UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

Sensory experience driven network plasticity in the awake developing brain Dunfield, Derek James 2009

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata

Download

Media
24-ubc_2009_fall_dunfield_derek.pdf [ 4.57MB ]
Metadata
JSON: 24-1.0067735.json
JSON-LD: 24-1.0067735-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0067735-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0067735-rdf.json
Turtle: 24-1.0067735-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0067735-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0067735-source.json
Full Text
24-1.0067735-fulltext.txt
Citation
24-1.0067735.ris

Full Text

 SENSORY EXPERIENCE DRIVEN NETWORK PLASTICITY IN THE AWAKE  DEVELOPING BRAIN      by      DEREK JAMES DUNFIELD    B.Sc.H ‐ SSP, Queen’s University, 2003  M.Sc., Queen’s University, 2004      A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF  THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    DOCTOR OF PHILOSOPHY      in      THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES    (Neuroscience)        THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA    (Vancouver)      September 2009    © Derek James Dunfield, 2009  ABSTRACT  During embryonic activity‐dependent brain circuit refinement, neurons receiving the  same natural sensory input may undergo either long‐term potentiation (LTP) or depression  (LTD). While the origin of variable plasticity in vivo is unknown, the type of plasticity induced  plays a key role in shaping dynamic neural circuit synaptogenesis and growth. Here, we  investigate the effects of natural visual stimuli on functional neuronal firing within the intact  and awake developing brain using calcium imaging of 100s of central neurons in the Xenopus  retinotectal system. We find that specific patterns of visual stimuli shift population responses  towards either potentiation or depression in an N‐methyl‐D‐aspartate receptor (NMDAR)‐ dependent manner. In agreement with the Bienenstock‐Cooper‐Munro (BCM) theory, our  results show that functional potentiation or depression in individual neurons can be predicted  by their specific receptive field properties and endogenous firing rates prior to plasticity  induction. Enhancing pre‐training activity shifts plasticity outcomes as predicted by BCM, and  this induced metaplasticity is also NMDAR dependent. Furthermore, network analysis reveals  an increase in correlated firing of neurons that undergo potentiation. These findings implicate  metaplasticity as a natural property governing experience‐dependent refinement of nascent  embryonic brain circuits.      ii    TABLE OF CONTENTS  ABSTRACT   .......................................................................................................................... ii  TABLE OF CONTENTS  .............................................................................................................. iii  LIST OF TABLES  ...................................................................................................................... vii  LIST OF FIGURES  ................................................................................................................... viii  ACKNOWLEDGEMENTS  ............................................................................................................ x  DEDICATION  ........................................................................................................................... xi  COAUTHORSHIP STATEMENT  ................................................................................................. xii  1.  Introduction ...................................................................................................... 1  1.1.  General introduction to developmental plasticity ........................................................... 1  1.2.  Long‐term changes in synaptic transmission ................................................................... 4  1.2.1  “Traditional” long term potentiation and long term depression within the mature  mammalian hippocampus ...................................................................................................... 4  1.2.2  Molecular mechanisms of LTP induction .................................................................. 6  1.2.3  Long term depression ............................................................................................... 9  1.2.4  LTP / LTD induction protocols and spike time dependent plasticity ...................... 11  1.2.5  Evidence for LTP/LTD in vivo ................................................................................... 12  1.2.6  LTP/LTD in the developing brain ............................................................................. 15  1.3.  Plasticity of intrinsic excitability ..................................................................................... 17  1.3.1  Neuronal excitability, ionic channels, and the input–output function ................... 17  1.3.2  NMDA receptor dependent EPSP‐spike plasticity .................................................. 18  1.4.  Experience‐driven plasticity in the Xenopus tadpole retinotectal system .................... 20  1.4.1  Morphological plasticity.......................................................................................... 20  1.4.2  Visually‐driven synaptic plasticity ........................................................................... 22  iii    1.4.3  Homeostatic regulation of intrinsic excitability ...................................................... 26  1.5.  Metaplasticity ................................................................................................................. 27  1.5.1  The plasticity of plasticity ....................................................................................... 27  1.5.2  The Bienenstock, Cooper and Munro (BCM) computational model of synaptic  plasticity ................................................................................................................................ 29  1.5.3  NMDA receptor‐mediated metaplasticity .............................................................. 31  1.5.4  Metaplastic E‐S plasticity: common learning rules? ............................................... 32  1.5.5  Metaplasticity induced by environmental stimuli .................................................. 33  1.6.  Research hypothesis and objectives .............................................................................. 36  1.7.  References ...................................................................................................................... 39  2.  Metaplasticity governs natural experience‐driven plasticity of nascent  embryonic brain circuits ........................................................................................................ 55  2.1.  Introduction .................................................................................................................... 55  2.2.  Results ............................................................................................................................ 57  2.2.1  Long lasting functional plasticity in central neuronal ensembles driven by natural  sensory stimuli ...................................................................................................................... 58  2.2.2  Variable plasticity of individual central neurons to the same sensory training  paradigm ............................................................................................................................... 59  2.2.3  Synaptic mechanisms underlying visually induced tectal RF plasticity .................. 61  2.2.4  RF mapping across tectal circuit and specificity of plasticity to the characteristics  of the training sensory stimuli .............................................................................................. 61  2.2.5  Metaplastic rules predict visually induced RF plasticity of individual neurons ...... 62  2.2.6  Experimentally increased pre‐training activity shifts spaced training plasticity  outcomes toward depression through an NMDAR dependent mechanism ........................ 64  2.2.7  Potentiation is associated with an increase in spontaneous correlated firing ...... 65  2.3.  Discussion ....................................................................................................................... 66  iv    2.4.  Experimental procedures ............................................................................................... 69  2.4.1  Animal rearing conditions ....................................................................................... 69  2.4.2  Calcium indicator loading ....................................................................................... 69  2.4.3  In vivo two‐photon calcium imaging of neuronal dynamics ................................... 70  2.4.4  Visual stimulation ................................................................................................... 70  2.4.5  Single cell excitability probing (SCEP) ..................................................................... 71  2.4.6  Visual training ......................................................................................................... 71  2.4.7  White noise ............................................................................................................. 72  2.4.8  Blockade of NMDAR ................................................................................................ 72  2.4.9  Analysis of imaging data ......................................................................................... 72  2.4.10  Evoked responses ................................................................................................... 73  2.4.11  Spontaneous spiking ............................................................................................... 73  2.4.12  Inclusion criteria ...................................................................................................... 73  2.4.13  Plasticity criteria ...................................................................................................... 74  2.4.14  Spontaneous correlations ....................................................................................... 74  2.4.15  Clustering ................................................................................................................ 75  2.5.  Acknowledgements ........................................................................................................ 75  2.6.  Figures ............................................................................................................................ 76  2.7.  References ...................................................................................................................... 96  3.  In vivo single cell excitability probing of neuronal ensembles in the intact  developing brain ................................................................................................................. 101  3.1.  Introduction .................................................................................................................. 101  3.2.  Materials ...................................................................................................................... 104  3.2.1  Reagents ................................................................................................................ 104  v    3.2.2  Equipment ............................................................................................................. 105  3.2.3  Reagent setup ....................................................................................................... 106  3.2.4  Equipment setup ................................................................................................... 107  3.3.  Procedure ..................................................................................................................... 109  3.3.1  Staining neurons with calcium‐indicator dye ....................................................... 109  3.3.2  Two‐photon imaging and excitability probing ...................................................... 111  3.4.  Anticipated results ....................................................................................................... 114  3.5.  Tables ........................................................................................................................... 116  3.6.  Figures .......................................................................................................................... 118  3.7.  References .................................................................................................................... 122  4.  Concluding chapter ....................................................................................... 125  4.1.  Metaplasticy’s role in development ............................................................................. 125  4.2.  Bridging the gap between cells and systems ............................................................... 128  4.2.1  Population recordings with single cell resolution ................................................ 128  4.2.2  Alternatives to SCEP .............................................................................................. 129  4.3.  Status of working hypotheses and contribution to the field ....................................... 130  4.4.  Future directions: Linking functional and morphological plasticity ............................. 132  4.5.  Clinical relevance .......................................................................................................... 134  4.6.  References .................................................................................................................... 137  5.  Appendix A: Ethics board certificates ............................................................ 142      vi    LIST OF TABLES  Table 3.1  Training paradigms .............................................................................................. 116  Table 3.2  Troubleshooting table ......................................................................................... 117  vii    LIST OF FIGURES  Figure 2.1  Visually‐driven plasticity of evoked Ca2+ events in the intact and awake brain ... 76  Figure 2.2  Fluorescent calcium responses to visual stimuli ................................................... 77  Figure 2.3  Characteristics of fluorescent calcium responses to visual OFF stimuli ............... 78  Figure 2.4  SCEP and training paradigms ................................................................................ 79  Figure 2.5  Activity during training .......................................................................................... 81  Figure 2.6  Natural visual stimuli induce variable functional plasticity in the embryonic brain ....................................................................................................................................................... 82  Figure 2.7  In vivo long lasting plasticity of single neurons and ensemble populations using  visually evoked single cell excitability probing (SCEP). ................................................................. 83  Figure 2.8  NMDAR blockade does not affect visually evoked calcium response amplitudes 85  Figure 2.9  Vehicle injection does not affect training ............................................................. 86  Figure 2.10  Line scan of single neuron OFF and ON response ................................................. 87  Figure 2.11  Tectal neurons cluster based on RF properties and RF plasticity is preferential to  the trained stimulus ...................................................................................................................... 88  Figure 2.12  Spontaneous activity of potentiated cells is unchanged after spaced training .... 89  Figure 2.13  Metaplasticity and stabilization of visually induced neuronal plasticity .............. 90  Figure 2.14  Variations in bulk loading dye uptake are not correlated with calcium transient  spike amplitudes ........................................................................................................................... 92  Figure 2.15  Training activity does not account for spaced training induced plasticity ........... 93  Figure 2.16  Increased activity prior to training shifts plasticity outcomes toward depression  through an NMDAR dependent mechanism ................................................................................ 94  Figure 2.17  Network analysis reveals increased correlated activity in neurons exhibiting  potentiation   ............................................................................................................................... 95      viii    Figure 3.1  SCEP equipment setup ........................................................................................ 118  Figure 3.2  Calcium indicator loading of the tadpole optic tectum ...................................... 119  Figure 3.3  Scanning triggered visual stimuli ......................................................................... 120  Figure 3.4  In vivo SCEP of wide field visual stimuli in the awake developing brain ............. 121      ix    ACKNOWLEDGEMENTS  I would like to thank my committee members – including Dr. Brian MacVicar, Dr. Catharine  Rankin, and Dr. Ann‐Marie Craig – for their invaluable support of my work. Special thanks go to  my supervisor, Dr. Kurt Haas, for providing me the freedom to develop my own research from  the ground up. The insights I’ve gained from being involved in the front line of a start‐up lab will  undoubtedly colour my vision of research for years to come. Incentives in academia may not  promote taking risks, but we did, and they paid off. Thank you to K. Podgorski for help with  correlation and clustering analysis in Chapter 2; D. Hines for supportive insights on calcium  imaging; the Haas lab for arduous, day‐long meetings and advice; and T. Murphy, D. Allan, S.  Bamji, and B. Chen, for revisions of my Chapter 2 manuscript. I would also like to thank my lab  mates for input on the following pages: B. Duncan for p. 1 and 12; S. Chen for p. 12, 25, 15, 21 ,  18, and 20; S. Hossain  for p. 8, 5, 19, and 9; X. Liu for p. 19, 1, 18, and 5; S. Hewapathirane for  p. 2, 5, 12 ,15, 14 ,7, and 20; W. Yen for p. 15, and 21; and P. Edgecumbe for p. 19.  This work and was supported by the National Science and Engineering Council of Canada, the  Canadian Institute of Health Research, the Michael Smith Foundation for Health Research, the  Canadian Foundation for Innovation, the British Columbia Innovation Council, The EJLB  Foundation, and the Human Early Learning Project. My full salary was funded by the Canadian  Federal Government, and Ontario and British Columbian Provincial Governments. As such, I  believe I have a great responsibility to contribute back to Canada. To the Canadian Tax Payer, I  will not let you down. Finally, thank you to Dr. Heidi Gordon. You brought me to Vancouver and  made every minute worth while.    x    DEDICATION  To Robert and Susan Dunfield, Ian and Barbara Browne, and Lois Dinwoodie:  Let’s hope this is the last summer I miss being in your company. xi    xii    COAUTHORSHIP STATEMENT  Derek  Dunfield  conceived,  designed,  executed,  and  analyzed  all  research  herein.  Dunfield  prepared  all  figures  and manuscripts. Dr.  Kurt Haas  contributed  valuable  comments  for  the  revision of the manuscripts presented in Chapters 2 and 3.  1. INTRODUCTION  1.1. GENERAL INTRODUCTION TO DEVELOPMENTAL PLASTICITY  One of the most complex tasks in all of biology is the formation of the human brain.  Throughout early development, neural circuits form by an active process of trial and error  where synaptic inputs are created and strengthened, or weakened and lost to optimize each  neuron’s response to a specific set of afferent stimuli or receptive field. During critical  developmental periods, receptive fields of central neurons undergo dramatic changes as they  are shaped by sensory input (Hubel and Wiesel, 1963; Katz and Shatz, 1996; Pratt et al., 2008).  The size and shape of a neuron’s structure also undergo dramatic changes throughout  development as newly differentiated neurons grow from simple spheres to extension of  elaborate dendritic tree‐like structures (Jontes et al., 2000; Kaethner and Stuermer, 1997; Niell  et al., 2004; Wu et al., 1999). Brain neuron structural growth is also highly dynamic coinciding  with, and integrally dependent on, developmental synaptogenesis. Synapse strengthening and  weakening confers morphological stabilization and extension, or destabilization and retraction  to highly plastic growing axons (Meyer and Smith, 2006; Ruthazer et al., 2003; Ruthazer et al.,  2006) and dendrites (Niell et al., 2004). Likewise, brain neuronal structural growth is also  influenced by environmental experience (Cline and Haas, 2008; Greenough et al., 1989; Sin et  al., 2002b).   1    Synapse plasticity, which is believed to mediate synaptotropic dendritic growth during  critical periods of early brain development, has primarily been studied as long‐term  potentiation and depression (LTP/LTD) of glutamatergic synaptic transmission of Schaffer  collateral‐CA1 synapses in the mature rodent hippocampus, a brain region considered integral  in memory formation (Bliss and Collingridge, 1993; Bliss and Lomo, 1973). LTP is a persistent  increase in synaptic strength in response to a strong training stimulus. It has been detected at  excitatory synapses throughout the brain and can last from hours to months (Malenka and  Bear, 2004). Experimentally, LTP is typically induced in hippocampal brain slices by strong  electrical stimulation of large numbers of afferent inputs using large bipolar electrodes (Bliss  and Collingridge, 1993; Rose and Dunwiddie, 1986). Long‐term depression (LTD), a persistent  decrease in synaptic strength, can be induced in Schaffer collateral‐CA1 synapses by low  frequency electrical simulation in the hippocampal brain slice preparation (Thiels et al., 1994).  The most commonly studied forms of LTP and LTD are N‐methyl‐D‐aspartate receptor (NMDAR)  dependent (Dudek and Bear, 1992; Mulkey and Malenka, 1992) and require Ca2+ influx for  activation (Mulkey and Malenka, 1992). LTP and LTD have also been described in the  developing brain (Crair and Malenka, 1995; Dudek and Friedlander, 1996; Kirkwood et al., 1995;  Rittenhouse et al., 1999; Sermasi et al., 1999; Tao et al., 2001; Yasuda et al., 2003; Zhang et al.,  1998).   One critical question in the field of LTP and LTD is whether it represents an endogenous  mechanism used by the brain for learning and memory, or whether it is an experimental  artefact. This question arises from the highly unnatural electrical stimuli typically employed for  LTP and LTD induction. Large bipolar electrodes are used to drive synchronous axonal firing of  2    large numbers of afferent inputs in a manner unlikely to occur under physiological conditions.  To address this concern, a number of studies in the adult nervous system have provided  evidence that natural sensory stimuli, such as fear conditioning and motor training, may induce  long‐term synaptic modifications similar to electrical stimulation‐induced LTP and LTD (Moser  et al., 1998; Rioult‐Pedotti et al., 1998; Rogan et al., 1997; Rumpel et al., 2005; Xu et al., 1998).  A central question in developmental neuroscience is whether the same molecular  mechanisms underlying synapse plasticity in the mature brain associated with learning and  memory are utilized during development for synaptogenesis and synaptotropic growth during  experience‐dependent brain circuit formation. In the mammalian brain, ability to  experimentally induce LTP by electrical stimulation is increased during developmental periods  of neural circuit formation (Crair and Malenka, 1995; Kirkwood et al., 1995), suggesting it may  serve in activity‐dependent synaptogenesis and competition‐based synapse stabilization or  pruning. In the Xenopus laevis tadpole optic tectum, during periods of active synaptogenesis,  neuronal growth, and receptive field refinement, NMDAR dependent LTP and LTD can be  induced by repetitive electric stimulation of afferent retinal ganglion cells in a similar fashion to  LTP and LTD induction at mature rodent Schaffer collateral‐CA1 hippocampal synapses (Tao et  al., 2001; Zhang et al., 1998).  A wealth of evidence demonstrates that developmental neural circuit formation is  strongly influenced by natural sensory stimuli during critical periods of brain development  (Greenough et al., 1986; Greenough et al., 1989; Katz and Shatz, 1996; Rittenhouse et al.,  1999). To support the hypothesis that LTP and LTD play a role in dendritic morphological  3    development, LTP and LTD plasticity must be shown to occur endogenously in response to  natural experience. Importantly, a number of studies have demonstrated LTP and LTD in the  developing brain induced by natural sensory stimuli (Engert et al., 2002; Tao et al., 2001; Xu et  al., 1998; Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2003). Electrophysiological evidence of visually‐driven  LTP in vivo was demonstrated in the developing Xenopus laevis tadpole retinotectal system  using repetitive dimming light stimuli and moving bar stimuli applied to the retina (Engert et al.,  2002; Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2003). Visually‐driven LTP induction resulted in persistent,  NMDAR dependent, enhancement of RGC glutamatergic synaptic inputs on tectal neurons and  exhibits similar characteristics to electrically‐induced LTP in this system (Tao et al., 2001; Zhang  et al., 2000).    1.2. LONG‐TERM CHANGES IN SYNAPTIC TRANSMISSION  1.2.1 “Traditional”  long  term  potentiation  and  long  term  depression  within  the  mature  mammalian hippocampus  In the adult nervous system, synaptic plasticity generally refers to modulation of  synaptic strength caused by changes in postsynaptic currents and potentials in response to  unvarying pre‐synaptic input. With over 10000 publications, the most studied form of synaptic  plasticity is NMDAR‐dependent long‐term potentiation (LTP) of glutamatergic synaptic  transmission – a long term increase in synaptic strength that can last from hours to possibly  months (Malenka and Bear, 2004).  LTP has been identified at synapses throughout the  mammalian brain, yet it is classically studied in area CA1 of the hippocampus, a brain region  4    considered an integral component of memory formation (Bliss and Collingridge, 1993). LTP  induction is accomplished by electrically stimulating the Schaffer collateral‐CA1 pathway.  Schaffer collaterals are axon projections given off by CA3 pyramidal cells that project to area  CA1. NMDAR‐dependent LTP is characterized by four basic properties: cooperativity,  associativity, input‐selectivity, and NMDAR dependence. Cooperativity underlies the  requirement of excitation of multiple afferents for LTP induction. ‘Weak’ electrical stimulation,  activating few afferent fibres, does not trigger LTP (McNaughton et al., 1978). Similarly, the  intensity and frequency of electrical stimulation is directly associated with the duration of the  induced potentiation – ‘strong’, multiple afferent, stimulation engages long‐term potentiation  while stimulation with intensities between ‘strong’ and ‘weak’ induces a shorter termed  potentiation (Lovinger and Routtenberg, 1988; Malenka, 1991). Associativity describes the  ability of ‘weak’ stimulated afferents to become potentiated if active at the same time as  secondary and separate ‘strong’ stimulated afferents (Levy and Steward, 1979; McNaughton et  al., 1978). Input selectivity is considered a property of LTP because only synapses that are  activated during stimulation are involved in potentiation (Andersen et al., 1977; Lynch et al.,  1977). These three properties follow the rule that a synapse will undergo LTP only when both  the synapse is active and the dendrite is sufficiently depolarized (Bliss and Collingridge, 1993).  Such a rule is achieved molecularly by using the NMDA receptor as a coincidence detector  within the post‐synaptic site for pre‐synaptic signals and strong post‐synaptic depolarization,  explaining the forth property – NMDAR‐dependence.   By definition, NMDAR‐dependent LTP requires activation of NMDARs during  postsynaptic depolarization. This is because Ca2+ influx through the NMDAR channel into the  5    postsynaptic site is absolutely necessary to trigger LTP (Malenka et al., 1992). NMDA receptors  play an essential role in detecting correlated pre‐ and postsynaptic activity; they are opened by  glutamate release from pre‐synaptic axonal terminals but only transmit ions when magnesium  ions (Mg2+) blocking their pores are removed by sufficient postsynaptic depolarization (Nowak  et al., 1984). When two cells with overlapping axonal arbours terminate on the dendrite of a  single neuron, correlated activity between these arbours will depolarize the post‐synaptic cell  dendrite to a greater extent than when one fires alone. Excitation from converging axons is  more likely to release postsynaptic Mg2+ blockade of NMDA receptors, making them permeable  to Ca2+ and activating second messenger cascades which mediate synaptic plasticity.    1.2.2 Molecular mechanisms of LTP induction  NMDAR‐dependent LTP is typically classified in two stages – an early phase (E‐LTP),  lasting only a few hours (Frey and Morris, 1997), and a late phase (L‐LTP) , which is protein  synthesis dependent and reported to last from hours to possibly months (Malenka and Bear,  2004). The molecular mechanisms governing the early phase of potentiation of the excitatory  postsynaptic current (EPSC) and its maintenance into L‐LTP are the focus of hundreds of labs. A  few molecules have been pin‐pointed as necessary for LTP’s induction and maintenance. Both  the early and late phases of LTP require calcium influx through activated NMDAR channels  during LTP induction, though a quantitative analysis of the necessary post‐synaptic Ca2+ signal  remains elusive. Ca2+ ions are rapidly bound by calmodulin which triggers adenylate cyclase  production of cAMP as well as Ca2+/calmodulin dependent kinase II (CaMKII) activation  (Kennedy et al., 2005). It is believed that the activation of protein kinases such as CaMKII, which  then phosphorylate proteins local to the site of calcium influx, underlies the expression of E‐ 6    LTP. Overall, CaMKII is a key component of the molecular machinery of LTP (Malenka and Nicoll,  1999). It is found in high concentrations at the post‐synaptic density; inhibition or genetic  deletion of CaMKII blocks LTP induction (Malenka et al., 1989; Malinow et al., 1989); and  constitutively active CaMKII both enhances synaptic transmission and occludes LTP in CA1 cells  of the hippocampus (Lledo et al., 1995; Pettit et al., 1994). CaMKII is not, however, associated  with the maintenance of previously established E‐LTP to the late L‐LTP phase (Chen et al., 2001;  Malenka et al., 1989; Malinow et al., 1988; Otmakhov et al., 1997). One important target of  CaMKII is the AMPA‐receptor (AMPAR) subunit GluR1. AMPARs mediate the majority of the  EPSC during synapse activation, and LTP has been shown to both enhance AMPAR single  channel conductance by phosphorylation, as well as to increase the number of AMPARs  inserted at the post‐synaptic site (Malinow and Malenka, 2002). GluR1 phosphorylation by  CaMKII has been show to directly enhance AMPAR single channel conductance (Andrasfalvy  and Magee, 2004; Derkach et al., 1999; Poncer et al., 2002). Furthermore, CaMKII activation has  been shown to promote insertion of GluR1 subunit‐containing AMPA receptors to synapses to  increase AMPAR number (Shi et al., 2001a).  L‐LTP requires stronger stimulation for induction than E‐LTP (Lovinger and Routtenberg,  1988; Malenka, 1991). An attractive theory suggests molecular mechanisms at the post‐ synaptic site, unused in E‐LTP, are activated during the strong stimulation to establish L‐LTP.  Strong input triggers a higher threshold involving transmission of signals to the nucleus to  initiate synthesis of plasticity associated proteins. The non‐specific kinase inhibitor  staurosporine blocks both E‐LTP and  L‐LTP (Hanse and Gustafsson, 1994), indicating kinase  activity at the site of calcium influx may be the molecular mechanism involved in the messenger  7    pathway that sends signals to the nucleus. A number of signalling molecules have been  investigated including CaMKIV, cAMP‐dependent protein kinase (PKA), and mitogen‐activated  protein kinase (MAPK), which in turn activate the key transcription factor CREB (cAMP‐response  element binding protein) as well as immediate early genes (IEGs) (Abraham and Williams, 2003;  Lynch, 2004; Pittenger and Kandel, 2003; Silva et al., 1998). CREB’s downstream target, the  Ca2+/calmodulin and cAMP‐dependent nuclear transcription factor CRE is selectivity activated  by a ‘strong’ L‐LTP induction protocol but insensitive to a ‘weak’ E‐LTP stimulus (Impey et al.,  1996), suggesting CREB is indeed involved in L‐LTP.   Along with enhancement of EPSCs, L‐LTP is also associated with morphological structural  changes which are believed to underlie the long term maintenance of the synaptic weight  change. Morphological changes include growth of new dendritic spines, enlargement of pre‐ existing spines and their post‐synaptic densities (PSDs), and possibly the splitting of single PSDs  and spines into two functional synapses (Abraham and Williams, 2003; Yuste and Bonhoeffer,  2001), though this is controversial (Maletic‐Savatic et al., 1999). Using two‐photon microscopy  and localized photolysis and release of caged glutamate, dendritic spine enlargement has been  directly associated with LTP (Matsuzaki et al., 2004). A popular model explaining the growth of  the PSD and dendritic spine, involves the insertion of “slot proteins” which act as placeholders  for addition of AMPARs to the synapse and associated molecules to the PSD (Malinow and  Malenka, 2002; Shi et al., 2001b). These slot proteins would allow a stable number of AMPARs  to be maintained at the synapse since AMPARs appear to cycle rapidly in and out of the  synaptic membrane (Luscher et al., 1999; Nishimune et al., 1998; Shi et al., 2001b; Song et al.,  1998).  8    1.2.3 Long term depression  A key breakthrough in activity dependent synaptic modulation was the discovery of an  electrical stimulation pattern of the Schaffer‐collateral‐CA1 pathway that elicited homosynaptic  NMDAR‐dependent long term depression (LTD) of basal synaptic response (Dudek and Bear,  1992).  LTD is a phenomenon similar to LTP but causes a long term decrease in synaptic  strength rather than long term increase. LTD is both NMDAR dependent (Dudek and Bear, 1992;  Mulkey and Malenka, 1992) and requires Ca2+ influx for its activation (Mulkey and Malenka,  1992). While quantitative characterization of the amount of Ca2+ required for LTD induction  remains to be determined, a model is emerging in which low levels of calcium elevation  produces LTD and higher levels induce LTP. NMDAR‐dependent LTD is widely expressed  throughout the mammalian brain, but is typically studied in the CA1 region of the hippocampus.   In an analog to the proposed signalling pathway of LTP, which requires protein  phosphorylation for its induction, LTD is correlated with dephosphorylation of postsynaptic  substrates, specifically PKC and PKA (Hrabetova and Sacktor, 2001; Kameyama et al., 1998; Lee  et al., 1998; van Dam et al., 2002).  The strongest case for the dephosphorylation of substrates  has been made for PKA, where postsynaptic inhibition of PKA, inducing displacement of PKA  from intercellular anchoring proteins (AKAPs), causes a run‐down in synaptic transmission  similar to LTD and also occludes LTD. Post‐synaptic activation of PKA can also abolish previously  induced LTD without affecting the basal synaptic response (Kameyama et al., 1998). A curiosity  with respect to the dephosphorylation model is the exclusion of CaMKII substrate  phosphorylation, which doesn’t change with LTD. It has been suggested that a very precise  recruitment of protein phosphatases, in particular protein phosphatase one (PP1), to selected  9    substrates such as PKA via the binding to specific post‐synaptic targeting proteins may explain  the observed selective dephosphorylation (Morishita et al., 2001). In fact, post‐synaptic  introduction of protein phosphatase inhibitors targeting calcineurin and PP1 prevent LTD  (Kirkwood and Bear, 1994; Mulkey et al., 1994; Mulkey et al., 1993).   Like LTP, the expression of LTD is thought to be a consequence of changes in AMPAR  phosphorylation. Dephosphorylation of ser‐845 on the C‐tail of the GluR1 subunit, a PKA  substrate, decreases AMPAR open channel probability and occurs with LTD. Interestingly, LTD  shows no change in phosphorylation of ser‐831, the substrate of CaMKII implicated in LTP.  Because ser‐845 is similarly unaffected by LTP, phosphorylation of ser‐845 and ser‐831 can be  used a markers for LTD and LTP in vivo (Shukla et al., 2007; Whitlock et al., 2006). In contrast to  LTP, AMPARs are rapidly internalized in response to LTD (Malinow and Malenka, 2002).  Precisely how Ca2+‐dependent phosphatase activity rapidly reduces surface expression of  AMPARs remains unclear.   LTD can also be classified into two stages, an early phase (E‐LTD) and a late phase (L‐ LTD) which requires protein synthesis (Kauderer and Kandel, 2000; Manahan‐Vaughan et al.,  2000; Sajikumar and Frey, 2003). However, in contrast to L‐LTP, L‐LTD seems to require only  mRNA translation, not transcription, to uphold stable expression of LTD. However, little is  known about which newly synthesized proteins are required to maintain LTD. It is likely that  structural modification of synapses and dendritic spines are required to maintain a steady‐state  reduction over time. The theory of “slot proteins” suggests LTD could result from a net loss of  slot proteins in contrast to the net recruitment required for LTP (Malinow and Malenka, 2002;  10    Shi et al., 2001b). Consistent with this theory, the over‐expression of PSD‐95 increases AMPAR  number at the synapse (Schnell et al., 2002), whereas removal of PSD‐95 from the synapse via  depalmitoylation depletes synaptic AMPARs (El‐Husseini Ael et al., 2002).  1.2.4 LTP / LTD induction protocols and spike time dependent plasticity  The most common form of LTP induction is tetanic stimulation of afferent fibres. A  typical tetanus consists of pre‐synaptic stimuli delivered at 100Hz over 1 second (Bliss and  Collingridge, 1993). Tetanic stimulation causes large depolarization of the post‐synaptic cell, in  turn delivering the calcium influx required for potentiation by activation and unblocking  NMDARs, activating voltage‐sensitive calcium channels and calcium‐induced release of  intracellular calcium stores. Typically, 3‐4 tetanic stimuli spaced 5 minutes apart are used for  consistent induction of L‐LTP. Slightly more physiological forms of burst stimulation, called  ‘theta‐burst stimulation’ (typically several sets of 4 stimuli at 100Hz delivered at 200ms  intervals) and ‘primed‐burst stimulation’ (Rose and Dunwiddie, 1986) (a single stimulus  followed by a single set of 4 stimuli at 100Hz 200ms later) are also commonly used as induction  protocols. These stimuli have the benefit of mimicking similar firing patterns that have been  reported in the hippocampus during learning (Otto et al., 1991). Repetitive low frequency (0.1 ‐ 1 Hz) pairing of single afferent stimuli with strong depolarization of the post‐synaptic cell (0mV  for 100ms) has also been show to induce LTP (Gustafsson et al., 1987). The paring is repeated  50‐100 times.    In a similar paradigm, called spike‐time dependent plasticity (STDP), the depolarizing  pulse is shortened to cause a single post‐synaptic action potential (AP). To induce LTP this single  post‐synaptic AP must back‐propagate into the dendrites within a narrow time window (usually  11    less than 50ms) after the pre‐synaptic stimuli produces an excitatory post‐synaptic potential  (EPSP) within the innervated cell. The degree of LTP diminishes as the interval between the pre‐  and post‐synaptic spikes increases (Bi and Poo, 2001).  A recent study by Vislay‐Meltzer et al.  demonstrated LTP induction by STDP requiring only a single pairing (Vislay‐Meltzer et al., 2006).   LTD can be induced by low frequency electrical simulation (900 stimuli at 1Hz for 15  minutes) with either single or dual pulses respectively (Thiels et al., 1994). E‐LTD alone can be  induced in a similar fashion (900 stimuli massed at 5 Hz for 3 minutes) (Kauderer and Kandel,  2000). LTD can also be induced by pairing protocols where the pre‐synaptic spike and post‐ synaptic cell depolarization are set out‐of‐phase (Debanne et al., 1999). STDP produces LTD  when the post‐synaptic AP is induced before the pre‐synaptic spike (usually by less than 50ms),  rather than afterward.  Both LTP and LTD induction by electrical stimuli can be blocked by the  application of the NMDA receptor antagonist D‐amino‐5‐phosphonovalerate (APV). Blocking of  the NMDAR channel stops local Ca2+ influx, which is thought to be the principal trigger for  molecular cascades underlying synapse specific LTP and LTD (Cavazzini et al., 2005).  1.2.5 Evidence for LTP/LTD in vivo  The first full reports of LTP in the hippocampus were described in vivo (Bliss and  Gardner‐Medwin, 1973; Bliss and Lomo, 1973). LTP was not reported in the in vitro slice  preparation until years later (Andersen et al., 1977). In other brain areas, such as the neocortex,  the complexity of the in vivo preparation has severely limited the number in vivo studies  (Glazewski et al., 1998; Lee and Ebner, 1992; Sakamoto et al., 1987; Tamura et al., 1992), and  advantages of the slice preparation have made in vitro work comparatively common (Artola and  Singer, 1987; Komatsu et al., 1988).  A significant benefit of in vivo LTP and LTD experiments is  12    the ability to assay the effect of long term synaptic modification on natural sensory responses  and animal behaviour.   The influence of LTP induction on natural information processing has been  demonstrated in the visual cortex:  The functional consequences of NMDAR‐dependent LTP  were monitored in the adult rat visual cortex after induction via theta burst stimulation of the  dorsal lateral geniculate nucleus.  Visually evoked potentials to full‐field flash were found to be  significantly enhanced after LTP, as well as responses to grating stimuli across a range of spatial  frequencies (Heynen and Bear, 2001). Similar findings were also demonstrated in the lateral  amygdale: High frequency stimulation (HFS) of the medial geniculate body resulted in long‐ lasting potentiation of field potentials in the lateral amygdala elicited by a naturally transduced  acoustic stimulus (Rogan and LeDoux, 1995).   In vivo LTP has also been demonstrated to affect learning and memory. Saturating  induction of LTP was shown to occlude learning in the rat hippocampus (Moser et al., 1998). Rats implanted with a multielectrode stimulating array were repeatedly excited with tetanus  pulses causing cumulative potentiation. Spatial learning was found to be disrupted in animals  with no residual LTP (less than ten percent) but not in animals that were capable of further  potentiation, suggesting saturation of hippocampal LTP impairs spatial learning (Moser et al.,  1998). Moreover, reversal of previously induced LTP in the rat hippocampus was demonstrated  following exposure to a new environment. In these experiments, exploration of a new, non‐ stressful environment rapidly caused a complete and persistent reversal of the expression of  high‐frequency stimulation‐induced E‐LTP in the CA1 area of the hippocampus (Xu et al., 1998).  13    The expression was not affected by exploration of a familiar environment. This novelty‐induced  reversal of LTP suggests decreases in synaptic efficacy may act in tandem with enhancements at  selected synapses to facilitate the storage of new information by the hippocampus.  Even with this in vivo work, a strong criticism of traditional LTP and LTD paradigms is  that the electrical activity used to evoke synaptic change does not resemble natural sensory  input. In an effort to link the phenomena to natural activity within the brain, a number of  correlative studies have provided evidence that natural sensory stimuli may induce long‐term  synaptic modification in adult nervous systems in the form of LTP (Moser et al., 1998; Rioult‐ Pedotti et al., 1998; Rogan et al., 1997; Xu et al., 1998). In the adult rat brain, sensory stimuli  associated with fear conditioning have been demonstrated to induce LTP in the amygdale. Fear  conditioning in the amygdala involves pairing of an amygdala‐dependent innocuous  conditioned stimulus (CS) with an aversive unconditioned stimulus (US). Auditory responses in  the lateral amygdale show similar enhancement after conditioning as demonstrated with LTP  induction. The changes parallel CS‐elicited fear responses and are enduring. They do not occur  if the CS and US remain unpaired (Rogan et al., 1997). Motor‐skill learning has also been  suggested as a source of LTP within the adult rat primary motor cortex (M1). Rats, trained for  three or five days in a skilled reaching task with one forelimb, were found to have increased  field potentials in the forelimb region of horizontal intracortical connections in layer II/III  contralateral to the trained limb (Rioult‐Pedotti et al., 1998). The ‘untrained’ hemisphere and  hind‐limb regions showed no change. Moreover, this strengthening was accompanied by a  reduction in the extent of subsequent electrically induced LTP, suggesting the effect of training  was possibly due to LTP‐like mechanisms (Rioult‐Pedotti et al., 1998).   14    While the fear conditioning and motor training show correlative evidence of experience‐ driven LTP induction, a recent study by Whitlock et al. (2006) was the first to show direct  evidence that leaning, in the form of simple inhibitory avoidance training, induces LTP and LTD  in CA1.  LTP and LTD were assayed by measuring phosphorylation of ser‐831 and ser‐845 of the  GluR1 subunit. The same phosphorylation of glutamate receptors found in HFS‐LTP was  demonstrated with one‐trial inhibitory avoidance learning in rats. The training also caused  spatially restricted increase in the amplitude of evoked synaptic transmission in CA1.  Furthermore, the learning induced synaptic potentiation occluded subsequent HFS‐induced  LTP. A similar study using contextual fear conditioning – another hippocampus‐dependent  learning task – has also demonstrated learning associated LTP‐like changes in ser‐831 (Shukla et  al., 2007).  1.2.6 LTP/LTD in the developing brain  Understanding the role of LTP and LTD in development is critically important since both  phenomena are likely involved in the activity‐dependent restructuring of neural circuits.  Nonetheless, comparatively few studies of LTP and LTD have been performed in early  development. The main reason for this is technical inconvenience – in utero  electrophysiological experiments are complex and brain slices of foetal animals are difficult to  perform. As such, developmental studies of LTP and LTD traditionally investigate critical periods  in the postnatal mammalian brain (the exception being Xenopus Laevis, described in section  1.4). Overall, the mechanisms, expression and maintenance of NMDAR‐dependent LTP and LTD  during development appear similar to those found in adult animals, with the added  complexities of developmental switches in neurotransmitter subunit expression and in the  15    molecular cascades associated with NMDAR Ca2+ influx at time points in development when  CaMKII expression is low (Wu and Cline, 1998; Yasuda et al., 2003). Some of the first  investigations of LTP in the developing brain demonstrated compelling evidence of its  importance to the formation of cortical circuitry: This work was completed in both the rat  somatosensory cortex (S1) (Crair and Malenka, 1995) and the visual cortex during ocular  dominance plasticity (Kirkwood et al., 1995). In mammalian development, the refinement of  topographical projections of the thalamus to form whisker barrels in the somatosensory cortex  includes a critical period, early in development, when barrels can be modified by sensory input  (Crair and Malenka, 1995). If normal activity is altered during this critical period, the  topographical map is disrupted (Crair and Malenka, 1995).  The ability to induce LTP in the  barrel cortex was discovered to closely match this critical period and to be lost with age due to  a simultaneous decrease in NMDA receptor‐mediated synaptic currents (Crair and Malenka,  1995). Similar experiments in the visual cortex during ocular dominance plasticity also  demonstrated the inability to induce LTP after the critical period (Kirkwood et al., 1995). LTP  induction was attempted in cortical slices taken at different ages from either light‐reared or  dark‐reared rats. Susceptibility to LTP was found to coincide with the critical period and, like the  critical period, could be prolonged by rearing animals in darkness (Crair and Malenka, 1995;  Kirkwood et al., 1995). These findings support the hypothesis that LTP reflects a normal  mechanism of experience‐dependent synaptic modification in the developing mammalian  brain.   LTD has also been induced in developing visual cortex (Dudek and Friedlander, 1996;  Rittenhouse et al., 1999; Sermasi et al., 1999). Unlike LTP however, the ability to induce LTD  16    does not seem to be limited to the critical period and can be elicited in the mature brain. Dark  rearing from birth resulted in a reduction of electrically induced LTD amplitude while light  deprivation from P17‐P30 showed no effect.     1.3. PLASTICITY OF INTRINSIC EXCITABILITY  1.3.1 Neuronal excitability, ionic channels, and the input–output function  While synaptic plasticity is an appealing candidate for learning and memory, LTP and  LTD are unlikely to be the whole story for neuronal computation. In fact, most network models  consider neuronal output via action potential (AP) firing to be the fundamental unit used to  decode information.  As such, neuronal excitability – defined as the likelihood of a neuron to  generate an output signal from some given presynaptic input – may be the most important  component in neural computation. Synaptic potentiation makes it more likely for the  postsynaptic neuron to fire an AP by increasing the postsynaptic response (excitatory  postsynaptic potentials) to the same afferent input. Synaptic depression works in the opposite  direction. However, while synaptic input plays a direct role in neuronal excitability, it is only one  of many steps required to induce neuronal firing.   Neuronal excitability is largely mediated by  voltage‐gated ion channels, located in dendritic and somatic membrane, that couple excitatory  postsynaptic potentials to the AP. Modulation of ion channel properties or density distributions  can dramatically alter intrinsic excitability, and in turn firing rates, in response to a given  afferent input (Daoudal and Debanne, 2003; Debanne et al., 2003).  17      Functionally, all ion channels, whether they are located in the dendritic spine or shaft, or  in the neuronal cell body, play a crucial role in AP generation. Ion channels can amplify  (persistent Na+ current and T‐type Ca2+ channels) or attenuate (A‐type K+ current and H‐type  cationic current) the excitatory postsynaptic potentials amplitude (Reyes, 2001). Regulation of  ion channels concentrated near the synapse (either in the postsynaptic spine or pre‐synaptic  bouton) may play a particularly important role if regulated at a local level.   1.3.2 NMDA receptor dependent EPSP‐spike plasticity  When Bliss and Lomo first reported LTP induction in the hippocampus after high  frequency stimulation (HFS) (Bliss and Lomo, 1973), they also recorded an enhanced probability  of AP firing in postsynaptic neurons after excitatory input. This parallel phenomenon is an  example of intrinsic excitability and has been labelled excitatory postsynaptic potential‐to‐spike  potentiation (E‐S potentiation). While E‐S potentiation has been overshadowed by LTP, it is  complementary to LTP, functionally important, and also long lasting. E‐S plasticity has been  demonstrated in hippocampal, neocortical, and cerebellar neurons and may be persistent  throughout the brain (Debanne et al., 2003).   The most commonly studied E‐S potentiation requires the activation of NMDARs for its  induction (Daoudal et al., 2002; Jester et al., 1995; Wang et al., 2003). Mechanistically, at least  part of this potentiation is linked to GABAA channels, as the potentiation is eliminated by the  GABAA channel blocker picrotoxin (Abraham et al., 1987; Chaveznoriega et al., 1989; Tomasulo  and Ramirez, 1993). A picrotoxin‐resistant E‐S component has also been confirmed (Asztely and  Gustafsson, 1994; Daoudal et al., 2002; Jester et al., 1995). Recent studies have also  demonstrated NMDAR dependent long lasting E‐S depression (Daoudal et al., 2002). This  18    plasticity is also partially dependent on the GABAA channel, with approximately 60% of E‐S  depression blocked by picrotoxin (Daoudal et al., 2002).  NMDAR dependent E‐S potentiation is input specific (Daoudal et al., 2002; Jester et al.,  1995) suggesting that modulation of intrinsic excitability may be restricted to a specific area of  the dendrite. Theoretical studies suggest that input specific changes in excitability are possible  when inputs are located on separate dendritic branches (Wathey et al., 1992). E‐S depression is  also input specific (Daoudal et al., 2002).     Dendritic integration, the summation of excitatory postsynaptic potentials across a  neuron’s dendritic tree, also plays a major role in E‐S plasticity.  Bidirectional enhancement and  weakening of summation follows associative LTP and LTD induction respectively (Wang et al.,  2003). As with E‐S plasticity, changes in synaptic integration are input specific. Long lasting  down regulation of K+ channels and up‐regulation of NMDARs may account for enhanced  summation of dendritic excitatory postsynaptic potentials (Schrader et al., 2002; Wang et al.,  2003).  Similarities between E‐S plasticity, bidirectional changes in dendritic integration, and  synaptic plasticity – including NMDAR dependence and input selectivity – may suggest a  common induction pathway for all plasticity types.    19    1.4. EXPERIENCE‐DRIVEN  PLASTICITY  IN  THE  XENOPUS  TADPOLE RETINOTECTAL SYSTEM  1.4.1 Morphological plasticity  During early brain development, newly differentiated neurons begin as simple spheres  but rapidly grow elaborate and extensive axonal and dendritic processes. These processes are  responsible for making the appropriate pre‐ and postsynaptic connections that ultimately form  functional brain circuits. Most of our knowledge of the mechanisms involved in establishing  circuits between distant CNS neuronal populations comes from studies of axonal projection  from the eye to central brain targets (Gaze, 1970; Horder and Martin, 1978; Jacobson, 1978;  Sperry, 1943, 1963). The output neurons of the eye are the retinal ganglion cells (RGCs), whose  axons exit the eye as the optic nerve, cross the midline at the optic chiasm, and innervate  central brain structures. This axonal tract has proven ideal for studies of axonal development  due to the accessibility of the optic nerve for discrete lesion, the compartmentalization of  projection and target neuronal populations for restricted pharmacological treatment, and the  highly ordered pattern of RGC axonal terminations (Fujisawa et al., 1982; Gaze and Jacobson,  1963; Sperry, 1943).   The pattern of connections between RGCs and their target tissue, the optic tectum in  lower vertebrates, is similar to many afferent projections in that it maintains the spatial  properties of information from one layer to the next (Gaze, 1958). This order is accomplished  by preserving the same spatial relationships between the soma positions of RGCs in the retina  20    and the tectal neurons with which they form synapses. Maintaining such near‐neighbour  connections creates a topographic representation of the retina, and therefore visual space, in  the tectum. Physically, the retina is mapped onto the tectum by axons of RGCs in dorsal retina  terminating in the ventral tectum, ventral retina RGCs projecting to dorsal tectum, nasal RGCs  projecting to caudal tectum, and temporal retina RGC axons terminating in rostral tectum  (Godement and Bonhoeffer, 1989; Roskies and O'Leary, 1994; Sperry, 1963; Vielmetter and  Stuermer, 1989; Walter et al., 1987a; Walter et al., 1987b).  During early development, the first RGC axons enter the optic tectum as simple  projections that terminate in retinotopically appropriate regions (Holt, 1984; Holt and Harris,  1983; Sakaguchi and Murphey, 1985). Thus the retinotectal map is established at the earliest  stages of RGC innervation. After reaching their target zones, RGC axons extend branches to  form arborisation, which grow to cover relatively large regions of the tectum (Sakaguchi and  Murphey, 1985). While the tectum continues to grow, RGC axonal arbours grow little or  condense. Therefore, the relative size of RGC axonal arbours compared to the entire tectum  decreases throughout development (Gaze et al., 1974; Sakaguchi and Murphey, 1985; Sretavan  and Shatz, 1984). This shift is supported by electrophysiological recordings of tectal neurons  demonstrating a progressive decrease in the area of tectum responding to a region of visual  space with maturation. Thus, in normal development, the retinotopic map goes through stages  of initial highly ordered RGC axonal termination, followed by extensive axonal arborization, and  subsequent refinement of the map through an increase in tectum size and pruning of RGC  axonal arbours. Functionally, this produces a developmental progression towards a smaller  21    proportion of the tectum responsive to a given area of visual field and associated increase in  visual resolution.  1.4.2 Visually‐driven synaptic plasticity  As a model system for the developing nervous system, Xenopus laevis tadpoles are  particularly suited for studies of LTP and LTD. Unlike mammalian systems, where investigation  of development typically includes only postnatal critical periods, investigation of the developing  Xenopus retinotectal system allows study of the very onset of activity‐dependent refinement.  Moreover, the ease of preparation allows all experimental work to be done in vivo. Nearly all  LTP and LTD work in this system has been carried out by the lab of Mu‐ming Poo using whole‐ cell or perforated‐patch clamp electrophysiology. The first study of developmental LTP and LTD  in the retinotectal system was also the first paper to identify spike‐time‐dependent‐plasticity  (STDP) as a method of LTP and LTD induction (Zhang et al., 1998). STDP has since been  demonstrated in nearly all traditional LTP preparations. In a similar fashion to induction of LTP  and LTD in CA1 via the Schaffer collaterals, LTP and LTD in the tectum was induced by repetitive  electric stimulation of innervating retinal ganglion cells. Both LTP and LTD were also shown to  be NMDAR‐dependent. Input specific LTP in tectal neurons via theta burst stimulation (TBS) was  found to develop over time (Tao et al., 2001). The change from non‐input specific to input  specific LTP occurred between stages 42 and 43 in the developing tectum and corresponded to  increased complexity of tectal neuron dendrites as well as a restricted distribution of Ca2+ influx  during NMDAR activation.   The process of activity‐dependent morphological plasticity in developing neural circuits  through Hebbian competition may be related to LTP and LTD, as both are activity‐dependent  22    modifications (Constantine‐Paton et al., 1990; Malenka and Bear, 2004; Zhang and Poo, 2001).   However, for LTP and LTD to be directly involved in activity‐dependent axonal and dendritic  refinement, natural sensory stimuli must be able to induce LTP and LTD during development.  Direct evidence of experience‐driven LTP in vivo in the developing retinotectal system was first  demonstrated using repetitive dimming light stimuli applied to the contralateral eye (Zhang et  al., 2000).  The LTP induction protocol consisted of 80, 50ms dimming stimuli at 0.3 Hz. In  patch‐electrophysiological studies, endogenous dimming stimuli elicited bursting activity similar  to electrically stimulated TBS (Tao et al., 2001). 50ms dimming stimuli were found to elicit only  OFF responses, though both OFF and ON responses could be induced if the dimming time  exceeded 300ms. Visually‐driven LTP induction resulted in persistent enhancement of  glutamatergic inputs, but not GABAergic or glycinergic inputs, on tectal neurons. Enhancement  required spiking in postsynaptic cells and was NMDAR‐dependent. It was both long‐lasting and  occluded further LTP of retinotectal synapses by direct electrical stimulation. Overall, visually‐ driven LTP is thought to have the same underlying cellular mechanisms as electrically‐induced  LTP.   These experiments also demonstrated the first direct single cell electrophysiological  evidence of activity‐driven LTP in vivo, as well as the first evidence of activity‐driven LTP at such  an early stage in development. In future studies, Poo and colleagues expanded their natural  visual stimulation paradigm to include a moving bar stimulus (Engert et al., 2002; Zhou et al.,  2003).  Using a similar training pattern to dimming stimuli (60 sweeps at 0.2Hz or 240 sweeps at  0.5Hz) tectal neurons could be trained to become direction‐sensitive within minutes after  repetitive exposure to moving bars in a particular direction. Direction‐sensitivity was dependent  23    on the speed of the moving bar, suggesting enhancement was constrained to a defined set of  spatiotemporal patterns. Direction selectivity could not be induced by random visual stimuli.  Direction selectivity was associated with activity‐induced enhancement of glutamate‐mediated  inputs, required spiking of the tectal neuron, and was NMDAR‐dependent.   Further investigation demonstrated that synaptic modifications induced by the moving  bar stimuli were in fact due to spike‐time dependent induction (Mu and Poo, 2006; Vislay‐ Meltzer et al., 2006). To prove moving bar stimuli were elicited by STDP, visual stimuli were first  paired with postsynaptic depolarization to demonstrate long‐term enhancement or reduction  of light‐evoked responses could be achieved using an STDP paradigm. Next, moving bar  stimulation was mimicked using a precisely timed sequential three‐bar stimulation pattern. The  properties (size and width) of the bars were modified such that the middle bar consistently  induced postsynaptic spiking.  This three bar ‘moving bar’ stimulus reliably induced spike time  dependent potentiation and depression of responses to the first and third bars respectively. At  the same time, the spike train elicited by the moving bar stimulus after training exhibited the  same direction selectivity shown in previous experiments. Therefore, spike timing‐dependent  LTP and LTD was shown to account for the asymmetric modification of the tectal cell response  induced by moving bar (Mu and Poo, 2006). Further investigation of visually‐driven LTP and LTD  in the retinotectal system has identified brain‐derived neurotrophic factor and nitric oxide as  elements required for light‐induced excitatory synaptic modification (Mu and Poo, 2006).   Though the work done in Xenopus demonstrates that natural sensory stimulation can  evoke NMDAR‐dependent LTP and LTD similar to electrically evoked LTP and LTD in CA1, the  methods used to investigate synaptic modifications have had direct effect on the modifications  24    themselves. In nearly all electrophysiological recordings, tectal cells were voltage‐clamped at a  constant membrane potential pre‐ and post‐training, preventing spontaneous neuronal spiking.    Under natural conditions, however, postsynaptic neurons are likely to spike spontaneously, as a  result of random sensory inputs due to ambient illumination (Tao et al., 2001) or inputs from  other brain regions (Sin et al., 2002a; Udin and Grant, 1999; Weliky and Katz, 1999). To address  the question of how synaptic modifications become stabilized in the constant presence of  neuronal activity in vivo, Zhou et al. (2003) investigated the effect of spontaneous firing either  via random visual stimulation or intermittently switching to current clamp.   Spontaneous burst firing was found to erase electrically induced LTP and LTD as well as  moving‐bar visually evoked LTP and LTD when training was massed. This reversal was  dependent on NMDAR activation. Similar loss of potentiation and depression has also been  demonstrated in the retinotectal system after STDP (Vislay‐Meltzer et al., 2006). In contrast,  spaced induction of repetitive electrical stimulation stabilized LTP and LTD in the presence of  random neuronal activity, suggesting that repeated event training is necessary for synaptic  modification in the developing brain.  For the retinotectal system, an inter‐TBS interval of five  minutes was found to be optimal for stabilized potentiation (Zhou et al., 2003). If the inter‐TBS  interval was increased beyond ten minutes, no stabilization was observed. Increased spiking in  favour of the direction of training was also found after spaced moving‐bar stimulation (3 sets of  60 sweeps at 0.2Hz separated by five minute intervals); however, no work was done to show  visually induced potentiation or depression for long term.  Finally, a separate visual stimulation assay, consisting of 4 h of enhanced visual  stimulation to freely swimming Xenopus tadpoles, has been shown to enhance both dendritic  25    growth rate of optic tectal neurons (Sin et al., 2002b) as well as the number of nascent synapses  (Aizenman and Cline, 2007).  Synaptic recordings were based on the electrophysiological finding  that paired‐pulse facilitation is greater in immature retinotectal synapses compared with more  mature synapses due to a lower release probability (possible because of a lack of complete  synaptic machinery)  (Aizenman and Cline, 2007). As such, paired pulses can be used to elicit  synaptic responses selectively from nascent synapses. Enhanced visual stimulation caused a  decrease in the AMPA/NMDA ratio in nascent synapses compared to control, suggesting the  addition of new immature synapses.  1.4.3 Homeostatic regulation of intrinsic excitability  In general, changes in intrinsic excitability tend to occur synergistically with changes of  excitatory synapses: if synapses potentiate, so does E‐S coupling (Burrone et al., 2002; Desai et  al., 1999a, b). While this type of synergistic plasticity is likely to also occur in the Xenopus optic  tectum, it has not yet been observed. Alternatively, experience‐dependent decreases in  synaptic drive seem to enhance intrinsic excitability (Aizenman et al., 2003; Aizenman et al.,  2002). During activity dependent refinement of the retinotectal map, four hours of enhanced  visual experience has been shown to induce a polyamine synthesis‐dependent reduction in  Ca2+‐permeable AMPAR‐mediated synaptic drive of tectal neurons (Aizenman et al., 2002). This  decrease in synaptic efficiency is correlated with an enhancement of voltage‐gated Na+ currents  (Aizenman et al., 2003). Enhancement of intrinsic excitability also requires polyamine synthesis  and could be prevented by blocking polyamine synthesis during visual stimulation.  Na+ currents  were rescued when Ca2+‐permeable AMPAR‐mediated transmission was selectively reduced.  This result suggests that a homeostatic mechanism may exist during development to maintain a  26    stable input‐output relationship. Further evidence, experimentally manipulating intrinsic  excitability by electroporation of a leak K+ channel gene or peptide that interferes with AMPA  receptor trafficking, supports this theory, as both manipulations result in an enhancement of  voltage‐gated Na+ currents to compensate (Pratt and Aizenman, 2007). Regulation of intrinsic  properties likely plays a crucial role during functional development and may serve to keep  neuronal input‐output relationships within a stable dynamic range.  1.5. METAPLASTICITY  1.5.1 The plasticity of plasticity  Long term modulation of synaptic transmission and intrinsic excitability plays a key role  in storing information within neural networks (Martin et al., 2000; Neves et al., 2008).  Saturation of LTP or LTD could compromise the ability of neural networks to decode stimuli and  discriminate events by limiting information storage. Moreover, Hebbian positive‐feedback  (Hebb, 1949; Turrigiano and Nelson, 2000)  – a process in which effective synapses undergo  strengthening and further increase their transmission, and ineffective synapses undergo  weakening and futher decrease their transmission – will ultimately lead to destabilization of  postsynaptic firing rates, reducing them to zero or increasing them to an intrinsic maximal level.  Furthermore, excessive strengthening of glutamatergic synapses via LTP may lead to damaging  amounts of glutamatergic transmission and excitotoxicity, producing cell damage or death  (Rothman and Olney, 1987).   As such, it is imperative that neurons employ mechanisms to  27    maintain synapses, dendritic integration, and resulting afferent‐evoked activity within a useful  dynamic range (Abraham et al., 2001). The degree of LTP and LTD induction has, in turn, been  found to be regulated by various intercellular signalling molecules and neurotrophic factors  (Stoop and Poo, 1996). However, a persistent long lasting regulation mechanism also exists,  where a neuron’s activity in the recent past can affect its ability to undergo LTP, LTD, or intrinsic  plasticity when presented later with plasticity‐inducing stimulus. Neurons with distinct initial  states can therefore respond differently to the same presynaptic stimulus. This form of  plasticity regulation is termed metaplasticity (Abraham and Bear, 1996), ‘Meta’ referring to a  higher‐order of plasticity: the plasticity of synaptic and intrinsic plasticity.   Importantly, the metaplastic effects of an initial metaplasticity trigger outlast the  activity that causes the initial priming. This priming remains at least until a second activity  period where synaptic or intrinsic plasticity occurs. The long lasting regulation caused by the  metaplasticity trigger is a key feature distinguishing metaplasticity from other forms of  plasticity modulation, where the modulation events and primary plasticity events must overlap.  Long lasting regulation also makes metaplasticity extremely difficult to study, since multiple  metaplasticity triggers can take place over time before the primary plasticity event occurs, and  previous metaplasticity triggers (unknown to the researcher) could influence experimentally  induced priming. Nevertheless, a number of key experiments have demonstrated metaplasticity  as an important factor regulating neuronal activity in vivo: For comprehensive reviews of the  theory of metaplasticity and the current research in the field see Abraham (2008) and Abraham  and Tate (1997).  28    1.5.2 The Bienenstock, Cooper and Munro (BCM) computational model of synaptic plasticity  BCM theory (Bienenstock et al., 1982) refers to a computational model for synaptic  plasticity proposed by Elie Bienenstock, Leon Cooper, and Paul Munro in 1982 to account for  orientation selectivity and ocular dominance in the visual cortex. BCM theory has two main  features:   First, it proposes that neurons have a plasticity modification threshold (θm) which  dictates whether a neuron’s activity at any given moment will lead to strengthening or  weakening of its input synapses. Synaptic modification varies as a complex nonlinear parabolic  function (Φ) of a neuron’s postsynaptic activity (c). Φ changes sign from negative to positive as  postsynaptic activity passes the modification threshold. Φ can be approximated by                (1)    If  c(t) > θm(t),  the synaptic modification value for active synapses is positive and their synaptic  efficiency increases (potentiation). If  0 < c(t) < θm(t) the synaptic modification value for active  synapses is negative and their synaptic efficacy weakens (depression). Hence, θm is the cross‐ over point from LTD to LTP.  Postsynaptic activity between the neuron’s excitation threshold and saturation can be  reasonably approximated as a linear input‐output function (Benuskova et al., 2001): the sum of  the product between presynaptic activity (x) and synaptic efficiency (w) for all synapses                 (2)  29     Hence, the change in synaptic efficiency (or the amount of potentiation / depression) Δw varies  as a product of the synaptic modification (Φ) and presynaptic input (x)                 (3)    where η is the modification rate.  If x=0, there will be no change in synaptic efficiency. As such,  synaptic weight changes according to Hebb’s learning rule (Hebb, 1949), requiring correlate  pre‐ and postsynaptic activity at the synapse.    Second, BCM theory states that the cell‐wide modification threshold for LTP induction is  metaplastic and varies as a function of the neuron’s historic firing rate.  θm varies proportionally  to the square of the neuron’s activity averaged over some recent past (τ) (Benuskova et al.,  2001)                         (4)    θm depends only on average postsynaptic activity, and hence is heterosynaptic in nature. A  history of high postsynaptic activity shifts the modification threshold to the right, increasing the  postsynaptic activity required to induce potentiation and biasing active synapses to weaken. A  history of low postsynaptic activity shifts the modification threshold to the left, making LTD  more difficult and LTP easier to induce (Abbott and Nelson, 2000; Abraham and Tate, 1997). As  such, BCM learning adjusts plasticity thresholds to keep the overall synaptic weightings of a  neuron within a dynamic range that prohibits saturation and stabilizes Hebbian plasticity by  negative‐feedback.    30      A seminal paper by Abraham et al. (2001) confirmed, in an in vivo model, two key  postulates of the BCM theory modification threshold: its heterosynaptic expression and its  regulation by postsynaptic neural activity. Electrical stimulation of two distinct synaptic inputs  converging on the dentate gyrus of awake, freely moving rats allowed researchers to apply  experimental conditioning stimulation via one input path and later evoke heterosynaptic LTP  via the neighbouring path. Conditioning stimuli raised the threshold for LTP for a 7‐ to 35‐day  period depending on the stimulation protocol.     Historic neuronal firing rates are the key computational unit of the BCM model;  however, intercellular calcium levels may be the physiological metric underlying plasticity  modification (Cho et al., 2001; Gold and Bear, 1994a). Ca2+ is a key component required for LTP  and LTD induction (Bear et al., 1987; Gold and Bear, 1994b) and some of the pioneering work  on metaplasticity has focused on metaplastic regulation of expression of NR2A and NR2B  subunits of the NMDA receptor, which produce short and long calcium entry, respectively,  during receptor activation (Erreger et al., 2005). Cooper and colleagues have expanded the  theoretical BCM framework to construct wholly Ca2+‐based plasticity models, emphasizing the  role of NMDARs in generating the relevant Ca2+ signals (Shouval et al., 2002a; Shouval et al.,  2002b). Most importantly, these models also feature a form of homeostatic metaplasticity,  generated by activity‐dependent changes in the regulation of intracellular Ca2+ levels (Yeung et  al., 2004).  1.5.3 NMDA receptor‐mediated metaplasticity  NMDAR mediated metaplasticity follows general BCM learning rules, with historical cell  firing rates replaced with NMDAR activity in the recent past. NMDAR priming 60‐90 minutes  31    prior to tetanic stimulation inhibits LTP induction (Huang et al., 1992). The effect is restricted to  primed and activated synapses and slowly decays with time. Increasing the intensity of the  tetanic stimulus can recover LTP induction, suggesting that NMDAR priming stimulation  increases the threshold for LTP rather than blocking it completely (Huang et al., 1992).  Nonetheless, even when LTP is induced by strong or repeated tetanic stimulation, NMDAR  priming can reduce the duration LTP (Fujii, 1996; Woo and Nguyen, 2002). NMDAR mediated  metaplasticity should not be confused with LTP occlusion (O'Connor et al., 2005), where  inhibition of LTP is explained by a simple saturation of potentiation, as it can occur even when  the priming NMDAR activation does not induce any detectable changes in baseline synaptic  transmission (Abraham and Huggett, 1997; Fujii, 1996; O'Connor et al., 2005).    NMDAR priming also enhances the later induction of LTD (Christie and Abraham, 1992;  Wang et al., 1998) via associative stimulation or conventional low‐frequency stimulation (LFS)  protocols (Mockett et al., 2002). LTD enhancement can be generated by a low frequency  priming stimulation (Christie and Abraham, 1992; Wang et al., 1998) and is restricted to the  activated synapses for 60‐90 minutes (Christie and Abraham, 1992). Similar to NMDAR  mediated LTP inhibition, LTD priming stimulation enhances LTD without any datable change in  synaptic transmission due to the priming stimulus.  1.5.4 Metaplastic E‐S plasticity: common learning rules?  Phenomenologically, synaptic and intrinsic plasticity share the same learning rules  proposed by the BCM curve (Daoudal and Debanne, 2003; Daoudal et al., 2002; Debanne et al.,  2003; Wang et al., 2003). For example, in CA1 E‐S potentiation is observed with both  homosynaptic (Bliss and Lømo 1973; Abraham et al. 1987; Daoudal et al. 2002) and associative  32    (Jester et al. 1995; Wang et al. 2003) LTP induction, and E‐S depression occurs at the same time  as synaptic depression or depotentiation (Daoudal et al. 2002; Wang et al. 2003). These intrinsic  plasticity changes are NMDAR dependent similar to their synaptic counterparts. Plasticity of  both synaptic efficiency as well as neuronal excitability may be reflected in long term changes in  a neuron’s functional response properties.    In addition, shifts in the BCM plasticity threshold can also occur due to changes in  intrinsic cell excitability. LTP induction by classical conditioning at convergent CA3‐CA1  pyramidal neurons synapses causes a prolonged enhancement of slow afterhyperpolarization  (sAHP) mediated by an increase in Ca2+‐activated K+ currents (Didier Le et al., 2004). This sAHP  enhancement reduces cell excitability, decreasing the capacity of the neuron to fire prolonged  bursts. Subsequent tetanization preferentially inhibits LTP on previously unpotentiated  synapses. Here, sAHP enhancement shifts θm to the right. K + channels in the postsynaptic  membrane are good candidates for intrinsic metaplasticity induction in other cells types as well  since they regulate the threshold for LTP induction in many neurons (Sah and Bekkers, 1996).  1.5.5 Metaplasticity induced by environmental stimuli  Natural stimuli, such as visual experience, stress, or environmental changes, can have  significant effects on plasticity induction in the brain. Regulation of plasticity by these  environmental stimuli may occur as a form of metaplasticity or as modulation of plasticity (via  concurrent release of hormones or neurotrophic factors). In practice, it is difficult to separate  metaplasticity from plasticity modulation in vivo. To account for this challenge, most natural  stimuli experiments use ex vivo preparations, where the environmental stimuli is first presented  to the living animal after which the brain is removed and plasticity induction is studied in vitro.  33    Using this approach, enriched environments have been shown to enhance hippocampal LTP  induction as well as LTP duration (Duffy et al., 2001; Van Praag et al., 1999), and stress caused  by both tail shock and restraint has been shown to inhibit LTP and enhance LTD in the  hippocampus for up to 24 hours after the initial stressor (Kim et al., 1996).    In one of the first experiments to demonstrate the BCM learning curve in vivo,  monocular lid suture was shown to cause significantly greater depression of deprived‐eye  responses in kitten visual cortex than treatment with tetrodotoxin as assayed by shifts in ocular  dominance columns (Rittenhouse et al., 1999). This is because lid suture leaves the retina  spontaneously active, whereas tetrodotoxin eliminates all activity. Similarly, homosynaptic LTD  caused by monocular deprivation is significantly greater than homosynaptic LTD caused by  binocular deprivation (Kirkwood et al., 1996a) where cortical activity is lower (Blais et al., 1999).  Visual experience in the recent past has also been demonstrated to shift the BCM  modification threshold.  Dark rearing shifts θm substantially to the left in visual cortical slices,  consequently lowering the threshold for LTP threshold and reducing in the capacity for  homosynaptic LTD (Kirkwood et al., 1996a)  (Kirkwood et al., 1996b; Philpot et al., 2003). Light  exposure for 2 days completely reverses the effects of visual deprivation (Kirkwood et al.,  1996b). NMDAR subunit composition may be the underlying mechanism behind dark rearing  induced metaplasticity. During regular development a maturational shift from the predominant  slow Ca2+ influx NR2B subunit to the fast Ca2+ influx NR2A subunit occurs in the visual cortex  (Quinlan et al., 1999a). This developmental shift is inhibited in dark reared animals but can be  rescued by 2 hours of light exposure (Quinlan et al., 1999b). A rapid activity‐dependent switch  34    in NMDAR subunit composition from NR2B to NR2A also occurs in neonatal hippocampus after  tetanic stimulation (Bellone and Nicoll, 2007).    Recent experiments have demonstrated experience regulated metaplasticity in both the  barrel cortex (Clem et al., 2008) and hypothalamus (Kuzmiski et al., 2009). NMDAR‐dependent  LTP can be induced in vivo between layer 4 and layer 2/3 neurons of the barrel cortex by single‐ whisker experience (SWE), where all whiskers but one is removed from the animal. Further  induction of LTP with SWE is inhibited in an NMDAR dependent manner. However, if NMDAR  channels are blocked, additional whisker stimulation can facilitate LTP through recruitment of  mGluRs. Hence, a balance between NMDAR inhibition of LTP and mGluR enhancement of LTP is  regulated by sensory experience. A behavioural tactile conditioning task pairing a non‐aversive,  habituating air‐puff stimulus with whisker deflection demonstrated that the enhanced mGluR  regulated LTP is correlated with increased learning behaviour. Metaplasticity mediated by  mGluRs also occurs in the hypothalamus, though in the opposite direction. Haemorrhage  induces a metaplastic enhancement of LTP through the down‐regulation of mGluRs.  Noradrenalin replicates this metaplasticity, which may underlie a homeostatic change in the  network to combat acute physiological challenge.      35    1.6. RESEARCH HYPOTHESIS AND OBJECTIVES  I hypothesize: (1) that visual sensory input drives both synaptic plasticity and intrinsic  excitability of retinotectal synapses undergoing receptive field refinement in the developing  brain, and that these plasticity changes result in long lasting modification of evoked neuronal  output; (2) that functional plasticity is both dependent on the pattern of visual training stimuli  and regulated by activation of NMDA receptor mediated pathways; (3) that training induced  functional plasticity follows BCM learning rules, including an activity dependent modification  threshold and regulation of that threshold by historic postsynaptic neural activity.    AIM 1: To develop a non‐invasive imaging protocol to assay long term changes in  evoked neuronal firing of ensemble networks in vivo. To date, studies of experience‐driven  LTP and LTD in the developing retinotectal system have been performed using whole‐cell or  perforated patch electrophysiology, techniques that require an open‐brain preparation. To  assay changes in neuronal activity over time non‐invasively, I used multi‐cell‐bolus‐loading  (MCBL) (Brustein et al., 2003; Stosiek et al., 2003) in combination with in vivo single cell  excitability probing (SCEP) (Johenning and Holthoff, 2007). MCBL is a minimally invasive Ca2+‐ indicator loading protocol that employs a membrane permeable AM‐form Ca2+‐indictor to  detect calcium changes within cells. MCBL allows cells to be monitored for hours without  disturbing intercellular ion balance or washing out signalling molecules and proteins. This  technique has specific advantages over electrophysiological work: it allows investigation of both  single cell excitability (Johenning and Holthoff, 2007), as well as population responses (100’s of  neurons) within the imaging field of view. Using the MCBL approach, I proposed to investigate  36    the functional responses of tectal neurons to visual stimuli over time, as well as how these  responses are modified with visual training.    AIM 2: To determine if visual stimulation induces long‐term potentiation or  depression of neuronal activity in the intact unanaesthetized developing brain. To date,  studies of experience‐driven changes of visual receptive fields have focused on the plasticity of  synaptic transmission rather than modifications of neuronal firing output. Here I focus on the  receptive field properties encoded in neuronal firing and how these can be modified by brief  visual experience. Using the in vivo SCEP technique developed in AIM 1, I proposed to measure  changes in neuronal firing of neuronal ensembles after various visual stimulation protocols,  including: high frequency repetitive OFF stimulation designed to elicit long lasting potentiation,  invariant light stimulation designed to elicit long lasting depression, and a control probing  stimulus – continuing SCEP throughout the training period. Moreover, I proposed to determine  if plasticity changes follow the BCM learning curve, such that neurons posses a modification  threshold that must be passed to undergo potentiation.    AIM 3: To determine the effects of visual‐stimulation induced training on network  interactions.  In vivo SCEP may be compared to electrophysiological recording, such as patch  clamp electrophysiology, which limits analysis to single cells, and field recordings, which do not  allow investigation of large contiguous neuronal ensembles at the single neuron level. In vivo  SCEP bridges the gap between single cell and population analysis, allowing measurement of  neuronal activity of hundreds of neurons simultaneously at the single cell level within the intact  brain. I proposed to utilize this technique to investigate changes in correlated neuronal firing  37    throughout the neuronal ensemble. The functional plasticity of individual neurons were then  compared to changes in those neurons’ network interactions.      AIM 4: To determine if previous experience regulates future visually‐driven plasticity.  BCM theory predicts that neuronal activity in the recent past will shift a neuron’s modification  threshold. This threshold shift then regulates synaptic and intrinsic plasticity induction at a later  point. I proposed that shifting of the modification threshold also effects functional plasticity.  Using in vivo SCEP, I compared visually induced plasticity outcomes with historic neuronal firing  rates. If BCM rules hold true, high pre‐training firing rates will inhibit functional potentiation  and facilitate functional depression. Low pre‐training firing rates will act in the opposite manor.   Furthermore, manipulating pre‐training firing rates by enhancing visual experience should shift  the plasticity outcomes of all neurons toward facilitation of LTD.  AIM 5: To determine if BCM metaplasticity in the developing retinotectal system is  regulated by NMDAR activity. If pre‐training activity does predict training‐induced functional  plasticity and modifying pre‐training activity shifts the BCM modification threshold, I proposed  that NMDAR blockade during modified pre‐training activity would prohibit the shift.    The manuscripts reproduced in Chapters 2 and 3, address these aims. Chapter 2  demonstrates, for the first time, ensemble network analysis of natural‐experience induced  metaplasticity in the developing brain. Chapter 3 provides a detailed protocol for reproducition  of the in vivo model system developed for the experiments performed in Chapter 2.   38    1.7. REFERENCES  Abbott, L.F., and Nelson, S.B. (2000). Synaptic plasticity: Taming the beast. Nature neuroscience  3, 1178‐1183.  Abraham, W.C. (2008). Metaplasticity: tuning synapses and networks for plasticity. Nature  Reviews Neuroscience 9, 387‐399.  Abraham, W.C., and Bear, M.F. (1996). Metaplasticity: the plasticity of synaptic plasticity.  Trends in Neurosciences 19, 126‐130.  Abraham, W.C., Gustafsson, B., and Wigstrom, H. (1987). Long‐Term Potentiation Involves  Enhanced Synaptic Excitation Relative to Synaptic Inhibition in Guinea‐Pig Hippocampus.  Journal of Physiology‐London 394, 367‐380.  Abraham, W.C., and Huggett, A. (1997). Induction and reversal of long‐term potentiation by  repeated high‐frequency stimulation in rat hippocampal slices. Hippocampus 7, 137‐145.  Abraham, W.C., Mason‐Parker, S.E., Bear, M.F., Webb, S., and Tate, W.P. (2001). Heterosynaptic  metaplasticity in the hippocampus in vivo: A BCM‐like modifiable threshold for LTP.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 10924‐ 10929.  Abraham, W.C., and Tate, W.P. (1997). Metaplasticity: A new vista across the field of synaptic  plasticity. Progress in Neurobiology 52, 303‐323.  Abraham, W.C., and Williams, J.M. (2003). Properties and mechanisms of LTP maintenance.  Neuroscientist 9, 463‐474.  Aizenman, C.D., Akerman, C.J., Jensen, K.R., and Cline, H.T. (2003). Visually driven regulation of  intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron 39, 831‐842.  Aizenman, C.D., and Cline, H.T. (2007). Enhanced visual activity in vivo forms nascent synapses  in the developing retinotectal projection. Journal of neurophysiology 97, 2949‐2957.  Aizenman, C.D., Munoz‐Elias, G., and Cline, H.T. (2002). Visually driven modulation of  glutamatergic synaptic transmission is mediated by the regulation of intracellular polyamines.  Neuron 34, 623‐634.  Andersen, P., Sundberg, S.H., Sveen, O., and Wigstrom, H. (1977). Specific long‐lasting  potentiation of synaptic transmission in hippocampal slices. Nature 266, 736‐737.  39    Andrasfalvy, B.K., and Magee, J.C. (2004). Changes in AMPA receptor currents following LTP  induction on rat CA1 pyramidal neurones. The Journal of physiology 559, 543‐554.  Artola, A., and Singer, W. (1987). Long‐term potentiation and nmda receptors in rat visual‐ cortex. Nature 330, 649‐652.  Asztely, F., and Gustafsson, B. (1994). Dissociation between Long‐Term Potentiation and  Associated Changes in‐Field Epsp Wave‐Form in the Hippocampal Ca1 Region ‐ an in‐Vitro Study  in Guinea‐Pig Brain‐Slices. Hippocampus 4, 148‐156.  Bear, M.F., Cooper, L.N., and Ebner, F.F. (1987). A physiological basis for a theory of synapse  modification. Science 237, 42‐48.  Bellone, C., and Nicoll, R.A. (2007). Rapid bidirectional switching of synaptic NMDA receptors.  Neuron 55, 779‐785.  Benuskova, L., Rema, V., Armstrong‐James, M., and Ebner, F.F. (2001). Theory for normal and  impaired experience‐dependent plasticity in neocortex of adult rats. Proceedings of the  National Academy of Sciences of the United States of America 98, 2797‐2802.  Bi, G., and Poo, M. (2001). Synaptic modification by correlated activity: Hebb's postulate  revisited. Annual review of neuroscience 24, 139‐166.  Bienenstock, E.L., Cooper, L.N., and Munro, P.W. (1982). Theory for the Development of Neuron  Selectivity ‐ Orientation Specificity and Binocular Interaction in Visual‐Cortex. Journal of  Neuroscience 2, 32‐48.  Blais, B.S., Shouval, H.Z., and Cooper, L.N. (1999). The role of presynaptic activity in monocular  deprivation: Comparison of homosynaptic and heterosynaptic mechanisms. pp. 1083‐1087.  Bliss, T.V., and Collingridge, G.L. (1993). A synaptic model of memory: long‐term potentiation in  the hippocampus. Nature 361, 31‐39.  Bliss, T.V., and Gardner‐Medwin, A.R. (1973). Long‐lasting potentiation of synaptic transmission  in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path.  The Journal of physiology 232, 357‐374.  Bliss, T.V., and Lomo, T. (1973). Long‐lasting potentiation of synaptic transmission in the  dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. The  Journal of physiology 232, 331‐356.  40    Brustein, E., Marandi, N., Kovalchuk, Y., Drapeau, P., and Konnerth, A. (2003). "In vivo"  monitoring of neuronal network activity in zebrafish by two‐photon Ca2+ imaging. Pflugers  Archiv‐European Journal of Physiology 446, 766‐773.  Burrone, J., O'Byrne, M., and Murthy, V.N. (2002). Multiple forms of synaptic plasticity triggered  by selective suppression of activity in individual neurons. Nature 420, 414‐418.  Cavazzini, M., Bliss, T., and Emptage, N. (2005). Ca2+ and synaptic plasticity. Cell calcium 38,  355‐367.  Chaveznoriega, L.E., Bliss, T.V.P., and Halliwell, J.V. (1989). The Epsp‐Spike (E‐S) Component of  Long‐Term Potentiation in the Rat Hippocampal Slice Is Modulated by Gabaergic but Not  Cholinergic Mechanisms. Neuroscience letters 104, 58‐64.  Chen, H.X., Otmakhov, N., Strack, S., Colbran, R.J., and Lisman, J.E. (2001). Is persistent activity  of calcium/calmodulin‐dependent kinase required for the maintenance of LTP? Journal of  neurophysiology 85, 1368‐1376.  Cho, K., Aggleton, J.P., Brown, M.W., and Bashir, Z.I. (2001). An experimental test of the role of  postsynaptic calcium levels in determining synaptic strength using perirhinal cortex of rat. pp.  459‐466.  Christie, B.R., and Abraham, W.C. (1992). Priming of associative long‐term depression by [thgr]  frequency synaptic activity. Neuron 8, 79‐84.  Clem, R.L., Celikel, T., and Barth, A.L. (2008). Ongoing in vivo experience triggers synaptic  metaplasticity in the neocortex. Science (New York, N.Y 319, 101‐104.  Cline, H., and Haas, K. (2008). The regulation of dendritic arbor development and plasticity by  glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. Journal of Physiology‐ London 586, 1509‐1517.  Constantine‐Paton, M., Cline, H.T., and Debski, E. (1990). Patterned activity, synaptic  convergence, and the NMDA receptor in developing visual pathways. Annu Rev Neurosci 13,  129‐154.  Crair, M.C., and Malenka, R.C. (1995). A critical period for long‐term potentiation at  thalamocortical synapses. Nature 375, 325‐328.  Daoudal, G., and Debanne, D. (2003). Long‐term plasticity of intrinsic excitability: Learning rules  and mechanisms. Learn. Mem. 10, 456‐465.  41    Daoudal, G., Hanada, Y., and Debanne, D. (2002). Bidirectional plasticity of excitatory  postsynaptic potential (EPSP)‐spike coupling in CA1 hippocampal pyramidal neurons.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 14512‐ 14517.  Debanne, D., Daoudal, G., Sourdet, V., and Russier, M. (2003). Brain plasticity and ion channels.  Journal of physiology, Paris 97, 403‐414.  Debanne, D., Gahwiler, B.H., and Thompson, S.M. (1999). Heterogeneity of synaptic plasticity at  unitary CA3‐CA1 and CA3‐CA3 connections in rat hippocampal slice cultures. J Neurosci 19,  10664‐10671.  Derkach, V., Barria, A., and Soderling, T.R. (1999). Ca2+/calmodulin‐kinase II enhances channel  conductance of alpha‐amino‐3‐hydroxy‐5‐methyl‐4‐isoxazolepropionate type glutamate  receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96,  3269‐3274.  Desai, N.S., Rutherford, L.C., and Turrigiano, G.G. (1999a). BDNF regulates the intrinsic  excitability of cortical neurons. Learn. Mem. 6, 284‐291.  Desai, N.S., Rutherford, L.C., and Turrigiano, G.G. (1999b). Plasticity in the intrinsic excitability  of cortical pyramidal neurons. Nature neuroscience 2, 515‐520.  Didier Le, R., David Fernández De, S., Ana Belén, P., Marco, F., and Washington, B. (2004).  Heterosynaptic metaplastic regulation of synaptic efficacy in CA1 pyramidal neurons of rat  hippocampus. pp. 1011‐1025.  Dudek, S.M., and Bear, M.F. (1992). Homosynaptic long‐term depression in area CA1 of  hippocampus and effects of N‐methyl‐D‐aspartate receptor blockade. Proceedings of the  National Academy of Sciences of the United States of America 89, 4363‐4367.  Dudek, S.M., and Friedlander, M.J. (1996). Developmental down‐regulation of LTD in cortical  layer IV and its independence of modulation by inhibition. Neuron 16, 1097‐1106.  Duffy, S.N., Craddock, K.J., Abel, T., and Nguyen, P.V. (2001). Environmental enrichment  modifies the PKA‐dependence of hippocampal LTP and improves hippocampus‐dependent  memory. Learn. Mem. 8, 26‐34.  El‐Husseini Ael, D., Schnell, E., Dakoji, S., Sweeney, N., Zhou, Q., Prange, O., Gauthier‐Campbell,  C., Aguilera‐Moreno, A., Nicoll, R.A., and Bredt, D.S. (2002). Synaptic strength regulated by  palmitate cycling on PSD‐95. Cell 108, 849‐863.  42    Engert, F., Tao, H.W., Zhang, L.I., and Poo, M.M. (2002). Moving visual stimuli rapidly induce  direction sensitivity of developing tectal neurons. Nature 419, 470‐475.  Erreger, K., Dravid, S.M., Banke, T.G., Wyllie, D.J.A., and Traynelis, S.E. (2005). Subunit‐specific  gating controls rat NR1/NR2A and NR1/NR2B NMDA channel kinetics and synaptic signalling  profiles. J. Physiol. 563, 345‐358.  Frey, U., and Morris, R.G. (1997). Synaptic tagging and long‐term potentiation. Nature 385, 533‐ 536.  Fujii, S. (1996). The long‐term suppressive effect of prior activation of synaptic inputs by low‐ frequency stimulation on induction of long‐term potentiation in CA1 neurons of guinea pig  hippocampal slices. Exp. Brain Res. 111, 305‐312.  Fujisawa, H., Tani, N., Watanabe, K., and Ibata, Y. (1982). Branching of regenerating retinal  axons and preferential selection of appropriate branches for specific neuronal connection in the  newt. Dev Biol 90, 43‐57.  Gaze, R.M. (1958). The representation of the retina on the optic lobe of the frog. Q J Exp Physiol  Cogn Med Sci 43, 209‐214.  Gaze, R.M. (1970). The Formation of Nerve Connections (New York: Academic Press).  Gaze, R.M., and Jacobson, M. (1963). A study of the retinotectal projection during regeneration  of the optic nerve in the frog. Proc R Soc Lond (Biol) 157, 420‐448.  Gaze, R.M., Keating, M.J., and Chung, S.H. (1974). The evolution of the retinotectal map during  development in Xenopus. Proc R Soc Lond B Biol Sci 185, 301‐330.  Glazewski, S., Herman, C., McKenna, M., Chapman, P.F., and Fox, K. (1998). Long‐term  potentiation in vivo in layers II/III of rat barrel cortex. Neuropharmacology 37, 581‐592.  Godement, P., and Bonhoeffer, F. (1989). Cross‐species recognition of tectal cues by retinal  fibers in vitro. Development 106, 313‐320.  Gold, J.I., and Bear, M.F. (1994a). A model of dendritic spine Ca2+ concentration exploring  possible bases for a sliding synaptic modification threshold. pp. 3941‐3945.  Gold, J.I., and Bear, M.F. (1994b). A model of dendritic spine Ca2+ concentration exploring  possible bases for a sliding synaptic modification threshold. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 3941‐ 3945.  43    Greenough, W.T., McDonald, J.W., Parnisari, R.M., and Camel, J.E. (1986). Environmental‐ conditions modulate degeneration and new dendrite growth in cerebellum of senescent rats.  Brain Research 380, 136‐143.  Greenough, W.T., Withers, G.S., and Wallace, C.S. (1989). Morphological changes in the nervous  system arising from behavioral experience: what is the evidence that they are involved in  learning and memory? In The Biology of Memory, L.R. Squire, and E. Lindenlaub, eds. (New  York: Springer‐Verlag), pp. 159–185.  Gustafsson, B., Wigstrom, H., Abraham, W.C., and Huang, Y.Y. (1987). Long‐term potentiation in  the hippocampus using depolarizing current pulses as the conditioning stimulus to single volley  synaptic potentials. J Neurosci 7, 774‐780.  Hanse, E., and Gustafsson, B. (1994). Staurosporine impairs both short‐term and long‐term  potentiation in the dentate gyrus in vitro. Neuroscience 58, 263‐274.  Hebb, D.O. (1949). The organization of behavior (New York: Wiley).  Heynen, A.J., and Bear, M.F. (2001). Long‐term potentiation of thalamocortical transmission in  the adult visual cortex in vivo. J Neurosci 21, 9801‐9813.  Holt, C.E. (1984). Does timing of axon outgrowth influence initial retinotectal topography in  Xenopus? J Neurosci 4, 1130‐1152.  Holt, C.E., and Harris, W.A. (1983). Order in the initial retinotectal map in Xenopus: a new  technique for labelling growing nerve fibres. Nature 301, 150‐152.  Horder, T.J., and Martin, K.A. (1978). Morphogenetics as an alternative to chemospecificity in  the formation of nerve connections. A review of literature, before 1978, concerning the control  of growth of regenerating optic nerve fibres to specific locations in the optic tectum and a new  interpretation based on contact guidance. Symp Soc Exp Biol 32, 275‐358.  Hrabetova, S., and Sacktor, T.C. (2001). Transient translocation of conventional protein kinase C  isoforms and persistent downregulation of atypical protein kinase Mzeta in long‐term  depression. Brain Res Mol Brain Res 95, 146‐152.  Huang, Y.Y., Colino, A., Selig, D.K., and Malenka, R.C. (1992). The influence of prior synaptic  activity on the induction of long‐term potentiation. Science 255, 730‐733.  Hubel, D.H., and Wiesel, T.N. (1963). Single‐cell responses in striate cortex of kittens deprived  of vision in one eye. J. Neurophyiol. 26, 1003‐1017.  44    Impey, S., Mark, M., Villacres, E.C., Poser, S., Chavkin, C., and Storm, D.R. (1996). Induction of  CRE‐mediated gene expression by stimuli that generate long‐lasting LTP in area CA1 of the  hippocampus. Neuron 16, 973‐982.  Jacobson, M. (1978). Developmental Neurobiology (New York: Holt, Rinehard and Winston Inc).  Jester, J.M., Campbell, L.W., and Sejnowski, T.J. (1995). Associative Epsp‐Spike Potentiation  Induced by Pairing Orthodromic and Antidromic Stimulation in Rat Hippocampal Slices. Journal  of Physiology‐London 484, 689‐705.  Johenning, F.W., and Holthoff, K. (2007). Nuclear calcium signals during L‐LTP induction do not  predict the degree of synaptic potentiation. Cell calcium 41, 271‐283.  Jontes, J.D., Buchanan, J., and Smith, S.J. (2000). Growth cone and dendrite dynamics in  zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nature neuroscience 3, 231‐ 237.  Kaethner, R.J., and Stuermer, C.A.O. (1997). Dynamics of process formation during  differentiation of tectal neurons in embryonic zebrafish. Journal of neurobiology 32, 627‐639.  Kameyama, K., Lee, H.K., Bear, M.F., and Huganir, R.L. (1998). Involvement of a postsynaptic  protein kinase A substrate in the expression of homosynaptic long‐term depression. Neuron 21,  1163‐1175.  Katz, L.C., and Shatz, C.J. (1996). Synaptic activity and the construction of cortical circuits.  Science (New York, N.Y 274, 1133‐1138.  Kauderer, B.S., and Kandel, E.R. (2000). Capture of a protein synthesis‐dependent component  of long‐term depression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States  of America 97, 13342‐13347.  Kennedy, M.B., Beale, H.C., Carlisle, H.J., and Washburn, L.R. (2005). Integration of biochemical  signalling in spines. Nature reviews 6, 423‐434.  Kim, J.J., Foy, M.R., and Thompson, R.F. (1996). Behavioral stress modifies hippocampal  plasticity through N‐methyl‐D‐aspartate receptor activation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 4750‐ 4753.  Kirkwood, A., and Bear, M.F. (1994). Homosynaptic long‐term depression in the visual cortex. J  Neurosci 14, 3404‐3412.  45    Kirkwood, A., Lee, H.K., and Bear, M.F. (1995). Co‐regulation of long‐term potentiation and  experience‐dependent synaptic plasticity in visual cortex by age and experience. Nature 375,  328‐331.  Kirkwood, A., Rioult, M.G., and Bear, M.F. (1996a). Experience‐dependent modification of  synaptic plasticity in visual cortex. Nature 381, 526‐528.  Kirkwood, A., Rioult, M.G., and Bear, M.F. (1996b). Experience‐dependent modification of  synaptic plasticity in visual cortex. Nature 381, 526‐528.  Komatsu, Y., Fujii, K., Maeda, J., Sakaguchi, H., and Toyama, K. (1988). Long‐term potentiation  of synaptic transmission in kitten visual‐cortex. Journal of neurophysiology 59, 124‐141.  Kuzmiski, J.B., Pittman, Q.J., and Bains, J.S. (2009). Metaplasticity of Hypothalamic Synapses  following In Vivo Challenge.  62, 839‐849.  Lee, H.K., Kameyama, K., Huganir, R.L., and Bear, M.F. (1998). NMDA induces long‐term  synaptic depression and dephosphorylation of the GluR1 subunit of AMPA receptors in  hippocampus. Neuron 21, 1151‐1162.  Lee, S.M., and Ebner, F.F. (1992). Induction of high‐frequency activity in the somatosensory  thalamus of rats invivo results in long‐term potentiation of responses in si cortex. Experimental  Brain Research 90, 253‐261.  Levy, W.B., and Steward, O. (1979). Synapses as associative memory elements in the  hippocampal formation. Brain research 175, 233‐245.  Lledo, P.M., Hjelmstad, G.O., Mukherji, S., Soderling, T.R., Malenka, R.C., and Nicoll, R.A. (1995).  Calcium/calmodulin‐dependent kinase II and long‐term potentiation enhance synaptic  transmission by the same mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the  United States of America 92, 11175‐11179.  Lovinger, D.M., and Routtenberg, A. (1988). Synapse‐specific protein kinase C activation  enhances maintenance of long‐term potentiation in rat hippocampus. The Journal of physiology  400, 321‐333.  Luscher, C., Xia, H., Beattie, E.C., Carroll, R.C., von Zastrow, M., Malenka, R.C., and Nicoll, R.A.  (1999). Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron 24, 649‐ 658.  Lynch, G.S., Dunwiddie, T., and Gribkoff, V. (1977). Heterosynaptic depression: a postsynaptic  correlate of long‐term potentiation. Nature 266, 737‐739.  46    Lynch, M.A. (2004). Long‐term potentiation and memory. Physiological reviews 84, 87‐136.  Malenka, R.C. (1991). Postsynaptic factors control the duration of synaptic enhancement in  area CA1 of the hippocampus. Neuron 6, 53‐60.  Malenka, R.C., and Bear, M.F. (2004). LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron 44, 5‐ 21.  Malenka, R.C., Kauer, J.A., Perkel, D.J., Mauk, M.D., Kelly, P.T., Nicoll, R.A., and Waxham, M.N.  (1989). An essential role for postsynaptic calmodulin and protein kinase activity in long‐term  potentiation. Nature 340, 554‐557.  Malenka, R.C., Lancaster, B., and Zucker, R.S. (1992). Temporal limits on the rise in postsynaptic  calcium required for the induction of long‐term potentiation. Neuron 9, 121‐128.  Malenka, R.C., and Nicoll, R.A. (1999). Long‐term potentiation‐‐a decade of progress? Science  (New York, N.Y 285, 1870‐1874.  Maletic‐Savatic, M., Malinow, R., and Svoboda, K. (1999). Rapid dendritic morphogenesis in CA1  hippocampal dendrites induced by synaptic activity. Science (New York, N.Y 283, 1923‐1927.  Malinow, R., Madison, D.V., and Tsien, R.W. (1988). Persistent protein kinase activity underlying  long‐term potentiation. Nature 335, 820‐824.  Malinow, R., and Malenka, R.C. (2002). AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.  Annual Review of Neuroscience 25, 103‐126.  Malinow, R., Schulman, H., and Tsien, R.W. (1989). Inhibition of postsynaptic PKC or CaMKII  blocks induction but not expression of LTP. Science (New York, N.Y 245, 862‐866.  Manahan‐Vaughan, D., Kulla, A., and Frey, J.U. (2000). Requirement of translation but not  transcription for the maintenance of long‐term depression in the CA1 region of freely moving  rats. J Neurosci 20, 8572‐8576.  Martin, S.J., Grimwood, P.D., and Morris, R.G.M. (2000). Synaptic plasticity and memory: an  evaluation of the hypothesis. Annu. Rev. Neurosci. 23, 649‐711.  Matsuzaki, M., Honkura, N., Ellis‐Davies, G.C., and Kasai, H. (2004). Structural basis of long‐term  potentiation in single dendritic spines. Nature 429, 761‐766.  McNaughton, B.L., Douglas, R.M., and Goddard, G.V. (1978). Synaptic enhancement in fascia  dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain research 157, 277‐293.  47    Meyer, M.P., and Smith, S.J. (2006). Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides  the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of  Neuroscience 26, 3604‐3614.  Mockett, B., Coussens, C., and Abraham, W.C. (2002). NMDA receptor‐mediated metaplasticity  during the induction of long‐term depression by low‐frequency stimulation. Eur. J. Neurosci. 15,  1819‐1826.  Morishita, W., Connor, J.H., Xia, H., Quinlan, E.M., Shenolikar, S., and Malenka, R.C. (2001).  Regulation of synaptic strength by protein phosphatase 1. Neuron 32, 1133‐1148.  Moser, E.I., Krobert, K.A., Moser, M.B., and Morris, R.G. (1998). Impaired spatial learning after  saturation of long‐term potentiation. Science (New York, N.Y 281, 2038‐2042.  Mu, Y., and Poo, M.M. (2006). Spike timing‐dependent LTP/LTD mediates visual experience‐ dependent plasticity in a developing retinotectal system. Neuron 50, 115‐125.  Mulkey, R.M., Endo, S., Shenolikar, S., and Malenka, R.C. (1994). Involvement of a  calcineurin/inhibitor‐1 phosphatase cascade in hippocampal long‐term depression. Nature 369,  486‐488.  Mulkey, R.M., Herron, C.E., and Malenka, R.C. (1993). An essential role for protein  phosphatases in hippocampal long‐term depression. Science (New York, N.Y 261, 1051‐1055.  Mulkey, R.M., and Malenka, R.C. (1992). Mechanisms underlying induction of homosynaptic  long‐term depression in area CA1 of the hippocampus. Neuron 9, 967‐975.  Neves, G., Cooke, S.F., and Bliss, T.V.P. (2008). Synaptic plasticity, memory and the  hippocampus: a neural network approach to causality. Nature Rev. Neurosci. 9, 65‐75.  Niell, C.M., Meyer, M.P., and Smith, S.J. (2004). In vivo imaging of synapse formation on a  growing dendritic arbor. Nature neuroscience 7, 254‐260.  Nishimune, A., Isaac, J.T., Molnar, E., Noel, J., Nash, S.R., Tagaya, M., Collingridge, G.L.,  Nakanishi, S., and Henley, J.M. (1998). NSF binding to GluR2 regulates synaptic transmission.  Neuron 21, 87‐97.  Nowak, L., Bregestovski, P., Ascher, P., Herbet, A., and Prochiantz, A. (1984). Magnesium gates  glutamate‐activated channels in mouse central neurones. Nature 307, 462‐465.  O'Connor, D.H., Wittenberg, G.M., and Wang, S.S.H. (2005). Dissection of bidirectional synaptic  plasticity into saturable unidirectional processes. J. Neurophysiol. 94, 1565‐1573.  48    Otmakhov, N., Griffith, L.C., and Lisman, J.E. (1997). Postsynaptic inhibitors of  calcium/calmodulin‐dependent protein kinase type II block induction but not maintenance of  pairing‐induced long‐term potentiation. J Neurosci 17, 5357‐5365.  Otto, T., Eichenbaum, H., Wiener, S.I., and Wible, C.G. (1991). Learning‐related patterns of CA1  spike trains parallel stimulation parameters optimal for inducing hippocampal long‐term  potentiation. Hippocampus 1, 181‐192.  Pettit, D.L., Perlman, S., and Malinow, R. (1994). Potentiated transmission and prevention of  further LTP by increased CaMKII activity in postsynaptic hippocampal slice neurons. Science  (New York, N.Y 266, 1881‐1885.  Philpot, B.D., Espinosa, J.S., and Bear, M.F. (2003). Evidence for altered NMDA receptor  function as a basis for metaplasticity in visual cortex. J. Neurosci. 23, 5583‐5588.  Pittenger, C., and Kandel, E.R. (2003). In search of general mechanisms for long‐lasting  plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philosophical transactions of the Royal Society of  London 358, 757‐763.  Poncer, J.C., Esteban, J.A., and Malinow, R. (2002). Multiple mechanisms for the potentiation of  AMPA receptor‐mediated transmission by alpha‐Ca2+/calmodulin‐dependent protein kinase II.  J Neurosci 22, 4406‐4411.  Pratt, K.G., and Aizenman, C.D. (2007). Homeostatic regulation of intrinsic excitability and  synaptic transmission in a developing visual circuit. Journal of Neuroscience 27, 8268‐8277.  Pratt, K.G., Dong, W., and Aizenman, C.D. (2008). Development and spike timing‐dependent  plasticity of recurrent excitation in the Xenopus optic tectum. Nature neuroscience 11, 467‐475.  Quinlan, E.M., Olstein, D.H., and Bear, M.F. (1999a). Bidirectional, experience‐dependent  regulation of N‐methyl‐D‐aspartate receptor subunit composition in the rat visual cortex during  postnatal development. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 12876‐12880.  Quinlan, E.M., Philpot, B.D., Huganir, R.L., and Bear, M.F. (1999b). Rapid, experience‐dependent  expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nature Neurosci. 2, 352‐357.  Reyes, A. (2001). Influence of dendritic conductances on the input‐output properties of  neurons. Annual Review of Neuroscience 24, 653‐675.  Rioult‐Pedotti, M.S., Friedman, D., Hess, G., and Donoghue, J.P. (1998). Strengthening of  horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience 1, 230‐234.  49    Rittenhouse, C.D., Shouval, H.Z., Paradiso, M.A., and Bear, M.F. (1999). Monocular deprivation  induces homosynaptic long‐term depression in visual cortex. Nature 397, 347‐350.  Rogan, M.T., and LeDoux, J.E. (1995). LTP is accompanied by commensurate enhancement of  auditory‐evoked responses in a fear conditioning circuit. Neuron 15, 127‐136.  Rogan, M.T., Staubli, U.V., and LeDoux, J.E. (1997). Fear conditioning induces associative long‐ term potentiation in the amygdala. Nature 390, 604‐607.  Rose, G.M., and Dunwiddie, T.V. (1986). Induction of hippocampal long‐term potentiation using  physiologically patterned stimulation. Neuroscience letters 69, 244‐248.  Roskies, A.L., and O'Leary, D.D. (1994). Control of topographic retinal axon branching by  inhibitory membrane‐bound molecules. Science 265, 799‐803.  Rothman, S.M., and Olney, J.W. (1987). Excitotoxicity and the Nmda Receptor. Trends in  Neurosciences 10, 299‐302.  Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., and Malinow, R. (2005). Postsynaptic Receptor Trafficking  Underlying a Form of Associative Learning. pp. 83‐88.  Ruthazer, E.S., Akerman, C.J., and Cline, H.T. (2003). Control of axon branch dynamics by  correlated activity in vivo. Science (New York, N.Y 301, 66‐70.  Ruthazer, E.S., Li, J., and Cline, H.T. (2006). Stabilization of axon branch dynamics by synaptic  maturation. J Neurosci 26, 3594‐3603.  Sah, P., and Bekkers, J.M. (1996). Apical dendritic location of slow afterhyperpolarization  current in hippocampal pyramidal neurons: implications for the integration of long‐term  potentiation. J. Neurosci. 16, 4537‐4542.  Sajikumar, S., and Frey, J.U. (2003). Anisomycin inhibits the late maintenance of long‐term  depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience letters 338, 147‐150.  Sakaguchi, D.S., and Murphey, R.K. (1985). Map formation in the developing Xenopus  retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. J Neurosci 5, 3228‐ 3245.  Sakamoto, T., Porter, L.L., and Asanuma, H. (1987). Long‐lasting potentiation of synaptic  potentials in the motor cortex produced by stimulation of the sensory cortex in the cat ‐ a basis  of motor learning. Brain Research 413, 360‐364.  50    Schnell, E., Sizemore, M., Karimzadegan, S., Chen, L., Bredt, D.S., and Nicoll, R.A. (2002). Direct  interactions between PSD‐95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 13902‐ 13907.  Schrader, L.A., Anderson, A.E., Varga, A.W., Levy, M., and Sweatt, J.D. (2002). The other half of  Hebb ‐ K+ channels and the regulation of neuronal excitability in the hippocampus. Mol.  Neurobiol. 25, 51‐66.  Sermasi, E., Tropea, D., and Domenici, L. (1999). Long term depression is expressed during  postnatal development in rat visual cortex: a role for visual experience. Brain Res Dev Brain Res  113, 61‐65.  Shi, S.‐H., Hayashi, Y., Esteban, J.A., and Malinow, R. (2001a). Subunit‐Specific Rules Governing  AMPA Receptor Trafficking to Synapses in Hippocampal Pyramidal Neurons. Cell 105, 331‐343.  Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J.A., and Malinow, R. (2001b). Subunit‐specific rules governing  AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell 105, 331‐343.  Shouval, H.Z., Bear, M.F., and Cooper, L.N. (2002a). A unified model of NMDA receptor‐ dependent bidirectional synaptic plasticity. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 10831‐10836.  Shouval, H.Z., Castellani, G.C., Blais, B.S., Yeung, L.C., and Cooper, L.N. (2002b). Converging  evidence for a simplified biophysical model of synaptic plasticity. Biol. Cybern. 87, 383‐391.  Shukla, K., Kim, J., Blundell, J., and Powell, C.M. (2007). Learning‐induced glutamate receptor  phosphorylation resembles that induced by long term potentiation. The Journal of biological  chemistry 282, 18100‐18107.  Silva, A.J., Kogan, J.H., Frankland, P.W., and Kida, S. (1998). CREB and memory. Annu Rev  Neurosci 21, 127‐148.  Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., and Cline, H.T. (2002a). Dendrite growth increased by visual  activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature 419, 475‐480.  Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., and Cline, H.T. (2002b). Dendrite growth increased by visual  activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature 419, 475‐480.  Song, I., Kamboj, S., Xia, J., Dong, H., Liao, D., and Huganir, R.L. (1998). Interaction of the N‐ ethylmaleimide‐sensitive factor with AMPA receptors. Neuron 21, 393‐400.  Sperry, R.W. (1943). Visuomotor coordination in the newt (Triturus viridescens) after  regeneration of the optic nerves. J Comp Neurol 79, 33‐55.  51    Sperry, R.W. (1963). Chemoaffinity in the Orderly Growth of Nerve Fiber Patterns and  Connections. Proc Natl Acad Sci U S A 50, 703‐710.  Sretavan, D., and Shatz, C.J. (1984). Prenatal development of individual retinogeniculate axons  during the period of segregation. Nature 308, 845‐848.  Stoop, R., and Poo, M.M. (1996). Synaptic modulation by neurotrophic factors: Differential and  synergistic effects of brain‐derived neurotrophic factor and ciliary neurotrophic factor. Journal  of Neuroscience 16, 3256‐3264.  Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., and Konnerth, A. (2003). In vivo two‐photon calcium  imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 100, 7319‐7324.  Tamura, H., Tsumoto, T., and Hata, Y. (1992). Activity‐dependent potentiation and depression  of visual cortical responses to optic‐nerve stimulation in kittens. Journal of neurophysiology 68,  1603‐1612.  Tao, H.W., Zhang, L.I., Engert, F., and Poo, M. (2001). Emergence of input specificity of ltp  during development of retinotectal connections in vivo. Neuron 31, 569‐580.  Thiels, E., Barrionuevo, G., and Berger, T.W. (1994). Excitatory stimulation during postsynaptic  inhibition induces long‐term depression in hippocampus in vivo. Journal of neurophysiology 72,  3009‐3016.  Tomasulo, R.A., and Ramirez, J.J. (1993). Activity‐Mediated Changes in Feedforward Inhibition  in the Dentate Commissural Pathway ‐ Relationship to Epsp Spike Dissociation in the Converging  Perforant Path. Journal of neurophysiology 69, 165‐173.  Turrigiano, G.G., and Nelson, S.B. (2000). Hebb and homeostasis in neuronal plasticity. Current  Opinion in Neurobiology 10, 358‐364.  Udin, S.B., and Grant, S. (1999). Plasticity in the tectum of Xenopus laevis: Binocular maps.  Progress in Neurobiology 59, 81‐106.  van Dam, E.J., Ruiter, B., Kamal, A., Ramakers, G.M., Gispen, W.H., and de Graan, P.N. (2002). N‐ methyl‐D‐aspartate‐induced long‐term depression is associated with a decrease in postsynaptic  protein kinase C substrate phosphorylation in rat hippocampal slices. Neuroscience letters 320,  129‐132.  Van Praag, H., Christie, B.R., Sejnowski, T.J., and Gage, F.H. (1999). Running enhances  neurogenesis, learning, and long‐term potentiation in mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 13427‐ 13431.  52    Vielmetter, J., and Stuermer, C.A. (1989). Goldfish retinal axons respond to position‐specific  properties of tectal cell membranes in vitro. Neuron 2, 1331‐1339.  Vislay‐Meltzer, R.L., Kampff, A.R., and Engert, F. (2006). Spatiotemporal specificity of neuronal  activity directs the modification of receptive fields in the developing retinotectal system.  Neuron 50, 101‐114.  Walter, J., Henke‐Fahle, S., and Bonhoeffer, F. (1987a). Avoidance of posterior tectal  membranes by temporal retinal axons. Development 101, 909‐913.  Walter, J., Kern‐Veits, B., Huf, J., Stolze, B., and Bonhoeffer, F. (1987b). Recognition of position‐ specific properties of tectal cell membranes by retinal axons in vitro. Development 101, 685‐ 696.  Wang, Y., Wu, J., Rowan, M.J., and Anwyl, R. (1998). Role of protein kinase C in the induction of  homosynaptic long‐term depression by brief low frequency stimulation in the dentate gyrus of  the rat hippocampus in vitro. J. Physiol. 513, 467‐475.  Wang, Z.R., Xu, N.L., Wu, C.P., Duan, S.M., and Poo, M.M. (2003). Bidirectional changes in  spatial dendritic integration accompanying long‐term synaptic modifications. Neuron 37, 463‐ 472.  Wathey, J.C., Lytton, W.W., Jester, J.M., and Sejnowski, T.J. (1992). Computer‐Simulations of  Epsp‐Spike (E‐S) Potentiation in Hippocampal Ca1 Pyramidal Cells. Journal of Neuroscience 12,  607‐618.  Weliky, M., and Katz, L.C. (1999). Correlational structure of spontaneous neuronal activity in the  developing lateral geniculate nucleus in vivo. Science (New York, N.Y 285, 599‐604.  Whitlock, J.R., Heynen, A.J., Shuler, M.G., and Bear, M.F. (2006). Learning induces long‐term  potentiation in the hippocampus. Science (New York, N.Y 313, 1093‐1097.  Woo, N.H., and Nguyen, P.V. (2002). Silent metaplasticity of the late phase of long‐term  potentiation requires protein phosphatases. Learn. Mem. 9, 202‐213.  Wu, G.Y., and Cline, H.T. (1998). Stabilization of dendritic arbor structure in vivo by CaMKII.  Science (New York, N.Y 279, 222‐226.  Wu, G.Y., Zou, D.J., Rajan, I., and Cline, H. (1999). Dendritic dynamics in vivo change during  neuronal maturation. Journal of Neuroscience 19, 4472‐4483.  Xu, L., Anwyl, R., and Rowan, M.J. (1998). Spatial exploration induces a persistent reversal of  long‐term potentiation in rat hippocampus. Nature 394, 891‐894.  53    Yasuda, H., Barth, A.L., Stellwagen, D., and Malenka, R.C. (2003). A developmental switch in the  signaling cascades for LTP induction. Nature neuroscience 6, 15‐16.  Yeung, L.C., Shouval, H.Z., Blais, B.S., and Cooper, L.N. (2004). Synaptic homeostasis and input  selectivity follow from a calcium‐dependent plasticity model. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101,  14943‐14948.  Yuste, R., and Bonhoeffer, T. (2001). Morphological changes in dendritic spines associated with  long‐term synaptic plasticity. Annual review of neuroscience 24, 1071‐1089.  Zhang, L.I., and Poo, M.M. (2001). Electrical activity and development of neural circuits. Nature  neuroscience 4, 1207‐1214.  Zhang, L.I., Tao, H.W., Holt, C.E., Harris, W.A., and Poo, M. (1998). A critical window for  cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature 395, 37‐44.  Zhang, L.I., Tao, H.W., and Poo, M. (2000). Visual input induces long‐term potentiation of  developing retinotectal synapses. Nature neuroscience 3, 708‐715.  Zhou, Q., Tao, H.W., and Poo, M.M. (2003). Reversal and stabilization of synaptic modifications  in a developing visual system. Science (New York, N.Y 300, 1953‐1957.  54    2. METAPLASTICITY GOVERNS NATURAL EXPERIENCE‐ DRIVEN  PLASTICITY  OF  NASCENT  EMBRYONIC  BRAIN CIRCUITS1    2.1. INTRODUCTION  During early periods of embryonic brain development, brief sensory experience plays a  direct role in shaping neural circuit structure, connectivity, and function. Plasticity of neuronal  firing during this critical period of development can have long lasting effects on network growth  to influence normal and abnormal brain function later in life. Unlike mammalian embryos, frog  and fish larvae provide an accessible developing brain circuit to study this stage of neuronal  growth, in which afferent input can be driven by well‐controlled visual stimuli for study of  activity‐dependent central circuit formation and refinement. In these systems, visual  experience affects dendritic and axonal growth (Haas et al., 2006; Ramdya and Engert, 2008;  Ruthazer et al., 2003; Sin et al., 2002), synaptic efficiency (Engert et al., 2002; Zhang et al.,                                                           1 A version of this chapter has been accepted for publication. Dunfield, D. and Haas, K. (2009)  Metaplasticity governs natural experience‐driven plasticity of nascent embryonic brain circuits.  Neuron, in press.    55    2000) and excitability (Aizenman et al., 2003; Aizenman et al., 2002) of central neurons. Single  neuron recordings in open brain preparations have demonstrated NMDAR‐dependent synaptic  long‐term potentiation (LTP) and long‐term depression (LTD) at retinotectal synapses after  electrical or visual stimulation (Engert et al., 2002; Vislay‐Meltzer et al., 2006; Zhang et al.,  1998; Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2003). Interestingly, the same visual experience can induce  either LTP or LTD (Zhou et al., 2003) simultaneously in different tectal cells. We hypothesize an  explanation for such variable plasticity responses is provided by the Bienenstock‐Cooper‐Munro  (BCM) (Bienenstock et al., 1982) theory which suggests that a neuron’s firing rate prior to  plasticity induction may directly affect that cell’s ability to exhibit subsequent synaptic LTP or  LTD. In this form of plasticity regulation, termed metaplasticity (Abraham, 2008), neurons with  distinct initial states can respond differently to the same presynaptic stimulus. The BCM  learning rule has been shown to be valid for plasticity induced changes in synaptic efficiency as  well as neuronal excitability (Daoudal et al., 2002; Wang et al., 2003), both of which may be  reflected in long term changes in a neuron’s functional response properties. It is presently  unclear whether metaplastic rules govern synaptic plasticity of individual neurons during  normal brain development or if metaplasticity occurs in the absence of experimental priming  such as dark rearing or monocular deprivation. Proper testing of these theories requires  simultaneous monitoring of activity in large populations of neurons within intact systems to  determine whether individual neuronal pre‐training firing rates predict variable plasticity  results.  To measure endogenous activity and visual response properties of large neuronal  ensembles, we utilized in vivo imaging of spontaneous and visually evoked calcium events. This  56    technique allows simultaneous probing of the visual properties of hundreds of tectal neurons in  the awake brain with single cell resolution. Visual receptive field (RF) responses were probed  both prior to, and up to one hour following visual training. Using population imaging and  network analysis of activity, we find experience‐driven plasticity in the retinotectal system  causes variable functional plasticity of individual tectal neurons, driving functional RF responses  of neurons toward long lasting potentiation or depression. Plasticity is specific to the RF  properties evoked during training and shows evidence for BCM metaplasticity, in that pre‐ training activity predicts plasticity outcome. Together, our results demonstrate that natural  sensory input plays a profound and lasting role in the functional development of intact brain  circuits, subject to each neuron’s previous history.     2.2. RESULTS  To noninvasively investigate how sensory experience alters circuit function within the  intact and awake developing brain, we simultaneously monitored the activity of hundreds of  neurons within the optic tectum of unanaesthetized Stage 50 tadpoles (Nieuwkoop and Faber,  1967) in response to wide‐field light ON or OFF stimuli (Gaze et al., 1974; Zhang et al., 1998)  using in vivo two‐photon time‐lapse single‐cell‐excitability‐probing (SCEP) (Johenning and  Holthoff, 2007) of calcium dynamics (Brustein et al., 2003; Stosiek et al., 2003) (Fig. 2.1a).  Because the amplitudes of Ca2+ transients in individual neurons are correlated with action  potential firing (Brustein et al., 2003; Fetcho, 1998; Johenning and Holthoff, 2007; Niell and  57    Smith, 2005; Ramdya et al., 2006; Smetters et al., 1999; Sumbre et al., 2008; Yaksi, 2006), SCEP  allows monitoring of the plasticity of functional RF responses within the intact circuit. We find  that more than 45% of cells in a single optical section of the tectum demonstrate clear evoked  calcium responses to 50ms OFF stimuli (Fig. 2.1b, Fig. 2.2, Fig 2.3). 50ms OFF stimuli trigger  somatic action potentials in tectal neurons without residual ON responses (Tao et al., 2001;  Zhang et al., 2000), allowing us to probe changes in a neuron’s OFF RF. Amplitudes of visually  evoked wide‐field responses remained stable over 1h 45min of probing at 60‐second intervals  in 69% of the visually responsive cells.  2.2.1 Long  lasting  functional  plasticity  in  central  neuronal  ensembles  driven  by  natural  sensory stimuli   Can brief patterned visual training affect network activity and circuit RF plasticity in the  intact and awake developing tadpole brain? While patterned input appears unnecessary for  early RF refinement in the intact tectum of zebrafish (Niell and Smith, 2005), exposure to  specific patterns of repeated visual stimuli can induce long lasting synaptic changes in single  tectal neurons recorded using patch clamp electrophysiology in open brain preparations of  developing Xenopus (Vislay‐Meltzer et al., 2006; Zhou et al., 2003). To asses functional RF  plasticity throughout the tectal circuit in response to visual training, we probed visually evoked  calcium responses to 50ms OFF stimuli before and after a 25 minute ‘spaced training’ paradigm  composed of repeated trains of high‐frequency 50ms OFF stimuli (Fig. 2.4, Fig. 2.6a). High  frequency stimulation significantly increases cell activity compared to pre‐training probing (Fig.  2.5a). Average calcium transient amplitude is also greater than pre‐training probing (28±6%,  p<<0.01 t‐test). Spaced training induced long lasting potentiation of visual evoked responses to  58    OFF stimuli, evident from a significant increase in the ensemble average firing rate measured  30‐60min post‐spaced training (Fig. 2.1c).  If spaced training can cause mean potentiation of tectal neuron responses in the  developing brain, is it possible for other patterns of brief visual experience to cause functional  depression? Homosynaptic depression can be induced in vivo during weak afferent activity from  the retina (Bear et al., 1987; Rittenhouse et al., 1999). BCM theory predicts this effect,  postulating that low levels of presynaptic activity will depress active synapses (Bienenstock et  al., 1982) and intrinsic excitability (Daoudal and Debanne, 2003), while high levels of  presynaptic activity above a modification threshold, θm, will lead to postsynaptic strengthening.  To reduce presynaptic activity, we presented an unchanging light stimulus to the immobilized  eye. Because retinal ganglion cells (RGCs) respond most strongly to changes in the pattern of  illumination, rather than to steady states of uniform illumination (Wade and Swanston, 2001),  ‘invariant’ light stimulation elicits significantly less neuronal firing than baseline probing (Fig.  2.5a). There is no change, however, in average calcium transient amplitude compared to pre‐ training probing (p=0.47, t‐test). Indeed, training with 25 minutes of invariant light stimulation  induced significant long lasting depression of ensemble visually evoked calcium responses 30‐ 60min post‐training (Fig. 2.1c).   2.2.2 Variable plasticity of individual central neurons to the same sensory training paradigm  Single‐cell excitability probing of visually evoked calcium responses allowed us to  determine the long‐term plasticity effects of natural visual stimulation on individual tectal  neurons during both spaced and invariant training (Fig 2.6). The amplitudes of visually evoked  59    calcium responses in all visually responsive cells showed one of four types of plasticity: long‐ lasting potentiation (Fig. 2.7, a and e), short‐term potentiation (Fig. 2.7, b and f), no change  from pre‐training levels (Fig. 2.7, c and g), and long‐lasting depression (Fig. 2.7, d and h). Such  variable RF plasticity is consistent with visually‐driven synaptic plasticity previously observed in  the retinotectal system (Zhou et al., 2003), and highlights the intrinsic complexity of natural  plasticity induction in the intact developing brain. In response to spaced training, over 50% of  neurons showed a short or long lasting potentiation to the probed stimulus, and 12% exhibited  long lasting depression (Fig. 2.7k). Probing during spaced training demonstrates plasticity is  additive over periods of high frequency stimulation (Fig. 2.5b). Similar to spaced training,  invariant training induced varied plasticity in neurons throughout the tectal circuit (Fig. 2.7, f to  h); however, the largest population of cells, 45%, exhibited long lasting depression (Fig. 2.7k).  Among cells showing persistent depression, the amount of depression was significantly greater  after invariant than following spaced training (invariant = ‐33±1%, spaced training = ‐26±1%,  p=0.00001 t‐test). Taken together, our results show that brief episodes of natural visual  experience can cause long lasting functional changes within the intact, awake, developing brain,  with specific patterns of stimulation favouring induction of either potentiation or depression.  Training did not produce potentiation or depression in all cells; rather, a varied amount and  type of plasticity was observed throughout the tectal circuit, with the specific training paradigm  preferentially shifting the majority of cells towards potentiation or depression. Potentiation or  depression of functional responses may reflect the plasticity of synaptic inputs (Debanne et al.,  2003; Powers et al., 1992) or altered neuronal excitability (Aizenman et al., 2003; Campanac  and Debanne, 2008; Daoudal and Debanne, 2003; Daoudal et al., 2002; Wang et al., 2003) .  60    2.2.3 Synaptic mechanisms underlying visually induced tectal RF plasticity  Activation of N‐methyl‐D‐aspartate receptors (NMDARs), a subtype of glutamate  receptors, is required for induction of LTP and LTD at retinotectal synapses (Engert et al., 2002;  Zhang et al., 1998; Zhang et al., 2000). We tested whether blockade of NMDARs by injection of  D‐aminophosphovalerate (D‐APV) (50µM), a specific NMDAR antagonist, interferes with  experience‐induced plasticity of visually evoked tectal Ca2+ responses. NMDAR blockade  significantly reduced visually‐driven potentiation by spaced training (Fig. 2.7i) and depression  after invariant training, albeit to a lesser degree (Fig. 2.7j). Residual depression may be due to  other non‐NMDAR dependent forms of LTD, such as mGluR mediated depression (Daoudal and  Debanne, 2003). Mean evoked calcium responses 30‐60 minutes post training demonstrated no  significant difference between a continuous probing control and either spaced training + APV or  invariant training + APV. APV injection did not affect visually evoked calcium response  amplitudes directly (Fig. 2.8), suggesting that the elimination of training induced plasticity was  not due to an APV‐induced reduction of activity during the training period. Injection of vehicle  control before training did not affect plasticity induction (Fig. 2.9). These results support an  NMDAR dependent mechanism mediating induction of visually driven functional plasticity in  the awake tadpole optic tectum.  2.2.4 RF mapping across tectal circuit and specificity of plasticity to the characteristics of the  training sensory stimuli  Is spaced training induced plasticity specific to the properties of the training stimulus?  Because 50ms OFF spaced training elicits only OFF responses, only OFF RFs should show  plasticity if training specificity is true. Probing with 60s OFF stimuli allowed us to map the wide‐ 61    field OFF (stimulus onset) and ON (stimulus offset) RF properties of neurons throughout the  tectum (Fig. 2.10). Approximately half of visually responsive tectal cells were purely OFF‐ dominated without detectable ON response, 5% were purely ON‐dominated, and the  remainder responded in varying degrees to both ON and OFF stimuli. Interestingly, analysis of  network responses revealed significant anatomical clustering of cells with ON‐ and OFF‐ dominated RFs compared to random reassignments of RF values (Fig. 2.11, a and b). Clustering  of ON‐ and OFF‐center afferents is predicted in computational models (Miller, 1992, 1994) and  has been demonstrated in mammalian primary visual cortex (Jin et al., 2008; Zahs and Stryker,  1988). By probing both ON and OFF responses pre‐ and post‐spaced training, we found that  plasticity induced by 50ms OFF spaced training is specific to OFF responses. 86% of cells  demonstrate no change in ON response after spaced training (p < 10‐10, compared to OFF no  change, chi‐squared test). Moreover, the amplitude of OFF response plasticity increased with  the degree of RF OFF‐domination (Fig. 2.11c). These results clearly demonstrate specificity of  plasticity to characteristics of the training stimuli as a defining characteristic of spaced training  with wide‐field ON and OFF stimuli in the intact tectum. Furthermore, we find that spontaneous  activity of long lasting potentiated cells is reduced after spaced training (Fig. 2.12), suggesting  spaced training induced potentiation is not due to a global increase in cell excitability.   2.2.5 Metaplastic rules predict visually induced RF plasticity of individual neurons  Do neurons within intact brain circuits exhibit metaplasticity, such that pre‐training  intrinsic properties of individual neurons influence their responses to training? A second  feature of BCM theory is that the value of the modification threshold, θm, which determines the  degree and direction of synaptic efficiency (Bienenstock et al., 1982) and intrinsic excitability  62    (Daoudal and Debanne, 2003) changes, is not fixed but instead dependent on each neuron’s  averaged postsynaptic firing rate during the recent past. If the averaged firing rate is high, θm  rises; if the averaged firing rate is low, θm falls (Fig. 2.13a). The intact Xenopus retinotectal  preparation in combination with uniform dye uptake after bulk loading (Fig. 2.14) (Garaschuk et  al., 2006; Yasuda et al., 2004) allowed us to indirectly monitor the firing rate of individual tectal  neurons during pre‐training by measuring spontaneous calcium events driven by endogenous  brain circuit activity (Zhou et al., 2003). Calcium transients reflect both slow cell firing rates  through their frequency and burst firing rates through their amplitudes. Transient amplitudes  have been shown to scale with the number of action potentials fired in a burst  in multiple  systems and organisms (Brustein et al., 2003; Fetcho, 1998; Johenning and Holthoff, 2007; Niell  and Smith, 2005; Ramdya et al., 2006; Smetters et al., 1999; Sumbre et al., 2008; Yaksi, 2006).  While we observed no significant differences in the frequency of pre‐training spontaneous  calcium transients between plasticity groups, the amplitudes of spontaneous calcium transients  were significantly different (Fig. 2.13b). Cells that exhibited long lasting functional potentiation  after spaced training had significantly lower pre‐training spontaneous calcium transient  amplitudes than other plasticity types, while cells demonstrating functional depression had  significantly higher amplitudes. These results are predicted by BCM theory (Bear, 2003; Beggs,  2001; Daoudal and Debanne, 2003) (Fig. 2.13a). Moreover, potentiation and depression are  unlikely to be caused by activity differences during the training period (Fig. 2.15). The BCM  model is also supported by our findings that cells demonstrating depression following invariant  training exhibited high pre‐training calcium transient amplitudes. In this case, minimal  presynaptic input during training prohibits neuronal activity from passing the modification  63    threshold, preventing potentiation. In turn, neurons with up‐shifted θm values due to high levels  of pre‐training activity are more likely to undergo depression (Fig. 2.13a). Both examples  provide evidence of metaplasticity within the intact developing brain, where intrinsic  spontaneous firing predisposes expression of future plasticity. While these theories do not  address induction of short‐term plasticity, increased spontaneous firing has been shown to  rapidly reduce synaptic plasticity in the tectum (Zhou et al., 2003). Here we find that cells that  undergo short‐term RF plasticity have significantly higher spontaneous firing rates post‐training  than those exhibiting long lasting plasticity, suggesting that enhanced spontaneous activity  post‐training reverses functional RF potentiation (Fig. 2.13c).   2.2.6 Experimentally  increased  pre‐training  activity  shifts  spaced  training  plasticity  outcomes toward depression through an NMDAR dependent mechanism  Spontaneous activity in tectal neurons consists of random single spikes and bursts of  spikes (Zhou et al., 2003). White noise light stimulation, such as flashes of randomly patterned  ON and OFF checker boards (Zhou et al., 2003), or rapidly varying wide‐field light intensities  (used here; Ramdya et al., 2006) can readily induce enhanced firing rates (Fig. 2.5a) in  tectal neurons with similar properties to endogenous spontaneous tectal activity (Zhou et al.,  2003). We presented wide‐field white noise stimuli at 5Hz to experimentally increase cell firing  for 1 hour prior to SCEP imaging. After white noise stimulation, pre‐training probing, spaced  training, and post‐training probing were presented the same as previous experiments.  Enhanced activity shifted plasticity outcomes toward depression (Fig. 2.16). BCM theory  predicts this change in space training induced plasticity as a result of each cell’s historical  64    enhanced firing rate shifting the modification threshold (Fig. 2.13a). These results strongly  support BCM metaplasticity as a plasticity regulator in the awake embryo.   Significantly, the shift in plasticity outcome due to enhanced activity can be abolished by  injection of D‐APV (50µM) directly before white noise priming during the metaplasticity phase  (Fig. 2.16). Spaced training plasticity results after white noise + APV show no significant  difference from spaced training alone without priming (p=0.1, chi‐square test). The absence of  reduction in potentiation compared to regular spaced training suggests that APV was washed  out prior to training stimulation. Our results reveal NMDARs as an endogenous mechanism for  metaplasticity in the awake developing brain.  2.2.7 Potentiation is associated with an increase in spontaneous correlated firing     Does spaced training induced plasticity alter intrinsic ensemble network activity?  Analysis of spontaneous activity shows significant correlated firing between tectal cells (Fig.  2.17). Correlated firing is more common among nearest anatomical neighbours, suggesting  shared afferent input or local interconnections (Tao et al., 2001) (Fig. 2.17a). Spaced training  induced a significant increase in correlated spontaneous activity 0‐10 min post training (Fig.  2.17b). Increased correlations of cells exhibiting long lasting potentiation were significantly  greater than other plasticity types. Cells showing long lasting depression following spaced  training showed no change in network correlation. Control tadpoles and tadpoles exposed to  invariant training exhibited no change in network correlations.     65    2.3. DISCUSSION    Together, our results provide a circuit analysis of the effects of natural sensory  experience on neural network function within the intact, awake, developing brain. Non‐invasive  functional imaging of sensory‐induced plasticity expands upon previous electrophysiological  studies (Engert et al., 2002; Pratt et al., 2008; Tao and Poo, 2005; Zhou et al., 2003) by  simultaneously linking single cell and ensemble plasticity. We find that individual neurons  within intact embryonic central circuits respond to plasticity‐inducing sensory input in a  complex manner, resulting in functional potentiation, depression, or no change toward a  probed RF stimulus (Fig. 2.7). While individual neurons show variable plasticity after visual  training, mean population responses to RF stimuli can be potentiated or depressed depending  on the training paradigm.   Spaced training composed of repeated trains of high frequency OFF visual stimuli  preferentially shifted cell response properties toward potentiation of the trained OFF  responses. The absence of change in ON RFs following OFF spaced training, demonstrated clear  specificity of RF plasticity to characteristics of the input training stimulus. Improved long‐term  neuronal performance restricted to characteristics of specific training stimuli has been  demonstrated in primary visual and auditory cortex (Pantev et al., 1998; Schoups et al., 2001;  Sengpiel et al., 1999; Zhang et al., 2001), though such acute effects at the embryonic stage  where RFs are generally broad and unrefined are striking.   66    Here we find that spaced training is also associated with an increase in correlated  spontaneous firing between potentiated neurons. Although enhancement of correlated circuit  activity induced by spaced training is transient, these correlations may play a significant role in  functional plasticity among neurons within select sub‐networks by promoting transition to long  lasting forms of potentiation (Voigt et al., 2005).   In contrast to spaced training, invariant light stimulation to the immobilized eye shifted  the majority of ensemble response properties toward depression. Binocular deprivation in early  postnatal development leads to similar effects, depressing synaptic transmission and rendering  visual cortical neurons unresponsive to subsequent visual stimulation (Bear et al., 1987;  Freeman et al., 1981; Prusky et al., 2000; Rittenhouse et al., 1999). In both invariant training  and binocular deprivation, BCM theory predicts induction of depression due to decreased pre‐ synaptic activity which is insufficient to reach the threshold required for potentiation.   Variable long lasting functional plasticity outcomes induced by both spaced training and  invariant training were accurately predicted by measuring the pre‐training activity of individual  cells. Neurons with high spontaneous firing rates during pre‐training periods exhibited  predisposition for training‐induced depression, while neurons with low spontaneous firing rates  demonstrated predisposition to potentiation. This metaplastic result follows the BCM learning  rule, where the plasticity modification threshold depends on average pre‐training activity and  will increase or decrease with higher or lower firing rates.   We find strong support for BCM theory by increasing pre‐training activity using white  noise visual stimulation. We demonstrate that white noise dramatically shifts tectal neuronal  67    plasticity responses to spaced training towards depression. One explanation for these results is  that the sliding threshold of BCM theory acts as a homeostatic mechanism to maintain  synapses, dendritic integration, and resulting afferent‐evoked neuronal activity within useful  dynamic ranges (Abraham et al., 2001). Hence, this rule makes it more difficult for highly active  neurons to potentiate further and easier for them to depress (Abbott and Nelson, 2000;  Abraham, 2008; Abraham and Tate, 1997). Our findings that APV blocks the ability of white  noise priming to shift plasticity outcomes implicate NMDAR‐mediated transmission as an  underlying mechanism of experience dependent metaplasticity in the awake developing brain.    The demonstration that brief sensory experience induces variable functional plasticity  throughout nascent developing neuronal ensembles as a function of each individual neuron’s  recent past activity and intrinsic RF properties has major implications for the functional  development of neural networks. Neurons exhibit bias to refine their existing RF responses by  strengthening if weak and weakening if strong, thereby maintaining responses within a  functional dynamic range. Metaplasticity to restrict significant alteration in RF properties and  training specificity to limit plasticity to distinct stimuli may elucidate evidence for stability in RF  responses throughout maturation (Niell and Smith, 2005), as well as the ability for brief sensory  stimuli to elicit substantial input specific plasticity. In this manner, environmental experience  may drive discrete modification of developing central circuits to optimize performance within a  relevant range.    68    2.4. EXPERIMENTAL PROCEDURES   2.4.1 Animal rearing conditions  Freely swimming albino Xenopus laevis tadpoles were reared and maintained in 10%  Steinberg’s solution (1× Steinberg's in mM: 10 HEPES, 58 NaCl, 0.67 KCl, 0.34 Ca(NO3)2,  0.83 MgSO4, pH 7.4) , and housed at 22 oC on a 12hour light/dark cycle. All experimental  procedures were conducted on Stage 50 tadpoles (Nieuwkoop and Faber, 1967) according to  the guidelines of the Canadian Council on Animal Care, and were approved by the Animal Care  Committee of the University of British Columbia’s Faculty of Medicine.  2.4.2 Calcium indicator loading   The calcium‐sensitive fluorescent indicator Oregon Green 488 BAPTA‐1, AM (OGB1‐AM,  Molecular Probes, Eugene, OR) was bulk loaded into neurons within the tadpole brain (Brustein  et al., 2003; Niell and Smith, 2005; Stosiek et al., 2003). OGB1‐AM was prepared at a  concentration of 10mM in DMSO with 20% pluronic acid (Molecular Probes) and further diluted  10:1 in Ca2+‐free Amphibian Ringers solution (in mM): 116 NaCl, 1.2 KCl, 2.7 NaHCO3. Under  visual guidance using an upright stereomicroscope, a sharp glass pipette loaded with OGB1‐AM  solution was inserted into the optic tectum of tadpoles anesthetized with 0.01% 3‐ aminobenzoic acid ethyl ester (MS222, Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO). Dye solution was slowly  perfused into the brain using low‐pressure (<10psi) on a Picospritzer III (General Valve  Corporation, Fairfield, NJ). Tadpoles were subsequently returned to normal bath solution and  allowed to recover from anaesthesia under dim light conditions (Brustein et al., 2003; Niell and  Smith, 2005). One‐hour following OGB1‐AM loading, tadpoles were immobilized with 5 minute  69    bath application of 2mM pancuronium dibromide (PCD; Tocris, Ellisville, MO), embedded in 1%  agarose, and placed in an imaging chamber continuously perfused with oxygenated 10%  Steinberg’s solution. PCD is a reversible paralytic and typically wears off 2 hours post  application at this dosage.  2.4.3 In vivo two‐photon calcium imaging of neuronal dynamics   The imaging chamber was mounted on the stage of a custom‐built two‐photon laser‐ scanning microscope, constructed from an Olympus FV300 confocal microscope (Olympus,  Center Valley, PA) and a Chameleon XR laser light source (Coherent, Santa Clara, CA). Optical  sections through the optic tectum were captured using a 60X, 1.1 NA, water immersion  objective (Olympus), and images were recorded and processed using Fluoview software  (Olympus). The optic tectum was imaged at a resolution of 640 x 480 pixels and zoom factor of  1.5X, encompassing an area of 177 x133 μm, allowing simultaneous imaging of approximately  100‐200 neurons in a single X‐Y scan. Repeated X‐Y scans of a single optical section were taken  at a rate of 1.2s per frame using a wavelength of 910nm to excite OGB1‐AM dye. The unique  dye‐loading pattern allows morphological corrections for drift over time without the need for a  secondary morphological marker (confirmed by dual labelling with OGB1‐AM and Red‐ fluorescent CellTracker Red CMTPX; Molecular Probes, Eugene, OR). Drift corrections (if  necessary) were made every four minutes.  2.4.4 Visual stimulation   To apply light stimuli, a diode (590nm) was projected through the camera port of a  trinocular eyepiece for whole‐field illumination. A coloured Wratten Filter 32 (Kodak,  70    Rochester, NY) assured no bleed‐through into the imaging channel. Illumination intensity,  timing, and duration of light stimuli was varied with custom written software (Matlab, The  Mathworks Inc., Natick, MA) synched to the microscope’s ‘ttl’ output for the onset of frame  scanning. Step changes in whole‐field light intensity from the background illumination were  used as visual stimuli.   2.4.5 Single cell excitability probing (SCEP)  Evoked responses to visual stimuli were probed every 60 sec during 20 min pre‐training  and 60 min post‐training (Fig. 2.4a). Two visual stimuli were used for SCEP probing: a 50ms OFF  stimulus (Fig. 2.4a) and a 60 sec OFF stimulus (Fig. 2.4b). For control stimulation, 60 second  probing was continued throughout the training window (Fig. 2.4a and c). Evoked OFF responses  were recorded at each 50ms stimulus and at the beginning of each 60 sec stimulus. Evoked ON  responses were recorded at the end of each 60 sec stimulus.   2.4.6 Visual training  To test RF plasticity after visual training, we utilized two separate training stimuli, each  25 minutes in duration (Fig. 2.4a and c). Invariant training consisted of 25 minutes ON light  stimulation to the paralyzed eye. Spaced training consisted of three sets of 90, 50ms OFF  stimuli at 0.3Hz, spaced by 5‐minute intervals of ON stimulation. Previous studies have  demonstrated persistent 5‐minute spaced training with a moving bar stimulus can induce long  term synaptic plasticity in the presence of endogenous spontaneous neuronal activity (Zhou et  al., 2003).  71    2.4.7 White noise  Wide field white noise stimulation was accomplished by random variation of the diode  voltage at 5Hz between empirically determined maximum and minimum intensity values within  the diode’s linear range. White noise was presented to the paralyzed eye for one hour prior to  pre‐training SCEP probing.  2.4.8 Blockade of NMDAR  For NMDAR blockade of spaced training and invariant training induced plasticity,  tadpoles were injected with 50 μM D‐APV (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) immediately before  training. For NMDAR blockade during the metaplasticity phase, 50 μM D‐APV was injected one  hour prior to pre‐training imaging, during which time white noise visual stimulation was  presented to the tadpole.  2.4.9 Analysis of imaging data  Fluorescence data stacks were initially x‐y aligned using Turboreg (Thévenaz et al., 1998)  (ImageJ, NIH). Experiments that showed z‐drift after alignment were discarded (approximately  1 in 4 cases). For each experiment, individual regions of interest (ROIs) were manually drawn  over neuronal cell bodies in each optical section and analyzed using custom written software.  For each neuron ROI the change in fluorescence intensity was calculated as ∆F/F0 = (F – F(t)base)/  F(t)base, where F is the average intensity of the ROI in an image frame and Fbase is a simple linear  regression fit to image frames with florescence values one standard deviation from the  minimum‐recorded fluorescence intensity. This fitting served to eliminate the amplitudes of  spontaneous spiking events from weighting the baseline fluorescence trace. Images frames  72    within 36 seconds (30 frames) of an evoked response were not included in the linear  regression.   2.4.10 Evoked responses  SCEP records the evoked responses of single neurons over time. Response amplitudes  were taken to be peak ∆F/F0 within three image frames after the visual stimulus. Only evoked  responses with ΔF/F peak values >1.5 standard deviations (STD) above the mean baseline  fluorescence trace were included in analysis (standard deviation of average baseline  fluorescence trace, ∆F/F0 = 0.09). Somatic Ca 2+ spikes elicited by visual OFF stimuli are rapid  (<100ms), long lasting (peak amplitudes of approximately 2sec), and reproducible (Fig. 2.2). ON  stimuli evoke similarly long duration and consistent amplitude somatic calcium events, yet spike  initiations are slower (approximately 900ms to peak) than OFF responses.   2.4.11 Spontaneous spiking  Fluorescence values were considered spikes if their ∆F/F0 >  STD above average baseline  fluorescence trace and they showed characteristic fast onset. Coincident peak values > STD  above the mean were taken as new spikes if ∆F/F0 values between events fell below the initial  peak minus STD. To assure spontaneous spiking was not influenced by evoked responses, image  frames within 48 seconds (40 frames) of an evoked response were not included in spontaneous  activity analysis.  2.4.12 Inclusion criteria  For all analysis, only cells with >70% of probed evoked responses with ΔF/F0 peak values  >1.5 STD above the mean were included. In addition, cells were required to have consistent  73    pre‐training responses, where the mean evoked responses of 3 out of 4 five‐minute epochs of  SCEP pre‐training (0‐5, 5‐10, 10‐15, 15‐20) could not differ significantly from the total mean  evoked pre‐training responses (0‐20min) (unpaired heteroscedastic 2‐tailed t‐test). Cells with  constantly drifting evoked responses were also excluded. These were determined by fitting pre‐ training responses with a linear regression and excluding all cells with slope values not equal to  0 within the 95% confidence interval. 92% of responding cells fit these criteria.  2.4.13 Plasticity criteria  For long‐term changes, response properties were assayed by comparing responses  during the 20 minutes of pre‐training to both the responses during the first 20 minutes of post‐ training and the responses between 40‐60 minutes post‐training. Cells undergoing long lasting  potentiation and long lasting depression showed significant changes both immediately and  persistently after training (t‐test p < 0.05). Cells undergoing short‐term potentiation showed  significant increase in responses during the first 20 minutes post‐training but no significant  change in responses 40‐60 minutes post‐training. Cells that showed no significant change in  responses were categorized as ‘no change’.   2.4.14 Spontaneous correlations  Pair‐wise correlations of spontaneous activity were calculated with the Pearson  product‐moment correlation coefficient (Rodgers and Nicewander, 1988). Correlations were  calculated over 10‐minute epochs.  74    2.4.15 Clustering  Numerical simulation was used to estimate the probability that observed levels of  anatomical clustering of receptive fields and correlated activity arose under a null hypothesis of  no spatial organization. To do this, the observed receptive field values or activity patterns were  randomly reassigned among neurons within a given tadpole and clustering measures were  calculated. This process was repeated 100,000 times. Reported p‐values are the fraction of  simulations that showed more clustering than was measured in the original data.    2.5. ACKNOWLEDGEMENTS  We thank K. Podgorski for help with correlation and clustering analysis, and D. Allan, S. Bamji, B.  Chen, T. Murphy, and C. Rankin for comments on the manuscript. This work was supported by  the National Science and Engineering Council of Canada, the Canadian Institute of Health  Research, the Michael Smith Foundation for Health Research, the Canadian Foundation for  Innovation, The EJLB Foundation, and the Human Early Learning Project.  75    2.6. FIGURES    Figure 2.1 | Visually‐driven plasticity of evoked Ca2+ events in the intact and awake brain.   a, Diagram of the experimental set‐up: Visual stimuli are projected into the tadpole eye while  performing two‐photon imaging of contralateral optic tectum (red box, image area shown in b).  b, Left‐Fluorescence optical section through tectum demonstrating neuropil (N), cell body  region (C), and ventricle (V) (average of 5 images; scale bar = 140 m); Middle – Ca2+ responses  immediately before visual stimulus; Right – Visually evoked calcium responses induced by brief,  50ms, OFF stimulus. Pseudo‐color image using scale of fractional change in fluorescence  intensity relative to average baseline levels. c, Mean SCEP recordings (± s.e.m.) of all cells after  spaced training (left; n = 6 tadpoles, 168 cells; 14±1%, p < 10‐11, 40‐60min post training, t‐test)  and invariant training (right; n = 5 tadpoles, 106 cells; ‐20±1%, p < 10‐12, 40‐60min post training,  t‐test). Bar denotes training periods.   76     Figure 2.2 | Fluorescent calcium responses to visual stimuli. a, Line scan of single cell response  to a brief, 50ms, OFF stimulus. The stimulus window is marked at one second. b, Fluorescence  responses to 50ms OFF stimuli for four neurons located at different areas across the tectum.  Stimuli were provided at 0.033Hz (indicated by black squares). Neurons respond consistently  and robustly across trials.  77     Figure 2.3 | Characteristics of fluorescent calcium responses to visual OFF s                                                               timuli.  Mean (±s.e.m.) SCEP recordings from tectal neurons to OFF stimuli of progressively  longer duration at the maximal background illumination (grey, n=55 in two tadpoles) and  progressively higher background intensities at the longest duration (black, n=36 in two  tadpoles). The standard probing stimuli were chosen to be (10‐1, 50ms or 60sec). SCEP  recordings were measured as peak ΔF/F of the fluorescent calcium response. For each tadpole,  stimulus series were randomly presented.        78    Figure 2.4 | SCEP and training paradigms. a, SCEP recording paradigm to probe visual OFF  response properties (black bars, 50ms OFF stimuli presented every 60 seconds; 20 minutes pre‐ training, 60 minutes post‐training). Training stimuli are illustrated between probing periods.  (Top) Inv, Invariant ON light stimulation; (Middle) ST, spaced training with repetitive 50ms OFF  stimuli; (Bottom) C, control stimulus (black bars, 50ms OFF stimuli). b, SCEP recording paradigm  to probe both visual OFF and ON response properties (black bars, 60 second OFF stimuli  presented every 120 seconds; ON response measure at end of OFF stimulus; 20 minutes pre‐ training, 60 minutes post‐training). c, Expanded illustrations of training stimuli.       79    80     Figure 2.5 | Activity during training. a, Scatter plot of activity during high frequency (0.3Hz)  spaced training (ST, green squares), invariant ON light stimulation (Inv, red squares), and white  noise stimulation (see figure 2.16) (WN, dark blue squares) of individual cells versus activity  during pre‐training SCEP probing. Black line, pre‐training and training (or WN) activity are equal.   Mean activities are significantly different from pre‐training: ST, 1.4±0.04 spikes/min (n=80 cells  in two tadpoles); Inv, 0.8±0.02 spikes/min (n=80 cells in two tadpoles); WN, 1.14±0.05  spikes/min (n=33 cells in two tadpoles). b, Spaced training plasticity effects are additive with  each presentation of high frequency OFF stimuli. Mean activity of different plasticity groups (±  s.e.m.) (3 tadpoles): Long lasting potentiation (n=20, green circles), short term potentiation  (n=8, grey circles), no change (n=48, blue circles), and long lasting depression (n=10, red  circles).  81     Figure 2.6 | Natural visual stimuli induce variable functional plasticity in the embryonic brain.   a, SCEP recording paradigm to probe visual OFF response properties and training stimulation.  SCEP is presented every 60 seconds: 20 minutes pre‐training, 60 minutes post‐training (black  bars, 50ms OFF stimuli). Training stimulation: spaced training, three sets of high frequency  (0.3Hz) repetitive 50ms OFF stimuli spaced by 5 minutes ON stimulation (top) and invariant ON  light stimulation (bottom). Coloured boxes correspond to raster plots shown in b. b, Raster plot  of the amplitude of Ca2+ transients for 100 randomly selected tectal neurons before and after  spaced training (top) and invariant training (bottom). Each vertical section of the plot shows  only 11 imaging frames; white lines separate time gaps. Green lines denote 50ms OFF stimuli.  Means of all 50 Ca2+ transients, normalized to average pre‐training peak values, are shown  below raster plot.  82    Figure 2.7 | In vivo long lasting plasticity of single neurons and ensemble populations using  visually evoked single cell excitability probing (SCEP). a‐d, SCEP recordings from single tectal  neurons exhibiting (a) long lasting potentiation (b) short term potentiation (c) no change and  (d) long lasting depression to the probed, 50ms OFF stimulus after spaced training (ST). e‐h,  Mean SCEP recordings (± s.e.m.) of all cells exhibiting similar plasticity after ST (closed circles)  and invariant training (Inv) (open circles); sample size same as k. i‐j, Mean SCEP recordings (±  s.e.m.) of all cells after (i) ST and (j) Inv. Plasticity is blocked by tectal injection of APV (red  triangles). Mean amplitudes 40‐60min post training are significant: i, n = 3 tadpoles, 79 cells, p <  10‐18; j, n = 3 tadpoles, 67 cells, p < 10‐14 (t‐tests). Bar denotes training periods and red arrow  APV injection. k, Percentage of neurons exhibiting long lasting potentiation (ST 29%, Inv 1%**,  Control 4%**, ST + APV 6%*, Inv + APV 9%**), short‐term potentiation (ST 24%, Inv 13%*,  Control 1%**, ST + APV 14%, Inv + APV 16%), no change (ST 35%**, Inv 41%**, Control 69%, ST  + APV 49%**, Inv + APV 45%**), and long lasting depression (ST 12%**, Inv 45%, Control  26%**, ST + APV 39%, Inv + APV 30%*), after various training. ST, n = 6 tadpoles, 168 cells; Inv,  n = 5 tadpoles, 106 cells; Control, n = 4 tadpoles, 168 cells; ST + APV, n = 3 tadpoles, 79 cells; Inv  + APV, n = 3 tadpoles, 67 cells.  * p < 0.05, ** p<0.01, significant difference (chi‐squared test)  compared to underlined sample.      83    84     Figure 2.8 | NMDAR blockade does not affect visually evoked calcium response amplitudes.  Scatter plot of mean evoked calcium response amplitudes (±s.e.m.) pre‐ and post‐ APV injection  (n=30 cells in 1 tadpole). Red line, linear regression fit of data (R2=0.95, slope=1.03±0.03).  85     Figure 2.9 | Vehicle injection does not affect training. a, Mean SCEP recordings (± s.e.m.) of all  cells after spaced‐training (black circles; n = 6 tadpoles, 168 cells) and spaced‐training + vehicle  injection  control  (blue  squares;  n  =  3  tadpoles,  97  cells). Mean  amplitudes  40‐60min  post  training show no significant difference (t‐test). b, Percentage of neurons exhibiting long lasting  potentiation  (28%),  short‐term  potentiation  (38%),  no  change  (24%),  and  long  lasting  depression  (10%),    after  spaced  training +  vehicle  control  injection. n = 3  tadpoles, 97  cells.  Percentages  show  no  significant  difference  from  spaced  training  alone  (p=0.09,  chi‐squared  test).           86     Figure 2.10 | Line scan of single neuron OFF and ON response. Top: 60 second light stimulus;  // time break. Bottom: Line scan of fluorescence response. Stimulus begins at 2 seconds and  ends at 62 seconds.    87     Figure 2.11 | Tectal neurons cluster based on RF properties and RF plasticity is preferential to  the trained stimulus. a, Purely ON and OFF‐dominated RFs cluster anatomically. Coloured bars  denote measured fraction of nearest anatomical neighbours with similar off‐responsiveness;  black bars and tails denote bootstrapped means and 95% confidence intervals for fraction of  nearest neighbour pairs within similar off‐responsiveness under random reassignment of  observed receptive field values (see Methods); n = 3 tadpoles, 254 cells * p = 0.04, ** p = 0.001,  significant difference (one‐tailed t‐test). b, Anatomical distribution of RFs in a single tadpole:  neurons can be identified as purely OFF‐dominated (red), purely ON‐dominated (dark blue) or  responsive to both ON and OFF stimuli (green) using 60sec OFF stimulus probing. Black circles  highlight anatomical clusters. c, The induced plasticity correlates to strength of neuronal  response to OFF vs. ON stimuli (mean ± s.e.m. of 10% bins, n= 3 tadpoles, 254 cells).  88     Figure 2.12 | Spontaneous activity of potentiated cells is unchanged after spaced training.  Scatter plot of mean spontaneous spike amplitudes (±s.e.m.) pre‐ and post‐ spaced training  (n=20 cells in 3 tadpoles). Red line, linear regression fit of data (R2=0.65, slope=0.85±0.03).  Black line, pre‐training and post‐training activity are equal.      89    Figure 2.13 | Metaplasticity and stabilization of visually induced neuronal plasticity.   a, BMC theory schematic. Horizontal axis, neuronal activity during training: determined as the  product of presynaptic activity and synaptic efficiency. Vertical axis, neuronal plasticity. A  neuron’s modification threshold during training, θm, is dependent on its average postsynaptic  firing during pre‐training. Neurons with high firing levels pre‐training shift θm to the right,  making potentiation more difficult and depression easier to induce. Neurons with low firing  levels pre‐training show the opposite effect. Reduced pre‐synaptic activity during invariant  training limits neuronal activity to below the modification threshold b, Mean amplitudes (±  s.e.m.) of spontaneous Ca2+ events predict plasticity outcomes (left). Spontaneous activity  during pre‐training is significantly greater in cells that undergo long lasting depression (red)  regardless of the training paradigm. Cells that undergo long lasting potentiation (green) after  spaced training show significantly less pre‐training spontaneous activity than those of other  plasticity types. Short‐term potentiated cells (grey) and cells showing no plasticity change (blue)  after spaced training show no significant difference; whereas, short‐term potentiated cells after  invariant training show no significant difference from depressed cells (* p < 0.05, ** < 0.01, t‐ tests). Spontaneous pre‐training activity of individual neurons shows significant correlation to  their plasticity outcomes (right) (spaced training; black line, linear regression R2=‐0.55; slope=‐ 0.07±0.019) c, Mean amplitudes (± s.e.m.) of spontaneous activity post‐training is significantly  lower in neurons exhibiting long lasting plasticity (* p < 0.05, ** < 0.01, t‐test). n for all data sets  in Fig. 2.13 are the same as in Fig. 2.7.       90    91     Figure 2.14 | Variations in bulk loading dye uptake are not correlated with calcium transient  spike amplitudes. Scatter plot of pre‐training calcium spike amplitudes (±s.e.m.) versus mean  baseline fluorescence of individual cells. Raw fluorescence values correlate to the level of dye  uptake by cells. ∆F/F fitting of baseline fluorescence allows for direct comparison of spike  amplitudes to firing rates due to relatively uniform uptake of the dye. Red line, linear regression  fit, slope = 0.008±0.015 (n=82 cells in 2 tadpoles).   92     Figure 2.15 | Training activity does not account for spaced training induced plasticity. Scatter  plot of mean pre‐training spontaneous calcium transient amplitudes (±s.e.m.) versus activity  during spaced training for individual cells.  Cells with high pre‐training activity do not show  significantly less activity during training and thus are unlikely to depress do to a reduction in  input. Similarly cells with low pre‐training, which potentiate, do not show significantly greater  training activity. Red line, linear regression fit, slope=‐0.0006±0.0012 (n=62 cells in 2 tadpoles).  93     Figure 2.16 | Increased activity prior to training shifts plasticity outcomes toward depression  through an NMDAR dependent mechanism. a, Mean SCEP recordings (± s.e.m.) of all cells after  spaced training (ST, black circles), white noise priming 1 hour prior to SCEP (WN, yellow circles),  and WN priming + APV injection (WN+APV, red triangles). 40‐60min post training: ST, 14±1%;  WN, 13±1%; WN+APV, ‐26±1%. ST and WN+APV show no significant difference, p=0.44, t‐test.  Bar denotes training periods. b, This shift is blocked by APV injection during the metaplasticity  phase. Percentage of neurons exhibiting long lasting potentiation (WN 9%, WN+APV 24%*),  short‐term potentiation (WN 6%, WN+APV 16%),  no change (WN 26%, WN+APV 51%**), and  long lasting depression (WN 58%, WN+APV 9%**), after various training. ST and WN+APV show  no significant difference, p=0.1, chi‐square test.  ST, n = 6 tadpoles, 168 cells; WN, n = 3  tadpoles, 53 cells; WN+APV, n = 3 tadpoles, 70 cells. * p<0.05, ** p<0.01, significant difference  (chi‐squared test).  94     Figure 2.17 | Network analysis reveals increased correlated activity in neurons exhibiting  potentiation. a, Correlated activity between neurons is significantly more common among  nearest neighbours. Black bars denote fraction of nearest neighbour pairs with significant  (p<0.05) correlations; grey bars and tails denote bootstrapped means and 95% confidence  intervals for fraction of nearest neighbour pairs with significant correlations under random  reassignment of neuronal activity patterns (* p < 0.05, ** < 0.01, one‐tailed t‐test). b,  Correlated activity increases after spaced training. Average (± s.e.m.) fraction of significant  (p<0.01) pair‐wise correlations between all cells for each plasticity group (* p < 0.05, ** < 0.01,  t‐test). a and b data, pair‐wise correlations calculated over 10‐minute epochs; n for all data sets  in Fig. 2.17 are the same as in Fig. 2.7.             95    2.7. REFERENCES  Abbott, L.F., and Nelson, S.B. (2000). Synaptic plasticity: Taming the beast. Nature neuroscience  3, 1178‐1183.  Abraham, W.C. (2008). Metaplasticity: tuning synapses and networks for plasticity. Nature  Reviews Neuroscience 9, 387‐399.  Abraham, W.C., Mason‐Parker, S.E., Bear, M.F., Webb, S., and Tate, W.P. (2001). Heterosynaptic  metaplasticity in the hippocampus in vivo: A BCM‐like modifiable threshold for LTP.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 10924‐ 10929.  Abraham, W.C., and Tate, W.P. (1997). Metaplasticity: A new vista across the field of synaptic  plasticity. Progress in Neurobiology 52, 303‐323.  Aizenman, C.D., Akerman, C.J., Jensen, K.R., and Cline, H.T. (2003). Visually driven regulation of  intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron 39, 831‐842.  Aizenman, C.D., Munoz‐Elias, G., and Cline, H.T. (2002). Visually driven modulation of  glutamatergic synaptic transmission is mediated by the regulation of intracellular polyamines.  Neuron 34, 623‐634.  Bear, M.F. (2003). Bidirectional synaptic plasticity: from theory to reality. Philos. Trans. R. Soc.  Lond. Ser. B‐Biol. Sci. 358, 649‐655.  Bear, M.F., Cooper, L.N., and Ebner, F.F. (1987). A Physiological‐Basis for a Theory of Synapse  Modification. Science (New York, N.Y 237, 42‐48.  Beggs, J.M. (2001). A statistical theory of long‐term potentiation and depression. Neural  Comput. 13, 87‐111.  Bienenstock, E.L., Cooper, L.N., and Munro, P.W. (1982). Theory for the Development of Neuron  Selectivity ‐ Orientation Specificity and Binocular Interaction in Visual‐Cortex. Journal of  Neuroscience 2, 32‐48.  Brustein, E., Marandi, N., Kovalchuk, Y., Drapeau, P., and Konnerth, A. (2003). "In vivo"  monitoring of neuronal network activity in zebrafish by two‐photon Ca2+ imaging. Pflugers  Archiv‐European Journal of Physiology 446, 766‐773.  96    Campanac, E., and Debanne, D. (2008). Spike timing‐dependent plasticity: a learning rule for  dendritic integration in rat CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology‐London 586, 779‐793.  Daoudal, G., and Debanne, D. (2003). Long‐term plasticity of intrinsic excitability: Learning rules  and mechanisms. Learn. Mem. 10, 456‐465.  Daoudal, G., Hanada, Y., and Debanne, D. (2002). Bidirectional plasticity of excitatory  postsynaptic potential (EPSP)‐spike coupling in CA1 hippocampal pyramidal neurons.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 14512‐ 14517.  Debanne, D., Daoudal, G., Sourdet, V., and Russier, M. (2003). Brain plasticity and ion channels.  Journal of physiology, Paris 97, 403‐414.  Engert, F., Tao, H.W., Zhang, L.I., and Poo, M.M. (2002). Moving visual stimuli rapidly induce  direction sensitivity of developing tectal neurons. Nature 419, 470‐475.  Fetcho, J.R., Cox, K.J., and O'Malley, D.M. (1998). Monitoring activity in neuronal populations  with single‐cell resolution in a behaving vertebrate. Histochem. J. 30, 153‐167.  Freeman, R.D., Mallach, R., and Hartley, S. (1981). Responsivity of Normal Kitten Striate Cortex  Deteriorates after Brief Binocular Deprivation. Journal of neurophysiology 45, 1074‐1084.  Garaschuk, O., Milos, R.I., and Konnerth, A. (2006). Targeted bulk‐loading of fluorescent  indicators for two‐photon brain imaging in vivo. Nature Protocols 1, 380‐386.  Gaze, R.M., Keating, M.J., and Chung, S.H. (1974). Evolution of Retinotectal Map During  Development in Xenopus. Proceedings of the Royal Society of London Series B‐Biological  Sciences 185, 301‐&.  Haas, K., Li, J.L., and Cline, H.T. (2006). AMPA receptors regulate experience‐dependent  dendritic arbor growth in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 103, 12127‐12131.  Jin, J.Z., Weng, C., Yeh, C.I., Gordon, J.A., Ruthazer, E.S., Stryker, M.P., Swadlow, H.A., and  Alonso, J.M. (2008). On and off domains of geniculate afferents in cat primary visual cortex.  Nature neuroscience 11, 88‐94.  Johenning, F.W., and Holthoff, K. (2007). Nuclear calcium signals during L‐LTP induction do not  predict the degree of synaptic potentiation. Cell calcium 41, 271‐283.  97    Miller, K.D. (1992). Development of Orientation Columns Via Competition between on‐Center  and Off‐Center Inputs. Neuroreport 3, 73‐76.  Miller, K.D. (1994). A Model for the Development of Simple Cell Receptive‐Fields and the  Ordered Arrangement of Orientation Columns through Activity‐Dependent Competition  between on‐ and Off‐Center Inputs. Journal of Neuroscience 14, 409‐441.  Niell, C.M., and Smith, S.J. (2005). Functional imaging reveals rapid development of visual  response properties in the zebrafish tectum. Neuron 45, 941‐951.  Nieuwkoop, P.D., and Faber, J. (1967). Normal Table of Xenopus laevis, 2nd edn edn  (Amsterdam: North Holland).  Pantev, C., Oostenveld, R., Engelien, A., Ross, B., Roberts, L.E., and Hoke, M. (1998). Increased  auditory cortical representation in musicians. Nature 392, 811‐814.  Powers, R.K., Robinson, F.R., Konodi, M.A., and Binder, M.D. (1992). Effective Synaptic Current  Can Be Estimated from Measurements of Neuronal Discharge. Journal of neurophysiology 68,  964‐968.  Pratt, K.G., Dong, W., and Aizenman, C.D. (2008). Development and spike timing‐dependent  plasticity of recurrent excitation in the Xenopus optic tectum. Nature neuroscience 11, 467‐475.  Prusky, G.T., West, P.W.R., and Douglas, R.M. (2000). Experience‐dependent plasticity of visual  acuity in rats. European Journal of Neuroscience 12, 3781‐3786.  Ramdya, P., and Engert, F. (2008). Emergence of binocular functional properties in a monocular  neural circuit. Nature neuroscience 11, 1083‐1090.  Ramdya, P., Reiter, B., and Engert, F. (2006). Reverse correlation of rapid calcium signals in the  zebrafish optic tectum in vivo. Journal of neuroscience methods 157, 230‐237.  Rittenhouse, C.D., Shouval, H.Z., Paradiso, M.A., and Bear, M.F. (1999). Monocular deprivation  induces homosynaptic long‐term depression in visual cortex. Nature 397, 347‐350.  Rodgers, J.L., and Nicewander, W.A. (1988). Thirteen ways to look at the correlation coefficient.  American Statistician 42, 59‐66.  Ruthazer, E.S., Akerman, C.J., and Cline, H.T. (2003). Control of axon branch dynamics by  correlated activity in vivo. Science (New York, N.Y 301, 66‐70.  98    Schoups, A., Vogels, R., Qian, N., and Orban, G. (2001). Practising orientation identification  improves orientation coding in V1 neurons. Nature 412, 549‐553.  Sengpiel, F., Stawinski, P., and Bonhoeffer, T. (1999). Influence of experience on orientation  maps in cat visual cortex. Nature Neuroscience 2, 727‐732.  Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., and Cline, H.T. (2002). Dendrite growth increased by visual  activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature 419, 475‐480.  Smetters, D., Majewska, A., and Yuste, R. (1999). Detecting action potentials in neuronal  populations with calcium imaging. Methods (San Diego, Calif 18, 215‐221.  Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., and Konnerth, A. (2003). In vivo two‐photon calcium  imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 100, 7319‐7324.  Sumbre, G., Muto, A., Baier, H., and Poo, M.‐m. (2008). Entrained rhythmic activities of  neuronal ensembles as perceptual memory of time interval. Nature.  Tao, H.W., and Poo, M.M. (2005). Activity‐dependent matching of excitatory and inhibitory  inputs during refinement of visual receptive fields. Neuron 45, 829‐836.  Tao, H.W., Zhang, L.I., Engert, F., and Poo, M. (2001). Emergence of input specificity of ltp  during development of retinotectal connections in vivo. Neuron 31, 569‐580.  Thévenaz, P., Ruttimann, U.E., and Unser, M. (1998). A Pyramid Approach to Subpixel  Registration Based on Intensity. IEEE Transactions on Image Processing 7, 27‐41.  Vislay‐Meltzer, R.L., Kampff, A.R., and Engert, F. (2006). Spatiotemporal specificity of neuronal  activity directs the modification of receptive fields in the developing retinotectal system.  Neuron 50, 101‐114.  Voigt, T., Opitz, T., and de Lima, A.D. (2005). Activation of early silent synapses by spontaneous  synchronous network activity limits the range of neocortical connections. Journal of  Neuroscience 25, 4605‐4615.  Wade, N., and Swanston, M. (2001). Visual perception: an introduction, 2 edn (East Sussex:  Psychology Press).  Wang, Z.R., Xu, N.L., Wu, C.P., Duan, S.M., and Poo, M.M. (2003). Bidirectional changes in  spatial dendritic integration accompanying long‐term synaptic modifications. Neuron 37, 463‐ 472.  99    Yaksi, E.F., R. W. (2006). Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by  temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nature Methods 3, 377‐383.  Yasuda, H., Nimchinsky, E.A., Scheuss, V., Pologruto, T.A., Oertner, T.G., Sabatini, B.L., and  Svoboda, K. (2004). Imaging Calcium Concentration Dynamics in Small Neuronal Compartments.  Sci. STKE 219.  Zahs, K.R., and Stryker, M.P. (1988). Segregation of on and Off Afferents to Ferret Visual‐Cortex.  Journal of neurophysiology 59, 1410‐1429.  Zhang, L.I., Bao, S.W., and Merzenich, M.M. (2001). Persistent and specific influences of early  acoustic environments on primary auditory cortex. Nature Neuroscience 4, 1123‐1130.  Zhang, L.I., Tao, H.W., Holt, C.E., Harris, W.A., and Poo, M. (1998). A critical window for  cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature 395, 37‐44.  Zhang, L.I., Tao, H.W., and Poo, M. (2000). Visual input induces long‐term potentiation of  developing retinotectal synapses. Nature neuroscience 3, 708‐715.  Zhou, Q., Tao, H.W., and Poo, M.M. (2003). Reversal and stabilization of synaptic modifications  in a developing visual system. Science (New York, N.Y 300, 1953‐1957.          100    3. IN  VIVO  SINGLE  CELL  EXCITABILITY  PROBING  OF  NEURONAL  ENSEMBLES  IN  THE  INTACT  DEVELOPING BRAIN2  3.1. INTRODUCTION  During embryonic development, brain neurons undergo extensive activity‐dependent  morphological (Cline and Haas, 2008; Haas et al., 2006; Ramdya and Engert, 2008; Ruthazer et  al., 2003; Sin et al., 2002) and synaptic (Aizenman et al., 2003; Aizenman et al., 2002; Engert et  al., 2002; Zhang et al., 2000) refinement. This experience‐driven reorganization results in  progressive persistent changes in the functional output of both single neurons and ensemble  populations to influence normal and abnormal brain function later in life.  In the developing  embryonic retinotectal system of Xenopus tadpoles, tectal neurons receiving direct innervation  from the optic nerve, exhibit functional changes reflected by both an age‐dependent reduction  in receptive field (RF) size (Gaze et al., 1974; Sakaguchi and Murphey, 1985; Sretavan and Shatz,  1984) as well as rapid potentiation or depression of firing rates induced by brief, RF‐specific,  visual experience (Dunfield and Haas, 2009; Engert et al., 2002; Vislay‐Meltzer et al., 2006). A                                                           2 A version of this chapter has been submitted for publication. Dunfield, D. and Haas, K. In vivo  single cell excitability probing of neuronal ensembles in the intact developing brain.  101    fundamental question of developmental neuroscience is how sensory experience modifies long‐ term firing behaviour and RF response properties of individual cells, as well as RF encoding of  large neuronal ensembles in vivo.   Functional calcium imaging offers a non‐invasive method to measure cell spiking in the  awake and intact developing brain. Tectal neurons typically exhibit AP bursting in response to  visual sensory input (Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2003). Because calcium transients scale  with the number of AP fired in a burst (Brustein et al., 2003; Fetcho, 1998; Johenning and  Holthoff, 2007; Niell and Smith, 2005; Ramdya et al., 2006; Smetters et al., 1999; Sumbre et al.,  2008; Yaksi, 2006), changes in calcium transient amplitudes can be used to map tectal RF  response properties as well as functional plasticity over time (Brustein et al., 2003; Dunfield and  Haas, 2009; Niell and Smith, 2005; Sumbre et al., 2008).  Single cell excitability probing (SCEP)  synchs stimulus probing with the scanning frames of time‐lapse two‐photon microscopy,  allowing functional response mapping of large neuronal ensembles within a single optical  section (100‐200 neurons in the Xenopus optic tectum). In its simplest form, SCEP analysis  records peak calcium transients in single cells directly after stimulus onset. By varying sensory  stimuli, SCEP recordings can map cellular response properties of neuronal ensembles. SCEP can  also record functional plasticity by probing before and after an induction stimulus. This  technique has been used as a read out for synaptic plasticity in CA1 hippocampal slices after  LTP induction (Johenning and Holthoff, 2007), as well as for RF mapping (Dunfield and Haas,  2009; Niell and Smith, 2005) and visually induced RF plasticity (Dunfield and Haas, 2009) in the  awake and intact optic tectum. Both evoked and spontaneous neuronal activity can be assayed  by recording calcium transients between probing stimuli (Dunfield and Haas, 2009).   102    During early embryonic development, Xenopus tectal neurons respond robustly to sharp  changes in wide field illumination (ON or OFF stimuli) (Gaze et al., 1974; Zhang et al., 1998;  Zhang et al., 2000). In this protocol, we outline in vivo SCEP paradigms for wide‐field RF  mapping in Xenopus laevis tadpoles as well as visual training paradigms that elicit both long  term functional potentiation and long term functional depression of OFF responses in neuronal  ensembles.  A similar protocol may be suitable for localized spot stimulation (Tao and Poo,  2005; Vislay‐Meltzer et al., 2006) or movement stimuli (Engert et al., 2002; Mu and Poo, 2006;  Zhou et al., 2003). By imaging large neuronal populations with single cell resolution, the  underlying contributions of individual cells to ensemble changes can be studied. This is  particularly important in the developing brain, where visual experience has been shown to  induce disparate synaptic (Vislay‐Meltzer et al., 2006; Zhou et al., 2003) and RF plasticity  (Dunfield and Haas, 2009) throughout the neural circuit.     103    3.2. MATERIALS  3.2.1 Reagents  • Albino or wild‐type Xenopus laevis tadpoles (obtained from lab colony or Nasco, Fort Atkinson, WI). Here, we used stage 50 tadpoles (Nieuwkoop and Faber, 1967), although visually  evoked responses may be elicited as early as stage 40 (Chen, 2001) . For detailed instructions  on acquiring and maintaining tadpoles, see ref. (Bhatt et al., 2004). Tadpoles used in excitability  probing experiments were raised on a twelve hour light/dark cycle. ! CAUTION All experiments  must be performed in accordance with the relevant authorities’ guidelines and regulations.  • 10% Steinberg’s solution (1× Steinberg's in mM: 10 HEPES, 58 NaCl, 0.67 KCl, 0.34 Ca(NO3)2,  0.83 MgSO4, pH 7.4).    • Anaesthetic agent: 0.01% MS222 (3‐Aminobenzoic acid ethyl ester or Tricane; Sigma) diluted  in 10% Steinberg’s Solution, adjusted to pH 7.4.  • Green fluorescent membrane‐permeable calcium‐indicator dye (e.g., Oregon Green 488  BAPTA‐1 AM, OGB‐1 AM, from Molecular Probes)  • 20% Pluronic F‐127 in DMSO (e.g., 2 g Pluronic F‐127 in 10 ml DMSO; Sigma) ! CAUTION  Strong detergent; skin, eye, and respiratory system irritant. Wear suitable protective clothing   • Standard pipette solution: Ca2+‐free Amphibian Ringers solution (in mM):  116 NaCl, 1.2 KCl,  2.7 NaHCO3.    • 2mM pancuronium dibromide (Tocris) dissolved in H2O.  104    • Low melting point agarose (Invitrogen GmbH)  3.2.2 Equipment  • Electronics: BNC cable, insulated wire with banana clips, TTL output from scan mirrors (usually  on microscope control unit), programmable stimulus generator (STG 2000, Multi Channel  Systems).  • Two‐photon laser‐scanning microscope commercially available from several providers (e.g.,  Zeiss, Olympus, Nikon, Prairie, others)  • Red/green (565nm) dichroic (Chroma)  • Separate trinocular head (BX or BH series Olympus)  • Objective mount adaptors: Lens tube adaptor, tube coupler, and objective adaptor (SM1A2,  SM1T1 SM1A3; Thorlabs)  • Two 60X long working distance water immersion lenses (e.g., Olympus LMPlanFl). One  objective should be attached to the main imaging microscope and the other to the trinocular  head used for visual stimulation.  • Light emitting diode, LED (590nm, 1.5V; Digi‐Key, Thief River Falls, MN)  • Trinocular mount adaptors: Olympus C mount adaptor (Micro Tech Lab, Austria), and C mount  to SM1 adaptor, tube coupler, and LED mount (SM1A10, SM1T1, S1LEDM; Thorlabs, Newton,  NJ)   105    • Imaging chamber with central and side access openings: custom‐made, see Figure 3.1b.   • Paintbrush and plastic transfer pipette to position and handle tadpoles.  • Dissection microscope equipped with fluorescence optics, to check for quality dye loading.   • Borosilicate capillary glass with filament: THIN GLASS: OD 1.0 mm, ID 0.78 mm, 75 mm and  THICK GLASS: OD 1.5mm, ID 0.86 mm, 75mm (e.g. G150F‐3; Warner Instruments, Hamden, CT).  • Pipette puller (e.g., P‐97 equipped with either box or trough filament ~3 mm; Sutter  Instruments, Novato, CA)  • Micromanipulator with coarse and fine control (e.g., MM‐3; Narishige International, East  Meadow, NY).  • Picospritzer III (General Valve Corporation, Fairfield, NJ)  • Millipore filter (Millipore, Billerica, MA)  • Unlubricated latex condoms   3.2.3 Reagent setup  Tadpole bath solution: Add 500 μL penicillin/streptomycin (5,000 U mL‐1/5,000 μg mL‐1,  Invitrogen), to 10L of 10% Steinberg’s solution; pH to 7.4. Keep and use at room temperature  (18–22 °C), oxygenate with 100% O2 for perfusion.  Calcium indicator: Stock ‐ dissolve membrane‐permeable calcium‐indicator dye at a  concentration of 10mM in 20% Pluronic F‐127/DMSO and store at ‐20 °C.  Working solution ‐  106    dilute 10:1 in Millipore filtered (pore diameter, 0.45μm) Ca2+‐free Amphibian Ringers solution  and use immediately.  3.2.4 Equipment setup  Manipulator and pressure‐application device To inject the staining solution into the brain we  use the coarse Narashige Micromanipulator and Picospritzer III.  Two‐photon laser‐scanning microscope We use a custom‐built microscope based on a mode‐ locked laser system operating at 700–960nm wavelength (Chameleon XR, Coherent) and a  laser‐scanning system (Fluoview, Olympus) coupled to an upright microscope (BX51WI,  Olympus). Emission should pass through a filter cube containing a red/green dichroic. Such a  custom‐built system can be assembled following the instructions in refs. 18,19.  Imaging chamber A custom made perfusion chamber with both top and side openings to  accommodate two microscope objectives is recommended for visual stimulation experiments.  The side objective opening allows exact positioning of the visual stimulation apparatus aligned  to the tadpole eye, assuring consistent illumination intensity and presentation of patterned  stimuli across samples. The imaging objective is inserted into the top opening of the imaging  chamber. A simple design for the imaging chamber requires only a lathing apparatus or drill  press (with 30mm and 50mm drill bits), and a cylinder of hard plastic (60mm in diameter and  30mm in height; McMaster‐Carr, Atlanta, GA). Begin construction by drilling a 30mm hole  20mm deep into the side of the plastic cylinder. Next drill the top opening with the 50mm bit to  a depth of 15mm. Finish by rounding sharp edges by hand with sand paper. Perfusion tubes  (Saint‐Gobain PPL Corp., Courbevoie, France) can be fixed to the chamber with Instant Krazy  107    Glue (Elmer’s Products Canada), Figure 3.1. Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) can be used to  add extra height or depth to the chamber if necessary.  Time synched visual stimulation Visual stimulation must be synched precisely with the onset of  scanning frames. This is achieved by triggering the stimulus generator (either hardware or  software) with the frame TTL output of the scan mirrors. Typically frame scan TTL output begins  with a pre‐pulse ~300ms before the first imaging frame. Accordingly, an offset must be applied  to the trigger to account for the lag time. Lag time can be measured empirically by imaging the  light diode directly (in the red emission channel) and calculating the delay between the  beginning of the first imaging frame and the onset of light stimulation (e.g., stimulation onset  occurs ¼ into the first imaging frame with 0.833 Hz frame rate and a 300ms lag time).  Inter‐ stimulus intervals after the initial trigger can be calculated to synch with scan mirror frame  rates (see Procedure 13). The STG 2000 series (Multi Channel Systems) programmable stimulus  generator allows for freely programmable waveforms (mono‐ or biphasic, square pulses, ramps,  sine wave) with individual time rates and duration of pulses. These stimulus protocols can be of  unlimited duration and number of pulses, perfect for long‐term stimulation. Stimulus  programming timing is dependent on the complexity of the visual stimulation protocol (approx.  5‐30 minutes). Output voltages should be set in the linear range of the LED.    Equipment assembly TIMING approximately 5 min:   Assemble the visual stimulus apparatus by attaching one of the 60X water immersion objectives  to the separate trinocular head using the objective mount adaptors. Prepare the trinocular port  for the LED by attaching the trinocular mount adaptors. In this configuration, the LED will  108    produce a wide‐field stimulus. If patterned stimuli are desired (such as a multi‐LED array), a lens  tube should be inserted between the tube coupler and LED mount to house the necessary  corrective optics (available at Thorlabs).   Connect the External Trigger of the scan mirror imaging system to the Additional Trigger Input  of the programmable stimulus generator with a BNC cable. Connect the Output Voltage and  Ground to the LED terminals with banana clips and fix the LED in the LED mount on the  trinocular head. ! CAUTION As with all electrical equipment, familiarize yourself with the safety  precautions of the equipment. During assembly, the equipment should be turned off.    3.3. PROCEDURE  3.3.1 Staining neurons with calcium‐indicator dye   ● TIMING ~ 15 min  1| Pull two micropipettes from borosilicate capillary glass, one THICK (the puncture  micropipette) and one THIN (the staining micropipette; see equipment) using the pipette puller.  Standard patch pipettes with a resistance of 6‐9 MΩ filled with standard pipette solution work  well. Back‐fill the staining micropipette with the calcium‐indicator dye working solution.  2| Anesthetize tadpoles in a Petri dish containing 0.01% MS222. Multiple tadpoles can be  anesthetized simultaneously, but they should not be kept under anesthesia for over 30 min.  3| Place a tadpole under the dissecting microscope on a moist Kimwipe with a plastic transfer  109    pipette. Position the tadpole using a paintbrush perpendicular to the staining pipette with the  dorsal side up, such that the brain is accessible.  4| Adjust the light and contrast of the microscope to emphasize the tissue structure and cell  outlines of the brain (see Figure 3.2).   5| Insert the puncture micropipette into the micromanipulator. Pierce the skin adjacent to the  tadpole brain with the puncture micropipette on the same side as the coarse micromanipulator  and pressure set up. Be careful not to puncture the pia or disturb the brain. This small hole will  be used to gain access to the brain without damaging the staining pipette. Remove the  puncture pipette and discard.  6| Insert the staining micropipette into the micromanipulator and pressure apparatus. While  the pipette tip is suspended in air, test the pipette tip size by applying pressure and monitoring  rate of solution extrusion. Dye solution should exit the tip of the pipette at pressures <20psi. If  this is not the case, a new micropipette with a slightly wider tip opening should be pulled, filled,  and re‐tested.  7| Focus on the target region and use the micromanipulator to carefully insert the staining  pipette through the puncture hole in the skin. Insert the pipette into the brain at a low angle  (~60‐70°). Advance the pipette along its axis until it reaches the desired depth (Figure 3.2).  Apply low pressure (1min, 10 psi) to eject ~400 femtoliters of staining solution. Infusion into the  tadpole neuropil will typically allow for staining of the entire tectal lobe and thalamus to a  depth of >300 μm with some auxiliary staining of the olfactory bulb. The area of dye loading can  be quickly assayed using epi‐fluorescence on the dissection scope. Remove the pipette.  110    ? TROUBLESHOOTING  ■ PAUSE POINT Place the tadpole in oxygenated bath solution and wait for ~1h to allow for  recovery, and consistent and stable loading of tectal neurons (Stosiek et al., 2003).  3.3.2 Two‐photon imaging and excitability probing   ● TIMING ~ 2‐3 h  8| Paralyze the tadpole with 5 minute bath application of 2mM pancuronium dibromide (PCD).  PCD is a reversible paralytic and typically wears off 2‐3 hours post application at this dosage.  9|  Prepare  the  imaging  chamber  by  thoroughly  rinsing  an  unlubricated  latex  condom  and  sheathing  it over the  imaging chamber,  leaving the top access open. Latex condoms provide a  water‐tight barrier to encase the imaging chamber.  10| Place  the  tadpole  in  the  imaging chamber with  the eye contralateral  to  the dye‐injected  tectal lobe aligned with the side access port for visual stimulation. Cover the tadpole with a thin  layer of liquid low melt agarose and let harden. Immediately perfuse the imaging chamber with  oxygenated bath solution. ▲CRITICAL STEP Agarose should be near room temperature before  application.   11| Fix the imaging chamber to the microscope stage, inserting the objective into the top of the  latex condom. Focus the microscope objective on to the tectal lobe with two‐photon laser  scanning, raising the excitation power carefully to avoid dye bleaching. Initial focusing should  be done at high resolution (frame rate, >1Hz). At this stage in development, tectal neuron  somata should be clearly visible, with a distinctive ring structure due to their large nuclei. Dark  111    areas corresponding to blood vessels are easily identifiable when focusing through the tissue  and can be used as rough landmarks between tadpoles. For OGBAM‐1, we use an excitation  wavelength of 910nm. Refer to Ref (Xu, 2000) for the two‐photon excitation spectra of different  dyes.  ? TROUBLESHOOTING  12| Before inserting the visual stimulation apparatus into the imaging chamber, make a small  puncture hole in the latex condom at the center of the side access opening. The puncture hole  assures optical clarity between the objective and the tadpole eye, and should be approximately  2mm in diameter – slightly larger than the front lens element of the objective, but small enough  that pressure from the objective housing will prevent fluid from leaking out of the perfusion  chamber.  Insert the objective into the visual stimulus apparatus immediately after making the  hole to prevent excessive leakage. Using the eyepieces on the trinocular head, align the visual  stimulation apparatus on the eye. Fix the visual stimulation apparatus to the microscope stage  and switch the trinocular to the camera port. Opening the trinocular port will project diffuse  light from the LED directly into the tadpole eye. Slight realignment of the tectal lobe under the  two‐photon microscope may be necessary after this step.  13| For SCEP set the frame rate such that the probe length plus inter‐stimulus interval (ISI)  divided by the 1/frame rate is an integer value (see Figure 3.3). Resolution and scan area should  be set to assure near continuous scanning with minimal lag between frames. To begin SCEP,  first focus at the depth of interest and then initialize the trigger on the programmable stimulus  generator. At this point, when the user begins time‐lapse two‐photon scanning, the TTL trigger  112    output will synch the pre‐programmed visual stimulus to the onset of the scan frame. Wide‐ field probing stimuli are typically set to correspond with frame onset (Figure 3.3).  Because  wide‐field RF responses in the optic tectum have quick onset (~100ms) and long lasting peaks  due to bursting behaviour (Dunfield and Haas, 2009; Tao et al., 2001; Zhang et al., 2000),  functional responses of tectal cells can be measured by taking the peak calcium transient within  1‐2 seconds of the stimulus frame. As such, minimum frame rates should be ~1 Hz, and two  photon scanning durations should be set to a minimum of 5 seconds after the onset of the last  presented stimulus. If presenting patterned visual stimuli, the user should determine minimum  frame rates independently using the Nyquist criteria as a rule of thumb (frame rate 1/(2*peak  time)). A simple wide‐field SCEP protocol would be a single 1 sec ON stimulus with two photon  scanning set to a frame rate of 1 Hz: Here the LED voltage should be initially set to 0V, and the  stimulus generator programmed to output a 1V pulse for 1 second upon being triggered (then  back to 0V). The time lapse movie would consist of 5 frames.   ? TROUBLESHOOTING  14| To map wide‐field RF properties, OFF and ON light stimuli with various durations and  contrasts can be presented. When mapping response curves, stimuli should be presented in a  pseudo‐random sequence and averaged over multiple trials. ▲CRITICAL STEP When probing  with wide‐field dimming stimuli longer than 50ms (Tao et al., 2001; Zhang et al., 2000), some  tectal cells will elicit both OFF (stimulus onset) and ON (stimulus offset) responses. If simply  recording cellular responses as peak calcium transients, SCEP probing is unable to resolve ON  and OFF responses in dual responding tectal cells for stimuli greater than 50ms and less than  113    ~10sec in duration. Other techniques may be used to resolve RF responses at these durations  (Ramdya et al., 2006).   15| To probe changes in firing rates over time, SCEP of the same plane can be continued for 3+  hours (after which AM ester dyes may begin to leak from cells). Typically, RF responses are  probed before and after visual training to study the effects of brief visual experience on the  intact awake developing brain (Dunfield and Haas, 2009). Care must be taken to assure  habituation to the visual response does not occur during probing. ISIs from 10‐60 seconds are  recommended. Possible visual training stimuli can be found in Table 3.1.  ? TROUBLESHOOTING  Troubleshooting advice can be found in Table 3.2.  3.4. ANTICIPATED RESULTS  Figure 3.4a illustrates bulk AM ester calcium sensitive dye staining of a single lobe of the  Xenopus tadpole optic tectum. Wide‐field OFF stimulus probing elicits visually‐evoked calcium  transients in ~70% of the neurons within the imaging plane (Figure 3.4a). Transients are  repeatable and consistent in amplitude (Figure 3.4b). 60s OFF stimuli evoke responses to both  stimulus onset (OFF response) and offset (ON response) (Figure 3.4c). Wide‐field RF properties  of single cells can be assayed with respect to both duration and contrast sensitivity. For OFF  RFs, functional response increases with both longer duration stimuli and higher contrast jumps  in light intensity (Dunfield and Haas, 2009; Zhang et al., 2000). Single cell resolution allows  anatomical localization of neurons in the tectum. Previous work using SCEP has demonstrated  114    local clustering of OFF and ON responding tectal neurons during development (Dunfield and  Haas, 2009).    Visual experience can cause long lasting changes in a neuron’s functional response  properties. As was shown by Dunfield and Haas, mean ensemble responses can be shifted  toward either potentiation or depression to an evoked stimulus by brief periods of  visual  training (Dunfield and Haas, 2009). A spaced‐training paradigm with high‐frequency 50ms OFF  stimuli (Table 3.1) causes preferential potentiation of OFF stimuli throughout the tectum.  Plasticity induced by spaced‐training is training stimulus specific (no change in ON  responsiveness was shown after training). An invariant light stimulation into the paralyzed eye  (Table 3.2) causes preferential depression to probed 50ms OFF stimuli. Visually‐driven long  lasting RF potentiation and depression in the tectum was shown to be N‐methyl‐D‐aspartic acid  (NMDA) receptor‐dependent (Dunfield and Haas, 2009) and may be related to NMDAR  dependent long‐term synaptic plasticity (Engert et al., 2002; Zhang et al., 2000; Zhou et al.,  2003). Correlation experiments highlight the power of SCEP: The functional plasticity of  individual neurons could be compared to changes in those neurons’ network interactions.  Correlated firing was found to increase in potentiated cells after spaced training. SCEP may be  compared to electrophysiological recording, such as patch clamp electrophysiology, which  limits analysis to single cells, and field recordings, which do not allow investigation of large  contiguous neuronal ensembles at the single neuron level. SCEP, however, bridges the gap  between single cell and population analysis, allowing researching to non‐invasively measure  neuronal activity of hundreds of neurons simultaneously at the single cell level within the intact  brain.     115    3.5. TABLES  Table 3.1 | Training paradigms  TYPE  STIMULATION PROTOCOL ANTICIPATED RESULTS  Spaced training  (potentiation)  Three sets of 90, 50ms OFF  stimuli at 0.3Hz, spaced by 5‐ minute intervals of ON  stimulation  29% long lasting potentiation, 24% short term potentiation,  35% no change,  12% long lasting depression  Invariant training  (depression)  25 minutes ON light stimulation  to the paralyzed eye  1% long lasting potentiation, 13% short term potentiation,  41% no change,  45% long lasting depression    Continuous probing  (no change)  50ms OFF stimuli presented every  minute for 25 minutes with inter‐ stimulus ON light stimulation  4% long lasting potentiation, 1% short term potentiation,  69% no change,  26% long lasting depression        116    Table 3.2 | Troubleshooting table PROBLEM  POSSIBLE REASON  SOLUTION Cells are  not labelled    Failure to  penetrate tissue   Re‐puncture the skin beside the tectum using the  thick‐glass micropipette. Adjust angle of manipulator.  Adjust light/contrast so that electrode tip can be  visualized in the tissue. Make sure staining pipette is  located in the target region.    Tip size too small /  staining patch  micropipette  clogged  Dissolve Ca2+‐indicator dyes immediately before use;  filter the staining solution before use (e.g., with a  Millipore filter; pore diameter, 0.45 μm). Increase  pressure and/or modify puller program.    Pluronic F‐127  crystallization  Re‐make stock solution. Before adding pluronic F‐127  and DMSO to stock solution heat to ~40°C and vortex.  Cells do not  respond to  visual  stimulus  Imaging plane  contains  unresponsive cells  Depending on the visual stimulus, certain regions of  the tectum may not be excited by visual input (see  (Sperry, 1963) for a map of retinotopic innervations).  Cells respond robustly to wide‐field stimuli at depths  of interest > 100μm.    Insufficient calcium  indicator loading   Increase time for pressure loading; increase  concentration of working solutions to 1:5 (calcium  indicator : Ringer’s solution). ! CAUTION Dye  concentrations should be kept to a minimum.  Excessive dye loading may cause calcium chelation.    Ca2+ stores  released due to  ischemic stroke  Assure agarose does not clog tadpole gills (located  ventrally) when loading specimen into the imaging  chamber. Increase perfusion rate of oxygenated 10%  Steinberg’s solution.  Scanning  trigged  stimuli are  off‐time  Offset requires  adjustment  Re‐measure trigger offset by imaging LED directly;  calculate trigger lag as (# lag scan lines / # scan lines in  frame) / frame rate   ISI is incorrect  1/(frame rate) should divide equally into the stimulus  duration + ISI for each stimulus + ISI pair         117    3.6. FIGURES      Figure 3.1 | SCEP equipment setup. (a) A custom dually‐innervated imaging chamber is  perfused with room temperature oxygenated Steinberg’s solution. Two‐photon microscopy is  used to image ensemble neuronal activity with a green calcium indicator, while red light of  varying contrasts is projected onto the tadpole’s contralateral eye. (b) Schematic drawing of the  imaging chamber (top) top view and (bottom) side view. Blue arrows indicate locations for  fixation of perfusion tubes.  118     Figure 3.2 | Calcium indicator loading of the tadpole optic tectum. (a) Transparent albino  Xenopus laevis tadpole. (b)  Magnification of forebrain and optic tectum and placement of  staining micropipette in neuropil of the optic tectum. The electrode is outlined in red. Arrow  indicates skin puncture from the thick glass micropipette.  (c) Fluorescence overlay of Ca2+  indicator loading. Scale bar, 1 mm .    119     Figure 3.3 | Scanning triggered visual stimuli. (top) Example of 50ms OFF stimuli with ON  stimulation ISIs. The first OFF stimulus is triggered at the onset of laser scanning and a second  OFF stimulus occurs 5 frames later. (bottom) Example of 5 frame OFF and 5 frame ON stimuli.  The first OFF stimulus is set 2 imaging frames after laser scanning beings. Stimulus offset  induces an ON response. A second 5 frame OFF stimulus occurs 5 frames later. (Red, ON light  stimulation; BLACK, OFF light stimulation).      120     Figure 3.4 | In vivo SCEP of wide field visual stimuli in the awake developing brain. (a) (top) In  vivo two‐photon fluorescence image of OGB‐AM calcium loading of an optical section of the  Xenopus laevis  tadpole optic tectum. Scale bar, 140 μm. (bottom) Visually evoked calcium  responses induced by a brief, 50ms, OFF stimulus. Pseudo‐color image using scale of fractional  change in fluorescence intensity relative to average baseline levels. (b) Calcium transient  evoked by 50ms OFF stimuli in two cells marked in panel (a); Transients are robust and long  lasting. (c) OFF and ON calcium transients evoked by the onset and offset of a 60 second OFF  stimulus. (bottom) 60 second light stimulus; // time break.    121    3.7. REFERENCES  Aizenman, C.D., Akerman, C.J., Jensen, K.R., and Cline, H.T. (2003). Visually driven regulation of  intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron 39, 831‐842.  Aizenman, C.D., Munoz‐Elias, G., and Cline, H.T. (2002). Visually driven modulation of  glutamatergic synaptic transmission is mediated by the regulation of intracellular polyamines.  Neuron 34, 623‐634.  Bhatt, D.H., Otto, S.J., Depoister, B., and Fetcho, J.R. (2004). Cyclic AMP‐induced repair of  zebrafish spinal circuits. Science (New York, N.Y 305, 254‐258.  Brustein, E., Marandi, N., Kovalchuk, Y., Drapeau, P., and Konnerth, A. (2003). "In vivo"  monitoring of neuronal network activity in zebrafish by two‐photon Ca2+ imaging. Pflugers  Archiv‐European Journal of Physiology 446, 766‐773.  Chen, C. (2001). Heterosynaptic LTP in Early Development. Neuron 31, 510‐512.  Cline, H., and Haas, K. (2008). The regulation of dendritic arbor development and plasticity by  glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. Journal of Physiology‐ London 586, 1509‐1517.  Dunfield, D., and Haas, K. (2009). Metaplasticity governs natural experience‐driven plasticity of  nascent embryonic brain circuits. Neuron In Press.  Engert, F., Tao, H.W., Zhang, L.I., and Poo, M.M. (2002). Moving visual stimuli rapidly induce  direction sensitivity of developing tectal neurons. Nature 419, 470‐475.  Fetcho, J.R., Cox, K.J., and O'Malley, D.M. (1998). Monitoring activity in neuronal populations  with single‐cell resolution in a behaving vertebrate. Histochem. J. 30, 153‐167.  Gaze, R.M., Keating, M.J., and Chung, S.H. (1974). The evolution of the retinotectal map during  development in Xenopus. Proc R Soc Lond B Biol Sci 185, 301‐330.  Haas, K., Li, J.L., and Cline, H.T. (2006). AMPA receptors regulate experience‐dependent  dendritic arbor growth in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 103, 12127‐12131.  Johenning, F.W., and Holthoff, K. (2007). Nuclear calcium signals during L‐LTP induction do not  predict the degree of synaptic potentiation. Cell calcium 41, 271‐283.  122    Mu, Y., and Poo, M.M. (2006). Spike timing‐dependent LTP/LTD mediates visual experience‐ dependent plasticity in a developing retinotectal system. Neuron 50, 115‐125.  Niell, C.M., and Smith, S.J. (2005). Functional imaging reveals rapid development of visual  response properties in the zebrafish tectum. Neuron 45, 941‐951.  Nieuwkoop, P.D., and Faber, J. (1967). Normal Table of Xenopus laevis, 2nd edn edn  (Amsterdam: North Holland).  Ramdya, P., and Engert, F. (2008). Emergence of binocular functional properties in a monocular  neural circuit. Nature neuroscience 11, 1083‐1090.  Ramdya, P., Reiter, B., and Engert, F. (2006). Reverse correlation of rapid calcium signals in the  zebrafish optic tectum in vivo. Journal of neuroscience methods 157, 230‐237.  Ruthazer, E.S., Akerman, C.J., and Cline, H.T. (2003). Control of axon branch dynamics by  correlated activity in vivo. Science (New York, N.Y 301, 66‐70.  Sakaguchi, D.S., and Murphey, R.K. (1985). Map formation in the developing Xenopus  retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. J Neurosci 5, 3228‐ 3245.  Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., and Cline, H.T. (2002). Dendrite growth increased by visual  activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature 419, 475‐480.  Smetters, D., Majewska, A., and Yuste, R. (1999). Detecting action potentials in neuronal  populations with calcium imaging. Methods (San Diego, Calif 18, 215‐221.  Sperry, R.W. (1963). Chemoaffinity in the Orderly Growth of Nerve Fiber Patterns and  Connections. Proc Natl Acad Sci U S A 50, 703‐710.  Sretavan, D., and Shatz, C.J. (1984). Prenatal development of individual retinogeniculate axons  during the period of segregation. Nature 308, 845‐848.  Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., and Konnerth, A. (2003). In vivo two‐photon calcium  imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 100, 7319‐7324.  Sumbre, G., Muto, A., Baier, H., and Poo, M.‐m. (2008). Entrained rhythmic activities of  neuronal ensembles as perceptual memory of time interval. Nature.  123    Tao, H.W., and Poo, M.M. (2005). Activity‐dependent matching of excitatory and inhibitory  inputs during refinement of visual receptive fields. Neuron 45, 829‐836.  Tao, H.W., Zhang, L.I., Engert, F., and Poo, M. (2001). Emergence of input specificity of ltp  during development of retinotectal connections in vivo. Neuron 31, 569‐580.  Vislay‐Meltzer, R.L., Kampff, A.R., and Engert, F. (2006). Spatiotemporal specificity of neuronal  activity directs the modification of receptive fields in the developing retinotectal system.  Neuron 50, 101‐114.  Xu, C. (2000). Two‐photon Cross Sections of Indicators. In Imaging Neurons: A Laboratory  Manual, R. Yuste, F. Lanni, and A. Konnerth, eds. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring  Harbor Press), pp. 191 ‐ 199.  Yaksi, E.F., R. W. (2006). Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by  temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nature Methods 3, 377‐383.  Zhang, L.I., Tao, H.W., Holt, C.E., Harris, W.A., and Poo, M. (1998). A critical window for  cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature 395, 37‐44.  Zhang, L.I., Tao, H.W., and Poo, M. (2000). Visual input induces long‐term potentiation of  developing retinotectal synapses. Nature neuroscience 3, 708‐715.  Zhou, Q., Tao, H.W., and Poo, M.M. (2003). Reversal and stabilization of synaptic modifications  in a developing visual system. Science (New York, N.Y 300, 1953‐1957.            124    4. CONCLUDING CHAPTER  4.1. METAPLASTICY’S ROLE IN DEVELOPMENT  Studies of metaplasticity during critical periods of activity‐dependent development have  mainly concentrated on the developmental shift on NMDAR subunits as a possible metaplastic  mechanism. The NMDA receptor is a heteromer that contains an obligatory NR1 subunit along  with one or more of the subunits NR2A – 2D (McBain and Mayer, 1994; Monyer et al., 1994).  During early development, most NMDARs contain NR2B subunits (Monyer et al., 1994), which  results in longer single‐channel open times and significantly longer lasting Ca2+ inward currents.  Because afferent activity is less synchronized in the early brain, NR2B subunits may help induce  LTP by enhancing coincidence detection. NR2A subunits, which produce shorter duration Ca2+  currents, gradually increase in expression over development and reach a peak at the end of the  critical period, while NR2B decreases (Flint et al., 1997; Roberts and Ramoa, 1999). This  NR2B/NR2A switch is thought to be metaplastic because it is regulated by recent past history of  visual experience. As an example, dark rearing prevents the switch from NR2B to A, and brief  light exposure after dark rearing rescues NR2A expression (Philpot et al., 2001; Quinlan et al.,  1999a; Quinlan et al., 1999b). Moreover, because NR2A subunits reduce Ca2+ entry into the cell  (Erreger et al., 2005), an increase in NR2A is thought to facilitate LTD. Pharmacologically  shortening NMDAR currents also enhances LTD (Philpot et al., 2003). Recent studies using  NR2A‐knockout mice have elegantly demonstrated that the NR2A/B ratio is critical for the  induction of experience‐dependent alterations in the plasticity threshold. NR2A‐knockouts both  125    lose the facilitation of LTD with dark rearing (Philpot et al., 2007) as well as demonstrate an  enhancement of LTP in non‐deprived eye inputs (Cho et al., 2009). These studies suggest that  NR2A/B regulation in the visual cortex may be one molecular mechanism underlying the sliding  modification threshold of BCM theory in early development.   Our study complements the NMDAR subunit story by demonstrating that brief visual  experience during embryonic development with white noise stimuli prior to visual training  dramatically shifts the modification threshold in an NMDAR dependent manor. Further studies  on NMDAR subunit expression pre/post white‐noise stimulus are warranted to determine if the  modification threshold shift is due to up‐regulation of NR2A subunits. Recently, NR2A/B  composition was demonstrated to regulate dendritic growth the Xenopus laevis optic tectum  (Ewald et al., 2008) and may be the driving mechanism behind topographically organized  sensitivity of the dendritic tree to patterned visual stimulation (Bollmann and Engert, 2009).  Based on the complete sequences of X. laevis NR2A and NR2B cDNA, the amino acid sequence  and all major functional regions and residues are conserved between Xenopus and rat  NR2 subunits (Ewald and Cline, 2009).  Questions about the role of experience in development have been a primary focus of  neuroscience since the coining of the phrase “Nature vs. Nurture”. Pioneering work by William  Greenough has elegantly demonstrated that environmental experience significantly impacts  brain development (Greenough et al., 1989; Jones et al., 1997). Our work provides significant  insight into the role of visual experience‐driven afferent activity in altering neuronal function in  the embryonic brain. Previous studies have demonstrated that brief visual experience can cause  126    long lasting plasticity of tectal neuron synaptic transmission (Engert et al., 2002; Mu and Poo,  2006; Zhang et al., 2000; Zhou et al., 2003). Visually‐driven synaptic plasticity in the tectum has  been demonstrated to be spike‐time‐dependent (Mu and Poo, 2006; Vislay‐Meltzer et al.,  2006), suggesting that the precise timing of pre‐ and postsynaptic activity is critical in  determining the direction of plasticity outcome. Under certain conditions, when neuronal firing  rates conform to Poisson statistics, spike‐time‐dependent‐plasticity may be the underlying  mechanism of BCM metaplasticity (Izhikevich and Desai, 2003). Here, we expand on previous  work by demonstrating that functional output of neurons also undergoes long lasting  bidirectional plasticity after visual training. Moreover, we show that the threshold for plasticity  switching from depression to potentiation can be shifted with prior visual experience.   If experience plays such a large role in regulating synaptic plasticity and neuronal output  during development, it may come as a surprise that RFs in the zebrafish optic tectum develop  rapidly (within 12h after the first evoked visual stimulus) and remain stable throughout life  (Niell and Smith, 2005). BCM theory, however, may provide an answer for this phenomenon.  The sliding threshold of BCM biases neurons to strengthen their output if weak and weakening  if strong, thereby maintaining responses within a functional dynamic range. This homeostatic  regulation may restrict significant alteration in RF properties in neurons after their initial  development.  Overall, our work, in combination with recent literature in the field, suggests  that environmental experience may drive discrete modification of developing central circuits to  optimize performance and prevent saturation of plasticity.    127    4.2. BRIDGING THE GAP BETWEEN CELLS AND SYSTEMS  4.2.1 Population recordings with single cell resolution  Historically, neuroscience research has been limited to the study of either the very small  – molecular pathways, ions channels, and single cell morphology – or the very large – functional  imaging of brain regions, and lesion studies. As such, our current understanding of neural  network processing has relied on compiling statistics of single neuron recordings or bulk  recordings of averaged neuronal responses. Functional magnetic resonance imaging, intrinsic  optical signal imaging, and voltage‐sensitive dye imaging have allowed study of activity across  different brain regions to broadly assess changes in brain function; however, these techniques  cannot capture network dynamics at the single cell level. This limitation is particularly  important since the collective function of individual neuronal output is not linear – simply  averaging response properties of individual cells overlooks the complex computational  relationships of neural population coding, where firing rates of individual neurons in context  with the full neuronal ensemble convey information about the input stimulus. Both  multielectrode unit recording and functional multi‐neuron calcium imaging allow us to bridge  this gap between systems and cells (Wong, 1998).  Multielectrode unit recording allows simultaneous recording from dozens of neurons  with high temporal resolution. Spike sorting algorithms are used to classify action potentials  from individual neurons. Functional calcium imaging, in contrast, has low temporal resolution,  but allows simultaneous imaging of large contiguous populations of neurons. The ability to  identify the locations of all neurons in the population (include those that do not respond to a  128    probing stimulus) is the significant advantage of Ca2+ imaging (Takahashi et al., 2007). Currently  the only fundamental limitation of multi‐neuron analysis (either via electrode recording or Ca2+  imaging) is the lack of computation support to analyze large neuronal networks.   In Chapter 2, we show, for the first time, the effect of visual stimulus training on the  correlated firing of a developing neural network. Correlated firing increases significantly in a  subpopulation of functionally potentiated neurons after a high frequency visual training  stimulus.   4.2.2 Alternatives to SCEP    Because SCEP is stimulus triggered, probed calcium fluctuations (measured as ∆F/F) can  be averaged to determine evoked RF responses. RF probing with various external stimuli  permits RF mapping of large neuronal ensembles. These averages assume that stimulus  interactions do not influence Ca2+ signals. Interactions between evoked responses can be  limited by employing inter‐stimulus‐intervals of sufficient length. Alternatively, individual  probed responses can be assayed over time to investigate changes in evoked response  properties (as described in Chapter 3). In Chapter 2, a simple spike extraction algorithm  requiring calcium fluctuations to cross a ∆F/F threshold was also used to eliminate probed  responses without evoked responses. This procedure is particularly important when one is  interested in determining evoked transient amplitudes and when neurons throughout the  ensemble respond with different levels of reliability. In Chapter 2, thresholding was also used to  evaluate spontaneous cell firing between trigger stimuli.  Thresholding Ca2+ responses or their  derivatives is a relatively common approach (Cossart et al., 2003; Ikegaya et al., 2004).   129      Nevertheless, SCEP and thresholding techniques suffer from a number of limitations.  First, SCEP requires relatively consistent and robust evoked responses to image large  populations of neurons. Inconsistent, weak responses can also be assayed by stimulus triggers,  but two‐photon scanning speeds need to be increased to compensate for shifts in peak Ca2+  response. Increasing scanning speeds means resolution must be decreased and magnification  increased, defeating the ability to measure activity of large ensembles. Thresholding also  suffers from semi‐arbitrary threshold levels and sensitivity to optical noise.      Several methods have been developed to automatically reconstruct neuronal events  from raw fluorescence signals to resolve these problems, including template‐matching  algorithms (Kerr et al., 2005), reverse correlation (Ramdya et al., 2006), a novel detection  algorithm for rodent cortex in vivo (Greenberg et al., 2008), and a spike detection algorithm  based on principal‐component analysis (PCA) (Sasaki et al., 2008).     4.3. STATUS  OF  WORKING  HYPOTHESES  AND  CONTRIBUTION  TO THE FIELD  In Chapter 1, I proposed three working hypotheses: (1) that long lasting functional  plasticity in the developing retinotectal system may be driven by visual sensory input via  synaptic and intrinsic plasticity; (2) that this functional plasticity is NMDAR dependent and  varies with the pattern of visual training; and (3) that training induced plasticity follows the  130    learning rules established in the Bienenstock, Cooper and Munro (BCM) computational model  of synaptic plasticity (Bienenstock et al., 1982).  Consistent with hypotheses 1, research in Chapter 2 demonstrated that functional  plasticity could be driven with wide‐field visual stimulation, including high frequency wide‐field  OFF stimuli and invariant ON light stimulation. Functional plasticity was assayed using the SCEP  protocol, outlined in Chapter 3, using low frequency wide‐field OFF probing. A limitation of the  SCEP protocol was our inability to determine the cause of plasticity in neuronal firing, though a  number of pieces of evidence point to synaptically mediated regulation. In agreement with  hypothesis 2, plasticity outcomes induced by different training protocols resulted in various  ensemble plasticity outcomes – high‐frequency OFF training promoting potentiation to the  trained stimulus and invariant training promoting depression. Visually‐driven functional  plasticity was also demonstrated to be NMDAR dependent.   Metaplastic learning rules, according to hypothesis 3, were observed both with respect  to individual endogenous neuronal firing rates as well as visually manipulated firing rates,  where activity was enhanced during the pre‐training period using white‐noise stimulation. BCM  learning rules were also evident in the existence of a plasticity threshold, such that weak  presynaptic input resulted in ensemble depression and strong input results in ensemble  potentiation.  The experiments in this thesis contribute to the field of developmental neuroscience by  providing a number of firsts: The protocol in Chapter 3 is the first example of SCEP in vivo and  outlines a novel developmental model system to study network plasticity in the intact,  131    developing brain. By making use of the albino Xenopus laevis tadpole, time‐lapse two‐photon  imaging of calcium sensitive dyes, and imaging trigged visual stimulation, I demonstrate a  powerful experimental model for studying functional plasticity of many neurons simultaneously  at single cell resolution. My experiments are also the first to investigate changes in network  dynamics after visually‐driven plasticity. Previous studies of natural stimulus induced plasticity  using patch or field electrophysiology have been unable to bridge this gap between single cell  and network plasticity. I also expand upon previous work by demonstrating natural experience  induced metaplasticity.  While metaplasticity has been hypothesized to hold an important role  in development, the brief durations required to induce metaplastic effects demonstrated here  are striking. My experiments are also the first to examine metaplastic effects on neuronal  ensembles in the intact, awake embryo. The results demonstrate that metaplastic rules hold at  the single cell level even in a population that has been exposed to the same pre‐synaptic  stimulation. Overall, results from my experiments greatly enhance the understanding of  sensory stimulation’s role the regulation of functional plasticity during brain development.     4.4. FUTURE  DIRECTIONS:  LINKING  FUNCTIONAL  AND  MORPHOLOGICAL PLASTICITY  Because the size and shape of a neuron’s dendritic arbours dictate the number and type  of synapses the neuron can form, it is believed that a growing neuron’s structural refinement is  directly related to the functional plasticity of its RF. Dendritogenesis is an extremely dynamic  132    process which involves extension of branches via dendritic growth cones (Portera‐Cailliau et al.,  2003), the addition and retraction of motile interstitial filopodia from existing dendritic shafts,  and the stabilization and extension of interstitial filopodia into branches (Niell et al., 2004). The  high turnover and probing behaviour of dendritic filopodia suggest they may be involved in  sampling the local environment for appropriate presynaptic contact sites. The ‘synaptotropic  model’ of dendritic growth proposes that filopodial stabilization is mediated by correct axonal‐ dendritic contact and subsequent formation and maturation of synapses. The synaptotropic  model is supported by direct evidence that synapse strengthening and weakening correlate  with morphological dynamics (Konur and Yuste, 2004; Niell et al., 2004) and by time‐lapse  imaging studies of living neurons showing activity‐dependent regulation of filopodial motility  and stability (Haas et al., 2006; Konur and Yuste, 2004; Maletic‐Savatic et al., 1999; Portera‐ Cailliau et al., 2003; Sin et al., 2002).   While brief periods enhanced visual stimulation (4h) applied to freely swimming  tadpoles (Aizenman et al., 2002; Sin et al., 2002) can enhance both RGC axonal development  (Ruthazer et al., 2006) as well as tectal neuron dendritic arbour growth (Sin et al., 2002) in the  developing retinotectal system, to date there have been no direct imaging studies investigating  the effects of visual stimulation paradigms eliciting potentiation or depression on early  dendritic growth. Calcium imaging protocols outlined in Chapter 3 provided a perfect  experimental backbone to explore this relationship.     To directly assess the effects of functional potentiation and depression on filopodial  dynamics and dendritic growth, both the functional plasticity as well as morphological changes  133    must be measured simultaneously. This can be achieved by combining functional calcium  imaging of green fluorescent dye with single‐cell electroporation (SCE) (Dunfield and Haas,  2008; Haas et al., 2002; Haas et al., 2001) of a plasmid encoding red fluorescent protein. The  morphology of SCE tagged neurons can be imaged in vivo at the very onset of activity‐ dependent plasticity with time‐lapse multi‐photon microscopy (Majewska et al., 2000; Svoboda  and Yasuda, 2006). Combining morphological imaging with periods of SCEP functional imaging  may provide important insight into how experience‐dependent functional plasticity is linked to  morphological changes within the intact developing brain during critical periods of activity‐ dependent growth.    4.5. CLINICAL RELEVANCE  Dysregulation of synaptic plasticity plays a major role in many neurological disorders  including Fragile X‐linked mental retardation syndrome (Huber et al., 2002), epilepsy  (Goussakov et al., 2000), and traumatic brain injury (Albensi and Janigro, 2003; Kuzmiski et al.,  2009; Schwarzbach et al., 2006). Understanding how regulatory mechanisms, such as  metaplasticity, effect synaptic plasticity in the intact brain may play a crucial role in developing  therapies to promote functional recovery.   For example, BCM theory proposes that neuronal firing shifts the modification threshold  of cells to homeostatically regulate LTP and LTD and prevent the saturation of synaptic  plasticity. A rightward shift in the modification threshold caused by high levels of recent activity  134    would inhibit future LTP and facilitate future LTD, thereby guarding against excitotoxicity by  preventing Hebbian‐driven positive feedback. Accordingly, enhanced activity may also prevent  the formation of epileptic networks by inhibiting the formation of these positive‐feedback  loops. Indeed, both electrical and pharmacological stimulation of glutamate receptors during  early kindling has been demonstrated to inhibit subsequent induction of epileptic seizures  (Hesp et al., 2007; Ullal et al., 1989). Our studies suggest that experience‐driven cell firing may  also be sufficient to shift the plasticity threshold – offering new possibilities for potential  behavioural therapy.  Metaplastic rules can also be employed to rescue morphological plasticity. Traditional  dogma suggests that neurons in the mature brain largely lose their ability to exhibit the  experience‐dependent plasticity seen during development. In the cat visual cortex, the ability to  induce ocular dominance plasticity was shown to diminish with age (Hubel and Wiesel, 1963).  In the mature mouse barrel cortex, in vivo time‐lapse imaging has demonstrated that whisker  clipping produced no change in gross dendritic arbour structure (Trachtenberg et al., 2002).  Because drastic arbour remodelling may be detrimental unless it is in response to severe  alterations of sensory inputs such as direct brain lesions, the reduction of morphological  plasticity over time may help ensure that any plasticity induced in the adult cortex would be  reversible ‐  the original pre‐synaptic partners remain in place, as do the major dendritic  branches.   Nevertheless, metaplastic rules have been used to completely rescue the capacity for  ocular dominance plasticity in the adult visual cortex (He et al., 2006). Ocular dominance shifts  occur during monocular deprivation if animals are initially primed with 7 days of dark exposure  135    (He et al., 2006). During monocular deprivation, the deprived eye receives minimal presynaptic  input, causing its synapses to predominantly undergo LTD (Rittenhouse et al., 1999). While dark  exposure is unlikely to effect this deprivation induced depression, dark priming shifts the  modification threshold to the left, facilitating LTP in the open eye. Loss of visual acuity  (amblyopia) associated with chronic monocular deprivation over long periods, can be nearly  eliminated with a 3‐10 day dark exposure prior to re‐opening the deprived eye (He et al., 2007).  Mechanistically, dark priming is thought to reduce LTP thresholds by up‐regulating NR2B  subunits of NMDARs (He et al., 2006). These data fit well with our experiments where visual  experience was found to shift the metaplasticity threshold. Our work also suggests that  enhanced visual activity after eye opening should increase LTP and, in turn, the therapeutic  benefits to dark priming. Altogether, these experiments suggest a direct use for metaplastic  priming in the treatment of adult amblyopia.         136    4.6. REFERENCES  Aizenman, C.D., Munoz‐Elias, G., and Cline, H.T. (2002). Visually driven modulation of  glutamatergic synaptic transmission is mediated by the regulation of intracellular polyamines.  Neuron 34, 623‐634.  Albensi, B.C., and Janigro, D. (2003). Traumatic brain injury and its effects on synaptic plasticity.  Brain Inj. 17, 653‐663.  Bienenstock, E.L., Cooper, L.N., and Munro, P.W. (1982). Theory for the Development of Neuron  Selectivity ‐ Orientation Specificity and Binocular Interaction in Visual‐Cortex. Journal of  Neuroscience 2, 32‐48.  Bollmann, J.H., and Engert, F. (2009). Subcellular Topography of Visually Driven Dendritic  Activity in the Vertebrate Visual System. Neuron 61, 895‐905.  Cho, K.K.A., Khibnik, L., Philpot, B.D., and Bear, M.F. (2009). The ratio of NR2A/B NMDA  receptor subunits determines the qualities of ocular dominance plasticity in visual cortex.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 5377‐ 5382.  Cossart, R., Aronov, D., and Yuste, R. (2003). Attractor dynamics of network UP states in the  neocortex. Nature 423, 283‐288.  Dunfield, D., and Haas, K. (2008). Single Cell Electroporation. In Encyclopedia of Neuroscience,  L.R. Squire, ed. (Oxford: Academic Press).  Engert, F., Tao, H.W., Zhang, L.I., and Poo, M.M. (2002). Moving visual stimuli rapidly induce  direction sensitivity of developing tectal neurons. Nature 419, 470‐475.  Erreger, K., Dravid, S.M., Banke, T.G., Wyllie, D.J.A., and Traynelis, S.E. (2005). Subunit‐specific  gating controls rat NR1/NR2A and NR1/NR2B NMDA channel kinetics and synaptic signalling  profiles. J. Physiol. 563, 345‐358.  Ewald, R.C., Van Keuren‐Jensen, K.R., Aizenman, C.D., and Cline, H.T. (2008). Roles of NR2A and  NR2B in the development of dendritic arbor morphology in vivo. Journal of Neuroscience 28,  850‐861.  Flint, A.C., Maisch, U.S., Weishaupt, J.H., Kriegstein, A.R., and Monyer, H. (1997). NR2A subunit  expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. Journal of  Neuroscience 17, 2469‐2476.  137    Goussakov, I.V., Fink, K., Elger, C.E., and Beck, H. (2000). Metaplasticity of mossy fiber synaptic  transmission involves altered release probability. J. Neurosci. 20, 3434‐3441.  Greenberg, D.S., Houweling, A.R., and Kerr, J.N.D. (2008). Population imaging of ongoing  neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nature neuroscience 11, 749‐751.  Greenough, W.T., Withers, G.S., and Wallace, C.S. (1989). Morphological changes in the nervous  system arising from behavioral experience: what is the evidence that they are involved in  learning and memory? In The Biology of Memory, L.R. Squire, and E. Lindenlaub, eds. (New  York: Springer‐Verlag), pp. 159–185.  Haas, K., Jensen, K., Sin, W.C., Foa, L., and Cline, H.T. (2002). Targeted electroporation in  Xenopus tadpoles in vivo‐‐from single cells to the entire brain. Differentiation; research in  biological diversity 70, 148‐154.  Haas, K., Li, J.L., and Cline, H.T. (2006). AMPA receptors regulate experience‐dependent  dendritic arbor growth in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America 103, 12127‐12131.  Haas, K., Sin, W.C., Javaherian, A., Li, Z., and Cline, H.T. (2001). Single‐cell electroporation for  gene transfer in vivo. Neuron 29, 583‐591.  He, H.Y., Hodos, W., and Quinlan, E.M. (2006). Visual deprivation reactivates rapid ocular  dominance plasticity in adult visual cortex. J. Neurosci. 26, 2951‐2955.  He, H.Y., Ray, B., Dennis, K., and Quinlan, E.M. (2007). Experience‐dependent recovery of vision  following chronic deprivation amblyopia. Nature Neurosci. 10, 1134‐1136.  Hesp, B.R., Clarkson, A.N., Sawant, P.M., and Kerr, D.S. (2007). Domoic acid preconditioning and  seizure induction in young and aged rats. Epilepsy Res. 76, 103‐112.  Ewald, R.C. and Hollis, C. (2009). Cloning and phylogenetic analysis of NMDA receptor subunits  NR1, NR2A and NR2B in Xenopus laevis tadpoles. Front. Mol. Neurosci. 2.  Hubel, D.H., and Wiesel, T.N. (1963). Single‐cell responses in striate cortex of kittens deprived  of vision in one eye. J. Neurophyiol. 26, 1003‐1017.  Huber, K.M., Gallagher, S.M., Warren, S.T., and Bear, M.F. (2002). Altered synaptic plasticity in a  mouse model of fragile X mental retardation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 7746‐7750.  Ikegaya, Y., Aaron, G., Cossart, R., Aronov, D., Lampl, I., Ferster, D., and Yuste, R. (2004). Synfire  chains and cortical songs: Temporal modules of cortical activity. Science (New York, N.Y 304,  559‐564.  138    Izhikevich, E.M., and Desai, N.S. (2003). Relating STDP to BCM. Neural Comput. 15, 1511‐1523.  Jones, T.A., Klintsova, A.Y., Kilman, V.L., Sirevaag, A.M., and Greenough, W.T. (1997). Induction  of multiple synapses by experience in the visual cortex of adult rats. Neurobiology of Learning  and Memory 68, 13‐20.  Kerr, J.N.D., Greenberg, D., and Helmchen, F. (2005). Imaging input and output of neocortical  networks in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of  America 102, 14063‐14068.  Konur, S., and Yuste, R. (2004). Developmental regulation of spine and filopodial motility in  primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation. Journal of  neurobiology 59, 236‐246.  Kuzmiski, J.B., Pittman, Q.J., and Bains, J.S. (2009). Metaplasticity of Hypothalamic Synapses  following In Vivo Challenge.  62, 839‐849.  Majewska, A., Yiu, G., and Yuste, R. (2000). A custom‐made two‐photon microscope and  deconvolution system. Pflugers Archiv‐European Journal of Physiology 441, 398‐408.  Maletic‐Savatic, M., Malinow, R., and Svoboda, K. (1999). Rapid dendritic morphogenesis in CA1  hippocampal dendrites induced by synaptic activity. Science (New York, N.Y 283, 1923‐1927.  McBain, C.J., and Mayer, M.L. (1994). N‐Methyl‐D‐Aspartic Acid Receptor Structure and  Function. Physiological reviews 74, 723‐760.  Monyer, H., Burnashev, N., Laurie, D.J., Sakmann, B., and Seeburg, P.H. (1994). Developmental  and Regional Expression in the Rat‐Brain and Functional‐Properties of 4 Nmda Receptors.  Neuron 12, 529‐540.  Mu, Y., and Poo, M.M. (2006). Spike timing‐dependent LTP/LTD mediates visual experience‐ dependent plasticity in a developing retinotectal system. Neuron 50, 115‐125.  Niell, C.M., Meyer, M.P., and Smith, S.J. (2004). In vivo imaging of synapse formation on a  growing dendritic arbor. Nature neuroscience 7, 254‐260.  Niell, C.M., and Smith, S.J. (2005). Functional imaging reveals rapid development of visual  response properties in the zebrafish tectum. Neuron 45, 941‐951.  Philpot, B.D., Cho, K.K.A., and Bear, M.F. (2007). Obligatory role of NR2A for metaplasticity in  visual cortex. Neuron 53, 495‐502.  139    Philpot, B.D., Espinosa, J.S., and Bear, M.F. (2003). Evidence for altered NMDA receptor  function as a basis for metaplasticity in visual cortex. J. Neurosci. 23, 5583‐5588.  Philpot, B.D., Sekhar, A.K., Shouval, H.Z., and Bear, M.F. (2001). Visual experience and  deprivation bidirectionally modify the composition and function of NMDA receptors in visual  cortex. Neuron 29, 157‐169.  Portera‐Cailliau, C., Pan, D.T., and Yuste, R. (2003). Activity‐regulated dynamic behavior of early  dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. J Neurosci 23, 7129‐ 7142.  Quinlan, E.M., Olstein, D.H., and Bear, M.F. (1999a). Bidirectional, experience‐dependent  regulation of N‐methyl‐D‐aspartate receptor subunit composition in the rat visual cortex during  postnatal development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States  of America 96, 12876‐12880.  Quinlan, E.M., Philpot, B.D., Huganir, R.L., and Bear, M.F. (1999b). Rapid, experience‐dependent  expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nature neuroscience 2, 352‐357.  Ramdya, P., Reiter, B., and Engert, F. (2006). Reverse correlation of rapid calcium signals in the  zebrafish optic tectum in vivo. Journal of neuroscience methods 157, 230‐237.  Rittenhouse, C.D., Shouval, H.Z., Paradiso, M.A., and Bear, M.F. (1999). Monocular deprivation  induces homosynaptic long‐term depression in visual cortex. Nature 397, 347‐350.  Roberts, E.B., and Ramoa, A.S. (1999). Enhanced NR2A subunit expression and decreased  NMDA receptor decay time at the onset of ocular dominance plasticity in the ferret. Journal of  neurophysiology 81, 2587‐2591.  Ruthazer, E.S., Li, J., and Cline, H.T. (2006). Stabilization of axon branch dynamics by synaptic  maturation. J Neurosci 26, 3594‐3603.  Sasaki, T., Takahashi, N., Matsuki, N., and Ikegaya, Y. (2008). Fast and accurate detection of  action potentials from somatic calcium fluctuations. Journal of neurophysiology 100, 1668‐ 1676.  Schwarzbach, E., Bonislawski, D.P., Xiong, G., and Cohen, A.S. (2006). Mechanisms underlying  the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus 16,  541‐550.  Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., and Cline, H.T. (2002). Dendrite growth increased by visual  activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature 419, 475‐480.  140    Svoboda, K., and Yasuda, R. (2006). Principles of two‐photon excitation microscopy and its  applications to neuroscience. Neuron 50, 823‐839.  Takahashi, N., Sasaki, T., Usami, A., Matsuki, N., and Ikegaya, Y. (2007). Watching neuronal  circuit dynamics through functional multineuron calcium imaging (fMCI). Neuroscience  Research 58, 219‐225.  Trachtenberg, J.T., Chen, B.E., Knott, G.W., Feng, G.P., Sanes, J.R., Welker, E., and Svoboda, K.  (2002). Long‐term in vivo imaging of experience‐dependent synaptic plasticity in adult cortex.  Nature 420, 788‐794.  Ullal, G.R., Ninchoji, T., and Uemura, K. (1989). Low frequency stimulation induces an increase  in after‐discharge thresholds in hippocampal and amygdaloid kindling. Epilepsy Res. 3, 236‐247.  Vislay‐Meltzer, R.L., Kampff, A.R., and Engert, F. (2006). Spatiotemporal specificity of neuronal  activity directs the modification of receptive fields in the developing retinotectal system.  Neuron 50, 101‐114.  Wong, R.O. (1998). Calcium imaging and multielectrode recordings of global patterns of activity  in the developing nervous system Histochemical Journal 30, 217‐229.  Zhang, L.I., Tao, H.W., and Poo, M. (2000). Visual input induces long‐term potentiation of  developing retinotectal synapses. Nature neuroscience 3, 708‐715.  Zhou, Q., Tao, H.W., and Poo, M.M. (2003). Reversal and stabilization of synaptic modifications  in a developing visual system. Science (New York, N.Y 300, 1953‐1957.          141    5. APPENDIX A: ETHICS BOARD CERTIFICATES        142          143          144          145   

Cite

Citation Scheme:

        

Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics

Share

Embed

Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                        
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            src="{[{embed.src}]}"
                            data-item="{[{embed.item}]}"
                            data-collection="{[{embed.collection}]}"
                            data-metadata="{[{embed.showMetadata}]}"
                            data-width="{[{embed.width}]}"
                            async >
                            </script>
                            </div>
                        
                    
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:
https://iiif.library.ubc.ca/presentation/dsp.24.1-0067735/manifest

Comment

Related Items