G.R.Tibbs, and S.A.Siegelbaum. 1996. Subunit stoichiometry of cyclic nucleotide‐gated  channels and effects of subunit order on channel function. Neuron 16:983‐990.  Long,S.B., E.B.Campbell, and R.MacKinnon. 2005a. Crystal structure of a mammalian voltage‐ dependent Shaker family K+ channel. Science 309:897‐903.  Long,S.B., E.B.Campbell, and R.MacKinnon. 2005b. Voltage sensor of Kv1.2: structural basis of  electromechanical coupling. Science 309:903‐908.  Long,S.B., X.Tao, E.B.Campbell, and R.MacKinnon. 2007. Atomic structure of a voltage‐ dependent K+ channel in a lipid membrane‐like environment. Nature 450:376‐382.  Loussouarn,G., K.H.Park, C.Bellocq, I.Baro, F.Charpentier, and D.Escande. 2003.  Phosphatidylinositol‐4,5‐bisphosphate, PIP2, controls KCNQ1/KCNE1 voltage‐gated  potassium channels: a functional homology between voltage‐gated and inward rectifier  K+ channels. EMBO J 22:5412‐5421.  Lu,T., A.Y.Ting, J.Mainland, L.Y.Jan, P.G.Schultz, and J.Yang. 2001a. Probing ion permeation and  gating in a K+ channel with backbone mutations in the selectivity filter. Nat Neurosci  4:239‐246.  Lu,Z., A.M.Klem, and Y.Ramu. 2001b. Ion conduction pore is conserved among potassium  channels. Nature 413:809‐813.  Lu,Z., A.M.Klem, and Y.Ramu. 2002. Coupling between voltage sensors and activation gate in  voltage‐gated K+ channels. J Gen Physiol 120:663‐676.  Lvov,A., S.D.Gage, V.M.Berrios, and W.R.Kobertz. 2010. Identification of a protein‐protein  interaction between KCNE1 and the activation gate machinery of KCNQ1. J Gen Physiol  135:607‐618.   102     MacKinnon,R. 1991. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage‐activated  potassium channel. Nature 350:232‐235.  Mannuzzu,L.M., M.M.Moronne, and E.Y.Isacoff. 1996. Direct physical measurement of  conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science 271:213‐ 216.  Marx,S.O., J.Kurokawa, S.Reiken, H.Motoike, J.D'Armiento, A.R.Marks, and R.S.Kass. 2002.  Requirement of a macromolecular signaling complex for beta adrenergic receptor  modulation of the KCNQ1‐KCNE1 potassium channel. Science 295:496‐499.  McCrossan,Z.A. and G.W.Abbott. 2004. The MinK‐related peptides. Neuropharmacology  47:787‐821.  McDonald,T.V., Z.H.Yu, Z.Ming, E.Palma, M.B.Meyers, K.W.Wang, S.A.N.Goldstein, and  G.I.Fishman. 1997. A minK‐HERG complex regulates the cardiac potassium current IKr.  Nature 388:289‐292.  Moon,C.P. and K.G.Fleming. 2011. Side‐chain hydrophobicity scale derived from  transmembrane protein folding into lipid bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A 108:10174‐ 10177.  Morais‐Cabral,J.H., Y.F.Zhou, and R.MacKinnon. 2001. Energetic optimization of ion conduction  rate by the K+ selectivity filter. Nature 414:37‐42.  Morin,T.J. and W.R.Kobertz. 2008. Counting membrane‐embedded KCNE beta‐subunits in  functioning K+ channel complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 105:1478‐1482.  Nakajo,K. and Y.Kubo. 2007. KCNE1 and KCNE3 stabilize and/or slow voltage sensing S4  segment of KCNQ1 channel. J Gen Physiol 130:269‐281.  Nakajo,K., M.H.Ulbrich, Y.Kubo, and E.Y.Isacoff. 2010. Stoichiometry of the KC. Proc Natl Acad  Sci U S A 107:18862‐18867.  Napolitano,C., S.G.Priori, P.J.Schwartz, R.Bloise, E.Ronchetti, J.Nastoli, G.Bottelli, M.Cerrone,  and S.Leonardi. 2005. Genetic testing in the long QT syndrome: development and  validation of an efficient approach to genotyping in clinical practice. JAMA 294:2975‐ 2980.  Neher,E. and B.Sakmann. 1976. Single‐channel currents recorded from membrane of  denervated frog muscle fibres. Nature 260:799‐802.  Noble,D. and R.W.Tsien. 1969. Outward membrane currents activated in the plateau range of  potentials in cardiac Purkinje fibres. J Physiol (Camb ) 200:205‐231.  103     Noda,M., S.Shimizu, T.Tanabe, T.Takai, T.Kayano, T.Ideda, H.Takahashi, H.Nakayama,  Y.Kanaoka, N.Minamino, and et al. 1984. Primary structure of Electrophorus electricus  sodium channel deduced from cDNA sequence. Nature 312:121‐127.  Nowak,M.W., P.C.Kearney, J.R.Sampson, M.E.Saks, C.G.Labarca, S.K.Silverman, W.Zhong,  J.Thorson, J.N.Abelson, N.Davidson, and . 1995. Nicotinic receptor binding site probed  with unnatural amino acid incorporation in intact cells. Science 268:439‐442.  Osteen,J.D., C.Gonzalez, K.J.Sampson, V.Iyer, S.Rebolledo, H.P.Larsson, and R.S.Kass. 2010.  KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate.  Proc Natl Acad Sci U S A 107:22710‐22715.  Pace,C.N., B.A.Shirley, M.McNutt, and K.Gajiwala. 1996. Forces contributing to the  conformational stability of proteins. FASEB J 10:75‐83.  Papazian,D.M., T.L.Schwarz, B.L.Tempel, Y.N.Jan, and L.Y.Jan. 1987. Cloning of genomic and  complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.  Science 237:749‐753.  Papazian,D.M., X.M.Shao, S.A.Seoh, A.F.Mock, Y.Huang, and D.H.Wainstock. 1995. Electrostatic  interactions of S4 voltage sensor in Shaker K+ channel. Neuron 14:1293‐1301.  Papazian,D.M., L.C.Timpe, Y.N.Jan, and L.Y.Jan. 1991. Alteration of voltage‐dependence of  Shaker potassium channel by mutations in the S4 sequence. Nature 349:305‐310.  Payandeh,J., T.Scheuer, N.Zheng, and W.A.Catterall. 2011. The crystal structure of a voltage‐ gated sodium channel. Nature 475:353‐358.  Perozo,E., L.Santacruz‐Toloza, E.Stefani, F.Bezanilla, and D.M.Papazian. 1994. S4 mutations alter  gating currents of Shaker K channels. Biophys J 66:345‐354.  Planells‐Cases,R., A.V.Ferrer‐Montiel, C.D.Patten, and M.Montal. 1995. Mutation of conserved  negatively charged residues in the S2 and S3 transmembrane segments of a mammalian  K+ channel selectively modulates channel gating. Proc Natl Acad Sci U S A 92:9422‐9426.  Pless,S.A., J.D.Galpin, A.P.Niciforovic, and C.A.Ahern. 2011. Contributions of counter‐charge in a  potassium channel voltage‐sensor domain. Nature Chemical Biology 7:617‐623.  Pongs,O. and J.R.Schwarz. 2010. Ancillary subunits associated with voltage‐dependent K+  channels. Physiol Rev 90:755‐796.  Pusch,M. 1998. Increase of the single‐channel conductance of KvLQT1 potassium channels  induced by the association with minK. Pflugers Arch 437:172‐174.   104     Restier,L., L.Cheng, and M.C.Sanguinetti. 2008. Mechanisms by which atrial fibrillation‐ associated mutations in the S1 domain of KCNQ1 slow deactivation of I(Ks) channels.  Journal of Physiology‐London 586:4179‐4191.  Roepke,T.K., V.A.Kanda, K.Purtell, E.C.King, D.J.Lerner, and G.W.Abbott. 2011. KCNE2 forms  potassium channels with KCNA3 and KCNQ1 in the choroid plexus epithelium. FASEB J.  Roepke,T.K., E.C.King, A.Reyna‐Neyra, M.Paroder, K.Purtell, W.Koba, E.Fine, D.J.Lerner,  N.Carrasco, and G.W.Abbott. 2009. Kcne2 deletion uncovers its crucial role in thyroid  hormone biosynthesis. Nat Med 15:1186‐1194.  Roepke,T.K., A.Kontogeorgis, C.Ovanez, X.Xu, J.B.Young, K.Purtell, P.A.Goldstein, D.J.Christini,  N.S.Peters, F.G.Akar, D.E.Gutstein, D.J.Lerner, and G.W.Abbott. 2008. Targeted deletion  of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB  J 22:3648‐3660.  Roepke,T.K., K.Purtell, E.C.King, K.M.La Perle, D.J.Lerner, and G.W.Abbott. 2010. Targeted  deletion of Kcne2 causes gastritis cystica profunda and gastric neoplasia. PLoS One  5:e11451.  Romey,G., B.Attali, C.Chouabe, I.Abitbol, E.Guillemare, J.Barhanin, and M.Lazdunski. 1997.  Molecular mechanism and functional significance of the MinK control of the KvLQT1  channel activity. J Biol Chem 272:16713‐16716.  Roux,B. and R.MacKinnon. 1999. The cavity and pore helices the KcsA K+ channel: Electrostatic  stabilization of monovalent cations. Science 285:100‐102.  Sakmann,B. 1992. Elementary steps in synaptic transmission revealed by currents through  single ion channels. Science 256:503‐512.  Sanguinetti,M.C., M.E.Curran, A.Zou, J.Shen, P.S.Spector, D.L.Atkinson, and M.T.Keating. 1996.  Coassembly of KvLQT1 and minK (IsK) proteins to form cardiac IKs potassium channel.  Nature 384:80‐83.  Sanguinetti,M.C., C.Jiang, M.E.Curran, and M.T.Keating. 1995. A mechanistic link between an  inherited and an acquired cardiac arrhythmia:  HERG encodes the IKr potassium channel.  Cell 81:299‐307.  Sanguinetti,M.C. and N.K.Jurkiewicz. 1990. Two components of delayed rectifier K+ current. J  Gen Physiol 96:195‐215.  Sanguinetti,M.C., N.K.Jurkiewicz, A.Scott, and P.K.Siegl. 1991. Isoproterenol antagonizes  prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E‐4031 in guinea  pig myocytes. Mechanism of action. Circ Res 68:77‐84.  105     Schoppa,N.E., K.McCormack, M.A.Tanouye, and F.J.Sigworth. 1992. The size of gating charge in  wild‐type and mutant Shaker potassium channels. Science 255:1712‐1715.  Schoppa,N.E. and F.J.Sigworth. 1998a. Activation of Shaker potassium channels I.   Characterization of voltage‐dependent transitions. J Gen Physiol 111:271‐294.  Schoppa,N.E. and F.J.Sigworth. 1998b. Activation of Shaker potassium channels III.  An  activation gating model for wild‐type and V2 mutant channels. J Gen Physiol 111:313‐ 342.  Seebohm,G., C.Lerche, M.Pusch, K.Steinmeyer, A.Bruggemann, and A.E.Busch. 2001. A kinetic  study on the stereospecific inhibition of KCNQ1 and I(Ks) by the chromanol 293B. Br J  Pharmacol 134:1647‐1654.  Sesti,F. and S.A.N.Goldstein. 1998. Single‐channel characteristics of wild‐type IKs channels and  channels formed with two minK mutants that cause long QT syndrome. J Gen Physiol  112:651‐663.  Shamgar,L., L.J.Ma, N.Schmitt, Y.Haitin, A.Peretz, R.Wiener, J.Hirsch, O.Pongs, and B.Attali.  2006. Calmodulin is essential for cardiac I‐KS channel gating and assembly ‐ Impaired  function in long‐QT mutations. Circ Res 98:1055‐1063.  Shang,L., S.V.Ranson, and S.J.Tucker. 2009. Kir5.1 underlies long‐lived subconductance levels in  heteromeric Kir4.1/Kir5.1 channels from Xenopus tropicalis. Biochem Biophys Res  Commun 388:501‐505.  Sigworth,F.J. 1980. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol  307:97‐129.  Smith,J.A., C.G.Vanoye, A.L.George, Jr., J.Meiler, and C.R.Sanders. 2007. Structural models for  the KCNQ1 voltage‐gated potassium channel. Biochemistry 46:14141‐14152.  Smith‐Maxwell,C.J., J.L.Ledwell, and R.W.Aldrich. 1998. Uncharged S4 residues and  cooperativity in voltage‐dependent potassium channel activation. J Gen Physiol 111:421‐ 439.  Sokolova,O., L.Kolmakova‐Partensky, and N.Grigorieff. 2001. Three‐dimensional structure of a  voltage‐gated potassium channel at 2.5 nm resolution. Structure (Camb) 9:215‐220.  Soler‐Llavina,G.J., T.H.Chang, and K.J.Swartz. 2006. Functional interactions at the interface  between voltage‐sensing and pore domains in the Shaker K(v) channel. Neuron 52:623‐ 634.   106     Splawski,I., M.Tristani‐Firouzi, M.H.Lehmann, M.C.Sanguinetti, and M.T.Keating. 1997.  Mutations in the hminK gene cause long QT syndrome and suppress IKs function. Nat  Genet 17:338‐340.  Starace,D.M., E.Stefani, and F.Bezanilla. 1997. Voltage‐dependent proton transport by the  voltage sensor of the Shaker K+ channel. Neuron 19:1319‐1327.  Stefani,E., L.Toro, E.Perozo, and F.Bezanilla. 1994. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and  gating currents. Biophys J 66:996‐1010.  Suh,B.C., T.Inoue, T.Meyer, and B.Hille. 2006. Rapid chemically induced changes of  PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science 314:1454‐1457.  Swartz,K.J. 2004. Towards a structural view of gating in potassium channels. Nat Rev Neurosci  5:905‐916.  Takumi,T., K.Moriyoshi, I.Aramori, T.Ishii, S.Oiki, Y.Okada, H.Ohkubo, and S.Nakanishi. 1991.  Alteration of channel activitites and gating by mutations of slow IsK potassium channel. J  Biol Chem 266:22192‐22198.  Tao,X., A.Lee, W.Limapichat, D.A.Dougherty, and R.MacKinnon. 2010. A gating charge transfer  center in voltage sensors. Science 328:67‐73.  Tapper,A.R. and A.L.George, Jr. 2001. Location and orientation of minK within the I(Ks)  potassium channel complex. J Biol Chem 276:38249‐38254.  Tempel,B.L., D.M.Papazian, T.L.Schwarz, Y.N.Jan, and L.Y.Jan. 1987. Sequence of a probable  potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science 237:770‐ 775.  Tinel,N., S.Diochot, M.Borsotto, M.Lazdunski, and J.Barhanin. 2000. KCNE2 confers background  current characteristics to the cardiac KCNQ1 potassium channel. EMBO Journal 19:6326‐ 6330.  Tzounopoulos,T., J.Maylie, and J.P.Adelman. 1998. Gating of I‐sK channels expressed in Xenopus  oocytes. Biophys J 74:2299‐2305.  VanDongen,A.M. 2004. K channel gating by an affinity‐switching selectivity filter. Proc Natl Acad  Sci U S A 101:3248‐3252.  VanDongen,A.M.J. 1996. A new algorithm for idealizing single ion channel data containing  multiple unknown conductance levels. Biophys J 70:1303‐1315.  Venkataramanan,L., J.Zheng, R.Kuc, and F.J.Sigworth. 1998. Application of hidden Markov  modeling techniques to single channel recordings. Biophys J 74:A321.  107     Villalba‐Galea,C.A., W.Sandtner, D.M.Starace, and F.Bezanilla. 2008. S4‐based voltage sensors  have three major conformations. Proc Natl Acad Sci U S A 105:17600‐17607.  Volders,P.G., M.Stengl, J.M.van Opstal, U.Gerlach, R.L.Spatjens, J.D.Beekman, K.R.Sipido, and  M.A.Vos. 2003. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key  role for beta‐adrenergic receptor stimulation. Circulation 107:2753‐2760.  Wang,K.‐W. and S.A.N.Goldstein. 1995. Subunit composition of MinK potassium channels.  Neuron 14:1303‐1309.  Wang,Q., M.E.Curran, I.Splawski, T.C.Burn, J.M.Millholland, T.J.VanRaay, J.Shen, K.W.Timothy,  G.M.Vincent, T.De Jager, P.J.Schwartz, J.A.Towbin, A.J.Moss, D.L.Atkinson, G.M.Landes,  T.D.Connors, and M.T.Keating. 1996. Positional cloning of a novel potassium channel  gene:  KVLQT1 mutations cause cardiac arrhythmias. Nature Genet 12:17‐23.  Wu,J., W.Shimizu, W.G.Ding, S.Ohno, F.Toyoda, H.Itoh, W.J.Zang, Y.Miyamoto, S.Kamakura,  H.Matsuura, K.Nademanee, J.Brugada, P.Brugada, R.Brugada, M.Vatta, J.A.Towbin,  C.Antzelevitch, and M.Horie. 2010. KCNE2 modulation of Kv4.3 current and its potential  role in fatal rhythm disorders. Heart Rhythm 7:199‐205.  Xie,L.H., S.A.John, B.Ribalet, and J.N.Weiss. 2008. Phosphatidylinositol‐4,5‐bisphosphate (PIP2)  regulation of strong inward rectifier Kir2.1 channels: multilevel positive cooperativity. J  Physiol 586:1833‐1848.  Xu,Y., Y.Ramu, and Z.Lu. 2008. Removal of phospho‐head groups of membrane lipids  immobilizes voltage sensors of K+ channels. Nature 451:826‐829.  Yang,N. and R.Horn. 1995. Evidence for voltage‐dependent S4 movement in sodium channels.  Neuron 15:213‐218.  Yang,Y.S. and F.J.Sigworth. 1998. Single‐channel properties of IKs potassium channels. J Gen  Physiol 112:665‐678.  Yarov‐Yarovoy,V., D.Baker, and W.A.Catterall. 2006. Voltage sensor conformations in the open  and closed states in ROSETTA structural models of K(+) channels. Proc Natl Acad Sci U S  A 103:7292‐7297.  Yellen,G. 2002. The voltage‐gated potassium channels and their relatives. Nature 419:35‐42.  Yue,D.T., S.Herzig, and E.Marban. 1990. Beta‐adrenergic stimulation of calcium channels occurs  by potentiation of high‐activity gating modes. Proc Natl Acad Sci U S A 87:753‐757.  Zagotta,W.N., T.Hoshi, and R.W.Aldrich. 1994a. Shaker potassium channel gating.  III: Evaluation  of kinetic models for activation. J Gen Physiol 103:321‐362.  108     Zagotta,W.N., T.Hoshi, J.Dittman, and R.W.Aldrich. 1994b. Shaker potassium channel gating.  II:  Transitions in the activation pathway. J Gen Physiol 103:279‐319.  Zhang,M., M.Jiang, and G.N.Tseng. 2001. MinK‐related peptide 1 associates with Kv4.2 and  modulates its gating function ‐ Potential role as  subunit of cardiac transient outward  channel? Circ Res 88:1012‐1019.  Zheng,J. and F.J.Sigworth. 1997. Selectivity changes during activation of mutant Shaker  potassium channels. J Gen Physiol 110:101‐117.  Zheng,J. and F.J.Sigworth. 1998. Intermediate conductances during deactivatian of  heteromultimeric Shaker potassium channels. J Gen Physiol 112:457‐474.  Zheng,J., L.Vankataramanan, and F.J.Sigworth. 2001. Hidden Markov model analysis of  intermediate gating steps associated with the pore gate of shaker potassium channels. J  Gen Physiol 118:547‐564.  Zhou,J., J.F.Potts, J.S.Trimmer, W.S.Agnew, and F.J.Sigworth. 1991. Multiple gating modes and  the effect of modulating factors on the l sodium channel. Neuron 7:775‐785.          109     


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items