Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

A novel electrophoretic mechanism and separation parameter for selective nucleic acid concentration based… Pel, Joel 2009

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata

Download

Media
24-ubc_2009_fall_pel_joel.pdf [ 2.38MB ]
Metadata
JSON: 24-1.0067696.json
JSON-LD: 24-1.0067696-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0067696-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0067696-rdf.json
Turtle: 24-1.0067696-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0067696-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0067696-source.json
Full Text
24-1.0067696-fulltext.txt
Citation
24-1.0067696.ris

Full Text

A Novel Electrophoretic Mechanism and Separation Parameter  for Selective Nucleic Acid Concentration Based on Synchronous  Coefficient of Drag Alteration (SCODA)    by  Joel Pel  BASc, The University of British Columbia, 2005    A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE   REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    DOCTOR OF PHILOSOPHY  in  The Faculty of Graduate Studies  (Physics)    THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA  (Vancouver)  September 2009  © Joel Pel 2009    ii Abstract  Molecular manipulation and separation techniques form the building blocks for  much of fundamental science, yet many separation challenges still remain, in fields as  diverse as forensics and metagenomics. This thesis presents SCODA (Synchronous  Coefficient of Drag Alteration), a novel and general molecular separation and  concentration technique aimed at addressing such challenges. SCODA takes advantage  of physical molecular properties associated with the non‐linear response of long,  charged polymers to electrophoretic fields, which define a novel parameter for DNA  separation. The SCODA method is based on superposition of synchronous, time‐varying  electrophoretic fields, which can generate net drift of charged molecules even when the  time‐averaged molecule displacement generated by each field individually is zero. Such  drift can only occur for molecules, such as DNA, whose motive response to  electrophoretic fields is non‐linear.   This thesis presents the development of SCODA for extraction of DNA, and  outlines the design of the instrumentation required to achieve the SCODA effect. We  then demonstrate the selectivity, efficiency, and sensitivity of the technique.  Contaminant rejection is also quantified for humic acids and proteins, with SCODA  displaying excellent performance compared to existing technologies. Additionally, the  ability of this technology to extract high molecular weight DNA is demonstrated, as is its  inherent fragment length selection capability.  Finally, we demonstrate two applications of this method to metagenomics  projects where existing technologies performed poorly or failed altogether. The first is    iii the extraction of high molecular weight DNA from soil, which is limited in length to  fragments smaller than 50 kb with current direct extraction methods. SCODA was able  to recover DNA an order of magnitude larger than this. The second application is DNA  extraction from highly contaminated samples originating in the Athabasca tar sands,  where existing technology had failed to recover any usable DNA. SCODA was able to  recover sufficient DNA to enable the discovery of 200 putatively novel organisms.    iv Table of Contents   Abstract................................................................................................................................ii Table of Contents................................................................................................................iv List of Tables ......................................................................................................................vii List of Figures ....................................................................................................................viii Symbols, Nomenclature and Abbreviations ........................................................................x Acknowledgements.............................................................................................................xi Chapter 1 Introduction .................................................................................................... 1 1.1 Background and Motivation ............................................................................... 1 1.2 Thesis Outline ..................................................................................................... 4 Chapter 2 Synchronous Coefficient of Drag Alteration (SCODA) .................................... 5 2.1 The SCODA Principle ........................................................................................... 5 2.2 Implementations of SCODA ................................................................................ 7 2.3 Principles of Electrophoresis............................................................................. 10 2.4 The Electrophoretic SCODA Principle – A New Separation Parameter ............ 14 2.5 Significance of k/D ............................................................................................ 26 Chapter 3 Electrophoretic SCODA Concentration ......................................................... 28 3.1 Estimation of k/D .............................................................................................. 28 3.2 Design of Focusing Fields .................................................................................. 32 3.3 Demonstration of SCODA Concentration ......................................................... 34 Chapter 4 Methods and Apparatus for a Practical Implementation of SCODA ............ 41 4.1 Instrument Overview ........................................................................................ 42   v 4.2 Electric Field Optimization ................................................................................ 46 4.3 Electric Field Generation................................................................................... 50 4.4 Sample Injection ............................................................................................... 56 4.5 Gel Temperature Regulation ............................................................................ 64 4.6 Electrode and Gel Boat Design ......................................................................... 68 4.7 DNA Extraction.................................................................................................. 71 4.7.1 Gel Plug Extraction.................................................................................... 72 4.7.2 Diffusive Extraction................................................................................... 73 Chapter 5 SCODA performance in DNA extraction and purification............................. 79 5.1 Efficiency and Sensitivity................................................................................... 79 5.2 Selectivity and Contaminant Rejection............................................................. 81 5.2.1 Humic Acids............................................................................................... 83 5.2.2 Proteins ..................................................................................................... 86 5.3 High Molecular Weight DNA Concentration..................................................... 89 5.4 Short Fragment Concentration ......................................................................... 93 Chapter 6 DNA Length Selection ................................................................................... 96 6.1 Large DNA Rejection ......................................................................................... 97 6.2 Small DNA Rejection ....................................................................................... 102 Chapter 7 Applications of Electrophoretic SCODA ...................................................... 108 7.1 HMW DNA Extraction from Soil ...................................................................... 109 7.2 Tar Sands......................................................................................................... 111 Chapter 8 Conclusions ................................................................................................. 116   vi Works Cited..................................................................................................................... 119 Appendix A ‐ Thermal SCODA ......................................................................................... 126 Appendix B ‐ SCODA Theory ........................................................................................... 129 B.1 Field Dependent Electrophoretic Mobility ..................................................... 129 B.2 The Einstein‐Smoluchowski Equation............................................................. 129 B.3 The SCODA Potential....................................................................................... 132 B.4 SCODA Field Accuracy..................................................................................... 134 B.5 Electrokinetic Injection ................................................................................... 135 Appendix C – Materials and Methods ............................................................................ 138 Appendix D – Supplementary Data................................................................................. 142    vii List of Tables  Table 1: 12‐Step Normalized SCODA Voltages ................................................................. 33 Table 2: 4‐Step Normalized SCODA Voltages ................................................................... 34 Table 3: Discrete 4‐Step SCODA Voltages......................................................................... 37 Table 4: Maximum 12‐step SCODA Focusing Voltages..................................................... 49 Table 5: Maximum 4‐step SCODA Focusing Voltages....................................................... 50 Table 6: Protein Contaminant Rejection........................................................................... 89 Table 7: Defocusing Voltages.......................................................................................... 104 Table 8: Tar Sands Sequence Data.................................................................................. 142  viii List of Figures  Figure 1: DNA Reptation Regimes in a Sieving Medium................................................... 12 Figure 2: SCODA Demonstration Sequence...................................................................... 18 Figure 3: Two Dimensional Rotating SCODA Fields .......................................................... 22 Figure 4: Dimensionless SCODA Potential Well and Force ............................................... 25 Figure 5: DNA Velocity Response to Electric Fields .......................................................... 30 Figure 6: Realization of SCODA Fields............................................................................... 32 Figure 7: Discrete Dipole Voltages and Fields Patterns .................................................... 35 Figure 8: Discrete Quadrupole Voltages and Fields Patterns ........................................... 36 Figure 9: SCODA Concentration Sequence ....................................................................... 39 Figure 10: SCODA Instrument Schematic. ........................................................................ 42 Figure 11: SCODA Field Optimization ............................................................................... 48 Figure 12: Electrode Placement........................................................................................ 52 Figure 13: DC and AC Biases ............................................................................................. 54 Figure 14: AC Bias Generation .......................................................................................... 55 Figure 15: SCODA Gel and Injection Chamber.................................................................. 59 Figure 16: Injection and Concentration Sequence. .......................................................... 60 Figure 17: Temperature Oscillations vs. SCODA Period.................................................... 67 Figure 18: SCODA Gel Geometry ...................................................................................... 71 Figure 19: Diffusive Extraction in SCODA.......................................................................... 73 Figure 20: Diffusive Extraction Losses during SCODA....................................................... 74 Figure 21: Improved Diffusive Extraction ......................................................................... 76   ix Figure 22: Diffusive Extraction Sequence ......................................................................... 77 Figure 23: Electrophoretic Washing ................................................................................. 82 Figure 24: Humic Acid Contaminant Rejection................................................................. 84 Figure 25: HMW DNA Recovery vs. TBE Concentration ................................................... 91 Figure 26: DNA Cutoff and Run Length vs. Agarose Gel % ............................................... 99 Figure 27: DNA Cutoff vs. SCODA Period ........................................................................ 100 Figure 28: Rejection of Short DNA Fragments................................................................ 105 Figure 29: Instability of Defocusing ................................................................................ 106 Figure 30: Unstable Equilibrium in Defocusing............................................................... 106 Figure 31: HMW DNA Extraction from Soil..................................................................... 110 Figure 32: Oil Sands Samples .......................................................................................... 112 Figure 33: Conservation of Oil Sand Associated Environmental DNA ............................ 115 Figure 34: Yeast Chromosome PFG Marker.................................................................... 138 Figure 35: λ Ladder PFG Marker ..................................................................................... 139 Figure 36: 100 bp Ladder ................................................................................................ 140 Figure 37: Length Selection DNA Mix ............................................................................. 141   x Symbols, Nomenclature and Abbreviations  Term  Definition  Agarose  Gelatinous substance derived from seaweed commonly used  as a separation matrix in electrophoresis. Characterized by  the percentage (w/v) of agarose in solution.  dsDNA  Double‐stranded DNA  EDTA  Ethylenediaminetetraacetic Acid – a compound commonly  used to stabilize DNA by sequestering metal ions required by  DNA‐degrading enzymes.  FWHM  Full Width at Half Maximum – an expression for evaluating  the extent of a function, defined as the width of the function  at half its maximum value.  LMP  Low Melting Point – refers to agarose that melts at low  temperature after solidification.  Metagenomics  The study of bacterial DNA extracted directly from  environmental samples, without cultivation of the bacteria in  the laboratory.  PCR  Polymerase Chain Reaction – the protocol used to  exponentially amplify DNA fragments.  PFGE  Pulsed Field Gel Electrophoresis – an electrophoretic method  employing alternating fields to separate large DNA  fragments.  Plasmid  A circular DNA strand that can be reproduced independently  of the genome by a bacteria.  QRT PCR  Quantitative Real‐Time PCR ‐ A technique based on PCR that  simultaneously amplifies and quantifies target DNA  molecules.  Radius of Gyration (Rg)  A measure of the size of a polymer chain. Defined as:  2 1 2 )(1 meank N k g rrN R −∑= =  where N is the number of monomers,  and rmean is the mean position of the monomers.  SB  Sodium Borate – a Tris free buffer used in electrophoresis. 1x  SB buffer contains 10 mM NaOH and 49 mM Boric acid.  SCODA  Synchronous Coefficient of Drag Alteration  ssDNA  Single‐stranded DNA  TAE  Tris‐acetate EDTA – a standard buffer used in electrophoresis.  1x TAE contains 40 mM Tris and 2 mM EDTA.  TBE  Tris‐borate EDTA – a standard buffer used in electrophoresis.  1x TBE contains 90 mM Tris ‐borate, and 2 mM EDTA. TBE has  a higher buffering capacity than TAE.    xi Acknowledgements  I am indebted to many people, without whom this academic journey would not  have been possible. The first is my supervisor, Dr. Andre Marziali, whose creativity and  inventiveness is second to none. I have learned a tremendous amount under his  supervision, beginning many years ago as an undergraduate, and many of his ideas are  reflected in this work.  It was his creativity and attentive guidance that made my PhD  possible and also very enjoyable, and for both I am extremely grateful.  My entire PhD committee has also been an excellent source of academic  feedback and support. Many thanks to Dr. Lorne Whitehead for his deep insights into  this work as it progressed, and especially for developing some of the conceptual and  mathematical fundamentals of the work early on. Thank you also to Dr. Carl Hansen,  whose rigor and understanding of the relevance of this work has helped improve it  significantly. And thank you to Dr. Robert Holt of the Michael Smith Genome Sciences  Centre, who not only was an excellent collaborator on the Tar Sands work, but was also  willing to work as a biologist amongst physicists, providing  valuable insights into the  validation and applications of the SCODA technology.  I would also like to thank those that have preceded me in the Marziali Lab.  Former graduate students Robin Coope, Jon Nakane and Matt Wiggin, whose  lighthearted nature and helpful discussions around my many questions has contributed  much to the value and enjoyment of my degree. Similarly, many thanks to post‐docs Dr.  Vincent Tabard –Cossa and Dr. Jason Dwyer.    xii There are many other people from the Marziali Lab I wish to thank, but in  particular I would like to thank lab engineer and manager David Broemeling, who I lived  and worked with for 3 years of my degree, and who supported and contributed to this  work in many ways. In addition, I would like to thank fellow graduate student Jason  Thompson, biochemists Hau‐Ling Poon, Laura Mai and Giorgia Tropini, and engineers  Dylan Gunn, Miti Isbasescu and Peter Eugster, for their fruitful discussions and  contributions to this work.  Finally I would like to thank my friends and family who have encouraged and  supported me throughout this busy season. In particular I would like to thank my  parents, Leo and Janet Pel, for their steadfast support and encouragement that has  brought me to this point. To my dad, for instilling in me a passion to understand and  design all sorts of things from the garage to the wood shop, and giving me the skills to  do so. To my mom, for giving me her love of chemistry from the kitchen to the lab. And  although they were likely unaware of the combination of skills they were imparting to  me, I could not have been better prepared to enjoy the work I have been doing for the  past four‐plus years.  And in the words of 2 Corinthians 2:14: “Τῷ δὲ θεῷ χάρις τῷ πάντοτε θριαµβεύοντι ἡµᾶς ἐν τῷ Χριστῷ καὶ τὴν ὀσµὴν τῆς γνώσεως αὐτοῦ φανεροῦντι δι’ ἡµῶν ἐν παντὶ τόπῳ”         1 Chapter 1 Introduction  1.1 Background and Motivation  Methods for separating different molecular species are the cornerstone of  analytical techniques in molecular biology. Discovery or development of new separation  methods has spawned entire new industries, and opened new areas of scientific  development and application.  For example, mass spectrometry and chromatography  have combined to enable proteomics (the study of the entire protein complement of an  organism), while advances in electrophoresis have enabled the vast field of DNA  sequencing and the landmark Human Genome Project. There are few fundamental  methods for molecular separation, however, and many separation challenges remain  unmet with existing techniques [1].  In addition, manipulation of molecules, whether in gas, liquid, or solid state, is a  fundamental need in basic science. Much attention has recently been focused on  scanning tunneling microscope (STM) atomic manipulation in solids [2], and yet our  ability to induce selective motion of molecules in liquids in anything but simple patterns  is limited. The ability to arbitrarily create inhomogeneous concentration profiles of  selected molecules is of general utility not only in chemical preparation, but potentially  in areas such as chemical reaction acceleration or the manipulation of optical or physical  properties of a substance.  This thesis describes a novel technique for molecular separation and  manipulation. While the fundamentals of the work are applicable to a large number of  areas, from salt water desalination to biological imaging and chemical reaction  2  acceleration, we have chosen to focus on a problem of high relevance to the clinical and  life‐science research community – nucleic acids separation and concentration. Nucleic  acid extraction from complex sources is a molecular separation problem of great  importance to current challenges in genomics, metagenomics, forensics, bio‐defense,  food and water safety, and clinical molecular diagnostics.   The ubiquitous column and bead‐based nucleic acid extraction methods that  dominate the field of nucleic acid extraction employ selective chemical affinity between  nucleic acids and ion exchange or similar resins and beads to capture target molecules.  While these methods often involve mechanical steps including filtration and  centrifugation, they are relatively inexpensive and work well in a variety of samples.  Their inadequacy lies in the fact that the separations are based on chemical affinity, and  therefore perform poorly in the presence of contaminant molecules which either have  similar chemical properties to nucleic acids, or which foul the capture matrix [3].  Precipitation methods are often used following column or bead extractions to remove  contaminants that carry through into the purified sample, however this further reduces  yield of the methods, particularly in cases with low target concentrations.   This weakness of existing methods is a critical problem for DNA extraction from  environmental samples. For example, humic acids, a family of contaminants abundant in  soil, co‐extract with DNA in phenol based separations due to their solubility in the  aqueous phase [3], and partly carry through column and bead based methods. The  situation worsens with low starting concentration of nucleic acids, as the dual challenge  must then be faced of concentrating few nucleic acids while rejecting large amounts of    3 contaminants. A universal, simple, and highly selective method to concentrate DNA  from contaminated and low abundance sources would be very desirable.   We have found a novel solution to this problem in the physics of electrophoresis  – the motion of charged molecules in fluid under applied electric current. It has long  been known that nucleic acid molecules, due to their exceptionally long contour lengths  and high linear charge density, exhibit complex electrophoretic behavior when reptating  through a separation medium such as agarose gel [4]. In some electric field regimes, this  can include highly non‐linear response of the drift velocity to changes in field magnitude  [5]. We have shown that by exploiting this non‐linear response, we can induce net drift  of DNA molecules through the combined influence of two synchronously rotating  electric fields, each of which has a zero time‐averaged magnitude and would individually  impart no net drift to the molecules. We have termed this method SCODA [6‐8]. Failure  of the superposition principle, and the resulting net drift, occurs only for molecules  whose electrophoretic response is non‐linear. Consequently, molecules with highly non‐ linear response can be selected for drift over other ions and biomolecules.   Two significant realizations arose from this work. First, non‐linear electrophoretic  response could be used as a physical parameter for separating biomolecules. Second,  the velocity field pattern generated with this method could be made to diverge in  regions of the separation medium that did not contain current sources or sinks.  Maxwell’s equations governing electric current in conducting media specify that current  fields must be free of divergence except at electrodes, making DNA concentration based  on static electric fields impractical due to electrochemical damage of the DNA. The  4  velocity field generated by the SCODA method, however, selectively concentrates and  purifies DNA in a region free of electrodes.     1.2 Thesis Outline  In this thesis we describe the theory of SCODA, narrow it to an electrophoretic  implementation that is relevant to nucleic acid purification, defining a new separation  parameter in the process. Execution of electrophoretic SCODA requires significant  sophistication in apparatus such that the second order SCODA effect can dominate over  residual motion from the first order DC electrophoretic velocity, which must cancel  precisely. Consequently, we describe in some detail the instrumental implementation of  the SCODA system. We then present the performance of nucleic acid separation and  concentration using SCODA, with respect to yield, purity and molecular weight selection.  Finally we provide examples of results from several of the many nucleic acid purification  applications now enabled.  The SCODA method and its application to nucleic acid separation is entirely novel  and the work presented here and in the associated publications [6‐8] will likely become  seminal work in what we hope will be a broad new area of electrophoresis.  Consequently, this thesis covers a number of properties of the SCODA method, each of  which could potentially merit a thesis unto itself. The goal of this work is to provide a  practical method for DNA separation, and to provide a glimpse into the properties of  SCODA, in the hope that detailed exploration of some of the underlying topics touched  on in this thesis will be pursued further by others.     5 Chapter 2 Synchronous Coefficient of Drag Alteration (SCODA)  The fundamental concept behind Synchronous Coefficient of Drag Alteration  (SCODA) is to induce periodic motion of a particle, such that the average drift of the  particle is zero. If the particle’s motive properties (i.e. coefficient of drag, or mobility)  are then modified synchronously in time with the periodic driving field, net motion can  be produced. This is a powerful and fundamental new physical method, as individually  both the induced periodic motion and the mobility modifications produce no net  motion. It is only when the two interactions are combined in a specific target molecule  that net motion is produced.  Net motion is only produced for molecular species that respond to the drag or  mobility modification – thus SCODA can be used as a separation technique. The  separation mechanism depends on the method used to alter the drag of a particle,  opening the door for new separation parameters. Unique spatial manipulation and  concentrations of molecules can also be achieved, such that SCODA can be made non‐ dispersive, differentiating this technique from other electrophoretic methods.     2.1 The SCODA Principle  To demonstrate the SCODA principle, consider the simple example of a particle in  a medium subject to an external force F. In vector form, the steady‐state drift velocity of  such a particle is given by the equation    Fv rr ζ 1=drift ,  (1)  6  where ζ is the viscous friction (or drag) coefficient of the particle in the surrounding  medium. If the particle is subject to an oscillating force field:    FF ˆ)cos(0 tF ω= r   (2)  it will by definition1 move as:    Fv ˆ)cos()( 0 tFt ωζ= r   (3)  which has a time average velocity of zero. If, however, ζ is not constant but is able to  vary in time over the period of the oscillating force field, that is, the Fourier transform of  1/ ζ has a component proportional to cos(ωt), the time average of v(t) need not be zero.  Consider a simple time varying drag coefficient with arbitrary phase φ:    10 )cos(11 ζ φω ζζ ++= t   (4)  Substituting Equation (4) into Equation (3) and taking the time average over one cycle  gives:    Fv ˆ)cos( 2 1 0 φζ F=r   (5)  Thus it is possible to have a non‐zero time average velocity, or in other words a  net drift, even if the time average of the applied forcing field is zero. To achieve this, the                                                             1 This is assuming that the time to reach steady state velocity is short compared to the oscillation period  of the driving force.    7 effective drag of the particle must have a time dependence that contains an oscillatory  component that is synchronized (i.e. the same frequency) with the forcing field  oscillations. It is the non‐linear multiplication operation of two equal frequency (non‐ orthogonal) functions that produces a constant term that time averages to a non‐zero  value. Alternatively, this can be understood as the forcing field and effective drag having  a non‐zero correlation.  This selective drag manipulation provides the mechanism for SCODA separation.  The direction of the average drift depends on the relative phase of the two oscillations,  while the magnitude depends on the field amplitudes, the phase, and the number of  orthogonal component frequencies the oscillations have in common.     2.2 Implementations of SCODA  There are potentially many ways to achieve a SCODA interaction. First, there are a  number of possible force fields, including magnetic, gravitational, flow and electric fields  each in a variety of mediums. For each of these fields, there are presumably many ways  to oscillate the drag, such as the application of a second force field of the same or  different type or oscillating temperature or light sources, depending on the property of  the medium and of the particles contained within. What makes this technique  particularly appealing is that by spatially modulating the aforementioned drag  oscillations it is possible not only to induce a net drift on particles, but to concentrate  those particles in one or more dimensions (see Section 2.4). That is, by inducing SCODA  8  movements in different directions depending on the particle location, distributed  particles can be made to converge or focus to a common location.  As an example of such concentration, consider an electrophoretic driving force  used to manipulate charged particles in solution. The steady state velocity of the  particles can be described by:     Ev rr µ=   (6)  where  EE ˆ)cos(0 tE ω= r  is the driving electric field and μ is defined as the  electrophoretic mobility. To generate a non‐zero time averaged velocity, the  electrophoretic mobility must contain an oscillating component of the same frequency  as the electric field:    )cos()( 10 tt ωµµµ +=   (7)  One approach to generate such an oscillation is to apply sinusoidal temperature  fluctuations, which modulate a solution’s viscosity and hence the electrophoretic  mobility of its constituent ions. This has been demonstrated (Appendix A ‐ Thermal  SCODA) to lead to the time averaged drift velocity described in Equation (5). This effect  leads to current rectification that can equivalently be interpreted as arising from the  temperature dependence of the solution’s conductivity.   Optically induced changes in the electrophoretic mobility of a molecule may also  be possible; this would enable a very useful form of SCODA in which an optical pattern  could define focus locations. Certain classes of compounds, such as azo‐benzene or  spiro‐pyrans, undergo light‐induced reversible conformational changes [9].  Azo‐ benzene can isomerize from the trans to cis form upon exposure to UV light (300 ‐ 400    9 nm).  The conversion back to the trans form occurs once exposed to light with a  wavelength greater than 400 nm.  This photoisomerization process has recently been  used in the creation and dissociation of DNA duplex [10].  This ability for conformational  change introduces the possibility of optically inducing small but reversible periodic  changes in electrophoretic mobility of a molecule. In this case, ω in Equation (7) is the  frequency with which the optical excitation is switched between the wavelength  required for the isomerization to one state and the wavelength required for the reverse  process.   Patterning of the optical excitation over a solution using masks could lead to high  resolution concentration of molecules without the need to pattern electrodes or  dielectrics in the solution itself as would be required for other forms of electrophoretic  concentration. Though this could be of great use, the challenge in this SCODA  implementation remains the development of an appropriate compound that exhibits a  sufficient mobility change associated with different conformations, and that can  transition rapidly and repeatedly between conformations.   What can be seen conceptually from these descriptions of SCODA is the  molecular selectivity of this process. Only particles that respond to both the driving field  and the perturbation mechanism experience net movement and concentration.  Concentration may be balanced by diffusion or electrostatic repulsion, depending on the  system. Thus, there are potentially many new molecular selection parameters with this  technique, comprising a molecule’s response to a drag perturbation compared to  10  repulsive forces against concentration. This shall be seen in detail for electrophoretic  SCODA in Section 2.4.  Perhaps the simplest useful implementation of SCODA is purely electrophoretic.  By exploiting the electric‐field‐dependent mobility of a charged polymer in a gel  medium, electric fields can be used for both the driving field and mobility perturbation  field, allowing SCODA motion to be generated solely with electric fields2. Utilizing this  interaction between electric field and mobility, the purely electrophoretic SCODA  approach allows polymers such as DNA to be concentrated in a uniform homogeneous  medium. This is a relatively simple, inexpensive process, and of potential utility to  various biochemical purification processes. This form of SCODA is the principal subject  of this thesis and its presentation follows in detail.     2.3 Principles of Electrophoresis   DNA electrophoresis can be defined as the motion of charged DNA molecules in  an aqueous sieving matrix under the influence of an electric field. Typically, DNA  electrophoresis is carried out in bulk slab gels or in narrow capillaries, with the intention  of separating DNA by length. To understand the electrophoretic principles required for                                                             2 Thus it should also be possible to achieve SCODA with any other system that exhibits a non‐linear  relation between velocity and forcing field, such as  electron transport in a semiconductor [11].    11 SCODA (a small subset of the vast realm of electrophoresis theory), DNA motion through  buffer and slab gels will be the focus of this section.   Electrophoresis is a molecular separation technique in which molecules are  separated based on differences in mobility, μ, defined in Equation (6), where v is the  velocity of the molecule and E is the applied electric field. DNA is a linear, charged  molecule with a constant charge per unit length due to its phosphate backbone. In free  solution (buffer), DNA larger than a few hundred bases cannot be separated by length  due to its free‐draining nature [12]; that is, the mobility of the molecule is independent  of length, as the friction per unit length is constant [4, 13].  To achieve length dependent separation, a sieving matrix must be used to  produce a length‐dependent drag. The sieving matrix also serves a second purpose,  which is to reduce convection and diffusion that would tend to cause dispersion during  separation. Agarose and polyacrylamide gels are common matrices, although more  exotic types are also used [14]. In this thesis, the theoretical description and practical  uses will be limited to agarose.  There are three regimes that describe DNA migration through a sieving matrix,  reprinted in Figure 1 from [4]. In the Ogston regime, the radius of gyration of the  molecule (Rg, roughly, the radius of the DNA curled up) is less than the radius of the gel  pore (Rg < Rp), as the DNA stays coiled and is sieved. For larger molecules or smaller  pores, Rg > Rp, the DNA reptates through the matrix, but is still largely coiled. This can  cause pulling from both ends of the molecule, and entropic trapping in small pores. In  this size regime, but at higher fields, DNA enters the oriented reptation mode (or biased  12  reptation), where the DNA uncoils and travels through the matrix with one end leading.  In this regime, the DNA becomes free‐draining and its mobility again becomes  independent of molecular mass, as in free solution.    Figure 1: DNA Reptation Regimes in a Sieving Medium. Different regimes of migration in constant‐field  electrophoresis (a) Ogston sieving (b) Reptation without orientation (c) Biased reptation. Figure  reproduced from [4].    Because of the free‐draining nature of large molecules in the biased reptation  regime, it becomes very difficult to separate large molecules above 20 – 50 kb [13], even  at very low gel densities. Instead, pulsed field gel electrophoresis (PFGE) is employed,  which uses various forms of alternating electric fields to separate DNA based on how  long a molecule takes to reorient to a new field direction [15]. This technique provides  length separation into the Mb length range.   A result of the complicated gel‐reptation behavior, and possibly of transition  between reptation regimes at different field strengths, is that the mobility depends on  the magnitude of the electric field, such that Equation (6) becomes    13   Ev rr )( Edrift µ=   (8)  such that the velocity response to electric field is non‐linear, introducing the possibility  for interesting non‐linear dynamics [12]. The physical basis for this field‐dependent  mobility is not clear in all regimes, but it can be attributed in part to the orientation of  charged agarose fibres in the electric fields [13]. DNA molecules can wind and unwind  through and around the agarose fibres, presumably causing this non‐linearity. The  extent of the non‐linearity depends on many parameters, including gel percentage, DNA  length and conformation (linear, circular, single stranded, secondary structure) [16].  For all but the highest field regimes (where mobility is seen to decrease with  field [12, 17]), the field dependent mobility can be described by a monotonically  increasing function. To first order, this can be described as [12]    Ev rr )( 0 Ekdrift += µ   (9)  where k is the coefficient of the first field dependent term in the mobility, and a  measure of non‐linearity in the velocity response. It is important to note that even in  the biased reptation regime, where mobility is independent of DNA length, it is still a  function of electric field (which is not the case in free solution).  This non‐linearity in electrophoretic drift velocity with respect to field has enabled  alternate forms of electrophoresis (reviewed in [1]), that employ time varying or  spatially varying fields to separate and manipulate charged polymers including DNA. For  example, it has been shown that an asymmetric AC waveform can cause net drift of  electrophoretic particles [1, 18‐23] and that this effect can be used to focus particles in  one dimension [5, 16, 24]. Using a completely different principle, dielectrophoresis [25]  14  has been demonstrated capable of concentrating DNA in two or more dimensions [26,  27], but requires high electric field gradients to generate a significant effect. The  method described in this thesis is therefore unique in its ability to achieve DNA  concentration in two or more dimensions.    2.4 The Electrophoretic SCODA Principle – A New Separation Parameter  The non‐linear dependence of the electrophoretic velocity of DNA with respect to  applied electric field described in Section 2.3 provides a unique opportunity to realize  SCODA, which is outlined in the following section.  It can be shown that virtually any non‐linear relation between velocity and applied  field (or equivalently, any form of field dependent mobility) can be employed in SCODA  (Appendix B ‐ SCODA Theory). However, it will be helpful in the following explanation to  consider a simple example that is amenable to analytic treatment.  Let us therefore  consider the relationship in which the particle’s velocity is parallel to the field direction  and its mobility is equal to a constant term plus a term linearly dependent on the  magnitude of the electric field:    Ev rr )( 0 Ek+= µ   (10)  This is a very general relation, as the mobility term (k|E|) can be interpreted as  the first field dependent term in the Taylor expansion of an arbitrary field dependent  mobility relation. A constant term in the mobility does not contribute directly to the  SCODA velocity, but defines the size of the orbit the DNA makes during one cycle of the  SCODA fields. This can be rewritten when considering SCODA as    15   Ev rr )( Ek=   (11)  without any loss of generality.  Consider now the effective mobility of the particle, which is the relationship  between changes in drift velocity,  )(Ev rrd and small changes in the electric field  ),( yx EEdE r  (or equivalently, the changes in drift velocity under an ambient field with  the application of a perturbation field ),( yx EEdE r ). Expressing  )(Ev rrd  in Cartesian  coordinates, taking partial derivatives and using the chain rule, it is found that in  general,     y y x x x x x dEE vdE E vdv ∂ ∂+∂ ∂=   (12)      y y y x x y y dEE v dE E v dv ∂ ∂+∂ ∂=   (13)  Using Equation (11) to evaluate (12) and (13) the following is obtained:    ⎥⎥⎦ ⎤ ⎢⎢⎣ ⎡ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛+⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ += yyxxxx dEE EE dE E E Ekdv 2   (14)      ⎥⎥⎦ ⎤ ⎢⎢⎣ ⎡ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ ++⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛= yyxyxy dEE E EdE E EE kdv 2   (15)  To simplify interpretation, consider the case where  0=yE such that  EEx = (i.e.  the x‐axis is aligned in the direction of the field).  In this case Equation (14) and (15)  become:  16    xx kEdEdv 2=   (16)      yy kEdEdv =   (17)  These relations demonstrate that the influence of perturbations to the electric  field on the particle velocity has a magnitude proportional to that of the ambient field,  whether the perturbing field is applied parallel or perpendicular to the ambient field. In  this particular velocity‐field relation (Equation (11)), if the perturbations are in the same  direction as the ambient value of the electric field they have twice the influence on the  velocity than if the perturbation is perpendicular.  This idea of field dependent mobility  and directional coupling can be intuitively seen if one recognizes the fact that the x‐ component of the velocity in Equation (11) contains a term proportional to Ey  (contained in E) and vice versa. In general then, an applied electric field has a direct  influence on the effective mobility, which is the ratio of change in velocity to change in  field.  This means that alternating fields, whether parallel or orthogonal to the driving  field, can cause a periodic change in effective mobility, which is necessary for SCODA.    To demonstrate this idea, consider the following simple example of two particles  with field‐dependent mobilities and electric fields applied in 2‐dimensions causing  convergent motion in one dimension. In Figure 2A, both particles experience a driving  electric field in the x‐direction, while particle 1 also feels a perturbing field in the y‐ direction. Because of the field dependant mobility of particle 1, the projection of its  movement along the x‐axis (red) is larger than that of particle 2 (black). Switching the  direction of the perturbing y‐field on particle 1 in Figure 2B causes the same increased    17 motion along the x‐axis for particle 1. In Figure 2C the periodic driving field reverses  direction, and the mobility perturbing field is applied to the right hand side of the  electrode pattern, so that particle 2 experiences a perturbing field in the y‐direction,  while particle 1 only experiences the driving field in the x‐direction. Figure 2D is the  completion of the cycle for particle 2, and as indicated by the red arrows, both particles  exhibit net motion towards the centre of the electric field region, even though the time  average of each of the driving and perturbing electric fields are zero. It is important to  note that if particles 1 and 2 did not exhibit mobility dependence on electric field, their  final location, following application of one cycle of the illustrated field pattern, would be  identical to the initial location, and no net drift would be produced.      18    Figure 2: SCODA Demonstration Sequence. Oscillating fields produce convergent drift along one axis.  Images A‐D illustrate the electric fields required to cause convergent motion along a single axis for  particles with field dependent mobilities. Both the driving field (Ex) and the perturbing field (Ey) are  periodic and individually time average to zero, yet net motion is produced towards a central location, free  of electrodes, when the fields act together on a particle.    To demonstrate SCODA motion in 2 dimensions in this medium, consider a plane  in which there is a uniform driving dipole field of magnitude Ed that rotates counter    19 clockwise at angular frequency ω, such that the field components are  ),( yxd EE=E r   and:    )cos( tEE dx ω=   (18)    )sin( tEE dy ω=   (19)  Substituting Equations (18) and (19) into Equations (14) and (15), and simplifying with  the aid of trigonometric identities, the following is obtained:    [ ]yxdx dEtdEtkEdv )2sin())2cos(3(2 ωω ++=   (20)    [ ]yxdy dEtdEtkEdv ))2cos(3()2sin(2 ωω −+=   (21)  It is important to note the frequency doubling that has occurred between Equations (18)  and (19) and Equations (20) and (21) because of the non‐linearity of Equation (11). In  particular, the squared terms of Ex and Ey in Equations (14) and (15) produce frequency  components that are the sum and difference of fields oscillating at frequency ω (namely  a constant term and a 2ω term).   20  Now, it is possible to design the perturbing field  xdE and  ydE to take the form of  a small quadrupole field that varies in a sinusoidal manner, in proportion to  )2cos( tω ,  with amplitude  qdE , and which scales in size (x, y), relative to the size of the gel (xg, yg) 3:    g qx x xtdEdE )2cos( ω−=   (22)    g qy y ytdEdE )2cos( ω=   (23)  The exact choice of this perturbing field is very important, for two reasons.  First,  the geometry of the field is intentionally radial, so that any net motion that results is  also radial. Second, the frequency is chosen at 2ω so that when it is multiplied (i.e. non‐ linearly mixed) in Equations (20) and (21), a frequency beating occurs as described  previously, and a constant term is produced from the difference of the two frequencies.  The generation of this constant term is critical to SCODA, as it does not time average to  zero and thus produces net motion.  This concept of non‐linear mixing of frequencies is similar to the idea of  heterodyning in electronics, where two signals are mixed to produce signals at new  frequencies, the sum and difference of the original frequencies. In the case of SCODA,  the rotating driving dipole field (Equations (18) and (19)) is naturally doubled in                                                             3 Note that while gel size enters this equation, it is only a scaling factor determining the size of the  quadrupole field, and can be though of as a field parameter rather than a gel parameter.    21 frequency because of the non‐linear velocity response to electric fields. The resulting  movement at the doubled frequency is then mixed with another field at the doubled  frequency to produce a constant velocity term. If Equation (11) were linear, Equations  (20) and (21) would contain no time dependent terms, and net motion would not be  produced.  Substituting Equations (22) and (23) into Equations (20) and (21) and taking the  time average, the following is obtained:    g qd x x xdEkEdv 4 −=   (24)    g qd y y ydEkEdv 4 −=   (25)  Summarizing in vector notation:    g qd r dEkE d rv rr 4 −=   (26)  This shows that for all positions, the time averaged drift velocity is in the direction  toward the center of the electrode pattern (origin), with speed proportional to the  mobility field dependence coefficient k, the strength of the rotating field Ed and the  strength of the perturbing quadrupole field dEq. Figure 3 shows the rotating fields in a  gel graphically, where electrodes to generate the fields would be placed along each  edge of the gel.  Thus, any molecules exhibiting a velocity relation as in Equation (11) contained  within the gel and field region would be focused to a central location. This is an  important result since similar concentration characteristics are not possible with DC  22  fields, as this would require an electric field with negative divergence, in violation of  Maxwell’s Equations for regions free of electrodes. It is possible to generate such  concentration with AC fields because of the breakdown of the superposition principle  due to the non‐linearity of Equation (11).   It should be noted that while the above calculation used a small perturbing  quadrupole field in order to allow for a differential calculation that can easily be solved  analytically, there is in reality no restriction that the quadrupole be comparatively small.   In fact, the ratio of dipole and quadrupole fields can be optimized to maximize SCODA  speed (see Section 4.2). Equation 26, then, is only strictly valid for small quadrupole  fields or towards the centre of the SCODA gel as the quadrupole field scales with radius.     Figure 3: Two Dimensional Rotating SCODA Fields. The straight arrow represents the rotating dipole field  rotating at frequency ω1 and the curved arrows represent the quadrupole field rotating at frequency 2ω1.  Electrodes are placed along the four edges of a gel to produce these fields.     The limiting radius of the concentrated spot described above can be estimated  from the Einstein‐Smoluchowski equation for diffusion with an applied drift velocity:    23   ( )),,(),,(),,(),,( 2 tyxCtyxvtyxCD t tyxC ⋅∇+∇=∂ ∂   (27)  Here, C(x,y,t) is the concentration of the molecule of interest, D is the diffusion constant  of the molecule, and v(x,y,t) is the velocity of the molecule. Converting to cylindrical  coordinates and using Equation (26) as the SCODA velocity we get:    ( )),(1 4 ),(1),( 2 trCr rrr dEkE r trCr rr D t trC g qd ∂ ∂ ⋅−⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ ∂ ∂ ∂ ∂=∂ ∂   (28)  Dimensional analysis of Equation (28) at equilibrium reveals a characteristic  radius (see Appendix B ‐ SCODA Theory):    qd g dEkE rD R ⋅∝ 4   (29)   Ed, dEq and rg are constants depending on the applied field and geometry, whereas D  and k are parameters particular to a molecular species. Re‐writing in terms of molecular  parameters only:    D kR ∝−1   (30)  Written in this way, Equation (30) predicts a molecule’s ability to focus; the larger the  value of k/D for a particular molecule, the stronger its response will be to the SCODA  focusing fields, and the smaller the concentrated spot. This is an important result, as it is  a fundamentally new molecular parameter for the separation of molecules. Because k is  an indicator of a molecule’s ability to interact with a given gel matrix and concentrate,  k/D is simply the ratio of that interaction to the molecule’s propensity to diffuse in the  gel.   24  To aid with visualization, SCODA concentration can be seen as an effective  radial  potential well for DNA, so that the addition of external fields or the variation of SCODA  parameters can be easily imagined as a change of shape in the potential. By calculating  the displacement of a SCODA focused spot from a DC field, the shape of the effective  potential can be shown to be (see Appendix B ‐ SCODA Theory):    ⎥⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢ ⎣ ⎡ −−⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ += S S S eff kk r k r k kqrP µ µµµµ µ 2 3 00 2 3 2 2 0 12243 2)(   (31)  Here, P(r) is the effective potential energy, r is the radial position, qeff is the effective  charge of the DNA, and μS is the “SCODA mobility”, equal to kEddEq/4rg. The potential  scales roughly as r3/2 and depends on both the SCODA and DC mobility of the molecule.  This may appear surprising initially, as the DC mobility of a molecule cancels out of the  SCODA velocity. But the SCODA potential describes a molecules ability to be retained by  SCODA focusing and its resistance to a perturbation, which is a DC effect. A Taylor  expansion of P(r) shows that as μ0 increases, P(r) goes to zero, as the DC mobility  overwhelms the SCODA focusing. And as expected, as k goes to zero, P(r) also goes to  zero (see Appendix B ‐ SCODA Theory). Also, using the first (r2) term of the Taylor  expansion and the Equipartition Theorem, the average focus radius can be shown to be:    qd g dEkE rD R ⋅= 4   (32)  the same as predicted by dimensional analysis (see Appendix B ‐ SCODA Theory).  In addition, the SCODA “force” can be calculated by taking the derivative of P(r):    25   ⎥⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢ ⎣ ⎡ −⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +−=−= kk r k q dr rdPrF SeffSCODA 24 )()( 0 2 1 2 2 0 µµµ   (33)  which gives an indication of the strength of the focusing mechanism at a given radius.  A non‐dimensionalized plot of Equations (31) and (33) (see Appendix B ‐ SCODA  Theory) is shown in Figure 4, showing the shape and relative slope (force) of the  potential. Near the centre, the force is smallest, indicating SCODA is most susceptible to  small variations in field in this area. Towards the edge of the gel, however, the force is  largest (slope of the potential is steepest) and SCODA drift most pronounced.    Figure 4: Dimensionless SCODA Potential Well and Force. Non‐dimensionalizing Equation (31) (see  Appendix B ‐ SCODA Theory) produces the attractive radial potential shown at left, which scales roughly  as r3/2. The dimensionless force equation (from Equation (33) is plotted at right.    The derivation of SCODA presented above is restricted to motion in a plane and  generates a column of focused DNA, but a similar technique could be applied to achieve  concentration in 3D.  This could be accomplished by either performing two‐dimensional  SCODA sequentially on three orthogonal planes, or by using electrodes lying in a  common plane to create the in‐plane focusing effect described above, and applying DC  26  voltages on electrodes above and below the centre of the plane to direct molecules that  lie outside the plane back toward it.  Such a DC field would cause a de‐focusing effect  with respect to movement within the plane, but this could be designed to be weaker  than the SCODA focusing effect, such that the net result would be focusing in all three  dimensions.    2.5 Significance of k/D  As described above, k/D is a fundamental new parameter for the separation of  molecules. Fortuitously, compared to other molecules DNA has an unusually large value  of this parameter in a separation matrix (see Section 3.1). Its long, charged nature  produces a field dependent mobility, k, while its large size produces a relatively small  value of D.   What makes this parameter especially unique is that unlike many DNA separation  methods that depend on the chemical properties of the molecules, k/D is dependent on  the physical properties of the molecules. Many other methods for DNA separation rely  on the chemical affinity of DNA to a solid matrix or beads (such as silica columns), which  fail when other molecules with similar chemical affinities are present or when  contaminants foul the binding surfaces. The physical method outlined here is not as  easily disrupted by contaminant molecules as chemical affinity between the DNA and  the gel matrix is not required for the SCODA effect.  While k/D is very large for DNA in general, it is dependent on buffer conditions  (see Section 5.4) and DNA length. It has been observed empirically that in most    27 conditions k increases with DNA size up to a critical size (which depends on gel and  buffer parameters as well as the DNA reptation regime), after which it begins to  decrease.  This behaviour is not well understood in the literature [1] and its investigation  is beyond the scope of this thesis.   It is also important to note for D that the Nernst‐Einstein relation for diffusion and  mobility     Q TkD B=µ   (34)  where Q is the total DNA charge, does not hold, except for very small DNA sizes and  very low field intensities. Instead, it has been shown that D increases with applied  electric field and is a weak function of DNA size, proportional to Q in most cases [1].     28  Chapter 3 Electrophoretic SCODA Concentration  To demonstrate SCODA experimentally with DNA, the electric field parameters  outlined in Equation 29 must be carefully controlled for the first order electrophoretic  motion to cancel and thus allow observation of this second order effect. In particular,  two important conditions must be met. The first is a molecule, gel and buffer  combination that produces a large k/D value to enable focusing, and the second is the  accurate generation of the SCODA fields to ensure zero DC electrophoretic bias.     3.1 Estimation of k/D   It is well known in the literature that DNA exhibits a strong non‐linear dependence  of its drift velocity on electric field (see Section 2.3) in agarose gel, producing non‐zero  values of k.  Diffusion constants are also well known to be small for DNA in gel  conditions (Section 2.3), implying that SCODA concentration is feasible, even though  exact values of k or D may not exist in the literature.  The best mechanism for measuring  k/D is likely SCODA itself (Equation (29)); however, an a priori estimate of k/D, and in  particular k, is important to be able to predict SCODA performance such as focus time,  and to estimate required parameters such as field intensity.   Measurement of k in a gel matrix is conceptually straightforward and can be  performed by applying a series of increasing electric fields to SYBR® Green I stained DNA  and tracking the motion visually under UV illumination. This measurement, however, is  complicated by the fact that DNA mobility in a gel is highly dependent on temperature  [28, 29], as both buffer viscosity, ζ, and diffusion (D) depend on temperature. Therefore    29 there is no simple linear dependence as predicted by the Einstein‐Smoluchowski  relation:    TkD B∝⋅ζ   (35)  To remove temperature effects from these experiments, multiple measurements of  displacements (distance relative to the previous location of the DNA) were taken at each  applied field, with each measurement starting at the same initial temperature. The  resulting displacement vs. time curve for each field was extrapolated back to zero time,  giving the displacement for the particular field with no temperature increase. Dividing  this number by the measurement interval gives a temperature corrected velocity for  each electric field. It should also be noted that the addition of SYBR® Green I likely  affects the DNA mobility compared to an unstained molecule.     30  Data Fit: v = 4.0E-12E2 + 1.3E-08E R2 = 0.9992 0.E+00 1.E-05 2.E-05 3.E-05 4.E-05 5.E-05 6.E-05 7.E-05 8.E-05 9.E-05 1.E-04 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Electric Field (V/m) Ve lo ci ty  (m /s )   Figure 5: DNA Velocity Response to Electric Fields. Measured velocity of pUC19 DNA (circular, 2.7kb) as a  function of electric field in 1% agarose and 1x TAE from a single experiment. The solid line is a quadratic  polynomial fit to the data and takes the form v = 1.3x10‐8 E + 4.0x10‐12 E2.     Measurements were taken for pUC19 plasmid DNA (2.7kb) in 1% Gold  Technicians Grade (GTG) agarose and 1X TAE over the electric field range shown in  Figure 5. The data shows excellent agreement to our approximation of velocity in  Equation (10), implying μ0=1.3x10‐8 m2/Vs and k=4.0x10‐12 m3/V2s. The estimated  literature value of D under these conditions is on the order of 4x10‐12 m2/s [30], which  gives a k/D value of ~1 m/V2.     31  After long times, Equation (28) reaches focus equilibrium in a Gaussian form and  the Full Width Half Maximum (FWHM) of the spot can be defined as (Appendix B ‐  SCODA Theory):     qd g FWHM dEkE Dr R )2ln(2 4=   (36)  This should be valid for all values of Ed and dEq as the focus spot is at the centre of the  gel. Plugging in the values for k/D and rg = 8.5 mm, and assuming a focus spot radius of  RFWHM = 100 μm, requires that EddEq = 4.7 x 106 V2/m2.  If Ed~dEq~E are taken to be  similar for simplicity, then E = ~2200 V/m is an estimate of the field required for  focusing, which is in the middle of measured range used to predict k (Figure 5).   Using these values for field and k, concentration time, tf, can also be estimated,  as follows:    ∫= gr R f drrv t )( 1   (37)  where v(r) is the velocity as a function of distance, r (Equation (26)), R is the radius of  the focused spot and rg is the outer radius of the gel and the location of the slowest  molecule to concentrate. If rg = 8.5 mm, tf solves to be 5.6x103 s, or ~90 minutes. This  estimate is likely incorrect however, as v(r) is only valid towards the centre of the gel  where the quadrupole field is small, but gives a reasonable order of magnitude estimate  of concentration time, indicating the electrophoretic SCODA should be observable in a  practical experiment.    32  3.2 Design of Focusing Fields  To simulate the electric fields described in Equations (18), (19), (22) and (23)  without the requirement for analog control of the voltages (which was not available at  the outset of this development), sinusoidal waveforms were approximated by discrete  potentials, as shown in Figure 6. Each full cycle of the sinusoidal voltage is approximated  by 12 discrete potentials, resulting in 12 distinct voltage patterns applied to four  electrodes (one on each side of the gel) during SCODA electrophoresis (Figure 6).   -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 0 3 6 9 12 Cos Discrete Cos   Figure 6: Realization of SCODA Fields. Left: Discrete approximation of sinusoidal voltages. Right: SCODA  gel and numbered electrode positions.  The gel width is 17 mm, and the electrodes are spaced outside the  gel at 25 mm to provide uniform field generation.    The uniform dipole field is generated by applying equal and opposite voltages at  opposite electrodes and zero voltages at adjacent electrodes. The quadrupole field is  generated by applying equal voltages at opposite electrodes, and opposite voltages at  adjacent electrodes. The resulting normalized fields are shown in Table 1. It is important  to note that the quadrupole field is rotating at twice the frequency of the dipole field,    33 and that the phase of the two fields is retained from Equations (18), (19), (22) and (23)  so as to ensure a focusing geometry.     Table 1: 12‐Step Normalized SCODA Voltages. Dipole and quadrupole voltages are normalized to 1 and  summed together to generate the total applied voltage. The sum voltage is applied to each electrode (1,  2, 3, 4) over 12 time steps to simulate sinusoidal SCODA voltages.      The fields shown in Table 1 can be simplified even further by reducing the  number of discrete steps used in the approximation of the sinusoidal potential.  The  most simplified reduction leads to a four step set of voltages, as shown in Table 2. The  dipole and quadruple voltages can be scaled in total amplitude and with respect to each  other to optimize SCODA focusing (see Section 4.2).         34  Table 2: 4‐Step Normalized SCODA Voltages. Dipole and quadrupole voltage approximations are  simplified from 12‐steps and represented in a 4‐step configuration, reducing the complexity of voltages  required for SCODA.       3.3 Demonstration of SCODA Concentration  The discrete four‐step electric fields described in Section 3.2 can be adjusted to  provide the necessary field requirements for focusing as described at the end of Section  3.1. Using a Finite Element Analysis (FEA) program (Comsol Multiphysics), both dipole  and quadrupole SCODA field components can be estimated in the SCODA gel, as shown  in Figure 7 and Figure 8 respectively. The applied voltages in these figures are +/‐1 V, so  that fields can be easily scaled to the required values. The SCODA gel is approximately  17 mm square.    35   Figure 7: Discrete Dipole Voltages and Fields Patterns. Top: Dipole voltage pattern, with voltage  indicated on colour scale bar. Bottom: Dipole field pattern, with the magnitude of the y‐component  indicated on the colour scale. Streamlines indicate direction of total field.   36    Figure 8: Discrete Quadrupole Voltages and Fields Patterns. Top: Quadrupole voltage pattern, with  voltage indicated on colour scale bar. Bottom: Quadrupole field pattern, with the magnitude of the y‐ component indicated on the colour scale. Streamlines indicate direction of total field.      37 Magnitudes of dipole and quadrupole fields for the given set of electrode  potentials in a 17mm gel can be estimated from Figure 7 and Figure 8. Figure 7  illustrates a dipole field that is not completely uniform (due to gel and electrode  geometry) but ranges in magnitude from 100 V/m to 150 V/m in the y‐direction. The  quadrupole field depicted in Figure 8 shows a maximum field value in the y‐direction of  about 150 V/m at the D (top) electrode. Scaling the dipole voltages by a factor of 57.3  and the quadrupole voltages by a factor of 32.7 (chosen from power supply limitations)  produces a dipole field of Ed = ~7200 V/m and a quadrupole field of dEq = ~4900 V/m.  The product of these two values does indeed meet the estimate for focusing outlined in  Equation (36). The applied voltages are shown in Table 3, where each set of voltages  were applied for 1 s, for a total rotational period of 4 s.    Table 3: Discrete 4‐Step SCODA Voltages. Dipole and quadrupole voltages are combined to produce  focusing fields. Voltages are scaled up to a 90 V power supply limit, and truncated to two decimal places.  The voltages on each electrode sum to zero over a full cycle.      The effect of these applied voltages is demonstrated in Figure 9. Plasmid  (pUC19) dsDNA is initially uniformly dispersed in an 1% agarose gel made with 0.25X TBE  and stained with SYBR® Green I. 0.25X TBE was chosen for its low conductivity and low  38  heat generation but adequate buffering capacity to maintain stable electrochemical  properties of the buffer and DNA over the course of a run. When the SCODA rotating  fields (Figure 9a) are applied, the DNA migrates toward the center of the gel where it  eventually reaches a tight Gaussian distributed focus of 750 μm in diameter after 60  minutes (Figure 9h). The radial asymmetry in the pattern formed during the first  minutes of focusing results from the fact that the fields applied to the gel are discrete  approximations (both in spatial geometry and in time) of the ideal dipole and  quadrupole fields. Additionally, the concentration factor of this process can be  estimated from the ratio of the area of the gel to the area of the focused spot, about  650.              39   Figure 9: SCODA Concentration Sequence. Time‐lapse sequence showing concentration of SYBR® Green I  stained pUC19 DNA (2.7 kb) from a homogeneous distribution of 0.2 ng/μL of DNA in 1% low melting  point agarose and 0.25X TBE, to a 750 μm diameter spot. Images are taken at 10 minute intervals, for a  total run time of 60 minutes. The concentration of DNA in the focused spot is estimated to be 100‐200  ng/μL. Image A: Diagram of dipole and quadrupole SCODA field lines. Images B‐H: SCODA duration B=0,  C=10, D=20, E=30, F=40, G=50, H=60 minutes.  Camera exposure is reduced to avoid saturation from  increasing fluorescence intensity over the course of concentration. Exposure times: B=1000, C=750,  D=250, E=50, F=50, G=10, H=10 ms. Image reprinted from [8].    From this experimental data, it is possible to estimate k/D in a number of ways,  including using Equation (37). Likely the most accurate measurement of k/D, however,  can be made from focus spot equilibrium, where the SCODA velocity equation is valid.  Using a spot FWHM radius of 375 μm and Equation (36), k/D solves to be 3.8x10‐2 m/V2,  which is two orders of magnitude smaller than k/D estimated in Section 3.1. Different  buffer conditions may contribute in part to the variation, but a more likely cause for this  discrepancy is that the constant D used in Section 3.1 does not account for the presence  40  of electric fields. During SCODA, the DNA gets entangled in the gel as it is driven by the  electric fields, leading to dispersion and spot broadening, much like the band  broadening seen in DC and capillary electrophoresis. This would cause an increase in D  and thus a decrease in k/D. Also, D is a function of electric field and resulting molecule  orientation, as mentioned in Section 2.5, probably adding to this variation. In addition, k  measured in Section 3.1 does not account for any of the DNA reorientation or varying  field geometry effects seen in SCODA. While DNA molecules are reorienting to new field  direction during SCODA, they are not reptating in a single direction and likely do not  exhibit the same field dependence on their mobility, thus exhibiting a different value of  k. Finally, Equation 36 is based on uniform electric fields, and does not account for the  weak off‐axis focusing seen in Figure 9, that results from discrete electrodes.    41 Chapter 4 Methods and Apparatus for a Practical Implementation of  SCODA  To observe the second‐order motive effect of SCODA focusing demonstrated in  Chapter 3, very exact experimental conditions are required, as illustrated by many early  failed attempts. In the end, SCODA was made possible by the robust design of a custom  instrument, so that repeatable, well‐controlled concentration conditions could be met.  In particular, very precise voltage generation and control at robust electrodes is  required, so that any first order DC effects from voltage do not overwhelm the SCODA  effect. In addition, SCODA field strength is limited by heat dissipation, so a gel  temperature regulation system is necessary to maintain gel integrity. Further to this, the  method of casting sample directly in the gel as outlined in Section 3.3 is not practical. As  a result, provisions were made for electrokinetic injection, where a gel is cast without  DNA. A sample is placed next to the gel and DNA and all negatively charged molecules  are directly injected (Section 4.4). To enable this, special injection electrodes are  required, as well as a gel boat that contains a sample chamber for injection. To maintain  consistent gel and buffering conditions, including temperature and pH, a custom gel  boat is required. Finally, for subsequent analysis, a mechanism for extraction of the  concentrated DNA is implemented.     42  4.1 Instrument Overview     Figure 10: SCODA Instrument Schematic. Shown in detail are the gel boat, electrode plate and  temperature control mechanism, housed in the front of the instrument. Power supplies and other  electronics are contained in the rear of the instrument for isolation from liquid samples and easy  connection to a control computer. The gel boat measures 22.6 cm by 16.5 cm in size. Figure reprinted  from [7]. Figure used with permission from the Journal of the Association for Laboratory Automation.    Gel Boat  The custom fabricated gel boats consist of a 5 mL injection chamber (60 mm  long, 7 mm deep and 12 mm wide), a concentration gel casting region, and a 15 mL  electrophoretic buffer reservoir for each of the four electrodes that generate the  rotating fields. The agarose concentration gel is 17 mm square by 6 mm deep, for a total  gel volume of 1.5 mL. The gel is cast in the same manner as a standard DC agarose gel: it  is poured in liquid form and is contained by four gel dams that are removed after the gel  has cooled and solidified. When diffusive extraction is used (Section 4.7.2) the gel is cast    43 with an acrylic cap and a tube to exclude gel from the central region, forming an  extraction well at the focus location.  Due to the electrophoretic nature of the SCODA process, the DNA focuses at the  geometric centre of the electrodes, rather than at the centre of the gel (assuming a  uniform conductivity in the gel). Successful DNA extraction thus requires repeatable  positioning between the gel boat and the electrodes. To enable this, the gel boat is  designed with locating holes so the boat can be repeatably referenced to the electrodes.   The gel and sample are prepared with the gel boat positioned on a working  surface at the front of the instrument. Once the gel boat is ready to run, it slides into a  channel in the working surface where it mates with the electrodes.  In between runs,  the gel boat is cleaned with commercial DNA‐contamination removal solutions (DNA‐ Away, Molecular BioProducts, San Diego, CA and DNAZap™, Ambion, Austin, TX) and  10% bleach solutions to prevent any cross‐sample contamination.  To allow DNA imaging under UV transillumination, the boat is made of UV  transparent acrylic, and gels are cast containing a 1X concentration of SYBR® Green I. As  DNA migrates through the gel, SYBR® Green binds to the DNA conferring a green  fluorescence to the DNA when illuminated with UV light.       Electrodes/Electrode Plate   Generation of rotating fields in the gel requires four electrodes surrounding the  gel as previously described. Electrodes are spaced 25 mm apart, which enables  generation of moderate electric fields (~100 V/cm) with the power supplies described  44  below. In addition, a DNA injection electrode must be mounted at the rear of the  sample chamber to allow injection into the concentration gel (Section 4.4). Feedback  electrodes are placed behind each source electrode to control voltage output and  monitor buffer level. The platinum electrodes are mounted to an electrode plate  consisting of a custom designed printed circuit board with locating pins that mate to the  gel boat for accurate positioning. The electrode plate is mounted to a vertical stage  which is lowered manually into the prepared gel boat.   The electrode plate is detachable from the vertical stage to allow cleaning  between runs. All materials on the electrode plate were tested for compatibility with  commercial DNA‐contamination removal solutions and bleach solutions.    Temperature Control  The limiting factor in the speed of the SCODA process is heat dissipation from  the electric fields and eventual melting of the agarose gel. To prevent this, a  temperature sensor is built into the electrode plate to provide real time monitoring of  the gel temperature, and, if necessary, to automatically decrease the electric current in  the gel (by decreasing the applied fields). Evaporative cooling is effected by a misting  nozzle which sprays a short burst of de‐ionized water on the top of the gel at a defined  time interval, providing fluid for evaporative heat dissipation aided by two small cooling  fans. Additional cooling is applied via a tap water cooled copper block incorporated into  the gel tray directly beneath the center of the gel boat.      45 Power Supplies  Voltages are applied at each of the four electrodes by custom high power  amplifiers, each capable of delivering +/‐ 90 V at 150 mA. The input signals to the  amplifiers are generated by a National Instruments data acquisition (DAQ) 6229 PCI card  (National Instruments, Austin, TX) connected to a PC (Pentium 4, 1 GB RAM). The  voltages generated at the electrodes are as described in Section 4.2.     User interface  A custom LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) program controls the  SCODA instrument via the National Instruments data acquisition card. The program  allows access to the high level functions of the instrument, selection of injection or  concentration modes, voltage scale (as a percentage of Table 5), injection voltage, total  run time, the maximum temperature the gel can sustain before the instrument shuts  off, the misting interval, and the use of cooling fans.   Additionally, the program provides feedback to the user, including voltage  tracking, errors in protocol and parameter selection, engagement of safety interlocks,  and gel temperature.     DNA Extraction Mechanism  The final element of the instrument is a DNA extraction mechanism. There are  two methods of extraction ‐ either in gel plug format or in buffer as described in Section  4.7. For extracting gel plugs (~20 µL in volume), an extraction mechanism is used  46  independently of the electrophoresis instrument by referencing to the gel boat using  the same locating holes used for the electrode plate. A 2‐axis micrometer stage (460A – XY, Newport, Irvine, CA) is used to precisely control the location of a guide through  which a stainless steel tube is moved to punch and extract the desired gel core.   Extraction in buffer is achieved by the addition of an acrylic cap that is placed on top of  the gel, reducing the thickness of the gel itself but creating a chamber for DNA  collection.    4.2 Electric Field Optimization  The SCODA fields described in Sections 2.4 and 3.2 and used for concentration in  Section 3.3 are not optimized for SCODA focusing. There are three main factors to  consider during optimization: concentration speed, heat generation, and voltage  magnitude. Optimization is driven towards highest concentration speed for a given  tolerable heat generation, as in most cases this is the practical limiting factor for SCODA  performance. Voltage magnitude is also a practical consideration, as lower required  voltages for a given concentration speed simplify the electronics design.  The relative instantaneous focusing velocity for 12 step and 4 step fields  (described in Table 1 and Table 2 respectively) can be calculated using Equations 14 and  15 discretely for each time step. Analysis shows that 4‐step fields have 1.5 times the  focusing velocity per time step compared to 12‐step fields. This is not surprising, as  careful inspection of the 12‐step fields reveals 4 time steps when there is no net motion  towards the centre of the gel, as the perturbing field has a magnitude of zero at these    47 times. This can also be understood in another way. As outlined at the end of Section 2.1,  the magnitude of the SCODA velocity depends on how many different oscillatory  components the driving and perturbing fields have in common. Since 12‐step fields are  closer in approximation to the ideal sine waves, they contain fewer low frequency  harmonics than the 4‐step fields, for a given frequency ω. It is likely then that the  increased velocity of 4‐step fields is a result of the coupling of higher frequency  harmonics (2ω, 4ω and so on) into SCODA. In hindsight, even if analog control of voltage  was initially available to produce the ideal sine waves, it would not have produced as  rapid focusing as 4‐step fields.  Heat generation is also compared for 4‐step and 12‐step fields at a common  focusing velocity (12‐step fields require higher voltages to accomplish this). As shown in  Section 4.5, heat generation or power dissipated in a gel is proportional to the square of  the applied voltage or electric field. Using this relation it can be seen that 4‐step fields  generate only 69% of the heat compared to the equivalent focusing velocity using 12‐ step fields.  From this analysis, it is clear that along with being simpler to implement, 4‐ step fields are faster for a given voltage and produce less waste heat compared to 12‐ step fields. As a result, 4‐step fields are used almost exclusively with SCODA, except in  early work, when 4‐step fields had not yet been developed.   For a maximum applied voltage, the ratio of the dipole to quadrupole (D/Q)  fields can be optimized. From the analysis in the previous paragraphs, the calculations  on instantaneous velocity and heat generation can be combined to give a relative  efficiency for each field type – SCODA velocity per power dissipation. For a D/Q ratio of  48  1, the 4‐step fields show 1.33 times better efficiency than the 12‐step fields (which are  shown in Table 4). Considering only the 4‐step fields, an optimization for efficiency  (Figure 11) shows that the ideal D/Q ratio is between 4 and 5. While the SCODA velocity  does increase past this point, it does so very slowly (it limits asymptotically) at the cost  of reduced efficiency. The tradeoff for such a large D/Q ratio is that the dipole fields is  large and thus generates a large rotational orbit for the DNA each cycle. The orbit size  scales with DNA velocity, so reducing the D/Q ratio to 1.75 (Table 5) drops the efficiency  to ~85% of the maximum efficiency, but reduces orbit size by more than 2.25. Reduced  orbit size leads to a tighter focus spot.  0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 2 4 6 8 10 12 D/Q Ratio Ef fic ie nc y (a u) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Ve lo ci ty  (a u) Efficiency Velocity   Figure 11: SCODA Field Optimization. By changing the dipole to quadrupole (D/Q) ratio, the SCODA fields  can be optimized for velocity and efficiency, where efficiency is defined as the velocity per dissipated  power, in arbitrary units. SCODA velocity asymptotically increases with D/Q, while this analysis predicts a  maximum efficiency at a D/Q between 4 and 5.        49 It should be noted that the while discrete fields were used for these calculations,  the equations used still did assume a small quadrupole field, and so these results are  likely only strictly valid towards the centre of the gel. In addition, the four electrodes  used to generate the fields were chosen out of simplicity, as the minimum required to  generate the dipole and quadrupole field patterns.  Standard voltage patterns are shown in Table 4 and Table 5, where the  maximum SCODA voltage is scaled to ‐90 V, the maximum supported by the power  supplies. Unless noted otherwise, all voltage patterns used in this thesis are specified as  a percentage of the 4‐step voltages shown in Table 5, at varying rotational periods.    Table 4: Maximum 12‐step SCODA Focusing Voltages. Power supply rails limit the maximum applied  voltage to 90 V, so all 12‐step voltages are scaled in relation to these voltages, which have a D/Q ratio of  1.      50  Table 5: Maximum 4‐step SCODA Focusing Voltages. Power supply rails limit the maximum applied  voltage to 90 V, so all 4‐step voltages are scaled in relation to these voltages, which have a D/Q ratio of  1.75.      4.3 Electric Field Generation  A practical limitation in creating the electric fields described in Section 4.2 is  developing four power supplies that can deliver the required voltage (in amplitude and  accuracy) and current to the SCODA electrodes. Amplifiers capable of delivering +/‐100  V and ~50 mA to a mainly resistive load are sufficient for generating fields that can be  tolerated in terms of heat dissipation for standard (0.25X – 2X TBE) conductivity gels.  This is an unusual region for electrical design, as most components are either high  voltage (>1 kV) and low current (<1 mA) or low voltage (<50 V) and high current (>1 A).  As a result, four custom amplifiers (one for each electrode) were built around Apex  Microtech PA86 op‐amp chips, capable of delivering +/‐90 V at 150 mA with a gain of 10.  Current monitors to measure output currents of each amp were implemented through  the use of a high voltage differential amplifier.    Successful and repeatable demonstration of the SCODA effect requires accurate  generation of voltages (and resulting electric fields), where the maximum tolerable ratio    51 of an unwanted DC bias to the applied SCODA fields can be estimated as (see Appendix  B ‐ SCODA Theory):    2 1 2 12 1 / 1000 1 Vm E E S DC <   (38)  For a typical SCODA experiment where ES is on the order of 5000 V/m, the maximum  tolerable DC field is the order of 25 V/m.  Based on the ~150 V/m fields produced by a 1  V dipole field (see Section 3.3), 25 V/m corresponds to a ~170 mV bias on any individual  electrode. Variations larger than this can cause disruptive perturbations to the focusing,  or eliminate focusing altogether. Maintaining this accuracy in the potential commanded  to each electrode requires active feedback.  Feedback electrodes, for monitoring the applied SCODA voltages, are placed  behind the source electrodes, out of the current path and beyond any ionic screening  layers induced in the buffer (Figure 12). This allows the system to monitor the actual  potential in the buffer, thus correcting for changing impedance of the source electrode  to buffer interface. Gas bubble formation on the source electrodes is a significant source  of voltage fluctuation in the buffer. The four source electrode voltages are monitored  through high impedance (10 MΩ) 1:10 voltage dividers, followed by low input bias  current voltage followers. The resulting voltages are sampled and digitized using a PCI  6229 DAQ card for software implementation of a control algorithm (LabVIEW).  52    Figure 12: Electrode Placement. Source electrodes are placed uniformly around the gel (shown as lines),  with voltage feedback electrodes (shown as white dots) placed behind them out of the current path. For  channel 1, the feedback electrode (electrode 1’) is also the electrode used for injection (see Section 4.4),  and placed behind the sample chamber. Image reprinted from [8].     The control algorithm used is a mixture of PID and feed‐forward control. During  SCODA focusing, there are four different voltage levels on each electrode. A PID control  loop runs for each level and electrode, for a total of 16 control loops. The PID values are  tuned for each loop, and a state machine switches between loops depending on the  field frequency, so that it appears to each loop that it is running continuously with a  steady state input. This provides accurate voltage tracking and very fast switching (160  ms total period) which is only limited by the speed of the LabVIEW software.  Further stability was added by applying a second set of feedback loops operating  on a slower timescale. These loops monitor the current sourced or sunk by each source  electrode, and over many field rotations make small adjustments in the applied voltages  to ensure the total current at each electrode integrates to zero. The combination of    53 these two feedback loops partly removes errors in the electric fields due to dynamic  fluctuations in the electrode‐buffer interface, and system conductivities.  This is critical  for efficient concentration in a reproducible location.  The aforementioned feedback loops cannot eliminate all errors in focusing,  however. The SCODA process focuses DNA to the electrical center of the applied field  patterns. While under ideal and symmetric conditions the electrical center of the field  pattern and the geometric centre of the electrodes are the same, this is not always true.  In cases where sustained asymmetries are present in the gel conductivity, or in the  buffer conductivities on one side of the gel versus the other, DNA focuses off the  geometric centre of the electrode pattern. This occurs because the electric “geometry”  of the gel is effectively distorted by changes in conductivity, which leads to changes in  electric field. In an area of increased conductivity, for example, electric fields are  decreased, so DNA transiting through such a region moves slower, creating an  unbalanced velocity profile with a shifted centre. This is equivalent to a conformal  mapping of the gel to a shape modified by conductivity changes. Voltage and current  feedback cannot account for these variations, as they are only able to correct for  dynamic errors.   One could imagine correcting for such asymmetries through a calibration and  applied DC bias, but such biases do not properly shift the focus location to the middle of  the gel, as indicated in Figure 13. The reason for this is that the systematic errors  described above are not a result of an unbalanced DC offset that would split molecules  based on size, but are a positional offset resulting from a geometric remapping of the  54  gel. To correct for these types of errors, the position of the entire focusing potential  must be shifted, which we refer to as an AC bias. This is of particular importance when  using diffusive extraction (see Section 4.7.2), when the focus must be constrained to a  fixed location. This is in contrast to gel plug extraction (Section 4.7.1), where any offsets  remaining after voltage and current feedback can be accounted for in the calibration of  the extraction location.    Figure 13: DC and AC Biases.  Graph A: SCODA potential, as a section across the gel. Graph B: Potential  due to a uniform DC field applied across the gel, resulting in an unbalanced force. Graph C: Superposition  of DC and SCODA potentials illustrates biased shift of focus location caused by a DC bias, compared to the  initial position (shown as a dotted line). Graph D: An AC bias shifts the position of entire potential, without  introducing asymmetries due to an unbalanced DC field.     55   To compensate for off‐centre focusing of this nature, voltages at the electrodes  can be adjusted in an AC manner that time averages to zero to shift the virtual position  of the electrodes (Figure 14). This is accomplished by applying a variable voltage at the  electrodes to make it appear as if the electrodes were in a different (virtual) location.  The magnitude of the variable AC bias voltage, ΔV, depends on the spot offset distance  Δx, the voltage on the real electrode V (the applied SCODA voltages), as well as  conductivity and geometric parameters, G, which can be determined by calibration.    GxVV ⋅∆⋅=∆   (39)        Figure 14: AC Bias Generation. By applying an offset voltage ΔV to the ideal voltage V on the SCODA  electrodes (black lines), SCODA fields can be generated as if the voltage V was generated by electrodes  56  offset by Δx (grey lines). This can be applied in both x and y directions so that focus offsets (Δx) can be  corrected back to the middle of the gel. The size of the correction possible is limited geometrically by  electrode placement and gel size.      AC bias shifting can be understood by considering the simple example of equal  resistors of value R connected in series, where the resistors represent the gel and the  point between them represents the geometric centre of the gel. If an oscillating voltage  of Vosin(ωt)  is applied at one resistor and ‐Vosin(ωt) is applied at the other, the voltage  between the two resistors will be zero, providing central focusing. If one of the resistor  values changes by ΔR, however, the voltage between the resistors is no longer zero and  the focus is shifted. To maintain the central voltage between the resistors at zero, the  magnitudes of the oscillating source voltages must be adjusted by adding VAC to the  sources. Solving for VAC gives a value of VAC = Vosin(ωt)(1‐2R/(2R+ ΔR)), which is an AC  waveform. Thus, an AC shift is required for proper correction of this change in  resistance.   Used in this way, AC biases remove systematic errors such as electrode screening,  and can be set for given conditions to provide central focusing.       4.4 Sample Injection  The concentration ratio achievable from the implementation shown in Section 3.3  is limited by the size of the gel relative to the size of the focus. The latter is a function of  molecular parameters and is independent of gel dimensions. Consequently, large    57 concentration factors could be achieved with a large gel, though such an  implementation has the drawbacks of being unwieldy and requiring the sample to be  cast in a gel, which is impractical for most applications. To avoid both these deficiencies,  it is possible to couple electrokinetic injection of the sample with a small SCODA  concentration gel. To do this, sample chambers are placed adjacent to the gel, and an  electric field is applied in the correct sense to drive all negatively charged particles,  including DNA and any contaminants, into the gel.  A major advantage of injection is the absence of fluid flow, allowing particulates  such as sand and soil to remain in the sample chamber without disrupting the system,  eliminating a fractionation step required in many alternate purification techniques  which would suffer from clogging or fouling of membranes as a result of the solids.  Allowing the solids to be subjected to injection fields improves the likelihood of  recovering valuable DNA that might have bound to the solid surfaces, and might have  otherwise been removed with the solids. Though in regular electrophoretic separation  solids in an injection well would adversely effect dispersion of the sample band during  injection, such dispersion is inherently counteracted during SCODA focusing and  therefore does not affect the performance of the concentration and separation.  Furthermore, contaminants transiting through the gel have not been found to interfere  with concentration and can be eventually cleared from the gel (see Section 5.2).  One downside to electrokinetic injection of sample is the potential for a very high  localized DNA or contaminant concentration as it enters the gel. This large local  concentration of charge carriers can affect the SCODA fields, as increased charge density  58  causes local changes in gel conductivity and distortions in electric field. If the charge  concentration is too large, this can inhibit concentration, reducing its speed or disabling  it all together. Hence there is an upper limit of DNA that can be loaded into a gel, which  is about 1 μg for the gels described in this thesis. One way around this limit is to perform  multiple injection and concentration steps, but this increases overall process time.   In the simplest implementation of electrokinetic injection, an aqueous sample is  placed in a reservoir adjoining one side of the SCODA gel (Figure 15) and a uniform  dipole DC electric field is applied across the sample and SCODA gel (from electrodes 1’  to 3 in Figure 15) to drive negatively charged molecules into the gel. Electrodes 1’ and 3  are 9 cm apart, so that 9 V applied on electrode 3 results in a 1 V/cm injection field.  Once injection is complete, rotating SCODA fields are applied to the gel, focusing  molecules with large values of k/D, while moving contaminant molecules with negligible  k/D values in circles (Figure 16). The injection method itself is doubly selective: by  applying an injection field of the correct sense, only negatively charged molecules are  injected into the gel; of these, molecules with large k/D are trapped and focused, while  low k/D molecules undergo no net motion.         59   Figure 15: SCODA Gel and Injection Chamber. SCODA gel boat for electrokinetic injection and  concentration shown with a 60 μg/mL humic acid sample in the injection chamber. As indicated in the  overlay, electrodes placed at locations 1’ and 3 allow for application of a DC electric field to inject  negative ions into the gel, where the rotating SCODA fields (applied at electrodes 1, 2, 3, and 4)  concentrate and trap molecules with a high ratio of k/D , while low k/D  molecules do not concentrate.  This allows selective trapping and concentration of nucleic acids in the center of the gel. During injection,  1 is a high impedance electrode used only to monitor voltage; current is sourced at 1’. Opposite  electrodes (1 and 3, 2 and 4) surrounding the SCODA gel are spaced 25 mm apart. Image reprinted from  [8].    Because it is important to recover as much DNA as possible from the sample,  injection conditions must be such that the sample chamber is depleted of DNA while not  driving the leading edge of the injected DNA band off the far side of the gel. This  requirement is often satisfied due to the fact that the mobility of DNA in aqueous (free)  solutions is in general at least an order of magnitude larger than the mobility of DNA in a  1% agarose gel [13], resulting in stacking of DNA as it enters the gel (seen in the first  frame of Figure 16). Figure 16 is a demonstration of this method with λ‐phage DNA. It is  60  noticeable from these images that the linear displacement of DNA in the gel during the  injection time is less than the distance from the focus location to the edge of the gel.  Consequently, under these conditions, and if large sample volumes and large  concentration factors are required, a user can deplete and concentrate DNA from one 5  mL sample then replace the sample with a second 5 mL sample and repeat the injection  while allowing the existing focus, which will drift during injection, to remain in the gel.  An additional concentration step will merge the two DNA injections, and the process can  be repeated indefinitely to accumulate more DNA into the focus region. With this  method, concentration factors are limited only by the process time, not by the gel  geometry, and factors over 10,000 have been demonstrated4. The concentration  enhancement factor from a single 5 mL injection to a 500 μm diameter focused spot of  DNA is ~4000.    Figure 16: Injection and Concentration Sequence. Time‐lapse sequence demonstrating injection and  concentration of 200 ng of SYBR® Green 1 stained pUC19 DNA. DNA is injected from 5 mL of 0.05X TBE  buffer into a 1% agarose gel made with 0.25X TBE buffer. Image A is taken after 10 minutes of injection at  20 V/cm, image B is taken after 10 minutes of subsequent SCODA concentration using the fields described                                                             4 Multiple injections were used in the Tar Sands work described in Section 7.2.    61 in Table 5. Images C and D are taken at incremental 20 minute SCODA concentration intervals for a total  run time of 60 minutes. Camera exposure: A=1000, B=500, C=100, D=20 ms. Image reprinted from [8].    In some instances, due to sample conditions, there is insufficient stacking to  recover all DNA from an injection, or to do multiple injections.  This can be addressed by  applying injection and SCODA fields simultaneously. As before, all negatively charged  molecules are injected into the gel. Molecules with large values of k/D will be trapped  and focused by the SCODA fields, while molecules with low k/D are pushed through the  gel and off the edge because the injection drift velocity (toward the far edge of the gel)  is not counteracted by the SCODA drift velocity (toward the gel center). To implement  this, electrode 1 is configured as a high impedance monitoring electrode to clamp the  SCODA potentials at that location by sensing the potential and sourcing the appropriate  current at electrode 1’ to create the desired potential at electrode 1. Since electrode 1 is  in direct contact with the DNA sample, this avoids damage to DNA that would occur if  current were sourced at electrode 1. Current is therefore only sourced at electrode 1’ to  produce both injection and SCODA fields.   One drawback to this method is that larger voltages are required at 1’ to  generate the correct voltage at electrode 1, and these voltages depend on the  conductivity of the sample. Another drawback of simultaneous injection and focusing is  that the sustained DC injection field generates a drift velocity that counteracts SCODA in  one axis, pushing the focus spot off centre, and in some cases splitting into multiple foci  in the direction of the injection field. As this is a result of the DC injection drift velocity  working against the SCODA drift velocity, molecules in the gel will separate based on  62  their ratio of k/μ (SCODA/DC velocities). This can be advantageous for selective  separation of molecules, but must be controlled so molecules of interest are not washed  off the edge of the gel with a large injection field.  Despite the ability to perform simultaneous injection and concentration, dipole  injection still has several disadvantages. The first is that both molecules of interest and  contaminants are injected across the centre of the gel where the sample is collected.  This can lead to increased contamination, depending on the extraction mechanism used  (see Section 4.7).   Another disadvantage is that injection time can be very long.  In this method,  where the injection volume is fixed, injection speed is limited by the cross sectional area  of the gel available to for injection and current flow (Appendix B ‐ SCODA Theory).  Injection speed is also limited by the electric field seen by the sample. If a sample is  more conductive than the gel, a larger fraction of the voltage is dropped across the gel  and less across the sample than if the two conductivities were equal. This causes slower  migration of the molecules in the sample chamber, and also poor stacking as molecules  accelerate when entering the higher electric field in the gel.  It can be easily shown  (Appendix B ‐ SCODA Theory) that the time for depletion of all DNA from the sample  chamber scales as    Maxs s i I t µ σΨ∝   (40)  where Ψ is the volume of the sample chamber, σs is the conductivity of the sample, μs is  the mobility of the DNA in the sample, and IMax is the maximum current through the    63 sample and gel (generating the electric field), limited by the maximum temperature the  gel can withstand. Depletion time varies with Ψσs, but for a given sample the product of  Ψσs is constant, regardless of whether a sample is diluted to multiple lower conductivity  samples. μs is also constant for a given sample, so injection is fundamentally limited  thermally by IMax.  The parameters for a complete injection with no loss can be estimated by  requiring that the time it takes for DNA to move the length of the gel (tg) be longer than  the time it takes for the DNA to move the length of the sample chamber (ti), or tg > ti  Writing in terms of gel and sample chamber dimensions, conductivities and applied  voltage, one gets a non‐dimensional expression of the form    '1 V m c m c >⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ +⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ − µ   (41)  where c is the relative conductivity between the gel and sample (σg/σs), m is the ratio of  the length of the sample chamber to the length of the gel (ds/dg), μ is the relative  mobility of the DNA in the gel compared to sample (μ0/μs) and V’ is the scaled applied  voltage, kV/μsdb = kAV/μΨ where A is the cross‐sectional area of the sample chamber  and gel (Appendix B ‐ SCODA Theory). From this relation it is clear that for a given  sample volume and conductivity, parameters can be optimized for a complete injection,  although this is often thwarted by geometry constraints, samples containing species  with varied mobilities, and practical limitations in conductivities.   In general, for the best injections, the above relation motivates the choice of large  c, small m, μ and small applied voltage V. m is limited geometrically in the system  64  presented here to 3, and V can be easily changed. μ can be decreased by lowering μ0,  achieved by increasing the density of the gel, which however trades off with SCODA  concentration speed (see Figure 26). Finally, c can be increased by increasing the  conductivity of the gel in relation to the buffer, or decreasing the sample conductivity.  The former can cause heat dissipation limitations, during both injection and SCODA, an  issue which is addressed in the following section.    4.5 Gel Temperature Regulation  Heat dissipation is the largest limiting factor on the speed of SCODA injection and  concentration: it puts an upper limit on the maximum field that can be applied to a gel  of given conductivity before the gel will melt or boil (depending on matrix type). This  maximum field is the main parameter limiting the speed of the concentration process.   Agarose gels typically melt or become deformed beyond use between 30 – 50 oC  depending on the type, so gel temperature must be regulated to below this range.  Other gel matrices such as polyacrylamide can be used which have much higher melting  temperatures (above the boiling point of the buffer), but this has limitations, as circular  fragments and large DNA will not migrate well in such gels [13].  Power P dissipated in the gel scales as:    ggVEP σ2∝   (42)  where E is the applied electric field, σg is the conductivity of the gel, and Vg is the gel  volume. In the instrument presented here, where injection is limited by power supply  voltage range, heat dissipation is of concern mainly during SCODA concentration, rather    65 than injection. As a result of the process driving SCODA (Equation 26), the required heat  dissipation increases quadratically with increased field, but increases linearly with  SCODA velocity. Reducing gel volume and buffer conductivity help with reducing heat  generation, but can reduce injection speed dramatically (see Section 4.4). Ultimately,  performance improvements are most likely achieved by increased ability to extract heat  from the SCODA gel.  Heat extraction is limited by the thermal conductivity of the edges (sides and  bottom) of the gel boat, and by the thermal conductivity of the gel itself, especially if  the gel is thick. The instrument described in this thesis is cooled in two ways. A tap‐ water‐cooled copper block is situated underneath the gel region of the gel boat with a  thermally conductive pad to provide good thermal contact. When the top of the gel is  exposed (i.e. when diffusive extraction is not in use – Section 4.7.2), a misting nozzle  along with airflow is used to provide evaporative cooling as well as maintain hydration  of the gel. A small temperature sensor contacts the top of the gel and is monitored by  the software to ensure electric fields are reduced if melting is imminent.   A separate concern with heat dissipation from SCODA arises due to the fact that  molecule mobility is a function of temperature (Equation 35 and [28]), and dynamic  temperature oscillations from the applied fields can cause coupling with the SCODA  effect. Heat generation in SCODA is not uniform within the gel, but is greatest at  locations of largest field, and oscillates in time. These oscillations can significantly  impact SCODA concentration, depending on the phase and amplitude of the oscillations  with respect to the SCODA fields. If the oscillations are large and out of phase with the  66  mobility altering quadrupole field, they can reduce the effective non‐linearity of a  molecule which can cancel or distort the SCODA effect such that concentration becomes  very non‐uniform or does not occur at all. Put another way, if a temperature oscillation  is high at the same time and place that the quadrupole field strength is low, increasing a  molecule’s velocity when it should be small, the spatially modulated mobility alterations  required for SCODA are distorted.  As shown in Figure 17, temperature oscillations and relative phase due to  application of 30% of the SCODA voltages shown in Table 5 were measured in a 6mm  thick 1% agarose gel in 0.25X TBE as a function of SCODA period. At short periods, the  temperature oscillations are small compared to those at very long periods. This is  expected from a system with thermal mass that behaves inherently as a low pass filter  for driven thermal oscillation. Small oscillations, regardless of their phase, have little  effect on molecule mobility and SCODA concentration, explaining why this effect is not  seen at our standard 4 s field periods. The effect has been noticed empirically at larger  periods (above ~16 s for the conditions described in this experiment), where the  temperature oscillations are larger (~0.5 oC), and significantly out of phase with the  quadrupole field (Figure 17). In this regime, irregular SCODA focusing is observed, and in  some cases focusing does not occur at all.   At very large periods (above ~100 s), regular focusing patterns are again  observed. In this case, the temperature oscillations are largest (~2 oC, as the gel achieves  steady state before each field amplitude change) but the oscillations are in phase with  the quadrupole field, so that the mobility change due to temperature assists the SCODA    67 concentration. This thermal effect also changes the mobility of contaminant species,  however, possibly resulting in a weak non‐specific concentration of contaminants.  However, the estimate of final focus size on k/D, assumes that the electrophoretic orbit  size of the DNA is much smaller than the spot size. Thus when using very large periods,  spot size is limited by the radius of the DNA orbit. In general, this regime should be  avoided.     -20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 0 50 100 150 200 250 300 Period (s) Te m pe ra tu re  (d B) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 50 100 150 200 250 300 Period (s) Ph as e (d eg )   Figure 17: Temperature Oscillations vs. SCODA Period. Top: Normalized temperature (dB) oscillations  between electrodes 1 and 4, measured at the top of a 1% agarose gel in 0.25X TBE at a 30% SCODA field,  for varying SCODA periods. Oscillations are normalized to 2 oC oscillations seen at 240 s period. Bottom:  Phase lag of temperature oscillations relative to applied electric fields, for varying SCODA periods.  68    From this brief analysis, it is clear that there are certain regions of the SCODA  parameter space where dynamic temperature effects inhibit SCODA concentration. The  size and phase of the thermal oscillations, and thus the different operating regimes,  depend on total heat dissipation, which depends on the thickness of the gel, the gel  boat material, and the external heat extraction mechanisms. The effect is also a function  of electric field magnitude, as well as buffer conductivity. For very thin gels with good  heat dissipation, temperature oscillations are likely irrelevant regardless of field and  buffer conditions. For thicker gels however, empirically selecting a field magnitude and  period for a given sample and buffer concentration that minimizes out‐of‐phase thermal  effects is very important.    4.6 Electrode and Gel Boat Design  The design of the source and feedback electrodes for SCODA is guided by several  considerations, the main ones being chemical inertness and mitigation of hydrolysis. To  provide chemical inertness all electrodes are made of platinum. Because hydrolysis and  bubble formation increase with total current, source electrodes should have the highest  possible surface area to reduce the surface density of these processes. To achieve this,  multiple platinum posts (1 mm in diameter) at equal potentials are used, providing a  large surface area and even field distribution as well as space for fluid flow. Feedback  electrodes however are connected to high impedance circuits and are designed to  conduct very little current to minimize electrochemistry. Consequently, they do not    69 require large surface areas, and are made from small diameter (0.5 mm) platinum wire  so that they minimize field disruptions and the resulting hydrolysis that could occur. If  the feedback electrodes are too large in diameter, the voltage drop across the electrode  from the applied fields causes a field gradient that can disrupt the desired field and also  cause hydrolysis. Since the feedback electrodes are out of the current path during  SCODA, this is only a concern during injection. For a standard injection field of 10 V/cm,  a 0.5 mm diameter electrode results in a 0.5 V drop across the electrode, which is below  the 830 mV reduction potential of water at which hydrolysis  begins to occur.  The gel boat contains large buffer reservoirs (~15 mL) to provide an adequate  reservoir of ions, in order to maintain a stable buffer pH in conditions of high current  flow (and subsequent hydrolysis at the electrodes). The SCODA concentration fields are  symmetric and should not generate a net time‐averaged current at the source  electrodes, but during very long SCODA field periods or during application of DC  injection or bias voltages applied, buffer chambers must be able to withstand significant  charge depletion. If pH changes too much in any one chamber, the electrochemical  properties of the system (and of the target molecules and contaminants) can be altered  dramatically and disrupt focusing. For 0.25X TBE buffer, we have experimentally  estimated that the buffer can withstand 0.6 C/mL (assuming uniform mixing) of charge  depletion before the current it is able to supply drops off sharply. This corresponds to 8  C for 15 mL buffer reservoirs, and about 30 minutes of injection at a typical current of 5  mA.  70  Gel geometry is driven by several competing design factors, generally related to  the speed of the injection and concentration process. One of the fixed constraints is the  injection sample volume of 5 mL, set so the instrument is able to accept a large range of  samples. As shown in Section 4.4, dipole injection speed scales with sample volume,  with the optimum depending on many parameters. In general this optimization drives  the system toward large injection surface area and a large gel width. Physical limitations  on space and voltage to generate adequate electric fields drive toward a smaller gel  width, which thus motivates a thick gel to maintain the large surface area.  Thick gels  have poor heat dissipation however (heat dissipation increases with surface area to  volume ratio), which pushes the optimization towards thinner gels. The ideal gel  geometry is sample dependent, but a reasonable compromise can be made between  these competing factors by using a 17 mm by 17 mm gel footprint with variable height  (and where sample volume scales with gel height). Finally, the shape of the gel is  designed to minimize unnecessary regions of high electric field, by minimizing sharp  edges (Figure 18).            71   Figure 18: SCODA Gel Geometry. The SCODA gel is 17 mm by 17 mm, with electrodes placed along each  edge. The gel is shown with the total electric field generated from voltages described in Table 5. Edges  between electrodes are chamfered to minimize unnecessary regions of high electric field (noticeable as  yellow spots at the corners). Ideally the edges would be rounded, but these gel boats were made before  we had the capacity to fabricate those types of rounded edges.    4.7 DNA Extraction   For SCODA concentration to be most useful, DNA must be extracted after  concentration. To maintain the concentration, purity and efficiency advantages of the  SCODA process, the extraction method must minimize extraction volume, while  maintaining high recovery and rejection of contaminants. Two methods of extraction  are presented here.  72  4.7.1 Gel Plug Extraction  The simplest method of DNA extraction is the removal of the DNA column in a  gel plug. This is accomplished after SCODA concentration with the use of a precision 2‐ axis stage with micrometers that can be repeatably indexed above the gel boat. The  stage contains a mechanism for sliding stainless steel tubes of varying diameters into  the centre of the gel at a known position to punch out and extract the gel plug.  Calibration of the extraction mechanism is performed through a control run using the  desired run conditions (fields, gel concentration, buffer conductivity, sample type etc.)  with nucleic acid staining dye (SYBR® Green). Following this calibration, the extraction  mechanism can be used to repeatably extract DNA that has not been stained, as the  feedback mechanisms described in Section 4.3 provide reproducible focusing. Unless  indicated otherwise, all extractions described in this thesis are accomplished in this  manner.  This method has the advantage of being very efficient, as a capillary size can be  chosen to capture all visible DNA (large enough so the Guassian spot distribution has  tailed off sufficiently).  Conversely it also allows the choice of recovery of only the high  concentration region of the sample, as a small diameter capillary can be used that just  surrounds the largest portion of the Guassian DNA distribution.   A downside of this technique is that it is only possible in agarose or other gels  that are easily severed and subsequently melted or digested, and as such is not practical  in polyacrylamide. Another downside is of course the fact that the DNA is contained in  gel, thus limiting the utility of the recovered product for certain applications. Successful    73 downstream use of DNA directly from agarose plugs has been shown in DC gel analysis  (see  Figure 28 as an example) as well as in PCR amplification (see Sections 5.1 and 5.2),  but these methods involve dilution and melting of the agarose into larger volumes. The  contamination due to the agarose itself can pose problems for some downstream  processing, especially if high efficiency recovery and concentration is required. Agarase  digestion of the agarose into buffer removes the gel matrix, but introduces some losses  and reduces the final concentration of the recovered DNA.    4.7.2 Diffusive Extraction  Some of the problems associated with gel plug extraction can be solved with the  implementation of diffusive extraction. This method consists of casting a SCODA gel with  a small hole in the central region, and filling the hole with buffer. Concentration then  proceeds as normal, except the DNA is now collected directly in buffer in the central  region. This scheme is shown in Figure 19, with grey representing agarose gel and blue  representing buffer.      Figure 19: Diffusive Extraction in SCODA. A cross section of SCODA focusing performed in an agarose gel  (grey) with a hole filled with buffer (blue) at the central focus location.  74    During SCODA focusing, nucleic acids are subject to a net drift velocity towards  the centre of the gel, until they cross the gel‐buffer interface.  Once in buffer, they no  longer feel the SCODA concentration effect as their mobility is no longer field  dependent.  The dominant effect is now diffusion, and the nucleic acids will begin to  diffuse outwards from the buffer hole, back into the gel.  Eventually, equilibrium is  reached between diffusion and SCODA concentration effects, leaving some nucleic acids  in the gel (Figure 20), which is undesirable if high yield in the liquid phase is required.     Figure 20: Diffusive Extraction Losses during SCODA. Diffusive extraction implemented in an early SCODA  version 20 mm by 20 mm SCODA gel. Ethidium Bromide stained DNA in orange shows the equilibrium  between SCODA and diffusion – there is DNA visible in the central buffer reservoir, but DNA also remains  in the gel around the edge of the extraction reservoir.       75 Aside from yield, the diffusive extraction method has several other inherent  disadvantages. The first is that the focus location must now always be positioned in  reference to the extraction well. This can be solved by simply using a large extraction  reservoir, with the obvious downside of low extraction concentration. Alternatively, the  SCODA focus can be centered with the addition of AC biases to the field (described in  Section 4.3), but this adds both complexity and a calibration step to the process. Other  disadvantages to this method include the fact that as soon as molecules enter the  central region, SCODA is no longer active, because k drops to zero. This makes it more  difficult to remove contaminants from this region, as molecules are no longer  differentiable based on k/D.   Finally, since the mobility of DNA in buffer is roughly 10 times larger than in a 1%  agarose gel [13], the SCODA field magnitude and frequency must be chosen so that the  DNA does not leave the central well during the course of a field rotation. For fastest  focusing, this can be applied only at the end of the run when DNA containment is most  important for recovery.  The yield of diffusive extraction can be improved by extending the central buffer  region in the vertical direction, into a chamber which sits above the gel.  Figure 21  shows a schematic cross‐section of this layout – the agarose gel is grey, while buffer is  blue.  A machined plastic piece is used to form the upper chamber, and is shown here in  orange. In this method, nucleic acids are still driven into the buffer‐filled hole in the  centre of the gel as a result of the SCODA fields, and have some probability of diffusion  back into the gel.  They key difference is that diffusion can also occur upwards into the  76  chamber above, reducing the overall concentration of the liquid sample in contact with  the gel, and thus skewing the final equilibrium toward a  greater percentage of the  target molecules being present in the liquid.      Figure 21: Improved Diffusive Extraction. A cross‐section of improved diffusive extraction into a central  fluid reservoir. Extraction is improved by extending the reservoir in the vertical dimension to inhibit  diffusion back into the SCODA gel.    In other words, while diffusive equilibrium is still reached between the DNA in  the buffer and the gel, the concentration of the DNA in the buffer is decreased by the  extra available volume, without requiring an increase in the hole diameter (which would  increase the surface area of the gel available for diffusion of target back into the gel).  This is desirable to increase extraction efficiency, as it decreases the amount of nucleic  acid contained within the agarose gel, and increases the amount of nucleic acid that can  be extracted in the buffer. This method is demonstrated in Figure 22 where DNA is  injected, focused, and removed from the central hole, with improved extraction over  the previous method. In addition, larger amounts of DNA are now tolerated in the gel,    77 as concentrated DNA can move out of the plane of the gel and into the diffusive  extraction chamber.      Figure 22: Diffusive Extraction Sequence. UV‐excited images of stained DNA in a diffusive extraction  setup, being (A) injected and (B) concentrated to a central fluid reservoir.  Image (C) was taken after the  buffer was removed from the central reservoir, with dramatically reduced residual DNA remaining in the  gel. White scale bar in image (A) is 1 cm.    The main drawback of this improved method is the DNA is now recovered in an  increased volume due to the buffer above the gel. For many applications this is  acceptable, except when high concentration factors are required. Another drawback to  this method is that the diffusion time of DNA across the gel height (~1 mm) of the buffer  78  column is often longer than the run time5, so external mixing is required to take  advantage of the increased diffusion volume.                                                             5 The diffusion coefficient of 10 kb DNA in buffer is ~10‐7 cm2/s [31] and yields a diffusion time of ~5 hrs  across 1 mm.    79 Chapter 5 SCODA performance in DNA extraction and purification  As outlined in Sections 2.4 and 2.5, k/D is a new, fundamental molecular separation  parameter, unique to the electrophoretic SCODA process. The physical significance of  this parameter is described previously, and should exhibit a high selectivity for DNA. This  chapter characterizes the performance and selectivity of k/D as a molecular selection  parameter.    5.1 Efficiency and Sensitivity  The physical nature of the SCODA process leads to some significant advantages,  one of which is that concentration and selectivity do not require reversible binding to a  matrix. Such binding in other methods is not always very efficient or fully reversible,  leading to low yields, particularly at low molecule concentrations.   The efficiency of electrokinetic injection coupled with SCODA was measured using  QRT PCR (Quantitative Real‐Time PCR) on purified samples. 1 ng of circular ΦX174  dsDNA (5,386 bp) was diluted in 5 mL of 0.05X TBE (56fM) and applied to the SCODA  injection chamber. The DNA was injected at 20 V/cm for 45 minutes into a 1% low  melting point agarose gel made with 0.25X TBE and concentrated with a 4 s rotational  period at 100% voltage for 2.5 hours without stain to a predetermined focus location.  From there it was removed in a ~20 µL agarose plug. The agarose plug was melted and  diluted to three times its volume with dH20 before being divided into 5 µL aliquots and  inserted (in duplicate) into a QRT PCR reaction using TaqMan (Applied Biosystems, part  no. 4304437) chemistry, as per the manufacturers instructions (see Appendix C –  80  Materials and Methods). 10 fold and 100 fold dilutions of the SCODA sample were also  quantified in duplicate. SCODA purified samples were compared to a standard curve and  to aliquots of the SCODA input sample, from which efficiency was calculated in three  separate runs. The efficiency of injection and SCODA concentration is 91% with a  standard deviation of 28% for extraction from 56 fM (2 x 10‐4 ng/μL) DNA in buffer.  Variation in SCODA efficiencies comes in part from variation in quantification from the  QRT PCR assay.   SCODA concentration efficiency remains high when working with very few target  molecules. We tested SCODA’s ability to recover DNA from 1.72 x 108 molecules on  input (56 fM when diluted to 5 mL) down to 172 molecules (56 zM when diluted to 5  mL, or ~35 molecules per mL). In these experiments, serial dilutions of ΦX174 dsDNA in  buffer were diluted to 5 mL and applied to the SCODA sample chamber, injected and  concentrated as in the efficiency experiments, then extracted in ~20 μL gel cores.  The  agarose plug was melted and diluted to three times its volume with dH20 before being  divided into 5 µL aliquots and inserted (in duplicate) into a QRT PCR reaction using  TaqMan (Applied Biosystems, part no. 4304437) chemistry (Appendix C – Materials and  Methods). 10 fold and 100 fold dilutions of the SCODA sample were also quantified in  duplicate. SCODA purified samples were compared to a standard curve and to aliquots  of the SCODA input sample, from which successful amplification was determined.  Each  data point was assayed in triplicate. 100% of the purified samples, from 1.72 x 108  molecules down to 172 molecules input (56 zM), amplified successfully. 172 molecules  is the lower limit on detection, because assuming 100% SCODA recovery, only about 10    81 molecules enter the PCR reaction after dilution. This is a statistically reliable limit for  PCR detection, because the statistical noise (~101/2) is still larger than the sample size.  Zero molecule controls as input to SCODA produced no amplification.      5.2 Selectivity and Contaminant Rejection  As described in Section 2.4, SCODA actively selects molecules in proportion to k/D.  All negatively charged molecules are injected into the gel, and large k/D molecules are  focused. Small k/D molecules move in response to the SCODA fields, but undergo little  or no net motion, and so remain in the gel unless actively rejected. Because of the radial  geometry of the SCODA velocity pattern, distinguishing between molecules with  different values of k/D is only possible by differentiation based on focused spot size, or  by run length, both of which are poor mechanisms because of spot overlap and the  small size of the SCODA gel.   Molecules with varied values of k/D can be actively rejected or separated by  superimposing a static DC electrophoretic “washing” field over top of the rotating  SCODA fields. This happens automatically when doing simultaneous injection and  concentration, as the injection field continues through the gel and serves as the washing  field.   Alternatively, during regular SCODA, a bias can be applied back towards the  injection chamber so that contaminants are washed out of the gel towards where they  originated from. A washing field is applied by adding V volts to electrode 1 and V/2 volts  82  to electrodes 2 and 4 and 0 volts at electrode 3 to generate a uniform field. This process  is performed by emptying the sample chamber once injection is completed, replacing  the sample with running buffer, and continuing the focusing process with the small DC  bias field applied in the opposite direction of the injection field. The DC bias  electrophoretically pushes low k/D molecules that co‐injected with the DNA, back out of  the gel to the anode buffer chamber, resulting in clearance of contaminants while the  DNA is held in the gel by the concentration fields (Figure 23).    Figure 23: Electrophoretic Washing. Time‐lapse sequence showing dispersion and removal of  contaminants (brown) concurrently with concentration of the desired nucleic acids. Scale bar is 1 cm.  Images are a continuation of the experiment shown in Figure 15, where 200 ng of pUC19 DNA was spiked  into a 60 μg/mL humic acid solution, injected, and concentrated with superimposed electrophoretic  washing.  The increasing clarity of the gel indicates that the negatively charged humic acid contaminants  are migrating out of the gel under the applied fields. A‐C: Visible light images showing decreasing humic  acid (brown stain) contamination of the gel, A=following 20 minutes of DC injection, B= following  additional 10 minutes of SCODA concentration with DC field applied to wash contaminants from the gel,  C=following an additional 50 minutes of concentration with DC field. D: UV‐transilluminated image (100  ms exposure) taken at the same time point as image C (80 minutes total elapsed time), in which stained  DNA is clearly visible in the center of the gel.  Image reprinted from [8].      83 The addition of a washing field imposes a second drift velocity in the SCODA  system, so that molecules find a new equilibrium where the SCODA drift balances the  drift from the DC field, roughly according to the ratio of k/μ. The ratio of SCODA and  washing field can be adjusted so that contaminants are pushed off the side of the gel  and DNA is retained within the gel, often split into a number of focus spots depending  on the number of different DNA species in the gel. Once contaminants are washed off  the gel (a good estimate is to keep the product of electric field and time equal for both  injection and washing), focused spots can be extracted individually (this is useful for  discrimination of very select fragments) or focusing can proceed without the washing  field to return all DNA to the centre of the gel. This technique is demonstrated with the  specific contaminants described in the next sections.     5.2.1 Humic Acids  Using electrophoretic washing, SCODA’s ability to reject humic acids, a common  contaminant in environmental samples known to inhibit PCR and other molecular  biological methods [3], has quantitatively been demonstrated by comparing SCODA’s  performance to that of existing technologies (Figure 24). All samples contained a fixed  amount of DNA (2 ng) with increasing mass of humic acid as indicated Figure 24. DNA  extraction performance is therefore compared based on mass ratio of DNA to humic  acids, to account for the different input volumes of the other methods, and the  possibility of dilution or concentration prior to sample extraction.   84    Figure 24: Humic Acid Contaminant Rejection. Success of PCR amplification of 2 ng samples of ABI  Quantifiler Human DNA Standard containing increasing humic acid mass (horizontal axis, logarithmic  scale), after extraction with silica column, magnetic bead and SCODA purification methods. The 50%  cutoff for SCODA is beyond the range of humic acid concentrations that could be mixed from  commercially available humic acid stocks. Projected performance of SCODA in humic acid rejection is at  least 100 fold better than the next commercially available method that is not specifically designed to  reject humic acids. Multiple experiments were performed at each data point, as indicated in the text.  Image reprinted from [8].    To test for humic acid rejection, we spiked dH20 samples containing 2 ng of DNA  (Applied Biosystems, Quantifiler Human DNA Standard, part no. 4343895) with  increasing masses (see Figure 24) of humic acids (Sigma Aldrich, part no. H16752) and    85 purified these samples with Qiagen (QIAquick PCR Purification Kit, part no. 28104),  Promega (DNAiq DNA Isolation System, part no. TB297, using manufacturer’s DNA  Isolation from Liquid Blood protocol), and SCODA technologies. Qiagen and Promega  samples were processed as per manufacturer’s instructions. 100 μL of sample was  applied to the Qiagen columns, and extracted DNA was eluted in 30 μL of elution buffer.  25 μL of sample was input to the Promega system, with the final elution volume being  100 μL. The SCODA samples were injected from 5 mL at 10 V/cm for 20 minutes into a  1% low melting point agarose gel made with 0.25X TBE. A V = 2 V washing field (as  described in Section 5.2) was applied towards the injection chamber to wash  contaminants out of the gel as concentration proceeded at 50% voltage with a 4 s  rotational period for 3 hours. A final 2 hours of concentration at the same conditions  was completed without the washing field, so that the DNA was concentrated to a  predetermined focus location, where it was removed in a ~20 μL agarose plug. The  agarose plug was melted and diluted to three times its volume with dH20 before being  aliquoted and 5 μL inserted (in duplicate) into a QRT‐PCR reaction using SYBR® Green  (Applied Biosystems, part no. 4309155) chemistry as per the manufacturers instructions  (see Appendix C – Materials and Methods). The success of the humic acid rejection was  assayed by the relative success of PCR amplification of the spiked DNA over a number of  samples. Two experiments were completed for the lowest humic acid input to Qiagen,  and three experiments for the next two humic acid inputs. For the 4 μg and 20 μg  inputs, six and 15 experiments were completed, respectively. The highest three inputs  to Qiagen were completed in triplicate, and the lowest three humic inputs to Promega  86  were completed in triplicate. The 10, 40,105, 450 μg inputs were repeated nine, eight,  seven and four times, respectively. The final two samples were repeated twice.  For the  SCODA samples, one experiment was completed at each humic acid data point, except  for the highest humic input, for which 12 experiments were conducted. These  experiments were completed before there was sufficient cooling on our apparatus to  tolerate higher fields, leading to longer run times.  SCODA rejection of humic acids is excellent, and while other preparation  methods exist that are specifically designed to remove humic acids, the SCODA method  is not specific to this contaminant and has qualitatively been shown to behave similarly  with other contaminants.   An estimate on the upper limit of k/D can be made for humic acids. Observing  from images such as Figure 23 that humic acids undergo no noticeable focusing  movement within a gel radius (R= rg = 8.5 mm) under the applied fields (Ed = 7200 V/m,  dEq = 4900 V/m), a maximum value for k/D of 7 x 10‐5 m/V2 can be obtained from  Equation (36). This is 3 orders of magnitude smaller than k/D measured the same way  for DNA in Section 3.3, indicating the selectivity of SCODA concentration and separation.    5.2.2 Proteins  Similar contaminant rejection tests were carried out with a combination of  proteins from lysed E. coli cell culture. Plasmid DNA was extracted from a lysed E. coli  cell culture, then assayed for the presence of proteins in the extracted sample using the  BCA total protein assay [32] as per the manufacturer’s instructions. As a benchmark, the    87 SCODA results were compared to a Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit designed for E.  coli lysis and plasmid purification.  A colony of DH10BT1 E. coli cells transformed with pUC19 plasmid containing the  ampicillin resistance gene was grown until the OD of the cells at 600 nm was 0.6, and  then used for these experiments. 1.5 mL of E. coli culture was spun down and processed  following the Qiagen lysis and purification protocol. Initial results from the Qiagen  columns show near zero protein carry through. Protein concentration was measured  with the BCA assay after lysis (Qiagen protocol step 3) and after purification. To test the  protein rejection limits of the methods, 43.75 mg of BSA protein was added to the E. coli  lysate, which, after purification, showed significant protein carry through (Table 6).  Plasmid DNA recovered in control and spiked samples was verified for length and  sequence in a separate purification run by DC gel and QRT‐PCR.  To prepare the E. coli for SCODA purification, a different lysis method than that  of Qiagen was used to avoid the high conductivity associated with the Qiagen lysis  buffers, which can be undesirable for high performance SCODA runs. For lysis in SCODA,  1.5 mL of E. coli sample was pelleted and added to 350 μL of STET buffer containing 250  μg of Lysozyme and then boiled for 40 seconds. The sample was then diluted to 5 mL  with dH20 in the SCODA injection chamber. Injection was performed at 18 V/cm for 40  minutes into a 1% low melting point agarose gel made with Sodium Borate buffer (4 mM  NaOH, 20 mM Boric acid). Sodium Borate buffer was used in this experiment, as Tris  based buffers were seen to interfere with the BCA assay. Concentration and  contaminant rejection was accomplished by applying a V = 4 V washing field towards the  88  injection chamber and concentrating at 50% voltage for 2 hours with a 4 s rotational  period. A final 2 hours of concentration was repeated with the same conditions but no  DC field applied, so that the DNA was concentrated to a predetermined focus location,  where it was removed in a ~20 μL agarose plug, diluted to 100 μL with 0.4X SB buffer  [33], and analyzed with the BCA assay. Because of the addition of Lysozyme in the  SCODA lysis, the initial protein concentration of the SCODA samples is higher than that  of Qiagen, but comparable final protein concentration is observed after SCODA and  Qiagen purification methods. When the SCODA lysate is spiked with BSA as in the  Qiagen samples, and run with the same rejection conditions as the control sample,  minor protein carry through in SCODA is observed. Again, plasmid DNA recovered in  each purification method was verified in a separate run by DC gel and RT‐PCR.   These results indicate again that affinity‐based methods are more easily  overwhelmed by contaminants. By comparison to a spin column (Qiagen QIAprep Spin  Miniprep Kit), SCODA was greater than 60‐fold more effective at rejecting a mixture of  E. coli protein contaminants and BSA (Table 6), and did not suffer substantial reduction  in DNA yield as the amount of input contaminant was increased.                89 Table 6: Protein Contaminant Rejection. Data showing protein carry through for Qiagen and SCODA  purification methods. Under each purification method, the first column indicates protein concentration  without spiking, while the second indicates protein concentration after spiking with 43.75 mg of BSA. The  bottom row indicates the protein rejection ratio – the ratio of initial to final protein concentration. Four  repeats of each sample were performed for both Qiagen and SCODA. Table reprinted from [8].      5.3 High Molecular Weight DNA Concentration  Due to the non‐mechanical nature of the SCODA process (namely, there are no  vortexing or centrifugation steps that would tend to shear large molecules),  concentration of intact high molecular weight (HMW) DNA is possible.   The process is inherently slow due to trapping of large molecules at high electric  field strengths. Studies of DNA migration in PFGE have shown that long (>100 kb)  molecules exhibit a length dependent critical electric field value above which they will  be trapped in the gel matrix and not move [34], [35]. This phenomenon is even more  pronounced when large molecules are subject to fields of changing directions, as the act  of reorientation within the gel matrix can increase the likelihood of trapping. Thus there  is a fundamental limitation to the speed at which large molecules can be concentrated.   This phenomenon was observed when concentrating Yeast Chromosome Markers.  1 μg of yeast chromosome marker contained in an agarose plug (containing DNA from  225kb – 1900kb, see Appendix C – Materials and Methods) was cast directly (to avoid  90  long injection times due to large fragments) into a 1% LMP agarose SYBR® Green 1  stained SCODA gel in 0.25X TBE. Concentration then proceeded using 7% of the 12 step  voltages describe in Table 4 (page 49) for 72 hours at a rotational period of 2880 s. PFGE  analysis of the resulting concentrated DNA (using the manufacturers recommended  conditions for the marker) showed recovery of molecules up to 945 kb. Repeating this  experiment at 4% fields for 96 hours resulted in recovery of 1600 Mb. The longer run  time in the second experiment is to compensate for the reduction in electric fields. 12‐ step focusing voltage patterns were used in this experiment as these experiments  occurred before the development of 4‐step fields. Also, 2880 s was likely a large over‐ estimate of the period required for focusing large molecules.   A similar experiment was conducted in 2X TBE, 1% LMP agarose with a 400 s  period for 8 hours. At 20% fields, up to 375 kb DNA was recovered, whereas up to 225  kb DNA was recovered at 25% fields.  It was observed experimentally that increasing buffer concentration reduces  trapping for a given field. 1 µg of Yeast Chromosome Marker was cast in a 1% LMP  agarose SCODA gel in varying buffer concentrations and concentrated using 12% of the  voltages described in Table 4. The concentration was run for 17 hours with a 2880 s  rotational period. The results are displayed in Figure 25, showing a monotonic increase  in recovered DNA with buffer concentration. Error bars indicate the distance between  subsequent DNA bands in the Yeast Chromosome Marker.    91 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 TBE Concentration (x) C on ce nt ra te d D N A  (k b)   Figure 25: HMW DNA Recovery vs. TBE Concentration. Increasing buffer concentration (compared to the  1x TBE standard) at fixed SCODA conditions shows a monotonic increase in the length of recovered DNA.  Gels were run with 1 µg of Yeast Chromosome Marker in 1% agarose with 12‐step, 12% fields and 2880 s  period for 17 hrs. Each data point is from a single SCODA experiment, and error bars indicate the  resolution of the Yeast Chromosome Marker.    These results can be understood in the following way. In an ionic solution, an  electrostatic screening layer is generated around negatively charged DNA. This layer  increases in size as buffer concentration is lowered [36]. Also, for low molecular forces,  decreasing salt concentration increases the effective persistence length of a DNA  molecule [36]. This can be interpreted as electrostatic self repulsion – a bigger screening  length at lower buffer concentration increases the persistence length of the molecule,  thus increasing the radius of gyration. With a larger persistence length, a molecule is  less flexible, and more easily hung up in the gel. Thus, increasing buffer concentration  92  increases the length of molecules that can be recovered at a given field. The downside  to higher buffer concentration is increased heat generation, but the fields typically used  in HMW concentration are small enough that this is not a limiting factor.  There are several other potential methods for reducing trapping and improving  the speed of this process, most involving modifications in the electric field. The first,  resulting from work on PFGE, is to superimpose high frequency pulses on top of the DC  voltage [34] to keep the DNA moving locally and reduce its ability to get caught in the  gel matrix. While this was never tried in SCODA, it has shown promising results in PFGE.  A second method also resulted from PFGE work, where the shape of the voltage pulses  were optimized to enhance reorientation and reduce trapping [35]. The authors suggest  two methods – first, slowly ramping the voltage between two levels to gently reorient  the DNA. The second is to apply a short high voltage pulse at the changeover between  voltages to force quick reorientation. Again, these were not tried in SCODA, but showed  good results in PFGE. A third idea is to make the reorientation angle between  subsequent field patterns small to minimize reorientation enhanced trapping. In  retrospect, the fact that 12‐step fields were used in the previous experiments was likely  helpful because of reduced reorientation angle compared to the 4‐step fields.   Other ways to reduce trapping that do not involve changing the electric field  include reducing the density of the matrix (or changing the type of matrix to one such as  linear polyacrylamide or LPA) so that larger pores will cause less inhibition of large DNA  molecules. This would work when concentrating only long fragments, but reduce    93 focusing for smaller DNA. Also, gel temperature could be raised to increase the thermal  motion of DNA, potentially reducing its tendency to become trapped.  Finally, it may be possible to use field trapping to our advantage. It is clear from  this work that in certain regimes, when the electric field is increased, the DNA slows  down. This should produce a negative value of k, which may be larger than the positive  k value at lower fields. This would allow the use of reverse SCODA to concentrate  molecules (Section 6.2). Also, since the field value that traps molecules is length  dependent, it may be possible to use it as a length selection parameter.   These and other improvements to high molecular weight DNA extraction form a  compelling basis for future work, particularly given the current interest of the DNA  sequencing community in long DNA strand purification.    5.4 Short Fragment Concentration  As outlined in this thesis, molecules are focused based on their values of k/D. This  means that contaminants, but also small nucleic acids, such as short dsDNA, ssDNA or  RNA, have difficulty focusing.  Several techniques can be used to enhance the focusing of small molecules. The  first and most obvious method is to increase Ed and dEq. Doubling the fields gives a 4  times increase in speed (Equation 26) and a focus spot of half the size. This approach is  limited by heat extraction from the gel (see Section 4.5).  It was also observed that decreasing buffer strength enhanced the concentration  of short fragments. This was shown by injecting 100 bp ladder (100 bp – 1500 bp, see  94  Appendix C – Materials and Methods) from 0.4X TBE and injecting at 10 V/cm for 40  minutes into a 2% low melting point agarose, 2X TBE SCODA gel. Good stacking was  obtained so all fragments were retained in the gel. Focusing was performed using 35%  voltages with a 1 s period for 5 hours, and all fragments down to 500 bp were  recovered. The same experiment was repeated with 0.25X TBE, and all fragments down  to 400 bp were recovered. The mechanism for this minor improvement in recovery is  not clear, but it is likely that on the scale of these small molecules, the decrease in  buffer concentration causes an increase in persistence length large enough to increase  the size of the molecule so that it interacts more with the gel pore, thus increasing k.   Other methods for focusing short fragments involve increasing k/D, by some  combination of increasing k and decreasing D.  D can be decreased by increasing the  density of the gel matrix. This presumably causes an increase in k as well, as the smaller  molecule now interacts more with the matrix. But this increase in k stops at a certain gel  density (depending on molecule size) as the DNA becomes immobile. This can be seen in  Figure 26 on page 99. This figure shows the time it takes for fragments up to 48.5 kb to  focus under identical field and buffer conditions, but with increasing agarose gel  density. There exists an optimal gel percentage for minimum run time for the complete  focusing of 48.5 kb fragments, which is inversely proportional to k. It follows that the  optimal gel percentage for minimum run time would most likely be different for  molecules with different k values. As a result, gel density is difficult to optimize, as it is  highly dependent on molecule type and overall sample composition. It may be possible  however to employ different gel matrices such as polyacrylamide or micro‐fabricated    95 networks that preferentially increase k for short molecules through more uniform or  better controlled pore sizes.  Other possible techniques for increasing k/D include changing the steady state  temperature of the gel to alter any secondary structure in small ssDNA or RNA  molecules that might influence k. Finally, thermal oscillations could be used in phase  with the SCODA fields to induce a thermal change in mobility. The downside to  increasing k/D in this manner for small nucleic acids is that k/D will likely also increase  for contaminant molecules.  96  Chapter 6 DNA Length Selection  To this point in the thesis, the selectivity of SCODA has been based on charge (only  negatively charged particles are injected) and the value of k/D for a molecule. A unique  feature of the SCODA process is that further selection can be made based on the electric  field reorientation time of a molecule.   During SCODA, the electric fields rotate to produce a radial focusing geometry.  When a reptating DNA molecule experiences a change in electric field direction, the  molecule spends a certain time reorienting to the new field direction before beginning  to move in that new direction [37]. The period of the fields can be chosen such that they  are switching faster than the reorientation time, inhibiting a molecule’s motion.  Reorientation time (tr) increases with the length of a molecule [37], and thus provides a  method for DNA length selection, to further refine selection based on charge and k/D.  The ability to select for DNA length has many potential applications, including the  rejection of large template fragments in sequencing reaction purification [38], and the  removal of short fragments for genomic DNA library construction and cloning [39].   As outlined in Section 5.2, samples containing molecules with a range of k/D values  can be effectively separated by superimposing a DC field on top of the SCODA field so  that the focus is split into multiple spots or contaminants are washed off the gel.  Selection based on tr by varying the SCODA field frequency effectively reduces k/D for  certain molecules in a length dependent fashion, and allows molecules of desired length  to be selected for active rejection.    97 In research on reorientation time in PFGE systems, tr has been shown to be a  function of DNA length and conformation, buffer and gel concentration and type,  electric field strength and reorientation angle, and temperature by Lopez‐Canovas et al  [40]. They have shown that tr increases quadratically with length, decreases  asymptotically with temperature, and decreases strongly with increasing field. Most  interestingly, Lopez‐Canovas has shown that tr for large (>230 kb) molecules tends to  converge at high fields, potentially making molecular distinction based on tr difficult in  this case. How well SCODA is able to distinguish between molecular lengths will depend  on the operating regime. Ideally, one would operate where the difference in tr between  different lengths is as large as possible, implying low fields and longer run times.   Presented in this chapter are methods for taking advantage of tr to reject both long  and short DNA fragments.    6.1 Large DNA Rejection   As described above, the mechanism of length selection inherent in the SCODA  concentration process depends on many different parameters. To explore this large  parameter space, several key experiments were undertaken to gain a better  understanding of the fundamentals of length selection.   First, the length cutoff of concentrated DNA was measured as a function of  agarose gel percentage, with a fixed electric field, rotational period, and buffer  concentration. The cutoff is determined by injecting a custom DNA ladder (see  98  Appendix C – Materials and Methods) in the range of 25 bp to 48 kb, concentrating at  high frequency to reject large molecules, and running the resulting DNA out on a DC gel.  Because concentration speed depends on gel percentage (gel percentage effects k and  μ0), the concentration time is different for each gel density. The concentration time is  determined for each gel percentage by running a control concentration at the same field  but longer period known to concentrate all DNA and observing the time to concentrate.  600 ng of the custom DNA ladder was injected with a 20 V/cm dipole injection field from  0.05X TBE buffer into a 0.25X TBE buffer gel stained with SYBR® Green I.  Injection time  varied from 7 ‐ 40 minutes depending on gel concentration, but complete injection of all  fragment lengths was verified by UV visualization. Good stacking over the large length  range of the input sample was achieved by a 5 times reduction in conductivity from gel  to sample. After injection, DNA was concentrated using 50% voltages, with a total  rotational period of 160 ms, which is the fastest the apparatus described in this thesis  can operate.   The results of these experiments are summarized in Figure 26, showing an  asymptotically decreasing cutoff with increasing gel percentage, and a parabolic  dependence of run time on gel percentage. Error bars in DNA cutoff indicate the  distance between sequential bands in the DNA ladder. As expected the smaller pore size  associated with increasing gel percentage [41] causes a shorter DNA cutoff (and possibly  a sharper cutoff, although this was not investigated in this thesis) at the cost of  increasing run length.     99 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 1 2 3 4 5 6 7 Gel % D N A  C ut of f ( kb ) 0 2 4 6 8 10 12 14 R un  L en gt h (h ) DNA Cutoff Run Legnth   Figure 26: DNA Cutoff and Run Length vs. Agarose Gel %. DNA cutoff and run length are measured as a  function of agarose gel percentage at 50% voltages, 160 ms periods, and 0.25X TBE buffer concentration.  Run length exhibits a parabolic behaviour, with the minimum occurring around 1%. DNA cutoff (the  largest DNA recovered) exhibits an asymptotically decreasing cutoff with increased gel percentage. Each  data point is from a single SCODA experiment.    Following these experiments, the period dependence of DNA cutoff was  investigated at a fixed field, gel percentage, and buffer strength. The 4% gel with 0.25X  TBE buffer was chosen for this experiment as a balance of low cutoff and reasonable run  time. DNA was injected as in the previous experiment at 20 V/cm, but for 30 minutes.  The DNA was then concentrated with 50% voltages, at periods ranging from 160 ms to  1000 ms. The results are shown in Figure 27 – a non‐linear increase in DNA cutoff with  SCODA period. Extrapolating an exponential fit to this curve down to 100 bp predicts a  ~4 ms SCODA period. 100 bp may not focus under these experimental field and gel  100  conditions due to its low value of k/D, but this extrapolation should give an order of  magnitude of period required for low length cutoffs.   0 10 20 30 40 50 60 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 SCODA Period (s) D N A  C ut of f ( kb )   Figure 27: DNA Cutoff vs. SCODA Period. DNA cutoff is measured as a function of SCODA period at 50%  voltages in 4% agarose and 0.25X TBE for 5.5 hours. Cutoff increases monotonically with SCODA period  and is fitted with a smooth curve as shown. If an exponential curve is extrapolated down to 100 bp, the  trend predicts a 4 ms period required for cutoff. Each data point is from a single experiment, except the  lowest (160 ms) period, which was performed in triplicate.    A final experiment measured DNA cutoff as a function of electric field, at  constant period, gel and buffer conditions. The same 4% gel and 0.25X TBE conditions  were used as in the previous experiment, but two different voltage levels were used,  50% and 100%. The cutoff at the double field went to 17 kb from 3 kb, but the run time  went down from 5.5 hours to 2 hours. This experiment does not take into account the  effect of the temperature increase due to increased fields on length selection, but  shows a correlation between field and recovered DNA.    101 The preceding work has shown that while length selection is effective, it is  limited by how precisely it can cut off non‐desired lengths. This is observed when left to  focus for a long enough time, large molecules may slowly focus. One possible way to  understand this phenomenon is to consider that gel pore size in agarose is most likely  highly variable, even within a single gel. This could lead to a large variation in  reorientation time, depending on location within a gel. This variability leads to the  partial focusing of some molecules, even though the gel pore‐size distribution is  averaged over many field rotations.   To reduce this variation and improve length selection, there are several avenues  to pursue. The first would be to employ a more uniform gel matrix, such as  polyacrylamide or a micro fabricated matrix, such that pore sizes are more consistent  and designed for a particular length selection. Another obvious improvement would be  to average the fluctuations over more field reorientations, but this is limited by the size  of the gel. This process may also work better for long molecules, where high field  trapping can also aid in length selection. This trades off with run speed, however.   It may also be possible to actively increase the sharpness of the DNA cutoff.  Despite the wide range of reorientation times for a given molecule, correctly selecting  the rotating frequency of a SCODA field will decrease the SCODA velocity for that  molecule. As a result, it may be possible to apply an electrophoretic washing force to  push these molecules off the gel, analogous to the washing field used for contaminant  rejection and described in Section 5.2. This would likely improve length selection, at the  102  cost of a longer run time (as molecules that are focusing also have to overcome a  washing force).   This washing force could be implemented in several ways, the simplest being a DC  dipole field applied across the SCODA gel. This would cause the focus location for the  DNA of interest to shift off centre, but would drive weakly focusing molecules off the  gel, including contaminants. Another way to generate active washing would be to  superimpose on the focusing field a defocusing field (described in Section 6.2) of low  frequency and lower field strength, to actively defocus all molecules. While these fields  would not superimpose linearly because of the non‐linear nature of the system, it is  likely that under the right conditions it would still push long fragments off the gel in a  symmetric fashion, while shorter fragments would be constrained by the focusing field.      6.2 Small DNA Rejection  The technique for length selection described in Section 6.1 is able to reject long  DNA fragments, but is not capable of rejecting only short fragments while retaining the  longer molecules.  Short fragments with low k/D values can be rendered unable to focus  due to high diffusion (D) under the appropriate gel, buffer and field conditions, but this  produces a poor cutoff and is not easily tunable.     103 Short molecules, however, can be actively rejected by applying a defocusing field,  or reverse SCODA, so that molecules move away from the centre of the gel, and length  selection can be applied using the same principles described in Section 6.16. To do this,  consider the effect of altering the phase of the quadruple field with respect to the  dipole field by 180 degrees, effectively multiplying Equations 22 and 23 by ‐1. The  focusing drift velocity term of Equation 26 would then be positive rather than negative,  leading to a net drift of molecules away from the central focus, instead of toward it. A  simple change in the control software allows the generation of such fields.   Using reverse SCODA, the following process can be used to focus only long  molecules: Running regular SCODA with slow‐rotating fields, all molecules are focused.  The SCODA phase is then reversed as described above, and reverse SCODA is operated  with rapidly rotating fields, such that only short molecules feel the reverse SCODA                                                             6 Reverse phase SCODA also has applications for focusing molecules with inverse dependence of mobility  on field.  Some molecules, including extremely long strands of DNA, exhibit a mobility which decreases  with increasing field. For example, very long DNA can become pinned to the gel under high electric field  strengths (described in Section 5.3), decreasing its mobility to zero, while under low fields it is capable of  reptating through the gel. In this regime, k has a negative value, and regular SCODA would in fact cause  defocusing. Reverse phase SCODA should, though, lead to focusing. In this way, with a sample containing  molecules with both positive and negative values of k, it would be possible to actively focus some  molecules while actively defocusing others with the same field pattern.    104  effect. Long molecules then stay at the focus while short ones are removed from the  focus and driven toward the outside of the gel.   To demonstrate this idea, 200 ng of λ‐DNA (48.5 kb) and 1 kb DNA ladder (ranging  from 500 bp to 10 kb, see Appendix C – Materials and Methods) were mixed in a 1:1  mass ratio in 0.05X TBE and injected at 10 V/cm for 30 minutes into a 1% LMP agarose  gel made with 0.25X TBE.  The DNA was then focused for 2 hours using 60% voltages  with a 40 s period.     Table 7: Defocusing Voltages. These voltages are equivalent to 60% of the focusing voltages found in  Table 5 (page 50), but with the phase of the quadruple reversed to produce defocusing.      After focusing, defocusing voltages as described in Table 7 were applied for 1  hour. Figure 28 shows the results of this experiment. Lanes 1 and 2 are control lanes of  the sample inserted into SCODA. Lane 3 is a control injection and focus, as described  above, but without the defocusing step. Lane 4 is the DNA that remains at the centre of  the gel after defocusing, and lane 5 is a sampling of the DNA that had moved away from  the center after 1 hour of defocusing. The results show distinct selection of the λ DNA  away from the 1 kb ladder.     105   Figure 28: Rejection of Short DNA Fragments. DC gel image showing rejection of short fragments while  retaining λ DNA. Lane 1 at left is a control of the λ DNA loaded into SCODA, while lane 2 is a control of the  1 kb ladder DNA that was loaded. Lane three is a control where DNA was extracted after focusing,  showing the recovery of both input controls. Lane 4 is the extracted DNA from the centre of the SCODA  gel after defocusing, while Lane 5 is DNA extracted off‐centre. Lane 4 shows excellent retention of the λ  DNA, with no other visible DNA remaining, while Lane 5 shows the shorter molecules defocusing.    While this is a promising result, inspection of the defocusing pattern shown in  Figure 29 reveals non‐uniform defocusing. This is due to the fact that when defocusing,  the DNA is starting at the centre of the gel from an unstable equilibrium, as shown in  Figure 30, and is very sensitive to small non‐uniformities in field, temperature, diffusion  and other conditions.  106    Figure 29: Instability of Defocusing. Left Image: Defocusing after experiment described above. Right  Image: A subsequent experiment using the same conditions as the left image, with very different  defocusing pattern.      Figure 30: Unstable Equilibrium in Defocusing. During focusing, DNA is focused to the bottom of a  potential well, as described in Section 2.4. When molecules are defocused, the potential well is inverted,  with the DNA starting at the top, which is a position of unstable equilibrium.    This stability problem can be solved by combining focusing and defocusing fields  at different frequencies (either applied simultaneously or serially in time). The focusing   107 field would be low strength and low frequency, to allow all molecules to focus. The  defocusing field would be at higher strength and higher frequency, so that only short  molecules feel the defocusing effect, and the defocusing overwhelms the focusing for  these molecules. Using this method, only long molecules would reach the centre of the  gel, as short molecules would be defocused before reaching the centre.  It is clear that by using the methods described here and in Section 6.1 in  combination, a band of molecule lengths could also be selected for focusing. Focusing  field parameters would be selected to reject long fragments, while defocusing field  parameters would be selected to reject short fragments.  108  Chapter 7 Applications of Electrophoretic SCODA   The design and characterization of SCODA as shown in this thesis has allowed it to  become a robust platform for DNA recovery and purification. SCODA’s ability to reject  contaminants including humic acids, its high efficiency in samples with low DNA  abundances, and its ability to work directly with samples containing particulates make it  an ideal method for environmental DNA extraction.    It is estimated that less than 1% of all microorganisms observed in nature can be  cultured in the laboratory. This leaves researchers unable to study more than 99% of  microorganisms in some environments ‐ microorganisms that sometimes have unique  and potentially useful abilities such as waste degradation, energy generation, or  synthesis of compounds that could find use as drugs or antibiotics. While the majority of  this biological diversity in our environment remains unexplored, a number of  metagenomics projects, or surveys of such diversity through DNA sequencing, are  underway or have been carried out ([42], [43], [44]).   In this chapter, two applications are presented that demonstrate the utility of the  SCODA technique. The first, in Section 7.1, is the extraction of high molecular weight  DNA from soil, a task that has proven to be challenging with existing technology. The  second is a collaboration with Dr. Robert Holt and the Michael Smith Genome Science  Centre (GSC), who are doing a metagenomic survey of the Athabasca Tar Sands. In this  work, the GSC sent us a difficult tar sample for extraction of DNA.  We returned purified  DNA to them, which they subsequently sequenced and analyzed. Their results are  presented in detail in Section 7.2.    109   7.1 HMW DNA Extraction from Soil  Although new antibiotics and enzymes have already been discovered by direct  extraction of DNA from soil [45], successful production of such compounds requires  cloning fragments long enough to cover entire pathways encoded by gene clusters,  which can be over 100 kb in length. Clearly, extracting and cloning longer fragments  increases the chance of reproducing entire pathways, but this is at odds with presently  available DNA extraction and purification techniques particularly when samples also  contain high concentrations of contaminants that inhibit cloning. Existing purification  techniques stringent enough to provide high purity DNA fragments tend to shear  genomic DNA to fragments of 50 kb or less [46]. Consequently, research towards  methods for preparation of larger fragments that are pure enough to clone is being  pursued by many laboratories [45], and the development of such a method may enable  the discovery of many future drugs and antibiotics.  To extract DNA directly from soil and avoid shearing of long molecules, 0.1 g of  soil was cast mixed with 0.4% agarose gel and 0.25X TBE in the 5mL SCODA sample  chamber and incubated for 1 hour at 37 °C in the presence of 5 mg/mL of Lysozyme and  0.2 mg/mL Proteinase K. 1% SDS was then added and incubated at 65 °C for 30 minutes.  Following lysis, DNA was injected into a 1% agarose gel by 10 V/cm fields for 40 minutes,  and subsequently concentrated with 12% voltages and a field rotation period of 1440 s  to recover high molecular weight DNA. After 17 hours of concentration (the long run  length is due to the low mobility of large DNA fragments in an agarose gel), the agarose  110  plug extracted from the SYBR® Green I stained focus was analyzed by pulsed field gel  electrophoresis, and was found to contain DNA fragments up to 600 kb in length. This is  an order of magnitude greater in length than conventional direct extraction techniques  from soil, which are typically limited to less than 50 kb fragments due to shearing.    Figure 31: HMW DNA Extraction from Soil. PFGE electrophoresis of SCODA recovered DNA shows  recovery up to 600 kb, compared to Yeast Chromosome and λ Markers (see Appendix C – Materials and  Methods). Analysis of the distribution of the recovered DNA shows 45% of the total is above 100 kb, while  30% is above 225 kb.        111 7.2 Tar Sands  SCODA was applied to a particularly difficult metagenomics project that had  hitherto been thwarted by failure of DNA extraction: sampling the biological diversity of  subsurface material from the Athabasca oil sands, a project pursued in collaboration  with Dr. Robert Holt at the GSC.   Defining the microbial flora associated with petroleum reservoirs will facilitate  studies of petroleum microbiology, and resident microbes may also provide a source of  novel enzymes for industrial applications, such as bio‐remediation. The Athabasca oil  sands comprise a mixture of bitumen (heavy oil), water, sand and clay. Quartz sand  forms the bulk of the material, and it is thought that individual grains of sand are  covered in a film of water that is in turn surrounded by bitumen, such that the oil  fraction is not in direct contact with the mineral grains [47].  For the present study, subsurface material taken from a drilling core (Figure 32)  resuspended in 0.5X TE buffer (2 mL buffer for every 1 g of oil sands) before manual  stirring and pulveration. The separated oil layer was removed and lysozyme added to  the remaining sample at a concentration of 150 ng/mL, then shaken at 37 oC for 2 hours.  Triton X100 was added at 5% v/v and the sample was vortexed and subject to 3  freeze/thaw cycles. Finally, Proteinase K was added to a concentration of 100 µg/mL  and the solution was placed in a 50 oC water bath for 1 hour. 5 mL aliquots were loaded  into the SCODA injection chamber for subsequent injection and concentration.   Samples were injected at 10 V/cm for 15 minutes into a 1% low melting point agarose  gel made with 0.25X TBE. After sample injections, the sample was removed from the  112  sample chamber and replaced with fresh buffer during concentration. Concentration  proceeded with 60% voltages and 4 s rotational period for 4 hours to a pre‐calibrated  focus location, where the DNA was extracted in a ~50 μL agarose plug prior to agarase  digestion.   In subsequent experiments with 10 g and 50 g of raw oil sand drilling core  material, agarose plugs containing the concentrated DNA were successfully extracted  and estimated, to an order of magnitude based on DC gel fluorescence intensity of  controls, to yield ~100 ng and ~1 µg, respectively.  The fluorescent controls used for  DNA quantification also indicate DNA concentration factors over 10,000 from these  experiments, arising from multiple injections. The extracted DNA was delivered to the  GSC for subsequent sequencing and analysis.      Figure 32: Oil Sands Samples. Left: raw oil sand sample, showing bitumen, water, sand and clay mixture.  Image courtesy of Dr. Robert Holt, GSC. Right: Re‐suspension of oil sands mixture in buffer for DNA  extraction from SCODA. Image reprinted from [8].     113 Fosmid sequencing libraries were constructed by the GSC using the DNA  supplied, with no additional clean‐up or purification other than agarase extraction from  the agarose plugs.  SCODA‐concentrated DNA fragments from the oil sands were ligated  directly to pEpiFos5 vector without size selection, then packaged and plated using the  EpiFOS fosmid library production kit (Epicentre, catalog no. FOS0901) according to the  manufacturer’s instructions. Fosmid end sequences were obtained using a pEpiFos5‐ Forward, and pEpiFos5‐Reverse primers in 4 µL reactions containing 0.33 µL BigDye  terminators  v.3.1 (Applied Biosystems) and 2 µL of approximately 0.5 µg/µL of alkaline  lysis purified fosmid DNA. The sequences were read using a 96‐capillary 3730xl DNA  Analyzer (Applied Biosystems).  A total of 1152 total fosmid sequences were obtained  and these were vector trimmed using cross‐match [48] and quality trimmed using trim2  (‐M 10) [49]. The resulting 1124 sequences were aligned to GenBank‐nt and Genbank‐nr  using wuBLASTn (BLAST version 2.0) and wuBLASTx (BLAST version 2.0), respectively.  The default parameters were used for both programs and only the best scoring match  from each fosmid read was subsequently evaluated. We also used Blastx to search the  Genbank–nr database with predicted amino acid sequences from the fosmid end read.  Best scoring nucleotide Blastn [50] hits to GenBank‐nt were used to determine  similarity of sampled genetic material to that of known organisms. The sample appears  diverse, with matches to over 200 distinct bacterial genomes (Figure 33).  With caution,  given that these data are from a single sample, it appears that this observation is  consistent with the presence of microbial flora in the subsurface oil sand environment.  It is also important to note that since drilling conditions are non‐sterile, we cannot  114  exclude the possibility that there is representation of surface organisms in the sequence  data. By Blastn, the largest number of best scoring matches were obtained against the  genomes of aromatic hydrocarbons‐degraders Novosphingobium aromaticivorans and  Rhodopseudomonas palustris [51]  , metal‐reducer Anaeromyxobacter dehalogenans  [52], secondary metabolite producer Streptomyces avermitillis [53] and to well‐ characterized soil‐dwelling actinomycetes such as Nocardia farcinica [54], and  Rhodococcus sp. RHA1 [55], [56].  The G + C content of the fosmid clone sequences  ranged from 24% to 67% and Blastn matches generally show sequence conservation  between 30% and 70% with a Gaussian‐like distribution (Figure 33) and an average  match length of 705 nt +/‐ 33. Together, these results show that the SCODA method  yields DNA suitable for library construction and metagenomic analysis, and suggest that  genetic material associated with the oil sand environment is from divergent organisms  that have not been identified or characterized previously.     115 0 50 100 150 200 250 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100 Sequence Identity Range (%) N um be r o f b es t s co rin g H SP s Caulobacter crescentus CB15 Novosphingobium aromaticivorans DSM12444 RhodopseudomonaspalustrisHaA2 Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C Rhodopirellula baltica SH1 Sphingopyxis alaskensis RB2256 Erythrobacter litoralis HTCC2594 Bradyrhizobium japonicum USDA110DNA Other Organisms   Figure 33: Conservation of Oil Sand Associated Environmental DNA. Vector and quality trimmed fosmid  sequences prepared from SCODA‐concentrated DNA were aligned to GENBANK‐nt using wuBLAST.  The  percent sequence identity distribution for High Scoring Pairs (HSPs) follows a Gaussian distribution.  The  bulk of the fosmid sequences have restricted sequence identity (approximately 30 ‐ 70%) compared to  known genomes. A partial legend for best scoring hits is shown; for a complete list, see Appendix D –  Supplementary Data. Sequence data courtesy of Dr. Robert Holt, GSC. Image reprinted from [8].    The successful sequencing of DNA extracted from the Athabasca samples would not  have been easily accomplished with conventional methods, due to the high level of  humic substance contamination from the oil. In addition, the DNA yield achieved  through successive loads of the SCODA sample chamber was sufficient to allow library  construction without prior whole genome amplification, which is known to generate  sequence representation bias.   116  Chapter 8 Conclusions   This work presents the concept of SCODA, a novel molecular manipulation and  separation technique, and develops it as a broad method for separation of nucleic acids  based on non‐linear electrophoresis. Perhaps the most significant outcome of this work  is the definition and implementation of a new separation parameter, k/D, which allows  separation and concentration of molecules based on the ratio of two physical  properties:  non‐linear electrophoretic response and diffusion. k/D is both novel as a  separation parameter, and is unique in its differentiation of nucleic acids. This enables  DNA extractions that were not previously possible, and even at this early stage, is  impacting work in areas such as metagenomics and forensics.   We demonstrated the utility and selectivity of the technique for DNA separations.  The purely electrophoretic nature of the SCODA separation method yields additional  benefits over existing separation technologies, including high efficiency at low  concentration inputs, excellent rejection of contaminants that are difficult to reject by  other means, the ability to extract high molecular weight molecules, and length  selection based on coupling between the rotating SCODA fields and molecular relaxation  times.  While each of these features of the method motivates its own specific applications  in genomics and other nucleic acid applications, we have chosen to demonstrate the  fundamental properties of the method in two applications that serve as examples of  common challenges in environmental nucleic acid extraction.   117 The first application is extraction of high molecular weight DNA from soil. Standard  direct purification techniques are limited to recovering DNA less than 50 kb in size, while  SCODA was able to recover up to 600 kb. The second is DNA extraction from the  Athabasca Tar Sands, as part of a metagenomics survey of the area. Existing techniques  had failed to produce any usable DNA from these highly contaminated samples, but  SCODA was able to provide 1 μg of DNA that was the sequenced directly. The results  show hits to over 200 organisms with low homology to know organisms, indicating a  wealth of new biological data is present in these samples, and providing grounds for  further study.   As this thesis is the first to present SCODA and is a broad demonstration of its  fundamentals, many opportunities for future work exist. Some of these include  optimization of gel and field parameters for increased efficiency and reduced heat  dissipation, and exploration of k for different molecules based on gel and buffer  conditions.  Others include development of better heat dissipation schemes to allow for  the use of higher voltages and faster concentration, as well as alternate injection  methods to improve on limitations of dipole injection. Opportunities for further work  also exist to increase the speed of concentration of HMW DNA through a combination of  optimized fields and matrix development. Also, the concept of length selection has only  been briefly explored, so there remains much work to do in increasing the sharpness of  the length selection cutoff.   And while the operating parameters demonstrated in this thesis are optimized for  nucleic acids, many other applications remain to be explored. In fact, demonstrations of  118  SCODA under the right conditions have been made with both RNA and proteins, but are  beyond the scope of this thesis.  Finally, it should be evident that the success of the two applications presented here  is a good indication of SCODA’s promise for environmental sample analysis, ranging  from bio‐defense, to forensics, metagenomics, and food and water safety applications.  In addition, the similarity of the challenges faced in DNA extraction from soil and stool  samples, for example, indicates that SCODA may have significant promise in clinical  applications and in human genomics, particularly in the emerging Human Microbiome  Project, which aims to study the genomes of organisms living within us. We expect  SCODA and instruments based on this method to have significant impact in possibly all  of these fields, and hope that further study and commercial development will eventually  lead this method to become ubiquitous in all nucleic acid analysis applications where  starting sample materials are complex, dilute or otherwise difficult to extract.   The promise of this technology has led to the creation of Boreal Genomics Inc,  exclusive licensee of the SCODA technology, of which the author is a co‐founder.       119 Works Cited  1.  Slater, G.W., et al., Theory of DNA electrophoresis: A look at some current  challenges. Electrophoresis, 2000. 21(18): p. 3873‐3887.  2.  Lyo, I.W. and P. Avouris, Field‐Induced Nanometer‐Scale to Atomic‐Scale  Manipulation of Silicon Surfaces with the Stm. Science, 1991. 253(5016): p. 173‐ 176.  3.  Rajendhran, J. and P. Gunasekaran, Strategies for accessing soil metagenome for  desired applications. Biotechnology Advances, 2008. 26(6): p. 576‐590.  4.  Viovy, J.L., Electrophoresis of DNA and other polyelectrolytes: Physical  mechanisms. Reviews of Modern Physics, 2000. 72(3): p. 813‐872.  5.  Frumin, L.L., S.E. Peltek, and G.V. Zilberstein, Nonlinear focusing of DNA  macromolecules. Physical Review E, 2001. 64(2).  6.  Marziali, A., et al., Novel electrophoresis mechanism based on synchronous  alternating drag perturbation. Electrophoresis, 2005. 26(1): p. 82‐90.  7.  Broemeling, D., and J. Pel, et al., An Instrument for Automated Purification of  Nucleic Acids from Contaminated Forensic Samples. Journal of the Association for  Laboratory Automation, 2008. 13(1): p. 40‐48.  8.  Pel, J., et al., Non‐linear Electrophoretic Response Yields a New Parameter for  Separation of Biomolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of  the United States of America, 2009. 106(35): p. 14796‐14801.  9.  Durr, H. and H. Bouas‐Laurent, eds. Photochromism: Molecules and Systems.  1990, Elsevier: New York.  120  10.  Asanuma, H., et al., Synthesis of azobenzene‐tethered DNA for reversible photo‐ regulation of DNA functions: hybridization and transcription. Nature Protocols,  2007. 2(1): p. 203‐212.  11.  Bozano, L., et al., Temperature‐ and field‐dependent electron and hole mobilities  in polymer light‐emitting diodes. Applied Physics Letters, 1999. 74(8): p. 1132‐ 1134.  12.  Slater, G.W., et al., Theory of DNA electrophoresis (similar to 1999‐2002(1)/(2)).  Electrophoresis, 2002. 23(22‐23): p. 3791‐3816.  13.  Stellwagen, N.C. and E. Stellwagen, Effect of the matrix on DNA electrophoretic  mobility. Journal of Chromatography A, 2009. 1216(10): p. 1917‐1929.  14.  Fredlake, C.P., et al., Polymer systems designed specifically for DNA sequencing  by microchip electrophoresis: A comparison with commercially available  materials. Electrophoresis, 2008. 29(23): p. 4652‐4662.  15.  Schwartz, D.C. and C.R. Cantor, Separation of Yeast Chromosome‐Sized Dnas by  Pulsed Field Gradient Gel‐Electrophoresis. Cell, 1984. 37(1): p. 67‐75.  16.  Frumin, L.L., et al., Anomalous size dependence of the non‐linear mobility of DNA.  Physchemcomm, 2000(1‐14).  17.  van Heukelum, A. and H.R.W. Beljaars, Electrophoresis simulated with the cage  model for reptation. Journal of Chemical Physics, 2000. 113(9): p. 3909‐3915.  18.  Griess, G.A., E. Rogers, and P. Serwer, Unlimited increase in the resolution of DNA  ladders. Electrophoresis, 2000. 21(5): p. 859‐864.   121 19.  Griess, G.A., et al., Cyclic capillary electrophoresis. Electrophoresis, 2002. 23(16):  p. 2610‐2617.  20.  McDonell, M.W., M.N. Simon, and F.W. Studier, Analysis of Restriction  Fragments of T7 DNA and Determination of Molecular‐Weights by  Electrophoresis in Neutral and Alkaline Gels. Journal of Molecular Biology, 1977.  110(1): p. 119‐146.  21.  Slater, G.W., et al., Recent developments in DNA electrophoretic separations.  Electrophoresis, 1998. 19(10): p. 1525‐1541.  22.  Tessier, F. and G.W. Slater, Strategies for the separation of polyelectrolytes based  on non‐linear dynamics and entropic ratchets in a simple microfluidic device.  Applied Physics a‐Materials Science & Processing, 2002. 75(2): p. 285‐291.  23.  Slater, G.W., H.L. Guo, and G.I. Nixon, Bidirectional transport of polyelectrolytes  using self‐modulating entropic ratchets. Physical Review Letters, 1997. 78(6): p.  1170‐1173.  24.  Chacron, M.J. and G.W. Slater, Particle trapping and self‐focusing in temporally  asymmetric ratchets with strong field gradients. Physical Review E, 1997. 56(3):  p. 3446‐3450.  25.  Pohl, H.A., Di Electrophoresis the Behavior of Neutral Matter in Nonuniform  Electric Fields, in Di Electrophoresis the Behavior of Neutral Matter in  Nonuniform Electric Fields. 1978. p. 579.  26.  Asbury, C.L., A.H. Diercks, and G. van den Engh, Trapping of DNA by  dielectrophoresis. Electrophoresis, 2002. 23(16): p. 2658‐2666.  122  27.  Asbury, C.L. and G. van den Engh, Trapping of DNA in nonuniform oscillating  electric fields. Biophysical Journal, 1998. 74(2): p. 1024‐1030.  28.  Mathew, M.K., C.L. Smith, and C.R. Cantor, High‐Resolution Separation and  Accurate Size Determination in Pulsed‐Field Gel‐Electrophoresis of DNA .1. DNA  Size Standards and the Effect of Agarose and Temperature. Biochemistry, 1988.  27(26): p. 9204‐9210.  29.  Serwer, P. and J.L. Allen, Conformation of Double‐Stranded DNA During Agarose‐ Gel Electrophoresis ‐ Fractionation of Linear and Circular Molecules with  Molecular‐Weights between 3x106 and 26x106. Biochemistry, 1984. 23(5): p.  922‐927.  30.  Pluen, A., et al., Diffusion of macromolecules in agarose gels: Comparison of  linear and globular configurations. Biophysical Journal, 1999. 77(1): p. 542‐552.  31.  Nkodo, A.E., et al., Diffusion coefficient of DNA molecules during free solution  electrophoresis. Electrophoresis, 2001. 22(12): p. 2424‐2432.  32.  Smith, P.K., et al., Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Analytical  Biochemistry, 1985. 150(1): p. 76‐85.  33.  Brody, J.R. and S.E. Kern, Sodium boric acid: a Tris‐free, cooler conductive  medium for DNA electrophoresis. Biotechniques, 2004. 36(2): p. 214‐+.  34.  Turmel, C., et al., Molecular Detrapping and Band Narrowing with High‐ Frequency Modulation of Pulsed Field Electrophoresis. Nucleic Acids Research,  1990. 18(3): p. 569‐575.   123 35.  Gurrieri, S., S.B. Smith, and C. Bustamante, Trapping of megabase‐sized DNA  molecules during agarose gel electrophoresis. Proceedings of the National  Academy of Sciences of the United States of America, 1999. 96(2): p. 453‐458.  36.  Marko, J.F. and E.D. Siggia, Stretching DNA. Macromolecules, 1995. 28(26): p.  8759‐8770.  37.  Chu, G., Bag Model for DNA Migration During Pulsed‐Field Electrophoresis.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of  America, 1991. 88(24): p. 11071‐11075.  38.  Margulies, M., et al., Genome sequencing in microfabricated high‐density  picolitre reactors. Nature, 2005. 437(7057): p. 376‐380.  39.  Shizuya, H., et al., Cloning and Stable Maintenance of 300‐Kilobase‐Pair  Fragments of Human DNA in Escherichia‐Coli Using an F‐Factor‐Based Vector.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of  America, 1992. 89(18): p. 8794‐8797.  40.  Lopez‐Canovas, L., et al., Kinetic properties of DNA migration under clamped  homogeneous electric field conditions ‐ DNA size, migration velocities and  reorientation time determined in a single clamped homogeneous electric field  run. Journal of Chromatography A, 1998. 806(1): p. 123‐139.  41.  Narayanan, J., J.Y. Xiong, and X.Y. Liu, Determination of agarose gel pore size:  Absorbance measurements vis a vis other techniques. International Conference  on Materials for Advanced Technologies (ICMAT 2005), 2006. 28: p. 83‐86.  124  42.  Daniel, R., The metagenomics of soil. Nature Reviews Microbiology, 2005. 3(6): p.  470‐478.  43.  Lorenz, P. and J. Eck, Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews  Microbiology, 2005. 3(6): p. 510‐516.  44.  Langer, M., et al., Metagenomics: An inexhaustible access to nature's diversity.  Biotechnology Journal, 2006. 1(7‐8): p. 815‐821.  45.  Schloss, P.D. and J. Handelsman, Biotechnological prospects from metagenomics.  Current Opinion in Biotechnology, 2003. 14(3): p. 303‐310.  46.  Robe, P., et al., Extraction of DNA from soil. European Journal of Soil Biology,  2003. 39(4): p. 183‐190.  47.  Czarnecki, J., et al., On the nature of Athabasca Oil Sands. Advances in Colloid  and Interface Science, 2005. 114: p. 53‐60.  48.  Ewing, B., et al., Base‐calling of automated sequencer traces using phred. I.  Accuracy assessment. Genome Research, 1998. 8(3): p. 175‐185.  49.  Huang, X.Q., et al., PCAP: A whole‐genome assembly program. Genome  Research, 2003. 13(9): p. 2164‐2170.  50.  Altschul, S.F., et al., Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular  Biology, 1990. 215(3): p. 403‐410.  51.  Larimer, F.W., et al., Complete genome sequence of the metabolically versatile  photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris. Nature Biotechnology,  2004. 22(1): p. 55‐61.   125 52.  Sanford, R.A., J.R. Cole, and J.M. Tiedje, Characterization and description of  Anaeromyxobacter dehalogenans gen. nov., sp nov., an aryl‐halorespiring  facultative anaerobic myxobacterium. Applied and Environmental Microbiology,  2002. 68(2): p. 893‐900.  53.  Omura, S., et al., Genome sequence of an industrial microorganism Streptomyces  avermitilis: Deducing the ability of producing secondary metabolites. Proceedings  of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001.  98(21): p. 12215‐12220.  54.  Ishikawa, J., et al., The complete genomic sequence of Nocardia farcinica IFM  10152. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of  America, 2004. 101(41): p. 14925‐14930.  55.  Warren, R., et al., Functional characterization of a catabolic plasmid from  polychlorinated‐biphenyl‐degrading Rhodococcus sp strain RHA1. Journal of  Bacteriology, 2004. 186(22): p. 7783‐7795.  56.  McLeod, M.P., et al., The complete genome of Rhodococcus sp RHA1 provides  insights into a catabolic powerhouse. Proceedings of the National Academy of  Sciences of the United States of America, 2006. 103(42): p. 15582‐15587.  57.  Frumin, L.L., G.V. Zilberstein, and S.E. Peltek, The isoelectric focusing problem  analytic solution. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000. 45(2):  p. 205‐209.    126  Appendix A ‐ Thermal SCODA    For an initial demonstration of SCODA, a thermal apparatus was used.  A  microscope slide, cover slip and epoxy were used to construct a chamber capable of  holding 300 µL of 2.0 M NaCl solution. Two gold wire electrodes were glued to the  microscope slide 1cm apart such that they were immersed the NaCl solution. One of the  electrodes was grounded and the other connected through a 1 kΩ resistor to an AC  amplifier. Nickel‐Chromium Alloy wire (NIC60‐015‐125‐25, Omega, Stamford, CT) was  glued to one side of the microscope cover slip to allow heating of the solution.   During operation, 1.32 A of current was pulsed to the heater in the form of a  50% duty cycle square wave at 10 Hz. A small fan running continuously was used to cool  the microscope slide during off cycles of the heater. A 12 Hz, 3.0 Vrms sine wave was  applied across the resistor and electrodes. These two signals were mixed and the output  difference frequency (of 2 Hz) was fed into the reference input of a lock‐in amplifier  (SR830 DSP, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA). To measure the periodic  current resulting from SCODA, the voltage across the 1 kΩ resistor was measured with  the lock‐in amplifier and the 2 Hz component was singled out for analysis.   The driven temperature oscillation of the sample solution was measured directly  by a thermocouple (0.005‐36, Omega) glued to the microscope slide between the  electrodes.  The 2 Hz component of the thermocouple output was also analyzed using  the lock‐in amplifier.   127 When applying the AC potential across an electrolyte solution, and  synchronously raising and lowering the temperature of the solution, a net transport of  ions is expected. If the oscillation frequency of the AC potential differs from the  frequency of the thermal oscillations, a detectable component of the ionic current  should be present at the difference of the two frequencies, indicating alternating (AC)  transport due to SCODA.   Using the equipment and procedure described above, an ionic current oscillating  at 2Hz was detected. It is assumed that the temperature dependent change of the  electrolyte’s resistance R0 is small compared to both the 1kΩ current‐monitoring  resistor and the DC resistance of the solution (RDC). The voltage across the electrodes  is )cos( 10 tVV ω= , where  24.40 =V V,  1 1 2 T πω =  and T1 = 12 s.  The resistance of the salt solution is  )cos( 20 φω ++= tRRR DC  where the  frequency of the induced thermal oscillation is  2 2 2 T πω = ; T2 = 10 s. The total current  through the solution is then    )cos( )cos( 20 10 φω ω ++= tRR tV I DC tot   (43)    Assuming DCRR <<0 , the previous equation yields an expression with a  sinusoidal term at the difference frequency (ω1‐ω2) whose amplitude is  )2/( 2002 DCHz RRVI = . Such a component in the current is indeed observed, with a value  for I2Hz of 4 μA.  128  The measured value of  Ω≅ 1200DCR , yields  30 103.2// −⋅== RdRRR DC  .    Conductivity measurements as a function of temperature for 2.0 M NaCl gives  11715 )1085.7103.3()( −−− Ω⋅−⋅= mTKTσ  where T is in degrees Kelvin, implying  dTKmd )103.3( 1115 −−−Ω⋅=σ . Using  σσ // dRdR −=  it is possible to deduce the  temperature oscillation of the sample from the measured SCODA current. This  calculated temperature oscillation is dT = 0.26 K, which is in close agreement to the  thermocouple based measurement of dT = 0.25 K.  This result is expected from the known temperature dependence of electrolyte  solutions, and can be achieved without SCODA in any resistive medium whose  resistance varies with temperature. Despite this, it should be noted that, when applied  to ions in solution, this effect is a simple demonstration of SCODA in one dimension.   129 Appendix B ‐ SCODA Theory  B.1  Field Dependent Electrophoretic Mobility  An arbitrary field dependent mobility μ(E) can be expressed as a Taylor  expansion around E=0 for positive field values:    )()0('' 2 1)0(')0()( 32 EOEEE +++= µµµµ   (44)  Taking only the first two terms as an approximation implies that k=μ’(0). In general, this  is a good approximation, as higher order field dependencies are usually small. It breaks  down, however, when k=μ’(0)=0 but higher order derivatives are non‐zero, although  this seems physically in the current realization of SCODA.  The existence of non‐zero  higher order derivates under certain conditions may however lead to some interesting  SCODA properties.    B.2  The Einstein‐Smoluchowski Equation  The polar Einstein‐Smoluchowski Equation for diffusion with drift can be written  as:     ( ) ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ ∂ ∂ ∂ ∂=⋅⋅∂ ∂+∂ ∂ r trCr rr DtrCrrv rrt trC ),(1),()(1),(   (45)  where C(r,t) is the molecular concentration, D is the diffusion constant and v(r) is the  radial SCODA velocity function (Equation 26):    rrv sµ=)(   (46)    g qd s r dEkE 4 −=µ   (47)  130  Dimensional analysis of Equation (45) reveals characteristic length and time scales for  concentration. At focus equilibrium (large t), δC(r,t)/δt=0, which simplifies Equation (45)  to     ( ) ⎟⎠⎞⎜⎝⎛ ∂∂∂∂=⋅∂∂ r trCrrDtrCrrS ),(),(2µ   (48)  and implies an equilibrium solution of the form    ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −= 2 2 2 exp),( R rCtrC o   (49)  where R is the characteristic focus spot size. R is defined as:    qd g S dEkE DrDR 4== µ   (50)   A characteristic time scale for concentration can be take from the SCODA velocity, and  defined as:    qd g S S dEkE r t 41 == µ   (51)  Equation (45) can be solved analytically assuming a 2‐D stationary Gaussian solution of  the form [57]    ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛−= 2 2 )(2 exp)(),( ts rtAtrC   (52)  where A(t) is a time varying amplitude and s(t) is a time varying half‐width, initial  conditions can be defined as     ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛−= 2 2 2 2 exp 2 )0,( σπσ rCrC i   (53)   131 where Ci is the initial central spot concentration, and σ is the starting half width. This  implies A(0)=Ci/2πσ2 and s2(0)= σ2. While this initial condition is not realistic for a  SCODA concentration (either from a uniform concentration in the gel that is zero else  where, or from an injection band), it can reasonably approximate actual initial  conditions, and gives useful information about the dynamics of initial conditions.   By conservation of mass, the integral of (53) over all space should be constant for all  time. Comparing to the integral of (52), it can be shown that    iCtstA =)()(2 2π   (54)  which gives a relationship between A(t) and s(t) for all time. Substituting this into (52)  gives    ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −= )(2 exp )(2 ),( 2 2 2 ts r ts C trC iπ   (55)   where the only unknown is now s(t). Substituting this into (45) and simplifying gives an  equation involving only s(t)    2222423 )(2)()(2)()()()(2 DrtDsrtststs t tsrts t ts ss −=+−∂ ∂−∂ ∂ µµ   (56)   Collecting r2 terms, one gets    Dtsts t ts S −=+∂ ∂− )()()( 2µ   (57)  which can be solved with the initial condition on s(t) to get    )2exp()( 22 tDDts S ss µµσµ −⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −+=   (58)  132  Thus, Equations (55) and (58) describe the solution to (45) along with the initial  condition (53).  The solution does behave as expected. For long times, s2(t) tends towards D/μs,  as predicted in Equation (50). An expression for the size of the focused spot can be  obtained from the definition of the Full Width at Half Maximum (FWHM). By definition  for a Gaussian distribution:    S FWHM DR µ )2ln(22=   (59)   Also, for long times, the impact of the initial half width (σ) disappears, as expected.  Finally, μs appears explicitly as the time scale for concentration in the exponent of s2(t).    B.3  The SCODA Potential  SCODA concentration can be seen as an effective radial potential well for DNA.  By calculating the displacement of a SCODA focused spot from a DC field (a restoring  force of this nature is a typical characteristic of an attractive radial potential), the shape  of the potential can be derived, assuming DNA is a point particle on the scale of the  SCODA gel. The potential from a displacement r due to a field EDC is defined as    ∫= r DCeff dRREqrP 0 )()(   (60)  where qeff is the effective charge of the DNA, and EDC(R) is a function of distance R from  the centre of the SCODA pattern. EDC(R) can be calculated when the SCODA velocity  (Equation 26) is balanced against the DC velocity:   133   20 DCDCDC kEEv += µ   (61)  Solving for EDC(R) when these velocities are balanced gives:    kk R k RE SDC 24 )( 0 2 1 2 2 0 µµµ −⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +=   (62)  Inserting this into Equation 60 and integrating gives:    ⎥⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢ ⎣ ⎡ −−⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ += S S S eff kk r k r k kqrP µ µµµµ µ 2 3 00 2 3 2 2 0 12243 2)(   (63)  Taking the derivative of P(r) gives the force (also equivalent to FSCODA=‐ qeffEDC(R) ):    ⎥⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢ ⎣ ⎡ −⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +−=−= kk r k q dr rdPF SeffSCODA 24 )( 02 1 2 2 0 µµµ   (64)  A Taylor expansion of the potential gives:    ⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡ +−= )( 3 1 2 1)( 433 0 2 2 0 rOrkrqrP SSeff µ µ µ µ   (65)  which shows that P(r) goes to zero as k goes to zero (in μS) , as expected, and also that  P(r) goes to zero as μ0 goes to infinity. This also applies to the SCODA force.    Near the centre of the well, the potential can be approximated by a harmonic  oscillator, by using only the first (r2) term of the Taylor expansion in the previous  equation. The effective spring constant is qeffμS/μ0. Applying the Equipartition Theorem  in one dimension gives:    ><= 2 02 1 2 1 rqTk SeffB µ µ   (66)  Simplifying using the Nernst‐Einstein relation (Equation 34) then gives:  134    >=< 2rD Sµ   (67)  which gives the same average radius as predicted by dimensional analysis in Equation  50.  Setting non‐dimensional variables R=rkμS/μ02 and Γ=P(r)k2μS/μ03q the potential  can be re‐written in a dimensionless form:    ⎥⎥⎦ ⎤ ⎢⎢⎣ ⎡ −−⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ +=Γ 12 1 24 1 3 2)( 2 3 RRR   (68)  and a dimensionless force can be written as:    ⎥⎥⎦ ⎤ ⎢⎢⎣ ⎡ −⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ +−=Γ−=Ξ 2 1 4 1)()( 2 1 R dR RdR   (69)  These forms are useful for plotting the shape of the potential and force, as shown in  Figure 4.    B.4  SCODA Field Accuracy  A rough estimate for the electric field accuracy required for SCODA can be  calculated as follows. The focus spot should be retained in the centre of the gel, with a  radius of the order of one tenth of the SCODA gel radius, so r=rg/10. Also, the SCODA  velocity in the focus region should be much larger (order 10) than the velocity from any  DC offsets in the same region, expressed by the following equation:    ( )2 2 10 4 10 DCDCO g g S kEE r r kE +> µ   (70)   135 where Ed=dEq=Es for simplicity, and EDC is the electric field resulting from any DC offsets  in voltage. Simplifying and rearranging produces    2 1 1 20 1 − ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +< DC O S DC kEE E µ   (71)  Taking μo = 1.3 x 10‐8 m2/Vs and k=4.0x10‐12 m3/V2s from Section 3.1, it can be seen that  even for very small fields, μo/kEDC>>1, so    2 1 3250 20 1 − ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛< DCS DC EE E   (72)  Simplifying gives:    2 1 2 12 1 / 1000 1 Vm E E S DC <   (73)  as a rough estimate for field accuracy required for SCODA, where the electric fields are  in units of V/m. Since voltage is proportional to electric field in this case, the same  relation holds for the voltages generated at the SCODA electrodes.    B.5  Electrokinetic Injection  The time for depletion of all DNA from an injection sample can be estimated as  follows:    E d t s s i µ=   (74)  where ds is the length of the sample chamber, μs is the free solution mobility for DNA in  the sample (nearly constant for all molecular lengths) and E is the electric field across  136  the sample chamber. The sample volume is constant, and E can be re‐written as E=V/ds  so the injection time becomes    VA d t s s i µ Ψ=   (75)  where Ψ is the sample volume, V is the applied voltage and A is the cross sectional area  of the sample chamber and gel interface. Noting that V=IR=Id/Aσs where σs is the  conductivity of the sample, injection time can be re‐written as:    I t s s i µ σΨ=   (76)  Parameters for a complete injection (that is, an injection where the sample  chamber is depleted of all DNA but no DNA has been lost off the far edge of the gel) can  be estimated by requiring ti be less than the time it takes for DNA to migrate through  the gel (tg), ti<tg. Re‐writing in terms of gel and sample chamber lengths and velocities,  this becomes:    ggo g ss s EkE d E d )( +< µµ   (77)  where dg is the length of the gel, and Eg is the field across the gel.   Assuming a sample chamber with the same width as the gel (cross section A), the  field across the sample and gel (Es , Eg) can be calculated from the total applied injection  voltage (V), based on sample and gel conductivities (σs, σg).  This simplifies to:    s sggs s o g gs s dd kV dd σσσ σµσµ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ ++ <   (78)   137 Noting that geometrically the ratio of ds and dg is a constant m, and that sample  volume Ψ=dsA, the previous relation can be non‐dimensionalized. Defining c as the  relative conductivity between the gel and sample (σg/σs), μ as the relative mobility of  the DNA in the gel compared to sample (μ0/μs) and V’ as the scaled applied voltage,  kV/μsdb = kAV/μΨ where A is the cross‐sectional area of the sample chamber, one gets  an expression of the form:    '1 V m c m c >⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ +⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ − µ   (79)  which is a dimensionless equation describing complete injections.  138  Appendix C – Materials and Methods  Unless noted otherwise, all SCODA gels described in this thesis were made with  Invitrogen Ultrapure Low Melting Point agarose (Invitrogen part number 16520050).  The QRT PCR protocol used for the efficiency and sensitivity experiments  consisted of a 50 oC start for 2 minutes, followed by a 95 oC denaturing step for 10  minutes. Then, 40 repetitions of 95 oC for 15 s ramping down to 60 oC for 1 minute were  completed for amplification.  The QRT PCR protocol used for the humic acid and protein contaminant rejection  experiments consisted of a starting 95 oC denaturing step for 10 minutes, followed by  amplification with 40 repetitions of 95 oC for 15 s ramping down to 60 oC for 1 minute.  The DNA used for high molecular weight concentration is a Yeast Chromosome  PFG Marker (New England Biolabs, part no. N0345S), embedded in 1% LMP agarose. The  length distribution (225‐1900 kb) is shown in Figure 34.     Figure 34: Yeast Chromosome PFG Marker. Length distribution in kb, separated by PFG. Reprinted from  www.neb.ca   139   The DNA used as PFGE markers is a λ Ladder PFG Marker (New England Biolabs,  part no. N0340S), embedded in 1% LMP agarose. The length distribution (48.5 ‐727.5+  kb) is shown in Figure 35.    Figure 35: λ Ladder PFG Marker. Length distribution in kb, separated by PFG. Reprinted from www.neb.ca    A 100 bp ladder (New England Biolabs, part no. N3231L) was used in testing  short fragment recovery. The length distribution is shown in Figure 36.  140    Figure 36: 100 bp Ladder. Length distribution (bp) and relative mass of each length. Reprinted from  www.neb.ca    The DNA used for length selection was a custom mix, consisting of equal masses  of Low Molecular Weight Ladder (New England Biolabs, part no. N3233L), 1 kb Ladder  (New England Biolabs, part no. N3232L) and λ DNA Mono Cut Mix (New England Biolabs,  part no. N3019L). Length distributions are shown in Figure 37.   141               Figure 37: Length Selection DNA Mix. Left: Length distribution (bp) and relative mass for the Low  Molecular Weight Ladder. Centre: Length distribuition (bp) and relative mass for the 1 kb Ladder. Right:  Length distribution (bp) for the λ DNA Mono Cut Mix. Reprinted from www.neb.ca                     142  Appendix D – Supplementary Data  Table 8: Sequence Distribution. Complete distribution of best‐scoring hits to known DNA sequences. Data  courtesy of Dr. Robert Holt, GSC. Table reprinted from [8].         143   144     145   146     147                     148 

Cite

Citation Scheme:

        

Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics

Share

Embed

Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                        
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            src="{[{embed.src}]}"
                            data-item="{[{embed.item}]}"
                            data-collection="{[{embed.collection}]}"
                            data-metadata="{[{embed.showMetadata}]}"
                            data-width="{[{embed.width}]}"
                            async >
                            </script>
                            </div>
                        
                    
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:
https://iiif.library.ubc.ca/presentation/dsp.24.1-0067696/manifest

Comment

Related Items