UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

The roles of microglia in response to pathological stimuli in the brain Hines, Dustin J. 2009

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Notice for Google Chrome users:
If you are having trouble viewing or searching the PDF with Google Chrome, please download it here instead.

Item Metadata


24-ubc_2009_fall_hines_dustin.pdf [ 5.89MB ]
JSON: 24-1.0067256.json
JSON-LD: 24-1.0067256-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0067256-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0067256-rdf.json
Turtle: 24-1.0067256-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0067256-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0067256-source.json
Full Text

Full Text

    THE ROLES OF MICROGLIA IN RESPONSE   TO PATHOLOGICAL STIMULI IN THE BRAIN    by  Dustin J. Hines    B.Sc., University of Lethbridge, 2002  M.Sc., University of Lethbridge, 2004      A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF   THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    DOCTOR OF PHILOSOPHY    in  The Faculty of Graduate Studies  (Neuroscience)    The University of British Columbia  (Vancouver)    May, 2009    © Dustin J. Hines, 2009    ii    ABSTRACT    As  the principal  immune  cell of  the brain, microglia  cells  are  responsible  for monitoring  the  activity of other cells  in the CNS, and are able to respond to harmful stimuli with a myriad of  supportive  and  defensive  mechanisms.    With  these  capacities,  microglia  are  involved  in  numerous  diseases  of  the  CNS,  ranging  from  acute  damage  and  infection  to  chronic  neurodegeneration.    In  chapter  2  we  examine  the  motile  functions  of  microglia,  with  particular  focus  on  the  response  of  microglia  to  damage.  Microglia  cells  exhibit  two  forms  of  motility,  constant  movement of filopodia probing surrounding brain tissue, and outgrowth of  larger processes  in  response to nearby damage. The mechanisms and functions of these motile processes are not  well  characterized.  Using  two  photon  microscopy  we  investigated  microglia  motility,  and  explored the relationship between process outgrowth and filopodia movement. We found that  fiolopodia sensing and rapid process outgrowth activities of microglia are mediated by distinct  mechanisms, but both  require actin polymerization. We also showed  that  rapid outgrowth of  microglia processes contacted the damaged area and resulted  in a decrease  in  lesion volume,  whereas inhibition of process outgrowth allowed lesion volume to increase and spread into the  surrounding tissue.   In  chapter  3  we  examine  the  response  of  microglia  to  immune  stimuli  and  use  specific  interfering  peptides  to  modulate  this  response.  We  used  peptides  blocking  LPS‐induced  activation of the innate immune Toll‐Like Receptor 4 (TLR4) to prevent downstream signaling in  iii    brain, and thereby suppress sickness behavior. Interfering peptides blocked TLR4 signalling and  prevented  second  messenger  activation  and  cytokine  production  normally  induced  by  LPS  treatment.  These  peptides  also  blocked morphological  changes  in microglia  induced  by  LPS.   Further, injections of interfering peptides prevented LPS‐induced sickness behavior, as assessed  in novel homecage behavior and with the intracranial self‐stimulation paradigm.    Taken  together our  studies demonstrate distinct  responses of microglia  to different  types of  pathological  insults:  acute  damage  and  pathogenic  stimuli.  Further,  these  studies  provide  means of  regulating  the dynamic  responses of microglia  to different  stimuli. Ultimately,  this  research  reveals  pathways  by which microglia  can  be manipulated,  and  potentially  provides  therapeutic targets to enhance the recovery of the brain from acute injury or infection.          iv    TABLE OF CONTENTS      ABSTRACT ....................................................................................................................... ii    TABLE OF CONTENTS ...................................................................................................... iii    LIST OF TABLES .............................................................................................................. vii    LIST OF FIGURES ........................................................................................................... viii    ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................................... x    DEDICATION ................................................................................................................... xi    CO‐AUTHORSHIP STATEMENT ....................................................................................... xii  1.  INTRODUCTION ............................................................................................................... 1  GENERAL INTRODUCTION .............................................................................................................................................. 1  BACKGROUND AND CURRENT KNOWLEDGE ....................................................................................................................... 4  1.1.  HISTORICAL OVERVIEW ..................................................................................................................................... 4  1.2.  THE ORIGIN OF MICROGLIA CELLS ....................................................................................................................... 6  1.3.  THE FUNCTIONS OF MICROGLIA CELLS ................................................................................................................. 7  1.3.1.  Migration ............................................................................................................................................. 7  1.3.2.  Proliferation ......................................................................................................................................... 8  1.3.3.  Respiratory Burst ................................................................................................................................. 9  1.3.4.  Phagocytosis ...................................................................................................................................... 10  1.3.5.  Antigen Presentation ......................................................................................................................... 11  1.3.6.  Synaptic Stripping .............................................................................................................................. 13  1.4.  FUNCTIONAL STATES OF MICROGLIA .................................................................................................................. 13  1.4.1.  Activated Microglia ............................................................................................................................ 14  1.4.2.  Ramified or Resting Microglia ............................................................................................................ 17  1.4.3.  Microglia Morphology Changes Depict a Shift in Function ................................................................ 20  1.5.  MICROGLIA ACTIVATING STIMULI...................................................................................................................... 21  1.5.1.  Lipopolysaccharide ............................................................................................................................. 22  1.5.2.  Cytokines ............................................................................................................................................ 26  1.5.3.  Chemokines ........................................................................................................................................ 28  1.5.4.  Growth Factors .................................................................................................................................. 29  1.5.5.  Pathological Proteins ......................................................................................................................... 29  v    1.5.6.  Complement Components .................................................................................................................. 30  1.5.7.  Adenosine Triphosphate .................................................................................................................... 30  1.6.  ION CHANNELS AND THEIR FUNCTIONAL IMPORTANCE IN MICROGLIA ...................................................................... 32  1.6.1.  Potassium and the Membrane Potential ........................................................................................... 34  1.6.2.  Regulation of Cell Volume .................................................................................................................. 35  1.6.3.  Neurotransmitter Receptors on Microglia Cells ................................................................................. 36  1.7.  INNATE IMMUNE RECEPTORS ........................................................................................................................... 38  1.7.1.  Toll‐Like Receptors ............................................................................................................................. 39  1.8.  THE ROLE OF MICROGLIA IN SICKNESS BEHAVIOUR ............................................................................................... 46  1.8.1.  Molecular basis of sickness behaviour ............................................................................................... 47  1.8.2.  Chronic Effects of Sickness Behaviour ................................................................................................ 47  1.8.3.  Sickness Behaviour and Depression ................................................................................................... 48  1.9.  INFLAMMATION AND NEURODEGENERATION ....................................................................................................... 48  1.10.  MICROGLIA AND STROKE ................................................................................................................................. 49  1.11.  RATIONALE, HYPOTHESIS AND OBJECTIVES .......................................................................................................... 50  1.12.  REFERENCES ................................................................................................................................................. 55  2.  MICROGLIA PROCESSES BLOCK THE  SPREAD OF DAMAGE  IN THE BRAIN AND REQUIRE  FUNCTIONAL CHLORIDE CHANNELS ...................................................................................... 79  2.1.  INTRODUCTION ............................................................................................................................................. 79  2.2.  MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................................. 81  2.2.1.  Slice preparation and solutions .......................................................................................................... 81  2.2.2.  Two‐photon imaging and laser micro‐lesion ..................................................................................... 81  2.3.  RESULTS....................................................................................................................................................... 83  2.4.  DISCUSSION ................................................................................................................................................ 101  2.5.  REFERENCES ............................................................................................................................................... 105  3.  PREVENTION OF  LPS‐INDUCED MICROGLIA ACTIVATION,  CYTOKINE  PRODUCTION AND  SICKNESS BEHAVIOR WITH TLR4 RECEPTOR INTERFERING PEPTIDES .................................. 108  3.1.  INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 108  3.2.  MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................................... 109  3.2.1.  Peptide Design ................................................................................................................................. 109  3.2.2.  LPS and Peptide Administration ....................................................................................................... 109  3.2.3.  Slice Preparation and Solutions ....................................................................................................... 110  3.2.4.  Two‐Photon Imaging ....................................................................................................................... 110  vi    3.2.5.  Western Blotting and Co‐Immunoprecipitation ............................................................................... 111  3.2.6.  Enzyme‐Linked ImmunoSorbent Assay ............................................................................................ 112  3.2.7.  Cumulative Behavioral Score ........................................................................................................... 112  3.2.8.  Novel Home Cage Behavior ............................................................................................................. 114  3.2.9.  Intra‐cranial Self Stimulation ........................................................................................................... 114  3.3.  RESULTS..................................................................................................................................................... 116  3.4.  DISCUSSION ................................................................................................................................................ 130  3.5.  REFERENCES ............................................................................................................................................... 133  4.  CONCLUDING CHAPTER ............................................................................................... 135  4.1.  SUMMARY OF FINDINGS ................................................................................................................................ 135  4.2.  HARMFUL VERSUS BENEFICIAL ROLES OF MICROGLIA .......................................................................................... 137  4.3.  EFFECTS OF LPS ON COGNITION ..................................................................................................................... 139  4.4.  OTHER MEANS OF REGULATING MICROGLIA AND INFLAMMATION ........................................................................ 139  4.4.1.  RNA Interference .............................................................................................................................. 139  4.4.2.  Modulation of Microglia by Minocyline ........................................................................................... 140  4.5.  REFERENCES ............................................................................................................................................... 141  5.  APPENDIX A: ETHICS BOARD CERTIFICATES ................................................................. 144        vii    LIST OF TABLES    Table 1.1   Summary  of  categories  of  compounds  or  agents  that  activate  microglia  ............................................................................................................................. 22    Table 1.2   Summary table of cytokines and chemokines produced by microglia cells ........ 26    Table 1.3   Ion  channels of microglia,  and  the  factors  identified  to  regulate  their  function  ............................................................................................................................. 33    Table 1.4   Neurotransmitter  receptors  expressed  on microglia  cells,  and  their  identified  functions ............................................................................................................. 36        viii    LIST OF FIGURES    Figure 1.1   Overview  of  major  signalling  pathways  and  actions  of  microglia  ............................................................................................................................... 2     Figure 1.2   Functional  states  of  microglia  as  determined  by  their  morphology  ............................................................................................................................. 15    Figure 1.3   Generation of the CX3CR1 GFP transgenic mouse, which permits microglia specific  expression of green fluorescent protein ............................................................. 18    Figure 1.4   The  steps  of  LPS  recognition  and  binding  by  TLR4  and  associated  proteins  ............................................................................................................................. 24     Figure 1.5   Alignment of  the TIR domain  sequences  from multiple proteins, and  structural  representations of the TLR4 TIR domain ............................................................  40     Figure 1.6   Signalling  pathways  initiated  by  binding  of  LPS  to  TLR4  via  MD‐2  ............................................................................................................................. 43     Figure 2.1   Distinct microglia  activities  of  sensing,  and  process  outgrowth  in  response  to  laser microlesion ................................................................................................. 84    Figure 2.2   Microglia process outgrowth involves a loss of sensing filopodia, polarization and  competition between processes ......................................................................... 87    Figure 2.3   The chloride channel blocker tamoxifen  inhibits microglia process outgrowth  in  response to laser microlesions ............................................................................ 90    Figure 2.4   Blocking  actin  polymerization  or  chloride  channels  inhibits  microglia  process   outgrowth in response to laser micro‐lesions ..................................................... 93    Figure 2.5   Blockers  of  cytoskeletal  dynamics  block  sensing  activity  in microglia, whereas  chloride channel blockers do not ........................................................................ 96    Figure 2.6   Lesion  expansion  into  surrounding  tissue  only  occurred  when  microglia  processes were inhibited from reaching lesions ................................................. 98    Figure 3.1   Schematic diagram showing the mechanism of action of the Tat‐MyD88 and Tat‐ TLR4  peptides  and  their  efficacy  in  preventing  protein  interactions  in  vivo  ........................................................................................................................... 117    ix    Figure 3.2   Time course of kinase activation and TNF‐α  formation  following LPS treatment,  and the inhibition by Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4 ................................................ 120    Figure 3.3   Time  course  of  LPS‐induced microglia morphology  changes  visualized  using  2‐ photon  imaging  and  the  block  by  Tat‐TLR4  and  Tat‐MyD88  ........................................................................................................................... 124    Figure 3.4   LPS  induced  sickness  behavior  was  blocked  by  Tat‐MyD88  and  Tat‐TLR4  as  assessed  in mice using a modified SHIRPA  screen and  in  the novel home  cage  following various treatments ............................................................................ 127            x    ACKNOWLEDGEMENTS    First  and  foremost  I would  like  to  thank my  supervisor Dr. Brian MacVicar.   Dr. MacVicar  is  affectionately known as “The Big Man” by lab members.  This moniker might at first appear to  reflect  his  tall  stature but  I would  like  to  clarify  the meaning  of  this.   Dr. MacVicar  has  the  biggest spirit, the biggest heart, and a grand  intellect that all taken together have earned him  this title.  Dr. MacVicar has been both an advisor and a mentor to me during my PhD.    I would like to thank all my committee members including Dr. Wang, Dr. Raymond, Dr. Phillips  and  the  late Dr. El‐Husseini  for all  their comments. Dr. El‐Husseini’s smile  is still bright  in my  mind’s eye.   Ms. Denise Feighan for her support of my science and helping with my lack of my  administrative skills.   Dr. Mulligan and Dr. Thompson  for their support and  friendship both  in  and out of the lab. Mrs. Ning Zhou for her friendship and always laughing at my bad jokes.  Dr.  Choi for his amazing biochemistry skills. Finally, thanks to my family (Hines, Bruneau, and Freer)  for picking up or showing me the pieces when needed.      xi    DEDICATION    For Rochelle   Who has taught me that in dreams and in love there are   no impossibilities.    xii    CO­AUTHORSHIP STATEMENT    I was  involved  in the original conception and planning of all of the experiments  involved with  this  thesis.  I  also  participated  in  all  of  the  experimental  procedures  needed  to  conduct  the  research. For chapter 3, Dr. H.B. Choi conducted Western Blotting and ELISA assessments, and  R. Hines conducted co‐immunoprecipitation experiments. I prepared all of the figures for, and  co‐wrote both manuscripts in conjunction with Dr. Brian MacVicar.  1    1. INTRODUCTION  General Introduction  Vertebrate  organisms  can  be  thought  of  as  possessing  two  advanced  systems  capable  of  learning  and  remembering,  the  first  being  the  nervous  system,  and  the  second  being  the  immune system. The organism  is greatly dependent the functioning of both of these systems  for survival. Microglia,  the  resident  immune cells of  the brain, can be seen as a point where  research on the nervous system and the immune system converge.   As  the principal  immune  cell of  the brain, microglia  cells are  responsible  for monitoring  the  activity of other cells  in the CNS, and are able to respond to harmful stimuli with a myriad of  supportive and defensive mechanisms (Barron, 1995; Kreutzberg, 1996).  In order to complete  these tasks, microglia must have sensory equipment such as receptors and channels that can  report on alterations  in soluble and  insoluble  factors  in their  immediate environment  (Figure  1.1)  (Giulian  et  al.,  1993b;  Giulian  et  al.,  1993a).    In  addition  they  require  a  repertoire  of  releasable  factors  in  order  to  communicate with  neighbouring  cells  and mount  a  response  (Perry, 2004; Block et al., 2007).  With these capacities as the resident immune cell in the brain,  microglia are involved in numerous diseases of the CNS, ranging from acute injury or infection  to chronic neurodegeneration (Hanisch and Kettenmann, 2007; Kettenmann, 2007).  Microglia  cells provide  a  fundamental beneficial  response of  the brain  to damage,  cellular disruption,  stress, or foreign molecules (Streit, 1996).  However it is also widely accepted that these cells  can generate bystander damage  to neurons and disrupt normal brain  function  (Block et al.,  2007).    It  is  because  of  this multiplicity  of  fundamental  roles  that modulation  of microglia  activity represents an attractive means of regulating brain function.  2                                            Figure  1.1. Overview  of major  signalling  pathways  and  actions  of microglia. Microglia  are  capable of responding to a wide range of stimuli with a number of actions  including motility,  phagocytosis, proliferation and cytokine production. Figure adapted  from Hanisch, Glia. 2002  40(2):140‐55.       3                              4    Background and Current Knowledge  1.1.   Historical Overview  Although it is more than 100 years old, the earliest research on microglia provides remarkable  insights  into what we  know  now  about  these  amazing  cells.  Early  anatomists  like  Virchow  (1859) and His  (1874) used basic microscopy techniques to observe microglia and postulated  their  role  in  disease  processes  (Virchow,  1859;  His,  1874).  Further  His  (1874) was  able  to  identify  that microglia do not enter  the developing nervous  system of human embryos until  the  second month. Based on his observations  in 1892, Nissl proposed  that  glial  cells  in  the  brain have similar functions to the macrophage cells of other tissues (Nissl, 1892). The terms  neuroglia and mesoglia were developed by Robertson who defined mesoglia based on  their  origin  from  mesodermal  tissue  and  their  capabilities  for  phagocytic  activity  in  neurodegenerative  disease  (Robertson,  1890).    It  was  this  research  that  led  Alzheimer  to  suggest that an acute infection caused microglia cells to become activated, leading to disease  progression (Alzheimer, 1904). It was Cajal in 1913 that brought great interest to the research  on  glia  by  labelling  them  as  the  third  critical  element  in  the  central  nervous  system  (Cajal,  1913).   The research of the Spanish neuroanatomist Pio del‐Rio Hortega  was the first to highlight that  the mesoglia  largely  consisted of a  cell  type  that he  called  the  “microglia”  (del Rio‐Hortega,  1932, 1937) . It was this labelling of the cell that imparted Rio‐Hortega with the tile of “father  of microglia biology”.  Rio‐Hortega further elucidated the functions of microglia and developed  concepts  of  microglia  that  are  both  relevant  and  referenced  currently.  Hortega  identified  microglia  in  every  location  of  the  CNS  (del  Rio‐Hortega,  1932),  which  contributed  to  the  5    underappreciated understanding that the brain is composed primarily of glial cells, while only  15% of the cells in the brain are neurons (Streit, 1995).   With  the development of  research,  the  term microglia has come  to  refer  to cells  that  reside  within the CNS and share many,  if not all of, the properties of macrophages of other tissues.  One distinguishing  feature of microglia  from other macrophages  is  that microglia  appear  to  exist  in a  resting state, which differs  in morphology  from  the activated state  (Barron, 1995).  Also  microglia  are  distinguished  by  the  fact  that  they  are  not  enclosed  by  perivascular  membrane of the brain blood vessels (Perlmutter et al., 1995; Williams et al., 2001a; Williams  et al., 2001b). This  fact distinguishes microglia  from perivascular and meningial macrophages  (Steindler et al., 1996; Polfliet et al., 2001; Polfliet et al., 2002).  In the past 20 years there has been a giant reawakening of microglia research.   The thrust  in  new  research has come  from an understanding  that microglia cells are  the key mediators  in  numerous neurodegenerative diseases.   Various  reviews discussing  the  roles of microglia  in  normal and pathological states have also recently been published (Kaur et al., 1985; Ling and  Wong, 1993; Barron, 1995; Gehrmann et al., 1995; Aloisi, 1999; Davoust et al., 1999; Aloisi,  2001; Male and Rezaie, 2001; Nelson et al., 2002; Oliveira et al., 2003; Davoust et al., 2008;  Streit et al., 2008).  Although many articles have tackled the role of microglia in the progression  of disease, very few have critically assessed the beneficial roles of this important cell type. The  role of  this  thesis  research  is  to  examine mediators of both  the beneficial  and pathological  effects  of microglia  activation. Controversy  surrounds  the  role  of microglia  as  protective  or  harmful in response to various stimuli in the CNS, demonstrating that there are gaps remaining  6    in our understanding of these cells(Schwartz, 2003; van Rossum and Hanisch, 2004; Mena and  Garcia de Yebenes, 2008).    1.2.   The Origin of Microglia Cells  Some  controversy  has  also  surrounded  the  issue  of  the  origins  of microglia. Microglia  are  thought  to  arise  from  two  different  pools  of  myeloid  cells  that  successively  infiltrate  the  developing  nervous  system  (Chan  et  al.,  2007;  Tambuyzer  et  al.,  2009).    The  infiltration  of  these  cells  begins  embryonically  and  is  derived  from  hematopoietic  cells  arising  in  the  embryonic yolk sac  (Navascues et al., 2000; Cuadros and Navascues, 2001; Kaur et al., 2001;  Santos et al., 2008). The second pool of myeloid cells is derived from bone‐marrow monocytes  that  colonize  the  nervous  system  during  the  period  just  before  birth,  or  during  the  early  postnatal period  (Navascues et al., 2000; Cuadros and Navascues, 2001; Santos et al., 2008).  Although the origin of microglia cells during development is well understood, the ontogeny of  microglia cells in the adult CNS is not well understood. Certain events during the lifetime of the  CNS allow for the entry of cells through the tightly regulated blood brain barrier (Dallasta et al.,  1999; Medana et al., 2000; Kaur and Ling, 2008). Further, the functional role of resident versus  invading microglia cells in disease progression is also highly debated (Kreutzberg, 1996; Adam  et al., 2005; Davoust et al., 2006; Thomas et al., 2006; Denker et al., 2007; Neumann et al.,  2008).    7    1.3.   The Functions of Microglia Cells  Several different functions have been identified for microglia, which result from various types  of stimuli (Banati, 2003; Minghetti, 2005). The specific functions of microglia will be discussed  in this section, while the factors and signals that are  involved  in  initiating or regulating these  function will be discussed in the section “Microlgia Activating Stimuli” below.    1.3.1. Migration  One  of  the  first  characterized  active  responses  of microglia  to  physiological  stimuli  is  the  migratory response observed  following  injurious or  inflammatory  insults  (Eder, 2005; Garden  and Moller, 2006; Lee et al., 2006; Thored et al., 2008; Graber and Dhib‐Jalbut, 2009). Although  undefined,  it  is thought that  injury to CNS tissue results  in the release of chemotactic factors  that  initiate microglia migration to the site of  injury (Badie et al., 1999; de Haas et al., 2007;  Nutile‐McMenemy et al., 2007; Amantea et al., 2009). Pro‐migratory  factors  that have been  identified are members of  the  chemokine  family. Chemokine gradients have been  shown  to  guide microglia migration  in vitro and  in  injury models of  the developing CNS  (Cartier et al.,  2005).   Multiple  studies have also  shown  that extracellular ATP and ADP are  released upon  acute injury to the CNS, and act to guide microglia migration (Honda et al., 2001; Agresti et al.,  2005; Haynes  et  al.,  2006;  Farber  et  al.,  2008; Duan  et  al.,  2009).  Trophic  factors,  such  as  vascular endothelial growth factor (VEGF) have also been shown to act as guides for microglia  migration  (Forstreuter et al., 2002; Mentlein et al., 2004; Sobrado‐Calvo et al., 2007).  It has  also been shown that non‐soluble factors can direct microglia migration, such as changes in the  extracellular matrix. While  some matrix proteins,  such  as  the b2‐integrin CD11a, have been  8    shown to be necessary to permit normal migration  in response to  injury  (Ullrich et al., 2001;  Diestel et al., 2003; Lunemann et al., 2006), others have been shown to be anti‐adhesive and  thus  inhibitory,  such as  tenascin‐R  (Angelov et al., 1998). Tenascin‐R has been  shown  to be  down‐regulated, thus permitting the migration of microglia in response to microglia activation  by axotomy, exposure to TNF‐a, or treatment with microglia‐condiitoned media (Angelov et al.,  1998; Hao et al., 2007; Liao et al., 2008).      1.3.2. Proliferation  Microglia  cells  have  also  been  shown  to  enter  a  proliferative  state  in  response  to  various  stimuli (Kreutzberg, 1996; von Zahn et al., 1997; Perry, 1998; Liva et al., 1999; Das and Basu,  2008).  Signals  for  proliferation,  some  of  which  remain  unidentified,  typically  result  from  traumatic or ischemic injury, and neuronal or axonal degeneration (Neuwelt et al., 1978; Liu et  al., 2001; Davies et al., 2006; Kriz, 2006). During the process of migration, where existing cells  invade  an  injured  area  of  the  CNS,  microglia  simultaneously  respond  to  cytokines  that  stimulate microglia cell division, such as  interleukin (IL) ‐1β, IL‐4, and  interferon (IFN) ‐γ  (Kim  and  de  Vellis,  2005).    Some  of  the  most  potent  signals  for  the  induction  of  microglia  proliferation include macrophage colony‐stimulating factor (M‐CSF; (Kim and de Vellis, 2005)),  and granulocyte macrophage colony‐stimulating factor (GM‐CSF). GM‐CSF has been shown to  act in concert with the tyrosine kinase CD45 to induce microglia proliferation (Suh et al., 2005;  Floden and Combs, 2007). Release of neurotrophic  factors  from activated microglia,  such as  BDNF  and NT‐3,  can  also  act  in  as  inducers  of microglia  proliferation  (Elkabes  et  al.,  1996;  Tauber et al., 2005; Liao et al., 2008). The proliferative population of microglia has been shown  9    to be  resident microglia,  rather  than  infiltrating macrophages, and  further  that  the  resident  population of proliferating microglia express the stem cell marker CD34 (Ladeby et al., 2005b;  Ladeby et al., 2005a; Dissing‐Olesen et al., 2007; Julow et al., 2007). Some have suggested that  surveying or  resting microglia cells  represent an undifferentiated cell population  that can be  induced  to  divide  and  take  on  a  number  of  different  activated  microglia  phenotypes  (Santambrogio et al., 2001; Illes et al., 2005), however this possibility may not be rapid enough  to  account  for  the  speed  at which microglia  activation has been  seen  to occur under  some  stimuli.    Ajami  et  al.  (2007)  suggest  that  in  diseased  states  the  maintenance  and  local  expansion of microglia are solely dependent on the self‐renewal of CNS resident cells.    1.3.3. Respiratory Burst  Respiratory burst, also  referred  to as oxidative burst,  is  the  rapid  release of  reactive oxygen  species, most commonly from immune cells (Colton and Gilbert, 1987; Yao et al., 1990; Colton  and Gilbert, 1993).  Production of nitric oxide (NO) and respiratory burst are primary actions of  microglia  in  response  to  pathogen  invasion  of  the  CNS  (Fordyce  et  al.,  2005; Ghosh  et  al.,  2007). The generation of superoxide and peroxinitrate, a by‐product of NO, produce oxidative  DNA damage to nearby invading pathogens (Tolias et al., 1999; Halliwell, 2001; Wu et al., 2003;  Wilkinson  and  Landreth,  2006).   While  respiratory  burst may  act  to  protect  the  CNS  from  infection, this response to non‐infectious stimuli may result  in oxidative  injury to CNS tissues  themselves  (Halliwell,  2001).    NO  is  generated  in  microglia  by  the  inducible  form  of  NO  synthase (iNOS)(Kaushal and Schlichter, 2008). Induction of microglia iNOS and the generation  of  NO  has  been  associated  with  various  injury  and  disease  models  (Tieu  et  al.,  2003).  10    Examination of Multiple Sclerosis lesion pathology has shown that iNOS is expressed by a large  population of cells labelled with microglia markers, as well as a smaller population of activated  astrocytes labelled with GFAP surrounding the inflammatory lesion (Hill et al., 2004; Tsoi et al.,  2006). The superoxide anion and hydrogen peroxide of the respiratory burst are generated by  the  enzyme  NADPH  oxidase.  Studies  have  shown  that  cultured  microglia  express  NADPH  oxidase (Sankarapandi et al., 1998), and also  in tissue sections, NADPH oxidase was shown to  co‐localize with microglia markers  and  increase  in  expression  following  injury  (Green  et  al.,  2001).  NADPH  oxidase  knockout  animals  are  shown  to  be  protected  from  ischemic  insults  (Walder  et  al.,  1997),  as well  as models of Parkinson’s disease  (Qin  et  al.,  2004; Qin  et  al.,  2008).    1.3.4. Phagocytosis  Microglia  also  function  as  the  primary  phagocyte  in  the  brain,  acting  to  engulf  invading  microbes  and  pathological  proteins.  In  particular,  it  has  been  shown  that  the  Alzheimer  associated accumulation of Aβ can be engulfed by microglia (Rogers et al., 2002; Ambree et al.,  2006; Nicoll  et  al.,  2006;  Familian  et  al.,  2007;  Fiala  et  al.,  2007).  In  addition  to  control  of  invading  pathogens  and  pathological  proteins  in  the  CNS,  phagocytosis  by microglia  is  the  primary mechanism for removal of apoptotic cell debris. The molecular mechanisms governing  microglia  recognition  of  appropriate  items  for  phagocytosis  have  not  been  completely  characterized (Fiala et al., 2007).   Some  important  signals  identified  for phagocytosis of dying  cells  include phosphatidylserine  expressed on the surface of apoptotic cells, the microglia vitronectin receptor (Akiyama et al.,  11    1991; Witting et  al., 2000),  and  the CD36  scavenger  receptor  (Stolzing  and Grune, 2004). A  wide variety of microbes have been shown to bind and activate triggering receptor expressed  on myeloid  cells‐2  (TREM‐2;  (Piccio  et  al.,  2008)),  an  orphan  receptor  whose  endogenous  ligand  has  not  been  identified.  Microbial  activation  of  TREM‐2  promotes  phagocytosis  by  microglia  and  leads  to  inhibition  of  pro‐inflammatory  cytokines  (Takahashi  et  al.,  2005).  In  contrast, TREM‐2 deficiency leads to impairments in clearance of apoptotic cells, and promotes  microglia cytokine production (Takahashi et al., 2005). The human disease Nasu‐Hakola disease  has been  linked  to a TREM‐2 deficiency, and  is  characterized by progressive  frontotemporal  dementia (Cella et al., 2003; Piccio et al., 2008). This strongly suggests that TREM‐2 mediated  differentiation of microglia  is essential for normal maintenance of the CNS, which may result  from the need to prevent cytokine secretion, and/or the need  for phagocytosis by microglia,  and/or  the  initiation of  immunomodulatory events  subsequent  to phagocytosis by microglia  (Cella et al., 2003; Piccio et al., 2008).   Events subsequent to phagocytosis by microglia have  been shown to include reductions in secretion of IL‐12, IFN‐γ, and TNF‐α (Magnus et al., 2001).  In contrast, IFN‐β has been shown to enhance the ability of microglia to phagocytose apoptotic  T‐cells. Via this mechanism, IFN‐β has been shown to suppress the immune response, and thus  has been employed as an immunomodulatory therapy for multiple sclerosis (Chan et al., 2001;  Kawanokuchi et al., 2004; Graber and Dhib‐Jalbut, 2009).      1.3.5. Antigen Presentation   As a component of the  immune system, microglia also possess the capacity to act as antigen  presenting cells to generate an adaptive  immune response (Matsumoto et al., 1986; Streit et  12    al., 1988; Graeber, 1993; Santambrogio et al., 1999; Suzumura, 2002; Miller et al., 2007). Once  an antigen containing microbe,  infected cell or other foreign material has been engulfed, the  phagocytic cell presents the processed peptides on the cell surface to  interact with receptors  on T‐cells. The central  type of antigen presenting cell  is  the dendritic ell  type, which can be  identified  by  surface  expression  of major  histocompatibility  complex  (MHC)  ‐II  and  CD11c  (Akiyama  and McGeer, 1990; Ulvestad et  al., 1994b; Ulvestad et  al., 1994a). Microglia have  been  shown  to  up‐regulate  expression  of  these  dendritic  cell markers,  along with  the  co‐ stimulatory molecules B7.1 and B7.2, and  the cathepsin protease  required  for generation of  antigen peptides  in response to specific types of stimuli (De Simone et al., 1995; Aloisi et al.,  1998; Bohatschek et al., 2004). In models of CNS infection or in the encephalomyelitis murine  model  (EAE)  of  multiple  sclerosis,  isolated  CNS  cells  share  features  with  recently  divided  microglia cells, and are capable of presenting antigens to T‐cells (Mack et al., 2003; Ponomarev  et  al.,  2005;  Li  et  al.,  2007;  Beauvillain  et  al.,  2008).  In  addition  to  these models,  studies  conducted  on  stroke  (Reichmann  et  al.,  2002),  amyotrophic  lateral  sclerosis  (Henkel  et  al.,  2004;  Beers  et  al.,  2006),  and  neoplastic  (Watters  et  al.,  2005)  tissues  show  expression  of  surface markers. Some debate still exists as  to whether  these antigen presenting cells  in  the  CNS are actually dendritic cells from the periphery that invade.  Use of bone marrow chimeric  mice demonstrated that both peripheral cells and parenchymal microglia are required for the  neuroprotective  function  of  activated  T‐helper  cells  (Byram  et  al.,  2004).  This  suggests  that  microglia may not be capable of mounting a complete response on their own, but participate  in antigen presentation with the help of circulating dendritic cells.   13    1.3.6. Synaptic Stripping  Microglia have also been shown to be  involved  in the remodelling of dendritic arbour  follow  injury,  in a process termed synaptic stripping. The classic example of this process  is observed  about four days following axotomy of the facial nerve (Graeber et al., 1988; Rieske et al., 1989;  Streit and Graeber, 1993; McNamara et al., 2000; Ankeny and Popovich, 2007).  At this stage,  activated microglia ensheath the soma of injured motor neurons, and detach afferent synaptic  terminals from the motor neuron surface (Neiss et al., 1992; Graeber et al., 1993; Schiefer et  al., 1999; Yamada et al., 2008). Also in this model, microglia in the region of the motor neurons  become activated, but do not phagocytose the cells unless the motor neurons have undergone  lethal damage (Illes et al., 1996b; Schiefer et al., 1999; Rasmussen et al., 2007).     1.4.   Functional States of Microglia  The term glia for the non‐neuronal cell types in the brain was derived from the Greek word for  glue, which was  linked  to  the  supportive  role  that astroglia and oligodendroglia have  in  the  CNS. The supportive role for astrocytes  is evident, since they have been shown to contribute  importantly to neurotransmitter metabolism and regulation of synaptic activity (Barres, 1989;  MacVicar and Hochman, 1991; Fraser et al., 1994; Mennerick et al., 1996; Basarsky et al., 1999;  Carmignoto, 2000; Araque et al., 2001; Zonta and Carmignoto, 2002; Moriguchi et al., 2003;  Wang et al., 2006). Similarly, oligodendrocytes have been clearly identified by their role in the  myelination of neurons, making their supportive role evident (Kettenmann et al., 1984; Pastor  et al., 1995). In contrast, it is debated whether microglia activated in response to pathological  stimuli  have  a  supportive  or  harmful  role  (Schwartz  et  al.,  2003; Witting  et  al.,  2006).    In  14    addition, the precise role for normal, non‐activated or resting microglia in CNS support has not  been clearly identified (Pocock and Kettenmann, 2007). To understand further about the roles  of microglia,  it  is useful  to  consider what  is  known  about  the morphological  states,  termed  ramified  (resting),  or  activated,  that  are  used  to  classify  these  complex  cells  (Figure  1.2)  (Kreutzberg, 1996).    1.4.1. Activated Microglia  In  response  to  a  variety of  stimuli, microglia have  the  capacity  to dramatically  change  their  morphology to reactive forms, and to rapidly up‐regulate a number of receptors, and rapidly  produce a variety of secretory products (Maslinska et al., 1998; Tanaka et al., 1999; Mertsch et  al.,  2001;  Dalmau  et  al.,  2003;  Zhang  et  al.,  2005;  Tassi  et  al.,  2006). Within  the  state  of  activation, microglia  appear  to  have  a  spectrum  of  states.  For  example, minor  changes  in  microglia morphology and  functional state can even be observed  in the process of preparing  cultured microglia, which have been shown to express CD14, a marker not  found  in ramified  microglia  (Beschorner et al., 2002b).   At  the extreme end of  the activated  state, stimulation  with  lipopolysaccharide  (LPS)  to mimic  infection,  results  in marked  alterations  in microglia  function (Illes et al., 1996a; Hayakawa et al., 1997).  Many studies have suggested that microglia are  involved  in both protective and pathological  activities in the course of infection and inflammatory diseases of the CNS (Nakamura, 2002).  A  supportive  role  for  fully  activated,  ameboid microglia  in  CNS  is  observed  in  the  fetal  brain,  where  ameboid  microglia  scavenge  pruned  materials  during  the  remodelling  stages  of  development  (Voyvodic,  1996;  Watanabe  et al.,  1997).  Ameboid  microglia during this stage   15                                          Figure 1.2. Functional states of microglia as determined by their morphology. In the resting or  ramified  state, microglia  possess  numerous  branches,  in  contrast  to  the  fully  activated  or  ameboid state which lacks branches.    16                    17    have been shown to express specific scavenger receptors, which are not detected in postnatal  or adult tissue (Husemann et al., 2001; van Rossum et al., 2008; Napoli and Neumann, 2009).   The supportive role for activated microglia has been demonstrated in the case of nerve injury  or axotomy, where the trophic function of activated microglia is essential for recovery (Harada  et al., 2002; Makwana et al., 2007). Since  supportive  roles of activated microglia have been  identified, extensive research has been conducted on the regulatory factors that contribute to  microglia activation in vitro (Nakamura, 2002). However, it is clear that cultured microglia can  not  exactly  replicate  the  state  of  native microglia  in  intact  tissue,  and  recent  studies  are  focusing on the study of microglia in vivo (Hanisch and Kettenmann, 2007).    1.4.2. Ramified or Resting Microglia  The  contrasting morphology,  and  low  expression  of molecules  associated with macrophage  function,  has  lead  to  the  interpretation  that microglia  in  healthy  CNS  tissue  are  resting  or  inactive cells. Although  these cells are  thought  to be  resting,  they constitutively express cell  surface markers of immune cells, including the major histocompatibility complex (MHC) class II  molecules (Lowe et al., 1989; Redwine et al., 2001; Nakanishi, 2003; Liu et al., 2005). Further  study of microglia in vivo has enabled us to understand that cells with a ramified morphology  are  not  resting.  A  major  development  in  the  study  of  microglia  in  vivo  came  with  the  generation of a  transgenic mouse model, where expression of  the green  fluorescent protein  (GFP)  is  controlled  by  a microglia  specific  promoter  (Figure  1.3)  (Jung  et  al.,  2000).  In  this  mouse  model,  GFP  has  been  inserted  into  the  Cxcr1  locus,  which  encodes the chemokine       18                                      Figure 1.3. Generation of the CX3CR1 GFP transgenic mouse, which permits microglia specific  expression  of  green  fluorescent  protein.  Insertion  of  GFP  was  achieved  by  homologous  recombination  at  the  Cxcr1  locus.  Figure  adapted  from  Jung  et  al.,  Mol  Cell  Biol.  2000  20(11):4106‐14.      19                            20    receptor  for the CX3CL1 or  fractalkine which  is exclusively expressed  in microglia  in the CNS.  Live two‐photon imaging of this mouse showed that the arbour of ramified microglia is highly  motile,  with  continuous  withdrawal  and  extension  of  major  processes,  and  filopodia‐like  protrusions  (Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005; Haynes et al., 2006).  It has been  suggested that this filopodia movement allows microglia to constantly probe the surrounding  environment, without having to move the cell body, and with the precision of fine processes  that do not disrupt  the surrounding neuropil. Some estimates have stated  that  this constant  motility would permit scanning of the entire brain parenchyma every few hours (Davalos et al.,  2005; Nimmerjahn et al., 2005; Haynes et al., 2006).    1.4.3. Microglia Morphology Changes Depict a Shift in Function  These new studies raise questions about applying the term resting applied to microglia  in the  healthy CNS, because  it appears  that  these  ramified microglia are characterized by constant  morphology changes and continuous “observation” and “interpretation” of surrounding cues  (Haynes et al., 2006). Rather  than  viewing microglia  as existing  in distinct  active or  inactive  states,  it  is now becoming apparent  that microglia exist  in a  continuum of  functions, which  dynamically shifts depending upon the environment. This is in contrast to the understanding of  microglia  obtained  from microscopy  of  fixed  tissue  samples, which  provided  a  “step‐wise”  model  of  “awakening”  of  microglia  resulting  from  pathological  stimuli  (Barron,  1995;  Kreutzberg, 1996; Aloisi, 2001).    In a recent review, Hanisch and Kettenamnn (2007) propose  that  the  term  resting  should  no  longer  be  used,  and  because  of  their  active  probing  and  21    sensing of the environment these cells should be referred to as “surveying” microglia (Hanisch  and Kettenmann, 2007).    1.5.  Microglia Activating Stimuli  Out  of  the  large  body  of  research  based  on  activation  states  of  microglia  came  the  identification of  several  signals or  stimuli  that can  induce a  change  in microglia morphology  and  function  (Table 1.1)  (van Rossum and Hanisch, 2004).    In particular, neuronal damage or  the process of neurodegeneration can result  in the release of a myriad of factors that  initiate  molecular cascades in microglia cells (Streit et al., 2008). Specifically, studies have shown that  activated microglia respond to neuronal damage to phagocytose the damaged tissue (Schilling  et  al.,  2005). However,  the  signals  being  sent  by  damaged  or  dying  tissues  have  not  been  clearly identified.   Microglia have been shown  to  respond  to other  types of stimuli,  through cytokine pathways  that  remain unclear  (Hanisch, 2002). Further,  the  initial or common activator of microglia  in  response to harmful stimuli has not been established. Part of the problem in identification lies  in  the  fact  that while  some  cytokines  or  signals  are  capable  of  activating microglia,  others  inhibit, and yet another group more subtly modulates the  level of activation (Hanisch, 2002).  These modulators exist such that microglia activation can be carefully regulated, and not result  in additional damage.  In contrast, pathological or chronic activation of microglia may result in  conditions such as depression and/or neurodegeneration (Butovsky et al., 2005; Nakagawa et  al., 2006; Maccioni et al., 2009). This section will provide an overview of the major categories  22    of  compounds  that  have  been  shown  to  result  in morphological  and  functional  changes  to  microglia.    Table 1.1. Summary of categories of compounds or agents that activate microglia. Adapted  from Hanisch and Kettenmann, Nat Neurosci. 2007; 10(11):1387‐94.  Class of Compound  Examples  Infectious agent surface  Bacterial  cell  wall  proteoglycans;  Lipopolysaccharide  Pathological proteins   Β‐Amyloid  aggregates  &  fragments;  prion  protein  Other proteins and peptides  Apolipoprotein  E;  CD40L;  melanocyte  stimulating  hormone  (MSH);  endothelin;  vasoactive intestinal peptide (VIP)  Complement  Complement factor C1q and C5a    Antibodies  Immunoglobulin (Ig) A, G and M    Cytokines  Colony  stimulating  factor  (CSF) M‐  and GM‐;  interleukin (IL) ‐1β, ‐2, ‐4, ‐6, ‐10, ‐12, ‐15, and  ‐18;  interferon  (IFN) –γ;  transforming growth  factor (TGF) β; tumor necrosis factor (TNF) α  Chemokines  CCR3,  5;  CXCR,  2,  4;  CX3CR1;  interleukin  (IL)   ‐8R  Neurotrophic Factors  Brain‐derived  (BDNF);  glial‐derived  (GDNF);  nerve (NGF); neurothropin (NT) ‐3, ‐4  Serum factors and proteases  Albumin; thrombin    Ions  K+; Mn2+   Other compounds  Ceramide; gangliosides; lysophosphatidic acid;  melatonine;  platelet‐activating  factor;  prostaglandine  E2;  steroids  and  steroid  hormones; vitamin D3    1.5.1. Lipopolysaccharide   The glycolipid lipopolysaccharide (LPS) is a major component of the outer membrane of Gram‐ negative bacteria. Treatment with LPS has been shown to elicit a robust  immune response  in  23    animal models of  infection, and has been shown to trigger a complex series of  inflammatory  reactions  in macrophages and microglia,  leading to production of cytokines, chemokines, and  prostaglandins (Beutler et al., 2003; Hoebe et al., 2003). LPS has also been shown to result  in  the production of NO via iNOS (Golde et al., 2003; Li et al., 2005b). The production of cytokines  and NO can be so extreme that they  lead to endotoxin shock and even death (de Bock et al.,  1998; Mayer et al., 1999; Li et al., 2005a). These extreme responses to LPS can result from both  infections with a large number of bacteria, or by a high sensitivity of the organism to LPS.  Strains  of mice,  called  C3H/HeJ  (Sultzer,  1972a),  C57BL/10ScCr  (Coutinho  et  al.,  1977),  and  C57Bl/10ScN  (Rosenstreich  et  al.,  1978; Vogel  et  al.,  1979) were  identified  as  having  a  low  sensitivity to LPS. Subsequently it was identified that these mice carried mutations in the Tlr4  gene. This  lead to the recognition of the Toll‐like receptor (TLR) ‐4 as the central mediator of  LPS  induced  inflammatory responses  (Poltorak et al., 1998).   Further evidence  for the role of  TLR4 in LPS signalling was provided when Kalis et al., (2003) introduced wildtype Tlr4 into the  LPS non‐responsive strains of mice, restoring their response to LPS (Kalis et al., 2003; Lembo et  al., 2003). This showed that the LPS was an important ligand for the activation of the TLR4.   LPS binding to TLR4 requires the  involvement multiple proteins,  including  lipopolysaccharide‐ binding protein  (LBP), Cluster of Differentiation 14  (CD‐14), and Lymphocyte antigen 96  (also  known  as MD‐2)  (Figure  1.4).  In  the  first  step  of  binding,  LPS  is  pulled  from  the  bacterial  membrane  by  LBP  and  CD‐14  to  form  a  ternary  complex  (Yu and Wright, 1996).   The  last  extracellular  step  in  LPS  binding  to  TLR4  involves  the  transfer  of  LPS  from  CD‐14  to MD‐2,  which results in rearrangement of TLR4, leading to dimerization via TIR domain interaction. The  details of intracellular signalling initiated by LPS binding to TLR4 are discussed below.     24                                     Figure 1.4. The steps of LPS recognition and binding by TLR4 and associated proteins. LBP acts  to dissociate LPS monomers  from aggregates and  shuttles  these monomers  to CD‐14. CD‐14  then transfers LPS to MD‐2,  leading to rearrangement of TLR4 such that the TIR domains can  interact to form a dimer. Adapted from Jerala, Int J Med Microbiol. 2007; 297(5):353‐63.      25                        26    1.5.2. Cytokines   Cytokines  are  a  category  of  signalling  molecules  that  are  used  extensively  in  cellular  communication, similar to hormones or neurotransmitters. The term cytokine encompasses a  diverse family of signals including proteins, peptides, and glycoproteins. Microglia activated by  LPS  as  discussed  above,  produce  various  proinflammatory  cytokines  that  can  themselves  activate microglia.     Table  1.2.  Summary  table  of  the  cytokines  and  chemokines  produced  by microglia  cells.  Adapted from Hanisch, Glia. 2002; 40(2):140‐55.  Abbreviation  Full Name  Alternate Name  GROα  Growth regulated oncogene α  CXCL1  IL‐1α/IL‐1β  Interleukin‐1α/‐1β    IL‐1ra  Interleukin‐1 receptor antagonist    IL‐3  Interleukin‐3    IL‐6  Interleukin‐6    IL‐8  Interleukin‐8  CXCL8  IL‐10  Interleukin‐10    IL‐12  Interleukin‐12    IL‐15  Interleukin‐15    IL‐18/IGIF  Interleukin‐18/Interferon‐γ inducing factor    IP‐10  γ interferon inducible protein‐10  CXCL10  MCP‐1  Monocyte chemoattractant protein‐1  CCL2  M‐CSF  Macrophage colony stimulating factor    MDC  Macrophage derived chemokine  CCL22  MIP‐1α/MIP‐1β  Macrophage inflammatory protein‐1α/‐1β  CCL3/CCL4  MIP‐2  Macrophage inflammatory protein‐2    MIP‐3β  Macrophage inflammatory protein‐3β  CCL19  TGF‐β  Transforming growth factor    TNF‐α  Tumor necrosis factor    RANTES  Regulated on activation normal T cell expressed & secreted  CCL5 Tumour Necrosis Factor Alpha  Tumour necrosis factor (TNF) ‐α is the archetypical proinflammatory cytokine, and is produced  by  dendritic  cells, monocytes,  lymphocytes, macrophages,  and  accordingly microglia.  TNF‐α  27    release from these cells has effects on virtually all types of cells. Although microglia have been  identified as the principal producer of TNF‐α in the CNS, both neurons and astrocytes have also  been shown to produce this cytokine (Lee et al., 1993; Zhang et al., 1998). Microglia cells are  uniquely  positioned  in  the  CNS  to  both  receive  and  send  cytokine  signals,  resulting  in  an  autocrine feedback loop. Bezzi et al., (2001) suggest that TNF‐α could play a role in maintaining  an activated status and/or leading to pathological activity through this feedback activity (Bezzi  et al., 2001).  Increased  levels of TNF‐α have been associated with several pathological states  including neurodegenerative disorders such as multiple sclerosis and Alzheimer disease, acute  injury or  ischemia,  and bacterial or  viral  infection  (Mhatre  et  al., 2004;  Floden  et  al., 2005;  Janelsins et al., 2008).  When tissue is damaged in the CNS microglia cells are the first cells to  respond by releasing TNF‐α that is regulated by the extent of damage.  Following even a short  exposure to TNF‐α, surrounding microglia cells rapidly become activated in response to stimuli  (Gabay  et  al.,  1997).    Therefore,  rapid  delivery  of microglia  TNF‐α  influences  the  outcome  following  the  initial  stimuli  and  the  events  that  follow  (Angstwurm  et  al.,  1998).    Similarly  microglia  cells  have  been  shown  to  modulate  the  amount  of  TNF‐α  mediated  glutamate  release from astrocytes through the same processes (Bezzi et al., 2001).   Microglia  TNF‐α  receptors  (TNF‐R)  belong  to  larger  group  of  receptors  based  on  similar  activating ligands (Peschon et al., 1998).  These family members include TNF‐R1, TNF‐R2, CD40,  Fas,  TRAIL,  and NGF  (Ashkenazi  and  Dixit,  1998,  1999).   Upon  ligand  stimulation  all  family  members cause multiple effects in microglia cells ranging from proliferation to apoptosis.  The  TNF  family  of  ligands  play  important  roles  in  neural  development,  synaptogenesis,  and  cell  communication (Tan et al., 1999a; Tan et al., 1999b).  28 Interleukin‐1   Interleukin’s are a group of cytokines that were originally thought to only be secreted by white  white  blood  cells  (Dinarello,  1997a,  b).    It  has  since  been  shown  that  interleukins  are  key  signalling molecules for many immune cells including microglia (Schubert et al., 2000; Streit et  al.,  2000;  Skaper,  2007).    Interleukin  1  (IL‐1)  is  one  of  the  central  activators  of microglia  immune function (Dinarello, 1997b).  IL‐1 is unique in that it is capable of both innate immune  defence and more programmed long term immune responses.  Il‐1 has also been implicated in  the progression of various neuropathies (Allan and Rothwell, 2001) . Upon infection, ischemia,  and  injury micrglia  cells  release  large  amounts  of  IL‐1  to  prevent  the  spread  of  pathogens  (Hanisch et al., 2001).  A readily releasable pool of IL‐2 is thought to be stored by microglia cells  because  following  injury  in  the  CNS  IL‐1  is  released  in  large  quantities  faster  than  can  be  accounted for by new synthesis (Fassbender et al., 2001).  The main outcome for the release of  large  amounts  of  IL‐1  seems  to  be  neuronal  death  (Loddick  et  al.,  1998).    Conversely,  antagonizing or decreasing  levels of  Il‐1 has been  shown play  a neuroprotective  role  in  the  brain  (Choi et al., 2005; Turrin and Rivest, 2006; Bye et al., 2007).   The behavioural changes  that are seen during sickness behaviour, discussed in detail below, are thought to be partially  mediated by IL‐1 production (Konsman and Dantzer, 2001; Cunningham et al., 2002).     1.5.3. Chemokines  Chemokines are a group chemotactic cytokines that respond to  immune stimuli through a G‐ protein–coupled receptor (Locati and Murphy, 1999).     One of the key roles that chemokines  29    play is to provide guidance in during cell migration (Asensio and Campbell, 1999; Asensio et al.,  1999).  Chemokines also have been shown to regulate the levels of other cytokines  in disease  models (Glabinski and Ransohoff, 1999).   Research on the excretion of chemokines by neurons  suggests that they might also signal microglia to support various neuromodulatory roles (Biber  et al., 2002b; Biber et al., 2002a; Rappert et al., 2002).   Microglia cells contain  receptors  for  most  chemokines  including  CXCR2,  CXCR3,  CXCR4,  CCR3,  CCR5,  and  CX3CR1  (Glabinski  and  Ransohoff, 1999; Hanisch, 2002; Tambuyzer et al., 2009).    1.5.4. Growth Factors  Neurons use various factors to communicate their status to surrounding cells.  When neurons  become compromised microglia cells become activated to support neuronal activity. Microglia  can both receive signals and excrete various neurotrophic factors (NGF and BDNF) in vitro and  in vivo (Elkabes et al., 1996; Elkabes et al., 1998; Nakajima et al., 1998; Neumann et al., 1998;  Tonchev  et  al.,  2008).  Some  of  growth  factors  are  also  used  by microglia  cells  to  initiate  proliferation and increased phagocytotic activity in surrounding tissue (Hanisch, 2002).     1.5.5. Pathological Proteins  Many  neurodegenerative  diseases  stem  from  the  abnormal  creation  and/or  clearance  of  proteins.  Lack of clearance of protein and debris is central to diseases like Alzheimer (AD), and  Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) (Troost et al., 1993; Gelinas et al., 2004; Yue et al., 2005;  Zelcer et al., 2007).  Although microglia cells play a role in these diseases their role in becoming  activated  in  response  to  these proteins  is controversial  (Rogers and Lue, 2001; Rogers et al.,  30    2002; McGeer et  al., 2006).       The most  commonly  studied pathological protein  is  the beta  amyloid (Aβ) protein  implicated  in Alzheimer disease.   Aβ protein  is the major constituent of  the  plaques  found  in  Alzheimer  patients’s  brains.  Important  roles  of  microglia  in  the  pathogenesis of Alzheimer’s disease have been  recognized  since  the direct  effect of  the Ab  peptide on microglia was demonstrated (Meda et al., 1995; Meda et al., 2001).     1.5.6. Complement Components   A subcomponent of the immune system is the complement system.  It is composed of over 30  cell membrane  associated proteins  that help modulate both  innate  and  adaptive  immunity.  Recent studies have shown that neuronal complement activates microglia cells to participate in  clearance  of  apoptotic  cells  during  development  (Stevens  et  al.,  2007).  The  complement  system activates microglia through the classical pathway that is initiated by the binding of the  C1q recognition molecule. C1q  is specific to myeloid precursor cells and  in the CNS these are  the  resident and activated microglial cells  (Schwab et al., 1996; Schafer et al., 2000; Schwab  and McGeer, 2002; Galvan et al., 2008; Farber et al., 2009).    1.5.7. Adenosine Triphosphate   Activation  of  microglia  cells  by  adenosine  triphosphate  (ATP)  has  received  attention  in  literature  recently  (Davalos et al., 2005; Haynes et al., 2006) but has been known  for many  years (Kettenmann et al., 1993).  Over 15 years ago, Kettenmann (1993) showed that ATP was  capable of  inducing  large cation currents  in microglia cells.   Other research also showed that  31    exogenously applied ATP was capable of activating microglia cells to release pathological levels  of cytokines (Inoue, 2006). Purinergic Receptors  Microglia  cells  contain both  the  ligand  gated  (P2X)  and  the metabotropic  g‐protein  coupled  (P2Y)  purinergic  recpetors  (Brautigam  et  al.,  2005).    These  receptors  have  been  found  to  activate microglia  in response to LPS, cytokines and damage  (Davalos et al., 2005; Haynes et  al., 2006; Inoue, 2006). It has been suggested that tissue damage could result in the release of  purine  nucleotides,  including ATP, UDP  and UTP  (Raivich,  2005).  Tissue  damage  induced  by  laser microlesion has been shown  to  result  in  the  rapid activation of microglia,  involving  the  extension  of  branches  toward  the  site  of  damage  (Nimmerjahn  et  al.,  2005, Davalos  et  al.,  2005). The effects of  laser microlesion on microglia  could be mimicked by  local  injection of  ATP, ADP or UTP, and inhibited by P2Y receptor blockers (Davalos et al., 2005). Application of  apyrase  to  degrade  ATP,  ADP,  UTP  and  other  molecules  containing  di‐phosphate‐bonds,  resulted in inhibition of microglia process outgrowth in response to laser microlesions and also  locked the motility of resting or ramified microglia (Davalos et al., 2005). Supporting a role for  purinergic receptors  in microglia motility, Haynes et al.,  (2006) showed that mice  lacking the  P2Y12 receptor show diminished branch extension in response to microlesion. It has also been  shown  that wildtype microglia express P2Y12  receptors highly during  their  resting state, and  this  expression  in  reduced  after  activation  (Haynes  et  al.,  2006).  These  results  suggest  that  extracellular ATP via P2Y12 can regulate microglia motility and signal surrounding microglia to  respond to injury. However, since microglia activation in response to laser microlesion can also  be blocked by the hemichannel blocker  flufenamic acid  (Davalos et al., 2005),  it  is  likely that  32    ATP  itself  does  not  have  a  direct  effect  on microglia  processes,  and  that  other  signalling  is  required (Raivich, 2005).     1.6.   Ion Channels and their Functional Importance in Microglia  In general ion channels are membrane proteins  allowing for the tight control of ion gradients  inside and outside of the cell. Ion channels of microglia cells regulate membrane potential, cell  volume  and  intracellular  ion  concentrations  and  therefore  effect  cell  activities  such  as  morphology changes, migration, proliferation, and cytokine synthesis (Eder, 1998). 20 years of  patch  clamp  studies  on  microglia  cells  have  shown  them  to  express  potassium,  chloride,  hydrogen,  sodium,  calcium,  and  non‐selective  cation  channels  (Eder,  2005;  Newell  and  Schlichter, 2005; Ducharme et al., 2007).   With  respect  to  their kinetic and pharmacological  properties, most microglia  ion channels closely  resemble  ion channels characterized  in other  macrophage  preparations  (Walz  and  Bekar,  2001; Walz,  2002).    Expression  patterns  of  ion  channels  in microglia depend on the functional state of the cells.   Microglial  ion channels can  be modulated by exposure to lipopolysaccharide  or various cytokines, by activation of protein  kinase C or G proteins, by factors released from astrocytes, by changes in the concentration of  internal free calcium, and by variations of the  internal or external pH (Walz and Bekar, 2001;  Walz, 2002).  Ion channels of microglia have been strongly implicated in regulation of immune  responses including cytokine production, cell proliferation, morphology changes, and migration  (Elkabes et al., 1996; Lin and Bergles, 2002; Eder, 2005).        33      Table  1.3.  Ion  channels of microglia,  and  the  factors  identified  to  regulate  their  function.  IC50: half maximal current  inhibition; : down‐regulated; : up‐regulated; [Ca2+]I:  intracellular  free  calcium  concentration;  pHo:  extracellular  pH.  Adapted  from  Eder,  Am  J  Physiol.  1998.  275(2 Pt 1):C327‐42.  Channel  Type  Species  or  Preparation  Pharmacology  (IC50)  Regulation  References  Inward  rectifier  K+  (~30 pS)  Rat,  bovine,  human  culture;  mouse  culture,  slice,  BV2‐cells  Ba2+  (23μM);  Cs+  (μM);  TEA  (mM);  quinine  (mM);  Na+  (mM)  :  LPS;  TNF;  GM‐CSF;  IFN‐γ; G protein; PKC;  internal  acidification;  increased [Ca2+]I  : adherence; PKC  Bocchini  et  al.,  1992;  Brockhaus  et  al.,  1993;  Eder  et  al.,  1995;  Fischer  et  al.,  1995;  Ilschner  et  al.,  1995,  1996;  Kettenmann  et  al.,  1990;  Korotzer  and  Cotman,  1992;  McLarnon  et  al.,  1995, 1997  HERG‐like K+  Rat  MLS‐9  cells  E‐4031  (μM);  Cs+  (mM); Ba2+  (mM)    Zhou et al., 1998  Delayed  rectifier K+  Rat,  mouse,  human  culture  CTX  (1nM);  KTX  (1nM);  MTX  (nm);  4‐ AP  (0.27mM);  Cd2+ (μM); Zn2+  (μM);  Ba2+  (mM);  TEA  (10mM)  :  increased  [Ca2+]I;  PKC;  internal  acidification  : LPS; GM‐CSF; IFN‐γ;  astrocytic factors; PKC  Modulation of kinetics  by  Ba2+,  Ca2+,  Cd2+,  Zn2+, changes in pHo   Eder  et  al.,  1995,  1996a,  1996b,  1997;  Fischer  et  al.,  1995;  Korotzer,  1996;  Mclarnon et al., 1997;  Norenberg  et  al.,  1992,  1993,  1994;  Schlichter et al., 1996;  Visentin  et  al.,  1995,  1997; Yoo et al., 1996  Voltage‐ dependant  Ca2+  activated K+   Bovine,  human  culture  TEA (μM)    McLarnon  et  al.,  1995, 1997  Voltage‐ independent  Ca2+  activated K+   Mouse  culture  +  astrocyte  conditioned  medium  CTX  (3nM);  La3+  (μM  to  mM); Ba2+ (μM  to  mM);  Cd2+  (mM);  TEA  (mM)    Eder et al., 1997  G  protein‐ activated K+  Mouse  culture    4‐AP  (mM);  TEA (mM)    Ilschner  et  al.,  1995,  1996  34    Channel  Type  Species  or  Preparation  Pharmacology  (IC50)  Regulation  References  H+   Mouse,  rat,  human  culture  Zn2+  (μM); La3+  (μM);  Ni2+  (μM);  Cd2+  (μM);  Co2+  (μM);  Ba2+  (mM);  4‐AP  (mM);  TEA  (mM)  :  LPS;  astrocytic  factors;  cytochalasin  D; colchicine    Eder  et  al.,  1995,  1998;  McLarnon  et  al.,  1997;  Visentin  et  al., 1995  Na+  Human  culture;  Rat  culture,  co‐ culture  with  astrocytes  TTX (nM)  : actrocytic factors  Korotzer  et  al.,  1992;  Schmidtmayer  et  al.,  1994;  Sievers  et  al.,  1994;  Tsien  et  al.,  1995   Voltage‐ activated  Ca2+  Rat culture      Colton et al., 1994  Ca2+‐release  activate Ca2+  Rat culture      Norenberg  et  al.,  1997  Voltage‐ dependant  Cl‐  Bovine,  human  culture  Ba2+ (mM)    McLarnon  et  al.,  1995, 1997  Voltage‐ independent  stretch‐ activated Cl‐  Rat  culture;  mouse  culture,  culture  +  astrocyte  conditioned  medium  DIDS  (μM);  SITS  (μM);  NPPB  (30μM);  IAA‐94  (210μM);  flufenamic  acid (80μM)    Eder  et  al.,  1998;  Schlichter et al., 1996;  Visentin et al., 1997    1.6.1. Potassium and the Membrane Potential  The main regulator of the resting membrane potential of microglia cells has been shown to be  the  inward  rectifying  potassium  channel  (Kir)  (Norenberg  et  al.,  1994a;  Norenberg  et  al.,  1994b; Eder et al., 1995a, b). Single channel  recordings with  isotonic symmetrical potassium  solutions determined the conductance of these channels to be about 30 pS (Eder et al., 1995b).  Specifically,  Kir2.1  has  been  suggested  as  the  channel  for  the  microglia  inward  rectifying  35    current  (Schilling  et  al.,  2000).  These  channels  are  potently  blocked  by  TEA  (tetraethyl  ammonium) and barium  (Chung et al., 1999; Franchini et al., 2004). When  inward  rectifying  channels are blocked or absent, delayed rectifier outward potassium channels set the resting  membrane potential  (Norenberg et al., 1994a). These channels also appear to be  involved  in  re‐establishing  a negative potential when  the membrane potential  is disrupted by microglia  activation  (Eder et al., 1995b). The delayed rectifier of microglia has been  thought  to closely  resemble  Kv1.3  channels,  and  this  has  been  confirmed with  the  use  of  RTPCR  (Kust  et  al.,  1999). Agitoxin‐2 and TEA are potent blockers of the Kv1.3 channel (Schlichter et al., 1996).     1.6.2. Regulation of Cell Volume  Although  the  aforementioned  potassium  channels  are  thought  to  play  a  role  in  volume  decreases,  the main  channels  involved  in microglia  volume  regulation  are  chloride  channels  (Eder, 2005).   These chloride channels become activated when osmotic changes are detected  or when  the  cell membrane  is mechanically  stretched  (Eder,  1998;  Eder  et  al.,  1998).  The  chloride channels in microglia activate rapidly after membrane stretch has been initiated (Eder  et al., 1998).  These chloride channels are ATP sensitive and exhibit outward rectification, and  do not  show  time or  voltage dependent  gating  (Schlichter et  al., 1996).   Potent blockers of  these  chloride  channels  include  DIDS,  NPPB,  and  tamoxifen, which  all work  at micromolar  concentrations (Schlichter et al., 1996).    36    1.6.3. Neurotransmitter Receptors on Microglia Cells  In addition to the numerous  ion channels  identified on microglia,  it has also been shown that  these  cells possess  receptors  for  several  classes of neurotransmitters, which  are  thought  to  serve a range of sensing and activation functions (Table 1.4). Through expression of the major  excitatory  and  inhibitory  neurotransmitter  receptors  for  glutamate  and  GABA  respectively,  microglia  can  sense  and  respond  to  neuronal  activity  (Hagino  et  al.,  2004).  In  addition,  microglia have also been shown  to express purinergic  receptors capable of sensing astrocyic  calcium  waves  (Schipke  et  al.,  2002).  As  discussed  above,  microglia  can  be  activated  by  extracellular  ATP,  via  the  expression  of  both  P2X  receptors  (Bianco  et  al.,  2005).  Thus,  activation of neurotransmitter receptors on microglia can lead to cytokine production, leading  to immune regulation of the brain in response to activity (Pocock and Kettenmann, 2007).    Table  1.4.  Neurotransmitter  receptors  expressed  on  microglia  cells,  and  their  identified  functions. From Pocock and Kettenmann, Trends Neurosci. 2007 30(10):527‐35.  Receptor  Subtypes  Functions  References  Glutamate, ionotropic  AMPA  GluR 1‐4 (flip)  GluR 2, 4 (flop)  Modulation of TNF‐α release  Noda et al., 2000;  Hagino et al., 2004  NMDA  NR1  Expressed  after  ischemia,  function unknown  Gottlieb  &  Matute,  1997  Glutamate, metabotropic  Group I  mGluR1, 5a  Agonist induces Ca2+ increase  Biber et a., 1999  Group II  mGluR2, 3  Activation  of  mGluR2  induces  neurotoxic  Mg  phenotype  &  TNF‐α release  Taylor  et  al.,  2002;  Taylor et al., 2005  Group III  mGluR4, 6, 8  Activation  is protective to Mg &  neurons  Taylor et al., 2003  GABA    GABAB, B1a, B1b, B2  Activation  leads  to  K +  conductance,  reduces  LPS‐ induced IL release  Kuhn et al., 2004  37    Receptor  Subtypes  Functions  References  Purinergic  ATP  P2Y1, 2, 4, 6, 8, 12  P2X1, 4, 7  Agonists  cause  cationic,  increased  K+  conductance,  intracellular  Ca2+,  membrane  ruffling & chemotaxis    Norenberg  et  al.,  1994;  James  &  Butt,  2002;  Bianco  et  al.,  2005,Ohsawa  et  al.,  2007;  Honda  et  al.,  2001  Adenosine    A2a  Induces NGF, COX‐2 & PGE2  Hesse  et  al.,  1997;  Fiebich et al., 1996    A3  Reduces  LPS‐induced  TNF‐α  release  Lee et al., 2006  Cholinergic    Α7 nAChR  Ach  or  nicotine  inhibit  LPS‐ induced TNF‐α release;   Nicotine  reduces  IFNγ‐induced  Mg activation  Shytle et al., 2004    Giunta et al., 2004  Cannabinoid    CB2  Activation reduces Mg toxicity &  cytokine secretion  Liu et al., 2002; Nunez  et al., 2004    CB1, 2, and abn‐CBD  Non‐specific  activation  suppresses  Mg  activation  &  neurotoxicity;  Activation  of  CB2  &  abn‐CBD  increases migration;  Activation  of  CB2  induces  proliferation  &  blocks  Aβ‐ induced activation  Franklin  &  Stella,  2003;  Carrier  et  al.,  2004  Ortega‐Gutierrez  et  al., 2005  Ramirez et al., 2005  Adrenergic    Α1, α2, and β1, β2  Agonists  reduce  IL‐6  &  TNF‐α  mRNA;   Reduces cytokine & NO release  Mori  et  al.,  2002;  Tanaka et al., 2002  Colton & Chernyshev,  1996,  Dello  Russo  et  al., 2004  Dopamine    D1‐  and  D2‐like,  inferred from function Suppresses  NO  release  &  promotes migraiton  Farber et al., 2005  Opioid  MOR  MOR3  Agonists  induce  ameboid  phenotype, chemotaxis & BDNF  expression  Dobrenis et al., 1995;  Takayama  &  Ueda,  2005  KOR    Agonists  prevent  superoxide,  quinolinic  acid  production  &  HIV‐related toxicity  Hu  et  al.,  2000;  Wallace  2006;  Chao  et al., 2000  38    Receptor  Subtypes  Functions  References  Neuropeptide  Substance  P  Neurokinin‐1  Modulates  chemotaxis;  Activates NADPH oxidase  Lai et al., 2000; Rasley  et  al.,  2002;  Block  et  al., 2006  Bradykinin  B1 and B2  Increases  Mg  motility;  Induces  release of NO   Noda  et  al.,  2003;  Noda et al., 2006  PACAP/VIP  VPAC1  Inhibits  production  of  chemokines & cytokines  Dejda  et  al.,  2005;  Gonzalez‐Rey  &  Delgado, 2005      1.7.   Innate Immune Receptors  The mammalian  immune system, of which microglia are a component, employs a number of  mechanisms  to  detect  and  eliminate  invading  pathogens  (Janeway,  1993;  Medzhitov  and  Janeway, 1998b, a; Janeway, 1999, 2001; Heine and Lien, 2003). Immune responses have been  divided  into  two  major  categories,  the  highly  conserved  innate  immune  system  and  the  adaptive  immune  system  found only  in vertebrates  (Janeway, 2001). The  cells of  the  innate  immune  system provides  first  line defence  to pathogens  in a generic  fashion using germline  encoded  proteins,  and  does  not  confer  long  lasting  protection  to  the  organism  (Janeway,  1993).    In  contrast,  cells  of  the  adaptive  immune  system  recognise  and  remember  specific  pathogens. Adaptive  immune cells are capable of recognising self versus non‐self through the  recognition of peptide antigens using surface receptors (Akira et al., 2003; Akira and Takeda,  2004b, a; Takeda and Akira, 2004).  While a number of studies have lead to some understanding of the adaptive immune response,  the complexities of the innate immune response are less well known. Responses of the innate  immune  system  result  from  interaction  between  cell  surface  receptors  of  the  host  and  39    conserved structural motifs on the surface of pathogens, also known as pathogen‐associated  molecular patterns (PAMPs)(Kurata et al., 2006; Saito and Gale, 2007; Bernardino et al., 2008).  A  number  of  PAMP‐recognising  receptors  have  been  identified,  including  toll‐like  receptros  (TLR),  NOD‐like  receptors  (NLR),  and  RIG‐I‐like  receptors  (RLR)  (Creagh  and  O'Neill,  2006).  While TLRs recognise bacteria, viruses, fungi, and protozoa, NLRs typically recognise bacteria,  and RLRs recognise viruses (Creagh and O'Neill, 2006).    1.7.1. Toll­Like Receptors  The Toll protein was  first  identified  in Drosophila melanogaster as an  important  regulator of  dorsal‐ventral  patterning  during  embryonic  development  (Hashimoto  et  al.,  1988).  Several  years  later,  Toll  was  shown  to  contribute  to  immune  responses  to  fungal  pathogens  in  Drosophila (Lemaitre et al., 1996). Around the same time, the first mammalian homologue of  Toll,  termed  TLR4,  was  identified  as  a  pattern  recognition  receptor  required  for  adaptive  immune  responses  (Hong  et  al.,  1997; Medzhitov  and  Janeway,  1997a, b; Medzhitov  et  al.,  1997). Other members of the TLR family have subsequently been shown to play critical roles in  both innate and adaptive immune responses in mammalian systems (Takeda and Akira, 2007;  O'Neill, 2008). A total of 11 TLRs have been  identified to this point  in humans, while 13 have  been identified in mouse (Akira and Takeda, 2004a; Kawai and Akira, 2006, 2007, 2009).   In  terms  of  structure,  TLRs  are  membrane‐bound  proteins  composed  of  highly  conserved  extracellular  leucine‐rich  repeats  (LRR), which  vary  in  number,  and  a  highly  conserved  Toll‐ interleukin(IL)‐1 receptor (TIR) domain in the cytoplasmic region (Figure 1.5) (Akira and Takeda,  2004a).     Ligands of TLRs are recognised by their LRRs that transmit signals to the intracellular   40                                      Figure 1.5. Alignment of  the TIR domain  sequences  from multiple proteins, and  structural  representations of the TLR4 TIR domain. A. Alignment of TIR domain sequences illustrates the  conserved regions that have been shown to be important for TIR function. B, C. Representaiton  of  the  surface  structure  of  the  TLR4  TIR  domain  showing  the  BB‐loop  region  important  for  dimerization  (purple).  CLUSTALW  alignment  (A)  from  O’Neill  et  al.,  Trends  in  Immunology,  2003; 24(6): 286‐289. Crystal structures (B,C) from Xu et al., Nature, 2000; 408:111‐115.      41                  42    TIR domain. Signalling of these receptors  is mediated by  interactions with adaptor molecules  such as MyD88, TIRAP/Mal, TRIF, and TRAM (Figure 1.6) (Muraille et al., 2003; Kawai and Akira,  2007). Adaptor molecules then go on to trigger a signalling cascade leading to phosphorylation  of  IRAK and activation of downstream effector molecules  including NF‐κβ and  IRF3 (Li, 2008).  The  signalling cascade culminates  in  the production of  immune and  inflammatory mediators  such as TNF‐α (Akira and Takeda, 2004a). A large number of molecules have been shown to be  involved  in  TLR  activation  pathways  (Akira  and  Takeda,  2004a,  b)  and  through  several  modulatory mechanisms such as phosphorylation, targeted degradation, and sequestration of  molecules  this  complex  signalling  is  tightly  regulated  depending  upon  the  nature  of  the  immune stimulus (Miggin and O'Neill, 2006).  TLR  signalling has been  shown  to be  involved  in  the  response of glial  cells  to CNS  infection.  Since microglia are  the principal  immune  cell of  the CNS,  it  is not  surprising  that  they have  been shown to express all of the known TLRs (Lee and Lee, 2002; Lehnardt et al., 2002; DeLeo  et  al.,  2004;  Chakravarty  and Herkenham,  2005;  Kielian  et  al.,  2005; Guo  and  Schluesener,  2007; Hoffmann et al., 2007; Walter et al., 2007; Jin et al., 2008; DiRosario et al., 2009; Ford  and McVicar, 2009), while neurons (Prehaud et al., 2005; Jackson et al., 2006; Menager et al.,  2009)  and  oligodendrocytes  (Bsibsi  et  al.,  2002)  express  only  TLR3. Due  to  the  difficulty  in  producing  highly  pure  astrocyte  cultures  that  are  completely  free  of microglia,  it  has  been  more difficult to determine which TLRs are expressed  in astrocytes (Esen et al., 2004; Owens,  2005; Bernardino et al., 2008; Carpentier et al., 2008; De Miranda et al., 2008). Concequently  studies have reported a range of results from a  lack of TLR4  in highly pure human astrocytes  ((Bsibsi  et  al.,  2002;  Jack  et  al.,  2005),  to  the  presence  of mRNA  for  TLRs  1‐10  with  the  exception of TLR8 in culture murine astrocytes (Lee and Lee, 2002).  43                                        Figure 1.6. Signalling pathways initiated by binding of LPS to TLR4 via MD‐2. LPS binding leads  to  dimerization  of  TLR4  via  TIR  domain  interactions, which  leads  to  the  association  of  the  adaptor  protein MyD88. Adaptor molecules  go  on  to  trigger molecular  cascades,  ultimately  leading to the production of immune mediators such as TNF‐α.      44    45 Toll‐Like Receptor 4  One of  the  key discoveries  towards our understanding of  toll  like  repeceptors was  that  LPS  non‐responsive mouse strains C3H/HeJ (Sultzer, 1972b), C57BL/10ScCr have mutations  in the  TLR4 genes  (Poltorak et al., 1998; Poltorak et al., 2000).   However, the critical experiment to  show that TLR4 was the essential receptor for LPS signalling was conducted by the introduction  of  the  TLR4  gene  back  into  LPS  non‐repsonsive mice  to  rescue  the  phenotype  (Kalis  et  al.,  2003). Further, Kalis et al., (2003) also showed that there was a linear relationship between the  amount of TLR4 expression and the LPS response suggesting a direct correlation between the  amount of TLR4 expression and LPS sensitivity. Toll‐Like Receptor Signalling   Toll  receptors  are  thought  to  form  homodimers  that  undergo  dimerization when  they  are  stimulated by a specific ligand (Yamamoto et al., 2004; Kawagoe et al., 2008).  The dimerization  is initiated when cytoplasmic Toll/Il‐1 Receptor (TIR) interact with adapter proteins (O'Neill et  al., 2003; Brikos and O'Neill, 2008; Kenny and O'Neill, 2008).   Pathways and mechanisms  for  further  signalling downstream of  the TIR domain were  first  shown  to be  to  involve Myeloid  differentiation primary response gene 88 (MyD88) (Akira et al., 2003; Akira and Takeda, 2004a;  McGettrick and O'Neill, 2004).  The MyD88 pathway for signalling in TLRs has been shown to be the same as is for IL‐1 (Bowie  and O'Neill, 2000; Suzuki et al., 2002b; O'Neill et al., 2003; Hacker et al., 2006;  Jenkins and  Mansell,  2009).    The MyD88  Adaptor  protein  also  contains  a  TIR  domain  that  upon  ligand  stimulation  if the TLR associates with that receptor  (Suzuki et al., 2002b; O'Neill et al., 2003;  46    Hacker  et  al.,  2006).    The  interaction of MyD88 with  the  TLR  recruits  IL‐1  receptor  (IL‐1R)– associated kinase 4  (IRAK4)  to  the death domains of both MyD88 and  the TLR  (Suzuki et al.,  2002b; O'Neill et al., 2003; Hacker et al., 2006).  In‐vitro experiments have shown that the BB‐ loop  in  TIR  domain  of MyD88  is  a  good  target  for  specific  inhibition  of MyD88‐mediated  signaling in vivo (Loiarro et al., 2005; Loiarro et al., 2007).    The interaction of IRAK4 with the  death domains acts to facilitate the phosphorylation of IRAK1 (Kobayashi et al., 2002; Suzuki et  al., 2002b; Suzuki et al., 2002a; Ye et al., 2002).  The activated IRAK1 then binds to the tumour  necrosis  factor  receptor  associated  factor  6  (TRAF6)  (Kobayashi  et  al.,  2002).    Two  distinct  pathways  are  activated  by  TRAF6.    The  first  pathway  activated  is  the  transforming  growth  factor  β‐activated kinase  (TAK1) pathway.   The other pathway activated by TRAF6  is  the NF‐ kappa B and activator protein‐1  (AP‐1)  (Kobayashi et al., 2002; Hacker et al., 2006).   Both of  these pathways lead to transcription factors like NF‐kappa B being upregulated and an increase  in the activation of Mitogen‐activated protein (MAP) kinases (Akira and Takeda, 2004a).  These  factors play a role in the production of inflammatory cytokines that are created in response to  the TLR stimulation. Thus, the end result of stimulation of TLR4 by LPS is expression of several  genes that are involved in the immune response.      1.8.   The Role of Microglia in Sickness Behaviour  Following  infection dramatic changes are observed  in  the behaviour of animals and humans,  these  changes  are  collectively  referred  to  as  sickness  behaviour.  Sickness  behaviour  is  characterized by loss of interest in food or drink, fatigue, and changes in sleep patterns (Hart,  1988). Actions of proinflammatory cytokines in the brain are thought to be the principal cause  47    of  the  behavioural  expression  of  sickness  (Dantzer,  2001;  Kelley  et  al.,  2003; Miller,  2003;  Dantzer, 2006; Dantzer et al., 2008; Myers, 2008; Tizard, 2008).    1.8.1. Molecular basis of sickness behaviour  One identified molecular mediator of sickness behaviour is IL‐1. It has been shown that either  central or peripheral administration of  IL‐1β can  lead to the central components of the acute  response to sickness, including the behavioural response (Anforth et al., 1998). In contrast, IL‐6  administration  results  in  fever  and  other  indications  of  sickness  without  the  behavioural  changes  (Lenczowski  et  al.,  1999;  Skurlova  et  al.,  2006).  Despite  the  finding  that  IL‐1β  can  recapitulate aspects of  sickness,  this does not mean  that  it  is  the  sole mediator of  sickness,  instead multiple  cytokines  act with  coordinated  potentiation  and/or  suppression  of  activity  depending  upon  the  immune  stimulus.  Like  IL‐1,  recombinant  TNF‐α  has  been  found  to  decrease social exploration and  induce weight  loss when administered to mice (Bluthe et al.,  2001; Bluthe et al., 2002; Palin et al., 2007).  In mice lacking one of the receptor sub types for  TNF‐α, a pronounced decrease in sickness behaviour as a result of cytokine administration has  been reported (Palin et al., 2008; Palin et al., 2009). Specifically, this study showed that TNF‐α ‐ induced  sickness  behavior  is  mediated  by  TNF‐R1,  and  further  that  adaptor  proteins  are  necessary for the induction of sickness behaviour (Palin et al., 2009).    1.8.2. Chronic Effects of Sickness Behaviour  Sickness behaviour is the outward expression of inflammation in the CNS as a result of immune  stimulation. It is also thought that sickness associated changes in behaviour alter the actions of  48    the organism  in order to most effectively deal with the  infection (Dantzer, 2001; Kelley et al.,  2003;  Miller,  2003;  Dantzer,  2006).  While  evidence  supports  a  role  for  fever  and  loss  of  appetite in disease coping strategies, it is important to consider that chronic infection can lead  to excessive inflammation, detrimental anorexia and a range of other adverse effects (Dantzer  et al., 2008).    1.8.3. Sickness Behaviour and Depression  The  increased  expression  of  inflammatory  cytokines  that  contribute  to  sickness  behaviour  represents is thought to also contribute to the morbidity of major depression.  Both infectious  diseases and  inflammatory disorders have been show to  lead to depressive states  in patients  (Evans et al., 2002; Morrison et al., 2002; Zautra et al., 2004).  In conjunction with this, people  suffering  from  major  depression  also  show  a  reduction  in  their  capabilities  to  launch  an  appropriate innate immune response (Leserman et al., 2002; Leserman, 2003).  Cytokines, the  immune modulators  that  are  the  act  as  the mechanism  underlying  sickness  behaviour,  are  thought  to  play  a  causative  role  in  depression  (Dunn  et  al.,  2005; Wieczorek  et  al.,  2005;  Swiergiel et al., 2008).    1.9.     Inflammation and Neurodegeneration  As mentioned  above, microglia  are  capable  of many  different  states  and  these  states  are  dependent on  the  nature  of  the  CNS  environment  (Morimoto  et  al.,  2002;  Liu  et  al.,  2003;  Bellucci et al., 2004; Streit, 2004; Minghetti, 2005; Ralay Ranaivo et al., 2006; O'Callaghan et  al., 2008; Maccioni et al., 2009).  Systemic inflammation alters the basic state or phenotype of  49    microglia  cells  (Prat  et  al.,  2001;  Perry  et  al.,  2002;  Settembre  et  al.,  2007).    It  is  unclear  however, whether  the  alteration  in microglia  state  is  a  causality  in  the  neurodegenerative  process  or  if  it  is  a  response  to  an  already  altered  state.    Regardless,  suppressing  the  inflammation  that  is  associated  with  neurodegenerative  diseases  is  one  of  the  leading  therapies  for neurodegenerative diseases  (Lee  et  al.,  1995; Pasinetti,  1996; Asanuma  et  al.,  2001; Aisen, 2002; Melton  et  al., 2003;  Zilka  et  al., 2006; Hald  et  al., 2007;  Shulman  et  al.,  2008).        For  example,  the  use  of  non‐steroidal  anti‐inflammatory  drugs  (NSAIDs)  has  been  shown to of great  benefit for slowing the development of Alzheimer’s disease (Etminan et al.,  2003a, b) and Parkinson’s disease (Chen et al., 2005).   However, the complete mechanism of  how  blocking  inflammation  effects  the  progress  of  neurodegeneration  is  still  poorly  understood (Akiyama et al., 2000a; Akiyama et al., 2000b).    1.10. Microglia and Stroke  One  of  the  key  functions  of microglia  cells  is  to  help  clear  debris  associated with  damage  (Kreutzberg,  1996).      The  phagocytosing  of  damaged  cells  allows microglia  cells  to  play  an  important  role  in  traumatic  events  like  acute  stroke  and  acute  ischemia  (Kalman,  1989;  Schilling et al., 2005; Gao et al., 2008; Zhao et al., 2009).  Upon being activated by the damage  microglia are thought to release both cytotoxic and neuroprotective molecules (Osborne et al.,  1995; Wood, 1995).   Neurons  that are damaged  release Cell differentiating  factor 14  (CD14)  (Beschorner et al., 2002a; Beschorner, 2003), which can  lead  to microglia activation  through  TLR4  (Guha et  al., 2001).   Research on  transgenic mice  lacking  the TLR4  receptor  also have  show that microglia cells play and  important neuroprotective role following hypoxia/ischemia  50    (Lehnardt et al., 2002).  The role of microglia activation during stroke has also been shown to  increase damage  (Zhang et al., 2005).   The use of drugs  that block microglia activation,  like  minocycline,  has  been  suggested  to  decrease  the  damage  that  occurs  during  stroke  (Yrjanheikki et al., 1999; Koistinaho et al., 2004; Kim and Suh, 2009).   However, others have  shown  that  the  factors  released  by  activated microglia  are  capable  of  not  only  protecting  neurons but are capable of decreasing the size of the infarct area (Watanabe et al., 2000).    1.11. Rationale, Hypothesis and Objectives   The  creation of  transgenic mice with microglia‐specific markers has  added  extensive  insight  into our understanding of these complex cells (Jung et al., 2000), allowing examination of the  in vivo dynamics of microglia.  Two recent reports have noted that microglia cell processes are  highly motile and that they are quite possibly the most dynamic cells in the CNS (Davalos et al.,  2005;  Nimmerjahn  et  al.,  2005;  Pocock  and  Kettenmann,  2007).  However,  despite  the  redefinition  of  microglia  as  constantly  active  contributors  to  the  CNS,  the  stimuli  and  mechanisms  regulating  the  contrasting  harmful  and  beneficial  roles  of  these  dynamic  cells  remain unknown.    It is thought that microglia act as support cells for neurons and astrocytes (Barres, 1989; Aloisi,  2001;  Cunningham  et  al.,  2002;  Hanisch  and  Kettenmann,  2007;  Pocock  and  Kettenmann,  2007; Neumann et  al., 2008).  In  the healthy CNS  these  cells  constantly  survey, and when  a  harmful  stimuli  is  sensed,  microglia  become  active  in  removing  harmful  self‐compounds,  clearing  debris  from  the  damaged  site,  and  providing  immune‐related  requirements  for  recovery (Gehrmann et al., 1995; Akiyama et al., 2000b; Banati, 2003; Kim and de Vellis, 2005;  51    Block et al., 2007; de Haas et al., 2007; Hanisch and Kettenmann, 2007; Amantea et al., 2009).  Proper regulation of the inflammatory response to injury will arrest degeneration and promote  regrowth,  however  it  has  also  been  suggested  that  inappropriate  regulation  can  lead  to  damage  and  ongoing  degeneration.    The  specific mechanisms  regulating  this  dynamic  shift  from beneficial to harmful roles represents an attractive means for regulating the health and  integrity of the CNS.    The  experiments  of  this  thesis  will  examine  the  cellular  mechanisms  underlying  rapid  microglia  responses  to  harmful  stimuli  including  tissue  damage  and  immune  insults.   We  hypothesise  that microglia  can have both protective and harmful actions, depending upon  the stimuli causing  them  to become activated. Furthermore, we propose  that  regulation of  microglia activity can have a profound  impact on CNS function. Specifically,  in chapter 2 we  investigate  the  hypothesis  that  the  extension  of  microglia  processes  in  response  to  CNS  damage is dependent upon specific ion channels. We also hypothesise that microglia process  extension in response to lesion represents a mechanism for containing damage in the CNS. In  chapter 3, we test the hypothesis that microglia response to the endotoxin LPS depends on  TLR4  signalling  pathways,  and  this  response  can  be  blocked  using  specific  interfering  peptides  that  block  TLR4  interaction  with  the  adaptor  protein  MyD88.  Further  we  hypothesise that peptides blocking TLR4 signalling will ameliorate the negative inflammatory  effects on  the  CNS,  thereby  reducing  the  sickness behaviour observed  in  response  to  LPS  treatment.    52    Objectives:    Aim  1.  Characterize microglia  activities  in  acute  slices,  and  investigate whether microglia  process extension is dependent upon specific ion channels. Numerous studies have examined  the wide variety of ion channels identified in microglia cells (Macdonald and Olsen, 1994; Illes  et al., 1996a; Schlichter et al., 1996; Brown et al., 1998; Eder, 1998; Walz and Bekar, 2001; Lin  and  Bergles,  2002;  Walz,  2002;  Eder,  2005;  Newell  and  Schlichter,  2005;  Zierler  and  Kerschbaum, 2005; Kimelberg et al., 2006). These aims will examine  ion channels  involved  in  microglia process outgrowth in response to damage.  Of particular interest to these studies will  be channels that have previously been shown to be activated upon microglia stimulation.  Both  potassium  and  chloride  channels  are  excellent  candidates,  both  because  of  their  large  conductance and previous reports of their involvement in microglia activation (Schlichter et al.,  1996; Newell and Schlichter, 2005).       Aim 2. Test weather microglia processes are directed to lesioned areas to reduce the extent  and  spread of damage.  It  is  known  that microglia  rapidly extend processes  to  the  site of  a  lesion,  however  it  is  unclear what  functional  roles microglia may  have  at  sites  of  damage.   Specifically, it is unclear whether microglia surround a lesion in order to reduce or contain the  damage, or whether microglia have the effect of worsening damage due to inflammation.  We  will monitor the spread of damage from the initial lesion and test whether damage in adjacent  neurons is altered by preventing process outgrowth from microglia.      53    Aim 3. Test the ability of TLR4 interfering peptides to block cytokine activation and microglia  responses  following  treatment with  LPS.  It  is  known  that  LPS  is  a  potent  ligand  for  TLR4,  however it is unknown whether blocking TLR4 interaction with adaptor proteins is sufficient to  block  LPS  induced  microglia  responses  and  cytokine  production.  We  will  design  and  test  peptides to  interfere with the TIR domain  interactions between TLR4 and MyD88, preventing  their dimerization, thereby preventing their binding and downstream signalling. Following LPS  treatment we will assess the phosphorylation of downstream targets such as the MAP kinases,  and  quantify  cytokine  production  of  TNF‐α,  and  compare  these  responses  to  peptide  pre‐ treated conditions. We will also examine  the effects of LPS or peptide plus LPS on microglia  morphology changes.     Aim  4.  Examine  whether  peptides  that  block  TLR4  signalling,  cytokine  activation  and  microglia  responses  can  reduce  the  sickness  behaviour  observed  in  response  to  LPS.  The  sickness behaviour observed  in response  to LPS  treatment  in mice will be compared  to mice  pre‐treated with interfering peptides that block TLR4 signalling. We will use a modified SHIRPA  screen  based  on  the  EMPReSS  protocol  and  observe  the  behaviour  of  mice  in  a  novel  homecage environment to evaluate sickness. We will also evaluate the motivational effects of  LPS or peptide plus LPS treatments in rats using the intracranial self stimulation paradigm.      The  interface between the brain and the  immune system  is critical  for normal brain  function  and the prevention of diseases in the CNS. Since microglia are the principal immune cells of the  CNS, an understanding of the mechanisms by which microglia can switch their functional roles  54    from  beneficial  to  harmful  is  essential.  Insight  into  the  mechanisms  involved  in  dynamic  microglia activation will allow us  to understand how  these cells  influence  the progression of  various CNS diseases. Ultimately, this research will identify the pathways by which microglia  can be manipulated, and can potentially provide therapeutic targets to enhance the recovery  of the brain from acute injury or infection.      55    1.12. References  Adam R, Russing D, Adams O, Ailyati A,  Sik Kim K,  Schroten H, Daubener W  (2005) Role of  human brain microvascular endothelial  cells during  central nervous  system  infection.  Significance  of  indoleamine  2,3‐dioxygenase  in  antimicrobial  defence  and  immunoregulation. Thromb Haemost 94:341‐346.  Agresti C, Meomartini ME, Amadio S, Ambrosini E, Volonte C, Aloisi F, Visentin S  (2005) ATP  regulates  oligodendrocyte  progenitor  migration,  proliferation,  and  differentiation:  involvement of metabotropic P2 receptors. Brain Res Brain Res Rev 48:157‐165.  Aisen  PS  (2002)  The  potential  of  anti‐inflammatory  drugs  for  the  treatment  of  Alzheimer's  disease. Lancet Neurol 1:279‐284.  Akira S, Takeda K (2004a) Toll‐like receptor signalling. Nat Rev Immunol 4:499‐511.  Akira  S,  Takeda  K  (2004b)  Functions  of  toll‐like  receptors:  lessons  from  KO mice.  C  R  Biol  327:581‐589.  Akira  S,  Yamamoto  M,  Takeda  K  (2003)  Role  of  adapters  in  Toll‐like  receptor  signalling.  Biochem Soc Trans 31:637‐642.  Akiyama  H,  McGeer  PL  (1990)  Brain  microglia  constitutively  express  beta‐2  integrins.  J  Neuroimmunol 30:81‐93.  Akiyama H,  Kawamata  T, Dedhar  S, McGeer  PL  (1991)  Immunohistochemical  localization  of  vitronectin, its receptor and beta‐3 integrin in Alzheimer brain tissue. J Neuroimmunol  32:19‐28.  Akiyama H, Arai T, Kondo H, Tanno E, Haga C, Ikeda K (2000a) Cell mediators of inflammation in  the Alzheimer disease brain. Alzheimer Dis Assoc Disord 14 Suppl 1:S47‐53.  Akiyama  H,  Barger  S,  Barnum  S,  Bradt  B,  Bauer  J,  Cole  GM,  Cooper  NR,  Eikelenboom  P,  Emmerling M, Fiebich BL, Finch CE, Frautschy S, Griffin WS, Hampel H, Hull M, Landreth  G, Lue L, Mrak R, Mackenzie IR, McGeer PL, O'Banion MK, Pachter J, Pasinetti G, Plata‐ Salaman  C,  Rogers  J,  Rydel  R,  Shen  Y,  Streit  W,  Strohmeyer  R,  Tooyoma  I,  Van  Muiswinkel FL, Veerhuis R, Walker D, Webster S, Wegrzyniak B, Wenk G, Wyss‐Coray T  (2000b) Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 21:383‐421.  Allan SM, Rothwell NJ (2001) Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev Neurosci 2:734‐ 744.  Aloisi  F  (1999)  The  role  of  microglia  and  astrocytes  in  CNS  immune  surveillance  and  immunopathology. Adv Exp Med Biol 468:123‐133.  Aloisi F (2001) Immune function of microglia. Glia 36:165‐179.  Aloisi F, Ria F, Penna G, Adorini L (1998) Microglia are more efficient than astrocytes in antigen  processing and in Th1 but not Th2 cell activation. J Immunol 160:4671‐4680.  Alzheimer A (1904) Histologische Studien zur Differentialdiagnose der progressiven Paralyse    [Histological studies on the differential diagnosis of progressive paralysis]. Maximilians‐ Universitaet Muenchen   Amantea D, Nappi G, Bernardi G, Bagetta G, Corasaniti MT (2009) Post‐ischemic brain damage:  pathophysiology and role of inflammatory mediators. Febs J 276:13‐26.  Ambree O, Leimer U, Herring A, Gortz N, Sachser N, Heneka MT, Paulus W, Keyvani K (2006)  Reduction of amyloid angiopathy and Abeta plaque burden after enriched housing  in  TgCRND8 mice: involvement of multiple pathways. Am J Pathol 169:544‐552.  Anforth HR, Bluthe RM, Bristow A, Hopkins S, Lenczowski MJ, Luheshi G, Lundkvist J, Michaud  B, Mistry Y, Van Dam AM, Zhen C, Dantzer R, Poole S, Rothwell NJ, Tilders FJ, Wollman  56    EE (1998) Biological activity and brain actions of recombinant rat interleukin‐1alpha and  interleukin‐1beta. Eur Cytokine Netw 9:279‐288.  Angelov DN, Walther M, Streppel M, Guntinas‐Lichius O, Neiss WF, Probstmeier R, Pesheva P  (1998) Tenascin‐R is antiadhesive for activated microglia that induce downregulation of  the protein after peripheral nerve injury: a new role in neuronal protection. J Neurosci  18:6218‐6229.  Angstwurm K, Freyer D, Dirnagl U, Hanisch UK, Schumann RR, Einhaupl KM, Weber JR (1998)  Tumour necrosis factor alpha  induces only minor  inflammatory changes  in the central  nervous system, but augments experimental meningitis. Neuroscience 86:627‐634.  Ankeny  DP,  Popovich  PG  (2007)  Central  nervous  system  and  non‐central  nervous  system  antigen  vaccines  exacerbate  neuropathology  caused  by  nerve  injury.  Eur  J  Neurosci  25:2053‐2064.  Araque  A,  Carmignoto  G,  Haydon  PG  (2001)  Dynamic  signaling  between  astrocytes  and  neurons. Annu Rev Physiol 63:795‐813.  Asanuma M, Nishibayashi‐Asanuma S, Miyazaki  I, Kohno M, Ogawa N (2001) Neuroprotective  effects  of  non‐steroidal  anti‐inflammatory  drugs  by  direct  scavenging  of  nitric  oxide  radicals. J Neurochem 76:1895‐1904.  Asensio VC, Campbell  IL  (1999) Chemokines  in  the CNS: plurifunctional mediators  in diverse  states. Trends Neurosci 22:504‐512.  Asensio VC, Kincaid C, Campbell IL (1999) Chemokines and the inflammatory response to viral  infection  in  the central nervous  system with a  focus on  lymphocytic choriomeningitis  virus. J Neurovirol 5:65‐75.  Ashkenazi A, Dixit VM  (1998) Death  receptors:  signaling  and modulation.  Science 281:1305‐ 1308.  Ashkenazi A, Dixit VM (1999) Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell  Biol 11:255‐260.  Badie  B,  Schartner  J,  Klaver  J, Vorpahl  J  (1999)  In  vitro modulation  of microglia motility  by  glioma  cells  is  mediated  by  hepatocyte  growth  factor/scatter  factor.  Neurosurgery  44:1077‐1082; discussion 1082‐1073.  Banati RB (2003) Neuropathological imaging: in vivo detection of glial activation as a measure  of disease and adaptive change in the brain. Br Med Bull 65:121‐131.  Barres BA (1989) Neuronal‐glial interactions. A new form of transmission? Nature 339:343‐344.  Barron KD (1995) The microglial cell. A historical review. J Neurol Sci 134 Suppl:57‐68.  Basarsky  TA,  Feighan  D, MacVicar  BA  (1999)  Glutamate  release  through  volume‐activated  channels during spreading depression. J Neurosci 19:6439‐6445.  Beauvillain C, Donnou S, Jarry U, Scotet M, Gascan H, Delneste Y, Guermonprez P, Jeannin P,  Couez D  (2008) Neonatal  and  adult microglia  cross‐present  exogenous  antigens. Glia  56:69‐77.  Beers DR, Henkel JS, Xiao Q, Zhao W, Wang J, Yen AA, Siklos L, McKercher SR, Appel SH (2006)  Wild‐type microglia extend  survival  in PU.1  knockout mice with  familial  amyotrophic  lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 103:16021‐16026.  Bellucci A, Westwood AJ, Ingram E, Casamenti F, Goedert M, Spillantini MG (2004) Induction of  inflammatory mediators and microglial activation in mice transgenic for mutant human  P301S tau protein. Am J Pathol 165:1643‐1652.  57    Bernardino AL, Myers TA, Alvarez X, Hasegawa A, Philipp MT (2008) Toll‐like receptors: insights  into  their  possible  role  in  the  pathogenesis  of  lyme  neuroborreliosis.  Infect  Immun  76:4385‐4395.  Beschorner  R  (2003)  Human  brain  parenchymal microglia  express  CD14  and  CD45  and  are  productively  infected by HIV‐1  in HIV‐1 encephalitis. Brain Pathol 13:231; author reply  231‐232.  Beschorner R, Schluesener HJ, Gozalan F, Meyermann R, Schwab JM (2002a) Infiltrating CD14+  monocytes and expression of CD14 by activated parenchymal microglia/macrophages  contribute  to  the  pool  of  CD14+  cells  in  ischemic  brain  lesions.  J  Neuroimmunol  126:107‐115.  Beschorner  R,  Nguyen  TD,  Gozalan  F,  Pedal  I, Mattern  R,  Schluesener  HJ, Meyermann  R,  Schwab JM (2002b) CD14 expression by activated parenchymal microglia/macrophages  and  infiltrating monocytes  following human  traumatic brain  injury. Acta Neuropathol  103:541‐549.  Beutler B, Hoebe K, Du X, Ulevitch RJ  (2003) How we detect microbes and respond to them:  the Toll‐like receptors and their transducers. J Leukoc Biol 74:479‐485.  Bezzi P, Domercq M, Brambilla L, Galli R, Schols D, De Clercq E, Vescovi A, Bagetta G, Kollias G,  Meldolesi  J,  Volterra  A  (2001)  CXCR4‐activated  astrocyte  glutamate  release  via  TNFalpha: amplification by microglia triggers neurotoxicity. Nat Neurosci 4:702‐710.  Biber K, Rappert A, Kettenmann H, Brouwer N, Copray SC, Boddeke HW (2002a) Neuronal SLC  (CCL21)  expression:  implications  for  the  neuron‐microglial  signaling  system.  Ernst  Schering Res Found Workshop:45‐60.  Biber  K,  Dijkstra  I,  Trebst  C,  De  Groot  CJ,  Ransohoff  RM,  Boddeke  HW  (2002b)  Functional  expression  of  CXCR3  in  cultured  mouse  and  human  astrocytes  and  microglia.  Neuroscience 112:487‐497.  Block ML, Zecca L, Hong JS (2007) Microglia‐mediated neurotoxicity: uncovering the molecular  mechanisms. Nat Rev Neurosci 8:57‐69.  Bluthe RM, Bristow A, Lestage  J,  Imbs C, Dantzer R  (2001) Central  injection of  interleukin‐13  potentiates LPS‐induced sickness behavior in rats. Neuroreport 12:3979‐3983.  Bluthe RM, Lestage  J, Rees G, Bristow A, Dantzer R  (2002) Dual effect of central  injection of  recombinant rat  interleukin‐4 on  lipopolysaccharide‐induced sickness behavior  in rats.  Neuropsychopharmacology 26:86‐93.  Bohatschek M,  Kloss  CU,  Pfeffer  K,  Bluethmann H,  Raivich G  (2004)  B7.2  on  activated  and  phagocytic microglia  in the facial axotomy model: regulation by  interleukin‐1 receptor  type  1,  tumor  necrosis  factor  receptors  1  and  2  and  endotoxin.  J  Neuroimmunol  156:132‐145.  Bowie  A,  O'Neill  LA  (2000)  The  interleukin‐1  receptor/Toll‐like  receptor  superfamily:  signal  generators  for  pro‐inflammatory  interleukins  and  microbial  products.  J  Leukoc  Biol  67:508‐514.  Brautigam VM, Frasier C, Nikodemova M, Watters JJ (2005) Purinergic receptor modulation of  BV‐2 microglial  cell  activity:  potential  involvement  of  p38 MAP  kinase  and  CREB.  J  Neuroimmunol 166:113‐125.  Brikos C, O'Neill LA (2008) Signalling of toll‐like receptors. Handb Exp Pharmacol:21‐50.  Brown H, Kozlowski R, Perry H  (1998)  The  importance of  ion  channels  for macrophage  and  microglial activation in vitro. Glia 22:94‐97.  58    Bsibsi M, Ravid R, Gveric D, van Noort JM (2002) Broad expression of Toll‐like receptors in the  human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 61:1013‐1021.  Butovsky  O,  Talpalar  AE,  Ben‐Yaakov  K,  Schwartz  M  (2005)  Activation  of  microglia  by  aggregated beta‐amyloid or  lipopolysaccharide  impairs MHC‐II expression and renders  them cytotoxic whereas IFN‐gamma and IL‐4 render them protective. Mol Cell Neurosci  29:381‐393.  Bye N, Habgood MD, Callaway JK, Malakooti N, Potter A, Kossmann T, Morganti‐Kossmann MC  (2007)  Transient  neuroprotection  by minocycline  following  traumatic  brain  injury  is  associated with  attenuated microglial  activation  but  no  changes  in  cell  apoptosis  or  neutrophil infiltration. Exp Neurol 204:220‐233.  Byram SC, Carson MJ, DeBoy CA, Serpe CJ, Sanders VM,  Jones KJ  (2004) CD4‐positive T cell‐ mediated neuroprotection requires dual compartment antigen presentation. J Neurosci  24:4333‐4339.  Cajal SR (1913) Estudios sobre la degeneración y regeneración del  sistema nervioso.  Carmignoto G  (2000) Reciprocal  communication  systems  between  astrocytes  and neurones.  Prog Neurobiol 62:561‐581.  Carpentier PA, Duncan DS, Miller SD (2008) Glial toll‐like receptor signaling in central nervous  system infection and autoimmunity. Brain Behav Immun 22:140‐147.  Cartier L, Hartley O, Dubois‐Dauphin M, Krause KH (2005) Chemokine receptors in the central  nervous system: role in brain inflammation and neurodegenerative diseases. Brain Res  Brain Res Rev 48:16‐42.  Cella  M,  Buonsanti  C,  Strader  C,  Kondo  T,  Salmaggi  A,  Colonna  M  (2003)  Impaired  differentiation of osteoclasts in TREM‐2‐deficient individuals. J Exp Med 198:645‐651.  Chakravarty  S, Herkenham M  (2005) Toll‐like  receptor 4 on nonhematopoietic  cells  sustains  CNS  inflammation during endotoxemia,  independent of systemic cytokines. J Neurosci  25:1788‐1796.  Chan A, Magnus T, Gold R (2001) Phagocytosis of apoptotic inflammatory cells by microglia and  modulation  by  different  cytokines: mechanism  for  removal  of  apoptotic  cells  in  the  inflamed nervous system. Glia 33:87‐95.  Chan WY, Kohsaka S, Rezaie P  (2007) The origin and cell  lineage of microglia: new concepts.  Brain Res Rev 53:344‐354.  Chen H,  Jacobs  E,  Schwarzschild MA, McCullough ML, Calle  EE,  Thun MJ, Ascherio A  (2005)  Nonsteroidal  antiinflammatory  drug  use  and  the  risk  for  Parkinson's  disease.  Ann  Neurol 58:963‐967.  Choi  SH,  Lee DY,  Chung  ES, Hong  YB,  Kim  SU,  Jin  BK  (2005)  Inhibition  of  thrombin‐induced  microglial  activation  and  NADPH  oxidase  by  minocycline  protects  dopaminergic  neurons in the substantia nigra in vivo. J Neurochem 95:1755‐1765.  Chung  SH, Allen  TW, Hoyles M,  Kuyucak  S  (1999)  Permeation  of  ions  across  the  potassium  channel: brownian dynamics studies. Biophys J 77:2517‐2533.  Colton  CA,  Gilbert  DL  (1987)  Production  of  superoxide  anions  by  a  CNS macrophage,  the  microglia. FEBS Lett 223:284‐288.  Colton  CA, Gilbert DL  (1993) Microglia,  an  in  vivo  source  of  reactive  oxygen  species  in  the  brain. Adv Neurol 59:321‐326.  59    Coutinho A, Meo T, Watanabe T  (1977)  Independent  segregation of  two  functional markers  expressed  on  the  same  B‐cell  subset  in  the mouse:  the Mls  determinants  and  LPS  receptors. Scand J Immunol 6:1005‐1013.  Creagh  EM,  O'Neill  LA  (2006)  TLRs,  NLRs  and  RLRs:  a  trinity  of  pathogen  sensors  that  co‐ operate in innate immunity. Trends Immunol 27:352‐357.  Cuadros  MA,  Navascues  J  (2001)  Early  origin  and  colonization  of  the  developing  central  nervous system by microglial precursors. Prog Brain Res 132:51‐59.  Cunningham C, Konsman JP, Cartmell T (2002) Cytokines and the ageing brain. Trends Neurosci  25:546‐547.  Dallasta LM, Pisarov LA, Esplen  JE, Werley  JV, Moses AV, Nelson  JA, Achim CL  (1999) Blood‐ brain barrier tight junction disruption in human immunodeficiency virus‐1 encephalitis.  Am J Pathol 155:1915‐1927.  Dalmau  I,  Vela  JM, Gonzalez  B,  Finsen  B,  Castellano  B  (2003) Dynamics  of microglia  in  the  developing rat brain. J Comp Neurol 458:144‐157.  Dantzer R  (2001) Cytokine‐induced sickness behavior: mechanisms and  implications. Ann N Y  Acad Sci 933:222‐234.  Dantzer R (2006) Cytokine, sickness behavior, and depression. Neurol Clin 24:441‐460.  Dantzer  R, O'Connor  JC,  Freund GG,  Johnson  RW,  Kelley  KW  (2008)  From  inflammation  to  sickness  and  depression:  when  the  immune  system  subjugates  the  brain.  Nat  Rev  Neurosci 9:46‐56.  Das  S,  Basu  A  (2008)  Inflammation:  a  new  candidate  in modulating  adult  neurogenesis.  J  Neurosci Res 86:1199‐1208.  Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y, Jung S, Littman DR, Dustin ML, Gan WB (2005)  ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci 8:752‐ 758.  Davies  MH,  Eubanks  JP,  Powers  MR  (2006)  Microglia  and  macrophages  are  increased  in  response to ischemia‐induced retinopathy in the mouse retina. Mol Vis 12:467‐477.  Davoust N, Vuaillat C, Androdias G, Nataf S  (2008) From bone marrow  to microglia: barriers  and avenues. Trends Immunol 29:227‐234.  Davoust N, Nataf  S,  Reiman  R, Holers MV,  Campbell  IL,  Barnum  SR  (1999)  Central  nervous  system‐targeted expression of  the complement  inhibitor  sCrry prevents experimental  allergic encephalomyelitis. J Immunol 163:6551‐6556.  Davoust N, Vuaillat C, Cavillon G, Domenget C, Hatterer E, Bernard A, Dumontel C,  Jurdic P,  Malcus  C,  Confavreux  C,  Belin  MF,  Nataf  S  (2006)  Bone  marrow  CD34+/B220+  progenitors  target  the  inflamed  brain  and  display  in  vitro  differentiation  potential  toward microglia. Faseb J 20:2081‐2092.  de Bock F, Derijard B, Dornand J, Bockaert J, Rondouin G (1998) The neuronal death induced by  endotoxic shock but not that induced by excitatory amino acids requires TNF‐alpha. Eur  J Neurosci 10:3107‐3114.  de Haas AH, van Weering HR, de Jong EK, Boddeke HW, Biber KP (2007) Neuronal chemokines:  versatile messengers in central nervous system cell interaction. Mol Neurobiol 36:137‐ 151.  De Miranda  J, Yaddanapudi K, Hornig M,  Lipkin WI  (2008) Astrocytes  recognize  intracellular  polyinosinic‐polycytidylic acid via MDA‐5. Faseb J.  60    De  Simone  R,  Giampaolo  A,  Giometto  B,  Gallo  P,  Levi  G,  Peschle  C,  Aloisi  F  (1995)  The  costimulatory molecule B7  is expressed on human microglia  in culture and  in multiple  sclerosis acute lesions. J Neuropathol Exp Neurol 54:175‐187.  del Rio‐Hortega P (1932) Microglia‐Cytology and cellular pathology of the nervous system.483– 534.  del Rio‐Hortega P  (1937) Microglia. Cytology and Cellular Pathology of  the Nervous  System:  :481–534.  DeLeo  JA,  Tanga  FY,  Tawfik  VL  (2004)  Neuroimmune  activation  and  neuroinflammation  in  chronic pain and opioid tolerance/hyperalgesia. Neuroscientist 10:40‐52.  Denker SP, Ji S, Dingman A, Lee SY, Derugin N, Wendland MF, Vexler ZS (2007) Macrophages  are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely  after neonatal stroke. J Neurochem 100:893‐904.  Diestel  A,  Aktas O,  Hackel  D, Hake  I, Meier  S,  Raine  CS, Nitsch  R,  Zipp  F, Ullrich O  (2003)  Activation  of  microglial  poly(ADP‐ribose)‐polymerase‐1  by  cholesterol  breakdown  products  during  neuroinflammation:  a  link  between  demyelination  and  neuronal  damage. J Exp Med 198:1729‐1740.  Dinarello CA (1997a) Interleukin‐1. Cytokine Growth Factor Rev 8:253‐265.  Dinarello  CA  (1997b)  Role  of  pro‐  and  anti‐inflammatory  cytokines  during  inflammation:  experimental and clinical findings. J Biol Regul Homeost Agents 11:91‐103.  DiRosario  J,  Divers  E, Wang  C,  Etter  J,  Charrier  A,  Jukkola  P,  Auer  H,  Best  V,  Newsom  DL,  McCarty DM, Fu H (2009)  Innate and adaptive  immune activation  in the brain of MPS  IIIB mouse model. J Neurosci Res 87:978‐990.  Dissing‐Olesen  L,  Ladeby  R,  Nielsen  HH,  Toft‐Hansen  H,  Dalmau  I,  Finsen  B  (2007)  Axonal  lesion‐induced microglial proliferation and microglial  cluster  formation  in  the mouse.  Neuroscience 149:112‐122.  Duan Y, Sahley CL, Muller KJ (2009) ATP and NO dually control migration of microglia to nerve  lesions. Dev Neurobiol 69:60‐72.  Ducharme  G,  Newell  EW,  Pinto  C,  Schlichter  LC  (2007)  Small‐conductance  Cl‐  channels  contribute to volume regulation and phagocytosis in microglia. Eur J Neurosci 26:2119‐ 2130.  Dunn AJ, Swiergiel AH, de Beaurepaire R  (2005) Cytokines as mediators of depression: what  can we learn from animal studies? Neurosci Biobehav Rev 29:891‐909.  Eder C (1998) Ion channels in microglia (brain macrophages). Am J Physiol 275:C327‐342.  Eder C (2005) Regulation of microglial behavior by ion channel activity. J Neurosci Res 81:314‐ 321.  Eder  C,  Klee  R,  Heinemann  U  (1998)  Involvement  of  stretch‐activated  Cl‐  channels  in  ramification of murine microglia. J Neurosci 18:7127‐7137.  Eder C, Fischer HG, Hadding U, Heinemann U  (1995a) Properties of voltage‐gated potassium  currents  of microglia  differentiated with  granulocyte/macrophage  colony‐stimulating  factor. J Membr Biol 147:137‐146.  Eder C, Fischer HG, Hadding U, Heinemann U (1995b) Properties of voltage‐gated currents of  microglia  developed  using  macrophage  colony‐stimulating  factor.  Pflugers  Arch  430:526‐533.  Elkabes  S,  DiCicco‐Bloom  EM,  Black  IB  (1996)  Brain  microglia/macrophages  express  neurotrophins that selectively regulate microglial proliferation and function. J Neurosci  16:2508‐2521.  61    Elkabes  S,  Peng  L,  Black  IB  (1998)  Lipopolysaccharide  differentially  regulates microglial  trk  receptor and neurotrophin expression. J Neurosci Res 54:117‐122.  Esen N,  Tanga  FY, DeLeo  JA,  Kielian  T  (2004)  Toll‐like  receptor  2  (TLR2) mediates  astrocyte  activation  in  response  to  the  Gram‐positive  bacterium  Staphylococcus  aureus.  J  Neurochem 88:746‐758.  Etminan M, Gill S, Samii A  (2003a) Effect of non‐steroidal anti‐inflammatory drugs on  risk of  Alzheimer's disease: systematic review and meta‐analysis of observational studies. Bmj  327:128.  Etminan M, Gill S, Samii A (2003b) Comparison of the risk of adverse events with pramipexole  and  ropinirole  in patients with Parkinson's disease: a meta‐analysis. Drug Saf 26:439‐ 444.  Evans DL, Ten Have TR, Douglas SD, Gettes DR, Morrison M, Chiappini MS, Brinker‐Spence P,  Job C, Mercer DE, Wang YL, Cruess D, Dube B, Dalen EA, Brown T, Bauer R, Petitto JM  (2002) Association of depression with viral  load, CD8 T  lymphocytes, and natural killer  cells in women with HIV infection. Am J Psychiatry 159:1752‐1759.  Familian  A,  Eikelenboom  P,  Veerhuis  R  (2007)  Minocycline  does  not  affect  amyloid  beta  phagocytosis by human microglial cells. Neurosci Lett 416:87‐91.  Farber K, Cheung G, Mitchell D, Wallis R, Weihe E, Schwaeble W, Kettenmann H  (2009) C1q,  the  recognition  subcomponent  of  the  classical  pathway  of  complement,  drives  microglial activation. J Neurosci Res 87:644‐652.  Farber  K, Markworth  S,  Pannasch  U,  Nolte  C,  Prinz  V,  Kronenberg  G,  Gertz  K,  Endres M,  Bechmann  I,  Enjyoji  K,  Robson  SC,  Kettenmann  H  (2008)  The  ectonucleotidase  cd39/ENTPDase1 modulates purinergic‐mediated microglial migration. Glia 56:331‐341.  Fassbender  K,  Hodapp  B,  Rossol  S,  Bertsch  T,  Schmeck  J,  Schutt  S,  Fritzinger M,  Horn  P,  Vajkoczy  P,  Kreisel  S,  Brunner  J,  Schmiedek  P,  Hennerici  M  (2001)  Inflammatory  cytokines  in  subarachnoid  haemorrhage:  association  with  abnormal  blood  flow  velocities in basal cerebral arteries. J Neurol Neurosurg Psychiatry 70:534‐537.  Fiala  M,  Cribbs  DH,  Rosenthal  M,  Bernard  G  (2007)  Phagocytosis  of  amyloid‐beta  and  inflammation:  two  faces  of  innate  immunity  in Alzheimer's  disease.  J Alzheimers Dis  11:457‐463.  Floden AM, Combs CK  (2007) Microglia repetitively  isolated  from  in vitro mixed glial cultures  retain their initial phenotype. J Neurosci Methods 164:218‐224.  Floden AM, Li S, Combs CK (2005) Beta‐amyloid‐stimulated microglia induce neuron death via  synergistic stimulation of tumor necrosis factor alpha and NMDA receptors. J Neurosci  25:2566‐2575.  Ford JW, McVicar DW (2009) TREM and TREM‐like receptors in inflammation and disease. Curr  Opin Immunol.  Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, Schlichter LC (2005) Microglia Kv1.3 channels contribute to their  ability to kill neurons. J Neurosci 25:7139‐7149.  Forstreuter  F,  Lucius  R,  Mentlein  R  (2002)  Vascular  endothelial  growth  factor  induces  chemotaxis and proliferation of microglial cells. J Neuroimmunol 132:93‐98.  Franchini L, Levi G, Visentin S (2004) Inwardly rectifying K+ channels influence Ca2+ entry due  to nucleotide receptor activation in microglia. Cell Calcium 35:449‐459.  Fraser DD, Mudrick‐Donnon LA, MacVicar BA (1994) Astrocytic GABA receptors. Glia 11:83‐93.  Gabay C, Cakir N, Moral F, Roux‐Lombard P, Meyer O, Dayer JM, Vischer T, Yazici H, Guerne PA  (1997) Circulating  levels of  tumor necrosis  factor  soluble  receptors  in  systemic  lupus  62    erythematosus are significantly higher than  in other rheumatic diseases and correlate  with disease activity. J Rheumatol 24:303‐308.  Galvan MD,  Luchetti  S,  Burgos  AM,  Nguyen  HX,  Hooshmand MJ,  Hamers  FP,  Anderson  AJ  (2008) Deficiency  in complement C1q  improves histological and  functional  locomotor  outcome after spinal cord injury. J Neurosci 28:13876‐13888.  Gao  Z, Wang  J,  Thiex R, Rogove AD, Heppner  FL,  Tsirka  SE  (2008) Microglial  activation  and  intracerebral hemorrhage. Acta Neurochir Suppl 105:51‐53.  Garden GA, Moller T (2006) Microglia biology in health and disease. J Neuroimmune Pharmacol  1:127‐137.  Gehrmann  J, Matsumoto Y, Kreutzberg GW  (1995) Microglia:  intrinsic  immuneffector  cell of  the brain. Brain Res Brain Res Rev 20:269‐287.  Gelinas  DS,  DaSilva  K,  Fenili  D,  St  George‐Hyslop  P, McLaurin  J  (2004)  Immunotherapy  for  Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl 2:14657‐14662.  Ghosh A, Mukherjee J, Bhattacharjee M, Sarkar P, Acharya S, Chaudhuri S, Chaudhuri S (2007)  The other  side of  the  coin: beneficiary effect of  'oxidative burst' upsurge with T11TS  facilitates the elimination of glioma cells. Cell Mol Biol (Noisy‐le‐grand) 53:53‐62.  Giulian D,  Vaca  K,  Corpuz M  (1993a)  Brain  glia  release  factors with  opposing  actions  upon  neuronal survival. J Neurosci 13:29‐37.  Giulian D,  Corpuz M,  Chapman  S, Mansouri M,  Robertson  C  (1993b)  Reactive mononuclear  phagocytes  release  neurotoxins  after  ischemic  and  traumatic  injury  to  the  central  nervous system. J Neurosci Res 36:681‐693.  Glabinski AR, Ransohoff RM (1999) Chemokines and chemokine receptors  in CNS pathology. J  Neurovirol 5:3‐12.  Golde  S,  Coles  A,  Lindquist  JA,  Compston  A  (2003)  Decreased  iNOS  synthesis  mediates  dexamethasone‐induced protection of neurons from inflammatory injury in vitro. Eur J  Neurosci 18:2527‐2537.  Graber  JJ,  Dhib‐Jalbut  S  (2009)  Protective  autoimmunity  in  the  nervous  system.  Pharmacol  Ther 121:147‐159.  Graeber MB  (1993) Microglia, macrophages  and  the  blood‐brain  barrier.  Clin  Neuropathol  12:296‐297.  Graeber  MB,  Streit  WJ,  Kreutzberg  GW  (1988)  Axotomy  of  the  rat  facial  nerve  leads  to  increased CR3 complement receptor expression by activated microglial cells. J Neurosci  Res 21:18‐24.  Graeber MB, Bise K, Mehraein P  (1993) Synaptic  stripping  in  the human  facial nucleus. Acta  Neuropathol 86:179‐181.  Green  SP,  Cairns  B,  Rae  J,  Errett‐Baroncini  C,  Hongo  JA,  Erickson  RW,  Curnutte  JT  (2001)  Induction of gp91‐phox, a component of  the phagocyte NADPH oxidase,  in microglial  cells during central nervous  system  inflammation.  J Cereb Blood Flow Metab 21:374‐ 384.  Guha M, Mackman N (2001) LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal  13:85‐94.  Guha M, O'Connell MA, Pawlinski R, Hollis A, McGovern P, Yan SF, Stern D, Mackman N (2001)  Lipopolysaccharide  activation  of  the MEK‐ERK1/2  pathway  in  human monocytic  cells  mediates  tissue  factor  and  tumor  necrosis  factor  alpha  expression  by  inducing  Elk‐1  phosphorylation and Egr‐1 expression. Blood 98:1429‐1439.  63    Guo LH, Schluesener HJ (2007) The  innate  immunity of the central nervous system  in chronic  pain: the role of Toll‐like receptors. Cell Mol Life Sci 64:1128‐1136.  Hacker H, Redecke V, Blagoev B, Kratchmarova I, Hsu LC, Wang GG, Kamps MP, Raz E, Wagner  H, Hacker G, Mann M, Karin M (2006) Specificity in Toll‐like receptor signalling through  distinct effector functions of TRAF3 and TRAF6. Nature 439:204‐207.  Hald  A,  Van  Beek  J,  Lotharius  J  (2007)  Inflammation  in  Parkinson's  disease:  causative  or  epiphenomenal? Subcell Biochem 42:249‐279.  Halliwell  B  (2001)  Role  of  free  radicals  in  the  neurodegenerative  diseases:  therapeutic  implications for antioxidant treatment. Drugs Aging 18:685‐716.  Hanisch UK (2002) Microglia as a source and target of cytokines. Glia 40:140‐155.  Hanisch UK, Kettenmann H  (2007) Microglia: active  sensor and versatile effector cells  in  the  normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10:1387‐1394.  Hanisch UK, Prinz M, Angstwurm K, Hausler KG, Kann O, Kettenmann H, Weber JR (2001) The  protein  tyrosine  kinase  inhibitor  AG126  prevents  the  massive  microglial  cytokine  induction by pneumococcal cell walls. Eur J Immunol 31:2104‐2115.  Hao HP, Doh‐Ura  K, Nakanishi H  (2007)  Impairment  of microglial  responses  to  facial  nerve  axotomy in cathepsin S‐deficient mice. J Neurosci Res 85:2196‐2206.  Harada T, Harada C, Kohsaka S, Wada E, Yoshida K, Ohno S, Mamada H, Tanaka K, Parada LF,  Wada  K  (2002)  Microglia‐Muller  glia  cell  interactions  control  neurotrophic  factor  production during light‐induced retinal degeneration. J Neurosci 22:9228‐9236.  Hart BL (1988) Biological basis of the behavior of sick animals. Neurosci Biobehav Rev 12:123‐ 137.  Hashimoto  S,  Nagaoka  M,  Yokokura  T,  Mutai  M  (1988)  Correlation  of  susceptibility  and  cytostatic factor‐inducing activity of tumour cells to peritoneal macrophages. The role  of concanavalin A‐binding glycopeptides extracted from the tumour cell surface. Scand  J Immunol 27:261‐269.  Hayakawa K, Borchardt PE,  Sakuma  S,  Ijichi A, Niibe H, Tofilon PJ  (1997) Microglial  cytokine  gene  induction after  irradiation  is affected by morphologic differentiation. Radiat Med  15:405‐410.  Haynes SE, Hollopeter G, Yang G, Kurpius D, Dailey ME, Gan WB,  Julius D  (2006) The P2Y12  receptor  regulates  microglial  activation  by  extracellular  nucleotides.  Nat  Neurosci  9:1512‐1519.  Heine H, Lien E (2003) Toll‐like receptors and their function  in  innate and adaptive  immunity.  Int Arch Allergy Immunol 130:180‐192.  Henkel JS, Engelhardt JI, Siklos L, Simpson EP, Kim SH, Pan T, Goodman JC, Siddique T, Beers  DR,  Appel  SH  (2004)  Presence  of  dendritic  cells,  MCP‐1,  and  activated  microglia/macrophages  in amyotrophic  lateral sclerosis spinal cord tissue. Ann Neurol  55:221‐235.  Hill KE, Zollinger LV, Watt HE, Carlson NG, Rose  JW  (2004)  Inducible nitric oxide  synthase  in  chronic  active  multiple  sclerosis  plaques:  distribution,  cellular  expression  and  association with myelin damage. J Neuroimmunol 151:171‐179.  His (1874) Unsere Körperform und das physiologische Problem ihrer Enstehung. Vogel.  Hoebe K, Du X, Georgel P, Janssen E, Tabeta K, Kim SO, Goode J, Lin P, Mann N, Mudd S, Crozat  K, Sovath S, Han J, Beutler B (2003) Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88‐ independent TIR signalling. Nature 424:743‐748.  64    Hoffmann O, Braun JS, Becker D, Halle A, Freyer D, Dagand E, Lehnardt S, Weber JR (2007) TLR2  mediates neuroinflammation and neuronal damage. J Immunol 178:6476‐6481.  Honda S, Sasaki Y, Ohsawa K, Imai Y, Nakamura Y, Inoue K, Kohsaka S (2001) Extracellular ATP  or ADP  induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o‐coupled P2Y receptors. J  Neurosci 21:1975‐1982.  Hong  SC,  Sant'Angelo DB, Dittel BN, Medzhitov  R,  Yoon  ST, Waterbury  PG,  Janeway  CA,  Jr.  (1997) The orientation of a T cell receptor to its MHC class II:peptide ligands. J Immunol  159:4395‐4402.  Husemann J, Loike JD, Kodama T, Silverstein SC (2001) Scavenger receptor class B type I (SR‐BI)  mediates  adhesion  of  neonatal  murine  microglia  to  fibrillar  beta‐amyloid.  J  Neuroimmunol 114:142‐150.  Illes  P,  Norenberg  W,  Gebicke‐Haerter  PJ  (1996a)  Molecular  mechanisms  of  microglial  activation. B. Voltage‐ and purinoceptor‐operated channels in microglia. Neurochem Int  29:13‐24.  Illes P, Nieber K, Frohlich R, Norenberg W (1996b) P2 purinoceptors and pyrimidinoceptors of  catecholamine‐producing  cells  and  immunocytes.  Ciba  Found  Symp  198:110‐125;  discussion 125‐119.  Illes  Z,  Stern  JN,  Keskin DB,  Reddy  J,  Brosnan  CF, Waldner H,  Santambrogio  L,  Kuchroo VK,  Strominger JL (2005) Copolymer effects on microglia and T cells  in the central nervous  system of humanized mice. Eur J Immunol 35:3683‐3693.  Inoue K  (2006) The  function of microglia  through purinergic  receptors: neuropathic pain and  cytokine release. Pharmacol Ther 109:210‐226.  Jack CS, Arbour N, Manusow J, Montgrain V, Blain M, McCrea E, Shapiro A, Antel JP (2005) TLR  signaling  tailors  innate  immune  responses  in  human  microglia  and  astrocytes.  J  Immunol 175:4320‐4330.  Jackson  AC,  Rossiter  JP,  Lafon  M  (2006)  Expression  of  Toll‐like  receptor  3  in  the  human  cerebellar  cortex  in  rabies,  herpes  simplex  encephalitis,  and  other  neurological  diseases. J Neurovirol 12:229‐234.  Janelsins MC, Mastrangelo MA, Park KM, Sudol KL, Narrow WC, Oddo S, LaFerla FM, Callahan  LM, Federoff HJ, Bowers WJ (2008) Chronic neuron‐specific tumor necrosis factor‐alpha  expression  enhances  the  local  inflammatory  environment  ultimately  leading  to  neuronal death in 3xTg‐AD mice. Am J Pathol 173:1768‐1782.  Janeway CA, Jr. (1993) How the immune system recognizes invaders. Sci Am 269:72‐79.  Janeway  CA,  Jr.  (1999)  The  role  of  self‐recognition  in  receptor  repertoire  development.  Members of the Janeway Laboratory. Immunol Res 19:107‐118.  Janeway CA,  Jr.  (2001) How  the  immune  system protects  the host  from  infection. Microbes  Infect 3:1167‐1171.  Jenkins KA, Mansell A (2009) TIR‐containing adaptors in Toll‐like receptor signalling. Cytokine.  Jin JJ, Kim HD, Maxwell JA, Li L, Fukuchi K (2008) Toll‐like receptor 4‐dependent upregulation of  cytokines  in  a  transgenic mouse model  of Alzheimer's  disease.  J Neuroinflammation  5:23.  Julow J, Szeifert GT, Balint K, Nyary I, Nemes Z (2007) The role of microglia/macrophage system  in the tissue response to I‐125 interstitial brachytherapy of cerebral gliomas. Neurol Res  29:233‐238.  65    Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR (2000) Analysis  of  fractalkine  receptor CX(3)CR1  function by  targeted deletion and green  fluorescent  protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20:4106‐4114.  Kalis C, Kanzler B, Lembo A, Poltorak A, Galanos C, Freudenberg MA (2003) Toll‐like receptor 4  expression  levels  determine  the  degree  of  LPS‐susceptibility  in mice.  Eur  J  Immunol  33:798‐805.  Kalman M (1989) Dead cells can be phagocytosed by any neighboring cell  in early developing  rat brain. Int J Neurosci 46:139‐145.  Kaur C, Ling EA (2008) Blood brain barrier  in hypoxic‐ischemic conditions. Curr Neurovasc Res  5:71‐81.  Kaur C, Ling EA, Wong WC (1985) Transformation of amoeboid microglial cells into microglia in  the corpus callosum of  the postnatal  rat brain. An electron microscopical study. Arch  Histol Jpn 48:17‐25.  Kaur C, Hao AJ, Wu CH, Ling EA (2001) Origin of microglia. Microsc Res Tech 54:2‐9.  Kaushal  V,  Schlichter  LC  (2008) Mechanisms  of microglia‐mediated  neurotoxicity  in  a  new  model of the stroke penumbra. J Neurosci 28:2221‐2230.  Kawagoe T, Sato S, Matsushita K, Kato H, Matsui K, Kumagai Y, Saitoh T, Kawai T, Takeuchi O,  Akira S  (2008) Sequential  control of Toll‐like  receptor‐dependent  responses by  IRAK1  and IRAK2. Nat Immunol 9:684‐691.  Kawai T, Akira S (2006) TLR signaling. Cell Death Differ 13:816‐825.  Kawai T, Akira S (2007) TLR signaling. Semin Immunol 19:24‐32.  Kawai T, Akira S (2009) The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition. Int Immunol.  Kawanokuchi J, Mizuno T, Kato H, Mitsuma N, Suzumura A (2004) Effects of interferon‐beta on  microglial functions as inflammatory and antigen presenting cells in the central nervous  system. Neuropharmacology 46:734‐742.  Kelley  KW,  Bluthe  RM,  Dantzer  R,  Zhou  JH,  Shen  WH,  Johnson  RW,  Broussard  SR  (2003)  Cytokine‐induced sickness behavior. Brain Behav Immun 17 Suppl 1:S112‐118.  Kenny EF, O'Neill LA (2008) Signalling adaptors used by Toll‐like receptors: an update. Cytokine  43:342‐349.  Kettenmann H (2007) Neuroscience: the brain's garbage men. Nature 446:987‐989.  Kettenmann H, Gilbert P, Schachner M (1984) Depolarization of cultured oligodendrocytes by  glutamate and GABA. Neurosci Lett 47:271‐276.  Kettenmann H, Banati R, Walz W (1993) Electrophysiological behavior of microglia. Glia 7:93‐ 101.  Kielian T, Esen N, Bearden ED (2005) Toll‐like receptor 2 (TLR2)  is pivotal for recognition of S.  aureus peptidoglycan but not intact bacteria by microglia. Glia 49:567‐576.  Kim HS, Suh YH (2009) Minocycline and neurodegenerative diseases. Behav Brain Res 196:168‐ 179.  Kim SU, de Vellis J (2005) Microglia in health and disease. J Neurosci Res 81:302‐313.  Kimelberg HK, Macvicar  BA,  Sontheimer H  (2006)  Anion  channels  in  astrocytes:  Biophysics,  pharmacology, and function. Glia 54:747‐757.  Kobayashi K, Hernandez LD, Galan JE, Janeway CA, Jr., Medzhitov R, Flavell RA (2002) IRAK‐M is  a negative regulator of Toll‐like receptor signaling. Cell 110:191‐202.  Kobayashi M, Saitoh S, Tanimura N, Takahashi K, Kawasaki K, Nishijima M, Fujimoto Y, Fukase  K, Akashi‐Takamura S, Miyake K  (2006) Regulatory roles  for MD‐2 and TLR4  in  ligand‐ induced receptor clustering. J Immunol 176:6211‐6218.  66    Koistinaho J, Yrjanheikki J, Kauppinen T, Koistinaho M  (2004) Tetracycline derivatives as anti‐ inflammatory  agents  and  potential  agents  in  stroke  treatment.  Ernst  Schering  Res  Found Workshop:101‐115.  Konsman JP, Dantzer R (2001) How the immune and nervous systems interact during disease‐ associated anorexia. Nutrition 17:664‐668.  Kreutzberg GW (1996) Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci  19:312‐318.  Kriz  J  (2006)  Inflammation  in  ischemic  brain  injury:  timing  is  important.  Crit  Rev Neurobiol  18:145‐157.  Kurata  S,  Ariki  S,  Kawabata  S  (2006)  Recognition  of  pathogens  and  activation  of  immune  responses in Drosophila and horseshoe crab innate immunity. Immunobiology 211:237‐ 249.  Kust BM, Biber  K,  van Calker D, Gebicke‐Haerter  PJ  (1999) Regulation  of  K+  channel mRNA  expression  by  stimulation  of  adenosine  A2a‐receptors  in  cultured  rat microglia. Glia  25:120‐130.  Ladeby  R, Wirenfeldt M,  Garcia‐Ovejero  D,  Fenger  C,  Dissing‐Olesen  L,  Dalmau  I,  Finsen  B  (2005a) Microglial cell population dynamics in the injured adult central nervous system.  Brain Res Brain Res Rev 48:196‐206.  Ladeby R, Wirenfeldt M, Dalmau I, Gregersen R, Garcia‐Ovejero D, Babcock A, Owens T, Finsen  B  (2005b)  Proliferating  resident  microglia  express  the  stem  cell  antigen  CD34  in  response to acute neural injury. Glia 50:121‐131.  Lauer S, Kunde YA, Apodaca TA, Goldstein B, Hong‐Geller E (2009) Soluble MD2 increases TLR4  levels on the epithelial cell surface. Cell Immunol 255:8‐16.  Lee BS, Chen  J, Angelidis C,  Jurivich DA, Morimoto RI  (1995) Pharmacological modulation of  heat  shock  factor  1  by  antiinflammatory  drugs  results  in  protection  against  stress‐ induced cellular damage. Proc Natl Acad Sci U S A 92:7207‐7211.  Lee  JC,  Cho  GS,  Kwon  JH,  Shin MH,  Lim  JH,  Kim WK  (2006) Macrophageal/microglial  cell  activation  and  cerebral  injury  induced  by  excretory‐secretory  products  secreted  by  Paragonimus westermani. Neurosci Res 54:133‐139.  Lee SC, Liu W, Dickson DW, Brosnan CF, Berman JW (1993) Cytokine production by human fetal  microglia and astrocytes. Differential  induction by  lipopolysaccharide and  IL‐1 beta.  J  Immunol 150:2659‐2667.  Lee SJ, Lee S (2002) Toll‐like receptors and inflammation in the CNS. Curr Drug Targets Inflamm  Allergy 1:181‐191.  Lehnardt  S,  Lachance C, Patrizi  S,  Lefebvre  S,  Follett PL,  Jensen  FE, Rosenberg PA, Volpe  JJ,  Vartanian  T  (2002)  The  toll‐like  receptor  TLR4  is  necessary  for  lipopolysaccharide‐ induced oligodendrocyte injury in the CNS. J Neurosci 22:2478‐2486.  Lemaitre  B,  Nicolas  E,  Michaut  L,  Reichhart  JM,  Hoffmann  JA  (1996)  The  dorsoventral  regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in  Drosophila adults. Cell 86:973‐983.  Lembo  A,  Kalis  C,  Kirschning  CJ, Mitolo  V,  Jirillo  E, Wagner H, Galanos  C,  Freudenberg MA  (2003) Differential contribution of Toll‐like receptors 4 and 2 to the cytokine response  to Salmonella enterica serovar Typhimurium and Staphylococcus aureus in mice. Infect  Immun 71:6058‐6062.  67    Lenczowski MJ, Bluthe RM, Roth J, Rees GS, Rushforth DA, van Dam AM, Tilders FJ, Dantzer R,  Rothwell  NJ,  Luheshi  GN  (1999)  Central  administration  of  rat  IL‐6  induces  HPA  activation and fever but not sickness behavior in rats. Am J Physiol 276:R652‐658.  Leserman J (2003) HIV disease progression: depression, stress, and possible mechanisms. Biol  Psychiatry 54:295‐306.  Leserman J, Petitto JM, Gu H, Gaynes BN, Barroso J, Golden RN, Perkins DO, Folds JD, Evans DL  (2002) Progression  to AIDS,  a  clinical AIDS  condition  and mortality: psychosocial  and  physiological predictors. Psychol Med 32:1059‐1073.  Li G, Liu Y, Tzeng NS, Cui G, Block ML, Wilson B, Qin L, Wang T, Liu B, Liu  J, Hong  JS  (2005a)  Protective  effect  of  dextromethorphan  against  endotoxic  shock  in  mice.  Biochem  Pharmacol 69:233‐240.  Li J, Baud O, Vartanian T, Volpe JJ, Rosenberg PA (2005b) Peroxynitrite generated by inducible  nitric  oxide  synthase  and  NADPH  oxidase  mediates  microglial  toxicity  to  oligodendrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 102:9936‐9941.  Li M, Wang Y, Guo R, Bai Y, Yu Z (2007) Glucocorticoids impair microglia ability to induce T cell  proliferation and Th1 polarization. Immunol Lett 109:129‐137.  Li X  (2008)  IRAK4  in TLR/IL‐1R signaling: possible clinical applications. Eur  J  Immunol 38:614‐ 618.  Liao H, Huang W, Niu R, Sun L, Zhang L (2008) Cross‐talk between the epidermal growth factor‐ like  repeats/fibronectin  6‐8  repeats  domains  of  Tenascin‐R  and microglia modulates  neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation. J Neurosci Res 86:27‐34.  Lin SC, Bergles DE (2002) Physiological characteristics of NG2‐expressing glial cells. J Neurocytol  31:537‐549.  Ling  EA,  Wong  WC  (1993)  The  origin  and  nature  of  ramified  and  amoeboid  microglia:  a  historical review and current concepts. Glia 7:9‐18.  Liu  B,  Gao  HM,  Hong  JS  (2003)  Parkinson's  disease  and  exposure  to  infectious  agents  and  pesticides  and  the  occurrence  of  brain  injuries:  role  of  neuroinflammation.  Environ  Health Perspect 111:1065‐1073.  Liu  J,  Bartels M,  Lu  A,  Sharp  FR  (2001) Microglia/macrophages  proliferate  in  striatum  and  neocortex but not  in hippocampus after brief global  ischemia  that produces  ischemic  tolerance in gerbil brain. J Cereb Blood Flow Metab 21:361‐373.  Liu  ZQ,  Bohatschek M,  Pfeffer  K,  Bluethmann  H,  Raivich  G  (2005) Major  histocompatibility  complex (MHC2+) perivascular macrophages in the axotomized facial motor nucleus are  regulated  by  receptors  for  interferon‐gamma  (IFNgamma)  and  tumor  necrosis  factor  (TNF). Neuroscience 131:283‐292.  Liva SM, Kahn MA, Dopp JM, de Vellis J (1999) Signal transduction pathways  induced by GM‐ CSF in microglia: significance in the control of proliferation. Glia 26:344‐352.  Locati  M,  Murphy  PM  (1999)  Chemokines  and  chemokine  receptors:  biology  and  clinical  relevance in inflammation and AIDS. Annu Rev Med 50:425‐440.  Loddick SA, Liu C, Takao T, Hashimoto K, De Souza EB  (1998)  Interleukin‐1 receptors: cloning  studies and role  in central nervous system disorders. Brain Res Brain Res Rev 26:306‐ 319.  Loiarro M, Sette C, Gallo G, Ciacci A, Fanto N, Mastroianni D, Carminati P, Ruggiero V  (2005)  Peptide‐mediated  interference  of  TIR  domain  dimerization  in  MyD88  inhibits  interleukin‐1‐dependent activation of NF‐{kappa}B. J Biol Chem 280:15809‐15814.  68    Loiarro M, Capolunghi F, Fanto N, Gallo G, Campo S, Arseni B, Carsetti R, Carminati P, De Santis  R, Ruggiero V,  Sette C  (2007) Pivotal Advance:  Inhibition of MyD88 dimerization and  recruitment of  IRAK1 and  IRAK4 by a novel peptidomimetic compound.  J Leukoc Biol  82:801‐810.  Lowe J, MacLennan KA, Powe DG, Pound JD, Palmer JB (1989) Microglial cells  in human brain  have  phenotypic  characteristics  related  to  possible  function  as  dendritic  antigen  presenting cells. J Pathol 159:143‐149.  Lunemann A, Ullrich O, Diestel A,  Jons T, Ninnemann O, Kovac A, Pohl EE, Hass R, Nitsch R,  Hendrix  S  (2006) Macrophage/microglia  activation  factor  expression  is  restricted  to  lesion‐associated microglial cells after brain trauma. Glia 53:412‐419.  Maccioni RB, Rojo LE, Fernandez JA, Kuljis RO (2009) The role of neuroimmunomodulation  in  Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci 1153:240‐246.  Macdonald RL, Olsen RW (1994) GABAA receptor channels. Annu Rev Neurosci 17:569‐602.  Mack  CL,  Vanderlugt‐Castaneda  CL,  Neville  KL, Miller  SD  (2003) Microglia  are  activated  to  become  competent  antigen  presenting  and  effector  cells  in  the  inflammatory  environment of the Theiler's virus model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol 144:68‐ 79.  MacVicar  BA,  Hochman  D  (1991)  Imaging  of  synaptically  evoked  intrinsic  optical  signals  in  hippocampal slices. J Neurosci 11:1458‐1469.  Magnus  T, Chan A, Grauer O,  Toyka KV, Gold R  (2001) Microglial phagocytosis of  apoptotic  inflammatory  T  cells  leads  to  down‐regulation  of  microglial  immune  activation.  J  Immunol 167:5004‐5010.  Makwana M, Jones LL, Cuthill D, Heuer H, Bohatschek M, Hristova M, Friedrichsen S, Ormsby I,  Bueringer  D,  Koppius  A,  Bauer  K,  Doetschman  T,  Raivich  G  (2007)  Endogenous  transforming growth  factor beta 1  suppresses  inflammation and promotes  survival  in  adult CNS. J Neurosci 27:11201‐11213.  Male D, Rezaie P  (2001) Colonisation of the human central nervous system by microglia: the  roles of chemokines and vascular adhesion molecules. Prog Brain Res 132:81‐93.  Maslinska D, Laure‐Kamionowska M, Kaliszek A (1998) Morphological forms and localization of  microglial cells in the developing human cerebellum. Folia Neuropathol 36:145‐151.  Matsumoto Y, Hara N, Tanaka R, Fujiwara M (1986)  Immunohistochemical analysis of the rat  central  nervous  system  during  experimental  allergic  encephalomyelitis,  with  special  reference to Ia‐positive cells with dendritic morphology. J Immunol 136:3668‐3676.  Mayer AM, Oh  S,  Ramsey  KH,  Jacobson  PB, Glaser  KB,  Romanic AM  (1999)  Escherichia  coli  lipopolysaccharide  potentiation  and  inhibition  of  rat  neonatal  microglia  superoxide  anion  generation:  correlation  with  prior  lactic  dehydrogenase,  nitric  oxide,  tumor  necrosis  factor‐alpha,  thromboxane  B2,  and metalloprotease  release.  Shock  11:180‐ 186.  McGeer  PL,  Rogers  J,  McGeer  EG  (2006)  Inflammation,  anti‐inflammatory  agents  and  Alzheimer disease: the last 12 years. J Alzheimers Dis 9:271‐276.  McGettrick  AF,  O'Neill  LA  (2004)  The  expanding  family  of MyD88‐like  adaptors  in  Toll‐like  receptor signal transduction. Mol Immunol 41:577‐582.  McNamara RK, Jiang Y, Streit WJ, Lenox RH (2000) Facial motor neuron regeneration induces a  unique  spatial  and  temporal pattern of myristoylated  alanine‐rich C  kinase  substrate  expression. Neuroscience 97:581‐589.  69    Meda L, Baron P, Scarlato G (2001) Glial activation in Alzheimer's disease: the role of Abeta and  its associated proteins. Neurobiol Aging 22:885‐893.  Meda L, Cassatella MA, Szendrei GI, Otvos L, Jr., Baron P, Villalba M, Ferrari D, Rossi F (1995)  Activation  of microglial  cells  by  beta‐amyloid  protein  and  interferon‐gamma. Nature  374:647‐650.  Medana  IM, Chan‐Ling  T, Hunt NH  (2000) Reactive  changes of  retinal microglia during  fatal  murine cerebral malaria: effects of dexamethasone and experimental permeabilization  of the blood‐brain barrier. Am J Pathol 156:1055‐1065.  Medzhitov R,  Janeway CA,  Jr.  (1997a)  Innate  immunity:  the virtues of a nonclonal  system of  recognition. Cell 91:295‐298.  Medzhitov  R,  Janeway  CA,  Jr.  (1997b)  Innate  immunity:  impact  on  the  adaptive  immune  response. Curr Opin Immunol 9:4‐9.  Medzhitov R, Janeway CA, Jr. (1998a) An ancient system of host defense. Curr Opin  Immunol  10:12‐15.  Medzhitov  R,  Janeway  CA,  Jr.  (1998b)  Innate  immune  recognition  and  control  of  adaptive  immune responses. Semin Immunol 10:351‐353.  Medzhitov  R,  Preston‐Hurlburt  P,  Janeway  CA,  Jr.  (1997)  A  human  homologue  of  the  Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 388:394‐397.  Melton  LM,  Keith  AB,  Davis  S,  Oakley  AE,  Edwardson  JA,  Morris  CM  (2003)  Chronic  glial  activation,  neurodegeneration,  and  APP  immunoreactive  deposits  following  acute  administration of double‐stranded RNA. Glia 44:1‐12.  Mena MA, Garcia de Yebenes  J  (2008) Glial cells as players  in parkinsonism:  the "good,"  the  "bad," and the "mysterious" glia. Neuroscientist 14:544‐560.  Menager P, Roux P, Megret F, Bourgeois JP, Le Sourd AM, Danckaert A, Lafage M, Prehaud C,  Lafon M (2009) Toll‐like receptor 3 (TLR3) plays a major role in the formation of rabies  virus Negri Bodies. PLoS Pathog 5:e1000315.  Mennerick  S, Benz A,  Zorumski CF  (1996) Components of  glial  responses  to  exogenous  and  synaptic glutamate in rat hippocampal microcultures. J Neurosci 16:55‐64.  Mentlein  R,  Forstreuter  F,  Mehdorn  HM,  Held‐Feindt  J  (2004)  Functional  significance  of  vascular  endothelial  growth  factor  receptor  expression  on  human  glioma  cells.  J  Neurooncol 67:9‐18.  Mertsch K, Hanisch UK, Kettenmann H, Schnitzer  J  (2001) Characterization of microglial cells  and  their  response  to  stimulation  in  an  organotypic  retinal  culture  system.  J  Comp  Neurol 431:217‐227.  Mhatre M, Floyd RA, Hensley K (2004) Oxidative stress and neuroinflammation  in Alzheimer's  disease  and  amyotrophic  lateral  sclerosis:  common  links  and  potential  therapeutic  targets. J Alzheimers Dis 6:147‐157.  Miggin SM, O'Neill LA  (2006) New  insights  into  the  regulation of TLR  signaling.  J Leukoc Biol  80:220‐226.  Miller AH  (2003)  Cytokines  and  sickness  behavior:  implications  for  cancer  care  and  control.  Brain Behav Immun 17 Suppl 1:S132‐134.  Miller  SD, McMahon  EJ,  Schreiner  B,  Bailey  SL  (2007)  Antigen  presentation  in  the  CNS  by  myeloid  dendritic  cells  drives  progression  of  relapsing  experimental  autoimmune  encephalomyelitis. Ann N Y Acad Sci 1103:179‐191.  Minghetti  L  (2005)  Role  of  inflammation  in  neurodegenerative  diseases.  Curr  Opin  Neurol  18:315‐321.  70    Moriguchi  S, Mizoguchi  Y,  Tomimatsu  Y,  Hayashi  Y,  Kadowaki  T,  Kagamiishi  Y,  Katsube  N,  Yamamoto  K,  Inoue  K, Watanabe  S, Nabekura  J, Nakanishi H  (2003)  Potentiation  of  NMDA  receptor‐mediated  synaptic  responses  by microglia.  Brain  Res Mol  Brain  Res  119:160‐169.  Morimoto K, Murasugi T, Oda T (2002) Acute neuroinflammation exacerbates excitotoxicity in  rat hippocampus in vivo. Exp Neurol 177:95‐104.  Morrison MF, Petitto JM, Ten Have T, Gettes DR, Chiappini MS, Weber AL, Brinker‐Spence P,  Bauer RM, Douglas  SD,  Evans DL  (2002) Depressive  and  anxiety disorders  in women  with HIV infection. Am J Psychiatry 159:789‐796.  Muraille E, De Trez C, Brait M, De Baetselier P,  Leo O, Carlier Y  (2003) Genetically  resistant  mice  lacking MyD88‐adapter protein display a high susceptibility  to Leishmania major  infection associated with a polarized Th2 response. J Immunol 170:4237‐4241.  Myers JS (2008) Proinflammatory cytokines and sickness behavior: implications for depression  and cancer‐related symptoms. Oncol Nurs Forum 35:802‐807.  Nagai Y, Garrett KP, Ohta S, Bahrun U, Kouro T, Akira S, Takatsu K, Kincade PW (2006) Toll‐like  receptors  on  hematopoietic  progenitor  cells  stimulate  innate  immune  system  replenishment. Immunity 24:801‐812.  Nagai Y, Akashi S, Nagafuku M, Ogata M, Iwakura Y, Akira S, Kitamura T, Kosugi A, Kimoto M,  Miyake K (2002) Essential role of MD‐2 in LPS responsiveness and TLR4 distribution. Nat  Immunol 3:667‐672.  Nakagawa  T,  Suga  S,  Kawase  T,  Toda  M  (2006)  Intracarotid  injection  of  granulocyte‐ macrophage  colony‐stimulating  factor  induces  neuroprotection  in  a  rat  transient  middle cerebral artery occlusion model. Brain Res 1089:179‐185.  Nakajima K, Kikuchi Y,  Ikoma E, Honda S,  Ishikawa M, Liu Y, Kohsaka S  (1998) Neurotrophins  regulate the function of cultured microglia. Glia 24:272‐289.  Nakamura Y (2002) Regulating factors for microglial activation. Biol Pharm Bull 25:945‐953.  Nakanishi H (2003) Microglial functions and proteases. Mol Neurobiol 27:163‐176.  Napoli I, Neumann H (2009) Microglial clearance function in health and disease. Neuroscience  158:1030‐1038.  Navascues  J,  Calvente  R,  Marin‐Teva  JL,  Cuadros  MA  (2000)  Entry,  dispersion  and  differentiation  of microglia  in  the  developing  central  nervous  system.  An  Acad  Bras  Cienc 72:91‐102.  Neiss WF, Guntinas Lichius O, Angelov DN, Gunkel A, Stennert E (1992) The hypoglossal‐facial  anastomosis as model of neuronal plasticity in the rat. Ann Anat 174:419‐433.  Nelson PT,  Soma  LA,  Lavi E  (2002) Microglia  in diseases of  the  central nervous  system. Ann  Med 34:491‐500.  Neumann  H,  Misgeld  T,  Matsumuro  K,  Wekerle  H  (1998)  Neurotrophins  inhibit  major  histocompatibility class II inducibility of microglia: involvement of the p75 neurotrophin  receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 95:5779‐5784.  Neumann  J, Sauerzweig S, Ronicke R, Gunzer F, Dinkel K, Ullrich O, Gunzer M, Reymann KG  (2008) Microglia  cells  protect  neurons  by  direct  engulfment  of  invading  neutrophil  granulocytes: a new mechanism of CNS immune privilege. J Neurosci 28:5965‐5975.  Neuwelt EA, Garcia JH, Mena H (1978) Diffuse microglial proliferation after global ischemia in a  patient with aplastic bone marrow. Acta Neuropathol 43:259‐262.  Newell EW, Schlichter LC  (2005)  Integration of K+ and Cl‐ currents  regulate steady‐state and  dynamic membrane potentials in cultured rat microglia. J Physiol 567:869‐890.  71    Nicoll JA, Barton E, Boche D, Neal JW, Ferrer I, Thompson P, Vlachouli C, Wilkinson D, Bayer A,  Games D, Seubert P, Schenk D, Holmes C (2006) Abeta species removal after abeta42  immunization. J Neuropathol Exp Neurol 65:1040‐1048.  Nimmerjahn  A,  Kirchhoff  F,  Helmchen  F  (2005)  Resting microglial  cells  are  highly  dynamic  surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308:1314‐1318.  Nissl  F  (1892)  Über  experimentell  erzeugte  Veränderungen  an  den  Vorderhornzellen  des  Rückenmarken bei Kaninchen. . Zeitschrift für Neurologie:675‐682.  Norenberg W, Gebicke‐Haerter PJ,  Illes P  (1994a) Voltage‐dependent potassium  channels  in  activated rat microglia. J Physiol 475:15‐32.  Norenberg W,  Illes  P,  Gebicke‐Haerter  PJ  (1994b)  Sodium  channel  in  isolated  human  brain  macrophages (microglia). Glia 10:165‐172.  Nutile‐McMenemy N, Elfenbein A, Deleo  JA  (2007) Minocycline decreases  in  vitro microglial  motility, beta1‐integrin, and Kv1.3 channel expression. J Neurochem 103:2035‐2046.  O'Callaghan  JP,  Sriram K, Miller DB  (2008) Defining  "neuroinflammation". Ann N  Y Acad  Sci  1139:318‐330.  O'Neill LA (2008) Primer: Toll‐like receptor signaling pathways‐‐what do rheumatologists need  to know? Nat Clin Pract Rheumatol 4:319‐327.  O'Neill LA, Fitzgerald KA, Bowie AG (2003) The Toll‐IL‐1 receptor adaptor family grows to five  members. Trends Immunol 24:286‐290.  Oliveira A, Hodges H, Rezaie P  (2003) Excitotoxic  lesioning of  the  rat basal  forebrain with S‐ AMPA: consequent mineralization and associated glial  response. Exp Neurol 179:127‐ 138.  Osborne NN, McCord RJ, Wood J (1995) The effect of kainate on protein kinase C, GABA, and  the uptake of serotonin in the rabbit retina in vivo. Neurochem Res 20:635‐641.  Owens  T  (2005)  Toll‐like  receptors on  astrocytes: patterning  for  immunity.  J Neuroimmunol  159:1‐2.  Palin  K,  Bluthe  RM, McCusker  RH, Moos  F,  Dantzer  R,  Kelley  KW  (2007)  TNFalpha‐induced  sickness behavior in mice with functional 55 kD TNF receptors is blocked by central IGF‐ I. J Neuroimmunol 187:55‐60.  Palin K, McCusker RH,  Strle K, Moos  F, Dantzer R, Kelley KW  (2008)  Tumor necrosis  factor‐ alpha‐induced sickness behavior is impaired by central administration of an inhibitor of  c‐jun N‐terminal kinase. Psychopharmacology (Berl) 197:629‐635.  Palin K, Bluthe RM, McCusker RH, Levade T, Moos F, Dantzer R, Kelley KW (2009) The type 1  TNF  receptor  and  its  associated  adapter  protein,  FAN,  are  required  for  TNFalpha‐ induced sickness behavior. Psychopharmacology (Berl) 201:549‐556.  Pasinetti GM (1996) Inflammatory mechanisms in neurodegeneration and Alzheimer's disease:  the role of the complement system. Neurobiol Aging 17:707‐716.  Pastor A, Chvatal A, Sykova E, Kettenmann H  (1995) Glycine‐ and GABA‐activated currents  in  identified glial cells of the developing rat spinal cord slice. Eur J Neurosci 7:1188‐1198.  Perlmutter  LS,  Barron  E,  Myers  M,  Saperia  D,  Chui  HC  (1995)  Localization  of  amyloid  P  component in human brain: vascular staining patterns and association with Alzheimer's  disease lesions. J Comp Neurol 352:92‐105.  Perry VH  (1998) A  revised view of  the  central nervous  system microenvironment and major  histocompatibility complex class II antigen presentation. J Neuroimmunol 90:113‐121.  Perry  VH  (2004)  The  influence  of  systemic  inflammation  on  inflammation  in  the  brain:  implications for chronic neurodegenerative disease. Brain Behav Immun 18:407‐413.  72    Perry VH, Cunningham C, Boche D (2002) Atypical inflammation in the central nervous system  in prion disease. Curr Opin Neurol 15:349‐354.  Peschon JJ, Torrance DS, Stocking KL, Glaccum MB, Otten C, Willis CR, Charrier K, Morrissey PJ,  Ware CB, Mohler KM (1998) TNF receptor‐deficient mice reveal divergent roles for p55  and p75 in several models of inflammation. J Immunol 160:943‐952.  Piccio  L,  Buonsanti  C,  Cella M,  Tassi  I,  Schmidt  RE,  Fenoglio  C,  Rinker  J,  2nd, Naismith  RT,  Panina‐Bordignon P, Passini N, Galimberti D,  Scarpini E, Colonna M, Cross AH  (2008)  Identification  of  soluble  TREM‐2  in  the  cerebrospinal  fluid  and  its  association  with  multiple sclerosis and CNS inflammation. Brain 131:3081‐3091.  Pocock  JM, Kettenmann H  (2007) Neurotransmitter  receptors on microglia. Trends Neurosci  30:527‐535.  Polfliet MM, van de Veerdonk F, Dopp EA, van Kesteren‐Hendrikx EM, van Rooijen N, Dijkstra  CD,  van den Berg  TK  (2002)  The  role of perivascular  and meningeal macrophages  in  experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 122:1‐8.  Polfliet MM, Zwijnenburg PJ, van Furth AM, van der Poll T, Dopp EA, Renardel de Lavalette C,  van  Kesteren‐Hendrikx  EM,  van  Rooijen  N,  Dijkstra  CD,  van  den  Berg  TK  (2001)  Meningeal  and  perivascular  macrophages  of  the  central  nervous  system  play  a  protective role during bacterial meningitis. J Immunol 167:4644‐4650.  Poltorak  A,  Smirnova  I,  Clisch  R,  Beutler  B  (2000)  Limits  of  a  deletion  spanning  Tlr4  in  C57BL/10ScCr mice. J Endotoxin Res 6:51‐56.  Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos  C,  Freudenberg M,  Ricciardi‐Castagnoli  P,  Layton  B,  Beutler  B  (1998)  Defective  LPS  signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science 282:2085‐ 2088.  Ponomarev  ED,  Shriver  LP,  Maresz  K,  Dittel  BN  (2005)  Microglial  cell  activation  and  proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J Neurosci Res 81:374‐389.  Prat A,  Biernacki  K, Wosik  K, Antel  JP  (2001) Glial  cell  influence  on  the  human  blood‐brain  barrier. Glia 36:145‐155.  Prehaud C, Megret F, Lafage M, Lafon M (2005) Virus infection switches TLR‐3‐positive human  neurons to become strong producers of beta interferon. J Virol 79:12893‐12904.  Qi HY, Shelhamer JH (2005) Toll‐like receptor 4 signaling regulates cytosolic phospholipase A2  activation  and  lipid  generation  in  lipopolysaccharide‐stimulated macrophages.  J  Biol  Chem 280:38969‐38975.  Qin  L, He  J, Hanes  RN,  Pluzarev O, Hong  JS,  Crews  FT  (2008)  Increased  systemic  and  brain  cytokine production and neuroinflammation by endotoxin following ethanol treatment.  J Neuroinflammation 5:10.  Qin L, Liu Y, Wang T, Wei SJ, Block ML, Wilson B, Liu B, Hong JS (2004) NADPH oxidase mediates  lipopolysaccharide‐induced  neurotoxicity  and  proinflammatory  gene  expression  in  activated microglia. J Biol Chem 279:1415‐1421.  Ralay Ranaivo H, Craft JM, Hu W, Guo L, Wing LK, Van Eldik LJ, Watterson DM (2006) Glia as a  therapeutic target: selective suppression of human amyloid‐beta‐induced upregulation  of  brain  proinflammatory  cytokine  production  attenuates  neurodegeneration.  J  Neurosci 26:662‐670.  Rappert  A,  Biber  K, Nolte  C,  Lipp M,  Schubel  A,  Lu  B, Gerard NP, Gerard  C,  Boddeke HW,  Kettenmann H (2002) Secondary lymphoid tissue chemokine (CCL21) activates CXCR3 to  trigger a Cl‐ current and chemotaxis in murine microglia. J Immunol 168:3221‐3226.  73    Rasmussen S, Wang Y, Kivisakk P, Bronson RT, Meyer M, Imitola J, Khoury SJ (2007) Persistent  activation  of microglia  is  associated with  neuronal  dysfunction  of  callosal  projecting  pathways  and  multiple  sclerosis‐like  lesions  in  relapsing‐‐remitting  experimental  autoimmune encephalomyelitis. Brain 130:2816‐2829.  Redwine  JM, Buchmeier MJ,  Evans  CF  (2001)  In  vivo  expression  of major  histocompatibility  complex molecules on oligodendrocytes and neurons during viral infection. Am J Pathol  159:1219‐1224.  Reichmann  G,  Schroeter  M,  Jander  S,  Fischer  HG  (2002)  Dendritic  cells  and  dendritic‐like  microglia in focal cortical ischemia of the mouse brain. J Neuroimmunol 129:125‐132.  Rieske E, Graeber MB, Tetzlaff W, Czlonkowska A, Streit WJ, Kreutzberg GW (1989) Microglia  and microglia‐derived brain macrophages  in  culture: generation  from axotomized  rat  facial nuclei, identification and characterization in vitro. Brain Res 492:1‐14.  Robertson  W  (1890  )  New  Methods  of  Imbedding  Fresh  and  Hardened  Tissues.  J  Anat  Physiol:230–235.  Rogers  J, Lue LF  (2001) Microglial chemotaxis, activation, and phagocytosis of amyloid beta‐ peptide as linked phenomena in Alzheimer's disease. Neurochem Int 39:333‐340.  Rogers J, Strohmeyer R, Kovelowski CJ, Li R (2002) Microglia and inflammatory mechanisms in  the clearance of amyloid beta peptide. Glia 40:260‐269.  Rosenstreich DL, Vogel SN, Jacques AR, Wahl LM, Oppenheim JJ (1978) Macrophage sensitivity  to endotoxin: genetic control by a single codominant gene. J Immunol 121:1664‐1670.  Saito T, Gale M, Jr. (2007) Principles of intracellular viral recognition. Curr Opin Immunol 19:17‐ 23.  Sankarapandi  S,  Zweier  JL,  Mukherjee  G,  Quinn  MT,  Huso  DL  (1998)  Measurement  and  characterization of  superoxide  generation  in microglial  cells:  evidence  for  an NADPH  oxidase‐dependent pathway. Arch Biochem Biophys 353:312‐321.  Santambrogio L, Pakaski M, Wong ML, Cipriani B, Brosnan CF, Lees MB, Dorf ME (1999) Antigen  presenting capacity of brain microvasculature  in altered peptide  ligand modulation of  experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 93:81‐91.  Santambrogio L, Belyanskaya SL, Fischer FR, Cipriani B, Brosnan CF, Ricciardi‐Castagnoli P, Stern  LJ, Strominger  JL, Riese R  (2001) Developmental plasticity of CNS microglia. Proc Natl  Acad Sci U S A 98:6295‐6300.  Santos  AM,  Calvente  R,  Tassi M,  Carrasco MC, Martin‐Oliva D, Marin‐Teva  JL, Navascues  J,  Cuadros MA  (2008)  Embryonic  and  postnatal  development  of microglial  cells  in  the  mouse retina. J Comp Neurol 506:224‐239.  Schafer MK, Schwaeble WJ, Post C, Salvati P, Calabresi M, Sim RB, Petry F, Loos M, Weihe E  (2000) Complement C1q  is dramatically up‐regulated  in brain microglia  in response to  transient global cerebral ischemia. J Immunol 164:5446‐5452.  Schiefer J, Kampe K, Dodt HU, Zieglgansberger W, Kreutzberg GW (1999) Microglial motility in  the rat facial nucleus following peripheral axotomy. J Neurocytol 28:439‐453.  Schilling M, Besselmann M, Muller M, Strecker JK, Ringelstein EB, Kiefer R (2005) Predominant  phagocytic  activity  of  resident microglia  over  hematogenous macrophages  following  transient  focal  cerebral  ischemia:  an  investigation  using  green  fluorescent  protein  transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol 196:290‐297.  Schilling  T,  Quandt  FN,  Cherny  VV,  Zhou  W,  Heinemann  U,  Decoursey  TE,  Eder  C  (2000)  Upregulation of Kv1.3 K(+) channels in microglia deactivated by TGF‐beta. Am J Physiol  Cell Physiol 279:C1123‐1134.  74    Schlichter LC, Sakellaropoulos G, Ballyk B, Pennefather PS, Phipps DJ  (1996) Properties of K+  and  Cl‐  channels  and  their  involvement  in  proliferation  of  rat  microglial  cells.  Glia  17:225‐236.  Schubert P, Morino T, Miyazaki H, Ogata T, Nakamura Y, Marchini C, Ferroni S (2000) Cascading  glia  reactions:  a  common  pathomechanism  and  its  differentiated  control  by  cyclic  nucleotide signaling. Ann N Y Acad Sci 903:24‐33.  Schwab  C, McGeer  PL  (2002)  Complement  activated  C4d  immunoreactive  oligodendrocytes  delineate small cortical plaques in multiple sclerosis. Exp Neurol 174:81‐88.  Schwab C, Steele JC, McGeer PL (1996) Neurofibrillary tangles of Guam parkinson‐dementia are  associated with reactive microglia and complement proteins. Brain Res 707:196‐205.  Schwartz M  (2003) Macrophages  and microglia  in  central  nervous  system  injury:  are  they  helpful or harmful? J Cereb Blood Flow Metab 23:385‐394.  Schwartz M, Shaked I, Fisher J, Mizrahi T, Schori H (2003) Protective autoimmunity against the  enemy within: fighting glutamate toxicity. Trends Neurosci 26:297‐302.  Settembre C, Annunziata I, Spampanato C, Zarcone D, Cobellis G, Nusco E, Zito E, Tacchetti C,  Cosma  MP,  Ballabio  A  (2007)  Systemic  inflammation  and  neurodegeneration  in  a  mouse model of multiple sulfatase deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A 104:4506‐4511.  Shulman A, Goldstein B, Strashun AM  (2008) Central nervous system neurodegeneration and  tinnitus:  a  clinical  experience.  Part  II:  translational  neurovascular  theory  of  neurodegenerative CNS disease and tinnitus. Int Tinnitus J 14:43‐51.  Skaper  SD  (2007)  The  brain  as  a  target  for  inflammatory  processes  and  neuroprotective  strategies. Ann N Y Acad Sci 1122:23‐34.  Skurlova M, Stofkova A,  Jurcovicova  J  (2006) Exogenous  IL‐1beta  induces  its own expression,  but not that of  IL‐6  in the hypothalamus and activates HPA axis and prolactin release.  Endocr Regul 40:125‐128.  Sobrado‐Calvo  P,  Vidal‐Sanz M,  Villegas‐Perez MP  (2007)  Rat  retinal microglial  cells  under  normal  conditions,  after  optic  nerve  section,  and  after  optic  nerve  section  and  intravitreal injection of trophic factors or macrophage inhibitory factor. J Comp Neurol  501:866‐878.  Steindler DA, Kadrie T, Fillmore H, Thomas LB (1996) The subependymal zone: "brain marrow".  Prog Brain Res 108:349‐363.  Stevens B, Allen NJ, Vazquez LE, Howell GR, Christopherson KS, Nouri N, Micheva KD, Mehalow  AK, Huberman AD, Stafford B, Sher A, Litke AM, Lambris JD, Smith SJ, John SW, Barres  BA  (2007)  The  classical  complement  cascade mediates CNS  synapse  elimination. Cell  131:1164‐1178.  Stolzing  A,  Grune  T  (2004)  Neuronal  apoptotic  bodies:  phagocytosis  and  degradation  by  primary microglial cells. Faseb J 18:743‐745.  Streit WJ, ed (1995) Neuroglia. New York, N.Y: Oxford University Press.  Streit WJ (1996) The role of microglia in brain injury. Neurotoxicology 17:671‐678.  Streit WJ (2004) Microglia and Alzheimer's disease pathogenesis. J Neurosci Res 77:1‐8.  Streit WJ, Graeber MB  (1993) Heterogeneity of microglial  and perivascular  cell populations:  insights gained from the facial nucleus paradigm. Glia 7:68‐74.  Streit WJ, Graeber MB, Kreutzberg GW (1988) Functional plasticity of microglia: a review. Glia  1:301‐307.  75    Streit  WJ,  Hurley  SD,  McGraw  TS,  Semple‐Rowland  SL  (2000)  Comparative  evaluation  of  cytokine profiles and reactive gliosis supports a critical role for interleukin‐6 in neuron‐ glia signaling during regeneration. J Neurosci Res 61:10‐20.  Streit WJ, Miller KR, Lopes KO, Njie E  (2008) Microglial degeneration  in  the aging brain‐‐bad  news for neurons? Front Biosci 13:3423‐3438.  Suh HS, Kim MO, Lee SC (2005) Inhibition of granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor  signaling and microglial proliferation by anti‐CD45RO:  role of Hck  tyrosine kinase and  phosphatidylinositol 3‐kinase/Akt. J Immunol 174:2712‐2719.  Sultzer BM (1972a) Genetic control of host responses to endotoxin. Infect Immun 5:107‐113.  Sultzer BM (1972b) Genetic analysis of lymphocyte activation by lipopolysaccharide Endotoxin.  Infect Immun 13:1579‐1584.  Suzuki N,  Suzuki  S,  Yeh WC  (2002a)  IRAK‐4  as  the  central  TIR  signaling mediator  in  innate  immunity. Trends Immunol 23:503‐506.  Suzuki N, Suzuki S, Duncan GS, Millar DG, Wada T, Mirtsos C, Takada H, Wakeham A, Itie A, Li S,  Penninger JM, Wesche H, Ohashi PS, Mak TW, Yeh WC  (2002b) Severe  impairment of  interleukin‐1 and Toll‐like  receptor  signalling  in mice  lacking  IRAK‐4. Nature 416:750‐ 756.  Suzumura A (2002) Microglia: immunoregulatory cells in the central nervous system. Nagoya J  Med Sci 65:9‐20.  Swiergiel  AH,  Leskov  IL, Dunn  AJ  (2008)  Effects  of  chronic  and  acute  stressors  and  CRF  on  depression‐like behavior in mice. Behav Brain Res 186:32‐40.  Takahashi  K,  Rochford  CD,  Neumann  H  (2005)  Clearance  of  apoptotic  neurons  without  inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells‐2. J Exp Med  201:647‐657.  Takeda K, Akira S (2004) TLR signaling pathways. Semin Immunol 16:3‐9.  Takeda K, Akira S (2007) Toll‐like receptors. Curr Protoc Immunol Chapter 14:Unit 14 12.  Tambuyzer  BR,  Ponsaerts  P,  Nouwen  EJ  (2009)  Microglia:  gatekeepers  of  central  nervous  system immunology. J Leukoc Biol 85:352‐370.  Tan J, Town T, Saxe M, Paris D, Wu Y, Mullan M (1999a) Ligation of microglial CD40 results in  p44/42  mitogen‐activated  protein  kinase‐dependent  TNF‐alpha  production  that  is  opposed by TGF‐beta 1 and IL‐10. J Immunol 163:6614‐6621.  Tan JT, Whitmire JK, Ahmed R, Pearson TC, Larsen CP (1999b) 4‐1BB  ligand, a member of the  TNF family, is important for the generation of antiviral CD8 T cell responses. J Immunol  163:4859‐4868.  Tanaka J, Toku K, Sakanaka M, Maeda N (1999) Morphological differentiation of microglial cells  in  culture:  involvement  of  insoluble  factors  derived  from  astrocytes.  Neurosci  Res  34:207‐215.  Tassi M, Calvente R, Marin‐Teva JL, Cuadros MA, Santos AM, Carrasco MC, Sanchez‐Lopez AM,  Navascues J (2006) Behavior of  in vitro cultured ameboid microglial cells migrating on  Muller cell end‐feet in the quail embryo retina. Glia 54:376‐393.  Tauber SC, Stadelmann C, Spreer A, Bruck W, Nau R, Gerber J (2005)  Increased expression of  BDNF  and  proliferation  of  dentate  granule  cells  after  bacterial  meningitis.  J  Neuropathol Exp Neurol 64:806‐815.  Thomas DM, Francescutti‐Verbeem DM, Kuhn DM (2006) Gene expression profile of activated  microglia  under  conditions  associated  with  dopamine  neuronal  damage.  Faseb  J  20:515‐517.  76    Thored P, Heldmann U, Gomes‐Leal W, Gisler R, Darsalia V, Taneera J, Nygren JM, Jacobsen SE,  Ekdahl  CT,  Kokaia  Z,  Lindvall  O  (2008)  Long‐term  accumulation  of  microglia  with  proneurogenic  phenotype  concomitant  with  persistent  neurogenesis  in  adult  subventricular zone after stroke. Glia.  Tieu  K,  Ischiropoulos  H,  Przedborski  S  (2003)  Nitric  oxide  and  reactive  oxygen  species  in  Parkinson's disease. IUBMB Life 55:329‐335.  Tizard I (2008) Sickness behavior, its mechanisms and significance. Anim Health Res Rev 9:87‐ 99.  Tolias  CM,  McNeil  CJ,  Kazlauskaite  J,  Hillhouse  EW  (1999)  Superoxide  generation  from  constitutive  nitric  oxide  synthase  in  astrocytes  in  vitro  regulates  extracellular  nitric  oxide availability. Free Radic Biol Med 26:99‐106.  Tonchev AB, Boneva NB, Kaplamadzhiev DB, Kikuchi M, Mori Y, Sahara S, Yamashima T (2008)  Expression of neurotrophin receptors by proliferating glia in postischemic hippocampal  CA1 sector of adult monkeys. J Neuroimmunol 205:20‐24.  Troost D, Claessen N, van den Oord  JJ, Swaab DF, de  Jong  JM  (1993) Neuronophagia  in  the  motor cortex in amyotrophic lateral sclerosis. Neuropathol Appl Neurobiol 19:390‐397.  Tsoi  VL, Hill  KE,  Carlson NG, Warner  JE,  Rose  JW  (2006)  Immunohistochemical  evidence  of  inducible  nitric  oxide  synthase  and  nitrotyrosine  in  a  case  of  clinically  isolated  optic  neuritis. J Neuroophthalmol 26:87‐94.  Turrin NP, Rivest  S  (2006)  Tumor  necrosis  factor  alpha but not  interleukin  1 beta mediates  neuroprotection in response to acute nitric oxide excitotoxicity. J Neurosci 26:143‐151.  Ullrich O, Diestel A, Eyupoglu IY, Nitsch R (2001) Regulation of microglial expression of integrins  by poly(ADP‐ribose) polymerase‐1. Nat Cell Biol 3:1035‐1042.  Ulvestad  E, Williams  K, Mork  S,  Antel  J, Nyland H  (1994a)  Phenotypic  differences  between  human  monocytes/macrophages  and  microglial  cells  studied  in  situ  and  in  vitro.  J  Neuropathol Exp Neurol 53:492‐501.  Ulvestad E, Williams K, Bjerkvig R, Tiekotter K, Antel J, Matre R (1994b) Human microglial cells  have phenotypic and functional characteristics in common with both macrophages and  dendritic antigen‐presenting cells. J Leukoc Biol 56:732‐740.  van Rossum D, Hanisch UK (2004) Microglia. Metab Brain Dis 19:393‐411.  van Rossum D, Hilbert S, Strassenburg S, Hanisch UK, Bruck W  (2008) Myelin‐phagocytosing  macrophages  in  isolated sciatic and optic nerves  reveal a unique  reactive phenotype.  Glia 56:271‐283.  Virchow R (1859) Cellular pathology.  Special ed., 204‐207 John Churchill London, UK.  Vogel SN, Hansen CT, Rosenstreich DL (1979) Characterization of a congenitally LPS‐resistant,  athymic mouse strain. J Immunol 122:619‐622.  von Zahn  J, Moller T, Kettenmann H, Nolte C  (1997) Microglial phagocytosis  is modulated by  pro‐ and anti‐inflammatory cytokines. Neuroreport 8:3851‐3856.  Voyvodic  JT  (1996) Cell death  in  cortical development: How much? Why?  So what? Neuron  16:693‐696.  Walder CE, Green SP, Darbonne WC, Mathias  J, Rae  J, Dinauer MC, Curnutte  JT, Thomas GR  (1997)  Ischemic  stroke  injury  is  reduced  in mice  lacking a  functional NADPH oxidase.  Stroke 28:2252‐2258.  Walter S, Letiembre M, Liu Y, Heine H, Penke B, Hao W, Bode B, Manietta N, Walter J, Schulz‐ Schuffer W, Fassbender K (2007) Role of the toll‐like receptor 4 in neuroinflammation in  Alzheimer's disease. Cell Physiol Biochem 20:947‐956.  77    Walz W (2002) Chloride/anion channels in glial cell membranes. Glia 40:1‐10.  Walz W, Bekar LK (2001) Ion channels in cultured microglia. Microsc Res Tech 54:26‐33.  Wang  X,  Lou N,  Xu Q,  Tian  GF,  Peng WG,  Han  X,  Kang  J,  Takano  T, Nedergaard M  (2006)  Astrocytic Ca2+  signaling  evoked by  sensory  stimulation  in  vivo. Nat Neurosci 9:816‐ 823.  Watanabe H, Abe H, Takeuchi S, Tanaka R  (2000) Protective effect of microglial conditioning  medium on neuronal damage induced by glutamate. Neurosci Lett 289:53‐56.  Watanabe T, Voyvodic JT, Chan‐Ling T, Sagara H, Hirosawa K, Mio Y, Matsushima S, Uchimura  H, Nakahara K, Raff MC (1997) Differentiation and morphogenesis  in pellet cultures of  developing rat retinal cells. J Comp Neurol 377:341‐350.  Watters  JJ,  Schartner  JM, Badie B  (2005) Microglia  function  in brain  tumors.  J Neurosci Res  81:447‐455.  Wieczorek  M,  Swiergiel  AH,  Pournajafi‐Nazarloo  H,  Dunn  AJ  (2005)  Physiological  and  behavioral responses to  interleukin‐1beta and LPS  in vagotomized mice. Physiol Behav  85:500‐511.  Wilkinson  BL,  Landreth  GE  (2006)  The  microglial  NADPH  oxidase  complex  as  a  source  of  oxidative stress in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation 3:30.  Williams  K,  Alvarez  X,  Lackner  AA  (2001a)  Central  nervous  system  perivascular  cells  are  immunoregulatory cells that connect the CNS with the peripheral immune system. Glia  36:156‐164.  Williams KC, Corey S, Westmoreland SV, Pauley D, Knight H, deBakker C, Alvarez X, Lackner AA  (2001b) Perivascular macrophages  are  the primary  cell  type productively  infected by  simian  immunodeficiency  virus  in  the  brains  of  macaques:  implications  for  the  neuropathogenesis of AIDS. J Exp Med 193:905‐915.  Witting  A, Muller  P,  Herrmann  A,  Kettenmann  H,  Nolte  C  (2000)  Phagocytic  clearance  of  apoptotic  neurons  by Microglia/Brain macrophages  in  vitro:  involvement  of  lectin‐,  integrin‐, and phosphatidylserine‐mediated recognition. J Neurochem 75:1060‐1070.  Witting A, Chen L, Cudaback E, Straiker A, Walter L, Rickman B, Moller T, Brosnan C, Stella N  (2006)  Experimental  autoimmune  encephalomyelitis  disrupts  endocannabinoid‐ mediated neuroprotection. Proc Natl Acad Sci U S A 103:6362‐6367.  Wood  PL  (1995) Microglia  as  a  unique  cellular  target  in  the  treatment  of  stroke:  potential  neurotoxic mediators produced by activated microglia. Neurol Res 17:242‐248.  Wu DC,  Teismann  P,  Tieu  K, Vila M,  Jackson‐Lewis V,  Ischiropoulos H,  Przedborski  S  (2003)  NADPH  oxidase  mediates  oxidative  stress  in  the  1‐methyl‐4‐phenyl‐1,2,3,6‐ tetrahydropyridine model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 100:6145‐ 6150.  Yamada J, Hayashi Y, Jinno S, Wu Z, Inoue K, Kohsaka S, Nakanishi H (2008) Reduced synaptic  activity precedes synaptic stripping in vagal motoneurons after axotomy. Glia 56:1448‐ 1462.  Yamamoto M,  Yamazaki  S,  Uematsu  S,  Sato  S,  Hemmi  H,  Hoshino  K,  Kaisho  T,  Kuwata  H,  Takeuchi O,  Takeshige  K,  Saitoh  T,  Yamaoka  S,  Yamamoto N,  Yamamoto  S, Muta  T,  Takeda K, Akira S (2004) Regulation of Toll/IL‐1‐receptor‐mediated gene expression by  the inducible nuclear protein IkappaBzeta. Nature 430:218‐222.  Yao J, Harvath L, Gilbert DL, Colton CA (1990) Chemotaxis by a CNS macrophage, the microglia.  J Neurosci Res 27:36‐42.  78    Ye  H,  Arron  JR,  Lamothe  B,  Cirilli  M,  Kobayashi  T,  Shevde  NK,  Segal  D,  Dzivenu  OK,  Vologodskaia M, Yim M, Du K, Singh S, Pike JW, Darnay BG, Choi Y, Wu H (2002) Distinct  molecular mechanism for initiating TRAF6 signalling. Nature 418:443‐447.  Yrjanheikki  J, Tikka T, Keinanen R, Goldsteins G, Chan PH, Koistinaho  J  (1999) A  tetracycline  derivative,  minocycline,  reduces  inflammation  and  protects  against  focal  cerebral  ischemia with a wide therapeutic window. Proc Natl Acad Sci U S A 96:13496‐13500.  Yue X, Lu M, Lancaster T, Cao P, Honda S, Staufenbiel M, Harada N, Zhong Z, Shen Y, Li R (2005)  Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease  animal model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:19198‐19203.  Zautra  AJ,  Yocum  DC,  Villanueva  I,  Smith  B,  Davis MC,  Attrep  J,  Irwin M  (2004)  Immune  activation  and  depression  in women with  rheumatoid  arthritis.  J  Rheumatol  31:457‐ 463.  Zelcer N, Khanlou N, Clare R, Jiang Q, Reed‐Geaghan EG, Landreth GE, Vinters HV, Tontonoz P  (2007) Attenuation of neuroinflammation and Alzheimer's disease pathology by  liver x  receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 104:10601‐10606.  Zhang C, Shen JK, Lam TT, Zeng HY, Chiang SK, Yang F, Tso MO (2005) Activation of microglia  and chemokines in light‐induced retinal degeneration. Mol Vis 11:887‐895.  Zhang  P,  Hogan  EL,  Bhat  NR  (1998)  Activation  of  JNK/SAPK  in  primary  glial  cultures:  II.  Differential activation of kinase  isoforms  corresponds  to  their differential expression.  Neurochem Res 23:219‐225.  Zhao X, Grotta J, Gonzales N, Aronowski J (2009) Hematoma resolution as a therapeutic target:  the role of microglia/macrophages. Stroke 40:S92‐94.  Zierler S, Kerschbaum HH (2005) Blockade of chloride conductance antagonizes PMA‐induced  ramification in the murine microglial cell line, BV‐2. Brain Res 1039:162‐170.  Zilka N,  Ferencik M, Hulin  I  (2006) Neuroinflammation  in  Alzheimer's  disease:  protector  or  promoter? Bratisl Lek Listy 107:374‐383.  Zonta  M,  Carmignoto  G  (2002)  Calcium  oscillations  encoding  neuron‐to‐astrocyte  communication. J Physiol Paris 96:193‐198.                79    2. MICROGLIA  PROCESSES  BLOCK  THE  SPREAD  OF  DAMAGE  IN  THE  BRAIN AND REQUIRE FUNCTIONAL CHLORIDE CHANNELS1    2.1.  Introduction   Recent imaging studies in vivo and in brain slices have shown two new remarkable properties  of microglia; 1)  they are capable of extending processes  in  response  to acute damage  in  the  brain  and  2)  they  constantly  probe  the  surrounding  tissue  with  filopodia  during  sensing  (Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005). The  roles  for  receptors and  ion  channels  in  these two motile activities of microglia are still not fully understood.  ATP activation of P2Y12  receptors  has  been  shown  to  be  important  for  guiding  processes  in  response  to  damage  (Davalos et al., 2005). There are also several studies from cell culture that  indicate  important  roles  for  ion  channel activation  in  ramification, phagocytosis, proliferation, and migration of  microglia (Newell and Schlichter, 2005; Ducharme et al., 2007).  Cell culture has also been used  for the study of extending neuronal processes, such as growth cones, which have been shown  to  require  activity  of  specific  ion  channels  (Greka  et  al.,  2003),  and  changes  in  the  actin  cytoskeleton  (Nishiyama  et  al.,  2008).  However, microglia  processes  have  been  difficult  to  study  in  reduced preparations such as culture, due  to  their highly reactive nature.   Although  culture studies have elucidated several important pathways involved in microglia activation,  it  remains  unclear  if  the  rapid  process  outgrowth  in  native microglia  is  governed  by  similar  cellular mechanisms (Hanisch and Kettenmann, 2007).  Furthermore, the mechanisms of rapid  filopodia movement during sensing have not been investigated.                                                         1 A version of  this chapter has been accepted  for publication. Hines DJ, Hines RM, Mulligan S, & MacVicar BA.  (2009). Microglia processes block the spread of damage in the brain and require functional chloride channels. Glia.  80    In  numerous  cell  types,  chemokines  or  growth  factors,  (Rebenko‐Moll  et  al.,  2006)  trigger  directional movement  resulting  from  receptor  activated  signalling  cascades,  leading  to  the  formation of protrusions with branching actin filament networks at their  leading edges (Dent  and Gertler, 2003). The multitude of signals and the signalling pathways governing this process  in microglia are still unclear.  A recent report indicated that metabotropic purinergic receptor‐ mediated  activation  of  K+  channels  is  important  for  the  guidance  of  microglia  process  outgrowth  (Wu  et  al.,  2007).    However,  no  ion  channels  have  been  implicated  in  directly  mediating  process  outgrowth  or  filopodia  activity.  Microglia  express  chemokine  activated  chloride  (Cl‐)  channels  that  have  a  similar  pharmacology  to  volume  sensitive  Cl‐  channels   (Rappert et al., 2002).    In microglia  cell  culture,  volume  changes activate  these Cl‐  channels  which also play a role in phagocytosis in cell culture and cell migration (Ducharme et al., 2007).   Cl‐  channel  activation  is  critical  in  several  cell  types  for  allowing  the morphological  changes  necessary for movement through the extracellular space of intact tissue.  Based upon the roles  of  ion  channels  and  actin  in  cellular  morphological  changes  in  other  cell  types,  we  hypothesized  that  Cl‐  channels  and  actin  polymerization  are  critical  for  sensing  and  rapid  process  outgrowth  of microglia  in  intact  tissue.  Furthermore, we  propose  that  inhibition  of  these types of motility would provide a model in which to investigate the physiological roles of  microglia.    Here  we  show  that  both  sensing  and  rapid  process  outgrowth  require  actin  polymerization,  but  only  rapid  outgrowth  is  sensitive  to  Cl‐  channel  block.    Furthermore,  inhibition of process outgrowth and subsequent contact with damaged brain tissue results  in  significant lesion expansion, suggesting that microglia processes are critical for preventing the  expansion of damaged brain regions into surrounding tissue.    81    2.2.  Materials and Methods  2.2.1. Slice preparation and solutions  Brain  slices  were  obtained  as  described  previously  (Mulligan  and  MacVicar,  2004)  from  CX3CR1‐EGFP  (Jung et al., 2000)   transgenic mice   aged 21–40 days postnatal. Microglia cells  from these transgenic animals are reported to show similar properties to those from wildtype  mice and no observed differences have been reported between heterozygous and homozygous  strains of  the CX3CR1‐EGFP mice  (Jung et al., 2000; Nimmerjahn et al., 2005; Davalos et al.,  2005  )  .   Slices were  stored at  room  temperature  (20  to 23o C)  for 1h before  imaging  in an  oxygenated artificial  cerebrospinal  fluid  (aCSF) containing  (in mM): NaCl 126, KCl 2.5 or 4.2,  NaHCO3  26,  glucose  10, MgCl2  2,  NaH2PO4  1.25  and  CaCl2  2.    Slices were  transferred  to  a  recording chamber and perfused with oxygenated aCSF at a rate of 1–3 ml/min and maintained  at 25  ºC with an  inline heater  (Warner  Instruments).    In experiments  to  reduce external Cl‐  isethionic  acid  was  used  as  a  replacement.    Cl‐  channel  antagonists  NPPB  (40μM),  DIDS  (100μM), Tamoxifen (40μM) were first prepared  in stock DMSO solutions and were diluted  in  aCSF so that DMSO concentrations were < 0.1 %.  BaCl2 (2mM), 4‐AP (1mM), TEA (1mM) were  directly  added  to  aCSF.    Agents  were  perfused  onto  slices  for  at  least  30  min  before  experiments were initiated.   2.2.2. Two­photon imaging and laser micro­lesion  We performed imaging with a two‐photon laser‐scanning microscope (Zeiss LSM510‐Axioskop‐ 2  fitted with  a  40X‐W/0.80  numerical  aperture  objective  lens)  directly  coupled  to  a  10 W  Chameleon ultrafast  laser (Coherent Inc.).   EGFP and  lipofuscin, which have  large two‐photon  absorption cross‐sections, were typically excited at 820nm and epifluorescence was detected  82    with external detectors with 510‐nm  (40nm bandpass) and 605‐nm  (55 nm bandpass)  filters.   For acquiring  images,  laser  intensities were <25 mW exiting  the objective and  there was no  photobleaching or any evidence of cellular damage during extensive scanning  to obtain  time  lapse images.  In order to create discrete micro‐lesions using two‐photon excitation, a circular  region (5μm diameter) was illuminated briefly (total cumulative illumination time 110 msec at  10x  intensities  used  for  obtaining  images)  at  the  same  wavelength  as  used  for  obtaining  images.    The  laser  intensity was  carefully monitored  in  all  instances  and  kept  comparable  between all experiments.  Imaging was done at depths in brain slices > 50μm and up to 100μm.   The mean  depth  for  imaging  lesions was  75μm.    Z‐stacks were  taken  in  1.5μm  steps  and  covered a field of 64.5μm x 64.5μm.  The mean scan time for z‐stack was approximately 1 min  and 18 sec.  3D  reconstruction and calculations  for  lesion  size were performed using  Imaris 5.0  (Bitplane  AG, Zurich, Switzerland).  Images were thresholded for the background, and pixels with a value  equal to and less than the threshold, which were not associated with or within the lesion, were  omitted.    Lesion  volume was  calculated  using  the  total  number  of  voxels  in  the  lesion  and  converting this  into a geometric object.   This allowed  for the analytical processing of volume  without  any  loss  of  precision.    The  Gaussian  filter was  set  to  0.5μm  in  accordance  to  the  dimensions of the point spread function (PSF) of the microscope.     2.3.   Results  Our  initial  goals  were  to  investigate  and  contrast  the mechanisms  in microglia  underlying  process outgrowth  in response to damage versus filopodia surveillance of surrounding tissue.   83    Therefore we first examined the dynamic nature of microglia and their responses to trauma in  acutely prepared  brain slices to ensure that the responses of microglia in brain slices were the  same  as  reported  in  vivo  (Figure  2.1)  (Davalos  et  al.,  2005; Nimmerjahn  et  al.,  2005).    The  morphology of EGFP expressing microglia  (Jung et  al., 2000)  in  the  interior healthy parts of  brain  slices, which  can  be  observed  using  two  photon  laser  scanning microscopy,  had  the  appearance of normal resting microglia cells with ramified processes. Careful handling of acute  slices ensured that only cells at the surface (<10um) of the acute slice appeared to be affected  by  the  slicing process,  and  in  the depths  at which we  imaged neurons and  astrocytes were  healthy and microglia did not appear activated.    In addition, we observed extensive filopodia  extension and retraction, indicating that active surveillance or sensing by microglia filopodia of  the surrounding tissue occurs in brain slices as shown in vivo (Figure 2.1a) (Nimmerjahn et al.,  2005).    We  induced highly circumscribed  lesions  in  the dendritic  zone of CA1 by brief high  intensity  two  photon  laser  illumination  within  a  small  region  of  tissue  as  in  previous  studies  (Nimmerjahn et al., 2005). Surprisingly we found that the lesioned region was easily detected  by  observing  an  autofluorescent  component,  which  represents  lipofuscin  created  by  the  breakdown  of membranes  and  peroxidation  of  lipids  (Harman,  1989;  Eichhoff  et  al.,  2008).   Lipofuscin  has  a  broad  fluorescence  emission  spectrum  from  460  to  630  nm  (Seehafer  and  Pearce, 2006)  therefore when simultaneously acquiring EGFP  fluorescence at 510  to 550 nm  and  lipofuscin   fluorescence  at  610  to  640nm  we  could  separate  the  microglia   processes        84              Figure 2.1. Distinct microglia activities of sensing, and process outgrowth in response to laser  microlesion. A. Time series showing the rapid extensions and retractions of microglia filopodia  observed  during  sensing  of  the  microenvironment  in  live  hippocampal  slices.  Red  arrows  denote filopodia that retract, while green arrows denote filopodia that extend. B. Time series  showing progressive extension of microglia processes (green) toward laser lesion (orange from  overlay  of  green  and  red).    Left  panel  is  control  image  of microglia  before  lesion, with  the  middle panel showing the lesion (orange circular region in center). Processes growing out from  the surrounding microglia are obvious at 4 min (center panel). At 12 min the first processes of  the  converging  growth  cones  are  reaching  the  lesion  (right  panel).    Top  right  panel  shows  zoomed overlay of microglia endfeet (green) and  laser  lesion at 19 min post  lesion  induction.   The  lesion  appears  yellow  because  of  the  broad  fluorescence  emission  of  lipofuscin  like  degradation products  in green and red channels.   Bottom right panel shows an  image of the  lesion alone detected by fluorescence emission at the 610 to 640 nm range.           85                          86    (detected in the green spectrum) from lipofuscin in the lesion (detected in both the green and  red spectra; Figure 2.1b).   The response of microglia to damage was  immediate and  initiation  of outgrowing processes was evident within seconds.    We  also  observed  a  previously  unreported  interplay  between  the  filopodia  extensions  of  sensing  and  the  process  outgrowth  in  response  to  damage.    Triggering  damage  caused  formation of microglia cell polarity within seconds, whereby the membrane area closest to the  damage showed robust process outgrowth and opposite to the lesion microglia extensions and  filopodia were retracted (Figure 2.2a‐d).  After the microglia growth cones reached the lesion,  cell polarity was  lost and microglia  filopodia were again observed  in  the membrane  regions  opposite the lesion.  Therefore the process outgrowth in response to damage is also associated  with  inhibition  of  filopodia  sensing  in  regions  of  the  cell  opposite  to  where  the  process  extension originates.  This inhibition is lost when the processes reach the lesioned tissue.    Another  characteristic pattern was  that  the  growth  cone‐like processes of  several microglia  often arrived concurrently at the lesion.  Using rapid time‐lapse microscopy, we observed that  growth cones from different processes or from different cells would grow together to converge  on a lesion.  Normally processes from microglia immediately retract when they encounter the  process from another microglia cell (Figure 2.2e).  In contrast, the growing tips of the processes  showed a pattern of cooperation  that was apparently only  selective between growth cones.   This  creates  a  sphere  of  growing  tips  where  the  primary  growth  cones  from  numerous  microglia cells simultaneously converge onto and engulf  the  lesion  (Figure 2.2a).   This highly  organized  process  was facilitated by the  inhibition of  trailing processes through contact with      87                  Figure 2.2. Microglia process outgrowth involves a loss of sensing filopodia, polarization and  competition between processes. A. Two photon  images of progression of microglia process  outgrowth including cell polarity, process extension, lesion engulfment, and process retraction  and  inhibition over 30 min.   The resting microglia  is shown  in the first panel.   The changes  in  fluorescence  intensity  in  the  different  coloured  rectangles  from  microglia  process  growth  through those regions are plotted in B. C. High magnification of the process retraction opposite  the  lesion  in  the  region  indicated  by  the  dotted white  rectangle.    This  region  on  the  side  opposite the lesion showed a retraction of processes and a decrease in EGFP fluorescence (red  rectangle plotted  in D).   This decrease  in EGFP fluorescence and process retraction continued  until  the  processes  reached  the  lesion  (black  dot  in  B  and D).    At  that  time,  filopodia  and  sensing on the side opposite the lesion was restored, as indicated by the progressive increase  in EGFP  fluorescence  in  this  region. E. Time series of  images demonstrating  the  inhibition of  trailing  microglia  growth  cones  by  the  converging  growth  cone  wave.    Initially  a  growing  process  is observed  (green arrows)  that  retracts  (red arrows) after  it  touches a  filamentous  extension.  Inhibition did not occur when growth cones contacted each other.        88                            89    any other regions of leading microglia processes (Figure 2.2e).   We  investigated  the  roles  for Cl‐ and K+ channels known  to be expressed  in microglia  (Eder,  2005), in the rapid changes in response to damage.  Microglia cells have Cl‐ channels that can  be  activated  by  volume  changes, by membrane  stretching,  and  by  chemokines  (Eder  et  al.,  1998; Rappert et al., 2002; Eder, 2005; Fordyce et al., 2005; Newell and Schlichter, 2005).    In  cell culture, Cl‐ channels are necessary for microglia ramification (Rappert et al., 2002), which  might  use  similar  cellular  mechanisms  as  injury  induced  process  outgrowth.    Movement  through  the narrow  extracellular  space by other  cells,  such  as  gliomas,  requires Cl‐  channel  activation because Cl‐  fluxes are necessary  for  cells  to  rapidly  change  shape  (Ransom et al.,  2001; Kimelberg  et  al., 2006).    In  addition,  chemotaxis of microglia  in  cell  culture has been  shown to require activation of stretch and volume activated Cl‐ channels (Rappert et al., 2002;  Zierler and Kerschbaum, 2005) and ATP has been shown to contribute to activation of these Cl‐   channels (Darby et al., 2003).  We therefore tested the involvement of Cl‐ channels in process  outgrowth by applying Cl‐ channel inhibitors at concentrations that have been demonstrated to  be effective on volume activated Cl‐ channels (Kimelberg et al., 2006).  Our data illustrated that  tamoxifen  (40μM) blocks  the ability of microglia  cells  to extend processes  to  the  site of  the  lesion (Figure 2.3). The  inhibition of process outgrowth by tamoxifen was reversible, because  upon washout microglia cells in the same brain slices extended processes in response to a new  lesion  (Figure 2.3b).   This  indicates  that  tamoxifen only caused a  transient  inhibition and did  not  reduce microglia  viability.     We  tested  the  actions  of NPPB  (40μM)  and DIDS  (100μM),  which also are potent blockers of volume activated Cl‐ channels  (Rappert et al., 2002; Eder,  2005; Newell and Schlichter, 2005; Zierler and Kerschbaum, 2005) and  found  that, similar  to  tamoxifen, they completely blocked the extension of processes in response to damage (Figure   90                                      Figure 2.3. The chloride channel blocker  tamoxifen  inhibits microglia process outgrowth  in  response to  laser microlesions. A. Two panels at t=0 and 30 min  in tamoxifen  (Tam, 40 uM)  showing that  inhibiting microglia Cl‐ channels completely blocked the outgrowth of processes  from microglia  in  response  to damage.   The  lesion  is  the  circular  fluorescence  region  in  the  lower  left  in both A and B.   B.  In  the same brain slice after wash‐out of  tamoxifen microglia  processes were now observed to grow in response to new lesion formation.       91                    92    2.4b,e).   Removing external Cl‐ prevented process outgrowth consistent with the primary role  for Cl‐ fluxes in morphological changes or process outgrowth.  Picrotoxin (100μM), an inhibitor  of ligand gated Cl‐ channels which are expressed on neurons (Macdonald and Olsen, 1994) and  astrocytes (Fraser et al., 1995) had no effect on microglia process outgrowth (Figure 2.4e).  In  contrast to the results obtained with Cl‐ channel antagonists,  inhibiting microglia K+ channels  with selective K+ channel antagonists did not block process outgrowth.  We tested 4‐AP (1mM)  and TEA (1mM), which block the voltage gated K+ channels, and BaCl2 (2mM), which blocks the  inward rectifier K+ channels (Eder, 2005; Fordyce et al., 2005).  Process outgrowth still occurred  in response to lesions with these blockers applied (Figure 2.4d,e).  We also found no reduction  of  microglia  process  outgrowth  after  blocking  synaptic  transmission  with  the  glutamate  receptor  antagonist  CNQX  (20μM),  or  after  blocking  action  potentials  with  tetrodotoxin  (23μM) (Figure 2.4e).    In  a  number  of  different  cell  types,  the  actin  cytoskeleton  has  been  shown  to  play  a  fundamental role  in mediating both cell motility and morphological changes (Heidemann and  Buxbaum, 1998).   The actin cytoskeleton has also been shown  to be necessary  for microglia  morphology changes  in response to other stimuli (Klee et al., 1998;  Imai and Kohsaka, 2002).   Cell motility and morphological changes are powered by coordinating actin network mediated  extensions and contractions via polymerization and depolymerization processes.   We  examined whether  process  outgrowth  in  response  to  lesion  requires  actin  cytoskeleton  remodelling.    In order  to block actin polymerization we bath applied either cytochalasin‐B, a  drug  that  reversibly  blocks  filament  assembly  by  binding  to  the  barbed  ends  of  filaments,  indirectly  inducing  their  depolymerization,  or  latrunculin  B,  which  acts  by  binding  g  actin  monomers   and   preventing   the   incorporation   into   f‐actin   and  thereby  preventing  actin   93                  Figure 2.4. Blocking actin polymerization or Cl‐ channels inhibits microglia process outgrowth  in response to laser micro‐lesions.   Upper panels (A to D) show representative  images of the  extent of process outgrowth in the presence of different pharmacological antagonists after 30  min.   A.   In control conditions numerous processes were observed to converge on the  lesion.   B.  In  the  presence  of  a  Cl‐  channel  antagonist  (DIDS  100  uM)  no  process  outgrowth  was  observed at 20 min.  C. When slices were treated with cytochalasin B (20 uM) microglia process  outgrowth was also observed to be  inhibited. D.  In the K+ channel blocker TEA (5mM) robust  process outgrowth was observed,  similar  to  control  conditions.   E. Quantification of process  outgrowth  in μm per minute  in response to  laser micro‐lesions with various pharmacological  applications.  Each of the Cl‐ channel antagonists that are known to block microglia Cl‐ channels  blocked process outgrowth, whereas the  ligand gated Cl‐ channel blocker, picrotoxin, had no  effect.   Agents blocking actin polymerization,  including cytochalasin B and  latrunculin B, were  effective at inhibiting process outgrowth. In contrast, each of the K+ channel antagonists alone  had no effect.  TTX, which blocks Na+ dependent action potentials in neurons and CNQX, which  blocks AMPA/kainate receptors and synaptic transmission, had no effect on microglia process  outgrowth.         94            95    polymerization  (Bear  et  al., 2002; Witteck  et  al., 2003).    The  actin polymerization  inhibitors  cytochalasin‐B (20um) or Latrunculin B (4um) were bath applied, and the process outgrowth of  microglia was monitored after  inducing a  laser  lesion.   Cytochalasin blocked the retraction or  polarization, and completely prevented process outgrowth  in  response  to  the  induced  lesion  (Figure 2.4c,e).  Similarly, bath application of latrunculin also completely inhibited polarization  and process outgrowth following lesion induction.   We examined  the effects of  the Cl‐ channel blocker  tamoxifen on  the  spontaneous  filopodia  extensions and  retractions  that are  indicative of  the sensing of microglia.    In contrast  to  the  complete inhibition of process outgrowth after lesioning as described above, tamoxifen did not  alter  filopodia  extensions  and  retractions  (Figure  2.5a,b,d).    Sensing  by  filopodia  continued  unabated.    Filopodia  movements  are  reported  to  rely  upon  actin  filament  dynamics  in  numerous cell types.  We tested cytochalasin‐B and found that filopodia movement was totally  blocked (Figure 2.5c,d).   This was similar to the inhibition of process outgrowth that was also  blocked by cytochalasin‐B.  Next we examined whether  the  lesion volume changed with  time and whether blocking  the  rapid extension of microglia processes had an  impact on  the progressive changes  in  induced  lesion size.  Lesion volume was measured by creating 3‐dimensional reconstructions of z‐stacks  taken immediately after creating the lesion and again after 30 min.  In control slices, microglia  processes reached the  lesion by 10 min and surrounded and contained the  lesion by 20 min.   After 30 min the lesion volume was reduced by about 37% (n=5; Figure 2.6a,b,f).  In contrast, in  the presence of the Cl‐ channel inhibitor tamoxifen (40 µM), microglia processes did not reach  the  lesion,  and  the  lesion  increased  in  volume by 365%  at 30 min  (n=5;  Figure 2.6c,f).   We  controlled for  the  effect of  tamoxifen itself by  perfusing  tamoxifen  onto  the tissue after the   96                      Figure 2.5. Blockers of cytoskeletal dynamics block sensing activity in microglia, whereas Cl‐  channel  blockers  do  not.  A.  Time  series  showing  the  dynamic  extension  and  retraction  of  microglia  filopodia during sensing under control conditions. B. Application of  the Cl‐ channel  blocker  tamoxifen  does  not  inhibit  sensing.  In  contrast  to  the  striking  effect  of  blocking  Cl‐  channels  on  process  outgrowth, microglia  fiolopdia  are  still observed  to  rapidly  extend  and  retract in the presence of tamoxifen. C. When cytochalasin B is applied, sensing is completely  inhibited,  and microglia  filopodia  neither  extend  nor  retract.  D.  Quantification  of  filopodia  motility in m per minute under control, tamoxifen and cytochalasin B conditions.      97              98                    Figure 2.6. Lesion expansion into surrounding tissue only occurred when microglia processes  were  inhibited  from  reaching  lesions.  A.  Under  control  conditions,  microglia  process  outgrowth prevented spread of the  lesion and reduced  lesion volume by 40% at 30 min.   The  top panels  (t=0)  shows  the  initial  lesion  formation  (overlay of  green  and  red  channels)  and  extension of processes surrounding and partially obscuring the lesion (t=30 min).  B.  The lesion  in isolation was visualized in the red channel and reconstructed in 3D  to observe the volume  of the  lesion without being obscured by microglia processes.   In control conditions, the  initial  lesion  (B  left  panel) was  observed  to  shrink  by  30 min  (B  right  panel).    C. When  process  outgrowth was blocked by tamoxifen, the lesion grew by 30 min to a much larger volume (right  panel).    D.  When  latrunculin  B  is  used  to  block  actin  polymerization  lesion  volume  was  observed  to grow at 30 min.   E. Similarly, when  surrounding microglia were ablated and no  processes  reached  the  lesion,  the  lesion  gradually  grew  and  after  30 min  had  dramatically  expanded.  F. Percent change in lesion volume between t=0 and 30 min in control, tamoxifen,  tamoxifen wash‐in, latrunculin B, and microglia ablation conditions.  The initial lesion volumes  were identical, and in control the lesion volume shrank by approximately 37% when microglia  processes  were  allowed  to  reach  the  lesion.    However  in  tamoxifen,  the  lesion  volume  expanded  significantly by 365%  (*, p<0.05).  The  lesion  growth  in  tamoxifen was not due  to  tamoxifen  itself  because  if we  applied  tamoxifen  after  the microglia  processes  reached  the  lesion at 10 min  (Tam W/I) the  lesion growth did not occur. Comparable to blocking process  outgrowth via tamoxifen, latrunculin B also resulted in an increase in lesion volume by 441% at  30 min  (*, p<0.05). Similarly, microglia ablation blocked process outgrowth and resulted  in a  significant 272% increase in lesion volume (*, p<0.05).        99                100    processes  had  extended  toward  the  lesion.   When  tamoxifen  was  perfused  after  process  extension  (approximately 10 min post‐lesion),  the  lesion did not grow  in  size  indicating  that  tamoxifen  itself  did  not  affect  lesion  growth  (Figure  2.6f)  and  that  the  newly  sprouted  microglia  processes  prevent  lesion  growth.    Since  process  outgrowth  was  also  blocked  by  agents that interfere with actin polymerization, we also tested the impact of Latrunculin B on  lesion volume.   Thirty minutes following  lesion  induction  in the presence of Latrunculin B, no  process outgrowth was observed, and the lesion volume was found to increase by 441% (n=5;  Figure 2.6d,f).  We  tested  the ability of microglia processes  to  reduce  lesion volume using another  strategy  not  involving pharmacological  inhibition of Cl‐ channels or actin dynamics.    In  this approach,  microglia within a  large region of a brain slice were themselves ablated by searching through  the  tissue  and  illuminating  each  microglia  soma  with  discrete  laser  pulses.    Microglia  at  different depths surrounding the planned  lesion site were ablated  in a serial pattern, starting  distal to the area and finishing with the central most microglia.  The serial pattern of ablation  ensured  that microglia  processes would  not  invade  the  planned  lesion  site  prior  to  lesion  induction.    Subsequently  a  lesion  was  created  as  described  above  in  the  area  devoid  of  microglia.    If  the  inactivation  of microglia was  successful  and  no microglia  processes were  observed  to  reach  the  area  of  damage,  the  lesion  volume  grew  272%  (n=5;  Figure  2.6e,f),  suggesting that microglia process outgrowth is critical for lesion containment.    101    2.4.   Discussion  The results  in this study provide  important evidence that microglia act to  limit the spread of  damage  from  an  acute  lesion.    Microglia  process  outgrowth  in  response  to  damage  is  remarkably rapid and highly organized involving cell polarity, process extension, engulfment of  the lesion, and process retraction and inhibition The process outgrowth observed in microglia  is strikingly rapid (2μm/min), particularly in comparison with the responses of other major cell  types  of  the  CNS  to  a  variety  of  stimuli,  including  neurons  (0.012μm/min;  (De  Paola  et  al.,  2006))  and  astrocytes  (0.5  μm/min  (Hirrlinger  et  al.,  2004)).    ATP  is  a  guide  for  this  rapid  response (Davalos et al., 2005; Haynes et al., 2006) but there are numerous chemokines and  other signalling factors that could also play a role (Minghetti, 2005).   Additionally, these studies provide a detailed description of sensing activities of microglia, the  mechanisms of which have not been examined.   The present experiments reveal that sensing  and  process  outgrowth  appear  to  be  exclusive  processes  as  filopodia  sensing  ceases when  microglia initiate process outgrowth in response to the lesion.  This demonstrates that sensing  and process outgrowth are distinct, but interrelated activities of microglia cells. A commonality  shared between sensing and process outgrowth is the inhibition observed between processes  of adjacent cells. When  the  filopodia contact one another  they are observed  to  immediately  retract.  Similarly,  when  process  outgrowth  occurs  in  response  to  damage,  processes  are  inhibited and  retract when  they contact any parts of other microglia except  for  the growing  tips.  The  present  experiments  also  reveal  that  both  sensing  and  process  outgrowth  require  cytoskeletal  rearrangement,  but  differ  in  other  aspects  of  their  regulation.  Dynamic  102    rearrangement of  the actin  cytoskeleton  is  crucial  for  the  functioning of most  immune  cells  (Lambrechts  et  al.,  2004).   Upon  activation,  immune  cells  polarize  their membranes  in  the  direction of the immune stimuli.  In the lesion assay, microglia cells show a similar polarization,  whereby  the  opposite  side  of  the  cell  retracts  its  filopodia.    Long  parallel  bundles  of  actin  filaments act as sensors at the leading edge of the cell’s membrane and guide the movement  of immune cells towards immune stressors (Ridley et al., 2003).    A distinct difference between sensing and process outgrowth is Cl‐ channel activity. In contrast  to process outgrowth, Cl‐ channels do not seem to be critical  for sensing, as the blockers  for  these channels did not disturb microglia sensing. The rapid process outgrowth in microglia may  require Cl‐ channels to allow the volume changes necessary for processes to squeeze through  the narrow extracellular space.   The effectiveness of antagonists against volume sensitive Cl‐  channels (tamoxifen, NPPB, DIDS) indicate that this type of Cl‐ channel, previously described to  be expressed in microglia, is involved in regulating process outgrowth (Eder, 2005; Newell and  Schlichter,  2005).    Cl‐  channels  in  other  glial  cells  have  been  shown  to  be  associated with  cytoskeletal remodeling, cell morphology and cell motility (Lascola and Kraig, 1996; Lascola et  al.,  1998).    Also,  specific  chemokines  have  been  shown  to  regulate  volume  activated  Cl‐  channels  in epithelial cells  (Chu et al., 2004).    In comparison, antagonists against K+ channels  that are expressed  in microglia,  including the  inward rectifier  (Ba2+) and calcium activated K+  channels (TEA)(Eder, 2005; Fordyce et al., 2005), did not block process outgrowth.  Immune cells are capable of both sensing and sending out processes to the sites of damage.   These data show that microglia functions of process outgrowth and sensing are resistant to the  excitotoxic  effects  of  damage,  and  in  fact  microglia  processes  growinto  regions  of  brain  103    damage serving to protect surrounding cells.   When microglia processes surround the  lesion,  they may act to contain damage via uptake of harmful factors released from damaged tissues.    The autoflourescence detected at  the  lesion  site  is  lipofuscin,  resulting  from peroxidation of  unsaturated  fatty acids, and may reflect membrane damage, or rupture of mitochondria and  lysosomes(Eichoff et al., 2008)  .   Contents of the  lesion were also  likely to contain denatured  proteins, DNA, and other non fluorescent cellular metabolites(Harmin, 1989).   The  imaging of  lipofuscin  in these experiments afforded a valuable means of assessing the extent of damage  resulting  from  the  lesion assay.   By measuring  the volume of  the autoflourescent  lesion we  were able to determine that when microglia process outgrowth was prevented, the extent of  damage was dramatically  increased. Conversely, when process outgrowth reached the  lesion  site, the autofluorescent volume representing the extent of damage decreased dramatically.   Of particular interest, lipofuscin is a key marker for advanced stages of macular degeneration,  and abnormal accumulation of  lipofuscin  is  implicated  in central nervous system pathologies  such as Alzheimer disease, Parkinson disease, and  the group of neurodegenerative disorders  called  lipofuscinoses which  includes Batten disease  (Palmer et al., 1992; Starita et al., 1995).  The  accumulation of  lipofuscin‐like material  in  some of  these disorders  is  thought  to  result  from  an  imbalance  between  formation  and  disposal mechanisms.  Experimental models  of  lipofuscin  accumulation  are  induced  via  administration  of  protease  inhibitors,  and  these  accumulations are observed to recover after a period of three months  following cessation of  treatment  (Koike  et  al.,  2000),  indicating  the  action  of  a  disposal mechanism.  The  present  experiments  suggest  a  microglia  based  mechanism  for  the  containment  and  clearance  of  lipofuscin under healthy conditions.  104    In conclusion we demonstrate that the rapid response of microglia cells to damage requires Cl‐  channel  activity.    Further we  characterized  the  dynamic  function  of microglia  in  live  tissue,  including rapid sensing of the environment, and polarization occurring in concert with process  outgrowth  toward  sites  of  damage.    It  is  clear  that  both  sensing  (6  µm/min)  and  process  outgrowth (2 µm/min) are extremely rapid and dynamic processes in the nervous system that  are  unique  to  microglia.    We  also  provide  evidence  to  suggest  that  sensing  and  process  outgrowth  are  part  of  a  continuum  of  microglia  function,  but  are  regulated  by  separate  mechanisms. Understanding  the mechanisms of microglia  function will provide  insights  into  the role of these unique cells under normal and pathological conditions.     It  is clear however,  that the first line of defence in the brain is provided by the rapid response of microglia cells.        105    2.5.   References  Bear JE, Svitkina TM, Krause M, Schafer DA, Loureiro JJ, Strasser GA, Maly IV, Chaga OY, Cooper  JA,  Borisy  GG,  Gertler  FB  (2002)  Antagonism  between  Ena/VASP  proteins  and  actin  filament capping regulates fibroblast motility. Cell 109:509‐521.  Chu  S,  Blaisdell  CJ,  Bamford  P,  Ferro  TJ  (2004)  Interferon‐gamma  regulates  ClC‐2  chloride  channel in lung epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 324:31‐39.  Darby  M,  Kuzmiski  JB,  Panenka  W,  Feighan  D,  MacVicar  BA  (2003)  ATP  released  from  astrocytes during swelling activates chloride channels. J Neurophysiol 89:1870‐1877.  Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y, Jung S, Littman DR, Dustin ML, Gan WB (2005)  ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci 8:752‐ 758.  De Paola V, Holtmaat A, Knott G, Song S, Wilbrecht L, Caroni P, Svoboda K  (2006) Cell  type‐ specific  structural  plasticity  of  axonal  branches  and  boutons  in  the  adult  neocortex.  Neuron 49:861‐875.  Dent EW, Gertler FB  (2003) Cytoskeletal dynamics and transport  in growth cone motility and  axon guidance. Neuron 40:209‐227.  Ducharme  G,  Newell  EW,  Pinto  C,  Schlichter  LC  (2007)  Small‐conductance  Cl‐  channels  contribute to volume regulation and phagocytosis in microglia. Eur J Neurosci 26:2119‐ 2130.  Eder C (2005) Regulation of microglial behavior by ion channel activity. J Neurosci Res 81:314‐ 321.  Eder  C,  Klee  R,  Heinemann  U  (1998)  Involvement  of  stretch‐activated  Cl‐  channels  in  ramification of murine microglia. J Neurosci 18:7127‐7137.  Eichhoff G, Busche MA, Garaschuk O (2008) In vivo calcium imaging of the aging and diseased  brain. Eur J Nucl Med Mol Imaging 35 Suppl 1:S99‐106.  Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, Schlichter LC (2005) Microglia Kv1.3 channels contribute to their  ability to kill neurons. J Neurosci 25:7139‐7149.  Fraser  DD,  Duffy  S,  Angelides  KJ,  Perez‐Velazquez  JL,  Kettenmann  H,  MacVicar  BA  (1995)  GABAA/benzodiazepine  receptors  in  acutely  isolated  hippocampal  astrocytes.  J  Neurosci 15:2720‐2732.  Greka  A,  Navarro  B,  Oancea  E,  Duggan  A,  Clapham  DE  (2003)  TRPC5  is  a  regulator  of  hippocampal neurite length and growth cone morphology. Nat Neurosci 6:837‐845.  Hanisch UK, Kettenmann H  (2007) Microglia: active  sensor and versatile effector cells  in  the  normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10:1387‐1394.  Harman D (1989) Lipofuscin and ceroid formation: the cellular recycling system. Adv Exp Med  Biol 266:3‐15.  Haynes SE, Hollopeter G, Yang G, Kurpius D, Dailey ME, Gan WB, Julius D (2006) The P2Y(12)  receptor  regulates  microglial  activation  by  extracellular  nucleotides.  Nat  Neurosci  9:1512‐1519.  Heidemann SR, Buxbaum RE (1998) Cell crawling: first the motor, now the transmission. J Cell  Biol 141:1‐4.  Hirrlinger J, Hulsmann S, Kirchhoff F (2004) Astroglial processes show spontaneous motility at  active synaptic terminals in situ. Eur J Neurosci 20:2235‐2239.  Imai Y, Kohsaka S  (2002)  Intracellular signaling  in M‐CSF‐induced microglia activation: role of  Iba1. Glia 40:164‐174.  106    Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR (2000) Analysis  of  fractalkine  receptor CX(3)CR1  function by  targeted deletion and green  fluorescent  protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20:4106‐4114.  Kimelberg HK, Macvicar  BA,  Sontheimer H  (2006)  Anion  channels  in  astrocytes:  Biophysics,  pharmacology, and function. Glia 54:747‐757.  Klee R, Heinemann U, Eder C (1998) Changes in proton currents in murine microglia induced by  cytoskeletal disruptive agents. Neurosci Lett 247:191‐194.  Koike M, Nakanishi H, Saftig P, Ezaki J, Isahara K, Ohsawa Y, Schulz‐Schaeffer W, Watanabe T,  Waguri S, Kametaka S, Shibata M, Yamamoto K, Kominami E, Peters C, von Figura K,  Uchiyama  Y  (2000)  Cathepsin  D  deficiency  induces  lysosomal  storage  with  ceroid  lipofuscin in mouse CNS neurons. J Neurosci 20:6898‐6906.  Lambrechts A, Van Troys M, Ampe C (2004) The actin cytoskeleton in normal and pathological  cell motility. Int J Biochem Cell Biol 36:1890‐1909.  Lascola CD, Kraig RP (1996) Whole‐cell chloride currents  in rat astrocytes accompany changes  in cell morphology. J Neurosci 16:2532‐2545.  Lascola  CD, Nelson DJ,  Kraig  RP  (1998)  Cytoskeletal  actin  gates  a  Cl‐  channel  in  neocortical  astrocytes. J Neurosci 18:1679‐1692.  Macdonald RL, Olsen RW (1994) GABAA receptor channels. Annu Rev Neurosci 17:569‐602.  Minghetti  L  (2005)  Role  of  inflammation  in  neurodegenerative  diseases.  Curr  Opin  Neurol  18:315‐321.  Mulligan SJ, MacVicar BA (2004) Calcium transients in astrocyte endfeet cause cerebrovascular  constrictions. Nature 431:195‐199.  Newell EW, Schlichter LC  (2005)  Integration of K+ and Cl‐ currents  regulate steady‐state and  dynamic membrane potentials in cultured rat microglia. J Physiol 567:869‐890.  Nimmerjahn  A,  Kirchhoff  F,  Helmchen  F  (2005)  Resting microglial  cells  are  highly  dynamic  surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308:1314‐1318.  Nishiyama M,  von  Schimmelmann MJ,  Togashi  K,  Findley WM,  Hong  K  (2008) Membrane  potential  shifts  caused by diffusible guidance  signals direct growth‐cone  turning. Nat  Neurosci 11:762‐771.  Palmer DN, Fearnley IM, Walker JE, Hall NA, Lake BD, Wolfe LS, Haltia M, Martinus RD, Jolly RD  (1992)  Mitochondrial  ATP  synthase  subunit  c  storage  in  the  ceroid‐lipofuscinoses  (Batten disease). Am J Med Genet 42:561‐567.  Ransom CB, O'Neal JT, Sontheimer H (2001) Volume‐activated chloride currents contribute to  the  resting  conductance  and  invasive  migration  of  human  glioma  cells.  J  Neurosci  21:7674‐7683.  Rappert  A,  Biber  K, Nolte  C,  Lipp M,  Schubel  A,  Lu  B, Gerard NP, Gerard  C,  Boddeke HW,  Kettenmann H (2002) Secondary lymphoid tissue chemokine (CCL21) activates CXCR3 to  trigger a Cl‐ current and chemotaxis in murine microglia. J Immunol 168:3221‐3226.  Rebenko‐Moll NM, Liu L, Cardona A, Ransohoff RM (2006) Chemokines, mononuclear cells and  the nervous system: heaven (or hell) is in the details. Curr Opin Immunol 18:683‐689.  Seehafer  SS,  Pearce  DA  (2006)  You  say  lipofuscin, we  say  ceroid:  defining  autofluorescent  storage material. Neurobiol Aging 27:576‐588.  Starita  C,  Hussain  AA,  Marshall  J  (1995)  Decreasing  hydraulic  conductivity  of  Bruch's  membrane:  relevance  to photoreceptor  survival and  lipofuscinoses. Am  J Med Genet  57:235‐237.  107    Witteck A, Yao Y, Fechir M, Forstermann U, Kleinert H (2003) Rho protein‐mediated changes in  the  structure  of  the  actin  cytoskeleton  regulate  human  inducible NO  synthase  gene  expression. Exp Cell Res 287:106‐115.  Wu LJ, Vadakkan KI, Zhuo M  (2007) ATP‐induced chemotaxis of microglial processes requires  P2Y receptor‐activated initiation of outward potassium currents. Glia 55:810‐821.  Zierler S, Kerschbaum HH (2005) Blockade of chloride conductance antagonizes PMA‐induced  ramification in the murine microglial cell line, BV‐2. Brain Res 1039:162‐170.          108    3. PREVENTION OF  LPS­INDUCED MICROGLIA ACTIVATION,  CYTOKINE  PRODUCTION  AND  SICKNESS  BEHAVIOR  WITH  TLR4  RECEPTOR  INTERFERING PEPTIDES2       3.1. Introduction   The Toll‐like receptor 4 (TLR4) and its potent ligand lipopolysaccharide (LPS), represent one of  the first and best characterized ligand and receptor combinations in the innate immune system  (Chakravarty and Herkenham, 2005; Doyle and O'Neill, 2006). Systemic  LPS acts on  the CNS  through several parallel pathways (reviewed  in Dantzer et al, 2007)  including; 1) activation of  TLR4  on microglia  in  regions  where  the  blood  brain  barrier  (BBB)  is  permeable  (e.g.  area  postrema  and  circumventricular  organ  (CVO)  (Laflamme  and  Rivest,  2001)  2)  activation  of  perivascular cells and endothelial cells of blood vessels in the brain (Gosselin and Rivest, 2008);  3)  stimulation  of  the  afferent  vagal  nerves  and  4)  transport  across  the  BBB  of  cytokines  generated by peripheral cells (Banks, 2006).   TLR4 activation has also been  linked to sickness  behavior  and  neurodegenerative  pathologies  in  several  CNS  diseases  (Caso  et  al.,  2007;  Lehnardt  et  al.,  2008) which  could  be  better  understood  by  the  development  of  effective  inhibitors against TLR4 activation. The   profound changes which constitute sickness behavior   include loss of motivation for food and drink, diminished social interaction, fatigue, irritability,  depression and cognitive impairment (Hart, 1988).  Sickness behavior is thought to result from  cytokine secretion following   activation of TLR4 receptors on microglia  in perivascular regions  and in brain regions where the BBB is highly permeable, as well as TLR4 activation in peripheral  cells  (Perry  et  al.,  2003).    Although  sickness  behavior  is  a  normal  acute  response  to                                                         2 A version of this chapter will be submitted for publication. Hines DJ, Choi HB, Hines RM, Phillips AG, MacVicar  BA. Prevention of LPS‐induced microglia activation, cytokine production and sickness behavior with TLR4 receptor  interfering peptides.  109    inflammation,  abnormal  or  prolonged  inflammation  and  cytokine  release  can  contribute  to  depressive  disorders  and  CNS  dysfunction  (Perry,  2004;  Kettenmann,  2007;  Dantzer  et  al.,  2008).     3.2.    Materials and Methods  3.2.1. Peptide Design  The generated peptides (Anaspec, San Jose, CA.) were based on epta peptides (Loiarro et al.,  2005) with sequences mimicking the BB‐loop of TLR4 and MyD88 TIR domains, preceded by a  truncated Tat sequence (Mann, et al., 1991).  Sequences for the peptides are as follows:  Tat‐TLR4: YGRKKRRQRRR‐RDFIPGV  Tat‐MyD88: YGRKKRRQRRR‐RDVLPGT   Tat‐Scram: YGRKKRRQRRR‐PTDLVRG                  3.2.2. LPS and Peptide Administration  LPS was dissolved in saline at a concentration of 40 μg/mL and either injected intraperitoneally  for in vivo experiments, or bath applied for experiments conducted in slice. Both the Tat‐TLR4  and Tat‐MyD88 peptides were dissolved  in saline  to a concentration of 20 μg/mL, and again  were either bath applied or  injected depending upon  the experiment.  In experiments where  both LPS and peptide treatments were used, peptide injection preceded LPS by 30 min.  110      3.2.3. Slice Preparation and Solutions  Brain slices were obtained as described previously  (Mulligan et al., 2004)  from CX3CR1‐EGFP  (Jung  et  al.,  2000)  transgenic mice  aged  21–40  days  postnatal.  Slices were  stored  at  room  temperature (20 to 23o C) for 1 hr before imaging in an oxygenated artificial cerebrospinal fluid  (aCSF) containing  (in mM):NaCl 126, KCl 2.5 or 4.2,NaHCO3 26, glucose 10, MgCl2 2,NaH2PO4  1.25  and  CaCl2  2.  Slices  were  transferred  to  a  recording  chamber  and  perfused  with  oxygenated aCSF at a rate of 1–3 mL/min and maintained at either 25˚C with an inline heater  (Warner Instruments).      3.2.4. Two­Photon Imaging  We performed imaging with a two‐photon laser‐scanning microscope (Zeiss LSM510‐Axioskop‐ 2  fitted with  a  40X‐W/0.80  numerical  aperture  objective  lens)  directly  coupled  to  a  10 W  Chameleon  ultrafast  laser.    EGFP  was  typically  excited  at  820nm  and  epifluorescence  was  detected with external detectors.   For acquiring  images  laser  intensities were <25 mW at the  tissue and there was no photobleaching nor was there any evidence of cellular damage during  extensive scanning to obtain time lapse images. The laser intensity was carefully monitored in  all  instances and kept comparable between all experiments.    Imaging was done at depths  in  brain slices > 50 µm and up to 100 um.   The mean depth  for  imaging  lesions was 75 um.   Z‐ stacks were taken  in 0.5 µm steps and covered a field of 64.5 µm x 64.5 µm.   The mean scan  time for z‐stack was approximately 1 min and 18 sec.  111    3D  reconstruction of microglia,  and  automated  assessment of  the number of branches was  performed using  Imaris 5.0  (Bitplane AG, Zurich, Switzerland).   The Gaussian  filter was set to  0.5 uM in accordance to the dimensions of the PSF of the microscope.     3.2.5. Western Blotting and Co­Immunoprecipitation  All samples were boiled  in SDS page sample buffer with DTT  for 10 min. After SDS page and  transfer, nitrocellulose membranes were probed with anti‐TLR4 and anti‐MyD88, followed by  alexa  680  and  IRD800  conjugated  secondary  antibodies  for  detection  using  an  Odyssey  machine (Li‐Cor), or HRP conjugated secondaries for ECL detection.   For co‐immunoprecipitation, brain tissue from either Tat‐TLR4 injected, Tat‐scram injected, or  untreated mice was rapidly harvested and homogenized in TEEN buffer (50mM Tris‐HCL, 1mM  EGTA, 150mM NaCl) plus 0.2%SDS and 0.8% TWEEN, supplemented with PMSF, and protease  inhibitor tablet  (1  for 10 mL; Roche Applied Science). Following a 30 min  lysis, samples were  spun at 14000  rpm  for 10 min at 4˚C, and  the  supernatant was  transferred  to a clean  tube.  Lysed protein was  incubated with either anti‐TLR4 (company) or anti‐MyD88 (company) for 1  hr  at  4˚C.  Sepharose beads  (company) were washed  3x  in  TEEN buffer  and  added  to  tubes  containing lysed protein‐antibody, and incubated at 4˚C for 1 hr. Following incubations, beads  were washed  3x  in  the  above  described  TEEN  buffer,  and  subjected  to  SDS‐page  described  above.     112    3.2.6. Enzyme­Linked ImmunoSorbent Assay  Enzyme‐linked  immunosorbent  assays  (ELISA)  were  performed  according  to  manufacturer  instructions  (R  &  D  systems,  Minneapolis,  MN).  In  brief,  hippocampal  brain  slices  were  incubated  and  treated  in  a  homemade  chamber  (using  12 multi‐well  plates)  equipped with  continuous  aeration with  95% O2/5%  CO2.    Slices were  treated with  LPS  (40  μg/ml)  in  the  absence  or  presence  of  Tat  peptides.    The  latter were  pretreated  for  30 min  prior  to  LPS  application.  The cell‐free supernatants were used for analysis of TNF‐α production.  For in vivo  experiments, mice were  IP  injected with  LPS  (CONC μg/kg)  and  hippocampi were  surgically  removed for protein assay and mouse TNF‐α ELISA (eBioscience, San Diego, CA).  Tat peptides  (CONC) were intraperitoneally injected 30 min prior to LPS administration.     3.2.7. Cumulative Behavioral Score   The behavioral  screen were based on  the modified SHIRPA protocol employed by European  Mouse  Phenotyping  Resource  of  Standardised  Screens  (EMPReSS)  designed  to  evaluate  phenotypes  of  mouse  strains  (Brown  et  al.,  2005,  Brown  et  al.,  2006).  Details  of  the  assessments used and the scoring are as follows:  Observation of animal during uninterrupted activity in the home cage:  Body position  Normal: sitting or standing  1 = Occasional hunching of back (kyphosis)  2 = Intermittent but pronounced kyphosis  3 = Lying on side, or prone    Basal activity (square crossings)  Normal: vigorous scratching, grooming, moderate movement  1 = Vigorous, rapid/darting movement  113    2 = Repeated rearing on hind legs and/or repeated vertical leaping    Palpebral Closure  Normal: eyes open  1 = Eyes 1/2 closed  2 = Eyes closed    Piloerection  0 (Normal): None, coat smooth  1 = Coat stands on end    Observation of animal in open arena with manipulation    Transfer arousal  0 (Normal): brief freeze followed by active movement  1 = Prolonged freeze, then slight movement  2 = No freeze, immediate movement  3 = Extremely excited ("manic")      Tail position during forward motion  0 (Normal): horizontally extended tail during locomotion  1 = Dragging  2 = Elevated / Straub Tail    Touch escape from finger stroke on back from above  Normal: moderate (rapid response to light stroke)  1 = Vigorous (escape response to approach)  2 = No response    Pinna reflex (to touch of the proximal part of the inner canthus)  Normal: active retraction, moderately brisk flick  1 = Hyperactive, repetitive flick  2 = None    Corneal reflex (to light touch of the cornea)  Normal: active single eye blink  1 = Multiple eye blink  2 = None    Body tone (resistance to finger press on body cavity)  Normal: resistance  1 = Flaccid, no return of cavity to normal  2 = Extreme resistance, board like    Limb tone (limb resistance to gentle finger tip pressure on hind paw)  114    Normal: resistance  1 = Extreme resistance  2 = No resistance      3.2.8. Novel Home Cage Behavior  The  behavior  of  mice  in  the  novel  home  cage  was  assessed  using  the  Noldus  Ethovision  automated  Video  Tracking  system  (Noldus,  Wageningen,  The  Netherlands).  Parameters  including total distance travelled, average speed, and number of rears were assessed. Results  from tracking analysis were analyzed using ANOVA to compare means.     3.2.9. Intra­cranial Self Stimulation  Surgery: Rats were anaesthetized with xylazine (7 mg/kg i.p.) and ketamine hydrochloride (100  mg/kg i.p.), and placed in a standard stereotaxic apparatus. The dorsal surface of the skull was  exposed  and  a  single  hole  was  drilled  to  allow  implantation  with  a  stainless‐steel  bipolar  electrode. Electrodes were directed at a site  in the medial forebrain bundle corresponding to  the  level  of  the  posterior  lateral  hypothalamus  (AP,  x0.5 mm  from  bregma; ML,+1.7 mm;  DV,x8.3 mm from dura; tooth bar, 5.0 mm above the interaural line). Electrodes were secured  to  the  skull with  surgical  stainless‐steel  screws  and  dental  acrylic  cement. All  animals were  allowed to recover from surgery for at least 1 wk before starting ICSS training.  ICSS Training: Training and testing were conducted in 8 Plexiglas boxes (30r30r24 cm), housed  within sound‐attenuating chambers. Depression of a lever delivered a sinewave current (60 Hz)  of  fixed  duration  (200  ms),  via  a  flexible  lead  connected  to  the  chronically  implanted  115    intracranial electrode assembly. During the initial training period, the current was set at 16 mA,  and only  those animals  that maintained  consistent  lever pressing were used  for  the  second  stage of training. This stage consisted of training subjects on an ascending series rate‐intensity  protocol, whereby current intensities were preset by a computer (Nova‐3; Manx software) and  increased in 2 mA steps, from an initial value of 8 to 28 mA. Five priming pulses of stimulation  were delivered to each animal at the beginning of the first minute of testing at a given current  level. The number of bar presses was recorded for the subsequent 4‐min period, after which  the current intensity was set at the next level. Data collection was controlled by the computer  and  individual  rate–intensity  curves were  plotted  daily  for  each  subject,  from which  three  measures were  calculated  ;  the  current  at which  responding was  half maximal  (M50),  the  minimum  current  required  to maintain  a  threshold  level  of  responding  of  30  presses  per  minute, and the asymptotic level of responding.   After stable levels of ICSS responding had been achieved (M50<¡10%, for 3 consecutive days),  animals  were  rank  ordered  based  upon  their  level  of  responding  over  the  previous  three  baseline sessions. Rats were  then assigned sequentially  to 4 groups,  from  the highest  to  the  lowest M50 values. Two groups (n=7, 8 per group) were assigned to receive administration of  LPS, either acutely or chronically, while two groups (n=7 per group) received vehicle.  Electrode placements were verified at the conclusion of the experiment by sectioning 50 mm  coronal slices of the brain at the level of the lateral hypothalamus. Brain sections were stained  with Cresyl Violet and the locations of the electrode tips were recorded.    116    3.3.   Results  Our goal was to manipulate the impact of LPS binding to TLR4 in vivo, which leads to sickness  behavior.   Accordingly, we developed  interfering peptides coupled  to a  truncated Tat carrier  sequence (Mann and Frankel, 1991)  in an attempt to block TLR4 signalling  in brain slices, and  subsequently  examined  their  efficacy  in  preventing  TLR4  activation  in  vivo.  Specifically,  the  peptides were designed to block TLR4‐MyD88 binding via the intracellular TIR domain induced  by  LPS activation of TLR4  (Figure 3.1A).   We based our  sequence on epta‐peptides directed  against  the  BB‐loop  within  the  TIR  domains  of  TLR4  (Tat‐MyD88)  and  MyD88  (Tat‐TLR4)  (Loiarro et al., 2005;  Loiarro et al., 2007).   We were able  to monitor  the effects of blocking  TLR4‐MyD88  by  monitoring  a  cascade  of  downstream  interactions  with  IL‐1  receptor  associated  kinases  (IRAK)  (Cao  et  al.,  1996a; Muzio  et  al.,  1997),  and  tumor necrosis  factor  receptor associated  factor 6  (TRAF6),that  lead ultimately  to  cytokine production  (Cao et al.,  1996b).   We  first determined whether these Tat‐interfering peptides entered cells  in brain slices after  bath application  in vitro or crossed  the BBB and entered CNS cells after  IP  injections  in vivo.   Dansylated Tat‐MyD88 was injected intraperitoneally (IP) into mice and  30 minutes later acute  brain slices were prepared for immediate examination using two‐photon microscopy. A strong  fluorescence signal was detected  in the cytoplasm of cells  in the hippocampus,  in contrast to  vehicle injected controls (Figure 3.1B,C), indicating that the Tat‐fused peptides could cross the  BBB and permeate CNS cells.   Similar cell staining was observed following  incubation of brain  slices with dansylated Tat‐MyD88  in the ACSF. Entry of  labelled Tat‐MyD88 peptides  into CNS  cells  shows  that  the  peptides  have  access  to  the  intracellular  site  of  TLR4  receptors where  MyD88 is bound.   117                                Figure 3.1. Schematic diagram showing the mechanism of action of the Tat‐MyD88 and Tat‐ TLR4 peptides and  their efficacy  in preventing protein  interactions  in vivo. A. The peptides  are directed against regions of the TLR4 receptor and MyD88 TIR domain, thereby  interfering  with the interaction of these two proteins. LPS treatment has been shown to increase TLR4 and  MyD88 binding leading to the activation of MAP kinases and NFκβ modulation of TNF‐α. Thus  the peptides may be effective  in blocking downstream signalling  to MAP kinases and TNF‐α.  B,C. 2‐photon images of brain tissue showing that following intraperitoneal (IP) injection in the  mouse dansylated Tat peptide can be observed  in cells  in the brain. D When  IP  injected Tat‐ MyD88 and Tat‐TLR4 but not Tat‐scram reduced co‐immunoprecipitation of TLR4 and MyD88  from brain tissue. E. Quantification of co‐immunoprecipitaiton experiments, the density of the  co‐immunoprecipitated  protein  was  normalized  to  the  density  of  the  immunoprecipitated  protein.       118                119      We next  tested whether Tat‐MyD88  can effectively block  the  interaction between TLR4 and  MyD88  in  the whole  brain  by  assessing  their  interaction  via  co‐immunoprecipitation. Mice  were  injected  IP with either vehicle  (control), Tat‐MyD88 peptide, or a scrambled version of  the MyD88  sequence  coupled  to Tat  (Tat‐scram) and whole brain  lysates were prepared 30  minutes later.  Western blots of immunoprecipitated brain lysate prepared from mice injected  with  Tat‐MyD88  showed  a  reduction  in  the  intensity  of  the  MyD88  band  co‐ immunoprecipitated  using  anti‐TLR4  antibody  (Figure  3.1D,E).  Likewise,  the  reverse  co‐ immunoprecipitation of TLR4 using the MyD88 antibody was also diminished  in mice  injected  with  Tat‐MyD88.  In  contrast,  when  animals  were  treated  with  Tat‐scram,  no  change  was  observed  in  the  co‐immunoprecipitation  of  either MyD88 with  TLR4,  or  TLR4 with MyD88  (Figure 3.1D,E).      The disruption of co‐immunoprecipitation supports the possibility that Tat‐interfering peptides  cause functional disruption, which we tested by examining the efficacy of Tat‐MyD88 and Tat‐ TLR4 to inhibit LPS activation of second messenger pathways and cytokine production in both  brain  slices  and  in  vivo. We  began  by  determining  the  time  course  of  downstream  kinase  activation in acutely prepared brain slices treated with LPS. Lysates were prepared 0, 15, 30, 45  or 60 minutes following treatment of slices with LPS (40ug/mL; 45 min), and membranes were  probed  for phospho‐p38 MAPK  (P‐p38MAPK), phospho‐JNK  (P‐JNK),  and GAPDH, which was  used as a loading control (Figure 3.2A).   Increases in both P‐p38MAPK and P‐JNK (normalized  to GAPDH  intensity) were significant at 30  (172.63±17.83, p=.003; 155.91±17.38, p=.004), 45  (235.65±29.42,  p=.001; 166.10±13.32, p=.004),  and  60  (271.14±38.85, p<.001; 189.94±23.41,   120                    Figure 3.2. Time course of kinase activation and TNF‐α  formation  following LPS  treatment,  and the inhibition by Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4. A. Representative blots showing P‐p38 MAPK  and P‐JNK rapidly increased in brain tissue following LPS treatment. GAPDH was monitored as a  loading  control.  B,C. Quantification  of  the  increased  P‐p38 MAPK  and  P‐JNK  levels  over  60  minutes  following LPS  treatment. D‐F. P‐p38 MAP kinase and P‐JNK  increases  from LPS were  attenuated by Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4. D. Representative blots of kinase activation following  various  treatments.  E.  Quantification  of  P‐p38  MAPK  normalized  to  GAPDH  levels.  F.  Quantification  of  P‐JNK  normalized  to  GAPDH  levels.  G,H.  LPS  treatment  increased  TNF‐α  levels,  and  this  increase was  blocked  by  Tat‐TLR4  and  Tat‐MyD88.   Quantification  of  TNF‐α  levels  using  ELISA  in  acute  brain  slice  (G)  parallels  results  found  in whole  brain  lysates  of  injected animals (H).      121            122    p=.001) min following LPS treatment (Figure 3.2B,C). However preincubation (1 hour) of brain  slices  with  either  Tat‐MyD88  (3nM),  Tat‐TLR4  (3nM)  prevented  the  same  LPS  stimulation  (40ug/mL; 45 min)  from  increasing P‐p38MAPK  (p=.654; p=.395) and P‐JNK  (p=.386; p=.686)  levels  (Figure  3.2D‐F).  In  contrast,  matched  brain  slices  preincubated  with  a  scrambled  sequence of either the Tat‐MyD88 or Tat‐TLR4 (0.635±0.057, p=.027; 0.710±0.169, p=.005) still  showed  the  LPS‐stimulated  increases  (Tat‐scram; 3nM).   Therefore Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4  peptides blocked  the  first  steps  involving  second messengers  that  result  from  the  functional  activation of TLR4  receptors by  LPS.     We next  tested  the efficacy of  these peptides on  the  production of the cytokine TNF‐α in brain slices and in vivo which is further downstream from  the  second  messenger  activation  (Medzhitov  and  Janeway,  2000).    Brain  slices  were  preincubated with  either  vehicle,  Tat‐MyD88,  Tat‐TLR4  or  Tat‐scram  I  hr  before  a  2  hr  LPS  treatment.  ELISA detection of TNF‐α in lysates from brain slices showed that the LPS‐induced  (17.38±1.00,  p=.001)  cytokine  production  was  blocked  by  Tat‐MyD88  (p=.532),  Tat‐TLR4  (p=.287) but not by Tat‐scram (14.70±2.17, p=.003) (Figure 3.2G).  After determining that these  Tat interfering peptides were effective in brain slices we next investigated whether they could  effectively prevent in vivo activation of TLR4 receptors by LPS.  We tested their efficacy in vivo  by  IP  injections of   Tat‐scram, Tat‐MyD88 or Tat‐TLR4  I hour before  IP  injection of LPS,  then  measuring TNF‐α  levels  in whole brain  lysate using ELISA after 45 min.     Recent studies have  demonstrated  that brain  circumventricular organs devoid of  a  functional BBB  and blood‐to‐ brain  transport  are  the main  sources  of  cytokines  in  the  brain  after  IP  LPS  administration  (Dantzer et  al., 2008; Konsman  et  al., 2008Dantzer, 2008  #4).  The  robust  increase  in  TNF‐α  levels  that  normally  occurred  in  control  CNS  tissue  45 min  after  LPS  injection  (53.83±7.94,  123    p<.001) was depressed by pre‐treatment with either Tat‐MyD88 (p=.030) or Tat‐TLR4 (p<.001)  (Figure 3.2H).  We next  tested  the  impact of blocking TLR4  signalling on  the dramatic morphology changes  induced  in microglia by LPS. To specifically  image dynamic changes  in  live microglia, we used  two  photon  laser  scanning  microscopy  (tplsm)  in  brain  slices  from  mice  expressing  EGFP  exclusively  in microglia cells (Jung et al., 2000). Under control conditions, microglia  in acutely  prepared  brain  slices  exhibit  the  typical  ramified  morphology  of  resting  microglia  with  numerous  long branches,  and multiple  filopodia  (Hines et  al., 2009)  (Figure 3.3A)  similar  to  their  appearance  in  vivo  (Nimmerjahn  et  al.,  2005).  Staining  of  fixed  tissue  has  shown  that  microglia in vivo acquire an amoeboid shape in response to brain injuries or to immunological  stimuli  such  as  LPS  (Buttini  et  al.,  1996).    The morphological  changes  in microglia  reflect  profound changes  in these cells because the release of cytokines and other signalling  factors  into  the  surrounding  tissue  (Hanisch  and  Kettenmann,  2007)  is  enhanced  when  microglia  acquire amoeboid morphology (Buttini et al., 1996).    Using time‐lapse tplsm, we observed the  progression  of  LPS‐induced  morphology  changes  in  large  fields  of  view  where  multiple  microglia were  visible. Within 10 min we observed  the  first  indications  that  LPS  application  (t=0)  changed  microglia  morphology  from  the  typical  branched  and  ramified  morphology  (Figure  3.3A),  and  by  40 minutes,  the majority  of  branches  were  lost  and  the  cells  were  amoeboid.    The  ameboid morphology  of microglia  persisted  throughout  the  remainder  of  imaging (80 minutes).  In comparison, when slices were preincubated with Tat‐MyD88 or Tat‐ TLR4, the transition from ramified to ameboid characterized by branch loss was not observed  at either 40 or 80 minutes following LPS treatment (Figure 3.3B).   The transition of microglia  from  ramified  to  amoeboid  form  by  LPS  and  the  inhibitory  effects  of  the   Tat‐interfering  124                                    Figure  3.3.  Time  course  of  LPS‐induced microglia morphology  changes  visualized  using  2‐ photon imaging and the block by Tat‐TLR4 and Tat‐MyD88.   A. Series of  images at 0, 40 and  80  minutes  following  application  of  LPS  showing  the  progression  to  ameboid  shape  in  microglia.  B.  Series  of  images  at  0,  40  and  80  minutes  showing  Tat‐MyD88  blocked  the  ameboid  shape  change  normally  induced  by  LPS.  Quantitative  assessment  of  microglia  morphology  changes  following  various  treatments.  C.  Representative  images  of  single  microglia  following  individual  treatments.  D.  Quantification  of  the  number  of  branches  of  microglia following treatment.      125      126     peptides on this transformation were quantified by analysing the number of branches in three  dimensional  reconstructions  of  individual microglia  (n=21  cells  per  group).    The  number  of  branches  in microglia were  significantly  reduced  by  LPS  (Figure  3.3C,D;  control=187.5±29.5,  LPS=78.5±17.5;  p=0.011).    This morphological  transformation was  blocked  by  preincubation  with  either  Tat‐MyD88  or  Tat‐TLR4,  and was  not  significantly  different  from  control  (Figure  3.3B;  p=0.722  and  p=0.369  respectively).  In  contrast, microglia  in  brain  slices  preincubated  with Tat‐scram,  showed a  change  in branch number  induced by  LPS  that was  similar  to  LPS  treated control slices (Figure 3.3D; Tat‐scram=43.5±4.5; p=0.04).  The ability of Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4 to prevent many of the cellular actions of LPS such as  second  messenger  stimulation,  cytokine  formation  and  transformations  of  microglia  to  amoeboid  shapes encouraged us  to  test  their effectiveness  at  treating  LPS‐induced  sickness  behavior. We began by assessing mice given LPS or LPS plus peptide treatments on a number  of basic behavioral  indices of  sickness  including various  reflexes and  sensorimotor  functions  (described  in  methods  section  above).      Mice  were  scored  for  the  extent  to  which  they  displayed each of the 10 indices of sickness and a cumulative score was calculated (n= 10 mice  per group). Control mice scored  in the  lowest category on each of the measures of sickness,  with an average cumulative score of 0.50  (±0.40; Figure 3.4A).  In contrast, mice assessed 30  min.  after  LPS  treatment  scored  high  on  each  of  the  measures,  with  a  cumulative  score  averaging 19.90 (±0.84).  Similar results were observed for mice pretreated with the Tat‐scram  peptide and LPS (21.67±0.24). When mice were pretreated with either Tat‐MyD88 or Tat‐TLR4  peptides, we  observed  a  remarkable  prevention  of  LPS‐induced  sickness  as  reflected  in  the  cumulative  behavioral  scores  (Tat‐MyD88=0.70±0.26;  Tat‐TLR4=1.80±0.20).  To  evaluate  LPS‐ induced  sickness behaviour and the effectiveness of the Tat fused interfering peptides further,   127                      Figure  3.4.  LPS  induced  sickness  behavior  was  blocked  by  Tat‐MyD88  and  Tat‐TLR4  as  assessed  in mice  using  a modified  SHIRPA  screen  and  in  the  novel  home  cage  following  various  treatments.  A.  Cumulative  score  of  sickness  obtained  using  the  SHIRPA  screen.  B.  Representative paths of mice over 30 min  in  the home cage  showing decreased exploration  induced by LPS, and effective block by Tat‐MyD88 and Tat‐TLR4 but not Tat‐scram. Average  speed travelled (C), cumulative distance travelled (D), number of rears in the homecage (E). F,  G. Assessment  of  sickness  behavior  in  rats  using  intracranial  self  stimulation.  F. Number  of  responses per minute during baseline, LPS treatment, and following LPS treatment. G. Number  of  responses per minute during baseline,  LPS plus  Tat‐MyD88  treatment,  and  following  LPS  plus Tat‐MyD88.      128            129    we observed mouse behavior  in a novel home cage. Mice were treated with LPS  for 30 min,  with a subset treated with Tat‐MyD88, Tat‐TLR4 or Tat‐scram 30 min prior to LPS treatment,  and then allowed to explore a new homecage environment freely for 30 min. Representative  path plots of mice  from  each of  the  groups  tested  illustrate  striking differences  among  the  groups  (Figure  3.4B).  Using  Noldus  ethovision  software  for  quantification,  average  speed  (Figure  3.4C),  cumulative  distance  traveled  (Figure  3.4D),  and  total  number  of  rears  (Figure  3.4E) were used to provide objective measures of the severity of sickness. Mice treated with  LPS alone, or LPS plus pretreatment with Tat‐scram showed significant reductions  in average  speed  (1.15±0.166,  p<.001;  0.43±0.045,  p<.001)  and  cumulative  distance  travelled  (1531.44±369.10,  p<.001;  691.75±113.97,  p<.001),  as  well  as  the  total  number  of  rears  (42.4±12.66, p<.001) compared to control (vehicle injected) mice. In contrast, mice pretreated  with  either  Tat‐MyD88  or  Tat‐TLR4  prior  to  LPS  treatment  showed  an  increase  in  average  speed  (2.25±0.232,  p=.003;  1.88±0.208,  p=.038),  total  distance  (3330.95±429.16,  p=.008;  2808.68±206.98, p=.022), or number of rears (187.10±19.60, p=.001; 121.10±16.52, p=.005) in  the novel home cage, compared to LPS controls.   These differences in motor activity between  control,  LPS  and  interference  peptide‐treated  groups  are  immediately  observable when  the  behaviors are viewed concurrently.  Given  the  prevalence  of  decreased  motivation  in  sickness  behavior,  we  examined  the  effectiveness of the TLR4‐MyD88 interfering peptides on the behavioral response of rewarding  intracranial  self‐stimulation  (ICSS).  ICSS  accesses    self‐motivated behaviors  to  acquire brain‐ stimulation  reward  related  to  activation  of  brain  dopamine  neurons  (Phillips,  1984)  ,  and  consequently may be used to assess the direct effect of LPS on brain function in the absence of  peripheral effects (Borowski et al., 1998; Barr et al., 2003) allowing us to examine the effects of  130    sickness and peptide  treatment on underlying motivational  states.  In  LPS  treated animals, a  significant  reduction  in  the number of  responses per 5 minutes was observed  compared  to  baseline and post‐treatment sessions (Figure 3.4F).  In contrast, when animals were pretreated  with  Tat‐MyD88  prior  to  LPS,  this  reduction  in  the  number  of  responses was  not  observed  (Figure 3.4G). This result  indicates that peptides  interfering with TLR4‐MyD88 can reduce the  effects of sickness on motivation for self‐stimulation.    3.4.   Discussion  Taken together, our results show a remarkable ability of two different Tat‐interfering peptides  to prevent  the downstream actions of TLR4  receptor stimulation at  the  intracellular, cellular  and behavioral  levels.   These peptides cross  the BBB and enter cells where  they disrupt  the  protein‐protein  interactions  between  TLR4  and  MyD88.    The  peptides  mimicked  the  key  sequences necessary for dimerization of MyD88 and TLR4 TIR domains.   Natural mutations of  this  key  sequence  in  the  TLR4  receptors  were  previously  discovered  to  explain  the  unresponsiveness  of  a  specific  strain  of  rat  to  LPS  (Poltorak  et  al.,  1998).   We  found  that  mimicking either the sequence of TLR4 receptors or the sequence on the recognition site on  MyD88  prevented  the  co‐immunoprecipitation  of  these  proteins  and  the  ability  of  LPS  to  activate second messengers and increase cytokine formation in intact tissue in brain slices and  in vivo.  LPS‐induced cytokine formation has both CNS components and peripheral components  and  it  is difficult  to  separate  the  influences of  TLR4  receptor  activation  at  either  central or  peripheral sites (reviewed in Dantzer).  There are TLR4 receptors on microglia in the CNS, and  LPS diffusion into the brain in circumventricular regions where the BBB is permeable results in  131    activation of microglia  (Laflamme  and Rivest, 1999; Chakravarty  and Herkenham, 2005).    In  addition, LPS activates TLR4 receptors on endothelial cells, hematopoetic cells of the liver and  lung,  and  perivascular  microglia  (Steiner  et  al.,  2006).    Therefore,  these  findings  further  support the hypothesis that it is necessary to block TLR4 receptors at both CNS and peripheral  sites to block the actions of LPS on the CNS (Perry et al., 2003).   The most dramatic  indication of the efficacy of the Tat‐interfering peptide strategy employed  here  is our finding that the rapid microglia morphological changes  from ramified to ameboid  normally  induced by LPS were blocked by Tat‐MyD88 and by Tat‐TLR4.  In addition these Tat‐ interfering  peptides were  remarkably  effective  at  preventing  the  behavioral  syndrome  that  accompanies  sickness  caused  by  LPS.     When mice were  administered  LPS  by  peripheral  IP  injection,  a  series  of  behavioral  changes  occurred within  a  one  hour  period,  as  previously  reported  (Dantzer et al., 2008). Following  treatment with either Tat‐MyD88 or Tat‐TLR4, but  not  a  Tat‐scrambled  peptide,  there  was  a  complete  absence  of motoric  and motivational  effects of LPS‐induced sickness which we attribute to the direct action of the peptide on brain  function.   The sickness behavior of animals, triggered by the  inflammatory release of cytokines, mirrors  the well known symptoms of sickness  in humans which  include  fatigue,  loss of appetite and  cognitive changes.  It  is also becoming evident  that  sickness and  inflammation are  important  contributors to the occurrence of depressive episodes (Dantzer et al., 2008). Therefore, these  peptides  represent  a  novel  means  of  blocking  the  behavioral  impact  of  sickness,  and  potentially a more effective strategy for alleviating symptoms of depression induced by chronic  inflammation and sickness. Our detailed description of a molecular target linking inflammation  132    and  sickness  to motivational  states  provides  valuable  insight  into  pathways  involved  in  the  cross  talk  between  the  CNS  and  the  immune  system.  In  addition  to  acute  sickness  and  depression, TLR4 activation  in microglia has also been  linked to neurodegeneration (Lehnardt  et al., 2003). Therefore, Tat‐interfering peptide strategies may also be useful for investigations  of potential  therapeutic  interventions  in CNS diseases  in which activated microglia may be a  causal factor in the underlying pathology.      133    3.5.   References  Banks WA (2006) The blood‐brain barrier as a regulatory interface in the gut‐brain axes. Physiol     Behav 89:472‐476.  Barr AM, Song C, Sawada K, Young CE, Honer WG, Phillips AG (2003) Tolerance to the     anhedonic effects of lipopolysaccharide is associated with changes in syntaxin     immunoreactivity in the nucleus accumbens. Int J Neuropsychopharmacol 6:23‐34.  Borowski T, Kokkinidis L, Merali Z, Anisman H (1998) Lipopolysaccharide, central in vivo     biogenic amine variations, and anhedonia. Neuroreport 9:3797‐3802.  Buttini M, Limonta S, Boddeke HW (1996) Peripheral administration of lipopolysaccharide     induces activation of microglial cells in rat brain. Neurochem Int 29:25‐35.  Cao Z, Henzel WJ, Gao X (1996a) IRAK: a kinase associated with the interleukin‐1 receptor.     Science 271:1128‐1131.  Cao Z, Xiong J, Takeuchi M, Kurama T, Goeddel DV (1996b) TRAF6 is a signal transducer for     interleukin‐1. Nature 383:443‐446.  Caso JR, Pradillo JM, Hurtado O, Lorenzo P, Moro MA, Lizasoain I (2007) Toll‐like receptor 4 is     involved in brain damage and inflammation after experimental stroke. Circulation     115(12):1599‐608.  Chakravarty S, Herkenham M (2005) Toll‐like receptor 4 on nonhematopoietic cells sustains     CNS inflammation during endotoxemia, independent of systemic cytokines. J Neurosci     25:1788‐1796.  Dantzer R, O'Connor JC, Freund GG, Johnson RW, Kelley KW (2008) From inflammation to     sickness and depression: when the immune system subjugates the brain. Nat Rev     Neurosci 9:46‐56.  Doyle SL, O'Neill LA (2006) Toll‐like receptors: from the discovery of NFkappaB to new insights     into transcriptional regulations in innate immunity. Biochem Pharmacol 72:1102‐    1113.  Gosselin D, Rivest S (2008) MyD88 signaling in brain endothelial cells is essential for the     neuronal activity and glucocorticoid release during systemic inflammation. Mol     Psychiatry 13:480‐497.  Hanisch UK, Kettenmann H (2007) Microglia: active sensor and versatile effector cells in the     normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10:1387‐1394.  Hart BL (1988) Biological basis of the behavior of sick animals. Neurosci Biobehav Rev 12:123‐    137.  Hines D, Hines R, Mulligan SJ, MacVicar BA (2009) Microglia processes block the spread of     damage in the brain and require functional chloride channels. Glia.  Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR (2000) Analysis     of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent     protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20:4106‐4114.  Kettenmann H (2007) Neuroscience: the brain's garbage men. Nature 446:987‐989.  Konsman JP, Veeneman J, Combe C, Poole S, Luheshi GN, Dantzer R (2008) Central nervous     action of interleukin‐1 mediates activation of limbic structures and behavioural     depression in response to peripheral administration of bacterial lipopolysaccharide.     Eur J Neurosci 28:2499‐2510.  Laflamme N, Rivest S (1999) Effects of systemic immunogenic insults and circulating     proinflammatory cytokines on the transcription of the inhibitory factor kappaB alpha   134      within specific cellular populations of the rat brain. J Neurochem 73:309‐321.  Laflamme N, Rivest S (2001) Toll‐like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune     response triggered by circulating gram‐negative bacterial cell wall components. Faseb     J 15:155‐163.  Lehnardt S, Massillon L, Follett P, Jensen FE, Ratan R, Rosenberg PA, Volpe JJ, Vartanian T     (2003) Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a     Toll‐like receptor 4‐dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 100:8514‐8519.  Loiarro M, Sette C, Gallo G, Ciacci A, Fanto N, Mastroianni D, Carminati P, Ruggiero V (2005)     Peptide‐mediated interference of TIR domain dimerization in MyD88 inhibits     interleukin‐1‐dependent activation of NF‐{kappa}B. J Biol Chem 280:15809‐15814.  Loiarro M, Capolunghi F, Fanto N, Gallo G, Campo S, Arseni B, Carsetti R, Carminati P, De Santis     R, Ruggiero V, Sette C (2007) Pivotal Advance: Inhibition of MyD88 dimerization and     recruitment of IRAK1 and IRAK4 by a novel peptidomimetic compound. J Leukoc Biol     82:801‐810.  Mann DA, Frankel AD (1991) Endocytosis and targeting of exogenous HIV‐1 Tat protein. Embo J     10:1733‐1739.  Medzhitov R, Janeway C, Jr. (2000) Innate immune recognition: mechanisms and pathways.     Immunol Rev 173:89‐97.  Muzio M, Ni J, Feng P, Dixit VM (1997) IRAK (Pelle) family member IRAK‐2 and MyD88 as     proximal mediators of IL‐1 signaling. Science 278:1612‐1615.  Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Helmchen F (2005) Resting microglial cells are highly dynamic     surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308:1314‐1318.  Perry VH (2004) The influence of systemic inflammation on inflammation in the brain:     implications for chronic neurodegenerative disease. Brain Behav Immun 18:407‐413.  Perry VH, Newman TA, Cunningham C (2003) The impact of systemic infection on the     progression of neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci 4:103‐112.  Phillips AG (1984) Brain reward circuitry: a case for separate systems. Brain Res Bull 12:195‐    201.  Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos     C, Freudenberg M, Ricciardi‐Castagnoli P, Layton B, Beutler B (1998) Defective LPS     signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science     282:2085‐2088.  Steiner AA, Ivanov AI, Serrats J, Hosokawa H, Phayre AN, Robbins JR, Roberts JL, Kobayashi S,     Matsumura K, Sawchenko PE, Romanovsky AA (2006) Cellular and molecular bases of     the initiation of fever. PLoS Biol 4:e284.      135    4. CONCLUDING CHAPTER     4.1.  Summary of Findings  The  creation  of  transgenic mice with microglia  specific markers  has  allowed  researchers  to  focus  on  the  dynamic  functioning  of  these  cells  (Jung  et  al.,  2000;  Davalos  et  al.,  2005;  Nimmerjahn et al., 2005).   However, despite the redefinition of microglia as constantly active  contributors to the CNS, the stimuli and mechanisms regulating these rapid microglia activities  are not well studied.  The goal of this thesis was to examine the specific mechanisms regulating  these dynamic cells and to understand how microglia shift from beneficial to harmful roles  in  the CNS.   The experiments of  this  thesis examined  the cellular mechanisms underlying  rapid  microglia  responses  to  harmful  stimuli  including  tissue  damage  and  immune  insults.   We  hypothesised that microglia can have both protective and harmful actions, depending upon the  stimuli that activate them.     The objectives of the current work were to determine:    1. Whether the activities of microglia in acute slices resemble those in vivo, and whether  microglia  process  extension  is  dependent  upon  specific  ion  channels. We  identified  chloride  channels  as  key  regulators  of microglia  process  outgrowth  in  response  to  damage.  2. Whether microglia processes are directed  to  lesioned areas  to  reduce  the extent and  spread  of  damage.  By  blocking  chloride  channels  and  inhibiting  microglia  process  outgrowth, we determined that microglia limit the spread of damage.  136    3. If  TLR4  interfering  peptides  can  block  cytokine  activation  and  microglia  responses  following  treatment with  LPS. We  designed  and  tested  Tat‐conjugated  interference  peptides  in  blocking  the  TLR4‐MyD88  signalling  pathway.  These  peptides  were  effective  in blocking MAP‐kinase phosphorylation,  TNF‐α production,  and microglia  morphology changes induced by LPS treatment.  4. Whether  peptides  that  block  TLR4  signalling,  cytokine  activation  and  microglia  responses  can  reduce  the  sickness  behaviour  observed  in  response  to  LPS.  Using  peptides  that  block  TLR4‐MyD88  signalling,  we  observed  a  reduction  in  sickness  behaviour observed in response to LPS.  I  demonstrated  that  the  rapid  response  of microglia  cells  to  damage  requires  Cl‐  channel  activity.  Further I characterized the dynamic function of microglia in live tissue, including rapid  sensing  of  the  environment,  and  polarization  occurring  in  concert with  process  outgrowth  toward  sites of damage.    It  is clear  that both  sensing  (6 µm/min) and process outgrowth  (2  µm/min) are extremely rapid and dynamic processes in the nervous system that are unique to  microglia.  I also provide evidence to suggest that sensing and process outgrowth are part of a  continuum of microglia function, but are regulated by separate mechanisms.   I also showed that two different Tat‐interfering peptides can prevent the downstream actions  of TLR4 receptor stimulation at the intracellular, cellular and behavioral levels.  These peptides  crossed  the  BBB  and  entered  cells  where  they  disrupted  the  protein‐protein  interactions  between  TLR4  and  MyD88.    Tat‐MyD88  prevented  the  co‐immunoprecipitation  of  these  proteins and the ability of LPS to activate second messengers and increase cytokine formation  in  intact  tissue  in brain  slices  and  in  vivo.   A dramatic  indication of  the  efficacy of  the  Tat‐ 137    interfering  peptide  strategy  employed  here  is  our  finding  that  the  rapid  microglia  morphological  changes  from  ramified  to ameboid normally  induced by  LPS were blocked by  Tat‐MyD88  and  by  Tat‐TLR4.  In  addition  these  Tat‐interfering  peptides  were  effective  at  preventing the behavioral syndromes that accompanies sickness caused by LPS.   The sickness  behavior  of  animals,  triggered  by  the  inflammatory  release  of  cytokines, mirrors  the  well  known symptoms of sickness  in humans which  include  fatigue,  loss of appetite and cognitive  changes. It is also becoming evident that sickness and inflammation are important contributors  to the occurrence of depressive episodes.  Therefore, these peptides represent a novel means  of  blocking  the  behavioral  impact  of  sickness,  and  potentially  a more  effective  strategy  for  alleviating symptoms of depression induced by chronic inflammation and sickness.     4.2.   Harmful versus Beneficial Roles of Microglia  When viewed as a whole, microglia activation is beneficial to most of the acute pathologies of  the CNS (van Rossum and Hanisch, 2004; Schwartz et al., 2006; Harry and Kraft, 2008; Streit et  al.,  2008; Boissonneault  et  al.,  2009).      The ultimate  role of microglia  is  to  create  a barrier  between  the  healthy  cells  and  sick  or  infected  cells  (Kreutzberg,  1996;  Hanisch  and  Kettenmann, 2007).   However, when defending against  invading pathogens  in the defence of  healthy  cells,  the microglia  states  can  become  excessively  activated  (Butovsky  et  al.,  2005;  Minghetti, 2005; Kim and Joh, 2006; Kraft et al., 2006; Witting et al., 2006; Fiala et al., 2007;  Boche and Nicoll, 2008).  Van  Rossum  and  Hanisch  (2004)  suggest  that modulation  of  excessive microglia  activation  should only be considered  in  three  situations.   Firstly,  it  is only useful  to decrease microglia  138    activation  if  the extracellular signal  that  is activating  the microglia has been eliminated  from  the CNS.  This points out that therapies must be directly related to the channels and receptors  that are involved in the disease.  Secondly, the deactivation of microglia needs to decrease all  the  products  and  signals  of  activation.    The  delicate  balance  between  various  cytokines  highlights this situation because decreasing one harmful cytokine can increase the detrimental  regulatory  effects  of  other  cytokines.    Finally,  the  intracellular  mechanism  of  microglia  activation in response to the pathogenic stimuli can only be manipulated if they do not effect  homeostatic functions of microglia.  Shutting down all microglia function in the brain during a  diseased state would surely lead to other disease states.    The  regulation  of  microglia  cell  activation  should  not  be  viewed  only  as  decreasing  their  signalling  capabilities.    Decreasing  the  clearance  of  amyloid‐beta  plaques  during  the  initial  phase  of Alzheimer  disease  has  been  shown  to  have  negative  effects  on  disease morbidity  (Shigematsu et al., 1992; von Bernhardi et al., 2001; Koenigsknecht and Landreth, 2004; Floden  and Combs, 2006).   Therefore,  the  resolution  to whether microglia  are  harmful  or  beneficial  is  contained  in  a  better understanding of  the  intracellular  interactions between microglia and  the pathogenic  cells.  Removing microglia cells from the CNS in healthy states necessarily has negative effects  of on development because of  their beneficial  role  in  synaptic  stripping  (Neiss et  al., 1992;  Graeber  et  al.,  1993;  Schiefer  et  al.,  1999;  Yamada  et  al.,  2008).    Therefore,  removing  all  microglia function during a diseased state would also have negative consequences.    139    4.3.   Effects of LPS on Cognition  In  addition  to  the  activation  of  TLR4,  LPS  has  numerous  downstream  effects  in  the  CNS  including the creation of stress activated kinases  including c‐jun‐N‐terminal kinase (JNK).   The  phosphorylation of  JNK has been  shown  to  cause  impairment  in  the  induction of  long  term  potentiation (LTP) (Li et al., 2007).  Various reports have shown that blocking LPS‐induced IL‐1r  activation decreases pJNK expression  (Vereker et al., 2000; Curran et al., 2003; Costello and  Herron, 2004; Lynch et al., 2004; Li et al., 2007).  Furthermore, it has been shown that limiting  pJNK expression can rescue the detrimental effects of LPS on LTP (Barry et al., 2005).  It would  be  interesting to examine the effects of the peptides developed  in chapter 3 of this thesis on  LPS‐induced  LTP  impairments.  Specifically,  blocking  LPS‐induced  TLR4  activation  directly  in  association with hippocampal  LTP may  rescue  the detrimental  effects of  LPS.    If  significant,  these findings then could be further extrapolated to behavioural models of hippocampal based  learning.     4.4.  Other Means of Regulating Microglia and Inflammation  4.4.1. RNA Interference  An alternative to using peptides to block  immune signalling  in the CNS would be to use small  interfering RNA (siRNA) technology.  siRNA is involved in the RNA interference pathway where  it  blocks  the  expression  of  a  specific  gene  by  targeted  degradation  of  its messenger  RNA.   Therapies based on siRNA have great potential for diseases in the CNS where the pathology is  caused by the overproduction or aberrant production of gene products (Calegari et al., 2002;  Arthur et al., 2004; Trulzsch and Wood, 2004; Malik et al., 2008; De Souza et al., 2009; Querbes  140    et al., 2009). In the case of inflammatory pathologies in the CNS, siRNA could target the chronic  production  of  proinflammatory  cytokines  that  have  been  linked  to  depressive  states  and  neurodegeneration. This type of therapy would have similar effects to the peptides employed  in  this  thesis,  if  siRNA  was  generated  to  target  TNF‐α  production  in  response  to  TLR4  activation.     4.4.2. Modulation of Microglia by Minocyline   Another  useful  agent  that  has  not  been  discussed  in  the  scope  of  this  thesis  is  the  broad  spectrum  anti‐biotic  minocycline.    Minocycline  has  been  shown  to  have  both  anti‐ inflammatory  and  anti‐apoptotic  actions  on microglia  (Seabrook  et  al.,  2006;  Yenari  et  al.,  2006; Bosco et al., 2008; Lechpammer et al., 2008; Padi and Kulkarni, 2008; Graber and Dhib‐ Jalbut,  2009).    The  ability  of minocycline  to  decrease microglia  activation  has  seen  it  used  effectively    as  treatment  for  neurodegenerative  diseases  such  as  ischemia,  Alzheimer  and  Parkinson’s  diseases (Hunter et al., 2004; Neumann et al., 2006; Seabrook et al., 2006; Garcia‐ Alloza et al., 2007; Liu et al., 2007; Carty et al., 2008; Lechpammer et al., 2008).  However, the  exact mechanism that minocycline alters microglia activation is not understood.  Use of similar  techniques employed  in this thesis could elucidate these mechanisms.   However, minocycline  may work via other mechanisms due to its broad range of effects.          141    4.5.  References  Arthur JS, Fong AL, Dwyer JM, Davare M, Reese E, Obrietan K, Impey S (2004) Mitogen‐ and     stress‐activated protein kinase 1 mediates cAMP response element‐binding protein     phosphorylation and activation by neurotrophins. J Neurosci 24:4324‐4332.  Barry CE, Nolan Y, Clarke RM, Lynch A, Lynch MA (2005) Activation of c‐Jun‐N‐terminal kinase is     critical in mediating lipopolysaccharide‐induced changes in the rat hippocampus. J     Neurochem 93:221‐231.  Boche D, Nicoll JA (2008) The role of the immune system in clearance of Abeta from the brain.     Brain Pathol 18:267‐278.  Boissonneault V, Filali M, Lessard M, Relton J, Wong G, Rivest S (2009) Powerful beneficial     effects of macrophage colony‐stimulating factor on {beta}‐amyloid deposition and     cognitive impairment in Alzheimer's disease. Brain.  Bosco A,  Inman DM, Steele MR, Wu G, Soto  I, Marsh‐Armstrong N, Hubbard WC, Calkins DJ,  Horner PJ, Vetter ML (2008) Reduced retina microglial activation and improved optic nerve     integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest     Ophthalmol Vis Sci 49:1437‐1446.  Butovsky O, Talpalar AE, Ben‐Yaakov K, Schwartz M (2005) Activation of microglia by     aggregated beta‐amyloid or lipopolysaccharide impairs MHC‐II expression and renders     them cytotoxic whereas IFN‐gamma and IL‐4 render them protective. Mol Cell     Neurosci 29:381‐393.  Calegari F, Haubensak W, Yang D, Huttner WB, Buchholz F (2002) Tissue‐specific RNA     interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease‐prepared     short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14236‐14240.  Carty ML, Wixey JA, Colditz PB, Buller KM (2008) Post‐insult minocycline treatment attenuates     hypoxia‐ischemia‐induced neuroinflammation and white matter injury in the neonatal     rat: a comparison of two different dose regimens. Int J Dev Neurosci 26:477‐485.  Costello DA, Herron CE (2004) The role of c‐Jun N‐terminal kinase in the A beta‐mediated     impairment of LTP and regulation of synaptic transmission in the hippocampus.     Neuropharmacology 46:655‐662.  Curran BP, Murray HJ, O'Connor JJ (2003) A role for c‐Jun N‐terminal kinase in the inhibition of     long‐term potentiation by interleukin‐1beta and long‐term depression in the rat     dentate gyrus in vitro. Neuroscience 118:347‐357.  Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim JV, Zuo Y, Jung S, Littman DR, Dustin ML, Gan WB (2005)     ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci     8:752‐758.  De Souza EB, Cload ST, Pendergrast PS, Sah DW (2009) Novel therapeutic modalities to address     nondrugable protein interaction targets. Neuropsychopharmacology 34:142‐158.  Fiala M, Cribbs DH, Rosenthal M, Bernard G (2007) Phagocytosis of amyloid‐beta and     inflammation: two faces of innate immunity in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis     11:457‐463.  Floden AM, Combs CK (2006) Beta‐amyloid stimulates murine postnatal and adult microglia     cultures in a unique manner. J Neurosci 26:4644‐4648.  Garcia‐Alloza M, Ferrara BJ, Dodwell SA, Hickey GA, Hyman BT, Bacskai BJ (2007) A limited role     for microglia in antibody mediated plaque clearance in APP mice. Neurobiol Dis     28:286‐292.  142    Graber JJ, Dhib‐Jalbut S (2009) Protective autoimmunity in the nervous system. Pharmacol     Ther 121:147‐159.  Graeber MB, Bise K, Mehraein P (1993) Synaptic stripping in the human facial nucleus. Acta     Neuropathol 86:179‐181.  Hanisch UK, Kettenmann H (2007) Microglia: active sensor and versatile effector cells in the     normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10:1387‐1394.  Harry GJ, Kraft AD (2008) Neuroinflammation and microglia: considerations and approaches for     neurotoxicity assessment. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4:1265‐1277.  Hunter CL, Quintero EM, Gilstrap L, Bhat NR, Granholm AC (2004) Minocycline protects basal     forebrain cholinergic neurons from mu p75‐saporin immunotoxic lesioning. Eur J     Neurosci 19:3305‐3316.  Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR (2000) Analysis     of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent     protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20:4106‐4114.  Kim YS, Joh TH (2006) Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the     pathogenesis of Parkinson's disease. Exp Mol Med 38:333‐347.  Koenigsknecht J, Landreth G (2004) Microglial phagocytosis of fibrillar beta‐amyloid through a     beta1 integrin‐dependent mechanism. J Neurosci 24:9838‐9846.  Kraft AD, Lee JM, Johnson DA, Kan YW, Johnson JA (2006) Neuronal sensitivity to kainic acid is     dependent on the Nrf2‐mediated actions of the antioxidant response element. J     Neurochem 98:1852‐1865.  Kreutzberg GW (1996) Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci     19:312‐318.  Lechpammer M, Manning SM, Samonte F, Nelligan J, Sabo E, Talos DM, Volpe JJ, Jensen FE     (2008) Minocycline treatment following hypoxic/ischaemic injury attenuates white     matter injury in a rodent model of periventricular leucomalacia. Neuropathol Appl     Neurobiol 34:379‐393.  Li XM, Li CC, Yu SS, Chen JT, Sabapathy K, Ruan DY (2007) JNK1 contributes to metabotropic     glutamate receptor‐dependent long‐term depression and short‐term synaptic     plasticity in the mice area hippocampal CA1. Eur J Neurosci 25:391‐396.  Liu Z, Fan Y, Won SJ, Neumann M, Hu D, Zhou L, Weinstein PR, Liu J (2007) Chronic treatment     with minocycline preserves adult new neurons and reduces functional impairment     after focal cerebral ischemia. Stroke 38:146‐152.  Lynch AM, Walsh C, Delaney A, Nolan Y, Campbell VA, Lynch MA (2004) Lipopolysaccharide‐    induced increase in signalling in hippocampus is abrogated by IL‐10‐‐a role for IL‐1     beta? J Neurochem 88:635‐646.  Malik M, Chen YY, Kienzle MF, Tomkowicz BE, Collman RG, Ptasznik A (2008) Monocyte     migration and LFA‐1‐mediated attachment to brain microvascular endothelia is     regulated by SDF‐1 alpha through Lyn kinase. J Immunol 181:4632‐4637.  Minghetti L (2005) Role of inflammation in neurodegenerative diseases. Curr Opin Neurol     18:315‐321.  Neiss WF, Guntinas Lichius O, Angelov DN, Gunkel A, Stennert E (1992) The hypoglossal‐facial     anastomosis as model of neuronal plasticity in the rat. Ann Anat 174:419‐433.  Neumann J, Gunzer M, Gutzeit HO, Ullrich O, Reymann KG, Dinkel K (2006) Microglia provide     neuroprotection after ischemia. Faseb J 20:714‐716.  Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Helmchen F (2005) Resting microglial cells are highly dynamic   143      surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308:1314‐1318.  Padi SS, Kulkarni SK (2008) Minocycline prevents the development of neuropathic pain, but not     acute pain: possible anti‐inflammatory and antioxidant mechanisms. Eur J Pharmacol     601:79‐87.  Querbes W, Ge P, Zhang W, Fan Y, Costigan J, Charisse K, Maier M, Nechev L, Manoharan M,     Kotelianski V, Sah DW (2009) Direct CNS Delivery of siRNA Mediates Robust Silencing     in Oligodendrocytes. Oligonucleotides 19:23‐30.  Schiefer J, Kampe K, Dodt HU, Zieglgansberger W, Kreutzberg GW (1999) Microglial motility in     the rat facial nucleus following peripheral axotomy. J Neurocytol 28:439‐453.  Schwartz M, Butovsky O, Bruck W, Hanisch UK (2006) Microglial phenotype: is the commitment     reversible? Trends Neurosci 29:68‐74.  Seabrook TJ, Jiang L, Maier M, Lemere CA (2006) Minocycline affects microglia activation,     Abeta deposition, and behavior in APP‐tg mice. Glia 53:776‐782.  Shigematsu K, McGeer PL, Walker DG, Ishii T, McGeer EG (1992) Reactive     microglia/macrophages phagocytose amyloid precursor protein produced by neurons     following neural damage. J Neurosci Res 31:443‐453.  Streit WJ, Miller KR, Lopes KO, Njie E (2008) Microglial degeneration in the aging brain‐‐bad     news for neurons? Front Biosci 13:3423‐3438.  Trulzsch B, Wood M (2004) Applications of nucleic acid technology in the CNS. J Neurochem     88:257‐265.  van Rossum D, Hanisch UK (2004) Microglia. Metab Brain Dis 19:393‐411.  Vereker E, O'Donnell E, Lynch MA (2000) The inhibitory effect of interleukin‐1beta on long‐    term potentiation is coupled with increased activity of stress‐activated protein     kinases. J Neurosci 20:6811‐6819.  von Bernhardi R, Ramirez G, Matile H, Dobeli H (2001) Immobilized amyloid precursor protein     constructs: a tool for the in vitro screening of glial cell reactivity. Eur J Neurosci     14:946‐956.  Witting A, Chen L, Cudaback E, Straiker A, Walter L, Rickman B, Moller T, Brosnan C, Stella N     (2006) Experimental autoimmune encephalomyelitis disrupts endocannabinoid‐    mediated neuroprotection. Proc Natl Acad Sci U S A 103:6362‐6367.  Yamada J, Hayashi Y, Jinno S, Wu Z, Inoue K, Kohsaka S, Nakanishi H (2008) Reduced synaptic     activity precedes synaptic stripping in vagal motoneurons after axotomy. Glia     56:1448‐1462.  Yenari MA, Xu L, Tang XN, Qiao Y, Giffard RG (2006) Microglia potentiate damage to blood‐    brain barrier constituents: improvement by minocycline in vivo and in vitro. Stroke     37:1087‐1093.                


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items