UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

Supraspinal actions of pentobarbital on transmission through the spinothalamic tract Namjoshi, Dhananjay 2007

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata

Download

Media
24-ubc_2008_spring_namjoshi_dhananjay.pdf [ 4.4MB ]
Metadata
JSON: 24-1.0066191.json
JSON-LD: 24-1.0066191-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0066191-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0066191-rdf.json
Turtle: 24-1.0066191-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0066191-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0066191-source.json
Full Text
24-1.0066191-fulltext.txt
Citation
24-1.0066191.ris

Full Text

   SUPRASPINAL ACTIONS OF PENTOBARBITAL ON TRANSMISSION  THROUGH THE SPINOTHALAMIC TRACT   by  Dhananjay Namjoshi  M. Pharm, University of Mumbai, 2003  B. Pharm, University of Mumbai, 1999    A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF  THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    MASTER OF SCIENCE  in  The Faculty of Graduate Studies  (Pharmaceutical Sciences)    THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA  December 2007  © Dhananjay Namjoshi, 2007      ABSTRACT     Despite  the  advances  made  in  our  understanding  of  the  molecular  mechanistic  actions  of  general anesthetics very little is known about the in vivo neural circuits involved in creating  the state of general anesthesia. To date the common consensus is that general anesthetics act  ubiquitously  within  the  CNS.  Recently,  (Devor  and  Zalkind,  2001)  have  reported  that  microinjections  of  pentobarbital  (PB)  into  a  discrete  brainstem  focal  area  of  conscious  rats  induced  a  classical,  reversible  general  anesthesia‐like  behavioral  state.  The  authors  concluded  that  this area,  termed the  mesopontine tegmental  anesthesia area  (MPTA), may  be important for the induction of general anesthesia. The purpose of the present project was  to  study  the  neurophysiological  basis  of  the  analgesia,  which  accompanied  the  state  of  general  anesthesia  induced  by  PB  microinjections  into  the  MPTA  that  was  reported  by  (Devor and Zalkind, 2001). Here, sensory inflow via the spinothalamic tract (STT), a classical  spinal  nociceptive  pathway  in  the  rat,  was  assessed  using  single  neuron  extracellular  recording techniques before, during and after microinjections of PB into the MPTA.    Spontaneous firing rate (SFR), antidromic firing index (FI) and sciatic as well as sural  nerve‐evoked  responses  (Sc‐,  Su‐ER)  of  STT  neurons  in  isoflurane‐anesthetized  rats  were  quantified before as well as 2, 15, 30 and 60 min following bilateral microinjections of either  PB (200 μg/side) or vehicle control solution (Vh, 1 μL/side) into the MPTA.    The  group  mean  SFR,  FI  as  well  as  magnitudes  of  Sc‐,  Su‐ER  of  STT  neurons  were  significantly  and  reversibly  reduced  following  PB  microinjections  compared  to      ii      corresponding baseline measurements. There were no significant changes in any of the three  parameters  following  microinjections  of  Vh  compared  to  the  pre‐microinjection  baseline  responses.    The  results  from  this  study  indicate  that  analgesia,  which  occurs  during  the  anesthesia‐like  state  following  microinjections  of  PB  into  the  MPTA,  may  be  due  to  attenuation  of  sensory  inflow  through  the  STT.  The  suppression  of  STT  neurons  likely  occurs  via  direct  and/or  indirect  descending  pathways  from  the  MPTA  to  the  spinal  cord.  This study provides the first direct electrophysiological evidence for the analgesia caused by  PB microinjections into the rat MPTA.         iii       TABLE OF CONTENTS  ABSTRACT......................................................................................................................................... ii  TABLE OF CONTENTS .................................................................................................................. iv  LIST OF TABLES............................................................................................................................viii  LIST OF FIGURES ............................................................................................................................. x  LIST OF SYMBOLS AND ABBREVIATIONS ...........................................................................xv  ACKNOWLEDGEMENTS.............................................................................................................xix  DEDICATIONS ...............................................................................................................................xxi  CHAPTER 1: GENERAL INTRODUCTION................................................................................. 1  1.1. Mechanism(s) of Actions of General Anesthetics: From Lipid to Protein Theory...... 2  1.2. Central Sites of General Anesthetic Actions...................................................................... 3  1.3. Mesopontine Tegmental Anesthesia Area: Potential Central Site for the Induction  of General Anesthesia .......................................................................................................... 4  1.4. The Spinothalamic Tract ........................................................................................................ 9  1.5. Study Rationale...................................................................................................................... 10  1.6. Research Hypothesis............................................................................................................. 12  1.7. Research Objectives .............................................................................................................. 12  CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS............................................................................ 16  2.1. SURGICAL PROCEDURES ................................................................................................ 16  2.1.1. Anesthetic Induction......................................................................................................... 16  2.1.2. Tracheotomy ....................................................................................................................... 18  2.1.3. Sciatic and Sural Nerve Surgery ..................................................................................... 19  2.1.4. Thoracolumbar Laminectomy ......................................................................................... 19  2.1.5. Craniotomy.......................................................................................................................... 20     iv      2.1.6. T13‐L1 Vertebral Immobilization Procedures ................................................................ 21  2.2. EXTRACELLULAR RECORDING PROCEDURES ........................................................ 22  2.2.1. Antidromic Identification of Spinothalamic Tract (STT) Neurons ......................... 22  2.2.2. Electroencephalogram....................................................................................................... 24  2.2.3. Spike Amplification, Recording and Data Acquisition Procedures ........................ 25  2.2.4. Baseline Electrophysiological Recording Procedures................................................. 26  2.2.4.1. Spontaneous Spike Activity .................................................................................. 26  2.2.4.2. Antidromic Firing Index......................................................................................... 27  2.2.4.3. Peripheral Nerve Stimulation‐Evoked STT Responses ................................... 28  2.3. DRUG AND CONTROL SOLUTIONS ............................................................................ 29  2.4. INTRACEREBRAL MICROINJECTIONS PROCEDURE............................................. 30  2.5. DRUG/VEHICLE CONTROL‐RESPONSE STUDIES ................................................... 32  2.6. BRAIN PERFUSION AND HISTOLOGY ........................................................................ 34  CHAPTER 3: RESULTS ................................................................................................................... 39  3.1. SPINOTHALAMIC TRACT NEURONS: GENERAL CHARACTERISTICS............ 40  3.2. STUDIES OF THE ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS ............................. 44  3.2.1. Three Groups of Spinothalamic Tract Neurons According to the Treatment  Protocol............................................................................................................................... 45  3.2.2. ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS AT THE BASELINE ....................... 48  3.2.2.1. Spontaneous Firing Rate ........................................................................................ 48  3.2.2.2. Antidromic Firing Index......................................................................................... 49  3.2.2.3. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses.......................................................... 49  3.2.2.3.1. Sural Nerve‐Evoked STT Responses ............................................................ 51  3.2.2.3.2. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses .......................................................... 55      v      3.2.3. EFFECTS OF BILATERAL MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL  SOLUTION/PENTOBARBITAL INTO THE RAT MPTA ON THE  ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF STT NEURONS...................... 59  3.2.3.1. MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL SOLUTION ....................... 59  3.2.3.1.1. Spontaneous Firing Rate: Vehicle Control Microinjections .................... 59  3.2.3.1.2. Interspike Interval Data: Vehicle Control Microinjections...................... 64  3.2.3.1.3. Antidromic Firing Index: Vehicle Control Microinjections..................... 67  3.2.3.1.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses:                   Vehicle Control Microinjections ................................................................... 70  3.2.3.1.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses:                   Vehicle Control Microinjections ................................................................... 74  3.2.3.2. MICROINJECTIONS OF PENTOBARBITAL................................................... 82  3.2.3.2.1. Spontaneous Firing Rate: Pentobarbital Microinjections......................... 82  3.2.3.2.2. Interspike Interval Data: Pentobarbital Microinjections.......................... 87  3.2.3.2.3. Antidromic Firing Index: Pentobarbital Microinjections ......................... 90  3.2.3.2.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses:                   Pentobarbital Microinjections ....................................................................... 94  3.2.3.2.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses:                   Pentobarbital Microinjections ....................................................................... 98  3.3. RESULTS OF HISTOLOGY OF MICROINJECTION SITES ..................................... 106  CHAPTER 4: DISCUSSION ......................................................................................................... 110  4.1. Introductory Remarks......................................................................................................... 110  4.2. Technical Considerations: Animal Model, Study Design, Histology,          and Statistical Analysis ...................................................................................................... 112  4.3. STT Neurons: General Properties .................................................................................... 119     vi      4.4. Inhibition of Spontaneous and Evoked Responses of STT Neurons by  Pentobarbital Microinjections into the MPTA ............................................................ 122  4.4.1. Spontaneous Firing Rate ................................................................................................ 123  4.4.2. Interspike Interval Parameters...................................................................................... 128  4.4.3. Antidromic Firing Index................................................................................................. 129  4.4.4. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses .................................................................. 132  4.5. Time Course of Effects of Pentobarbital on the Spike Activity of STT Neurons ... 136  4.6. Possible Neural Mechanism(s) of Pentobarbital‐Mediated Suppression of STT  Neurons through the MPTA............................................................................................ 137  4.7. MPTA: A Possible Pronociceptive Center in the Brain? .............................................. 147  4.8. Future Directions ................................................................................................................. 150  CHAPTER 5: SUMMARY AND CONCLUSIONS .................................................................. 155  REFERENCES.................................................................................................................................. 157  APPENDICES.................................................................................................................................. 179  Appendix A.................................................................................................................................. 179  Appendix B .................................................................................................................................. 180      vii       LIST OF TABLES     Table 3.1   Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on interspike interval parameters of STT neurons ……………………….…....66      Table 3.2   Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on the electrophysiological parameters of Group I STT neurons.……….…....79      Table 3.3   Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on the electrophysiological parameters of Group III STT neurons…...…...…80      Table 3.4   Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control   solution into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation   on electrophysiological parameters obtained by combining the results  obtained from Groups I and III STT neurons…………………………………...81      Table 3.5   Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on interspike  interval parameters of STT neurons…...…………………………...……………89      Table 3.6   Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on   the electrophysiological parameters of Group II STT neurons………………103        viii      Table 3.7   Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital   into the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the   electrophysiological parameters of Group III STT neurons …........................104      Table 3.8   Summary of combined results of effects of bilateral microinjections   of pentobarbital into the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat   preparation on electrophysiological parameters of Group II and   Group III STT neurons…………………..…………………………….…………105      ix       LIST OF FIGURES    Figure 2.1    Schematic of the experimental setup for extracellular recording   of STT neurons and intracerebral microinjections of pentobarbital   and/or vehicle control solutions into the MPTA…...…………………………...36     Figure 2.2   Photograph of microinjection cannula system used for intracerebral  microinjections of pentobarbital/vehicle control solutions……………………37     Figure 2.3   Flowchart of the steps involved in electrophysiological parameter  recording and microinjections procedures……………………………………..38     Figure 3.1   Criteria used for antidromic identification of STT neuron……………………42      Figure 3.2   Schematic diagram of estimated thalamic stimulation and spinal  recording sites of STT neurons recorded in isoflurane‐anesthetized   rat preparation……………………………………………………………………..43     Figure 3.3   Correlation between axonal conduction velocity and spinal recording   depth of STT neurons….………………………………………………….……….46     Figure 3.4   Schematic explanation of STT neurons classified into three groups   based on the treatment(s) they received………………………………………...47     Figure 3.5   Correlation of baseline spontaneous firing rate with spinal and axonal  conduction velocity of STT neurons……………………………………………..50    Figure 3.6   Example of sural nerve‐evoked STT responses……………...…………………53     x      Figure 3.7   Absence of habituation of sural nerve‐evoked STT responses......……………54      Figure 3.8   Example of sciatic nerve‐evoked STT responses……………….………………57       Figure 3.9   Absence of habituation of sciatic nerve‐evoked STT responses.……………...58      Figure 3.10   Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous   rate of firing STT neurons.....…………..………………………...….……………61      Figure 3.11   Spontaneous firing rate of each STT neuron before and after bilateral  microinjections of vehicle control solution into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation..…………………………………….………….…...62      Figure 3.12   Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the  spontaneous firing rate of a STT neuron before and following bilateral  microinjections of vehicle control solution into the MPTA………………........63      Figure 3.13   Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of   spike activity of a lumbar STT neuron recorded before and after   bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation...….…..…...….…………………….65     Figure 3.14   Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA on the antidromic firing index of STT neurons in the   isoflurane‐anesthetized rat preparation...…………….………...……………….68        xi      Figure 3.15   Antidromic firing index of each STT neuron before and after   bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation……………………………...69      Figure 3.16   Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural   nerve‐evoked responses of STT neurons………………………...……...………71      Figure 3.17   Example of presynaptic afferent volley recorded in the spinal cord   evoked by stimulation of sural nerve......……………...………………………...72     Figure 3.18   Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural   nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of   isoflurane‐anesthetized rat preparation………..………………………………..73     Figure 3.19   Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the   MPTA of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐  evoked responses of STT neurons.……………………………………………….76       Figure 3.20   Example of presynaptic afferent volley recorded in the spinal cord   evoked by stimulation of sciatic nerve..………………...……………………….77      Figure 3.21   Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into   the MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐  evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of the   isoflurane‐anesthetized rat preparation………..………………………………..78     xii      Figure 3.22   Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous   firing rate of STT neurons………………………...………………...…………….84     Figure 3.23   Spontaneous firing rate of each STT neuron before and after bilateral  microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐  anesthetized rat preparation…………………..…………………….…………...85     Figure 3.24   Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the  spontaneous firing rate of a STT neuron before and following the   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of the   isoflurane‐anesthetized rat……….…..…………….……………………………..86     Figure 3.25   Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of   spike activity of a lumbar STT neuron recorded before and after   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐  anesthetized rat preparation……………...…………….……………...................88      Figure 3.26   Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the antidromic   firing index of STT neurons……………………...……………………………….92      Figure 3.27   Antidromic firing index of each STT neuron before and after   bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of   isoflurane‐anesthetized rat preparation…………………………………………93           xiii      Figure 3.28   Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sural nerve‐evoked   responses of STT neurons……………………………….……………….………..96     Figure 3.29   Effects of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   on sural nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal   cord of isoflurane‐anesthetized rat preparation………..…………..…………..97     Figure 3.30   Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked   responses of STT neurons………………..………….………………………...…101     Figure 3.31   Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA   of isoflurane‐anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked   afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of the isoflurane‐  anesthetized rat preparation…...………………..………………………………102      Figure 3.32   Representative examples of anatomical location of MPTA in the rat       brainstem………………………………………………………………………….107         Figure 3.33   Summary of anatomical locations of dye microinjections within the   MPTA of rat brain stem…………………...…………….……………………….109      Figure 4.1   Schematic of the hypothetical neural circuitry involved in suppression   of STT neuron by pentobarbital microinjections into the rat MPTA…...…...145         xiv       LIST OF SYMBOLS AND ABBREVIATIONS    ANOVA    analysis of variance   AMPA    alpha‐amino‐3‐hydroxy‐5‐methyl‐4‐isoxazolepropionic acid   AP      anterior‐posterior distance from the bregma   °C      degree Celsius   CD      coefficient of dispersion   cm      centimeter(s)   CNS     central nervous system   CO2      carbon dioxide   CSF      cerebrospinal fluid   CV      coefficient of variation   DRt      dorsal reticular nucleus   DV      ventral distance from the dorsal surface of brain   EEG      electroencephalogram   FI      antidromic firing index    g      gram(s)   GABA    gamma aminobutyric acid   h      hour(s)   Hz      hertz      xv      ID      inner diameter   i.m.      intramuscular   i.v.      intravenous   ISIH     interspike interval histogram   kg      kilogram(s)   kHz      kilohertz   L      liter(s)   L1      first lumbar vertebra/spinal segment   L2      second lumbar vertebra/spinal segment   LC      locus ceruleus   LTD      long‐term depression   LTP      long‐term potentiation   m      meter(s)   M      mole   ML      lateral distance from the midline   MΩ      megaohm(s)   μA      microampere(s)   μg      microgram(s)   μL      microliter(s)   μm      micrometer(s)      xvi      mA      milliampere(s)    mL      milliliter(s)   mm      millimeter(s)   ms      millisecond(s)   min      minute(s)   MPA     medial preoptic area   MPTA    mesopontine tegmental anesthesia area   NaCl     sodium chloride   NE      norepinephrine   nM      nanomol   NMDA   N‐methyl‐D‐aspartic acid   NRGC   nucleus reticularis gigantocellularis      NRM     nucleus raphe magnus   NREM    non‐rapid eye movement   OD   outer diameter      PAD     primary afferent depolarization   PAG     periaqueductal grey   PAH     primary afferent hyperpolarization   PB      pentobarbital   PBS      phosphate buffered saline      xvii      PE      polyethylene   PTg      pedunculopontine tegmental nucleus   PSTH     poststimulus time histogram   REM     rapid eye movement   RVM     rostral ventromedial medulla   s   second(s)      5‐HT     serotonin (5‐hydroxytryptamine)   Sc‐ER     sciatic nerve stimulation‐evoked response(s)   SEM     standard error of mean   SFR      spontaneous firing rate   STT      spinothalamic tract    SS      stainless steel   Su‐ER     sural nerve stimulation‐evoked response(s)   T      threshold intensity   T12      twelfth thoracic vertebra/spinal segment   T13      thirteenth thoracic vertebra/spinal segment   TC      thalamocortical   TMN     tuberomammillary nucleus   Vh      vehicle control solution   VPL      ventral posterior lateral nucleus of thalamus     xviii       ACKNOWLEDGEMENTS  As I come to this milestone in the pursuit of knowledge, I cannot help but reflect back and  acknowledge all those who have contributed towards completion of this work in one or the  other way.  First of all, I offer my deepest gratitude to Almighty GOD for showering HIS infinite  bounties,  graces  and  mercies  on  me.  Without  HIS  wishes  and  blessings,  this  work  could  have remained a dream only.     I  would  like  to  dedicate  this  work  to  my  parents  for  their  unconditional  love,   encouragement and to my wife Archana for her immense love and support, who stood with  me in every good and bad moment. I would also like to thank my parents‐in‐law for their  constant motivation and support.     I  express  my  deepest  gratitude  for  my  mentor  Dr.  Peter  Soja  for  his  guidance,   unstinting  support,  constant  encouragement,  constructive  criticism  and  valuable  suggestions throughout my work. Thank you Peter for introducing me to the exciting world  of  neuroscience.  It  has  been  an  enriching  experience  and  privilege  working  in  your  laboratory.      This  work  was  supported  by  the  grants  from  U.S.  National  Institutes  of  Health   (NS041921) and Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Dr. Peter Soja.      My sincere thanks to Dr. Shelly A. McErlane, who helped me throughout my study.   Thank  you  Shelly  for  teaching  me  aseptic  neurosurgical  techniques  and  sharing  your  vast  knowledge of animal care. It has been a delight working with you.     I would like to thank my supervisory committee members Drs. Marc Levine (Chair),   Sastry  Bhagavatula,  Anthony  Pearson  and  Nicholas  Swindale  for  providing  their  critical  review of this thesis and the benefit of their experience and expertise.      xix         Special  thanks  are  extended  to  Dr.  Niwat  Taepavarapruk  for  helping  me  with  the   schematic of the experimental setup.     I am grateful to Dr. Ernest Puil for kindly providing me with pentobarbital used in   this thesis.     I would also like to convey my deepest gratitude to Dr. Ujendra Kumar for allowing   me to use his laboratory facility for the rat brain histology. Special thanks are also extended  to  Padmesh  Rajput  for  helping  me  with  the  histological  examinations  and  imaging  of  rat  brain samples.     Special  thanks  are  passed  on  to  Dr.  Elissa  Strome  for  sharing  some  useful  tips  for   microinjection  techniques  as  well  as  for  providing  stainless  steel  cannulae  for  the  drug  microinjections.      Thanks  are  also  extended  to  my  colleague,  Xu  (Ervin)  Zhu  for  his  help  during  the   initial part of my experiments.     I  would  like  to  thank  the  Faculty  of  Pharmaceutical  Sciences  at  the  University  of   British Columbia for allowing me to use its facilities as well as providing me with Teaching  and Research Assistantships.     Last  but  not  the  least  I  would  like  to  thank  all  my  well‐wishers,  who  directly  or   indirectly contributed to this thesis work.      DHANANJAY NAMJOSHI                 xx       DEDICATIONS       Dedicated to  My Parents  &  My Wife and Best Friend  Archana     xxi    General Introduction   CHAPTER 1   GENERAL INTRODUCTION   General  anesthesia  is  a  chemically  induced,  reversible,  loss  of  consciousness  that  is  accompanied  by  analgesia,  atonia,  and  abolition  of  autonomic  responses.  Since  the  first  successful  demonstration  of  ether  anesthesia  by  Morton  in  1846  (see,  Whalen  et  al.,  2005),  general  anesthetics  have  been  widely  used  clinically.  Despite  over  150  years  of  clinical  practice  with  general  anesthetics,  exactly  how  structurally  and  pharmacologically  distinct  substances  act  to  cause  general  anesthesia  is  not  yet  completely  understood.  Our  current  knowledge about the mechanism(s) by which general anesthetics act has gradually evolved  through in vitro studies that were principally focused on cellular and subcellular targets. The  prevailing  view  is  that  general  anesthetics  bind  to  specific  neurotransmitter  receptors  and  inhibit  neuronal  firing  by  dampening  excitatory  synaptic  transmission  and/or  potentiating  synaptic  inhibition.  The  state  of  general  anesthesia  represents  a  consortium  of  different  behavioral  components  including  unconsciousness,  analgesia,  atonia,  and  attenuation  of  autonomic  responses  (Evers  et  al.,  2006).  However,  exactly  which  neural  circuits  are  involved in the different components of general anesthesia is still unclear. To correlate the  observed clinical effects of general anesthetics to their molecular mechanism(s) of actions, it  is  necessary  to  dissect  out  specific  neural  structures/networks  involved  that  mediate  the  different components of general anesthesia, for example analgesia.       1   General Introduction   1.1.  Mechanism(s)  of  Actions  of  General  Anesthetics:  From  Lipid  to  Protein  Theory   Since substances with a wide array of chemical structures and/or classes can induce general  anesthesia,  several  hypotheses  were  proposed  to  link  their  actions  to  a  single  mechanism.  Following the first public demonstration of general anesthesia, three theories have emerged  to  explain  the  mechanisms  of  general  anesthetic  actions.  The  very  first  theory  of  general  anesthesia  was  proposed  by  the  French  physiologist,  Claude  Bernard  in  1875.  Bernard  proposed that general anesthetics act by “reversible coagulation” of chemical constituents of  nerves  and  muscles,  in  particular,  their  proteins  (Leake,  1971).  Bernard’s  theory  was  subsequently  refuted  for  the  reasons  that  coagulation  of  proteins  required  a  given  general  anesthetic  in  a  concentration  that  was  much  higher  than  that  required  for  general  anesthesia.  About  thirty  years  later,  Meyer  (1899)  and  Overton  (1901)  independently  proposed  the  lipid  theory  of  general  anesthesia.  The  Meyer‐Overton  lipid  hypothesis  was  based  on  the  observed  correlation  between  the  lipid  solubility  and  potency  of  general  anesthetics.  Accordingly,  the  lipid  hypothesis  proposed  that  general  anesthetics  act  by  perturbation  of  the  lipid  membrane.  The  lipid  theory  enjoyed  a  wide,  unchallenged  acceptance for nearly eight decades.       The  lipid  theory  paradigm  was  severely  challenged  by  the  pioneering  work  of   Franks  and  Lieb  (1984),  who,  in  their  ‘protein  theory’,  proposed  that  anesthetics  could  directly  bind  and  modulate  membrane  proteins.  Since  then,  the  research  emphasis  has  shifted from the lipid theory to membrane receptors. Studies over the last two decades have   2   General Introduction  revealed  several  voltage‐gated  (Na+,  K+  and  Ca2+)  and  ligand‐gated  (GABA,  glycine,  acetylcholine,  NMDA  and  AMPA)  ion  channels  as  targets  of  general  anesthetics  (for  reviews,  see  Franks  and  Lieb,  1998;  Belelli  et  al.,  1999;  Krasowski  and  Harrison,  1999;  Thompson  and  Wafford,  2001;  Campagna  et  al.,  2003;  Mashour  et  al.,  2005).  The  current  consensus is that general anesthetics modulate a variety of neurotransmitter channels in the  CNS in a distributed manner to cause general anesthesia.   1.2. Central Sites of General Anesthetic Actions   Although  much  is  now  known  about  the  molecular  and  cellular  mechanisms  of  general  anesthetics, our understanding of the regions of the CNS affected by them remains elusive.  An  understanding  of  the  neural  networks  affected  by  general  anesthetics  is  required  for  linking their molecular actions to their observed clinical effects. Along these lines, the effects  of  various  anesthetics  have  been  studied  primarily  in  the  brain  including  various  cortical  (Alkire  et  al.,  1995;  Alkire,  1998;  Fiset  et  al.,  1999;  Hayton  et  al.,  1999)  and  sub‐cortical  (Guilbaud et al., 1981; Antognini and Carstens, 1999a; Detsch et al., 1999; Ries and Puil, 1999;  Alkire et al.,  2000) sites. Parallel  experiments in rats  (Rampil  et  al.,  1993; King  and  Rampil,  1994; Rampil, 1994; Rampil and King, 1996), cats (Namiki et al., 1980), goats (Antognini and  Schwartz,  1993;  Antognini  and  Kien,  1994),  and  humans  (Zhou  et  al.,  1997)  indicate  that  besides  the  brain,  the  spinal  cord  is  another  important  site,  for  anesthetic  action.  The  principal putative sites in the spinal cord for the actions of general anesthetics are the dorsal  horn  and  motoneuron  pools.  It  is  now  widely  accepted  that  the  unconsciousness  and  amnesia caused by the general anesthetics are attributed to their supraspinal actions, while   3   General Introduction  analgesia and atonia are due to the actions of general anesthetics in the spinal cord (Collins  et al., 1995; Antognini, 1997; Antognini and Carstens, 1998, 1999a; Antognini et al., 1999). In  addition, many non‐neural sites, including glial cells, cells  of the skeleton, cardiomyocytes  and  cells  comprising  the  immune  systems  have  also  been  reported  as  targets  of  general  anesthetics (Urban, 2002).   1.3.  Mesopontine  Tegmental  Anesthesia  Area:  Potential  Central  Site  for  the  Induction of General Anesthesia   The  studies  in  the  field  of  general  anesthesia  so  far  have  assessed  global  but  not  specific  neural circuits in the CNS where anesthetics might act. Recent intracerebral microinjection  studies  in  rats  have  provided  evidence  of  discrete  loci  in  the  brain  that  may  likely  be  involved in barbiturate‐induced anesthesia. (Devor and Zalkind, 2001) recently reported on  the  discovery  in  conscious  rats  of  a  discreet  locus  in  the  brainstem  pontomesencephalic  tegmentum,  which  might  be  involved  in  pentobarbital  (PB)‐induced  general  anesthesia.  In  this  exploratory  study,  microliter  quantities  of  PB  were  injected  into  various  brain  stem  areas of conscious rats while the animals’  anesthesia scores  (based  on standard  behavioral  assessment)  and  electroencephalogram  (EEG)  were  recorded.  The  authors  reported  that  bilateral  microinjections  of  PB  into  a  focal  zone  in  the  mesopontine  tegmentum  induced  a  reversible  “anesthesia‐like”  behavioral  state  characterized  by  flaccid  muscle  atonia,  analgesia,  loss  of  consciousness  and  righting  reflexes  along  with  a  shift  in  the  EEG  waveform pattern from low‐voltage, desynchronized, “fast‐wave” pattern to a high‐voltage,  synchronized, “slow‐wave” pattern. In the same study, microinjections of phenobarbital, the   4   General Introduction  selective  GABAA  receptor  agonist,  muscimol  (Johnston,  1996)  and  alphathesin,  a  steroid  anesthetic, mimicked the effects of PB. Since the cytoarchitectonic boundaries and the target  neuron population of this brain stem area were not clearly defined, the authors coined the  term mesopontine tegmental anesthesia area (MPTA) to describe this focal site. The authors  concluded  that  the  MPTA  contains  a  barbiturate‐sensitive  “switch”  that  may  modulate  ascending  and  descending  pathways  producing  the  state  of  anesthesia.  The  authors  have  further reported that, the anesthetic actions of PB within the MPTA were highly site‐specific.  That  is,  microinjections  of  PB  in  the  areas  surrounding  MPTA  either  failed  to  induce  anesthesia  or  induced  only  mild  sedation.  Notably,  these  sites  surrounding  the  MPTA  included the periaqueductal grey (PAG), which is involved in morphine‐induced analgesia  (Fields  et  al.,  2006)  and  the  pedunculopontine  tegmental  nucleus  (PTg),  which  plays  an  important role in regulation of the sleep‐wake cycle (Rye et al., 1987; Steriade and McCarley,  2005).    Surprisingly,  in  the  Devor  and  Zalkind  (2001)  study,  microinjections  of  the  local  anesthetic lidocaine into MPTA failed to reproduce the anesthetic effects of PB. The reason  for  this  discrepancy  is  not  presently  known.  One  possible  reason  may  be  that  the  concentration  of  the  intracerebrally  microinjected  lidocaine  (2%,  0.5  μL  volume)  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001).  In  some  earlier  intracerebral  microinjection  studies  in  rats  (Aimone  and  Gebhart,  1986;  Ren  et  al.,  1990)  a  4%  lidocaine  (0.5  μL  volume)  was  used  to  block  the  activity  of  local  circuit  neurons.  Thus  it  may  be  possible  that  the  lower   5   General Introduction  concentration  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  was  insufficient  to  block  the  MPTA  neurons to induce general anesthesia.    Recently,  the  Devor  group  has  reported  that  the  anesthetic  effects  of  PB  microinjections  were  antagonized  by  pre‐microinjections  of  selective  GABAA  receptor  antagonist, bicuculline (Seutin and Johnson, 1999) into the MPTA (Sukhotinsky et al., 2007).  This  suggests  that  the  anesthesia  induced  by  PB  microinjections  into  the  MPTA  involves  GABAA  receptor‐mediated  mechanisms.  In  further  neuroanatomical  tracing  studies,  the  Devor group has demonstrated that the neurons in the MPTA express GABAA receptors and  send axonal projections to various anatomical sites in the higher and lower brain centers as  well  as  spinal  cord  (Sukhotinsky  et  al.,  2003).  The  targets  of  MPTA  projections  include  components of the endogenous motor control systems including the pontine and medullary  reticular  formation,  structures  in  the  rostral  ventromedial  medulla  (RVM),  and  substantia  nigra (Sukhotinsky et al., 2005). MPTA neurons are also reciprocally connected with several  supraspinal  structures  involved  in  the  control  of  pain  transmission,  including  the  periaqueductal  grey  (PAG),  relay  nuclei  in  the  RVM,  in  particular,  the  nucleus  reticularis  gigantocellularis (NRGc) (Sukhotinsky et al., 2006). Recently, Sukhotinsky et al. (2007) have  reported  axonal  projections  of  the  MPTA  neurons  to  higher  brain  centers,  which  are  involved in the control of consciousness. These structures include the intralaminar nuclei of  the  thalamus,  the  hypothalamus,  the  cholinergic  PTg,  the  laterodorsal  tegmental  nucleus,  and forebrain (Sukhotinsky et al., 2007). Interestingly, there are almost no MPTA projections  to the thalamic sensory relay nuclei (Sukhotinsky et al., 2007). Finally, MPTA neurons send   6   General Introduction  distinct axonal projections to the dorsal and ventral horns of the spinal cord (Sukhotinsky et  al.,  2006;  Reiner  et  al.,  2007;  Sukhotinsky  et  al.,  2007).  Thus,  microinjection  of  barbiturate  anesthetics  into  the  MPTA  may  inhibit  local  circuit  GABAergic  neurons,  which  in  turn,  modulate the activities of various target regions of the MPTA in the brain and spinal cord  inducing the behavioral state of general anesthesia.    In  a  recent  study,  Voss  et  al.  (2005)  have  corroborated  the  findings  of  Devor  and  Zalkind  (2001)  by  reporting  that  microinjections  of  the  short‐acting  barbiturate  anesthetic,  thiopental  into  the  MPTA  of  conscious  rats  induced  general  anesthesia‐like  state.  In  the  same study, microinjections of non‐barbiturate anesthetic propofol into the MPTA failed to  induce  general  anesthesia.  This  finding  by  Voss  et  al.  (2005)  is  interesting,  given  that  propofol,  like  barbiturate  anesthetics,  acts  by  enhancing  the  inhibitory  GABAergic  neurotransmission (Trapani et al., 2000; Irifune et al., 2003). It may be possible, that the dose  of  propofol  microinjected  into  the  MPTA  may  have  been  insufficient  to  induce  general  anesthesia.  Secondly,  propofol  may  be  acting  by  engaging  neurons  other  than  the  MPTA  neurons.  Alternately,  this  may  also  be  attributable  to  the  mechanisms  by  which  propofol  and  barbiturates  modulate  the  kinetic  properties  of  GABAA  receptor‐Clˉ  channel.  While  at  anesthetic  concentrations,  both  the  barbiturates  and  propofol  increase  the  Clˉ  flux  through  the GABAA receptor channel, barbiturates increase the mean channel open time of GABAA  receptor  without  altering  the  channel  conductance  (Macdonald  and  Olsen,  1994).  On  the  other  hand,  therapeutic  concentrations  of  propofol  increase  the  probability  of  GABAA  receptor Clˉ channel being in the open state (Hara et al., 1993; Orser et al., 1994; Trapani et al.,   7   General Introduction  2000).    This  raises  a  question  whether  MPTA‐mediated  induction  of  general  anesthesia  is  dependent on the way in which the kinetic properties of GABAA receptors are modulated.    From the studies of the Devor group, it appears that MPTA has an important role in  the induction of general anesthesia. However, is MPTA the sole site for induction of general  anesthesia? One potential way to answer this question is by microinjecting bicuculline, into  the  MPTA  of  the  same  animal  model  as  used  by  Devor  and  Zalkind  (2001),  followed  by  intravenous  (i.v.)  administration  of  anesthetic  dose  of  PB.  If  i.v.  administration  of  PB  following  bicuculline  microinjections  into  the  MPTA  fails  to  induce  a  general  anesthetic  state,  it  may  be  logical  to  suggest  that  the  MPTA  plays  a  significant  role  in  engaging  the  state of barbiturate‐induced general anesthesia. There are, however parallel studies, which  indicate that brain nuclei distinct from the MPTA, may also play important role(s) in general  anesthetic  unconsciousness.  For  example,  Nelson  et  al.(2002)  recently  reported  dose‐ dependent  sedation  and  a  loss  of  the  righting  reflex,  a  hallmark  of  anesthesia  in  animals,  after  microinjection  of  muscimol,  a  GABAA  agonist  into  the  tuberomammillary  nucleus  (TMN) of conscious rats. In the same study, microinjections of PB and propofol in the TMN  produced only sedation. These responses were antagonized by the putative GABAA receptor  antagonist,  gabazine.  The  TMN  is  a  small  area  located  in  the  hypothalamus  which  sends  major histaminergic input to the cortex and is known to play a critical role in the sleep‐wake  cycle (Lin et al., 1990; Wada et al., 1991). Interestingly, the MPTA has very little connectivity  with the TMN (Sukhotinsky et al., 2007). Thus these two brain areas, i.e., MPTA and TMN,  may  be  acting  independently  in  the  control  of  consciousness.  In  a  similar  type  of  study,   8   General Introduction  microinjections  of  PB  into  the  medial  preoptic  area  (MPA)  of  rat  brain  induced  sleep  with  reduced sleep onset latency and increased non‐rapid eye movement (NREM) sleep as well  as  total  sleep  time  (Mendelson,  1996).  It  is  not  known  presently  if  any  neural  connectivity  exists between MPA and MPTA.   1.4. The Spinothalamic Tract   The  spinothalamic  tract  (STT)  is  the  most  important  and  extensively  studied  ascending  sensory pathway in the anterolateral quadrant of the spinal cord projecting to the thalamus  (Hodge  and  Apkarian,  1990;  Willis  and  Westlund,  1997).  STT  neurons  receive  and  relay  nociceptive, tactile, and thermal information from the periphery to the higher centers in the  brain (Willis, 1985; Willis and Westlund, 1997; Willis and Coggeshall, 2004). In addition, the  STT  has  also  been  implicated  in  postural  changes  and  locomotion  (Menetrey  et  al.,  1984).  The  distribution  of  the  cell  bodies  of  STT  neurons  in  the  spinal  cord  is  species‐specific.  Studies  in  the  rat  have  shown  that  majority  of  the  STT  neurons  are  located  in  the  nucleus  proprious,  deep  dorsal  horn,  ventromedial  zone  and  dorsomedial  ventral  horn  (Giesler  et  al., 1979; Giesler et al., 1981a; Yezierski and Bowker, 1981). The axons of the majority of rat  STT neurons decussate initially towards the ventral funiculus and then migrate to the lateral  funiculus  while  ascending  to  the  contralateral  thalamus.  In  rodent  brain,  the  major  termination site for STT axons is the ventral posterior lateral (VPL) nucleus of the thalamus  (Willis, 1985; Hodge and Apkarian, 1990). STT axons also send collaterals to the medullary  reticular  formation  (Kevetter  and  Willis,  1982),  parabracheal  area  (Hylden  et  al.,  1989)  and  periaqueductal  gray  (Kevetter  and  Willis,  1983;  Liu,  1986;  Harmann  et  al.,  1988).  STT   9   General Introduction  neurons receive a variety of both somatic and visceral afferent inputs. This has been shown  by  electrically  stimulating  visceral,  cutaneous,  and  motor  nerves  (Foreman  et  al.,  1975;  Chung et al., 1979; Ammons, 1989).   1.5. Study Rationale   The  intracerebral  microinjection  studies  reviewed  here  suggest  that  certain  neural  foci  within the brain may play important roles in the generation of unconsciousness due to sleep  or general anesthesia. The discoveries of discrete intracerebral foci, when modulated by an  anesthetic  drug  to  evoke  a  behavioral  anesthetic  state,  have  challenged  the  contemporary  view  that  general  anesthetics  act  in  a  non‐site‐specific  manner  by  ubiquitous  inhibition  of  CNS neurons. The Devor and Zalkind (2001) study, however, was based on the behavioral  assessment  of  the  animals.  The  neurophysiological  basis  of  PB  microinjection‐induced  anesthesia is not known. The purpose of the study presented in this thesis was to partially  address this issue.    The  two  very  important  components  that  are  considered  as  part  of  the  state  of  general  anesthesia  are  analgesia  and  atonia.  In  the  microinjection  study  of  Devor  and  Zalkind (2001), the behavioral assessment of the animal showed that presence of PB in the  MPTA  caused  both  analgesia  and  atonia.  However,  it  may  very  well  be  that  the  analgesia  reported in this study was a consequence of the animal’s failure to elicit nociceptive motor  responses to the noxious stimuli due to atonia. Accordingly, there is lack of sound evidence  that  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  caused  analgesia.  One  way  to  address  this   10   General Introduction  question is by assessing the physiological properties of sensory tract neurons in the spinal  cord after PB microinjections into the MPTA.    The  afferent  fibers  carrying  sensory  (and  nociceptive)  information  from  the  peripheral  tissues  make  synaptic  connectivities  with  several  second‐order  ascending  pathways  in  the  spinal  cord.  These  ascending  pathways,  in  turn,  transmit  the  sensory  signals  to  the  higher  brain  centers.  As  mentioned  previously,  suppression  of  noxious  stimuli‐induced  responses  by  most  of  the  general  anesthetics  (inhalational,  barbiturates,  propofol  and  nitrous  oxide)  is  thought  to  be  due  to  their  direct  actions  on  the  spinal  cord  (Collins  et  al.,  1995;  Antognini  and  Carstens,  1998).  Thus,  it  may  be  possible  that  general  anesthetic‐induced  analgesia  is  due  to  the  suppression  of  the  spinal  ascending  pathways  (e.g.,  the  STT),  which  transmit  nociceptive  input  from  the  periphery  to  the  brain.  Surprisingly,  there  are  few,  if  any,  studies  assessing  the anesthetic‐induced  changes  in  the  physiological characteristics of ascending spinal sensory tract neurons.    Soja  et  al.  (2002)  have  reported  that  intravenous  injection  of  thiopental  reversibly  suppressed  the  spike  activities  of  electrophysiologically  identified  (proprioceptive)  dorsal  spinocerebellar  tract  (DSCT)  and  (nociceptive)  spinoreticular  tract  (SRT)  neurons  in  the  chronic  cat preparation. Their study was  unique  because  it examined  the  activity of DSCT  and SRT neurons in the awake, unanesthetized animal, free from recent surgery. The effects  of the anesthetic, thiopental were examined on DSCT and SRT neurons under near‐natural  conditions.  The  results  obtained  by  Soja  et  al.  (2002)  indicate  that  barbiturate  anesthetics  suppress ascending non‐nociceptive and nociceptive transmission through the spinal cord.   11   General Introduction  However,  since,  the  anesthetic  was  delivered  through  the  i.v.  route  it  may  have  acted  in  other parts of the CNS besides the spinal sensory neurons, perhaps even the MPTA (Devor  and Zalkind, 2001).    The  PB  microinjection  studies  reported  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  and  the  electrophysiological studies reported by Soja et al. (2002), thus, present a unique provenance  for  studying  the  effects  of  intracerebrally  administered  barbiturate  anesthetics  on  the  activity of spinal nociceptive neurons. Accordingly, in the present thesis, the excitability of  identified  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  was  assessed  before,  during  and  after  microinjections of PB into the MPTA of the rat brain.    1.6. Research Hypothesis   The research hypothesis for the present study was:  “Bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  mesopontine  tegmental  anesthesia  area  (MPTA)  of  the  rat  brain,  suppresses  sensory  inflow  through  the  spinothalamic tract.”   1.7. Research Objectives     The  overall  objective  of  the  study  reported  in  this  thesis  was  to  assess  the  electrophysiological  parameters  of  identified  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  of  the  rat,  namely, the spontaneous discharge, antidromic excitability  and afferent nerve stimulation‐ evoked  responses  after  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA.  For  the  purpose  of   12   General Introduction  this study, the highest effective concentration of 200 μg/μL (800 nM) with the largest volume  of 1 μL/side of PB, which induced a behavioral state of general anesthesia in conscious rats  (Devor and Zalkind, 2001) was used. In the control studies, PB‐free vehicle control solution  (Vh, 1 μL/side) was microinjected into the MPTA. Since the cytoarchitectonic boundaries of  MPTA are not yet clearly defined, the stereotaxic coordinates referring to the MPTA zone in  this  study  were  derived  from  the  information  of  the  surrounding  structures  reported  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  and  the  stereotaxic  atlas  of  the  rat  brain  (Paxinos  and  Watson,  2007), which together, corroborated with those reported in recent papers (Voss et al., 2005;  Sukhotinsky  et  al.,  2006).  A  brief  detail  of  each  electrophysiological  parameter  is  given  below.   Electrophysiological Parameter 1: Assessment of Spontaneous Firing Rate   The  spontaneous  spike  activity  of  a  STT  neuron  is  defined  as  the  cell’s  background  spike  activity  in  the  absence  of  any  stimulus.  Thus,  it  would  be  useful  to  determine  if  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  modulate  the  ongoing  afferent  input  and  rhythmic  properties of individual STT neurons. In this experimental paradigm, once the STT cell was  antidromically identified and confirmed, its spontaneous spike activity was recorded before  and  at  specified  time  intervals  after  microinjections  of  PB/Vh  into  the  MPTA.  Samples  of  recorded  spike  activity  were  analyzed  to  determined  mean  spike  rate,  interspike  interval,  coefficient of variation, and coefficient of dispersion. These two latter parameters are useful  for detecting indirectly whether changes in spontaneous firing rate due to drug actions are   13   General Introduction  also accompanied by changes in spike patterns (Cocatre‐Zilgien and Delcomyn, 1992; Soja et  al., 1996).   Electrophysiological Parameter 2: Assessment of Antidromic Firing Index.   The firing index (FI) is the probability of evoking action potentials in the neuron in response  to a consecutive number of stimuli applied to it (Lloyd and McIntyre, 1955). The FI method  has long being used for assessing changes in the postsynaptic excitability of motor neurons  (Hunt, 1955; Lloyd and McIntyre, 1955; Wilson and Burgess, 1962), group Ia and Ib afferents  (Wall,  1958;  Willis  et  al.,  1976),  tooth  pulp  afferents  (Lisney,  1979;  Cairns  et  al.,  1996),  and  some descending fiber systems (Rudomin and Jankowska, 1981). To assess changes in the FI,  the  identified  STT  neurons  were  “backfired”  with  100  consecutive  stimuli  applied  to  the  VPL  nucleus  at  threshold  stimulus  intensity.  The  numbers  of  antidromic  spikes  obtained  from  75  consecutive  stimuli  (excluding  the  collision  between  the  antidromic  and  orthodromic  spikes)  were  calculated  before  and  after  microinjections  of  PB/  Vh  into  the  MPTA.  A  decrease  in  the  FI  after  the  microinjections  compared  to  the  baseline  FI  would  indicate reduced excitability of the STT cell due to putative somatic hyperpolarization (Wall,  1958, 1962; Lipski, 1981).    Electrophysiological  Parameter  3:  Assessment  of  Peripheral  Nerve  Stimulation‐Evoked  Responses    STT  neurons  receive  tactile  and  afferent  nociceptive  input  from  the  skin  and  viscera.  Therefore,  in  this  study,  the  responsiveness  of  the  STT  neurons  to  the  afferent  peripheral   14   General Introduction  nerve  stimulation  was  assessed  following  the  microinjections.  In  the  present  experiments,  the sciatic (Sc) and sural (Su) nerves were stimulated to evoke synaptic responses recorded  in  STT  neurons.  The  Sc  nerve  is  the  largest  nerve  originating  from  the  lumbosacral  spinal  segments and innervates the lower extremities. It is a mixed nerve containing both sensory  and motor nerve fibers. The Su nerve is a sensory cutaneous nerve innervating the foot. It  joins  to  the  peroneal  nerve,  which  is  a  branch  of  the  sciatic  nerve.  The  mean  response  magnitude  and  latency  of  the  STT  neurons,  evoked  by  the  stimulation  of  both  of  these  nerves  were  studied  before  and  after  microinjection  of  PB  into  the  MPTA.  In  addition,  to  determine  if  microinjections  of  PB/Vh  changed  the  presynaptic  input,  the  peak‐trough  amplitude and latency of orthodromic afferent volley recorded within the spinal cord after  peripheral nerve stimulation was analyzed around PB/Vh microinjections.   15   Materials and Methods   CHAPTER 2  MATERIALS AND METHODS   All  protocols  of  the  studies  reported  in  this  thesis  were  approved  by  the  University  of  British Columbia Committee on Animal Care and were carried out in  accordance with the  national  (Canadian  Council  for  Animal  Care,  1993)  and  institutional  (University  of  British  Columbia Committee on Animal Care) guidelines. All the experiments were carried out in  adult  male  Sprague‐Dawley  rats  (290‐590  g),  obtained  from  the  animal  breeding  facility  at  the  University  of  British  Columbia.  The  animals  were  housed  in  standardized  conditions  with  12:12  h  light/dark  cycles  and  ambient  temperature  (21˚C).  The  animals  were  fed  on  standard laboratory rodent chow and given water ad libitum.   2.1. SURGICAL PROCEDURES   All  the  surgical  procedures  were  performed  using  aseptic  techniques.  During  surgery  a  deep surgical plane of anesthesia was maintained and monitored.   2.1.1. Anesthetic Induction   On  the  day  of  the  experiment,  a  rat  was  weighed  and  placed  in  an  anesthetizing  box  (#  500108, Harvard Apparatus, Holliston, MA) that was supplied with a continuous stream of  isoflurane (4 %) and nitrous oxide (0.6 L/min), in oxygen (3 L/min). The animal usually lost  consciousness  within  1‐2  min,  which  was  confirmed  by  observing  loss  of  righting  reflex.  Once  the  animal  lost  its  righting  reflex,  it  was  taken  out  of  the  chamber  and  placed  on  its  back  on  the  surgery  table.  The  anesthetic  mixture  thereafter  was  delivered  through  a     16    Materials and Methods  custom‐made nose cone and the isoflurane level was lowered to 2.5%. The surgical plane of  anesthesia  was  confirmed  with  the  absence  of  blink  and  toe  pinch  reflexes.  The  core  body  temperature  was  maintained  at  37  ±  0.5°C  using  a  feedback‐controlled  heating  blanket.  A  lubricated rectal probe was gently inserted about 1 cm into the rectum and used to monitor  the body temperature throughout the experiment.    Enrofloxacin (5 mg/kg, i.m.) was administered and lubricating ophthalmic ointment  (Lacrilube®) was applied to the eyes to prevent corneal drying. The ointment was re‐applied  as  needed  throughout  the  experiment.  Warm,  lactated  Ringer’s  solution  was  administered  as a continuous drip (10 mL/kg/h) for the entire length of the experiment through a 24 or 26  gauge  “over  the  needle”  catheter  placed  in  the  lateral  tail  vein.  The  drip  rate  was  intermittently  checked  throughout  the  experiment.  The  flow  of  the  Lactated  Ringer’s  solution was adjusted as needed to compensate for bleeding during surgical manipulations.  The  portion  of  the  tail,  where  the  intravenous  (i.v.)  catheter  was  inserted  was  checked  periodically  to  ensure  proper  i.v.  catheterization.  The  skin  overlying  the  neck,  left  thigh,  back, and head was shaved for surgical manipulations. The shaved skin was disinfected by  serial  application  of  the disinfectants  in  the  following  order:  chlorhexidine  (4%),  isopropyl  alcohol  (70%),  and  povidone  iodine.  Ampicillin  sodium  (33  mg/kg,  slow  i.v.)  and  dexamethasone  (0.6  mg/kg,  slow  i.v.)  were  slowly  administered  through  the  i.v.  catheter.  Heart  rate,  blood  oxygen  levels,  and  end  tidal  CO2  were  continuously  monitored  with  a  pulse oximeter/capnograph (SurgiVet™; Harvard Apparatus, Holliston, MA). The heart rate,      17    Materials and Methods  oxygen  saturation,  end‐tidal  CO2,  and  core  body  temperature  were  kept  within  normal  physiological limits at all times.    2.1.2. Tracheotomy   When  the  animal  was  in  a  surgical  plane  of  anesthesia,  as  confirmed  by  the  absence  of  a  pinch reflex, a partial tracheotomy was performed to allow intubation with an endotracheal  tube. First, a vertical midline incision was made in the shaved skin of the ventral aspect of  the neck. The subcutaneous tissue and sternohyoideus muscles were longitudinally split by  blunt  dissection  and  held  apart  using  a  self‐retaining  retractor  to  expose  the  underlying  trachea. The trachea was carefully dissected from the underlying connective tissue. A partial  transverse incision was made between two tracheal rings rostral to the ring where the suture  threads were tied.  A custom made plastic cannula (ID: 0.05ʺ OD: 0.09ʺ), with a beveled end  was used for tracheal intubation. The beveled end of the cannula was quickly but carefully  inserted through the incision into the trachea. The other end of the cannula was connected  to a mechanical respirator (Inspira; Harvard Apparatus, Holliston, MA) using a Y connector.  The endotracheal tube was secured with sutures placed distal and proximal to the tracheal  incision. The rat was then mechanically ventilated by the respirator after tracheal intubation  for  the  entire  length  of  the  experiment.  Once  the  artificial  ventilation  was  started,  the  isoflurane  level  was  adjusted  between  2  ‐  2.25%,  depending  on  the  depth  of  anesthesia  required  to  complete  the  remaining  surgery.  The  respiration  rate  was  set  between  65‐72  breaths/min. After tracheal intubation, the animal was closely observed for chest expansion.  Blood  oxygen  saturation  as  well  as  an  end  tidal  CO2  readings  between  1.5%  and  2%  were     18    Materials and Methods  maintained  at  all  times  throughout  the  experiment  by  adjusting  the  tidal  volume  and  the  respiration  rate  functions  of  the  ventilator.  Once  the  rat  was  stabilized  after  tracheal  intubation, the neck incision was closed using tissue adhesive (Vetbond™; 3M Animal Care  Products, St. Paul, MN). Thereafter, level of anesthesia was checked by observing heart rate,  absence of toe and tail pinch reflexes as well as the eye blink responses.   2.1.3. Sciatic and Sural Nerve Surgery   Following tracheal intubation procedures, the animal was placed on its right side to expose  the left sciatic and sural nerves. An incision was made in the shaved skin along the length of  the  femur.  The  skin  around  the  incision  was  carefully  separated  from  the  underlying  connective  tissue  and  fascia.  This  was  followed  by  blunt  dissection  of  the  biceps  femoris  muscles, caudal to the femur to expose the sciatic nerve. Once the sciatic nerve was visible,  the  dissection  was  continued  along  the  gastrocnemius  muscle  and  the  sciatic  nerve  to  expose  the  sural  nerve.  Both  the  nerves  were  carefully  freed  from  the  connective  tissue  in  the popliteal fossa. The incision was irrigated with sterile saline, packed with saline‐soaked  gauze, and closed with the tissue adhesive until the end of the thoracolumbar laminectomy.    2.1.4. Thoracolumbar Laminectomy   After peripheral nerve surgery, the animal was placed in prone position. A thoracolumbar  laminectomy  was  then  performed  to  expose  the  spinal  cord  between  the  T13  and  L1  segments.  The  T13  segment  was  identified  by  first  palpating  the  last  floating  rib  at  the  T13  vertebra. Once the T13 vertebra was identified and marked, a midline incision in the shaved      19    Materials and Methods  skin  of  the  back  was  made  along  length  from  T12  to  L2  vertebrae.  The  adhering  fascia  was  gently separated from the underlying muscles. Paraspinal incisions were made on the either  side of the vertebral column through the muscle layer to the bones extending from T12 to L2  vertebrae.  The  paravertebral  muscles  and  the  underlying  connective  tissue  were  carefully  dissected from the vertebrae. Then the intervertebral space between L1 and L2 vertebrae was  identified.  A  dorsal  laminectomy  was  performed  using  microrongeurs,  starting  from  the  caudal part of the L1 vertebra to the rostral part of the T13 vertebra. Extreme care was taken  to  avoid  damaging  the  underlying  spinal  cord.    After  completion  of  laminectomy,  the  exposed  spinal  segments  were  covered  with  a  piece  of  sterile  calcium  alginate  dressing  (Curasorb™),  soaked  in  sterile  saline.  The  incision  was  temporarily  closed  with  tissue  adhesive.    2.1.5. Craniotomy   Following laminectomy procedures, the rat was placed in a stereotaxic frame (Kopf® 1430;  David  Kopf  Instruments,  Tujunga,  CA).  The  head  of  the  rat  was  secured  firmly  to  the  stereotaxic frame with ear bars and a palate bar. A midline incision was made in the scalp  from  the  frontal  bone  to  the  atlanto‐occipital  junction  to  expose  the  calvarium.  The  calvarium was exposed and partially etched with 35% phosphoric acid to clearly reveal the  bregma  (intersection  of  coronal  and  sagittal  sutures)  and  lambda.  The  head  was  firmly  secured in a stereotaxic zero position. Two bilateral trephinations were made in the frontal  bones  to  fix  screws  for  recording  the  cortical  EEG.  A  unilateral  trephination  (~1  mm  diameter) was made in the parietal bone, contralateral to the site of sciatic nerve surgery for     20    Materials and Methods  introducing  a  microelectrode  into  the  ventral  posterior  lateral  (VPL)  nucleus  of  the  thalamus. Finally, two trephinations were also made bilaterally along the central suture in  the left and right parietal bones for insertion of microinjection probes into the mesopontine  tegmentum  anesthesia  area  (MPTA).  After  completion  of  surgical  manipulations,  all  the  exposed nerve tissues were covered with warm mineral oil to prevent dehydration.   2.1.6. T13‐L1 Vertebral Immobilization Procedures   Following  craniotomy  procedures,  the  laminectomy  site  was  carefully  re‐opened.  The  T12  and L2 vertebrae were tightly secured by two spinal clamps, which in turn, were anchored  to  the  stereotaxic  frame,  so  that  the  exposed  spinal  segment  was  fixed  between  the  two  clamps. The clamps were adjusted so that the spinal cord was held level to the frame with  no  visible  respiration‐induced  movements.  A  recording  well  was  constructed  around  the  exposed spinal segments using denture repair acrylic. The dura of the exposed spinal cord  was gently incised and reflected away from the recording site. The spinal cord was covered  with a small pool of warm mineral oil.   The  incision  site  of  peripheral  nerve  dissection  was  also  re‐opened.  The  skin  flaps  surrounding  the  incision  were  used  to  form  a  pool  to  contain  warm,  sterile  mineral  oil  bathing  the  exposed  sciatic  and  sural  nerves.  Both  these  nerves  were  carefully  draped  on  small bipolar hook electrodes to synaptically activate recorded STT neurons.            21    Materials and Methods   2.2. EXTRACELLULAR RECORDING PROCEDURES   2.2.1. Antidromic Identification of Spinothalamic Tract (STT) Neurons   The experimental setup scheme for extracellular recording and intracerebral microinjections  procedures  is  depicted  in  Figure  2.1.  A  Parylene‐C®  insulated  monopolar  tungsten  microelectrode  (Catalog  #  573500,  Length:  76  mm,  Diameter:  250 μm,  2  MΩ  AC,  A‐M  Systems, Inc., Sequim, WA), secured to a three axis micromanipulator (Kopf® 1460‐61, David  Kopf Instruments, Tujunga, CA), was directed into the VPL nucleus of thalamus using the  following stereotaxic coordinates: AP: ‐3.0 to –3.5 mm from bregma, ML: 3.0 to 3.3 mm from  the midline, and DV: 5.5 to 7 mm from the dorsal surface of the brain (Palecek et al., 1992;  Paxinos and Watson, 2007). This electrode was used as the antidromic stimulating electrode  for  “backfiring”  STT  neurons.  A  second  monopolar  tungsten  microelectrode,  held  by  a  hydraulic micropositioner (Kopf® 650, David Kopf Instruments, Tujunga, CA), was used for  recording the spike activity of L1 spinal neurons.    At the beginning of each recording session, both the thalamic stimulation as well as  the  spinal  recording  microelectrodes  were  checked  under  a  microscope  to  ensure  that  electrode  tip  was  perfectly  formed  according  to  the  manufacturer  specifications.  If  the  tip  was even slightly bent, a fresh electrode was used. Care was taken that both the stimulating  and  recording  electrodes  were  held  vertically  straight  against  two  planes  of  the  micropositioner.       22    Materials and Methods  For  antidromic  identification  of  lumbar  STT  neurons,  a  systematic  search  of  the  exposed spinal segment was carried out. Initially, the stimulation electrode was positioned  in  the  thalamus  at  the  following  stereotaxic  coordinates:  AP:  ‐3.25  mm,  ML:  3.15  mm  and  DV: 6 mm (references: bregma and dorsal surface of the brain). The “zero” position of the  spinal  recording  electrode  was  adjusted  so  that  the  tip  of  the  electrode  just  touched  the  surface  of  the  exposed  spinal  cord  close  to  the  midline  and  contralateral  to  the  thalamic  stimulation site.    For  antidromic  identification  of  STT  neurons,  low‐intensity  search  stimuli  (0.2  ms,  0.67  Hz,  200‐300  μA)  were  continuously  delivered  to  the  VPL  nucleus  through  the  stimulating electrode while searching the spinal gray matter for the antidromically activated  spikes. While applying search stimuli to the VPL, the recording microelectrode was slowly  lowered  in  5 μm  increments  into  the  exposed  spinal  segment.  The  dorsal‐ventral  advancement of the recording electrode into the spinal cord was controlled using the Kopf®  650 hydraulic micropositioner. Care was taken not to cause spinal cord compression during  the  electrode  descent.  The  microelectrode  was  gradually  lowered  to  a  maximum  depth  of  1800 μm below the dorsal surface of the spinal cord as indicated on the digital display of the  microdrive device. If no antidromic spike was detected, the electrode was slowly retracted  while searching again for an antidromically propagated spike.    The  spinal  cord  segment  was  systematically  explored  in  grid‐like  fashions  from  a  caudal to rostral direction at 0.5 mm inter‐tract distance. This was carried also out in vertical  tracts,  0.5  mm  lateral  from  each  other  starting  at  the  midline.  Antidromic  spikes  were      23    Materials and Methods  usually  encountered  when  such  tracking  procedures  were  performed  in  each  anesthetized  rat  preparation.  When  an  antidromically  activated  spike  was  encountered,  the  recording  electrode was moved slowly up or down in 2.5 μm increments until a maximum antidromic  spike  amplitude  was  obtained  (a  minimum  signal‐to‐noise  ratio  of  3:1).  The  depth  of  the  recording electrode corresponding to the maximum antidromic spike amplitude relative to  the  surface  of  the  spinal  cord  was  recorded  as  that  depth  reading  indicated  on  the  digital  display of the micropositioner.    The  following  criteria  were  used  for  demonstrating  antidromic  activation  of  STT  neurons from VPL nucleus: 1. spike responses with a constant antidromic latency (< 0.2 mm  variability)  as measured  from the  beginning  of  the stimulus  artifact  to  the initiation  of the  antidromic action potential, 2. ability of the STT cell to respond faithfully to short trains (2 ‐  3)  of  high‐frequency  stimuli  (300‐500  Hz),  and  3.  a  collision  between  orthodromic  and  antidromically generated action potentials during a critical interval (Lipski, 1981; Palecek et  al.,  1992;  Soja  et  al.,  1995).  Each  neuron  meeting  all  of  the  above  criteria  was  therefore  identified  as  a  STT  neuron  and  selected  for  further  study  of  the  electrophysiological  parameters (Lipski, 1981; Palecek et al., 1992; Soja et al., 1995).   2.2.2. Electroencephalogram    The  cortical  electroencephalogram  (EEG)  was  continuously  monitored  and  recorded  throughout  the  experiment  using  standard  amplifier  (Model  79,  Grass  Instrument  Co,  Quincy, MA). The EEG was used as an adjuvant to verify the surgical plane of anesthesia.      24    Materials and Methods  The  filters  on  the  recording  amplifier  were  set  between  10  Hz  and  3  kHz  (half‐amplitude  attenuation). A 60 Hz notch filter was used.   2.2.3. Spike Amplification, Recording and Data Acquisition Procedures    The extracellular spike activity of the STT cell was recorded by passing the signal recording  from  the  microelectrode  through  a  high‐impedance  probe  and  a  60  Hz  noise  eliminator  (Hum  Bug,  Quest  Scientific  Instruments  Inc.,  North  Vancouver,  BC).  The  signal  was  then  amplified  (x10000)  and  filtered  (band‐pass:  100  –  10,  000  Hz)  using  an  AC‐coupled  differential  amplifier  (Model  1800,  A‐M  Systems,  Inc.,  Sequim,  WA).  The  amplified  signal  was then routed to an oscilloscope (Model D11, Tektronix, Inc., Beaverton, OR) as well as to  a spike processor (Model D130, Digitimer Ltd., Hertfordshire, UK), which was set to detect  only  the  STT  action  potential  waveforms.  The  amplified  and  filtered  STT  spike  activity  as  well  as  the  EEG  signals  were  recorded  and  digitized  “on‐line”  into  separate  waveform  channels  using  a  Pentium  4  computer  equipped  with  spike  acquisition  and  analysis  software  (Spike2®,  v  5;  Cambridge  Electronics  Design  Limited,  Cambridge,  UK)  and  hardware  (Power  1401  Plus,  Cambridge  Electronics  Design  Limited,  Cambridge,  UK).  The  sampling rates for the spike wave data and EEG were 20 kHz and 100 Hz, respectively. Data  files  of  each  STT  neuron  recording  were  stored  on  a  data  server  for  subsequent  off‐line  analysis using specialized subroutine scripts.            25    Materials and Methods   2.2.4. Baseline Electrophysiological Recording Procedures   Once  the  STT  cell  identification  was  confirmed  and  spike  amplitude  maximized,  the  thalamic stimulating microelectrode was fixed and held in the position by carefully gluing it  to  the  surrounding  cranium  with  denture  acrylic.  After  the  acrylic  cured,  the  micromanipulator holding the stimulating electrode was carefully removed. This procedure  was necessary to allow sufficient room on the anterior‐posterior rails of the Kopf stereotaxic  frame  for  two  additional  micromanipulators  required  for  holding  the  microinjection  cannulae. The STT recorded cell activity was allowed to stabilize for about 20‐30 min before  recording  of  the  baseline  electrophysiological  parameters.  Here,  the  isoflurane  levels  were  first reduced to the lowest possible levels (1.5 ‐ 1.75 %) so that the rat was still maintained at  a steady plane of surgical anesthesia as confirmed by the EEG and absence of corneal and  pinch reflexes. Initially, the depth of recording, stimulation threshold and latency of the STT  cell  were  measured.  The  threshold  intensity  (T)  of  the  cell  was  defined  as  the  minimum  stimulus  intensity  (0.2  ms  pulse  duration)  required  for  evoking  an  antidromic  action  potential. The electrophysiological parameters recorded during the experimental procedure  are described below.    2.2.4.1. Spontaneous Spike Activity   The ongoing spontaneous spike activity of STT cell was recorded for a minimum of 15 min.  The spontaneous spike activity was analyzed further with computer software (Spike2®, v 5,  Cambridge  Electronics  Design  Limited,  Cambridge,  UK).  A  subroutine  was  employed  to      26    Materials and Methods  sort  the  spike  templates  to  ensure  that  the  spike  activity  of  the  same  STT  neuron  was  recorded  throughout  the  experiment.  The  average  spontaneous  spike  rate  for  each  STT  neuron was calculated using 2 min epochs of the spike activity before and at specified time  intervals after intracerebral microinjections of PB/Vh.  Interspike  interval  histograms  (ISIH)  were  plotted  for  the  same  2  min  epochs  used  for  the  spike  activity  before  and  after  microinjections. To describe the interspike interval data the following statistical parameters  were  calculated  automatically  by  Spike2®  using  custom‐made  scripts:  median  interval,  coefficient  of  variation  (CV;  CV  =  standard  deviation/mean  interval),  and  coefficient  of  dispersion (CD; CD = variance/median interval). These later parameters were used to study  the  spike  patterns  and  potential  changes  in  rhythmic  firing  properties  of  STT  neurons  (Cocatre‐Zilgien and Delcomyn, 1992; Soja et al., 1996). A paired Student’s t test was used to  compare  the  group  mean  values  of  spontaneous  spike  activity  at  each  time  point  after  microinjection  with  the  baseline  spontaneous  activity  as  well  as  the  other  aforementioned  parameters (interspike interval, CD, CV etc.) with the respective baseline values. A value of  p ≤ 0.05 was considered to be statistically significant.   2.2.4.2. Antidromic Firing Index   To  determine  the  baseline  firing  index  (FI),  triple  pulse  stimuli  (train  width:  2  ms)  at  threshold intensity were applied to the VPL. The interstimulus interval was kept at 1.5 s. A  total of 100 consecutive antidromic stimuli were applied to the VPL nucleus. This was done  to compensate for the absence of antidromic spikes due to their collision with spontaneously  occurring orthodromically propagating spikes. The FI was expressed as a ratio of antidromic     27    Materials and Methods  spikes/75  stimulus  trials  corrected  for  any  spontaneous  collisions  using  the  following  equation (Lloyd and McIntyre, 1955).    Firing Index (FI) = (Number of antidromic spikes / number of stimulus trials) x 100   A paired Student’s t test was used to compare the group mean FI for all STT neurons  tested at each time  point after microinjection (discussed  further)  against  the baseline  FI. A  value of p ≤ 0.05 was considered to be statistically significant.   2.2.4.3. Peripheral Nerve Stimulation‐Evoked STT Responses    Stimulation of the sciatic nerve at the intensities used during the control and test paradigms  produces  a  robust  twitch  in  the  hindlimb,  which  can  disturb  the  position  of  the  recording  electrode  in  the  spinal  cord.  Hence,  before  the  recording  of  sciatic  and  sural  nerve  stimulation‐evoked STT responses, the rat was paralyzed by a single dose of pancuronium  bromide  (0.03  ‐  0.3  mg/kg,  i.v.).  The  dose  of  pancuronium  was  repeated  as  required  throughout  the  experiment.  The  sciatic  and  sural  nerves  were  stimulated;  one  nerve  at  a  time,  with  single  shock  stimuli  (0.1  ms,  0.67  Hz)  delivered  through  the  hook  electrodes  placed  on  them.  Initially,  the  threshold  intensity  (T)  for  stimulation  for  each  nerve  was  determined  as  the  minimum  intensity  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic action potentials (Soja et al., 1993; Soja et al., 1995). The peripheral nerves were  then  stimulated  at  the  intensities  of  2T  to  3T  for  52  consecutive  trials.  The  evoked  STT  neuron spike responses of 50 trials were analyzed with specialized software.      28    Materials and Methods  Post‐stimulus  time  histograms  (PSTH)  were  generated  with  Spike2®  software  to  quantitatively  assess  the  sciatic  and  sural  nerve  stimulation‐evoked  responses  of  the  STT  neurons.  Here,  PSTHs  (bin  width:  0.5  ms)  were  constructed  from  50  stimulation  trials  applied to each of the nerves. A baseline response PSTH as well as PSTH at the four post‐ microinjection time points were constructed. A Spike2® subroutine was used to measure the  average  response  magnitude  (mean  number  of spikes/trial) and  response  latency  (ms) and  from  the  user‐defined  epochs  of  the  PSTHs.  The  response  magnitude  as  well  as  response  latency  for  each  nerve  at  each  post‐microinjection  time  point  (discussed  further)  were  compared with the corresponding baseline values with a paired Student’s t test. A value of p  ≤ 0.05 was considered to be statistically significant.   To  determine  if  microinjections  of  Vh/PB  changed  the  presynaptic  afferent  input,  afferent  volleys  from  both  the  sural  as  well  as  sciatic  nerves  were  studied  using  peak‐to‐ trough  amplitude  analysis.  Peak‐trough  amplitudes  of  afferent  volleys  before  and  after  microinjections  were  compared  with  a  paired  Student’s  t  test.  A  value  of  p  ≤  0.05  was  considered to be statistically significant.      2.3. DRUG AND CONTROL SOLUTIONS   Pentobarbital sodium (Dumex Medical Surgical Products Ltd., Pickering, ON, Canada) was  generously provided by Dr. Ernest Puil (Professor Emeritus, Department of Anesthesiology,  Pharmacology  and  Therapeutics,  University  of  British  Columbia).  Pentobarbital  (PB)  was  carefully weighed and dissolved in a vehicle composed of 10% ethanol and 20% propylene     29    Materials and Methods  glycol  (Sigma‐Aldrich  Inc.,  St  Louis,  MO)    in  water  to  make  a  final  concentration  of  200  μg/μL (800 nM) (Devor and Zalkind, 2001). PB‐free vehicle was used as control. Both PB and  vehicle control solution (Vh) were filtered through a 0.2 μm Millipore filter prior to use. In  pilot  experiments,  it  was  observed  that  the  pH  of  the  final  drug  solution  and  drug‐free  vehicle  remained  between  6.9  and  7.2  in  corroboration  with  Devor  and  Zalkind  (2001).  Hence,  no  pH  adjustments  were  made.  Once  prepared,  the  drug  solution  remained  stable  without visible crystal formation at room temperature for one week. Hence the same drug  solution  was  used  in  the  experiments  that  were  conducted  in  the  same  week.  However,  if  any  precipitate  was  observed,  the  drug  solution  was  discarded  and  a  fresh  solution  was  made.   2.4. INTRACEREBRAL MICROINJECTIONS PROCEDURE   Once all the baseline parameters of STT neurons were determined, microinjections of either  PB or Vh were performed. The detailed procedure used for the microinjections is as follows:    Two  custom  length  (~  5.5  cm)  hypodermic  stainless  steel  (SS)  tubes  (Catalog  #  832400,  regular  wall,  29‐gauge,  ID:  0.0065”,  OD:  0.013”,  A‐M  Systems,  Inc.,  Sequim,  WA)  were used as cannulae for the microinjections of PB and/or Vh into the MPTA (Figure 2.2).  One end of each SS cannula was attached and glued to a polyethylene tube (Intramedic™ PE  20; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) which, in turn, was attached to a syringe  containing saline. Each SS cannula was firmly fastened to a micromanipulator (Kopf® 1460‐ 61, David Kopf Instruments, Tujunga, CA). The two micromanipulators were anchored, one  on each of the two anterior‐posterior rails of the Kopf® stereotaxic frame.      30    Materials and Methods  Before  each  experiment,  each  cannula  was  visually  confirmed  to  be  straight  when  held in a vertical position perpendicular to the micromanipulator. Initially, the PE tubes and  SS  cannulae  were  completely  filled  with  saline.  A  small  volume  of  air  was,  then  drawn  through the SS cannulae to form a small bubble in each of the two PE tubes. According to  the protocol, a sufficient quantity of either PB or Vh was then gently drawn into each of the  PE tubes via the SS cannulae so that the PB/Vh and saline were separated by the air bubble.  The  syringe  plungers  were  gently  pushed  forward  to  ensure  complete  filling  of  the  SS  cannulae.  The  initial  positions  of  the  bubbles  in  both  the  tubes  were  marked.  The  bubbles  were used for dual purposes: to ensure that the PB/Vh was actually being injected into the  brain and to measure the volume injected.    The  SS  cannulae  were  gently  lowered  bilaterally  into  the  brain  toward  the  MPTA  using the following stereotaxic coordinates: ‐7.2 to ‐8.0 mm posterior to bregma, ± 1.1 to 1.2  mm lateral to the midline and 7.0 to 7.5 mm ventral to the surface of the brain (Devor and  Zalkind, 2001; Voss et al., 2005; Paxinos and Watson, 2007). Extreme care was taken to avoid  brain compression while lowering the cannulae. On occasions, bleeding was observed at the  onset  of  cannulae  lowering.  On  such  occasions,  the  probes  were  slowly  taken  out  and  the  trephination  sites were bathed with a  small amount  of epinephrine  (1  mg/mL) to  facilitate  hemostasis.  Once  the  bleeding  subsided,  the  trephination  sites  were  rinsed  with  sterile  saline and the cannulae were then carefully lowered into the brain.   A  total  volume  of  1 μL/side  of  PB/Vh  was  slowly  injected  bilaterally  using  a  calibrated  syringe  infusion  pump  (Model  22,  Harvard  Apparatus,  South  Natick,  MA).  The      31    Materials and Methods  injection  into  the  MPTA  was  confirmed  by  measuring  the  displacement  of  the  bubble  through  a  pre‐calibrated  distance.  The  microinjection  cannulae  were  left  in  place  for  15‐30  min  after  completion  of  the  injections  to  avoid  backtracking  of  the  injection  fluid  into  the  probe trajectory (Devor and Zalkind, 2001).       2.5. DRUG/VEHICLE CONTROL‐RESPONSE STUDIES   All  the  STT  neurons  reported  in  this  thesis  were  randomly  selected  for  three  kinds  of  treatment  protocols.  In  the  first  protocol,  the  electrophysiological  parameters  of  the  identified  STT  neurons  were  recorded  to  establish  control  baseline  activity.  Then,  Vh  (1 μL/side)  was  microinjected  bilaterally  into  the  MPTA.  The  same  parameters  of  the  STT  neurons were then measured  at  pre‐determined  time  intervals  (described  further).  Each  of  the  STT  neuron  parameter  values  at  each  time  interval  was  then  compared  with  their  corresponding baseline values.    In  the  second  treatment  protocol,  the  electrophysiological  parameters  of  identified  STT neurons were recorded to establish a control baseline first. Then, 1 μL of PB ( 200 μg/μL)  was  injected  into  each  side  of  the  MPTA.  The  same  parameters  of  the  STT  neurons  were  then measured at pre‐determined time intervals (described further).    In  the  third  protocol,  the  electrophysiological  parameters  of  STT  neurons  were  assessed  first  with  the  microinjections  of  Vh  followed  by  PB  microinjections.  A  recovery  period of at least 1 hr occurred between the microinjections of Vh and PB.      32    Materials and Methods     In  this  study,  temporal  responses  of  the  STT  neurons  after  PB  and/or  Vh   microinjection were recorded. The time at which bilateral microinjections of PB and/or Vh in  the  MPTA  were  completed  was  considered  as  time  zero.  After  completion  of  the  microinjections,  each  electrophysiological  parameter  was  measured  and  recorded  in  the  following sequence:   a. The spontaneous firing rate (SFR) of the STT neuron was recorded at the time intervals of        2, 15, 30, and 60 min after completion of the microinjections.   b. The antidromic firing index (FI) of the STT neuron was determined at the time intervals        of 3, 16, 31, and 61 minutes after completion of the microinjections.   c. The sural nerve stimulation‐evoked STT responses (Su‐ER) were recorded at the time        intervals of 3.5, 16.5, 31.5, and 61.5 min after completion of the microinjections.   d. The sciatic nerve stimulation‐evoked STT responses (Sc‐ER) were recorded at the time        intervals of 4.5, 17.5, 32.5, and 62.5 min after the microinjections.   The time periods during which the actions of PB would be expected to occur, were  derived from the results obtained from the preliminary studies and those from Devor and  Zalkind (2001).   The procedural steps in the recording and microinjection study are summarized the  Figure 2.3.      33    Materials and Methods   2.6. BRAIN PERFUSION AND HISTOLOGY   To verify that the microinjections were in the MPTA, at the end of all recording procedures  1 μL of a 2% solution of pontamine blue dye in 4M NaCl was bilaterally microinjected in the  same location as that of Vh/PB microinjections. The distance between thalamic stimulation  electrode  and  spinal  recording  electrode  was  measured  for  calculation  of  the  conduction  velocity (m/s) of the STT neuron. One hour after the microinjections of the dye, the animal  was prepared for perfusion. All the electrodes were removed and the animal was removed  from  the  setup  while  still  being  mechanically  ventilated  and  anesthetized.  The  isoflurane  level  was  deepened  to  3‐5%.  The  animal  was  placed  in  a  dorsal  recumbent  position  in  a  shallow tray.    A midline incision was made over the length of the sternum and a sternotomy was  performed  to  allow  access  to  the  heart.  Self‐retaining  retractors  were  used  to  hold  the  sternum open. The pericardium was incised to expose the heart. An i.v. administration line  was attached to an i.v. fluid bag containing cold 4% paraformaldehyde. A 16 G x 1” needle  was attached to the other end of the administration line. The needle was carefully inserted  into the left ventricle of the beating heart and directed towards the aorta. The right atrium  was incised and the rat was perfused with the paraformaldehyde solution with the flow rate  of  1  drop/s.  When  all  cardiac  activity  ceased,  the  ventilator  was  turned  off  and  anesthesia  delivery  was  terminated.  The  paraformaldehyde  flow  was  maintained  until  the  fluid  draining from the right atrium was clear.       34    Materials and Methods  The brain was carefully removed and placed in cold 4% paraformaldehyde and post‐ fixed for at least 24 hours before histological processing. For histological analysis, the brain  was  washed  under  a  slow  and  continuous  stream  of  water  to  wash  off  any  residual  paraformaldehyde.  Serial  coronal  sections  (40‐50 μm)  of  the  brain  were  then  made  with  a  microtome  (Vibratome®  1000  Classic)  as  free  floating  slices  in  phosphate‐buffered  saline  (PBS).  The  slices  were  then  counterstained  with  hematoxylin  QS  nuclear  counterstain  (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). The slices were finally washed with water and  fixed on microscopy slides for further microscopic analysis. To locate the dye microinjection  sites, the entire brain sections were digitally scanned using a ScanScope®CS scanner system  (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA) at 40X magnification.                                   35    Materials and Methods        Figure 2.1 Schematic of the experimental setup for extracellular recording of STT neurons  and  intracerebral  microinjections  of  pentobarbital  and/or  vehicle  control  solutions  into  the  MPTA.  In  this  figure,  drawings  of  transverse  sections  of  thalamus,  pons  and  lumbosacral  spinal cord are shown. A Parylene‐C® insulated monopolar tungsten electrode (S) directed  towards the ventral posterior  lateral (VPL) nucleus of thalamus, contralateral to the sciatic  (Sc)  and  sural  (Su)  nerve  stimulation  site,  was  used  to  antidromically  activate  a  spinothalamic tract (STT) neuron. The excitability of a STT neuron within the spinal dorsal  horn  was  recorded  through  another  Parylene‐C®  insulated  monopolar  tungsten  electrode  (R).  The  identified  STT  neuron  was  synaptically  activated  by  two  bipolar  hook  electrodes  placed on sciatic (Sc) and sural (Su) nerves. The sensory nerve bundles of the sciatic nerve  are  shown  in  continuity  with  the  dorsal  root  ganglion  (DRG).  The  central  branch  of  the  DRG,  the  primary  afferent  neuron  makes  oligosynpatic  connections  with  the  STT  neuron  within the L1 spinal cord dorsal horn. The output from the recording electrode is routed to  an  amplifier  (A),  a  window  discriminator  (WD)  and  spike  acquisition  hardware  (Power  1401)  and  software  (Spike2®)  and  stored  on  a  computer  PC).  Two  microinjection  cannulae  (MIC)  directed  bilaterally  into  the  mesopontine  tegmental  anesthesia  area  (MPTA)  in  the  pons  were  used  for  PB/Vh  microinjections.  The  PB  and/or  Vh  solutions  were  injected  through the MIC by a microinjection pump.     36    Materials and Methods      D  A B  C  cm      Figure  2.2  Photograph  of  microinjection  cannula  system  used  for  intracerebral  microinjections  of  pentobarbital/vehicle  control  solutions.  The  cannula  consisted  of  a  custom‐made 29‐gauge hypodermic regular wall hypodermic stainless steel tube (A) cut to a  length of ~ 5.5 cm. The microinjection cannula was passed through and glued to another 27‐ gauge hypodermic stainless steel tube (B) cut to a length of ~ 2.5 cm. The outer tube, which  also  provided  the  structural  strength  to  the  cannula,  was  attached  to  a  polyethylene  tube  (C).  The  polyethylene  tube,  in  turn  was  attached  to  a  syringe  (not  shown)  placed  in  a  microinjection pump (not shown). The probe was held to a Kopf® microelectrode holder (D).        37    Materials and Methods           Antidromic  identification of STT  neuron            Baseline recording of  electrophysiological  parameters of STT neuron             Microinjections of PB/Vh into MPTA          Recording of electrophysiological      parameters at 2, 15, 30 and 60 min      following microinjections          Brain histology        Figure 2.3 Flowchart  of  the  steps  involved  in  electrophysiological  parameter  recording  of  STT neuron and microinjections procedures.  PB – Pentobarbital, Vh – vehicle control solution     38    Results   CHAPTER 3  RESULTS    The results of the present study are described in the three major partitions as follows.   1. General characteristics of the spinothalamic tract (STT) neurons  In this partition the general characteristics of STT neurons are described.   2. Studies of electrophysiological parameters of STT neurons    This  partition  is  divided  into  three  sub‐sections:  In  the  first  section,  the  baseline  properties of the three electrophysiological parameters; the spontaneous firing rate, the  antidromic  firing  index,  and  the  peripheral  (sural  and  sciatic)  nerve‐evoked  STT  responses,  are  reported.  In  the  second  sub‐section,  the  results  of  effects  of  bilateral  microinjections  of  the  control  vehicle  solution  on  the  aforementioned  properties  are  described.  In  the  third  sub‐section,  the  results  of  effects  of  bilateral  microinjections  of  pentobarbital are described.   3. Histological studies   In  the  last  partition,  histological  results  of  the  microinjection  sites  in  the  MPTA  are  reported.    All  values  reported  in  this  results  chapter  are  expressed  as  group  mean  (±  SEM)  unless  otherwise noted.      39    Results   3.1. SPINOTHALAMIC TRACT NEURONS: GENERAL CHARACTERISTICS   A  total  of  18  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  in  18  rats  (one  neuron/rat)  were  recorded  extracellularly from the L1 spinal segment using the standard electrophysiological recording  techniques.  Each  of  the  18  extracellularly  recorded  STT  neurons  fulfilled  three  standard  antidromic  criteria  namely,  an  invariable  latency,  high  frequency  following,  and  collision  between  the  antidromically  and  orthodromically  propagating  action  potentials  (see  Materials  and  Methods  section).  An  example  of  a  STT  neuron  meeting  all  three  criteria  of  antidromicity is shown in the Figure 3.1.    Figure  3.1A  shows  four  superimposed  traces  of  single  antidromic  stimuli  with  the  corresponding  antidromic  action  potentials.  As  can  be  seen  in  this  figure,  the  antidromic  action potentials appear with the same latency after each antidromic stimulus without any  “jitter”.  If  a  chemical  synapse  was  involved  between  the  stimulating  and  the  recording  electrodes, the antidromic latency would not be constant and the antidromic spikes would  not be superimposable.    Figure  3.1B  shows  the  second  criterion,  i.e.,  high‐frequency  following  of  the  same  STT neuron. In this case, short trains of high‐frequency antidromic stimuli were applied to  the thalamic electrode. Each train was applied at 1.5 s intervals. The total train width was 9  ms  and  the  inter‐pulse  interval  within  each  train  was  3  ms.  Thus,  the  frequency  of  antidromic stimuli was 333 Hz. If a chemical synapse was involved, it would act as a low‐ pass filter (Lipski, 1981), and synaptic transmission would fail at such a high frequency. This  would mean that no antidromic responses could be recorded. As can be seen in Fig. 3.1B, the     40    Results  STT  neuron  faithfully  followed  the  high‐frequency  stimuli  applied  to  the  thalamus  indicating  that  the  antidromic  action  potentials  were  recorded  very  close  to  the  soma  and  that  no  synapse  was  involved.  The  STT  neurons  reported  in  this  thesis  were  successfully  stimulated using frequencies ranging from 333 Hz to 1.5 kHz, indicating a high safety factor  (Lipski, 1981).    The third and the most robust criterion for antidromicity was collision between the  antidromically and orthodromically propagating action potentials, as depicted in the Figure  3.3C.  If  an  antidromic  stimulus  was  applied  at  an  interval  shorter  than  a  period  of  occurrence of the orthodromic spike, called the critical delay (Lipski, 1981), the antidromic  and  orthodromic  spikes  “collided”  and  cancelled  each  other.  As  a  result,  no  antidromic  spike was recorded (*, Figure 3.1C, the lowermost trace). This phenomenon can occur only  when the stimulating and the recording electrodes are recording one and the same neuron  and  no  chemical  synapse  is  involved.  In  many  cases,  a  “collision  artifact”  was  observed,  which can often be misconstrued as a nearby STT neuron with very low spike amplitude.   All  the  antidromically  identified  STT  neurons  were  recorded  in  vertical  electrode  tracks  within  0.5  mm  lateral  from  the  midline.  The  mean  (±  SD)  recording  depth  of  all  18  STT  neurons  was  771.8  ±  396.9 μm  (range:  97  –  1528 μm)  below  the  surface  of  the  spinal  cord.  The  depths  of  thalamic  stimulating  and  spinal  recording  sites  of  STT  neurons  are  depicted in the Figure 3.2.       41    Results          Figure 3.1 Criteria used for antidromic identification of STT neuron. 1. invariant latency of  the  antidromic  spikes  evoked  by  single  pulse  stimuli  at  the  threshold  intensity  applied  to  the VPL nucleus of contralateral thalamus (A). The figure shows four superimposed sweeps  (note the absence of any “jitter” in the antidromic spike); 2. ability to follow high‐frequency  stimulation (333 Hz. 3‐pulse trains lasting 9 ms) applied at stimulus trigger (S) shown at the  bottom (B) and 3. collision (*) of antidromically propagating spikes from the thalamus with  spontaneous, orthodromic action potentials (C). Insets shown in each figure are voltage and  time calibration bars.     42       Figure 3.2 Schematic diagram of estimated thalamic stimulation and spinal recording sites of STT neurons recorded in isoflurane‐ anesthetized  rat  preparation.  The  estimated  antidromic  stimulation  sites  (black  filled  circles)  in  the  VPL  nucleus  of  thalamus  are  shown in the coronal section of the rat brain (A) at the level of ‐3.24 mm from Bregma (Paxinos and Watson, 2007). Figure B depicts  cross section of L1 spinal segment of rat (Grant and Koerber, 2004) showing laminae 1‐9 corresponding to the Rexed’s (1952) laminae  I‐IX. The estimated contralateral recording sites of STT neurons below the surface of spinal cord are shown with black, filled circles.    43     Results  Legend: VPL – ventral posterior lateral nucleus of the thalamus, VPM: ‐ ventral posterior medial nucleus.   Results  The group mean (± SD) antidromic latency of all 18 STT neurons, as measured from  the stimulus artifact to the onset of the antidromic  action  potential,  measured  4.4 ± 0.6  ms  (range:  3  ‐  6  ms).  The  group  mean  (±  SD)  conductin  distance,  as  estimated  by  the  post‐ mortem  measurement  of  the  separation  between  the  thalamic  stimulating  and  spinal  recording microelectrodes, measured 81.4 ± 7.6 mm (range: 60 ‐ 90 mm). This corresponds to  an axonal conduction velocity of 18.6 ± 2.5 m/s (range: 14 ‐ 23 m/s). The signal‐to‐noise ratio  of  the  antidromic  spike  of  all  the  STT  neurons  included  in  this  study  was  at  least  3:1  and  often  exceeded  4:1.  The  spike  waveform  template  of  the  STT  neurons,  as  monitored  and  recorded  within  the  computer  by  the  Spike2®  software,  did  not  change  throughout  the  length of recording. All the STT neurons included in this study could be stimulated by low‐ intensity  antidromic  stimuli  applied  to  the  thalamus.  The  mean  (±  SD)  threshold  intensity  used to “backfire” 18 STT neurons measured 341 ± 143 μA.   A statistical analysis was performed to detect if the conduction velocity of all 18 STT  neurons was correlated with their spinal recording depths. As shown in the Figure 3.3, no  correlation existed between these two parameters (r(16) = 0.07, p = 0.8, Pearson’s correlation).       3.2. STUDIES OF THE ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS   To  examine  the  supraspinal  actions  of  PB  on  the  overall  excitability  of  the  STT  neurons,  three  electrophysiological  parameters  of  STT  neurons,  namely  the  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s),  the  antidromic  firing  index  (FI)  as  well  as  sural  (Su)  and  sciatic  (Sc)  nerve  stimulation‐evoked  STT  responses  (ER)  were  measured  before  and  after  intracerebral   44   Results  bilateral microinjections of either Vh (1 μL/side) or PB, (200  μg/side). This section describes,  in detail, the results of the studies of the electrophysiological parameters of the STT neurons  before and following Vh/PB microinjections. The section is divided into two major parts: in  the first part the results of baseline data of the SFR, FI as well as Su‐ and Sc‐ER are described  followed by the results of the data collected following the Vh and/or PB microinjections in  the second part.   3.2.1.  Three  Groups of Spinothalamic  Tract Neurons  According to the Treatment  Protocol  All the STT neurons examined in this thesis comprised three groups as determined during  post‐hoc analysis with six neurons in each group: Group I, Group II, and Group III.  Group I  STT  neurons  were  treated  only  with  Vh  microinjections  while  group  II  STT  neurons  were  treated  only  with  PB  microinjections.  In  the  case  of  Group  III  STT  neurons,  after  baseline  recording,  microinjections  of  Vh  were  carried  out  and  all  the  electrophysiological  parameters  were  measured  at  2,  15,  30  and  60  min  following  Vh  microinjections.  Then,  following  a  recovery  period  of  about  an  hour  after  the  last  time  point,  PB  microinjections  were carried out and the parameters were measured at time points described above. Taken  together,  out  of  18  STT  neurons,  12  STT  neurons  were  treated  with  microinjections  of  Vh  and 12 with PB microinjections. As discussed further, there were no significant differences  in the baseline values of all the electrophysiological parameters of STT neurons among the  three groups (p > 0.05, one‐way ANOVA).    Further  details  on  the  STT  neuron  groups  and  their  treatment  protocols  are  summarized in Figure 3.4.   45   Results     Axonal Conduction Velocity (m/s)  24 22 20  r = 0.07 18 16 14 12 0  200  400  600  800  1000 1200 1400 1600 1800  Spinal Recording Depth (μm)     Figure 3.3  Correlation  between  axonal  conduction  velocity  and  spinal  recording  depth  of  STT neurons. The abouve figure depicts scatter plot of axonal conduction velocity (m/s) and  the  respective  spinal  recording  depths  (μm)  of  18  antidromically  identified  STT  neurons.  The coefficient of correlation (r) was 0.07. Note that no significant correlation exists between  the two parameters (p = 0.8, Pearson’s correlation).   46   Results     Measurement of SFR, FI, Sc‐Su ER of STT neuron         Group I (n =6)   Group II (n = 6)   Group III (n = 6)      Vh   PB   Vh      Microinjections   Microinjections   Microinjections   Recording of SFR, FI   Recording of SFR, FI   Recording of SFR, FI   and Sc‐Su ER at 2, 15,   and Sc‐Su ER at 2, 15,   and Sc‐Su ER at 2, 15,   30 and 60 min after Vh   30 and 60 min after PB   30 and 60 min after Vh  microinjections   microinjections   microinjections                Recovery period      (~ 60 min)        PB microinjections        Recording of SFR, FI and      Sc‐Su ER at 2, 15, 30 and 60  min after PB        End of the experiment     Figure 3.4 Schematic explanation of STT neurons classified into three groups based on the  treatment(s) they received.  Legend:  FI  –  firing  index,  PB  –  pentobarbital,  SFR  –  spontaneous  firing  rate,  Sc‐Su  ER  ‐  sciatic and sural nerve‐evoked responses, Vh – vehicle control solution   47   Results   3.2.2. ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS AT THE BASELINE   After  a  STT  neuron  was  isolated  and  identified,  all  the  electrophysiological  parameters  (SFR, FI, Su‐ER and Sc‐ER) were measured before the microinjections of Vh and/or PB. The  values  for  each  of  these  parameters  served  as  baseline  values  for  comparison  with  those  obtained after microinjections of Vh and/or PB.    3.2.2.1. Spontaneous Firing Rate    All  the  STT  neurons  examined  in  this  thesis  were  found  to  be  spontaneously  active.  For  determining  the  baseline  spontaneous  firing  rate  (SFR),  two  distinct  epochs  from  the  STT  spike waveform of 2 min each were selected. The SFR (in spikes/s) obtained from each of the  epochs were averaged to obtain the final baseline SFR. The SFR at the time points following  the  microinjections  were  compared  against  this  baseline  SFR.  The  group  mean  (±  SEM)  baseline  SFR  of  all  the  18  STT  neurons  was  13.1  ±  2.1  spikes/s  (range:  4  ‐  40).  The  group  mean (± SEM) baseline SFR of Group I, Group II and Group III STT neurons were 8.6 ± 2.1  spikes/s (range: 4 – 18), 11.8 ± 2.9 spikes/s (range: 5 ‐ 22), and 19 ± 4.7 spikes/s (range: 11 –  40), respectively.   A  statistical  comparison  between  the  baseline  SFR  of  the  three  groups  showed  no  significant differences (F(2, 15) = 2.7, p = 0.12, one‐way ANOVA).   To determine if baseline SFR of all 18 STT neurons depended on the depth at which  they  were  recorded,  a  Pearson’s  correlation  analysis  was  performed  between  these  two  parameters.  As  shown  in  the  Figure  3.5A  no  statistically  significant  correlation  existed   48   Results  between  these  two  parameters  (r(16)  =  0.33,  p  =  0.18,  Pearson’s  correlation).  Similarly,  the  correlation  analysis  between  the  baseline  SFR  and  axonal  conduction  velocity  of  all  the  eighteen  STT  neurons  revealed  no  significant  relationship  (Fig.  3.5B,  r  =  0.39,  p  >  0.05,  Pearson’s correlation).      3.2.2.2. Antidromic Firing Index    The group mean ± SEM baseline FI of all the 18 STT neurons was 87.9 ± 3.3 (range: 53‐100).  The group mean (± SEM) baseline FI of Group I, Group II and Group III STT neurons were  82.3  ±  6.1  (range:  63  ‐  99),  88.9  ±  7.4  (range:  53  ‐  100)  and  93.8  ±  2.1  (range:  86  ‐100),  respectively.   The baseline FI of the three groups did not differ significantly from each other (F(2,  15) = 1.04, p = 0.38, one‐way ANOVA).      3.2.2.3. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses   Of 18 STT neurons, no orthodromic responses could be elicited in 2 STT neurons  (# 7 and 8)  with  either  sural  or  sciatic  nerve  stimulation  despite  a  gradual  increase  in  the  stimulus  intensity.  In  case  of  one  STT  neuron  (#  9),  only  sural  nerve‐evoked  responses  could  be  recorded while for another STT neuron (# 11), only sciatic nerve‐evoked responses could be  recorded. Thus, sural and sciatic nerve‐evoked responses were recorded and measured in 15  of 18 STT neurons.    49   Results     A. Baseline SFR (spikes/s)  50 40 30  r = 0.33  20 10 0 0  200  400  600  800  1000 1200 1400 1600 1800  Spinal Recording Depth (μm)  B. Baseline SFR (spikes/s)  50 40 30  r = 0.39  20 10 0 0  5  10  15  Axonal conduction velocity (m/s)  20  25     Figure 3.5 Correlation of baseline spontaneous firing rate with spinal recording depth and  axonal conduction velocity of STT neurons. The graph in A depicts relationship between the  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s)  of  STT  neurons  (n  =  18)  and  their  respective  recording  depth  (μm)  within  the  spinal  gray  matter.  The  graph  in  B  shows  relationship  between  the  SFR  of  18  STT  neurons  and  their  respective  axonal  conduction  velocity  (m/s).  The lines of best fit are drawn through the points. Respective correlation coefficients (r) are  denoted  on  the  right  side  of  each  graph.  Note  that  there  was  no  significant  correlation  between these parameters (p > 0.05, Pearson’s correlation).   50   Results   3.2.2.3.1. Sural Nerve‐Evoked STT Responses   Of 18 STT  neurons recorded in  this  project, responses  of 15  STT  neurons  to  stimulation  of  sural  nerve  were  observed.  For  three  STT  neurons  (#  7,  8  and  11),  no  response  could  be  elicited with sural nerve stimulation despite a gradual increase in the stimulus intensity.   The threshold intensity for sural nerve stimulation was determined as the minimum  stimulus  intensity,  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  The  mean  (±  SEM)  threshold  intensity  for  sural  nerve  stimulation  was  1.8  ±  0.4  mA (range: 0.2 ‐ 5). A typical sural nerve stimulation‐evoked STT response is illustrated in  the Figure 3.6B.       Baseline  sural  nerve  stimulation‐evoked  responses  (Su‐ER)  of  STT  neurons  were   recorded  and  measured  before  the  microinjections.  The  baseline  group  mean  (±  SEM)  magnitude of the Su‐ER of 15 STT neurons measured 7.4 ± 1.2 spikes/trial (range: 2 ‐ 18). The  corresponding group  mean (±  SEM)  response‐to‐latency  measured  15 ±  2.8  ms (range: 13 ‐  18). The group means (± SEM) of the baseline response magnitude of Su‐ER of Group I (n =  5),  Group  II  (n  =  6)  and  Group  III  (n  =  4)  STT  neurons  were  6  ±  2  (range:  2  ‐  14),  8.8  ±  2.3  (range: 3 ‐ 18) and 7.1 ± 1.1 (range: 4 ‐ 10) spikes/trial, respectively. The baseline values for  the response magnitude of the three groups did not differ significantly from each other (F(2,  12) = 0.53, p = 0.6, one‐way ANOVA). The response latencies of Group I, Group II and Group  III  STT  neurons  were  14.8  ±  5.9  (range:  13  ‐  17),  16.1  ±  5.2  (range:  15  ‐  18)  and  14 ±  2.9  ms  (range: 13 ‐ 15), respectively. The baseline values for the response latency of the three groups  did not differ significantly from each other (F(2, 12) = 0.04, p = 0.96, one‐way ANOVA).   51   Results     Previous  studies  have  shown  that  repetitive  application  of  peripheral  stimuli  can   lead  to  suppression  of  spinal  neurons,  called  the  habituation  phenomenon  (Griffin  and  Pearson, 1967; Macdonald and Pearson, 1979). To test if repetitive stimulation of sural nerve  in  the  present  study  underwent  a  habituation  phenomenon,  the  magnitude  of  synaptic  responses  of  five  STT  neurons  to  the  first,  second,  third,  fourth  and  fifth  batteries  of  ten  consecutive stimuli as well as to a total battery of fifty consecutive stimuli were compared.  As shown in the Figure 3.7 there were no significant differences between the magnitudes of  Su‐ER  STT  responses  obtained  from  five  individual  batteries  of  ten  stimuli  (p  >  0.05,  one‐ way repeated measures ANOVA). Similarly, when response magnitudes obtained from all  the five batteries  of ten trials were  compare  with  one  battery  of fifty  stimuli  no  significant  differences were found (p > 0.05, one‐way repeated measures ANOVA). This data indicates  that repetitive stimulation of sural nerve did not undergo habituation of evoked responses  of STT neurons and thus provided stable baseline response.                     52   Results        Figure  3.6  Example  of  sural  nerve‐evoked  STT  responses.  The  upper  left  trace  (A)  shows  antidromic  spike  of  a  STT  neuron  recorded  in  the  L1  spinal  segment  after  single  pulse  (S)  stimulation in the thalamus. The upper right trace (B) shows orthodromic responses of the  same  STT  neuron  evoked  after  single  pulse  (S)  stimulation  (0.1  ms,  0.9  mA)  of  the  sural  nerve  (B).  Post  stimulus  time  histograms  (bin  width:  0.5  ms)  of  the  antidromic  spike  (50  trials) and sural nerve‐evoked response (1 trial) are shown in the bottom traces (C and D),  respectively. The insets in A and B are voltage and time calibration lines.           53   Results  14  Number of spikes/trial  12 10 8 6 4 2 0 1-10  11-20  21-30  31-40  Stimulus Trials  41-50  1-50        Figure  3.7  Absence  of  habituation  of  sural  nerve‐evoked  STT  responses.  The  sural  nerve  was  stimulated  using  the  intensity  2  times  the  threshold  intensity.  The  first  five  bars  represent the group mean (± SEM) response magnitude (number of spikes/trial) of five STT  neurons obtained from five consecutive batteries of sural nerve stimulation, each consisting  of 10 stimulus trials. The last bar represents group mean (± SEM) response magnitude of five  STT neurons obtained from one battery of sural nerve stimulation consisting of 50 stimulus  trials. Note that there were no differences among the magnitude of responses obtained from  small number (10) of trials as well as large number (50) of trials (p > 0.05, one‐way repeated  measures ANOVA).                     54   Results   3.2.2.3.2. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses    The  threshold  intensity  for  sciatic  nerve  stimulation  was  determined  as  the  minimum  stimulus  intensity,  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  Out  of  18  STT  neurons,  responses  of  15  STT  neurons  were  recorded  after  stimulation of sciatic nerve. In three STT neurons (# 7, 8 and 9), no response could be elicited  with sciatic nerve stimulation despite a gradual increase in the stimulus intensity. The mean  (± SEM) threshold intensity for sciatic nerve stimulation was 1.4 ± 0.7 mA (range: 0.08 ‐ 10).    A typical Sc nerve stimulation‐evoked response (Sc‐ER) of a STT neuron is illustrated  in  the  Figure  3.8B.  Note  that  the  cellular  response  for  this  particular  neuron  consisted  of  “early” and “late” polysynaptic components, although this was observed for only three STT  neurons examined.   The  group  mean  (±  SEM)  magnitude  and  latency  of  the  Sc‐ER  (at  2  times  the  threshold intensity) of 15 STT neurons measured 8.1 ± 1.5 spikes/trail (range: 1 ‐ 17) and 44.8  ±  1.8  ms  (range:  31  ‐  54),  respectively.  The  group  means  (±  SEM)  of  the  baseline  response  magnitudes of Group I (n = 5), Group II (n = 6) and Group III (n = 4) STT neurons measured  6.3  ±  2.3  (range:  3  ‐  15),  9.7  ±  2.8  (range:  1  ‐  17)  and  8.1  ±  1.2  spikes/trial  (range:  5  ‐  11),  respectively.  The  baseline  values  for  the  response  magnitude  of  the  three  groups  did  not  differ  significantly  from  each  other  (F(2,  12)  =  0.51,  p  =  0.61,  one‐way  ANOVA).The  group  means (± SEM)  of the baseline  response latencies of Group  I,  Group  II,  and  Group  III STT  neurons  measured  47.2  ±  2.4  (range:  44  ‐  54),  42.3  ±  3.6  (range:  31  ‐  54)  and  44.5  ±  0.5  ms  (range:  43  ‐  46),  respectively.  The  baseline  values  for  the  response  latency  of  all  the  three   55   Results  groups  did  not  differ  significantly  from  each  other  (F(2,  12)  =  0.78,  p  =  0.48,  one‐way  ANOVA).   To determine if repetitive stimulation of Sc nerve in the present study underwent a  habituation  phenomenon  (Griffin  and  Pearson,  1967;  Macdonald  and  Pearson,  1979),  the  response magnitude of five STT neurons to the first, second, third, fourth and fifth batteries  of  ten  consecutive  stimuli  with  a  battery  comprising  of  fifty  consecutive  stimuli  were  compared.  As  shown  in  the  Figure  3.9  there  were  no  significant  differences  between  the  response magnitudes of obtained from five individual batteries of ten stimuli (p > 0.05, one‐ way repeated measures ANOVA) as well as with one battery of fifty stimuli (p > 0.05, one‐ way repeated measures ANOVA). This data indicates that repetitive stimulation of Sc nerve  did not undergo habituation of evoked responses of STT neurons and thus provided stable  baseline response.    56   Results   Figure 3.8 Example of sciatic nerve‐evoked STT responses. The upper left trace (A) shows  antidromic spike (arrow) of a STT neuron evoked in the L1 spinal segment after single pulse  (S)  stimulation  in  the  thalamus.  The  upper  right  trace  (B)  shows  orthodromic  responses  (arrows) of the same STT neuron evoked after single pulse (S) stimulation (0.1 ms, 1.5 mA)  of  the  sciatic  nerve.  Post  stimulus  time  histograms  (bin  width:  0.5  ms)  of  the  antidromic  spike (50 trials) and sciatic nerve‐evoked response (1 trial) are shown in the bottom traces (C  and D), respectively. The insets in A and B are voltage and time calibration lines.             57   Results     Number of spikes/trial  8  6  4  2  0 1-10  11-20  21-30  31-40  Stimulus trials  41-50  1-50      Figure 3.9 Absence of habituation of sciatic nerve‐evoked STT responses. The sciatic nerve  was  stimulated  using  the  intensity  2  times  the  threshold  intensity.  The  bars  represent  the  group  mean  (±  SEM)  response  magnitude  (number  of  spikes/trial)  of  five  STT  neurons  obtained  from  five  consecutive  batteries  of  sciatic  nerve  stimulation,  each  consisting  of  10  stimuli as well as a single battery of 50 stimulus trials. Note that there were no differences  among  the  magnitude  of  responses  obtained  from  small  number  (10)  of  trials  as  well  as  large number (50) of trials (p > 0.05, one‐way repeated measures ANOVA).       58   Results   3.2.3.  EFFECTS  OF  BILATERAL  MICROINJECTIONS  OF  VEHICLE  CONTROL  SOLUTION/PENTOBARBITAL   INTO   THE   RAT   MPTA   ON   THE   ELECTROPHYSIOLOGICAL PARAMETERS OF STT NEURONS     3.2.3.1. MICROINJECTIONS OF VEHICLE CONTROL SOLUTION    In the present study, aqueous vehicle containing 10% ethanol and 20% propylene glycol as  co‐solvents  was  used  to  dissolve  PB  (Devor  and  Zalkind,  2001).  Ethanol  itself  can  exert  differential  effects  in  the  CNS,  including  analgesia  (James  et  al.,  1978;  Woodrow  and  Eltherington,  1988).  Further,  ethanol  is  shown  to  suppress  the  excitability  of  primary  sensory neurons (Oakes and Pozos, 1982; Nieminen, 1987; Gruss et al., 2001).  On the other  hand, subcutaneous microinjection of ethanol has been shown to increase the sensitivity of  dorsal horn sensory neurons (Carstens, 1997). Accordingly, to examine if the vehicle control  solution (Vh) itself had any effect on the ongoing as well as evoked spike activity of the STT  neurons, all of the three electrophysiological parameters of the STT neurons were compared  before and after microinjections of PB‐free vehicle into the MPTA.    3.2.3.1.1. Spontaneous Firing Rate: Vehicle Control Microinjections   To determine if changes in the mean SFR of the STT neurons occurred after microinjections  of Vh (1 μL/side) into the MPTA, the SFR at time point (2, 15, 30 and 60 min) following Vh  microinjections  was  compared  with  the  baseline  SFR.  Figure  3.10  summarizes  the  group  mean (± SEM) SFR of Group I (A, n = 6) and Group III (B, n = 6) STT neurons as well as their   59   Results  combined SFR (Vh, n = 12) before and following microinjections of Vh. Comparisons of SFR  at each of the time points after Vh microinjections with the respective baseline SFR showed  no  significant  change  for  STT  neurons  in  the  Group  I  and  Group  III  or  when  their  results  were combined (p > 0.05, paired Student’s t test).       The  SFR  of  each  STT  neuron  in  the  Group  I,  Group  III  before  and  after  Vh   microinjection  are  illustrated  in  the  Figure  3.11.  Figure  3.12  illustrates  a  typical  rate‐meter  histogram  trace  showing  the  firing  rate  of  a  STT  neuron  before  and  following  control  microinjections.                     60   Results   Group III (n = 6)  B.  Group I (n = 6) 16  30  14  25  12  SFR (spikes/s)  SFR (spikes/s)  A.  10 8 6 4 2  20 15 10 5  Vh  Vh  0  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  SFR (spikes/s)  C.  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Combined SFR (Groups I and III, n = 12) 25 20 15 10 5  Vh  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60     Figure 3.10 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous firing rate of STT neurons. Time  relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (±  SEM)  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  point  where  the  baseline  SFR  was  measured  before  vehicle  control  solution (Vh; 1 μL/side) microinjections. The graphs in A (open bars) and B (grey bars) show  SFR of Group I and Group III STT neurons, respectively. The graph in C (black bars) shows  the group mean (± SEM) combined SFR of the Groups I and III STT neurons. Note that the  SFR following Vh microinjections in any of the groups as well as in the combined results did  not change significantly compared to the baseline SFR (p > 0.05, paired Student’s t test).            61   Results   A. Group I (n = 6)  STT 6 STT 9 STT 10 STT 11 STT 15 STT 18  SFR (spikes/s)  40 30 20 10 0  Vh -30  2 15 30 Time Points (min)  60  B. Group III (n = 6)  STT 7 STT 8 STT 12 STT 14 STT 17 STT 19  50  SFR (spikes/s)  40 30 20 10 0  Vh -30  2 15 30 Time Points (min)  60  Figure  3.11  Spontaneous  firing  rate  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The  Figure  shows  spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s)  of  each  of  the  STT  neurons in Group I (A) and Group III (B). The time point ‐30 min in each graph represents  the time point where the baseline SFR was measured before vehicle control solution (Vh; 1 μL/side)  microinjections.  The  downward  arrow  indicates  time  zero  corresponding  to  the  time of completion of the microinjections.    62              Figure 3.12 Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the spontaneous firing rate of a STT neuron before and  following  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA.  The  completion  of  microinjections  of  vehicle  control  solution (Vh, 1 μL/side) is denoted by the upward arrow at the bottom of the trace. A sliding average (white line; bin width: 30 s) is  superimposed over the rate histogram trace (bin width: 1 s). Spontaneous firing rate (SFR; spikes/s) at the baseline (SFRB) and at 2  min  (SFR2),  15  min  (SFR15),  30  min  (SFR30),  and  60  min  (SFR60)  following  Vh  microinjections  are  noted  abouve  the  trace.  Note  that  following microinjections of Vh, the firing rate does not change significantly from the baseline.   Results  63     Results   3.2.3.1.2. Interspike Interval Data: Vehicle Control Microinjections   To determine if the microinjections of the vehicle control solution caused any change in the  firing  pattern  of  the  STT  neurons,  the  interspike  interval  histograms  (ISIH),  as  well  as  the  coefficient of variation (CV) and dispersion (CD) were analyzed. To construct ISIHs at each  time  point,  the  same  data  files  were  used  that  were  used  for  determining  the  SFR.  The  results of the interspike interval data analysis of the Groups I and III STT neurons as well as  their combined results are summarized in the Table 3.1.       The  ISIH  distributions  were  leptokurtic  and  in  the  10  of  the  12  neurons  positively   skewed.  Since  the  ISIH  distributions  were  skewed,  median  interval  rather  than  mean  interval  was  measured  and  analyzed.  The  overall  analysis  of  the  interspike  interval  data  revealed no significant changes after microinjections of Vh.       Similarly,  the  CV  and  CD,  which  are  measures  of  spike  train  irregularity  (Cocatre‐  Zilgien  and  Delcomyn,  1992;  Soja  et  al.,  1996),  were  not  altered  by  vehicle  control  microinjections  (p  >  0.05,  paired  Student’s  t  test).  Collectively,  these  data  indicate  that,  microinjections of vehicle control solution into the MPTA did not change the firing pattern  of the recorded STT neurons.       An  example  of  ISIH  distribution  of  the  spike  activity  of  a  STT  neuron  before  and   after microinjections of vehicle control solution into the MPTA is represented in Figure 3.13.         64      Figure 3.13 Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of spike activity of a lumbar STT neuron recorded before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  Each  ISIH  was  constructed  from  2  min  epoch  of  the  spike  activity  recorded  before  (Baseline)  and  at  each  time  point  (2,  15,  30  and  60  min)  following  microinjections  of  vehicle  control  solution  (Vh;  1  μL/side).  The  median  intervals  are  indicated  by  dashed  vertical  lines.  Computer‐generated  spike  trains  (5  s)  for  the  respective  time  points  are  shown  as  insets.  The  time  calibration  bars  (500  ms)  are  Results  shown below each spike train. Note that the spike pattern of this cell did not change following microinjections of Vh.  65  Results       Interspike  Interval  Parameter  Median  Interval  (ms)   CV   CD   STT  Neuron  Group  I (n = 6)   Baseline   Minutes after vehicle control (1 μL/side)  microinjections  2  15  30  60   28.3 ± 2.3   30 ± 2.7  30.3 ± 3.9  III (n = 6)   33.3 ± 7   31.5 ± 4.7  33 ± 10   27 ± 5.6   27.7 ± 2.2  34.2 ± 7.1  31.1 ± 4.9  Combined   30.8 ± 8.9  33.3 ± 2.3 31.7 ± 3.8 34.6 ± 5.3  29.4 ± 2.5 I and III  I (n = 6)   0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1  0.7 ± 0.1   0.8 ± 0.1   1 ± 0.2   III (n = 6)   0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1  0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1   Combined  I and III   0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1  0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.1   0.8 ± 0.0   I (n = 6)   0.1 ± 0.1   0.1 ± 0.1  0.2 ± 0.1   0.2 ± 0.1   0.2 ± 0.1   III (n = 6)   0.1 ± 0.0   0.1 ± 0.1  0.1 ± 0.3   0.1 ± 0.1   0.1 ± 0.1   Combined  I and III   0.1 ± 0.0   0.1 ± 0.0  0.3 ± 0.2   0.1 ± 0.0   0.1 ± 0.2     Table 3.1 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  interspike  interval  parameters  of  STT  neurons. The table summarizes results of interspike interval analysis of Groups I and III STT  neurons  as  well  as  their  combined  data  before  (baseline)  and  at  the  four  time  points  after  microinjections of control vehicle solution (1 μL/side). Each parameter is represented as the  group  mean  (±  SEM).  Note  that  none  of  the  interspike  interval  parameters  changed  significantly following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  CV: coefficient of variation; CD: coefficient of dispersion       66   Results   3.2.3.1.3. Antidromic Firing Index: Vehicle Control Microinjections    To assess the effects of bilateral microinjections of Vh into MPTA on the excitability of STT  neurons,  the  FI  at  various  time  points  (2,  15,  30  and  60  min)  after  the  microinjections  was  compared with the baseline FI.   As shown in Figure 3.14 there was no significant change in the group mean (± SEM)  FI  of  Group  I  (Fig.  3.14A;  n  =  6)  and  Group  III  (Fig.  3.14B;  n  =  6)  STT  neurons  after  microinjections  of  Vh  when  compared  to  their  respective  baseline  FI  (p  >  0.05,  paired  Student’s t test). When the data from these two groups were combined (Fig. 3.14C; n = 12),  the  mean  FI  also  remained  unchanged  following  microinjections  of  Vh  when  compared  to  the baseline FI (p > 0.05, paired Student’s t test).   The  FI  of  each  STT  neuron  in  the  Groups  I  (A;  n  =  6),  and  III  (B;  n  =  6)  before  and  following Vh microinjections are presented in the Figure 3.15.    The  overall  results  indicate  that  the  antidromic  firing  index  (FI)  and  thus  the  excitability of STT neurons was not significantly altered following microinjections of vehicle  control solution into MPTA (p > 0.05, paired Student’s t test).              67   Results   A.  B.  Group I (n = 6)  Group III (n = 6)  100  120  80  100 80 FI  FI  60 40  60 40  20  20  Vh  0  Vh  0 -30  0  2  15  30  60  -30  0  Time Points (min)  C.  2 15 30 Time Points (min)  60  Combined FI (Groups I and III, n = 12) 100 80  FI  60 40 20  Vh  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Figure 3.14 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA on  the  antidromic  firing  index  of  STT  neurons  in  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  Time relative to zero, is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group  mean  (±  SEM)  firing  index  (FI).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  point  where  the  baseline  FI  was  measured  before  vehicle  control  solution  (Vh;  1 μL/side)  microinjections.  The  graphs  in  A  (open  bars)  and  B  (grey  bars)  show  FI  of  Group  I  and  Group III STT neurons, respectively. The graph in C (black bars) shows the group mean (±  SEM) SFR combined FI in Group I and Group III STT neurons. Note that the FI following Vh  microinjections  in  any  of  the  Groups  I  and  III  as  well  as  in  the  combined  results  did  not  change significantly compared to the baseline (p > 0.05, paired Student’s t test).          68   Results     A. Group I (n = 6) STT - 6 STT - 9 STT - 10 STT - 11 STT - 15 STT - 18  120 100  FI  80 60 40  Vh  20 -30  2 15 30 Time Points (min)  60  B. Group III (n = 6)  STT - 7 STT - 8 STT - 12 STT - 14 STT - 17 STT - 19  110 100  FI  90 80 70 60  Vh  50 -30  2  15  30  Time Points (min)  60     Figure  3.15 Antidromic  firing  index  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The  figure  depicts  antidromic  firing  index  (FI)  of  each  of  the  STT  neurons  in  Group  I  (A)  and  Group  III  (B).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  when  baseline  antidromic  firing  index  FI  was  measured  before  vehicle  control  solution  (Vh;  1 μL/side)  microinjections.  The  downward  arrow  indicates  time  zero  corresponding  to  the  time of completion of the microinjections.    69   Results   3.2.3.1.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses: Vehicle Control Microinjections    Out  of  18  STT  neurons  recorded,  sural  nerve  stimulation  could  elicit  responses  in  15  STT  neurons. In three neurons, no responses could be elicited by sural (Su) nerve stimulation. Of  the 15 STT neurons, 9 STT neurons were assessed for their responses to the stimulation of Su  nerve before and following microinjections of Vh.    As  shown  in  Figure  3.16,  the  microinjection  of  Vh  did  not  alter  the  response  magnitude  as  well  as  the  latency  of  Su‐ER  of  STT  neurons  whether  it  was  Group  I  (Fig.  3.16A), Group III (Fig. 3.16.B), or combined data set (Fig. 3.16C) (p > 0.05, paired Student’s t  test).     To examine if microinjections of Vh altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  peak‐trough  amplitude  analysis  of  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal cord after Su nerve stimulation were performed. Figure 3.17 illustrates an example of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  followed  by  a  compound  action  potential evoked by Su nerve stimulation. As shown in the Figure 3.18, both the peak height  as  well  as  latency  did  not  change  significantly  following  microinjections  of  Vh  (p  >  0.05,  paired Student’s t test).   To summarize, both the magnitude as well as latency of responses of STT neurons to  stimulation of the Su nerve were not significantly altered following bilateral microinjections  of Vh into the MPTA.  The afferent volley arising as a consequence of Su nerve stimulation  also did not change following Vh microinjections into the MPTA.   70   Results                        Response Magnitude                                             Mean Latency  Group I (n = 5) 30  18 16 14 12 10 8 6 4 2 0  Mean Latency (ms)  Spikes / Trial  A.  C  Vh  20 15 10 Vh  5 0  -30  0  2  15  30  60  -30  0  Time Points (min)  B.  15  30  60  30  60  30  60  Group III (n = 4) 25 Mean Latency (ms)  8 6 4 2  Vh C  20 15 10 5  Vh  0  0 -30  0  2  15  30  60  -30  0  Time Points (min)  C.  2  15  Time Points (min)  Combined (Groups I and III, n = 9) 14  25 Mean Latency (ms)  12 Spikes / Trial  2  Time Points (min)  10 Spikes / Trial  25  10 8 6  C  4 Vh  2 0 -30  0  2  15  Time Points (min)  30  60  20 15 10 5  Vh  0 -30  0  2  15  Time Points (min)  Figure 3.16 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sural  nerve‐evoked  responses  of  STT  neurons. Time relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the  group  mean  (±  SEM)  value.  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which the baseline response was measured before microinjections of vehicle control solution  (Vh;  1  μL/side).  The  response  magnitudes  (spikes/trial)  and  response  latencies  (ms)  are  represented in the left and right panels, respectively. Graphs in A and B represent results of  Groups  I  and  III  STT  neurons,  respectively.  The  graphs  in  C  show  combined  values  of  Group I and Group III. In all cases, p > 0.05, paired Student’s t test.  71   Results   B.  Peak height (μV)  A.  Peak latency (ms)  S  0.1 μ V 1 ms  S  0.2 μV 5 ms  Figure  3.17  Example  of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  evoked  by  stimulation of sural nerve. The sural nerve was stimulated at 2 times the threshold intensity,  which was the minimum intensity required to produce a single or short train of orthodromic  action potentials. The stimulus (S) applied to the sural nerve is followed by afferent volley  (enclosed  in  the  box),  which  in  turn,  is  followed  by  a  compound  action  potential  (A).  The  trace shown in the upper right (B) is time and amplitude expanded portion of the stimulus  and afferent volley.    72   Results                     Peak‐Trough Amplitude                                        Latency  A.  Group I (n = 5) 4  0.7  0.5  Latency (ms)  Peak Height (μV)  0.6  0.4 0.3 0.2 0.1  2 1  Vh  Vh  0.0  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  B.  60  -30  4  0.6  3  0.4  2 15 30 Time Points (min)  60  0.2  2 1  Vh  Vh  0.0  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  C.  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Combined (Groups I and III, n = 9) 0.7  3.5  0.6  3.0  0.5  2.5  Latency (ms)  Peak Height (μV)  0  Group III (n = 4) 0.8  Latency (ms)  Peak Height (μV)  3  0.4 0.3 0.2 0.1  2.0 1.5 1.0 0.5  Vh  0.0  Vh  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Figure 3.18 Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sural  nerve‐evoked  afferent  volley  recorded  in the lumbar spinal cord of isoflurane‐anesthetized rat preparation. Time relative to zero is  indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (± SEM) value. The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  response  was  measured before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side).The peak‐trough  amplitudes (μV) and latencies (ms) of afferent volley are shown in the left and right panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  represent  results  of  Groups  I  and  III  STT  neurons,  respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In all cases, p  > 0.05, paired Student’s t test.   73   Results   3.2.3.1.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses: Vehicle Control Microinjections    Of  the  18  STT  neurons  recorded,  sciatic  (Sc)  nerve  stimulation  could  elicit  responses  in  15  STT  neurons.  In  three  neurons  (#  7,  8  and  9),  no  responses  could  be  elicited  by  Sc  nerve  stimulation. Of the 15 STT neurons, 9 STT neurons were assessed for their responses to the  stimulation of Sc nerve before and following microinjections of Vh.    As shown in Figure 3.19, microinjections of Vh did not alter the response magnitude  or  latency  of  Sc‐ER  of  STT  neurons  whether  the  neurons  were  from  Group  I  (Fig.  3.19A),  Group III (Fig. 3.19B), or combined data sets (Fig. 3.19C) (p > 0.05, paired Student’s t test).     To examine if microinjections of Vh altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  peak‐trough  amplitude  analysis  of  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal cord after Sc nerve stimulation were performed. Figure 3.20 illustrates an example of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  followed  by  a  compound  action  potential  evoked  by  Sc  nerve  stimulation.  The  peak‐trough  amplitude  and  latency  of  the  afferent volleys were compared before and after microinjection. As shown in the Figure 3.21,  both  the  amplitude  as  well  as  latency  of  the  afferent  volley  did  not  change  significantly  following microinjections of Vh (Fig. 3.21; p > 0.05, paired Student’s t test).      To summarize, both the magnitude as well as latency of responses of STT neurons to   stimulation of the Sc nerve were not significantly altered following bilateral microinjections  of Vh into the MPTA. The afferent volley arising as a consequence of Sc nerve stimulation  also did not change following Vh microinjections into the MPTA.  74   Results  Taken together, the results of the present study indicate that bilateral microinjections  of  vehicle  control  solution  into  the  MPTA  did  not  alter  all  the  four  electrophysiological  parameters (i.e. SFR, FI, Su‐ and Sc‐ER) of STT neurons recorded, thus establishing a good  control.   Tables  3.2  through  3.4  summarize  the  results  of  effects  of  microinjections  of  Vh  on  the electrophysiological parameters of STT neurons recorded in this study.                                 75   Results                          Response Magnitude                                  Response Latency  A. 10  60  8  50  Latency (ms)  Spikes / Trial  Group I (n = 5)  6 4 2  Vh  0  40 30 20 Vh  10 0  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  B.  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  2 15 30 Time Points (min)  60  2 15 30 Time Points (min)  60  12  60  10  50  Latency (ms)  Spikes / Trial  Group III (n = 4)  8 6 4 Vh  2 0  40 30 20 Vh  10 0  -30  0  C.  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  10  60  8  50  Latency (ms)  Spikes / Trial  Combined (Group I and III, n = 9)  6 4 2  Vh  0  40 30 20 Vh  10 0  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0         Figure 3.19 Effect of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sciatic  nerve‐evoked  responses  of  STT  neurons. Each bar in each graph represents the group mean (± SEM) value. The time point ‐ 30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  response  was  measured  before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side). The response magnitudes  (spikes/trial)  and  response  latencies  (ms)  are  represented  in  the  left  right  panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  show  results  of  Group  I  and  Group  II  STT  neurons,  respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In all cases, p  > 0.05, paired Student’s t test.       76   Results     B.  Peak height (μV)  A.  0.1 μV  S Peak latency (ms)  2 ms  S 0.1 μV 10 ms       Figure  3.20  Example  of  presynaptic  afferent  volley  recorded  in  the  spinal  cord  evoked  by  stimulation  of  sciatic  nerve.  The  sciatic  nerve  was  stimulated  at  2  times  the  threshold  intensity,  which  was  the  minimum  intensity  required  to  produce  a  single  or  short  train  of  orthodromic  action  potentials.  The  stimulus  (S)  applied  to  the  sciatic  nerve  is  followed  by  afferent  volley  (enclosed  in  the  box),  which  in  turn,  is  followed  by  a  compound  action  potential  (A).  The  trace  shown  in  the  upper  right  (B)  is  time  and  amplitude  expanded  portion of the stimulus and afferent volley.            77   Results                       Peak‐Trough Amplitude                                        Latency  Group I (n = 5) 1.4  3.5  1.2  3.0  1.0  2.5  Latency (ms)  Peak Height (μV)  A.  0.8 0.6 0.4 Vh  0.2  2.0 1.5 1.0 Vh  0.5 0.0  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  -30  60  0  2  15  30  60  2 15 30 Time Points (min)  60  Time Points (min)  Group III (n = 4) 3.0  3.0  2.5  2.5 Latency (ms)  Peak Height (μV)  B.  2.0 1.5 1.0 0.5  2.0 1.5 1.0 0.5  Vh  Vh  0.0  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  C.  -30  60  0  3.0  3.0  2.5  2.5 Latency (ms)  Peak Height (μV)  Combined (Groups I and III, n = 9)  2.0 1.5 1.0 0.5  2.0 1.5 1.0 0.5  Vh  Vh  0.0  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60     Figure 3.21 Effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  sciatic  nerve‐evoked  afferent  volley  recorded  in  the lumbar spinal cord of the isoflurane‐anesthetized rat preparation. Time relative to zero  is indicated in  minutes. Each  bar  in each graph represents the group mean (± SEM) value.  The time point ‐30 min in each graph represents the time at which the baseline response was  measured before microinjections of vehicle control solution (Vh; 1 μL/side). The peak‐trough  amplitudes  (μV)  and  the  latencies  (ms)  of  afferent  volley  are  shown  in  the  left  and  right  panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  show  results  of  Group  I  and  Group  II  STT  neurons, respectively. The graphs in C show combined values of Group I and Group III. In  all cases, p > 0.05, paired Student’s t test.  78   Results    Group I STT Neurons     minutes after vehicle control (1 μL/side)   Electrophysiological  Parameter   Baseline  SFR (n = 6)  8.6 ± 2.1   10 ± 4.6   8.5 ± 4.2   8.3 ± 3.43   10.4 ± 3.6   FI (n = 6)  82.3 ± 6.1   74.1 ± 11.3   74.3 ± 11.3  76.7 ± 8.2   84.9 ± 6.9   6 ± 2   7.3 ± 1.8   6.8 ± 1.7   7.1 ± 1.6   11.5 ± 5.4   14.8 ± 5.9   15.7 ± 4.4   15.7 ± 5.8   15 ± 4.6   15.8 ± 10.6   6.3 ± 2.3   6.7 ± 2.2   6.5 ± 2.1   6.5 ± 2.1   4.4 ± 1.2   47.2 ± 2.4   44.6 ± 0.67   43.3 ± 1.1   43.1 ± 1.6   43.2 ± 1   Su-ER Magnitude (n = 5) Su-ER Latency (n = 5) Sc-ER Magnitude (n = 5) Sc-ER Latency (n = 5)  2   microinjections 15  30   60      Table 3.2 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of  Group I STT neurons. The results are expressed as the group means (± SEM). The neurons in  this  group  were  treated  with  Vh  microinjections  (1  μL/side)  only.  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly  changed  following  Vh  microinjections  (p  >  0.05,  paired  Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)   79   Results    Group III STT Neurons     minutes after vehicle control (1 μL/side)   Electrophysiological Parameter   Baseline  SFR (n = 6)  19 ± 4.7   15.4 ± 4.8   14 ± 5.6   18.1 ± 6   18.9 ± 5.8   93.8 ± 2.1   83.8 ± 6.9   86.9 ± 6.7   89.1 ± 5.54   90.4 ± 4.7   7.1 ± 1.1   7.4 ± 2   6.2 ± 2.2   6.8 ± 1.9   7.2 ± 2   14 ± 2.9   14.4 ± 2   14.4 ± 0.4   13.8 ± 5.5   13.9 ± 2.1   8.1 ± 1.2   8.1 ± 1.9   6.7 ± 2.3   5.9 ± 2.1   6 ± 1.8   44.5 ± 0.53  43.4 ± 0.9   43.1 ± 1.9   41.8 ± 1.8   42 ± 1.3   FI (n = 6) Su-ER Magnitude (n = 4) Su-ER Latency (n = 4) Sc-ER Magnitude (n = 4) Sc-ER Latency (n = 4)  2   microinjections 15  30   60     Table 3.3 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA of isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of  Group  III  STT  neurons.  The  results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  The  STT  neurons in this group were treated first with the bilateral microinjections of Vh (1 μL/side)  into  the  MPTA.  After  recovery,  these  same  neurons  were  treated  with  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  (200  μg/side)  into  the  MPTA.  This  table  shows  results  obtained  following  the  microinjections  of  Vh.  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly changed following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)       80   Results       Combined results of  Groups I & III STT Neurons minutes after vehicle control (1 μL/side)   Electrophysiological Parameter   Baseline  SFR (n = 12)  13.8 ± 2.9   12.7 ± 3.3   11.3 ± 3.4   13.2 ± 3.6   15.5 ± 4.1   FI (n = 12)  88 ± 3.5   78.9 ± 6.1   81.1 ± 6.3   82.9 ± 5.1   89.2 ± 1.2   Su-ER Magnitude (n = 9) Su-ER Latency (n = 9) Sc-ER Magnitude (n = 9) Sc-ER Latency (n = 9)  6.5 ± 1.2   7.3 ± 1.2   6.5 ± 1.4   7 ± 1.2   9 ± 2.5   14.5 ± 3.6   15.1 ± 3.4   15.1 ± 3.9   14.5 ± 3.9   14.7 ± 5.7   7.1 ± 1.4   7.3 ± 1.4   6.6 ± 1.5   6.2 ± 1.4   5.2 ± 1.1   43.6 ± 2.3   44.1 ± 3.7   45.6 ± 3.2   47.2 ± 3.9   46.5 ± 3.6   2   microinjections 15  30   60      Table 3.4 Summary of effects of bilateral microinjections of vehicle control solution into the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  electrophysiological  parameters  obtained by combining the results obtained from Groups I and III STT neurons. The results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  Note  that  none  of  the  parameters  was  significantly changed following Vh microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)   81   Results   3.2.3.2. MICROINJECTIONS OF PENTOBARBITAL    3.2.3.2.1. Spontaneous Firing Rate: Pentobarbital Microinjections   Figure 3.22 shows the group mean (± SEM) spontaneous firing rate (SFR) of the STT neurons  before  and  at  various  time  points  after  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  (PB,  200  μg/side) into the MPTA.      STT neurons in group II (Fig. 3.22A, n = 6) were treated only with PB microinjections.   The  group  mean  (±  SEM)  baseline  control  SFR  of  Group  II  STT  neurons  before  PB  microinjections  measured  11.8  ±  2.9  spikes/s.  For  these  same  neurons,  the  SFR  were  significantly reduced  to  5.3  ± 1.4 spikes/s  at 2 min  and  to  5.5 ±  1.7  spikes/s at 15 min  after  microinjections of PB (p < 0.05, paired Student’s t test). This corresponds to a ~ 53% decrease  in  the  spike  rate.  The  reduction  in  the  SFR  was  reversible  within  30  min  of  PB  microinjections.  Interestingly,  in  one  STT  neuron  of  this  group  (#  16),  the  mean  firing  rate  was abolished 15 min after PB microinjections (Fig.  3.23),  which then returned  back  to  the  baseline  firing  rate  within  30  min  of  the  microinjections.  This  effect  was  not  observed  for  any other of the STT neurons.    The group mean (± SEM) baseline control SFR of Group III STT neurons (Fig. 3.22B, n  = 6) before PB microinjections measured 19 ± 4.7 spikes/s. For these same neurons, the SFR  was  significantly  reduced  to  12.8  ±  6.1  spikes/s  within  2  min  after  PB  microinjections  (p  <  0.05, paired Student’s t test). This corresponds to a 46% decrease in the spike activity. The  reduced SFR was reversed to baseline within 15 min. Interestingly, in the case of Group III   82   Results  STT neurons, following recovery of SFR, there was a significant reduction in the mean SFR  to  8.7  ±  7.7  spikes/s  at  the  60  min  time  point  after  PB  microinjection  (p  <  0.05,  Paired  Student’s t test). Note that as reported earlier, in the case of the same Group III STT neurons,  the microinjections of Vh did not alter the SFR (see section 3.2.3.1.1).   The  combined  group  mean  (±  SEM)  baseline  control  SFR  of  Groups  II  and  III  (Fig.  3.22C,  n  =  12)  before  PB  microinjections  measured  15.4  ±  2.8  spikes/s.  The  combined  SFR  data showed a significant but reversible decrease in the spike activity to 9.1 ± 3.2 spikes/s at  2  min  (p  <  0.01,  Paired  Student’s  t  test)  and  10.7  ±  3.3  spikes/s  at  15  min  (p  <  0.05,  Paired  Student’s  t  test)  time  points  after  PB  microinjections.  The  reduction  in  SFR  returned  to  baseline levels within 30 min after PB microinjections.   The SFR of each STT neuron in Group II and Group III is presented in the Figure 3.23.  The spike rate of all, but one STT  neurons dropped at the 2 min time  point and gradually  returned towards baseline values. In the case of one neuron (STT neuron # 14), there was a  slight (2%) increase in the SFR within 2 minutes of PB microinjections, which was followed  by ~ 23% decrease (Fig. 3.23B).    Figure 3.24 illustrates a typical rate‐meter histogram trace depicting the firing rate of  a  STT  neuron  before  and  following  PB  microinjections.  Note  that  the  spontaneous  activity  almost  abolished  15  min  following  the  PB  microinjections  into  the  MPTA,  although  this  happened only in the case of this particular STT neuron.      83   Results     A.  B.  Group II (n = 6)  Group III (n = 6) 25  SFR (spikes/s)  SFR (spikes/s)  20 15 10  *  5  *  20  *  15  *  10  PB  5  PB  0  0 -30  0 2 15 30 Time Points (min)  C.  -30  60  0 2 15 30 Time Points (min)  60  Combined (Groups II and III, n = 12)  SFR (spikes/s)  20 15  *  10  *  5 PB 0 -30  0 2 15 30 Time Points (min)  60  Figure  3.22  Effect  of  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  the  isoflurane‐anesthetized rat preparation on the spontaneous firing rate of STT neurons. Time  relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (±  SEM)  spontaneous  firing  rate  (SFR;  spikes/s).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  SFR  was  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  graphs  in  A  and  B  depict  the  SFR  of  Group  II  (open  bars) and Group III (grey bars) STT neurons, respectively. The graph in C (black bars) shows  the  combined  SFR  of  Groups  II  and  III.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  SFR  following  PB  microinjections  compared  to  the  baseline  SFR  (Paired  Student’s t test). The test statistics for significant differences is as follows: Group II (baseline‐ 2 min: t(5) = 3.05, p = 0.03; baseline‐15 min: t(5) = 2.93, p = 0.03); Group III (baseline‐2 min:  t(5)  =  3.41,  p  =  0.02;  baseline‐60  min:  t(3)  =  12.65,  p  =  0.001);  combined  Groups  II  and  III  (baseline‐2 min: t(11) = 3.5, p = 0.005; baseline‐15 min: t(11) = 2.37, p = 0.04).    84   Results   A.  Group II (n = 6) STT - 1 STT - 2 STT - 3 STT - 4 STT - 5 STT - 16  SFR (spikes/s)  30 25 20 15 10 5 0  PB  -30  B.  2 15 30 Time Points (min)  60  Group III (n = 6) STT - 7 STT - 8 STT - 12 STT - 14 STT - 17 STT - 19  SFR (spikes/s)  50 40 30 20 10 0  PB  -30  2 15 30 Time Points (min)  60    Figure  3.23 Spontaneous  firing  rate  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The figure depicts spontaneous firing rate (SFR; spikes/s) of each STT neuron in Group I (A)  and  Group  III  (B).  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  the  baseline  SFR  was  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  downward  arrow  indicates  time  zero  corresponding  to  the  time  of  completion  of  the  microinjections.   85      Figure 3.24 Example of a continuous ratemeter histogram trace depicting the spontaneous firing rate of a STT neuron before and  following  the  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  the  isoflurane‐anesthetized  rat.  A  sliding  average  (white  line;  bin  width:  30  s)  is  superimposed  over  the  rate  histogram  trace  (bin  width:  1  s).  The  time  period  at  which  pentobarbital  microinjection  (PB;  200  μg/side)  was  completed  is  denoted  by  an  arrow  at  the  bottom  of  the  trace.  Spontaneous  firing  rate  (SFR,  spikes/s) at the baseline (SFRB) and at 2 min (SFR2), 15 min (SFR15), and 30 min (SFR30) following PB microinjections is noted on the  top  of the trace.  Note  that  15 minutes  following  PB  microinjections  the firing  rate  was nearly abolished and recovered  toward  the  baseline value within 30 minutes. Time calibration bar is shown at the right hand bottom of the trace.    Results  86     Results   3.2.3.2.2. Interspike Interval Data: Pentobarbital Microinjections    To determine if the microinjections of PB caused any change in the firing pattern of the STT  neurons, the interspike interval histogram (ISIH), as well as the coefficient of variation (CV)  and  dispersion  (CD)  were  analyzed.  ISIHs  were  constructed  at  each  time  point  from  the  same data files that were used for determining the SFR. The results of the interspike interval  data analysis of the STT neurons in the Groups II and III as well as their combined results  are shown in the Table 3.5. The interspike interval distributions around PB microinjections  were leptokurtic and in 10 of 12 STT neurons positively skewed. The overall analysis of the  interspike  interval  data  revealed  no  significant  changes  after  PB  microinjections  in  any  of  these statistical parameters (p > 0.05, paired Student’s t test).       Similarly,  the CV and CD,  which  are measures of spike  train  irregularity,  were  not   significantly  altered  by  PB  microinjections  (p  >  0.05,  paired  Student’s  t  test).  Collectively,  these  data  indicate  that,  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  did  not  change  the  firing  pattern of the recorded STT neurons.       An  example  of  ISIH  distribution  of  the  spike  activity  of  a  STT  neuron  before  and   after microinjections of PB is represented in Figure 3.25.  87      Figure 3.25 Example of interspike interval histogram (ISIH) distributions of spike activity of a lumbar STT neuron recorded before  and  after  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  Each  ISIH  was  constructed from 2 min epoch of the spike activity recorded before (Baseline) and at each time point (2, 15, 30 and 60 min) following  microinjections  of  pentobarbital  (200  μg/side).  The  median  intervals  are  indicated  by  dashed  vertical  lines.  Computer‐generated  spike trains (5 s) for the respective time points are shown as insets. The time calibration bars (500 ms) are shown below each spike  train.  The  baseline  spontaneous  firing  rate  (SFR)  of  this  particular  STT  neuron  was  18.7  spikes/s.  The  SFR  at  various  time  points  spikes/s  Results  following  PB  microinjections  was  as  follows:  2  min  =  4.77  spikes/s,  15  min  =  5.6  spikes/s,  30  min  =  5.1  spikes/s  and  60  min  =  16.9   88  Results      Interspike  Interval  Parameter  Median  Interval  (ms)   CV   CD   minutes after pentobarbital (200 μg/side)  microinjections  2  15  30  60   STT  Neuron  Group   Baseline   I (n = 6)   35 ± 6.4   38 ± 3.7   35 ± 5.1   30 ± 13.4   32 ± 19.7   III (n = 6)   40 ± 8.3   40 ± 6.4   41 ± 9.6   43 ± 6.9   38 ± 5.7   Combined    I and III  I (n = 6)   38 ± 6.8   39 ± 3.7   38 ± 2.9   37 ± 3.4   35 ± 3.4   0.7 ± 0.1   0.8 ± 0.1   0.7 ± 0.1   0.7 ± 0.1   0.8 ± 0.03  III (n = 6)   0.8 ± 0.1  0.8 ± 0.03  0.7 ± 0.1   1.1 ± 0.4   0.6 ± 0.1   Combined  I and III  I (n = 6)   0.8 ± 0.1  0.8 ± 0.02   0.7 ± 0.1   0.9 ± 0.2   0.7 ± 0.04  0.1 ± 0.02  0.1 ± 0.04  0.1 ± 0.1   0.1 ± 0.02  0.1 ± 0.02  III (n = 6)   0.1 ± 0.1   0.1 ± 0.1   0.1 ± 0.03  0.1 ± 0.1   Combined  I and III   0.1 ± 0.03  0.1 ± 0.03  0.1 ± 0.03  0.1 ± 0.04  0.1 ± 0.03  0.2 ± 0.1      Table 3.5 Summary of effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  interspike  interval  parameters  of  STT  neurons.  The table summarizes results of interspike interval analysis of Groups II and III STT neurons  as  well  as  their  combined  data  before  (baseline)  and  at  the  four  time  points  after  microinjections  of  pentobarbital  (200  μg/side).  Each  parameter  is  represented  as  the  group  mean  (±  SEM).  Note  that  none  of  the  interspike  interval  parameters  changed  significantly  following PB microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).  CV: coefficient of variation; CD: coefficient of dispersion         89   Results   3.2.3.2.3. Antidromic Firing Index: Pentobarbital Microinjections    To  study  the  effects  of  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  on  the  excitability  of  STT  neurons  in  each  treatment  group,  the  mean  antidromic  firing  index  (FI)  at  four  time  points (2, 15, 30 and 60 min) following microinjections were compared with the baseline FI.  These data are presented in Figure 3.26.      The group mean (± SEM) baseline control FI of Group II STT neurons (n = 6) before   PB microinjections measured 88.9 ± 7.4. For these same neurons, the group mean (± SEM) FI  significantly  reduced  to  49.2 ±  13 within  2  mins of  the  PB  microinjections  (p  <  0.05,  paired  Student’s  t  test).  This  corresponds  to  a  45%  reduction  in  the  FI  at  this  time  point.  The  suppression  of  STT  neuron  FI  after  PB  microinjections  was  reversed  within  15  min.  The  results of group II STT neurons are shown in Figure 3.26A.   In the case of Group III STT neurons (n = 6) the group mean (±SEM) baseline control  FI  before  PB  microinjections  measured  93.8  ±  2.1.  Following  PB  microinjections,  the  group  mean (± SEM) FI of the same STT neurons was significantly reduced to 49.9 ± 20.2 within 15  min  (p  <  0.05,  paired  Student’s  t  test).  This  corresponds  to  a  47%  decrease  in  the  FI  at  the  same time point. The suppressed FI after PB microinjections recovered to the baseline value  within  30  min  (Fig.  3.26B).  Note  that  as  reported  earlier,  in  the  case  of  the  same  Group  III  STT neurons, the microinjections of Vh did not alter the FI (see section 3.2.3.1.2).      90   Results  When the FI data from Group II and III STT neurons were combined (n = 12), PB also  significantly  reduced  the  FI  by  37%  to  56.1  ±  11.1  at  2  min  time  point  compared  to  the  baseline FI of 89.2 ± 3.7 (p < 0.05, paired Student’s t test). This reduction was sustained up to  the  30  min  time  point  and  returned  toward  the  baseline  value  within  60  min  of  PB  microinjections (Fig. 3.26C).   The FI of each STT neuron in Groups II and III is depicted in the Figure 3.27. The FI  was  suppressed  following  PB  microinjections  in  all  but  2  STT  neurons.  In  these  2  STT  neurons, there was ~ 1 ‐ 8% increase in the FI shortly after PB microinjections.   Taken together, these results indicate that bilateral microinjections of PB into the rat  MPTA  significantly  and  reversible  suppressed  the  FI  and  thus  the  excitability  of  STT  neurons.                          91   Results     B.  A.  Group III (n = 6)  100  100  80  80  *  60  FI  FI  Group II (n = 6)  40 20  *  60 40 20  PB  0  PB  0 -30  0 2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0 2 15 30 Time Points (min)  60  C. Combined (Groups II and III, n = 12) 100  FI  80  *  60  *  *  40 20  PB  0 -30  0 2 15 30 Time Points (min)  60     Figure  3.26 Effect  of  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  the  isoflurane‐anesthetized rat preparation on the antidromic firing index of STT neurons. Time  relative to zero is indicated in minutes. Each bar in each graph represents the group mean (±  SEM) antidromic firing index (FI). The time point ‐30 min in each graph represents the time  at  which  the  baseline  FI  was  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  graphs  in  A  and  B  depict  the  FI  of  Group  II  and  Group  III  STT  neurons,  respectively. The graph in C shows the FI of Groups II and III combined. The asterisks (*)  indicate statistically significant reduction in the FI following PB microinjections compared to  the  baseline  FI.  The  test  statistics  (paired  Student’s  t  test)  for  significant  differences  is  as  follows: Group II (baseline‐2 min: t(5) = 3.16, p = 0.05); Group III (baseline‐15 min: t(5) = 2.34,  p = 0.04); combined Groups II and III (baseline‐2 min: t(11) = 3, p = 0.01; baseline‐15 min: t(11)  = 2.91, p = 0.01; baseline‐30 min: t(11) = 2.39, p = 0.04).    92   Results   A.  FI  Group II (n = 6) STT - 1 STT - 2 STT - 3 STT - 4 STT - 5 STT - 16  120 100 80 60 40 20 0  PB  -30  B.  2 15 30 60 Time Points (min)  Group III (n = 6) 120  STT - 7 STT - 8 STT - 12 STT - 14 STT - 17 STT - 19  100  FI  80 60 40 20 0  PB  -30  2 15 30 60 Time Points (min)  Figure  3.27 Antidromic  firing  index  of  each  STT  neuron  before  and  after  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation.  The figure depicts firing index (FI) of each STT neuron in Group I (A) and Group III (B). The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  baseline  FI  was  measured  before pentobarbital (PB; 200 μg/side) microinjections. The downward arrow indicates time  zero corresponding to the time of completion of PB microinjections.    93   Results   3.2.3.2.4. Sural Nerve‐Evoked STT Responses: Pentobarbital Microinjections    The  sural  nerve‐evoked  responses  (Su‐ER)  of  10  out  of  18  STT  neurons  were  deemed  suitable for testing with PB microinjections. As  outlined previously the Su‐ER (2 times the  threshold  intensity)  of  STT  neurons  were  recorded  and  measured  at  the  four  time  points  following  PB  microinjections.  The  mean  response  magnitude  and  latencies  at  each  of  the  post‐microinjection time points were compared with the respective baseline readings using  paired  Student’s  t  test.  The  results  of  the  STT  neurons  in  the  Groups  II  and  III  as  well  as  their combined data are reported below.    The results of effects of PB microinjections on Su‐ER of STT neurons are presented in  the Figure 3.28.   The  group  mean  (±  SEM)  baseline  control  response  magnitude  of  Group  II  STT  neurons (n = 6) before PB microinjections measured 8.8 ± 2.3 spikes/trial. The group mean (±  SEM)  response  magnitude  of  the  same  STT  neurons  significantly  decreased  to  4.9  ±  2.1  spikes/trial within 2 minutes following PB microinjections (p < 0.05, paired Student’s t test).  This  corresponds  to  a  45%  decrease  in  the  response  magnitude,  which  recovered  toward  baseline values within 15 minutes (Fig. 3.28A, left panel).    The  mean  latency  of  Su‐ER  of  Group  II  STT  neurons  was  not  altered  following  PB  microinjections (Fig. 3.28A, right panel) (p > 0.05, paired Student’s t test).   94   Results  In the case of Group III STT neurons (n = 4), there was no significant change in either  of the mean magnitude or latency of the Su‐ER following PB microinjections (Fig. 3.28B) (p >  0.05, paired Student’s t test).   When the data of Group II and Group III were combined, the group mean (± SEM)  response  magnitude  was  also  significantly  reduced  by  35.5%  within  2  min  to  6.3  ±  1.7  spikes/trial when compared to the baseline response magnitude of 9.3 ± 1.7 spikes/trial (p =  0.01,  paired  Student’s  t  test).  The  response  magnitude  remained  depressed  up  to  30  min  after  which  it  returned  to  pre‐microinjection  baseline  (Fig.  3.28C).  There  was  no  post‐PB  microinjections  significant  change  in  the  response  latency  to  sural  nerve  stimulation  in  either  Group  II  or  III  or  the  combined  set  of  data  from  Group  II  and  Group  III  (p  >  0.05,  paired Student’s t test).    To examine if microinjections of PB altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal  cord  after  sural  nerve  stimulation  was  analyzed.  The  peak‐trough  amplitude  and  latency  of  the  afferent  volleys  were  compared  before  and  after  PB  microinjection.  As  shown  in  the  Figure  3.29,  both  the  peak‐ trough amplitude as well as latency of the sural afferent volley did not change significantly  following microinjections of PB (p > 0.05, paired Student’s t test).   These  results  indicate  that  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  rat  MPTA  suppressed  the magnitude  of Su‐ER of STT  neurons.  The latency  of SuER  was not altered.  Similarly the presynaptic volley arising from sural nerve stimulation was not affected by PB  microinjections into the MPTA.    95   Results  Response Magnitude                                           Response Latency  Group II (n = 6)  A.  25  14 Mean Latency (ms)  Spikes / Trial  12 10  *  8 6 4 PB  2 0  20 15 10 5  PB  0 -30  0  B.  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  2 15 30 Time Points (min)  60  2 15 30 Time Points (min)  60  Group III (n = 4) 14  25 Mean Latency (ms)  Spikes / Trial  12 10 8 6 4 PB  2 0  20 15 10 5  PB  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  C.  60  -30  0  Combined (Groups II and III, n = 10) 25  Spikes / Trial  10  *  8  Mean Latency (ms)  12  * *  6 4 2  PB  0  20 15 10 5  PB  0 -30  0  2 15 30 Time Points(min)  60  -30  0     Figure 3.28 Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized  rat preparation on  sural nerve‐evoked  responses of STT  neurons.  Each  bar in  each graph represents the group mean (± SEM) value. Time relative to zero is indicated in  minutes.  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  baseline  responses  were  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  response magnitude (spikes/trial) and response latency (ms) are represented in the left and  right panels, respectively. The graphs in A and B represent results of Group II and Group III  STT neurons, respectively. The graphs in C show the combined data of Group II and Group  III STT neurons. The asterisks (*) indicate statistically significant reduction in the response  magnitude following PB microinjections compared to the baseline. The test statistics (paired  Student’s t test) for significant differences is as follows: Group II (baseline‐2 min: t(5) = 2.72,  p = 0.04); combined Groups II and III (baseline‐2 min: t(9) = 3.21, p = 0.01; baseline‐15 min:  t(9) = 2.67, p = 0.03; baseline‐30 min: t(9) = 2.6, p = 0.03).   96   Results                             Peak‐Trough Amplitude                                   Latency  A.  Group II (n = 6) 5  0.7  4  0.5  Latency (ms)  Peak Height (μV)  0.6  0.4 0.3 0.2  2 1  PB  0.1  3  0.0  PB  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  B.  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  1.0  1.0  0.8  0.8 Latency (ms)  Peak Height (μV)  Group III (n = 4)  0.6 0.4 0.2 0.0 0  2 15 30 Time Points (min)  C.  0.4 0.2  PB -30  0.6  PB  0.0  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  0.6  0.6  0.5  0.5 Latency (ms)  Peak Height (μV)  Combined (Groups II and III, n = 1))  0.4 0.3 0.2 0.1  0.4 0.3 0.2 0.1  PB  0.0  PB  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60     Figure  3.29  Effects  of  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  on  sural  nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar spinal cord of isoflurane‐anesthetized  rat preparation. Time relative to zero is indicated in minutes. The time point ‐30 min in each  graph  represents  the  time  at  which  baseline  responses  were  measured  before  PB  (200 μg/side)  microinjections.  Each  bar  represents  the  group  mean  (±  SEM)  value.  Peak‐trough  amplitude (μV) and the latency (ms) of afferent volley are shown in the left and right panels,  respectively.  The  graphs  in  A  and  B  represent  results  of  Groups  II  and  III  STT  neurons,  respectively. The graphs in C show combined results of Group II and III. For all cases, p >  0.5, paired Student’s t test.   97   Results   3.2.3.2.5. Sciatic Nerve‐Evoked STT Responses: Pentobarbital Microinjections   The  sciatic  nerve‐evoked  responses  (Sc‐ER)  of  10  out  of  18  STT  neurons  were  deemed  suitable  for  testing  with  pentobarbital  (PB)  microinjections.  As  outlined  previously  the  Sc‐ ER  (2  times  the  threshold  intensity)  were  recorded  and  measured  at  the  four  time  points  following  PB  microinjections.  The  mean  response  magnitude  and  latencies  at  each  of  the  post‐microinjection time points were compared with the respective baseline readings using  paired  Student’s  t  test.  The  results  of  the  STT  neurons  in  the  Groups  II  and  III  as  well  as  their combined data are reported below.    The  results  of  Sc‐ER  of  STT  neurons  following  PB  microinjections  are  graphically  summarized in the Figure 3.30.   The  group  mean  (±  SEM)  baseline  control  response  magnitude  of  Group  II  STT  neurons  (n  =  6)  before  PB  microinjections  measured  9.7  ±  2.8  spikes/trial.  Following  PB  microinjections,  the  group  mean  (±  SEM)  magnitude  of  Sc‐ER  of  Group  II  (n  =  6)  STT  neurons was significantly reduced by 35% to 6.3 ± 2.7 spikes/trial at 2 min, by 42% to 5.6 ±  2.7 spikes/trial at 15 min and by 41% to 5.7 ± 2.4 spikes/trial at 30 min time points following  PB microinjections (p < 0.05, paired Student’s t test). The response magnitude recovered to  the  pre‐microinjection  baseline  value  with  60  min  of  PB  microinjections  (Fig.  3.30A,  left  panel).   98   Results  In the case of Group III STT neurons (n = 4), the mean magnitude as well as latency  of  the  Sc‐ER  were  not  altered  following  PB  microinjections  (Fig.  3.30B)  (p  >  0.05,  paired  Student’s t test).   When the data of Group II and Group III were combined (n = 10), the group mean (±  SEM) baseline  response  magnitude measured  9.7 ± 1.8  spikes/trial.  For this  combined  data  set the response magnitude was also significantly reduced by 26% to 7.2 ± 1.6 spikes/trial at  2 min, by 29% to 6.9 ± 1.7 spikes/trial at 15 min, and by 27% to 7.1 ± 1.7 spikes/trial at 30 min  time  point  following  PB  microinjections  (p  <  0.05,  paired  Student’s  t  test).  The  suppressed  response  magnitude  recovered  toward  the  pre‐injection  baseline  within  60  min  of  PB  microinjection  (Fig.  3.30C,  left  panel).  The  response  latency  to  sciatic  nerve  stimulation  in  either Group II or III or the combined data set of Group II and Group III was not altered by  PB microinjections (p > 0.05, paired Student’s t test).    To examine if microinjections of PB altered the presynaptic afferent input to the STT  neurons,  the  afferent  volley  recorded  within  the  spinal  cord  after  sciatic  nerve  stimulation  was  analyzed.  The  peak‐trough  amplitude  and  latency  of  the  afferent  volleys  were  compared  before  and  after  PB  microinjection.  As  shown  in  the  Figure  3.31,  both  the  peak‐ trough amplitude as well as latency of the sciatic afferent volley did not change significantly  following microinjections of PB (p > 0.05, paired Student’s t test).   These  results  indicate  that  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  rat  MPTA  suppressed  the  magnitude  of  Sc‐ER  of  STT  neurons.  The  mean  latency  of  the  evoked   99   Results  responses  was  not  altered.  Similarly  the  presynaptic  volley  arising  from  sciatic  nerve  stimulation was not affected by PB microinjections into the MPTA.      The  results  of  effects  of  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  on  the  four  electrophysiological parameters are illustrated in Tables 3.6 through 3.8.   100   Results  Response Magnitude                                     Response Latency  A.  Group II (n = 6) 60 Mean Latency (ms)  14 Spikes / Trial  12 10  *  8 6  *  *  4 PB  2 0  0  2 15 30 Time Points (min)  B.  30 20 10  60  PB  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Group III (n = 4)  14 Mean Latency (ms)  60  12 Spikes / Trial  40  0 -30  10 8 6 4 PB  2 0  50 40 30 20 10  PB  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  C.  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Combined (Groups II and III, n = 10)  14 Mean Latency (ms)  60  12 Spikes / Trial  50  10  *  8  *  *  6 4 PB  2 0  50 40 30 20 10  PB  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  Figure 3.30 Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked responses of STT neurons. Each bar in  each graph represents the group mean (± SEM) value. Time relative to zero is indicated in  minutes.  The  time  point  ‐30  min  in  each  graph  represents  the  time  at  which  baseline  responses  were  measured  before  microinjections  of  pentobarbital  (PB;  200 μg/side).  The  response magnitude (spikes/trial) and response latency (ms) are represented in the left and  right panels, respectively. The graphs in A and B represent results of Group II and Group III  STT neurons, respectively. The graphs in C show combined data of Group II and Group III  STT  neurons.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  response  magnitude  following  PB  microinjections  compared  to  the  baseline  magnitude.  The  test  statistics (paired Student’s t test) for significant differences is as follows: Group II (baseline‐2  min: t(5) = 3.66, p = 0.02; baseline‐15 min: t(5) = 4.07, p = 0.01; baseline‐30 min: t(5) = 4.89, p =  0.005); combined Groups II and III (baseline‐2 min: t(9) = 3.32, p = 0.009; baseline‐15 min: t(9)  = 3.61, p = 0.006; baseline‐30 min: t(9) = 3.28, p = 0.01).    101   Results                         Peak‐Trough Amplitude                                     Latency  A.  Group II (n = 6) 5  0.7  4  0.5  Latency (ms)  Peak Height (μV)  0.6  0.4 0.3 0.2  3 2 1  PB  0.1  PB  0  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  -30  60  B.  0  2 15 30 Time Points (min)  60  2 15 30 Time Points (min)  60  1.0  5  0.8  4 Latency (ms)  Peak Height (μV)  Group III (n = 4)  0.6 0.4 0.2  3 2 1  PB  PB  0  0.0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  C.  -30  60  0  Combined (Groups II and III, n = 10) 4  0.6  Latency (ms)  Peak Height (μV)  0.5 0.4 0.3 0.2 0.1  3 2 1  PB  PB  0.0  0 -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60  -30  0  2 15 30 Time Points (min)  60     Figure 3.31 Effect of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of isoflurane‐ anesthetized rat preparation on sciatic nerve‐evoked afferent volley recorded in the lumbar  spinal cord of the isoflurane‐anesthetized rat preparation. Each bar in each graph represents  the group mean (± SEM) value. Time relative to zero is indicated in minutes. The time point  ‐30 min in each graph represents the time at which baseline responses were measured before  microinjections of pentobarbital (PB; 200 μg/side). The peak‐trough amplitude (μV) and the  latency  (ms)  of  afferent  volley  are  shown  in  the  left  and  right  panels,  respectively.  The  graphs in A and B depict results of Group II and Group III STT neurons, respectively. The  graph in C shows combined results of Group II and Group III. For all cases p > 0.05, paired  Student’s t test.   102   Results      Group II STT Neurons  Electrophysiological Parameter   Baseline  SFR (n = 6)  11.8 ± 2.9   FI (n = 6)  88.9 ± 7.4   Su-ER Magnitude (n = 6) Su-ER Latency (n = 6) Sc-ER Magnitude (n = 6) Sc-ER Latency (n = 6)  8.8 ± 2.3   minutes after pentobarbital (200 μg/side)  microinjections 15  30   2   16.1 ± 5.2  9.7 ± 2.8  42.3 ± 3.6   9.7 ± 1.3   *  5.5 ± 1.9    *  66.8 ± 14.1  78.5 ± 14.2   5.3 ± 1.4   49.2 ± 13    *  60  12.1 ± 3.5  78 ± 12.2   *  5.8 ± 2.2   5.9 ± 2.3   10.2 ± 2.3   15.7 ± 3.7   16 ± 4.8   15.9 ± 6.6   16.6 ± 4.6   *  9.6 ± 2.6   4.9 ± 2.1    6.3 ± 2.7    *  5.6 ± 2.4    *  5.7 ± 2.4    43.2 ± 5.8   43.4 ± 4.8   41.2 ± 6.14   44.6 ± 5.6     Table 3.6 Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of  the isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of Group  II STT neurons. The results are expressed as the group means (± SEM). The neurons in this  group  were  treated  with  pentobarbital  microinjections  (200  μg/side)  only.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  electrophysiological  parameter  following  pentobarbital  microinjections  compared  to  its  respective  baseline  value  (p  <  0.05,  Paired  Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)   103   Results      Group III STT Neurons  Electrophysiological Parameter   Baseline  SFR (n = 6)  19 ± 4.7   FI (n = 6) Su-ER Magnitude (n = 4) Su-ER Latency (n = 4) Sc-ER Magnitude (n = 4) Sc-ER Latency (n = 4)  minutes after pentobarbital (200 μg/side)  microinjections 15  30   2   *  12.8 ± 6.1    15.9 ± 5.8   15.9 ± 4.6   60   *  8.7 ± 7.7    51.3 ± 20.9  65.1 ± 12.4  93.8 ± 2.1   63 ± 19.4   10 ± 2.8   8.4 ± 2.7   8.7 ± 2.6   8.6 ± 1.3   8.9 ± 2.4   14.3 ± 4.6   14.5 ± 0.5   14.4 ± 0.2   14.5 ± 1.6   14.8 ± 1.8   9.7 ± 2.4   8.5 ± 2.6   8.8 ± 2.5   9.2 ± 2.2   9.4 ± 2.5   44.5 ± 0.5   45.5 ± 0.9   42.9 ± 1.2   43.5 ± 0.8   44.8 ± 1.1   49.9 ± 20.2  *    Table 3.7 Summary of effects of bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of  isoflurane‐anesthetized rat preparation on the electrophysiological parameters of Group III  STT  neurons.  The  results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  The  STT  neurons  in  this group were treated first with the bilateral microinjections of vehicle control solution (1  μL/side)  into  the  MPTA.  After  recovery,  these  same  neurons  were  treated  with  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  (200  μg/side)  into  the  MPTA.  This  table  shows  results  obtained  form  the  pentobarbital  microinjections.  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  electrophysiological  parameter  following  pentobarbital  microinjections compared to its respective baseline value (p < 0.05, Paired Student’s t test).  Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)   104   Results       Combined results of  Groups II & III STT Neurons   Electrophysiological Parameter   Baseline  SFR (n = 6)  15.4 ± 2.8   FI (n = 6)  89.3 ± 3.7   Su-ER Magnitude (n = 10) Su-ER Latency (n = 10) Sc-ER Magnitude (n = 10) Sc-ER Latency (n = 10)  minutes after pentobarbital (200 μg/side)  microinjections 15  30   2   *  10.7 ± 3.3  *  58.4 ± 12.1  56.1 ± 11.1  9.3 ± 1.7  15.4 ± 4.6  9.7 ± 1.8  43.6 ± 2.3   *  9.1 ± 3.2    60   12.8 ± 2.5   * 64.9 ± 12.7*   *  *  10.8 ± 3.5  72.8 ± 8.5  9.7 ± 1.6   6.3 ± 1.7    *  7 ± 1.7    7 ± 1.5    15.3 ± 2.9   15.4 ± 3.9   15.4 ± 4.5   15.9 ± 4   7.2 ± 1.9    *  6.9 ± 1.7    *  7.1 ± 1.7    *  6.7 ± 1.8   44.4 ± 3.7   43.2 ± 3.2   42..4 ± 3.9   44.7 ± 3.6     Table  3.8 Summary  of  combined  results  of  effects  of  bilateral  microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  on  electrophysiological  parameters  of  Group  II  and  Group  III  STT  neurons.  The  results  are  expressed  as  the  group  means  (±  SEM).  The  asterisks  (*)  indicate  statistically  significant  reduction  in  the  electrophysiological  parameter  following  pentobarbital  microinjections  compared to its respective baseline value (p < 0.05, Paired Student’s t test).   Legend:   SFR: spontaneous firing rate (spikes/s)  FI: firing index  Su‐ER magnitude: magnitude of sural nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Su‐ER latency: mean latency of sural nerve‐evoked STT response (ms)  Sc‐ER magnitude: magnitude of sciatic nerve‐evoked STT response (number of spikes/trial)  Sc‐ER latency: mean latency of sciatic nerve‐evoked STT response (ms)   105   Results  3.3. RESULTS OF HISTOLOGY OF MICROINJECTION SITES   In twelve rats, microinjections of pontamine blue dye solution were carried out in the MPTA  using the same stereotaxic coordinates that were used for PB/Vh microinjections. Figure 3.32  illustrates coronal sections of brainstems from three rats depicting the anatomical location of  the MPTA site in the brain stem marked by either microinjections of pontamine blue dye (B  and C) or cannula track mark (A).     The  dye  microinjections  were  found  to  be  in  brain  areas  corresponding  to  the  following  stereotaxic  coordinates  of  Paxinos  and  Watson  (2007):  AP:  ‐7.2  to  ‐8  mm  from  bregma, ML: 1.1 to 1.2 from the midline and DV: ‐ 7.0 to ‐7.7 mm from the dorsal surface of  the  brain.  The  dye  spread  was  found  to  be  limited  to  a  distance  of  1.5‐2  mm  in  the  mediolateral and dorsal‐ventral directions from the microinjection sites (Fig. 3.31 A, boxed  area). This corresponds precisely to the location of MPTA as reported in the earlier studies  (Devor and Zalkind, 2001; Sukhotinsky et al., 2005; Voss et al., 2005; Sukhotinsky et al., 2006;  Sukhotinsky  et  al.,  2007).  Figure  3.33  summarizes  the  data  of  anatomical  locations  of  dye  marks in the MPTA obtained from twelve rats.   106           Results        Figure 3.32  Representative examples of anatomical location of MPTA in the rat brainstem.  The figure shows coronal sections of brainstems of three different rats taken at the level of –  7.8  mm  caudal  to  bregma.  The  section  in  A  shows  track  mark  (black  rectangle)  made  by  microinjection  cannula  directed  toward  the  MPTA.  The  MPTA  region  marked  by  the  dye  (black  rectangle)  is  depicted  in  section  B.  Figure  C  shows  right  coronal  section  of  the  brainstem with MPTA (square), which is magnified (10 X) in the right hand picture. In the    107           Results   Figure 3.32 continued  magnified  image,  the  cavity  made  by  the  tip  of  the  microinjection  cannula  is  marked  by  arrow. Note the dye spread around the cavity within the brain parenchyma.  Legend: Aq – central aqueduct, DRD – dorsal part of dorsal raphe nucleus, MnR – median  raphe nucleus, MPTA – mesopontine tegmental anesthesia area, PMnR – paramedian raphe  nucleus, SPTg – subpeduncular tegmental nucleus                                             108           Results       Figure 3.33  Summary  of  anatomical  locations  of  dye  microinjections  within  the  MPTA  of  rat  brain  stem.  The  locations  of  dye  microinjections  (black,  filled  circles)  obtained  from  coronal sections of six rat brain stems are plotted on a representative section of brain stem  obtained  from  the  brain  atlas  of  rat  (Paxinos  and  Watson,  2007  electronic  version)  at  the  level  of  –  7.92  mm  caudal  to  bregma.  The  green  squares  represent  the  locations  of  tract  marks made by the tip of microinjection cannulae obtained from six other rat brain stems.  The  dye  used  was  pontamine  blue  (2%)  in  4M  NaCl.  The  figure  also  shows  abbreviated  names of some important structures surrounding the MPTA.  Legend: Aq – central aqueduct, DRD – dorsal part of dorsal raphe nucleus, DRV – ventral  part of dorsal raphe nucleus, MnR – median raphe nucleus, MPTA – mesopontine tegmental  anesthesia  area,  PMnR  –  paramedian  raphe  nucleus,  PnO  –  oral  part  of  pontine  reticular  nucleus,  PTg  –  pedunculopontine  tegmental  nucleus,  scp  –  superior  cerebellar  peduncle,   SPTg – subpeduncular tegmental nucleus   109           Discussion   CHAPTER 4  DISCUSSION     4.1. Introductory Remarks   The  recent  suggestion  that  the  mesopontine  tegmental  anesthesia  area  (MPTA)  in  the  brainstem  of  the  rat  may  function  as  an  important  node  for  the  induction  of  general  anesthesia  has  challenged  the  non‐specific  theory  of  the  general  anesthetic  actions  within  the CNS (Devor and Zalkind, 2001). The microinjections of GABAA –mimetic agents into this  particular  area  of  the  rat  brainstem  induced  classic,  reversible  general  anesthesia‐like  symptoms,  namely,  unconsciousness,  analgesia,  atonia  and  EEG  synchronization  (Devor  and  Zalkind,  2001).  The  observations  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  were  based  on  standardized  behavioral  test  assessment  techniques,  which  can  often  be  misinterpreted  or  obscured  by  the  inherent  limitations,  per  se,  in  the  techniques  used  and/or  complex  physiological  phenomena  occurring  during  the  test  state  of  anesthesia.  For  example,  the  analgesic effects of microinjections of pentobarbital (PB) as reported by Devor and Zalkind  (2001)  could  be  a  manifestation  of  the  animal’s  inability  to  respond  to  the  noxious  stimuli  due to the resulting muscle atonia. In other words, the animals may have been experiencing  pain to the noxious stimuli but could not respond because of muscle paralysis caused by PB  microinjections. Further, in behavioral testing paradigms, such as those employed by Devor  and Zalkind (2001), discrimination between true analgesia, unconsciousness and anxiolysis  is  often  ambiguous.  Thus,  the  analgesia  reported  through  the  behavioral  assessments  can   110           Discussion  not  be  unequivocally  related  to  the  “true  analgesia”.  Purported  neurophysiological  mechanisms  of  “true  analgesia”  are  only  conjectured  at  best.  Therefore,  it  seemed  appropriate to provide experimental evidence that would shed light on how analgesia arises  by performing the electrophysiological studies presented in this thesis.       In this thesis, the focus was on analgesia, simply because one of the most important   purposes  of  general  anesthesia  is  to  allow  pain‐free  surgery.  Several  lines  of  evidence  suggest  that  the  spinal  cord  is  an  important  site  of  action  for  general  anesthetic‐induced  analgesia  (de  Jong  et  al.,  1968;  de  Jong  et  al.,  1969;  de  Jong  et  al.,  1970;  Heavner,  1975;  Kitahata  et  al.,  1975;  Kullmann  et  al.,  1989;  Collins  et  al.,  1995;  Yamamori  et  al.,  1995;  Antognini, 1997; Antognini and Carstens, 1998). Further, intravenously injected thiopental, a  barbiturate anesthetic, suppresses the spontaneous, peripheral nerve, and glutamate‐driven  excitatory  responses  of  spinal  sensory  neurons  comprising  the  dorsal  spinocerebellar  tract  (DSCT)  and  spinoreticular  tract  (SRT)  in  chronic,  drug‐free  cats  (Soja  et  al.,  2002).  Thus,  in  the  quest  of  exploring  the  physiological  mechanism(s)  for  analgesia  induced  by  PB  microinjections into the MPTA, a logical site to target is the spinal cord.    The  spinothalamic  tract  (STT)  is  considered  to  be  the  most  important  spinal  ascending  pathway  in  the  mammals  conveying  nonnociceptive  and  nociceptive  transmission to the brain (Willis, 1985; Willis and Coggeshall, 2004; Willis, 2007). This being  so, it seemed logical to test whether the analgesia caused by the microinjections of PB into  the MPTA, was due to the reduction in the sensory inflow via the STT. Accordingly, certain  electrophysiological  properties  of  the  identified  STT  neurons  in  the  lumbar  spinal  cord  of   111           Discussion  the  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation  were  studied  before,  during,  and  after  microinjections of PB into the MPTA using extracellular recording techniques.    The principal hypothesis that was tested was that the bilateral microinjections of the  barbiturate  anesthetic,  pentobarbital  into  the  mesopontine  tegmental  anesthesia  area  (MPTA)  of  the  isoflurane‐anesthetized  rat  suppress  sensory  inflow  through  the  spinothalamic tract.       The  following  discussion  focuses  on:  1)  technical  considerations,  2)  general   properties  of  STT  neurons,  3)  inhibition  of  spontaneous  and  evoked  responses  of  STT  neurons  after  PB  microinjections  into  the  MPTA,  4)  time  course  of  PB  actions  on  STT  neurons 5) possible mechanism(s) of PB‐mediated suppression of STT neurons through the  MPTA, and 6) possible role of MPTA in the control of pain transmission.      4.2.  Technical  Considerations:  Animal  Model,  Study  Design,  Histology,  and  Statistical Analysis   The spinothalamic tract (STT) system in the acute rat preparation was chosen to study the  effects  of  PB  microinjections  into  the  MPTA  on  sensory  (nociceptive)  transmission.  The  experiments were performed in the rat, as opposed to other species such as the cat, rabbit,  guinea  pig,  etc.,  principally  because  the  precise  location  of  the  MPTA  region  was  well  described in the rat brain (Devor and Zalkind, 2001; Voss et al., 2005).    112           Discussion  A  chronic,  unanesthetized  cat  preparation  (Soja  et  al.,  1995)  perhaps  would  have  been  more  desirable  and  scientifically  more  appropriate  in  this  study,  because  of  the  obvious non‐requirement for the use of the anesthetic needed to prepare the spinal cord for  STT neuron recording as well as the lack of neuronal distortion caused by the anesthetic and  surgery  itself  (Soja  et  al.,  1995;  Soja,  2007).  In  this  unique  preparation,  STT  neurons  could  have  been  recorded  under  “natural”  conditions  during  the  state  of  wakefulness  akin  to  DSCT  and  SRT  neurons  (Soja  et  al.,  2002;  Soja,  2007).  However,  it  is  not  presently  known  whether  loci,  that  are  functionally  equivalent  to  the  rat  MPTA  exist  in  chronic  animal  preparations,  such  as  the  cat,  and,  if  they  do,  there  is  currently  no  data  on  their  precise  locations within the brain or their physiological function(s). Moreover, to our knowledge, no  reliable  chronic  rat  preparation  is  yet  available  for  recording  the  activities  of  the  lumbar  sensory neurons.    Indeed a chronic rat model is difficult to prepare with current techniques because of  the  small  size  of  the  vertebrae  and  relative  fragility  of  the  vertebral  column.  Such  factors  preclude  one  from  securing  a  permanent  implant  chamber  for  unit  recording  (Wall,  1967;  Soja,  2007).  Indeed,  the  development  of  a  viable  and  reliable  chronic  animal  preparation  akin to the chronic cat preparation developed by Soja and colleagues (Soja et al., 1995; Soja,  2007) would require significant time and resources that are beyond the scope of this thesis.    Even  with these limitations, the present  study provided  significant  findings  of STT  neuron  modulation  mediated  by  PB  through  the  MPTA.  The  results  of  the  present  study  provide a provenance to warrant further studies of PB microinjections into the MPTA in the   113           Discussion  chronic  unanesthetized  animal  preparation  that  is  free  of  neural  distortion  caused  by  preparative surgery and systemic anesthetic agents.   These caveats not withstanding, by necessity, the present study required the use of  isoflurane,  an  inhalational  general  anesthetic,  to  produce  a  state  of  surgical  anesthesia  to  prepare  the  animal  for  STT  neuron  recording  and  intracerebral  microinjection  procedures.  In  addition,  pancuronium,  a  neuromuscular  blocker,  was  used  to  block  the  movements  induced  by  electrical  stimulation  of  peripheral  nerves.  The  abolition  of  movements  produced  by  neuromuscular  blockade  is  essential  in  studies  of  this  kind,  but  it  should  be  recognized that this benefit is offset by the pancuronium‐induced de‐afferentation of large‐ diameter muscle spindle afferents and their sensory afferent input to STT neurons (Foreman  et  al.,  1979).  Hence,  the  surgical  preparation  of  the  spinal  cord  together  with  differential  effects  of  isoflurane  on  spinal  neurons  (Antognini  and  Carstens,  1999a,  b;  Antognini  et  al.,  1999; Jinks et al., 1999; Jinks et al., 2003; Haseneder et al., 2004; Cuellar et al., 2005) may have  altered the overall segmental and/or descending controls that impinge on STT neurons (Soja  et al., 2002; Soja, 2007). Although the STT neurons examined in this thesis were, by necessity,  recorded  under  “artificial”  conditions  (Soja,  2007)  the  actions  of  the  barbiturate  anesthetic  PB, when microinjected into the MPTA, were nevertheless reproducible and interpretable.   One  of  the  striking  observations  of  this  study  was  suppression  of  STT  neurons  by  one  general  anesthetic  (pentobarbital)  in  the  presence  of  the  other  background  anesthetic  (isoflurane). Probably the most critical experimental caveat of this study was the presence of  background  anesthetic  (isoflurane)  that  was  continuously  present  throughout  the   114           Discussion  experimental protocol. Ethical constraints  necessitated  having  the animal  anesthetized  at a  surgical  plane  of  anesthesia  at  all  the  times.  Even  though,  the  isoflurane  levels  were  minimized  as  much  as  possible,  while  still  maintaining  a  surgical  plane  of  anesthesia,  it  cannot be ruled out that complex interactions of isoflurane and PB may have occured on the  neural  circuitry  involved  in  the  MPTA‐mediated  STT  neurons  suppression  and,  for  that  matter, throughout other parts of the neuraxis including the spinal cord STT neurons being  recorded. It is possible that the isoflurane used to anesthetize the animal may have already  suppressed  the  excitability  of  STT  neurons  before  PB  microinjection  and  therefore  contributed  to  an  “occlusion”  phenomenon.  However,  in  the  absence  of  “true  baseline”  of  under  anesthesia‐free  control,  further  assessment  of  such  interactions  is  impossible  in  conventional  “acute”  animal  preparations.  Nevertheless,  one  would  expect  an  enhanced  suppression  of  STT  neurons  in  the  absence  of  any  background  anesthetic.  Such  a  possible  scenario would be expected to occur only in a chronic rat preparation, which is currently not  available (also, see Soja et al., 2001; Soja, 2007).       Standard  techniques  for  antidromic  identification  were  used  to  confirm  that  the   recorded spinal  neuron  in this  study  projected to the  thalamus.  Such  techniques  have  also  been used previously for identifying STT neurons in the rat (Giesler et al., 1976; Menetrey et  al., 1984; Palecek et al., 1992; Chen and Pan, 2002; Zhang and Giesler, 2005). All STT neurons  reported in this study fulfilled the following three “gold standard” antidromic criteria: 1) a  constant  antidromic  latency  (<  0.2  ms),  2)  high‐frequency  following  (>  300  Hz),  and  3)  a  collision  between  the  putative  antidromically  and  orthodromically  propagated  action   115           Discussion  potentials  (Lipski,  1981;  Ammons,  1989;  Palecek  et  al.,  1992;  Soja  et  al.,  1995).  Thus,  all  the  recorded spinal neurons reported in this thesis were confirmed to project to the contralateral  thalamus and therefore were identified as STT neurons.      One of the formidable technical challenges of this thesis was to record from the same   STT neuron for a protracted time wherein each STT neuron served as its own control before  and  after  microinjections  of  vehicle  control  solution  (Vh)  or  PB.  Here,  the  basic  electrophysiological  parameters  would  be  determined  at  regular  intervals  following  microinjection of Vh into the MPTA followed by microinjection of PB with a recovery period  between  the  two  microinjections.  This  approach  requires  stable  recording  conditions  that  exceed  four  hours.  Inevitably,  during  the  course  of  this  thesis,  many  STT  neurons  were  inadvertently  “lost”  during  the  baseline  data  collection  period  or  during  microinjection  procedure.    The  microinjection  procedure,  itself  increased  the  probability  of  losing  the  neuron  due  to  minute  vibrational  disturbances  to  the  experimental  preparation,  despite  conscientious efforts to minimize such disturbances. For these reasons it was not possible to  repeat the microinjections of either Vh or PB twice in the same neuron in every animal. As a  consequence  of  these  technical  issues,  the  data  collections  occurred  essentially  randomly  and  “post  hoc”  data  parsing  allowed  pooling  into  three  distinct  groups  of  STT  neurons.  These three groups of STT neurons, Group I (vehicle control‐only), Group II (pentobarbital‐ only) and Group III (vehicle control followed by pentobarbital group) were utilized to test  the principle hypothesis that the bilateral microinjections of pentobarbital into the MPTA of   116           Discussion  the  rat  brain  suppress  sensory  inflow  through  the  STT.  In  addition,  the  data  grouping  provided additional controls on STT neuron excitability as discussed later.      To  verify  that  the  PB/Vh  were  microinjected  actually  in  the  MPTA  pontamine  blue   dye was microinjected at the end of all recording protocols. For this, the same volume of the  dye, i.e., 1 μL, was injected into each side of the MPTA. The animal was then perfused 1 h  after  the  dye  microinjections.  Thus,  the  same  time  period  of  1  h  was  followed  after  dye  microinjections  as  that  followed  after  Vh/PB  microinjections.  An  unavoidable  technical  caveat  of  this  procedure  was  that  the  microinjection  cannulae  were  required  to  be  withdrawn  from  the  brain  for  loading  the  pontamine  blue  dye  into  them.  The  dye‐filled  cannulae were subsequently lowered into the brain at the stereotaxic coordinates previously  used  for  microinjections  of  Vh/PB.  Thus,  the  possibility  can  not  be  ruled  out  that  the  position  of  the  dye‐filled  cannulae  in  the  MPTA  was  not  exactly  the  same  as  that  used  for  microinjections of PB/Vh.    However,  several  measures  were  taken  to  minimize  the  possible  error  occurring  during repositioning of the dye‐filled cannulae into the microinjection site in the brain. First  of all, the movement of the cannulae was kept limited only in the dorsal‐ventral direction.  The  anterior‐posterior  and  mediolateral  positions  of  the  cannulae  were  undisturbed.  Secondly, before lowering the dye‐filled cannulae into the brain, the zero reference position  for  dorsal‐ventral  movement,  which  was  the  dorsal  surface  of  the  brain,  was  always  confirmed  to  be  the  same  as  that  used  for  Vh/PB  microinjections.  Notwithstanding  this  technical  caveat,  as  shown  in  the  Results  section,  the  histological  examination  of  the  brain   117           Discussion  sections  confirmed  that  the  location  of  dye  injections  was  indeed  in  the  MPTA.  This  was  confirmed  from  the  description  of  the  structures  surrounding  the  MPTA  (Devor  and  Zalkind, 2001) and stereotaxic atlas of the rat brain (Paxinos and Watson, 2007). In six rats,  location of the microinjection site was confirmed by examining the location of the dye. In six  other rats, the tips of tract marks made by microinjection cannulae were used to confirm the  location of microinjection site within the MPTA.      In this thesis, two statistical tests were used to analyze the data obtained, namely, a   paired  Student’s  t  test  and  a  repeated  measures  one‐way  analysis  of  variance  (ANOVA).  Surprisingly, where the paired Student’s t test indicated significant differences, the repeated  measures one‐way ANOVA failed to detect such differences. Two possible reasons that may  explain this are: 1) the relatively small sample size and, 2) the variability of the data within  the  small  sample  size.  However,  since  the  principal  concern  was  to  detect  significant  differences in each STT neuron parameter post‐microinjection at each time point against the  respective  pre‐microinjection  baselines  rather  than  among  the  time  points,  a  paired  Student’s  t  test  was  considered  more  appropriate  and  was  therefore  used  in  the  final  data  analyses.    The justification for using a paired Student’s t test for the final analyses was further  corroborated by the professional advice sought through the Statistical Consultation Services  provided  by  the  Department  of  Statistics  at  the  University  of  British  Columbia.  Thus,  not  only the techniques and parameters used to the test the hypothesis but also the choice of the  most  appropriate  statistical  test  for  detecting  significant  differences  appears  to  be  of   118           Discussion  paramount  importance  in  accepting  or  rejecting  the  null  hypothesis  that  microinjection  of  PB into the MPTA has no effect on STT neuron excitability and ultimately, the interpretation  of data obtained vis‐à‐vis anesthetic action of PB in the MPTA. This issue is of considerable  scientific importance given the inherit ramifications related to warranting further studies on  pentobarbital’s actions on STT neurons via the MPTA.       4.3. STT Neurons: General Properties   Spinothalamic tract (STT) neurons recorded in this thesis project were located at spinal cord  depths ranging from 97 to 1528 μm with an average depth of 772 ± 397 μm below the surface  of  the  spinal  cord.  This  range  corresponds  to  laminae  I  to  V  of  the  rat  spinal  grey  matter  (Molander  et  al.,  1984;  Grant  and  Koerber,  2004)  as  indicated  by  Palecek  et  al.  (1992).  The  laminar organization of the lumbar spinal cord in the rat (Molander et al., 1984; Grant and  Koerber, 2004) is closely similar to Rexed’s (1952) laminae in the cat spinal cord. The in situ  recording  depths  were  determined  primarily  from  the  electronic  display  of  the  hydraulic  microdrive.  The  precise  determination  of  the  laminar  locations  of  the  STT  neurons  within  the  spinal  cord  by  this  technique  can  often  be  erroneous  due  to  several  factors,  including,  but not limited to, the inherent dead space in the hydraulic microdrive, constant presence of  cerebrospinal fluid and/or mineral oil covering the exposed spinal segment that can obscure  one from determining the “true” dorsal surface of the cord as zero reference for measuring  the recording depth (Soja et al., 2001). Also, the relatively smaller size of the spinal cord of  the  rat  in  comparison  to  the  other  mammalian  spinal  cords,  e.g.  cat,  can  exaggerate  such   119           Discussion  errors to a greater extent. The only precise method to determine the depth of the recording  is to employ intracellular horseradish peroxidase (HRP) labeling procedures which stain the  entire soma‐dendritic processes of the recorded neurons (Brown et al., 1977). This technique,  however, was far beyond the scope of the present thesis project. Nevertheless, the average  depth of the STT neurons studied in this thesis project corroborates that reported by Palecek  et al. (1992).   The mean antidromic latency of 18 STT neurons reported in this thesis measured 4.4  ± 0.6 ms (range: 3.7 – 5.8 ms) while the mean axonal conduction velocity was estimated to be  18.6 ± 2.5 m/s (range: 14.3 – 23 m/s). These values are in close agreement with those reported  previously  for  the  STT  neurons  in  the  lumbar  spinal  cord  of  the  rat  (Giesler  et  al.,  1976;  Menetrey et al., 1984; Palecek et al., 1992). The conduction velocities of lumbar STT neurons  in the rat reported by Giesler et al. (1976) as well as Palecek et al. (1992) were in the range of  14 ‐ 26 m/s. Similarly, Menetrey et al. (1984) have reported a mean antidromic latency of 4.5  ±  0.5  ms  with  an  estimated  mean  conduction  velocity  of  17.8  ±  2.0  m/s.  Notably,  the  population of STT neurons recorded by Menetrey et al. (1984) was located in deeper laminae  (VII, VIII and IX). On the other hand, most of the STT neurons reported in this thesis were  located in laminae I to V, which corresponds more closely to findings reported by Giesler et  al. (1976) and Palecek et al. (1992). Thus the STT neuron population included in this study,  based  on  recording  depth,  seems  to  be  similar  to  that  reported  by  Giesler  et  al.  (1976)  and  Palecek  et  al.  (1992).  In  a  more  recent  study,  Zhang  and  Giesler  (2005)  have  reported  two  populations  of  the  STT  neurons  in  the  cervical  enlargements  of  anesthetized  rats.  One   120           Discussion  population  of  STT  neurons  located  in  the  superficial  dorsal  horn  had  an  estimated  mean  conduction  velocity  of 5.1  ± 0.4 m/s while  the other,  which  was located  in  the deep  dorsal  horn, had an average conduction velocity of 8.9 ± 0.8 m/s. These conduction velocities are 2‐ 3  times  slower  than  that  reported  (~  19  ms/s)  in  this  thesis.  However,  in  the  Zhang  and  Giesler (2005) study, the STT neurons were recorded from the cervical enlargement (C7 – C8)  of the rat spinal cord, while the STT neurons in the present study were recorded from the L1  spinal  segment.  Moreover,  the  majority  of  antidromically  recorded  STT  neurons  in  the  Zhang  and  Giesler  (2005)  study  projected  to  posterior  thalamic  nuclei  rather  than  to  the  more rostrally located VPL nucleus. Thus, differences between the values of the latency, the  conduction velocities as well as axon termination sites reported in this thesis and those by  Zhang and Giesler (2005) are likely to be due to the different populations of the STT neurons  across  the  various  spinal  cord  segments.  The  relatively  faster  conduction  velocities  of  the  STT  neurons  in  the  present  study  suggest  that  their  axons  are  of  larger  diameter,  and  are  probably  myelinated  compared  to  those  neurons  reported  by  Zhang  and  Giesler  (2005),  which seem to be of smaller diameter and may be sparsely myelinated.    To  determine  whether  STT  neuron  conduction  velocity  was  related  to  the  spinal  recording depth, a correlation analysis was carried out between these two parameters. The  analysis  revealed  no  correlation  between  the  axonal  conduction  velocity  and  the  spinal  recording  depth  of  STT  neurons.  Similar  observations  have  been  reported  for  lumbar  STT  neurons  in  cat  (Ammons,  1987)  and  monkey  (Ammons,  1989)  spinal  cord.  In  contrast,  Palecek  et  al.  (1992)  have  reported  that  the  more  superficial  STT  neurons  in  the  lumbar   121           Discussion  spinal cord of the rat had slower conduction velocities. Similarly, Giesler et  al. (1976) have  noted that the STT neurons located in the superficial dorsal horn of the lumbar spinal cord  of  the  rat  had  significantly  slower  conduction  velocities  than  those  located  in  the  deep  dorsal horn. Thus, while some lines of evidence suggest a correlation between the recording  depth  and  conduction  velocity  of  STT  neurons,  the  present  study  revealed  no  such  correlation.  This  may  be  due  to  the  relatively  small  sample  size  or  segmental  level  of  the  spinal  cord  where  STT  neurons  were  recorded.  Moreover,  greater  dorsal‐ventral  laminar  spread  of  STT  neurons  reported  in  the  present  thesis  project  may  have  diluted  a  possible  correlation  between  these  two  parameters.  Had  many  more  STT  neurons  been  examined,  such a correlation may have manifested itself. The significance of such  a correlation in the  absence of any procedural test is not clear.       4.4.  Inhibition  of  Spontaneous  and  Evoked  Responses  of  STT  Neurons  by  Pentobarbital Microinjections into the MPTA   The  results  of  the  present  study  clearly  show  that  the  cellular  excitability  of  STT  neurons  was  significantly  and  reversibly  suppressed  following  pentobarbital  (PB)  microinjections  into  the  MPTA.  Given  that  the  vehicle  control  solution,  containing  ethanol,  a  CNS  depressant  itself,  did  not  alter  these  parameters  after  microinjections  into  the  MPTA  indicates  that  the  effects  were  due  to  the  barbiturate  anesthetic  PB  itself.  The  observation  that the PB microinjections into the MPTA suppress the animal responses to noxious stimuli  (Devor and Zalkind, 2001; Voss et al., 2005) can be explained on the findings from this study.   122           Discussion  That is, the “analgesia” observed in the Devor and Zalkind (2001) study can be attributed, in  part,  to  a  reduction  in  sensory  inflow  through  the  STT.  In  the  following  sub‐sections,  the  effect  of  intracerebrally  microinjected  PB  on  each  of  the  parameters  is  discussed.  The  possible  neurophysiological  mechanisms  including  possible  neural  interconnections  between the MPTA neurons and the pain transmission and modulation systems within the  brain and spinal cord are also discussed.       4.4.1. Spontaneous Firing Rate    All of the L1 STT neurons recorded in the isoflurane‐anesthetized rat preparation displayed  ongoing spontaneous activity. The  ongoing activity  of the STT  neurons  at  the  resting  state  could  be  due  to  the  input  from  central  and  peripheral  neurons  as  well  as  the  intrinsic  integrative  properties  of  the  STT  neurons  (Surmeier  et  al.,  1989;  Zhang  et  al.,  1991a).  STT  neurons receive tactile and nociceptive afferent input via Aβ, Aδ and C fibers (Willis, 1985;  Willis  and  Coggeshall,  2004).  In  addition,  STT  neurons  recorded  in  the  lumbosacral  and  thoracolumbar  segments  of  monkey  spinal  cord  are  known  to  receive  proprioceptive  (Foreman  et  al.,  1979)  and  enteroceptive  inputs  (Milne  et  al.,  1981),  respectively.  Tissue  damage  resulting  from  surgical  manipulations  can  serve  as  sufficient  stimuli  to  activate  primary  afferents,  thereby  providing  tonic  excitatory  input  to  the  STT  neurons.  The  spontaneous  spike  activity  under  the  present  experimental  conditions  is  also  offset  by  the  depressant  actions  of  isoflurane  required  to  maintain  a  surgical  plane  of  anesthesia  (see  Vahle‐Hinz and Detsch, 2002). Despite these considerations, the mean baseline spontaneous   123           Discussion  firing rate (SFR) of the 18 STT neurons measured ~13 spikes/s. This SFR is much higher than  that of the STT neurons recorded in the lower lumbar (L4 ‐ L5) spinal cord segments reported  in  previous  studies  (Palecek  et  al.,  1992;  Chen  and  Pan,  2002).  In  the  studies  reported  by  Palecek  et  al.  (1992)  as  well  as  Chen  and  Pan  (2002),  the  SFR  measured  approximately  5  spikes/s and < 1 spikes/s, respectively. The differences between the background activities of  the STT neurons reported herein and those by Chen and Pan (2002) as well as Palecek et al.  (1992)  may  be  due  to  a  number  of  factors,  including,  but  not  limited  to,  the  type  of  anesthetic  used.  In  the  later  two  studies  PB  was  used  as  the  general  anesthetic  agent,  whereas in the present study, isoflurane was used to induce a surgical plane of anesthesia.    A  recent  study  from  our  laboratory  has  shown  that  the  lumbar  STT  neurons  recorded  in  the  same  isoflurane‐anesthetized  rat  preparation,  as  used  in  this  thesis,  are  under  descending  modulatory  influences,  which  are  dependent  on  the  type  of  general  anesthetic  used  (Soja  et  al.  unpublished  observation).  STT  neurons  in  the  dorsal  horn  are  largely  under  tonic  descending  facilitatory  influences  when  recorded  during  isoflurane  anesthesia. The descending influences on the same recorded STT neurons undergo a switch  from  facilitatory  to  inhibitory  influences  during  the  changeover  from  isoflurane  to  PB  anesthesia  (Soja  et  al.  unpublished  observation).  Thus,  the  relatively  higher  baseline  spontaneous activity of the STT neurons reported here compared to previous studies might  be due  in part to the use of isoflurane anesthesia. There appears to be  no other studies on  STT neuron responses recorded in the rat under isoflurane anesthesia in the literature that   124           Discussion  can  corroborate  these  observations.  This  is  rather  surprising  given  the  widespread  use  of  isoflurane as an inhalational anesthetic in human surgical procedures (Evers et al., 2006).      The mean baseline SFR of the STT neurons in Groups I, II, and III were ~ 9, 12, and   19 spikes/s, respectively. The mean baseline SFR of the Group III STT neurons seemed to be  somewhat  higher  than  that  of  Groups  I  and  II.  However,  statistical  comparison  between  baseline SFR of the three groups showed no significant difference. The apparently different  baseline  SFR  of  the  STT  neurons  in  these  three  groups  is  likely  due  to  the  sampling  bias  leading to preferential selection of anatomically different subsets of STT neurons among the  groups  (Surmeier  et  al.,  1989).  Moreover,  lamina‐specific  differences  in  the  spontaneous  discharge properties of dorsal horn neurons in the in vitro rat spinal cord preparation have  been  reported  recently  (Ruscheweyh  and  Sandkuhler,  2002).  Hence,  to  rule  out  the  possibility of sampling bias, a correlation analysis between the recording depth of the STT  neurons below the surface of the spinal cord and their respective baseline SFR within each  group was performed. The correlation analysis revealed no significant relationship existed  between the recording depth and SFR in any of the three groups (see Results 3.2.2.1). Thus,  the apparent differences in the SFR of the STT neurons in the three groups were not likely  due  to  sampling  bias.  Taken  together,  the  statistical  analysis  indicates  that  all  the  STT  neurons  recorded  in  this  thesis  represent  a  homogenous  population  of  STT  neurons.  In  contrast to the results of this study, a significant relationship has been reported between the  recording depth  and  SFR of STT neurons recorded  in  the primate  lumbosacral  spinal  cord  (Surmeier et al., 1989). The relatively higher firing rates of STT neurons located in the deeper   125           Discussion  laminae  (IV‐VI),  as  reported  by  Surmeier  et  al.  (1989)  have  been  attributed  to  the  large  dendritic  trees  of these neurons, and  subsequently, large  number  of afferent  connectivities  (Surmeier et al., 1989).     In  this  study,  slight  variations  were  found  in  the  background  spike  activities  of  individual  STT  neurons  following  microinjections  of  vehicle  control  solution  (Vh)  into  the  MPTA. For some STT neurons, the spike activity was slightly reduced, for others there was  slight increase in the spike activity. Collectively, when the entire population of STT neurons  was  considered,  spike  activity  did  not  differ  significantly  following  microinjections  of  pentobarbital  (PB)‐free  vehicle  into  the  MPTA.  This  provided  a  reliable  control  for  the  actions of PB on STT neuron activity. Hence the actions of PB on spontaneous spike activity  could be reasonably attributed to the actions of PB itself. These observations correspond to  the behavioral observations in conscious rats reported by Devor and Zalkind (2001), where  microinjections  of  control  vehicle  into  the  MPTA  failed  to  induce  general  anesthesia‐like  state and the associated analgesia.    As shown in the Results section, microinjections of PB into the MPTA resulted in a  rapid and significant decrease in the mean SFR of the STT neurons. In the case of the Group  II STT neurons, which were treated only with the PB microinjections, this suppression was  marked and measured > 50%. Similarly, a > 45% decrease was observed in the average SFR  of the Group III STT neurons. In the case of both of these neuron groups, this suppression in  the  SFR  was  rapid  and  occurred  within  two  minutes  of  PB  microinjections.  The  rapid  change in the SFR strongly suggests a local action(s) of PB in the MPTA. In the case of the   126           Discussion  Group II STT neurons, which were treated only with PB microinjections, this suppression in  the mean SFR was sustained for fifteen minutes and was followed by recovery toward the  baseline firing rate within thirty minutes. The SFR of Group III STT neurons was suppressed  for  a  shorter  time  period  (compared  to  the  Group  II  STT  neurons)  and  recovered  to  the  baseline firing rate within fifteen minutes of the PB microinjections.    Interestingly, in the case of the Group III STT neurons, after recovery within fifteen  minutes of PB microinjections, there was an “anomalous” but significant decrease in the SFR  after sixty minutes of the PB microinjections. This decrease was more pronounced than that  observed immediately following the PB microinjections. It is not known presently, whether  this  second  anomalous  decrease  in  the  SFR  was  due  to  a  drug  effect  at  the  level  of  MPTA  neurons or due to some other factor(s).    There are however two possible explanations for this anomalous decrease in the SFR.  First, there is a possible depression of spontaneous spike rate through the re‐distribution of  PB  to  the  spinal  cord  through  the  CSF  and/or  blood  flow,  where  it  may  have  directly  suppressed  the  activities  of  the  STT  neurons.  However,  this  possibility  seems  to  be  less  likely,  since  this  second  drop  in  the  SFR  after  initial  recovery  was  not  observed  in  case  of  Group  II  STT  neurons,  which  were  recorded  for  the  same  length  of  time  after  PB  microinjections. The second possibility is related to the physiological state of the spinal cord.  Group  III  STT  neurons  were  tested  first  with  microinjections  of  Vh  before  PB  microinjections.  For  this  group,  the  spinal  cord  was  exposed  for  over  10  h  (including  the  time  required  for  post‐laminectomy  surgical  procedures,  antidromic  identification  of  STT   127           Discussion  neuron,  baseline  recording,  and  recordings  following  Vh  microinjections,  recovery  period,  and recording following PB microinjections). Such a long exposure time may have induced  time‐dependent  deterioration  in  the  physiological  state  of  the  spinal  cord,  despite  considerable  conscientious  efforts  to  maintain  the  animal’s  vital  signs  and  depth  of  anesthesia  within  the  constraint  of  normal  physiological  limits.  Irrespective  of  the  mechanism underlying this decrease in the spike activity of Group III STT neurons at the 60  min post PB‐microinjection time point, the actions of PB in the MPTA on STT neurons are  consistent  with  the  same  time  course  as  that  observed  by  Devor  and  Zalkind  (2001)  who  first showed the anesthetic actions of PB in the MPTA.    4.4.2. Interspike Interval Parameters   Many  CNS  neurons  undergo  alterations  in  their  spike  firing  patterns when  shifts  occur  in  the animal’s behavioral state as reflected by predictable changes in their ISIH distributions  as  well  as  CV  and  CD  values.  For  example,  thalamocortical  (TC)  neurons  operate  in  two  modes depending on the animal’s behavioral state. During wakefulness, the spike discharge  of TC neurons was characterized by a regular tonic firing pattern that is referred to as “relay  mode” (Baker, 1971; Steriade and McCarley, 2005). When the animal’s behavioral state shifts  from wakefulness to non‐rapid eye movement (NREM) sleep accompanied by EEG spindle  oscillations, TC neurons switch from relay mode to a “bursting or oscillatory mode” that is  characterized  by  high‐frequency  bursts  of  spikes  with  long  interspike  intervals.  Clear  cut  changes  occur  in  TC  neuron  ISIH  distributions,  which,  in  turn,  reflect  spike  burst  activity  that  are  further  confirmed  by  changes  in  CV  and  CD  (Steriade  and  McCarley,  2005).   128           Discussion  Changes in the spike firing pattern have also been shown to occur in some ascending spinal  sensory  neurons,  including  the  DSCT  and  SRT  neurons  during  sleep  vs.  wakefulness  (see  Soja  et  al.,  2007;  Soja  et  al.,  1996).  Since  sleep  and  general  anesthesia  share  many  common  characteristics, it was logical to examine in the present study if microinjections of PB into the  MPTA altered the firing patterns of STT neurons.  To determine whether microinjections of  PB  into  the  MPTA  altered  the  spike  pattern  of  STT  neurons,  the  interspike  interval  histogram  (ISIH)  distributions  as  well  as  the  values  for  coefficient  of  variation  (CV)  and  coefficient of dispersion (CD) derived from 2 min spike trains were analyzed.  As shown in  the  Results  section,  microinjections  of  neither  Vh  nor  PB  altered  any  of  the  interspike  interval  parameters,  indicating  that the  spike  patterns  of  STT  neurons  as  a  population  did  not change. Had STT spike patterns changed from a regular “relay mode” to a “burst mode”  following  PB  microinjections,  such  a  finding  would  suggest  that  PB  may  exert  effects  on  neural networks in the brain affecting sensory neurons in the spinal cord that overlap with  those  of  the  TC  axis.  Further,  if  the  STT  spike  pattern  had  shown  “burst‐like”  activity  following PB microinjections into the MPTA, such a finding could also possibly suggest that  common  neural  networks  mediate  components  of  the  states  of  natural  sleep  and  MPTA‐ mediated general anesthesia.    4.4.3. Antidromic Firing Index   The  antidromic  firing  index  (FI),  which  indicates  the  probability  of  the  STT  neurons  responding  to  stimuli  applied  to  the  thalamus,  was  used  to  indirectly  measure  the  excitability of the STT neurons. The FI method has long being used for testing changes in the   129           Discussion  postsynaptic  excitability  of  motor  neurons  (Hunt,  1955;  Lloyd  and  McIntyre,  1955;  Wilson  and  Burgess,  1962),  group  Ia  and  Ib  afferents  (Wall,  1958;  Willis  et  al.,  1976),  tooth  pulp  afferents  (Lisney,  1979;  Cairns  et  al.,  1996)  and  some  descending  fiber  systems  (Rudomin  and  Jankowska,  1981).  In  studies  of  primary  afferent  terminals,  per  se,  the  presynaptic  inhibitory  changes  in  the  terminal  excitability  are  proposed  to  be  related  to  a  process  of  primary  afferent  depolarization  (PAD)  or  primary  afferent  hyperpolarization  (PAH)  mediated  through  the  axoaxonic  synapses  impinging  on  the  primary  afferent  fibers  (Rudomin, 1999; Rudomin and Schmidt, 1999). In case of spinal motoneurons, a decrease in  the  antidromic  FI  can  be  attributed  to  hyperpolarization  of  the  motoneuron  cell  body  (Lipski, 1981). A decrease in the FI could also be due to disfacilitation that can be the result  of  increased  outwardly  directed  potassium  conductances  that  might  occur  when  supraspinal (monoaminergic) influences are dampened (Wilson and Burgess, 1962; Zhang et  al., 1991b, a). An advantage of this technique is that changes in the cellular excitability can  be  measured  even  if  the  neuron  does  not  have  any  spontaneous  or  background  activity  (Lipski, 1981).    As shown in the Results section, the FI of STT neurons were not significantly altered  by  microinjections  of  Vh  into  the  MPTA.  Indeed  the  FI  was  the  most  stable  of  the  three  electrophysiological  parameters  measured  following  Vh  microinjections  since  it  was  intentionally set to ~ 90% by manually adjusting the intensity of thalamic stimulation.    The  FI  was  significantly  suppressed  following  PB  microinjections.  In  the  case  of  Group II STT neurons, the suppression was observed within two minutes, while in Group   130           Discussion  III  STT  neurons,  the  suppression  was  observed  15  min  after  PB  microinjections.  The  FI  recovered  within  30‐60  min  of  the  microinjections.  Interestingly,  in  the  case  of  one  STT  neuron (STT neuron # 17), the FI was abolished within two min of the microinjections. In the  same  neuron,  the  spontaneous  firing  rate  was  suppressed  by  ~  82%  within  2  min  of  PB  microinjections. An abolition of FI might suggest a nonspecific block  of axonal conduction  due to local anesthetic‐like activity of PB (Blaustein, 1968; Staiman and Seeman, 1974). This  scenario might occur if PB diffused to the more lateral sites in the brain stem where the STT  axons pass. It has been shown that the spread of a 1 μL volume of solution within the brain  parenchyma  is  limited  to  the  volume  of  ~  1  mm3  surrounding  the  microinjection  site  (Lomax, 1966; Myers, 1966). In rat, the area in the brainstem through which the STT axons  pass  along  with  the  lateral  lemniscus  is  more  than  2  mm  farther  from  the  MPTA  (Willis,  1985;  Paxinos  and  Watson,  2007).  Thus,  in  case  of  the  present  series  of  experiments,  the  possibility  of  local  anesthetic‐like  actions  of  PB  occurring  due  to  the  diffusional  spread  to  the STT axons passing through the brainstem seems less likely. Further, the abolition of FI  following  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  was  observed  for  only  one  STT  neuron.  Therefore PB‐mediated abolition of FI in this case may be due to some other mechanism.   Changes in the FI could also be due to several factors, besides the drug that include  but not are limited to, movement of the spinal cord with relation to the recording electrode,  changes  in  the  electrode  resistance,  temperature  oscillations,  and  fluctuations  in  the  excitability  if  smaller  number  of  trials  used  to  determine  the  FI  (Willis  et  al.,  1976;  Duenas  and  Rudomin,  1988;  Cairns  et  al.,  1996).  In  the  present  study,  conscientious  efforts  were   131           Discussion  made  to  minimize  the  influence  of  these  factors  and  to  ensure  that  the  changes  in  the  FI  were due to PB. In such experiments, the main source of cord movement is respiration. This  was  minimized  by  proper  adjustment  of  the  spinal  clamps  (see  Materials  and  Methods,  section 2.1.6.). To eliminate fluctuations in the electrode resistance, tungsten electrodes were  used  in  this  thesis,  which  have  a  stable  resistance  as  opposed  to  glass  microelectrodes.  Furthermore,  the  body  temperature  of  the  animals  was  always  maintained  within  the  physiological limits throughout the experiment (see Materials and Methods). Moreover, we  used a sufficient number (75) of antidromic trials to compute the FI, which is higher than the  small  number  of  trials  (~10)  used  in  the  previous  studies  (Willis  et  al.,  1976).  Finally,  the  stable  baseline  FI  after  microinjections  of  Vh  indicates  minimal  influence  of  these  “extraneous  factors”  on  the  FI.  Thus  FI  was  a  relatively  stable  parameter  of  STT  neuron  excitability.   In  conclusion,  the  suppression  of  STT  neuron  FI  by  microinjection  of  PB  into  the  MPTA  indicates  a  reduced  excitability  of  the  STT  neuron,  presumably  due  to  somatic  membrane hyperpolarization and/or increased conductance (Whitehorn and Burgess, 1973;  Willis et al., 1976; Lipski, 1981). This change in the STT neuron membrane polarization may  likely  have  been  due  to  an  action  of  PB  at  the  level  of  MPTA  via  descending  influences  impinging on the recorded neurons.    4.4.4. Peripheral Nerve‐Evoked STT Responses  In this thesis, the synaptic activation of STT neurons by sural and sciatic nerves resulted in a  complex  spike  response.  The  evoked  response  consisted  of  a  short  presynaptic  afferent   132           Discussion  volley,  followed  by  compound  action  potential  and  in  most  cases  a  burst  of  STT  neuron  spikes.  In  agreement  with  the  SFR  and  FI,  the  mean  response  magnitude  of  synaptically‐ evoked  responses  of  STT  neurons  to  both  the  sciatic  and  sural  nerve  stimulation  were  significantly  suppressed  following  PB  microinjections  into  the  MPTA.  This  suppression  however,  was  observed  in  the  case  of  STT  neurons  that  were  treated  only  with  PB  (i.e.,  Group II STT neurons).    Surprisingly, we did not see any significant changes in the mean magnitudes of both  the  sciatic  as  well  as  sural  nerve‐evoked  responses  of  Group  III  STT  neurons  after  PB  microinjections.  The  reason  for  this  apparent  discrepancy  is  presently  unclear,  although  there was a trend towards suppression of the evoked responses. Here, the small sample size  could be a principal contributing factor.   For  three  STT  neurons,  stimulation  of  sciatic  nerve  evoked  short‐latency  “early”  responses and long‐latency “late” responses (see Fig. 3.8). Taepavarapruk et al. (2004) have  reported similar type of peripheral nerve‐evoked responses of DSCT neurons in the lumbar  spinal  cord  of  cat.  In  the  study  of  Taepavarapruk  et  al.  (2004)  the  “early”  and  “late”  responses  are  thought  to  be  evoked  via  monosynaptic  and  polysynaptic  linkages,  respectively. Similarly, two types of burst discharges of STT neurons, evoked by sural nerve  stimulation were observed by Beall et al. (1977) in the monkey spinal cord. Here, these early  and late discharges are thought to be related to volleys in Aβ and Aδ fibers, respectively. It  should  however,  be  noted  that  as  discussed  further,  the  intensity  used  for  the  peripheral  nerve  stimulation  was  not  enough  to  activate  C  fibers.  Hence,  it  is  less  likely  that  “late”   133           Discussion  component of the evoked responses herein was due to C fiber stimulation. Since, the “early”  and “late” components of sciatic nerve‐evoked responses were observed in only three STT  neurons no systematic analysis of the “early” and “late” evoked responses was performed.    The inhibition of peripheral nerve‐evoked responses could result from postsynaptic  inhibition  of  the  STT  neuron  or  presynaptic  inhibition  of  the  primary  afferent  neurons.  In  this  study,  since  PB  was  microinjected  into  supraspinal  sites,  the  most  probable  source  of  inhibition of synaptic responses is through descending inhibition. A possible mechanism for  this inhibition is discussed in detail in the further sections.       High‐frequency  electrical  stimulation  at  C‐fiber  threshold  intensities  is  known  to   induce  long‐term  potentiation  (LTP)  or  long‐tem  depression  (LTD)  of  dorsal  horn  sensory  neurons  (Liu  and  Sandkuhler,  1995;  Liu  and  Sandkuhler,  1997;  Ikeda  et  al.,  2000)  and  primary  afferents  (Randic  et  al.,  1993).  The  stimulation  of  the  sciatic  and  sural  nerves  at  C  fiber  threshold  intensities  could  have  induced  complex  interactions  in  the  dorsal  horn  through LTP/LTD, making interpretation of the results more difficult. For this reason, in the  present study low‐intensity stimuli (two times the threshold intensity) were used for sciatic  and sural nerve activation that were insufficient to activate C fibers. Thus the afferent nerve  stimulation  protocol  at  the  intensities  used  in  this  study  can  by  no  means  reflect  noxious  input to the STT neurons. Even though the responses of STT neurons to the noxious input  were  not  studied  in  this  thesis,  the  general  suppression  of  STT  neuron  excitability  would  nevertheless be expected to reduce nociceptive transmission at the spinal level.   134           Discussion     A  second  effect  that  could  obscure  the  effect  of  PB  on  peripheral  nerve‐evoked   responses is the phenomenon of habituation. Repetitive application of peripheral stimuli can  lead to suppression of spinal neurons, by a process called habituation (Griffin and Pearson,  1967;  Macdonald  and  Pearson,  1979).  In  the  present  study,  no  habituation  of  evoked  responses  was  observed  after  stimulation  of  either  sciatic  or  sural  nerves.  This  provided  a  stable  baseline  for  both  the  sural  and  sciatic  nerve‐evoked  responses  for  comparison  with  the post‐microinjection responses.      In addition to the assessment of post‐synaptic responses of STT neurons, analyses of   effects of PB microinjections into the MPTA on presynaptic input via primary afferents was  also  performed.  Here,  peak‐trough  amplitudes  and  latencies  of  the  presynaptic  afferent  volleys  evoked  by  stimulation  of  the  sciatic  and  sural  nerves  were  compared  before  and  after microinjections. As indicated in the Results section, the size of the presynaptic afferent  volley evoked by both the nerves did not change significantly following microinjections of  either PB or Vh. This data suggests that synchronous presynaptic input to the STT neurons  provided  by  electrical  stimulation  of  peripheral  nerve  trunks  essentially  remained  unchanged after microinjections of PB into the MPTA. Thus, the suppression of peripheral  nerve‐evoked  STT  neurons  responses  following  PB  microinjections  into  the  MPTA  may  involve a post‐synaptic mechanism. Although, this type of analysis suggests that the same  numbers of axons are activated following sciatic and sural nerve stimulation, it does not rule  out  a  PB‐mediated  decrease  in  the  transmitter  release  from  central  terminal  arbors  of   135           Discussion  primary  afferent  fibers  in  the  spinal  cord  as  a  consequence  of  enhanced  impulse  traffic  through axoaxonic synapses (Rudomin, 1999; Rudomin and Schmidt, 1999).      4.5. Time Course of Effects of Pentobarbital on the Spike Activity of STT Neurons   In  this  study  the  temporal  profile  of  the  STT  neuron  responses  were  also  recorded  after  single bilateral PB microinjections. The results show that the spontaneous spike activity as  well as orthodromic and antidromic evoked responses of the STT neurons were suppressed  within 2 min of PB microinjections. This suppression was reversible and recovery occurred  within 15‐30 min of microinjections. A similar time course of suppression of identified DSCT  and  SRT  neurons  (Soja  et  al.,  2002)  as  well  as  unidentified  dorsal  horn  sensory  neurons  (Nagase  et  al.,  1994)  in  the  cat  spinal  cord  has  been  reported  after  intravenous  injection  of  barbiturate  anesthetics.  In  the  behavioral  studies  of  Devor  and  Zalkind  (2001)  as  well  as  Voss  et  al.  (2005),  the  anesthesia‐like  state  was  induced  within  1‐5  minutes  of  PB  microinjections into the MPTA. The animals recovered from anesthesia within 40‐120 min of  microinjections. In the present studies, the recovery of STT neurons following suppression  was relatively shorter (~30 min) than that reported in the behavioral studies.    In summary, the overall time course of the suppression and subsequent recovery of  spontaneous firing rate, antidromic firing index, and peripheral nerve‐evoked responses of  STT neurons following microinjections of PB into the MPTA reported in this thesis overlap  remarkably  with  the  behavioral  effects  reported  by  Devor  and  Zalkind  (2001).  The  data  reported  in  this  thesis  provide  a  neurophysiological  mechanism  of  the  analgesia  that  is   136           Discussion  associated  with  the  general  anesthesia‐like  state  after  PB  microinjections  into  the  MPTA  (Devor and Zalkind, 2001).      4.6. Possible Neural Mechanism(s) of Pentobarbital‐Mediated Suppression of STT  Neurons through the MPTA   The results of the present series of experiments show that the microinjections of PB into the  MPTA  of  the  rat  suppress  both  the  spontaneous  as  well  as  the  evoked  orthodromic  and  antidromic  activities  of  the  STT  neurons.  Suppression  of  sensory  inflow  through  the  STT,  which  is  considered  to  be  the  most  important  spinal  nociceptive  pathway,  could  be  the  possible physiological mechanism for the analgesia that accompanies the general anesthesia  as reported by Devor and Zalkind (2001). Whether this suppression was at the post‐synaptic  level or presynaptic level or both, is currently unknown. One way to determine whether a  post‐synaptic  mechanism  is  involved  or  not,  is  by  using  the  extracellular  recording  technique  in  conjunction  with  the  juxtacellular  application  of  glutamate  by  either  microiontophoresis  (Willcockson  et  al.,  1984)  or  microdialysis  (Dougherty  et  al.,  1992)  technique at the site of the STT neuron under study. Glutamate is an excitatory amino acid  neurotransmitter  known  to  excite  nearly  all  CNS  neurons  (Davies  et  al.,  1979;  Sahai,  1990;  Greenamyre and Porter, 1994), including STT neurons (Willcockson et al., 1984; Dougherty et  al.,  1992).  If  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  were  found  to  suppress  the  glutamate‐ evoked  STT  responses,  such  a  finding  would  be  further  indicative  of  post‐synaptic  hyperpolarization.  Intracellular  recording  paradigms  designed  to  estimate  STT  neuron   137           Discussion  conductance (Zhang et al., 1991a) can also be employed to confirm direct somatic inhibition  following  PB  microinjections.  The  hyperpolarization  could  be  the  consequence  of  at  least  two  neural  processes,  namely,  direct  inhibition  via  chloride‐gated  conductances  mediated  via GABA or glycine and/or disfacilitation. The latter disfacilitation process could arise due  to  a  possible  increase  in  outward  potassium  conductance  in  the  STT  neuron  membrane  resulting from the withdrawal of supraspinal influences (Zhang et al., 1991b, a).   Two  possible  scenarios  are  presented  below  that  may  involve  somatic  hyperpolarization and/or disfacilitation of STT neurons following microinjections of PB into  the  MPTA.  The  first  possibility  is  that  PB  microinjections  into  the  MPTA  may  engage  (in)directly endogenous descending pain control systems. Histochemical studies show that  the neurons in the MPTA send their axonal projections to various regions in the brain and  spinal  cord  which  are  involved  in  the  control  of  pain  transmission  and  modulation  (Sukhotinsky et al., 2003; Sukhotinsky et al., 2006; Reiner et al., 2007). These sites in the brain  include  relay  nuclei  in  the  rostral  ventromedial  medulla  (RVM),  especially  the  nucleus  reticularis  gigantocellularis  (NRGC)  and  nucleus  raphe  magnus  (NRM)  as  well  as  the  periaqueductal  grey  (PAG)  and  locus  ceruleus  (LC).  The  PAG  exerts  robust  descending  inhibition on the spinal pain transmission neurons including STT neurons through the relay  centers  in  the  RVM  (Gerhart  et  al.,  1984;  Zhang  et  al.,  1991b;  Stamford,  1995;  Bajic  and  Proudfit,  1999;  Mason,  1999;  Odeh  and  Antal,  2001;  Millan,  2002;  Fields  et  al.,  2006).  The  MPTA  neurons  also  send  direct  axonal  projections  to  the  spinal  cord  dorsal  horn  (Sukhotinsky  et  al.,  2006).  Thus,  MPTA  neurons  are  thought  to  modulate  the  activities  of   138           Discussion  these  structures  in  the  CNS.  The  microinjection  of  PB  into  the  MPTA  may  act  as  an  inhibitory switch through which GABAAergic mechanisms, in turn, might modulate various  descending  control  mechanisms,  mediated  by  NRGC,  NRM,  LC,  and  PAG,  that  ultimately  lead  to  oligosynpatic  suppression  STT  neurons  excitability.  Here  again  at  the  level  of  the  STT neuron, the suppression may be due to direct classical, chloride mediated, postsynaptic  inhibition,  and/or  disfacilitation  mediated  by  outward  potassium  or  other  conductances  (Zhang et al., 1991b, a).    A  second  scenario  might  include  direct  actions  of  PB  microinjected  into  the  MPTA  on the STT neurons themselves. It is possible that intracerebrally microinjected PB may have  reached the STT  soma in  the spinal cord  by  re‐distribution  through  the CSF and/or  blood.  The present thesis did not investigate this possibility. One method to test the re‐distribution  of PB to the spinal cord is by blocking the nerve transmission in the spinal cord between the  microinjection  and  recording  sites,  and  recording  the  spike  activity  around  PB  microinjections.  Spinal  transmission  can  be  blocked  by  reversible  cold  block  spinalization  (Wall, 1967; Soja and Sinclair, 1983). If the microinjections of PB into the MPTA suppress the  STT  neurons  when  spinal  cord  is  in  the  reversible  cold  block  state,  then  this  effect  can  be  attributed to a re‐distribution of PB to the spinal cord. In this thesis the suppression of STT  spike  activity  was  rapid;  observed  in  <  2  min  of  the  microinjections.  This  line  of  evidence  further indicates actions of PB on local neurons in the site of microinjection that ultimately  influence the STT responses in the spinal cord, rather than a re‐distribution phenomenon.    139           Discussion  It  is  also  possible  that  through  the diffusional  spread  within  the  brain  parenchyma  PB  may  have  reached  the  STT  axons  passing  through  the  brainstem.  In  most  of  the  mammalian  species,  including  the  rat,  the  STT  axons  pass  in  the  brainstem  in  conjunction  with the lateral lemniscus (Willis, 1985). Further, the average area of diffusional spread of 1  μL  volume  of  solution  microinjected  into  the  brain  is  ~  1  mm3  surrounding  the  microinjection  site  (Lomax,  1966;  Myers,  1966).  As  mentioned  previously,  the  area  in  the  brainstem  through  which  the  STT  axons  pass  along  with  the  lateral  lemniscus  is  >2  mm  farther from the MPTA (Willis, 1985; Paxinos and Watson, 2007). Thus, the possibility that  suppression  of  STT  neurons  occurred  through  diffusional  spread  of  PB  to  the  STT  axons  passing  through  the  brain  stem  seems  rather  remote,  and  if  so,  the  concentration  of  PB  would have to be great enough to exert a local anesthetic action on the membranes of STT  axons.  This  was  further  confirmed  by  the  histological  examination  of  the  brain  after  microinjections of pontamine dye into the MPTA. The lateral spread of the dye was always  found to be limited within 2 mm of the microinjection site.       Based  on  the  published  reports  of  the  neuroanatomy  of  MPTA  neurons  and  their   projections within the CNS, as well as the electrophysiological findings of the present study,  the  possible  neural  mechanism  for  PB‐induced  suppression  of  STT  neurons  is  presented  below.  To  aid  in  explaining  the  possible  neural  mechanism,  hypothetical  connectivities  of  MPTA  neurons  with  the  pain  transmission  and  intrinsic  control  system(s)  within  the  CNS  are depicted in the Figure 4.1.   140           Discussion     The  MPTA  contains  GABAergic  neurons  as  well  as  neurons  bearing  GABAA‐  receptors (Sukhotinsky et al., 2003). These neurons project to several key areas in the brain as  well  as  to  the  spinal  cord,  which  play  important  functions  in  pain  modulation  and  transmission,  respectively.  The  most  prominent  projections  of  the  MPTA  neurons  to  the  descending  pain  control  centers  in  the  brain  are:  the  periaqueductal  grey  (PAG),  rostral  ventromedial medulla (RVM), locus ceruleus (LC), and dorsal raphe nuclei (Sukhotinsky et  al., 2003; Sukhotinsky et al., 2006; Reiner et al., 2007). In addition, the spinal cord dorsal horn  receives  distinct,  direct  projections  from  the  MPTA  (Sukhotinsky  et  al.,  2006;  Reiner  et  al.,  2007).  However,  the  synaptic  interconnectivities  of  these  projections  with  the  sensory  neurons  in  the  dorsal  horn  are  not  yet  clear.  It  is  possible  that  the  spinal  projections  of  MPTA  neurons  may  make  direct  synapses  with  the  sensory  tract  neurons,  such  as  STT  neurons. This may provide an anatomical substrate for direct postsynaptic inhibition of STT  neurons following PB microinjections into the MPTA. It is also possible the MPTA neurons  may  make  direct  axoaxonal  connections  with  the  central  terminals  of  primary  afferent  neurons  or  indirect  synapses  via  various  interneurons.  This  would  provide  an  anatomical  substrate  for  primary  afferent  depolarization  (PAD)‐like  presynaptic  inhibition  (Rudomin,  1999;  Rudomin  and  Schmidt,  1999)  of  STT  neurons  following  PB  microinjections  into  the  MPTA.  Again,  it  should  be  emphasized  that  currently  no  evidence  exists  on  whether  spinally projecting MPTA axons form axoaxonic synapses with primary afferent neurons or  postsynaptic  synapses with  projection neurons  in  the spinal  cord  (Sukhotinsky  et  al., 2005;  Sukhotinsky et al., 2006).     141           Discussion     The PAG is one of the major sources of descending inhibition of spinal nociceptive   transmission. The neurons in the PAG exert a disfacilitatory influence through descending  projections that synapse directly onto the neurons in the RVM (Shah and Dostrovsky, 1980;  Bajic and Proudfit,  1999; Mason, 1999; Odeh  and  Antal,  2001;  Fields et  al.,  2006).  The  relay  centers in  the RVM, and  the adjacent reticular  formation,  especially  the nucleus  reticularis  gigantocellularis (NRGC) and nucleus raphe magnus (NRM), in turn, suppress the activities  of  spinal  sensory  neurons,  including  STT  neurons  (McCreery  and  Bloedel,  1975)  through  their serotonergic (Bowker et al., 1981; Liu et al., 2002; Millan, 2002; Fields et al., 2006) and/or  GABAergic  (Antal  et  al.,  1996)  projections  to  the  dorsal  horn.  As  stated  previously,  MPTA  neurons  also  send  axonal  projections  to  the  LC,  which  is  one  of  the  major  sources  of  noradrenergic descending inhibition of spinal pain transmission (Basbaum and Fields, 1978;  Millan, 2002; Fields et al., 2006). Spinally projecting neurons comprising the NRM and/or LC  may also suppress the STT neurons through presynaptic inhibition of the primary afferents  (Willis  et  al.,  1977;  Martin  et  al.,  1979).  Another  potential  mechanism  underlying  the  suppression of STT responses to afferent nerve stimulation in this study may be due to the  NRM  and/or  LC‐mediated  PAD‐like  presynaptic  inhibition  of  primary  afferent  neurons  (Willis et al., 1977; Martin et al., 1979; Rudomin, 1999; Rudomin and Schmidt, 1999).      Under resting conditions, the MPTA neurons may be spontaneously active and exert   tonic inhibitory influences on the neurons in the PAG as well as on the relay centers in the  RVM probably through GABAergic mechanisms (Sukhotinsky et al., 2003; Sukhotinsky et al.,  2005).  The  possible  sources  of  the  tonic  activity  of  MPTA  neurons  may  be  the  intrinsic   142           Discussion  properties of these neurons and/or the undefined projections from other brain areas to the  MPTA neurons and/or the local interneurons. In addition, the spinally projecting neurons in  the  MPTA  may  themselves  exert  tonic  descending  facilitation  of  STT  neurons  by  acting  directly  on  the  STT  neurons  and/or  by  suppressing  local  inhibitory  interneurons  and/or  activating  the  excitatory  interneurons  which  make  synaptic  connections  with  the  STT  neurons.       Alternatively,  the  spinally  projecting  neurons  from  the  MPTA  could  exert   descending  inhibition  of  the  ascending  spinal  sensory  neurons,  but  this  inhibition  may  be  dampened by the inhibitory interneurons at the resting state (Sukhotinsky et al., 2005). The  overall actions of the MPTA neurons on the pain modulatory centers in the brain as well as  the dorsal horn sensory neurons may facilitate pain transmission through the spinal cord at  the resting state.       Microinjections  of  PB  and  other  GABAA  receptor‐active  anesthetics  into  the  MPTA   may  suppress  the  tonic  activity  of  the  MPTA  neurons  (Devor  and  Zalkind,  2001;  Sukhotinsky  et  al.,  2003;  Sukhotinsky  et  al.,  2005).  As  a  consequence,  the  tonic  inhibitory  influences  on  the  PAG  as  well  as  the  relay  centers  in  the  RVM  and  LC  might  then  be  removed.  The  disinhibited  PAG  neurons  would  then  further  excite  the  serotonergic  and  noradrenergic neurons of the in the RVM and LC, respectively, which, in turn, suppress the  transmission through the STT. Further, the putative facilitatory input to the spinal sensory  (STT)  neurons  through  the  direct  spinal  MPTA  projections  could  be  dampened  by  the   143           Discussion  microinjections  of  PB.  However,  it  should  be  noted  that  none  of  these  scenarios  has  been  addressed in the scientific literature and are therefore, speculative in nature.            144           Discussion       MIDBRAIN  Thalamus     PAG GABA?     GABA?     PONS        MPTA  RVM/LC  GABA/GLY?  GABA/GLY?  MEDULLA       RVM/LC     SPINAL CORD    5-HT, NE  5-HT, NE       GABA/GLY     1˚ Afferent  STT Neuron    1˚ Afferent         Figure  4.1  Schematic  of  the  hypothetical  neural  circuitry  involved  in  suppression  of  STT  neuron  by  pentobarbital  microinjections  into  the  rat  MPTA.  The  MPTA  neurons  project  to  the descending pain control centers in the brain such as PAG, RVM and LC as well as to the  dorsal horn of the spinal cord. The MPTA neurons may tonically suppress the descending    145           Discussion   (Fig. 4.1 continued)   control centers at the baseline resting stage. Additionally, the descending projections of the  MPTA to the spinal cord dorsal horn may facilitate pain transmission through STT via either  a  direct  projection  to  the  STT  soma  and/or  indirectly  through  activation  of  excitatory  interneurons  and/or  suppression  of  inhibitory  interneuron(s)  making  synaptic  connections  with the STT neurons. The possible neurotransmitters involved in the MPTA actions include  GABA and/or glycine. The descending pain control system suppresses pain transmission by  direct actions on the STT through inhibitory interneuron(s) and/or indirectly by presynaptic  inhibition of  primary afferent neurons.  The possible  neurotransmitters involved include 5‐ HT,  NE,  GABA  and/or  glycine.  Microinjections  of  pentobarbital  into  the  MPTA  may  suppress  the  activity  of  MPTA  neurons,  probably  via  GABAAergic  mechanisms,  which  in  turn,  would  disinhibit  the  descending  pain  control  centers  in  the  supraspinal  cites.  The  disinhibited pain control system, in turn, suppresses pain transmission through the STT.    Legend:  PAG  –  Periaqueductal  grey,  RVM  –  rostral  ventromedial  medulla,  LC  –  locus  ceruleus,  5‐HT  –  serotonin,  NE‐  norepinephrine,  GLY  –  glycine,  \  ‐  inhibitory  neurotransmission,      ‐ excitatory neurotransmission                             146           Discussion   4.7. MPTA: A Possible Pronociceptive Center in the Brain?   The  neural  connectivities  of  MPTA  neurons  with  the  endogenous  pain  modulation  structures  in  the  brain  as  well  as  the  spinal  cord  (Sukhotinsky  et  al.,  2006)  suggest  that  MPTA may be playing important role in the descending pain modulation. Microinjections of  barbiturate  anesthetic,  pentobarbital  (PB)  are  hypothesized  to  inhibit  the  tonic  activity  of  MPTA neurons (Devor and Zalkind, 2001; Sukhotinsky et al., 2005; Sukhotinsky et al., 2006).  The results  of the present study indicate that  inhibition  of  MPTA neurons  by  PB  suppress  the  spike  activities  of  the  STT  neurons.  This  raises  the  question  whether  MPTA  neurons  overall,  provide  a  facilitatory  input  to  the  spinal  sensory  neurons  under  physiological  conditions. In other words, is MPTA a possible pronociceptive center in the brain?       Research  over  the  past  10  years  provides  compelling  evidence  for  the  existence  of   descending  pain  facilitatory  systems  in  the  brain.  The  medulla  contains  several  structures  that  have  been  shown  to  possess  pronociceptive  functions.  Almeida  and  colleagues  have  reported  that  the  medullary  dorsal  reticular  nucleus  (DRt)  is  a  distinct  source  of  pronociceptive input to the spinal cord dorsal horn (see review by Lima and Almeida, 2002).  Stimulation  of  DRt  neurons  by  glutamate  decreases  the  tail‐flick  latency  (Almeida  et  al.,  1996) while chemical and electrical lesions of the DRt suppress pain behavior (Almeida et al.,  1999).  Similarly,  stimulation  of  DRt  by  glutamate  showed  enhanced  responses  of  unidentified  spinal  nociceptive  neurons  to  peripheral  nerve  stimulation  at  C‐fiber  intensities,  which  were  suppressed  by  application  of  lidocaine  in  the  DRt  (Dugast  et  al.,  2003).  The  DRt  neurons  have  been  shown  to  be  reciprocally  connected  with  the  RVM  and   147           Discussion  LC  (Lima  and  Almeida,  2002).  It  would  be  interesting  to  know  whether  any  connectivity  exists between the MPTA and the DRt. Sukhotinsky et al. (2006) have not reported on such  connections between the MPTA and DRt neurons. If such connections do exist, a potential  modulatory  influence  of  MPTA  on  DRt  may  exist  that  facilitates  spinal  nociceptive  transmission.      The  rostral  ventromedial  medulla  (RVM),  which  contains  the  raphe  nuclei  and   NRGC, have been shown to exert biphasic (antinociceptive and pronociceptive) modulation  of  the  spinal  nociceptive  transmission  (Zhuo  and  Gebhart,  1990,  1991,  1992;  Urban  and  Gebhart, 1997; Zhuo and Gebhart, 1997; Zhuo et al., 2002). Electrical stimulation of the RVM  induced a discharge pattern in the STT neurons, which was similar to that produced by the  noxious stimulation of the skin (Giesler et al., 1981b). Similarly, occasional excitatory effects  of  electrical  stimulation  of  the  PAG  and  the  reticular  formation  on  identified  spinomesencephalic  tract  (SMT)  neurons  have  been  observed  in  the  cat  (Yezierski,  1990).  Fields and colleagues have shown that the RVM has three distinct neuronal populations: the  ON‐cells, the OFF‐cells and the neutral cells (Fields et al., 1983a; Fields et al., 1983b). The ON‐ cells show a burst of their spike activity while the OFF‐cells show a pause in their activity,  immediately  before  a  noxious  stimulus‐induced  motor  reflex.  The  neutral  cells  are  not  affected during the noxious stimulus‐induced reflex. It has been proposed that, activation of  RVM ON‐cells permits or facilitates nociceptive transmission through the spinal cord while  the activation of RVM OFF‐cells suppresses it (Fields et al., 1991). The role of RVM OFF‐cells   148           Discussion  in descending inhibition of pain transmission has been confirmed from several other studies  (Tortorici and Vanegas, 1994, 1995; Jones, 1996).      Given the direct synaptic inputs from the MPTA to the RVM neurons (Sukhotinsky   et al., 2006) there may be possible MPTA inputs to the RVM ON‐ and OFF‐cells. Histological  and/or  physiological  studies  are  required  to  confirm  this  possibility.  However,  if  such  connectivities are assumed then it may be possible that under resting conditions the MPTA  neurons  may  be  tonically  activating  the  RVM  ON‐cells  (possibly  through  glutamatergic  mechanisms)  and/or  inhibit  the  OFF‐cells  (probably  through  GABA/glycinergic  mechanisms), thus facilitating the spinal nociceptive transmission. At the same time, given  the reciprocal connectivities of RVM and LC with the MPTA as well as the DRt neurons, the  MPTA  neurons  may  provide  indirect  tonic  facilitatory  influences  to  the  DRt  neurons  through  the  RVM  and  LC.  Inhibition  of  MPTA  neurons  by  PB  may  remove  the  inhibitory  influences  on  the  RVM  OFF‐cells  and/or  excitatory  influences  on  the  ON‐cells.  The  disinhibited  RVM  OFF‐cells  in  turn  would  suppress  the  nociceptive  transmission  through  the spinal cord.       In  summary,  the  results  of  this  study  along  with  the  evidence  from  the  literature   suggest that MPTA may have a pronociceptive role along with other pronociceptive centers  in the brain. Alternatively, it may be acting as the source providing pronociceptive drives to  the  other  brain  centers  to  facilitate  spinal  nociceptive  transmission.  Further  studies  are  necessary to explore this possibility.      149           Discussion   4.8. Future Directions   The  physiological  role  of  MPTA  in  pain  transmission  and  analgesia  is  not  completely  understood yet. Extensive neural connectivities of the MPTA with various structures in the  brain as well as the spinal cord suggest that MPTA neurons may play an important role in  sleep‐wake  cycles  as  well  as  sensory‐motor  integration  (Sukhotinsky  et  al.,  2003;  Sukhotinsky et al., 2005; Sukhotinsky et al., 2006; Reiner et al., 2007; Sukhotinsky et al., 2007).  The reciprocal connections of MPTA neurons with the various structures of the endogenous  pain control system suggest that the MPTA may play important role in the descending pain  modulation, probably in a feedback/feed forward fashion. The results of the present study  indirectly suggest the possible descending pronociceptive influences of MPTA on the spinal  nociceptive transmission. These descending facilitatory effects may be mediated through the  direct  projections  of  the  MPTA  neurons  to  the  spinal  cord  and/or  indirectly  through  the  medullary relay centers. Further studies could be designed to explore these possibilities.      The STT pathway, by no means, is the sole spinal nociceptive pathway. The effects of   PB microinjection into the MPTA on other groups of ascending spinal nociceptive neurons  including, the spinoreticular tract (SRT), spinomesencephalic tract, spinohypothalamic tract,  and spinocervicothalamic tract are unknown. Therefore, the analgesia observed during the  general anesthesia‐like state after PB microinjections cannot be completely explained on the  basis  of  STT  suppression  alone.  However,  as  indicated  earlier,  systemic  administration  of  thiopental has been shown to suppress the spontaneous as well as evoked responses of the  identified  SRT  neurons,  which  like  STT  neurons,  do  convey  nociceptive  input  to  the  brain   150           Discussion  (Soja et al., 2002). It is, therefore plausible that the microinjection of PB into the MPTA may  suppress the excitability of other spinal nociceptive tract systems. This study thus provides  a  plausible  physiological  mechanism  for  the  analgesia  induced  by  PB  microinjections  into  the MPTA. The findings of this study provide a foundation for further physiological studies  to  elucidate  the  neural  networks  involved  in  MPTA‐mediated  general  anesthesia.  The  results  of  this  thesis  provide  more  questions  in  light  of  the  preceding  discussion  than  the  original hypothesis addressed. A myriad of experimental paradigms including in vivo and in  vitro techniques can be used to dissect out the neural circuitry underlying the analgesia (not  to mention the atonia, amnesia and unconsciousness) that accompanies the state of general  anesthesia induced by PB in the MPTA. Future studies that might be carried out are briefly  discussed below.   1. The  MPTA  is  only  a  functionally  defined  region  in  the  brain.  The  anatomical  boundaries  as well as the intrinsic  properties of neurons comprising the MPTA are  not presently known. This warrants further studies along this direction.   2. As  stated  earlier,  the  disadvantages  of  using  acute  animal  preparation  require  the  development of a reliable chronic animal preparation for such studies. The small size  of  vertebrae  and  relatively  fragile  vertebral  column  make  the  rat  a  technically  difficult  preparation  for  chronic  recording  studies  in  the  spinal  cord.  A  chronic  cat  preparation  (Soja  et  al.,  1995)  might  be  more  suitable  for  physiological  studies  of  MPTA neurons under “near natural” conditions. However, the presence of neurons,  functionally  equivalent  to  the  rat  MPTA  in  the  cat  is  yet  unknown.  Hence,   151           Discussion  exploratory  studies are required to  identify  such  functional  area(s)  in  the  cat  brain.  Since the chronic cat preparation has been successfully used for sleep‐wake studies,  it could be ideal to compare the effect of sleep states on STT neuron activity before  induction  of  the  anesthetic  state  by  PB  microinjections  into  the  MPTA  in  this  preparation.  These  cat  preparations  could  be  used  to  investigate  behavioral  state‐ related  changes  in  MPTA  neurons  as  well  as  and  the  effects  of  systemic  vs.  focal  administration of PB into the MPTA.     3. Suppression of STT neuron activity following microinjections of PB into the MPTA is  hypothesized  to  be  due  to  the  descending  inhibition  mediated  via  the  direct  projections  of  MPTA  neurons  to  the  dorsal  horn  and/or  indirect  pathway  through  the endogenous descending control system. The synaptic connectivities of the direct  MPTA projections with the spinal  cord  dorsal  horn  as well  as the neurotransmitter  system(s)  involved  are  presently  unknown.  On  the  other  hand,  the  endogenous  descending pain control system, which comprises of relay nuclei RVM and LC form  direct  synaptic  connectivities  or  indirect  synaptic  connectivities  through  the  interneurons with the sensory  tract cells in the spinal  cord  (Stamford,  1995;  Millan,  2002;  Fields  et  al.,  2006).  Further,  the  descending  projections  of  RVM  and  LC  use  serotonin (5‐HT) and norepinephrine (NE)  as the neurotransmitters,  respectively  at  the spinal cord level (Basbaum and Fields, 1978; Mason, 1999; Millan, 2002; Fields et  al., 2006). To assess if suppression of STT neurons following PB microinjections into  the  MPTA  involves  activation  of  indirect  descending  inhibitory  pathways,  changes  in  the  5‐HT  and  NE  levels  at  spinal  site  of  STT  cell  body  can  be  analyzed  using   152           Discussion  microdialysis  procedures.  In  this  case,  measurement  of  neurotransmitter  release  by  microdialysis  and  extracellular  recording  of  STT  neurons  can  be  simultaneously  performed before and following microinjections of PB into the MPTA (Sorkin et al.,  1988). The changes in the levels of 5‐HT and NE following PB microinjections can be  measured  by  subjecting  the  collected  microdialysis  fluid  to  the  high  performance  liquid  chromatographic  (HPLC)  analysis.  Following  PB  microinjections  into  the  MPTA, if there is suppression of STT neurons with corresponding increase in the 5‐ HT and/or  NE levels,  it  would  indicate activation of indirect  descending  inhibitory  pathway(s). This procedure, however, can not be used to assess the involvement of  direct  projections  of  MPTA  neurons  as  the  neurotransmitter  systems  as  well  as  synaptic connectivities in the spinal cord are not yet known.    4. Reciprocal  projections  of  MPTA  neurons  with  various  structures  involved  in  the  control  of  sleep‐wake  cycles  (Sukhotinsky  et  al.,  2007)  suggest  that  MPTA  neurons  may  play  important  role  in  the  regulation  of  sleep‐wake  cycles  as  well  as  modulation/control  of  sensory  transmission  through  the  spinal  cord  during  sleep‐ wake cycles. Since the earlier reports of Carli and colleagues (Carli et al., 1967a; Carli  et  al.,  1967b)  compelling  evidence  now  indicates  that  the  sensory  transmission  through  the  spinal  cord  is  under  modulatory  influences  during  sleep  (see,  Soja,  2007).  Along  these  lines,  previous  studies  from  our  laboratory  in  chronic  cat  preparation  have  shown  that  the  sensory  transmission  through  various  identified  spinal  ascending  pathways,  including  the  DSCT,  SRT  and  trigeminothalamic  tract  undergo sleep‐wake cycles‐dependent modulatory changes (Soja et al., 1993; Cairns   153           Discussion  et  al.,  1995;  Soja  et  al.,  1996;  Soja  et  al.,  2001;  Taepavarapruk  et  al.,  2002;  Taepavarapruk  et  al.,  2004).  It  may  be  conceivable  that  STT  neurons  also  undergo  modulation  in  their  activities  during  sleep‐wake  cycles.  Thus,  it  may  be  feasible  to  study the spike activities of MPTA neurons in conjunction with the identified spinal  sensory pathways such as STT neurons across the sleep‐wake cycles. If a functionally  equivalent MPTA locus is present and identified in the cat, a chronic cat preparation  (Soja  et  al.,  1993)  can  be  conveniently  used  for  such  inquiries.  Such  studies  may  provide  novel  information  on  the  actions  of  MPTA  neurons  on  spinal  sensory  transmission  during  natural  sleep‐wake  cycles.  Several  in  vivo  pharmacological  experiments can also be carried out using the aforementioned paradigms.   5. MPTA  neurons  are  reported  to  send  axonal  projections  to  the  endogenous  motor  control systems as well as the ventral horn (Sukhotinsky et al., 2005). This provides  an  opportunity  to  study  whether  the  motor  neurons  are  suppressed  after  PB  microinjections, which may provide potential mechanism for the atonia. This could  also be performed reliably in a chronic cat preparation and the anesthetic actions of  PB into the MPTA on motor outflow could also be compared with that, which occurs  during naturally occurring rapid eye movement (REM) sleep (Chase et al., 1989; Soja  et al., 1991).   154           Summary and Conclusions   CHAPTER 5  SUMMARY AND CONCLUSIONS  1. Extracellular  spike  activity  of  antidromically  identified  spinothalamic  tract  (STT)  neurons  in  the  L1  spinal  segment  was  studied  following  bilateral  microinjections  of  pentobarbital (PB, 200 μg/side) into the mesopontine tegmental anesthesia area (MPTA)  in the brainstem of isoflurane‐anesthetized rat preparation.   2. The  group  mean  spontaneous  firing  rate  (SFR)  of  STT  neurons  was  significantly  suppressed by 45‐50% following microinjections of PB into the MPTA. This suppression  of  the  SFR  returned  to  pre‐injection  baseline  values  within  15‐30  min  of  PB  microinjections. The firing pattern of STT neurons was not altered by microinjections of  Vh  or  PB.  The  group  mean  antidromic  firing  index  (FI),  along  with  the  magnitudes  of  sural,  as well as sciatic  nerve‐evoked  orthodromic  responses  of STT  neurons  were also  significantly  and  reversibly  suppressed  following  PB  microinjections.  Thus,  microinjections  of  PB  into  the  MPTA  suppressed  both  the  spontaneous  as  well  as  antidromically and orthodromically‐evoked spike activities of STT neurons.  3. There  were  no  changes  in  the  group  mean  peak‐trough  amplitude  of  the  presynaptic  afferent nerve volley following PB microinjections. This suggests that the suppression of  STT neuron excitability by PB microinjections into the MPTA is probably a post‐synaptic  phenomenon on the neurons under  study and/or a  reduction  in  transmitter  release  via  presynaptic inhibition.   155           Summary and Conclusions  4. The data of the present thesis project provides evidence that the MPTA is a barbiturate‐ sensitive area in the rat brain stem that is capable of diminishing sensory inflow through  the STT.    5. In summary, the physiological basis for the behavioral analgesia, which accompanies the  reversible  general  anesthesia‐like  state  after  bilateral  microinjections  of  PB  into  the  MPTA,  can  be  partially  attributed  to  the  suppression  of  STT  neurons,  which  transmit  nociceptive  signals  to  the  brain.  The  suppression  of  STT  neurons  following  PB  microinjections into the MPTA may be achieved directly through the axonal projections  of  MPTA  neurons  to  the  spinal  cord  dorsal  horn  and/or  indirectly  through  the  projections of MPTA neurons to the descending pain control system(s) in the brainstem  and  at  the  level  of  the  STT  neuron  itself.  Such  actions  of  PB  may  involve  pre  and/or  postsynaptic forms of inhibition.   156           References   REFERENCES  Aimone LD, Gebhart GF (1986) Stimulation‐produced spinal inhibition from the midbrain in  the  rat  is  mediated  by  an  excitatory  amino  acid  neurotransmitter  in  the  medial  medulla. J Neurosci 6(6): 1803‐1813.   Alkire  MT  (1998)  Quantitative  EEG  correlations  with  brain  glucose  metabolic  rate  during  anesthesia in volunteers. Anesthesiology 89(2): 323‐333.   Alkire  MT,  Haier  RJ,  Fallon  JH  (2000)  Toward  a  unified  theory  of  narcosis:  brain  imaging  evidence  for  a  thalamocortical  switch  as  the  neurophysiologic  basis  of  anesthetic‐ induced unconsciousness. Conscious Cogn 9(3): 370‐386.   Alkire MT, Haier RJ, Barker SJ, Shah NK, Wu JC, Kao YJ (1995) Cerebral metabolism during  propofol  anesthesia  in  humans  studied  with  positron  emission  tomography.  Anesthesiology 82(2): 393‐403.   Almeida  A,  Tjolsen  A,  Lima  D,  Coimbra  A,  Hole  K  (1996)  The  medullary  dorsal  reticular  nucleus facilitates acute nociception in the rat. Brain Res Bull 39(1): 7‐15.   Almeida  A,  Storkson  R,  Lima  D,  Hole  K,  Tjolsen  A  (1999)  The  medullary  dorsal  reticular  nucleus facilitates pain behaviour induced by formalin in the rat. Eur J Neurosci 11(1):  110‐122.   Ammons WS (1987) Characteristics of spinoreticular and spinothalamic neurons with renal  input. J Neurophysiol 58(3): 480‐495.   Ammons  WS  (1989)  Electrophysiological  characteristics  of  primate  spinothalamic  neurons  with renal and somatic inputs. J Neurophysiol 61(6): 1121‐1130.   157           References  Antal M, Petko M, Polgar E, Heizmann CW, Storm‐Mathisen J (1996) Direct evidence of an  extensive GABAergic innervation of the spinal dorsal horn by fibres descending from  the rostral ventromedial medulla. Neuroscience 73(2): 509‐518.   Antognini JF (1997) The relationship among brain, spinal cord and anesthetic requirements.  Med Hypotheses 48(1): 83‐87.   Antognini  JF,  Schwartz  K  (1993)  Exaggerated  anesthetic  requirements  in  the  preferentially  anesthetized brain. Anesthesiology 79(6): 1244‐1249.   Antognini  JF,  Kien  ND  (1994)  A  method  for  preferential  delivery  of  volatile  anesthetics  to  the in situ goat brain. Anesthesiology 80(5): 1148‐1154.   Antognini  JF,  Carstens  E  (1998)  Macroscopic  sites  of  anesthetic  action:  brain  versus  spinal  cord. Toxicol Lett 100‐101(51‐58.   Antognini  JF,  Carstens  E  (1999a)  Isoflurane  blunts  electroencephalographic  and  thalamic‐ reticular  formation  responses  to  noxious  stimulation  in  goats.  Anesthesiology  91(6):  1770‐1779.   Antognini  JF,  Carstens  E  (1999b)  Increasing  isoflurane  from  0.9  to  1.1  minimum  alveolar  concentration  minimally  affects  dorsal  horn  cell  responses  to  noxious  stimulation.  Anesthesiology 90(1): 208‐214.   Antognini JF, Carstens E, Buzin V (1999) Isoflurane depresses motoneuron excitability by a  direct spinal action: an F‐wave study. Anesth Analg 88(3): 681‐685.   Bajic D, Proudfit HK (1999) Projections of neurons in the periaqueductal gray to pontine and  medullary  catecholamine  cell  groups  involved  in  the  modulation  of  nociception.  J  Comp Neurol 405(3): 359‐379.   158           References  Baker  MA  (1971)  Spontaneous  and  evoked  activity  of  neurones  in  the  somatosensory  thalamus of the waking cat. J Physiol 217(2): 359‐379.   Basbaum  AI,  Fields  HL  (1978)  Endogenous  pain  control  mechanisms:  review  and  hypothesis. Ann Neurol 4(5): 451‐462.   Beall JE, Applebaum AE, Foreman RD, Willis WD (1977) Spinal cord  potentials evoked by  cutaneous afferents in the monkey. J Neurophysiol 40(2): 199‐211.   Belelli  D,  Pistis  M,  Peters  JA,  Lambert  JJ  (1999)  General  anaesthetic  action  at  transmitter‐ gated inhibitory amino acid receptors. Trends Pharmacol Sci 20(12): 496‐502.   Blaustein  MP  (1968)  Barbiturates  block  sodium  and  potassium  conductance  increases  in  voltage‐clamped lobster axons. J Gen Physiol 51(3): 293‐307.   Bowker  RM,  Westlund  KN,  Coulter  JD  (1981)  Origins  of  serotonergic  projections  to  the  spinal cord in rat: an immunocytochemical‐retrograde transport study. Brain Res 226(1‐ 2): 187‐199.   Brown  AG,  Rose  PK,  Snow  PJ  (1977)  The  morphology  of  spinocervical  tract  neurones  revealed by intracellular injection of horseradish peroxidase. J Physiol 270(3): 747‐764.   Cairns BE, Fragoso MC, Soja PJ (1995) Activity of rostral trigeminal sensory neurons in the  cat during wakefulness and sleep. J Neurophysiol 73(6): 2486‐2498.   Cairns BE, Fragoso MC, Soja PJ (1996) Active‐sleep‐related suppression of feline trigeminal  sensory neurons: evidence implicating presynaptic inhibition via a process of primary  afferent depolarization. J Neurophysiol 75(3): 1152‐1162.   159           References  Campagna JA, Miller KW, Forman SA (2003) Mechanisms of actions of inhaled anesthetics.  N Engl J Med 348(21): 2110‐2124.   Carli  G,  Diete‐Spiff  K,  Pompeiano  O  (1967a)  Transmission  of  sensory  information  through  the lemniscal pathway during sleep. Arch Ital Biol 105(1): 31‐51.   Carli  G,  Kawamura  H,  Pompeiano  O  (1967b)  Transmission  of  somatic  sensory  volleys  through  ascending  spinal  hindlimb  pathways  during  sleep  and  wakefulness.  Pflugers  Arch Gesamte Physiol Menschen Tiere 298(2): 163‐169.   Carstens  E  (1997)  Responses  of  rat  spinal  dorsal  horn  neurons  to  intracutaneous  microinjection  of  histamine,  capsaicin,  and  other  irritants.  J  Neurophysiol  77(5):  2499‐ 2514.   Chase  MH,  Soja  PJ,  Morales  FR  (1989)  Evidence  that  glycine  mediates  the  postsynaptic  potentials that inhibit lumbar motoneurons during the atonia of active sleep. J Neurosci  9(3): 743‐751.   Chen  SR,  Pan  HL  (2002)  Hypersensitivity  of  spinothalamic  tract  neurons  associated  with  diabetic neuropathic pain in rats. J Neurophysiol 87(6): 2726‐2733.   Chung  JM,  Kenshalo  DR,  Jr.,  Gerhart  KD,  Willis  WD  (1979)  Excitation  of  primate  spinothalamic neurons by cutaneous C‐fiber volleys. J Neurophysiol 42(5): 1354‐1369.   Cocatre‐Zilgien  JH,  Delcomyn  F  (1992)  Identification  of  bursts  in  spike  trains.  J  Neurosci  Methods 41(1): 19‐30.   Collins  JG,  Kendig  JJ,  Mason  P  (1995)  Anesthetic  actions  within  the  spinal  cord:  contributions to the state of general anesthesia. Trends Neurosci 18(12): 549‐553.   160           References  Cuellar JM, Dutton RC, Antognini JF, Carstens E (2005) Differential effects of halothane and  isoflurane on lumbar dorsal horn neuronal windup and excitability. Br J Anaesth 94(5):  617‐625.   Davies  J,  Evans  RH,  Francis  AA,  Watkins  JC  (1979)  Excitatory  amino  acid  receptors  and  synaptic  excitation  in  the  mammalian  central  nervous  system.  J  Physiol  (Paris)  75(6):  641‐654.   de Jong RH, Robles R, Morikawa KI (1969) Actions of halothane and nitrous oxide on dorsal  horn neurons (ʺThe Spinal Gateʺ). Anesthesiology 31(3): 205‐212.   de  Jong  RH,  Robles  R,  Heavner  JE  (1970)  Suppression  of  impulse  transmission  in  the  catʹs  dorsal horn by inhalation anesthetics. Anesthesiology 32(5): 440‐445.   de  Jong  RH,  Robles  R,  Corbin  RW,  Nace  RA  (1968)  Effect  of  inhalation  anesthetics  on  monosynaptic  and  plysynpatic  transmission  in  the  spinal  cord.  J  Pharmacol  Exp  Ther  162(2): 326‐330.   Detsch  O,  Vahle‐Hinz  C,  Kochs  E,  Siemers  M,  Bromm  B  (1999)  Isoflurane  induces  dose‐ dependent changes of thalamic somatosensory information transfer. Brain Res 829(1‐2):  77‐89.   Devor  M,  Zalkind  V  (2001)  Reversible  analgesia,  atonia,  and  loss  of  consciousness  on  bilateral intracerebral microinjection of pentobarbital. Pain 94(1): 101‐112.   Dougherty PM, Palecek J, Paleckova V, Sorkin LS, Willis WD (1992) The role of NMDA and  non‐NMDA excitatory amino acid receptors in the excitation of primate spinothalamic  tract neurons by mechanical, chemical, thermal, and electrical stimuli. J Neurosci 12(8):  3025‐3041.   161           References  Duenas SH, Rudomin P (1988) Excitability changes of ankle extensor group Ia and Ib fibers  during fictive locomotion in the cat. Exp Brain Res 70(1): 15‐25.   Dugast C, Almeida  A,  Lima D (2003) The  medullary  dorsal  reticular nucleus  enhances the  responsiveness of spinal nociceptive neurons to peripheral stimulation in the rat. Eur J  Neurosci 18(3): 580‐588.   Evers AS, Crowder CM, Balser JR (2006) General Anesthetics. In: Goodman & Gilmanʹs the  pharmacological basis of therapeutics, 11th Edition (Goodman LS, Gilman A, Brunton  LL, Lazo JS, Parker KL, eds), pp 341‐368. New York: McGraw‐Hill.   Fields  H,  Basbaum  A,  Heinricher  M  (2006)  Central  nervous  system  mechanisms  of  pain  modulation. In: Wall and Melzackʹs textbook of pain, 5th Edition (Wall PD, McMahon  SB, Koltzenburg M, eds), pp 125‐142. Philadelphia: Elsevier/Churchill Livingstone.   Fields  HL,  Heinricher  MM,  Mason  P  (1991)  Neurotransmitters  in  nociceptive  modulatory  circuits. Annu Rev Neurosci 14(219‐245.   Fields HL, Bry J, Hentall I, Zorman G (1983a) The activity of neurons in the rostral medulla  of the rat during withdrawal from noxious heat. J Neurosci 3(12): 2545‐2552.   Fields  HL,  Vanegas  H,  Hentall  ID,  Zorman  G  (1983b)  Evidence  that  disinhibition  of  brain  stem neurones contributes to morphine analgesia. Nature 306(5944): 684‐686.   Fiset  P,  Paus  T,  Daloze  T,  Plourde  G,  Meuret  P,  Bonhomme  V,  Hajj‐Ali  N,  Backman  SB,  Evans  AC  (1999)  Brain  mechanisms  of  propofol‐induced  loss  of  consciousness  in  humans: a positron emission tomographic study. J Neurosci 19(13): 5506‐5513.   Foreman RD, Schmidt RF, Willis WD (1979) Effects of mechanical and chemical stimulation  of fine muscle afferents upon primate spinothalamic tract cells. J Physiol 286(215‐231.   162           References  Foreman RD, Applebaum AE, Beall JE, Trevino DL, Willis WD (1975) Responses of primate  spinothalamic  tract  neurons  to  electrical  stimulation  of  hindlimb  peripheral  nerves.  J  Neurophysiol 38(1): 132‐145.   Franks  NP,  Lieb  WR  (1984)  Do  general  anaesthetics  act  by  competitive  binding  to  specific  receptors? Nature 310(5978): 599‐601.   Franks  NP,  Lieb  WR  (1998)  Which  molecular  targets  are  most  relevant  to  general  anaesthesia? Toxicol Lett 100‐101(1‐8.   Gerhart KD, Yezierski RP, Wilcox TK, Willis WD (1984) Inhibition of primate spinothalamic  tract  neurons  by  stimulation  in  periaqueductal  gray  or  adjacent  midbrain  reticular  formation. J Neurophysiol 51(3): 450‐466.   Giesler GJ, Menetrey D, Guilbaud G, Besson JM (1976) Lumbar cord neurons at the origin of  the spinothalamic tract in the rat. Brain Res 118(2): 320‐324.   Giesler  GJ,  Jr.,  Menetrey  D,  Basbaum  AI  (1979)  Differential  origins  of  spinothalamic  tract  projections to medial and lateral thalamus in the rat. J Comp Neurol 184(1): 107‐126.   Giesler GJ, Jr., Spiel HR, Willis WD (1981a) Organization of spinothalamic tract axons within  the rat spinal cord. J Comp Neurol 195(2): 243‐252.   Giesler  GJ,  Jr.,  Yezierski  RP,  Gerhart  KD,  Willis  WD  (1981b)  Spinothalamic  tract  neurons  that  project  to  medial  and/or  lateral  thalamic  nuclei:  evidence  for  a  physiologically  novel population of spinal cord neurons. J Neurophysiol 46(6): 1285‐1308.   Grant G, Koerber HR (2004) Spinal Cord Cytoarchitecture. In: The rat nervous system, 3rd  Edition (Paxinos G, ed), pp 121‐128. Amsterdam ; Boston: Elsevier Academic Press.   163           References  Greenamyre  JT,  Porter  RH  (1994)  Anatomy  and  physiology  of  glutamate  in  the  CNS.  Neurology 44(11 Suppl 8): S7‐13.   Griffin JP, Pearson JA (1967) Habituation of the flexor reflex in the rat. J Physiol 190(2): 3P‐ 5P.   Gruss M, Henrich M, Konig P, Hempelmann G, Vogel W, Scholz A (2001) Ethanol reduces  excitability  in  a  subgroup  of  primary  sensory  neurons  by  activation  of  BK(Ca)  channels. Eur J Neurosci 14(8): 1246‐1256.   Guilbaud  G,  Peschanski  M,  Gautron  M  (1981)  Functional  changes  in  ventrobasal  thalamic  neurones  responsive  to  noxious  and  non‐noxious  cutaneous  stimuli  after  chloralose  treatment:  new  evidence  for  the  presence  of  pre‐existing  ʺsilent  connectionsʺ  in  the  adult nervous system? Pain 11(1): 9‐19.   Hara  M,  Kai  Y,  Ikemoto  Y  (1993)  Propofol  activates  GABAA  receptor‐chloride  ionophore  complex in dissociated hippocampal pyramidal neurons of the rat. Anesthesiology 79(4):  781‐788.   Harmann  PA,  Carlton  SM,  Willis  WD  (1988)  Collaterals  of  spinothalamic  tract  cells  to  the  periaqueductal gray: a fluorescent double‐labeling study in the rat. Brain Res 441(1‐2):  87‐97.   Haseneder  R,  Kurz  J,  Dodt  HU,  Kochs  E,  Zieglgansberger  W,  Scheller  M,  Rammes  G,  Hapfelmeier G (2004) Isoflurane reduces glutamatergic transmission in neurons in the  spinal  cord  superficial  dorsal  horn:  evidence  for  a  presynaptic  site  of  an  analgesic  action. Anesth Analg 98(6): 1718‐1723, table of contents.   Hayton SM, Kriss A, Muller DP (1999) Comparison of the effects of four anaesthetic agents  on somatosensory evoked potentials in the rat. Lab Anim 33(3): 243‐251.   164           References  Heavner JE (1975) Jamming spinal sensory input: effects of anesthetic and analgesic drugs in  the spinal cord dorsal horn. Pain 1(3): 239‐255.   Hodge CJ, Jr., Apkarian AV (1990) The spinothalamic tract. Crit Rev Neurobiol 5(4): 363‐397.   Hunt  CC  (1955)  Monosynaptic  reflex  response  of  spinal  motoneurons  to  graded  afferent  stimulation. J Gen Physiol 38(6): 813‐852.   Hylden JL, Anton F, Nahin RL (1989) Spinal lamina I projection neurons in the rat: collateral  innervation of parabrachial area and thalamus. Neuroscience 28(1): 27‐37.   Ikeda  H,  Asai  T,  Murase  K  (2000)  Robust  changes  of  afferent‐induced  excitation  in  the  rat  spinal dorsal horn after conditioning high‐frequency stimulation. J Neurophysiol 83(4):  2412‐2420.   Irifune  M,  Takarada  T,  Shimizu  Y,  Endo  C,  Katayama  S,  Dohi  T,  Kawahara  M  (2003)  Propofol‐induced anesthesia in mice is mediated by gamma‐aminobutyric acid‐A and  excitatory amino acid receptors. Anesth Analg 97(2): 424‐429, table of contents.   James  MF,  Duthie  AM,  Duffy  BL,  McKeag  AM,  Rice  CP  (1978)  Analgesic  effect  of  ethyl  alcohol. Br J Anaesth 50(2): 139‐141.   Jinks S, Antognini JF, Carstens E, Buzin V, Simons C (1999) Isoflurane can indirectly depress  lumbar dorsal horn activity in the goat via action within the brain. Br J Anaesth 82(2):  244‐249.   Jinks  SL,  Martin  JT,  Carstens  E,  Jung  SW,  Antognini  JF  (2003)  Peri‐MAC  depression  of  a  nociceptive  withdrawal  reflex  is  accompanied  by  reduced  dorsal  horn  activity  with  halothane but not isoflurane. Anesthesiology 98(5): 1128‐1138.   165           References  Johnston GA (1996) GABAA receptor pharmacology. Pharmacol Ther 69(3): 173‐198.   Jones  SL  (1996)  Dipyrone  into  the  nucleus  raphe  magnus  inhibits  the  rat  nociceptive  tail‐ flick reflex. Eur J Pharmacol 318(1): 37‐40.   Kevetter GA, Willis WD (1982) Spinothalamic cells in the rat lumbar cord with collaterals to  the medullary reticular formation. Brain Res 238(1): 181‐185.   Kevetter  GA,  Willis  WD  (1983)  Collaterals  of  spinothalamic  cells  in  the  rat.  J  Comp  Neurol  215(4): 453‐464.   King BS, Rampil IJ (1994) Anesthetic depression of spinal motor neurons may contribute to  lack of movement in response to noxious stimuli. Anesthesiology 81(6): 1484‐1492.   Kitahata  LM,  Ghazi‐Saidi  K,  Yamashita  M,  Kosaka  Y,  Bonikos  C,  Taub  A  (1975)  The  depressant effect of halothane and sodium thiopental on the spontaneous and evoked  activity  of  dorsal  horn  cells:  lamina  specificity,  time  course  and  dose  dependence.  J  Pharmacol Exp Ther 195(3): 515‐521.   Krasowski  MD,  Harrison  NL  (1999)  General  anaesthetic  actions  on  ligand‐gated  ion  channels. Cell Mol Life Sci 55(10): 1278‐1303.   Kullmann DM, Martin RL, Redman SJ (1989) Reduction by general anaesthetics of group Ia  excitatory postsynaptic potentials and currents in the cat spinal cord. J Physiol 412(277‐ 296.   Leake CD (1971) Claude Bernard and anesthesia. Anesthesiology 35(2): 112‐113.   Lima D, Almeida A (2002) The medullary dorsal reticular nucleus as a pronociceptive centre  of the pain control system. Prog Neurobiol 66(2): 81‐108.   166           References  Lin  JS,  Sakai  K,  Vanni‐Mercier  G,  Arrang  JM,  Garbarg  M,  Schwartz  JC,  Jouvet  M  (1990)  Involvement of histaminergic neurons in arousal mechanisms demonstrated with H3‐ receptor ligands in the cat. Brain Res 523(2): 325‐330.   Lipski  J  (1981)  Antidromic  activation  of  neurones  as  an  analytic  tool  in  the  study  of  the  central nervous system. J Neurosci Methods 4(1): 1‐32.   Lisney SJ (1979) Evidence for primary afferent depolarization of single tooth‐pulp afferents  in the cat. J Physiol 288(437‐447.   Liu  RP  (1986)  Spinal  neuronal  collaterals  to  the  intralaminar  thalamic  nuclei  and  periaqueductal gray. Brain Res 365(1): 145‐150.   Liu  X,  Sandkuhler  J  (1997)  Characterization  of  long‐term  potentiation  of  C‐fiber‐evoked  potentials in spinal dorsal horn of adult rat: essential role of NK1 and NK2 receptors. J  Neurophysiol 78(4): 1973‐1982.   Liu XG, Sandkuhler J (1995) Long‐term potentiation of C‐fiber‐evoked  potentials in the rat  spinal dorsal horn is prevented by spinal N‐methyl‐D‐aspartic acid receptor blockage.  Neurosci Lett 191(1‐2): 43‐46.   Liu ZY, Zhuang DB, Lunderberg T, Yu LC (2002) Involvement of 5‐hydroxytryptamine(1A)  receptors in the descending anti‐nociceptive pathway from periaqueductal gray to the  spinal  dorsal  horn  in  intact  rats,  rats  with  nerve  injury  and  rats  with  inflammation.  Neuroscience 112(2): 399‐407.   Lloyd DP, McIntyre AK (1955) Mono‐synaptic reflex responses of individual motoneurons. J  Gen Physiol 38(6): 771‐787.   167           References  Lomax  P  (1966)  The  distribution  of  morphine  following  intracerebral  microinjection.  Experientia 22(4): 249‐250.   Macdonald  JF,  Pearson  JA  (1979)  Inhibition  of  spinal  interneuronal  activity  by  repeated  cutaneous  stimulation:  a  possible  substrate  of  flexor  reflex  habituation.  J  Neurobiol  10(1): 79‐92.   Macdonald RL, Olsen RW (1994) GABAA receptor channels. Annu Rev Neurosci 17(569‐602.   Martin  RF,  Haber  LH,  Willis  WD  (1979)  Primary  afferent  depolarization  of  identified  cutaneous fibers following stimulation in medial brain stem. J Neurophysiol 42(3): 779‐ 790.   Mashour  GA,  Forman  SA,  Campagna  JA  (2005)  Mechanisms  of  general  anesthesia:  from  molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol 19(3): 349‐364.   Mason P (1999) Central mechanisms of pain modulation. Curr Opin Neurobiol 9(4): 436‐441.   McCreery DB, Bloedel JR (1975) Reduction of the response of cat spinothalamic neurons to  graded mechanical stimuli by electrical stimulation of the lower brain stem. Brain Res  97(1): 151‐156.   Mendelson  WB  (1996)  Sleep  induction  by  microinjection  of  pentobarbital  into  the  medial  preoptic area in rats. Life Sci 59(22): 1821‐1828.   Menetrey D, de Pommery J, Roudier F (1984) Properties of deep spinothalamic tract cells in  the  rat,  with  special  reference  to  ventromedial  zone  of  lumbar  dorsal  horn.  J  Neurophysiol 52(4): 612‐624.   168           References  Meyer  HH  (1899)  Welche  Eigenschaft  der  Anasthetica  bedingt  ihre  narkitische  Wirkung?  .  Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 42(2‐4): 109‐118.   Millan MJ (2002) Descending control of pain. Prog Neurobiol 66(6): 355‐474.   Milne  RJ,  Foreman  RD,  Giesler  GJ,  Jr.,  Willis  WD  (1981)  Convergence  of  cutaneous  and  pelvic visceral nociceptive inputs onto primate spinothalamic neurons. Pain 11(2): 163‐ 183.   Molander C, Xu Q, Grant G (1984) The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in  the rat. I. The lower thoracic and lumbosacral cord. J Comp Neurol 230(1): 133‐141.   Myers  RD  (1966)  Injection  of  solutions  into  cerebral  tissue:  Relation  between  volume  and  diffusion. Physiol Behav 1(2): 171‐174, IN179.   Nagase  M,  Hanaoka  K,  Tagami  M,  Ide  Y,  Sumida  T,  Yamamura  H  (1994)  The  effect  of  pentobarbital sodium on the dorsal horn of the spinal cord. J Anesth 8(3): 321‐325.   Namiki A, Collins JG, Kitahata LM, Kikuchi H, Homma E, Thalhammer JG (1980) Effects of  halothane on spinal neuronal responses to graded noxious heat stimulation in the cat.  Anesthesiology 53(6): 475‐480.   Nelson LE, Guo TZ, Lu J, Saper CB, Franks NP, Maze M (2002) The sedative component of  anesthesia  is  mediated  by  GABA(A)  receptors  in  an  endogenous  sleep  pathway.  Nat  Neurosci 5(10): 979‐984.   Nieminen  K  (1987)  Effects  of  ethanol  on  the  electrical  membrane  properties  of  cultured  human sensory neurons. Alcohol Alcohol Suppl 1(719‐723.   169           References  Oakes  SG,  Pozos  RS  (1982)  Electrophysiologic  effects  of  acute  ethanol  exposure.  II.  Alterations  in  the  calcium  component  of  action  potentials  from  sensory  neurons  in  dissociated culture. Brain Res 281(3): 251‐255.   Odeh F, Antal M (2001) The projections of the midbrain periaqueductal grey to the pons and  medulla oblongata in rats. Eur J Neurosci 14(8): 1275‐1286.   Orser  BA,  Wang  LY,  Pennefather  PS,  MacDonald  JF  (1994)  Propofol  modulates  activation  and  desensitization  of  GABAA  receptors  in  cultured  murine  hippocampal  neurons.  J  Neurosci 14(12): 7747‐7760.   Overton  CE  (1901)  Studien  über  die  Narkose  zugleich  ein  Beitrag  zur  allgemeinen  Pharmakologie, 1 Edition. Jena: Gustav Fischer.   Palecek  J,  Paleckova  V,  Dougherty  PM,  Carlton  SM,  Willis  WD  (1992)  Responses  of  spinothalamic  tract  cells  to  mechanical  and  thermal  stimulation  of  skin  in  rats  with  experimental peripheral neuropathy. J Neurophysiol 67(6): 1562‐1573.   Paxinos G, Watson C (2007) The rat brain in stereotaxic coordinates, 6th Edition. Amsterdam  ; Boston: Elsevier/Academic Press.   Rampil IJ (1994) Anesthetic potency is not altered after hypothermic spinal cord transection  in rats. Anesthesiology 80(3): 606‐610.   Rampil IJ, King BS (1996) Volatile anesthetics depress spinal motor neurons. Anesthesiology  85(1): 129‐134.   Rampil IJ, Mason P, Singh H (1993) Anesthetic potency (MAC) is independent of forebrain  structures in the rat. Anesthesiology 78(4): 707‐712.   170           References  Randic  M,  Jiang  MC,  Cerne  R  (1993)  Long‐term  potentiation  and  long‐term  depression  of  primary afferent neurotransmission in the rat spinal cord. J Neurosci 13(12): 5228‐5241.   Reiner  K,  Sukhotinsky  I,  Devor  M  (2007)  Mesopontine  tegmental  anesthesia  area  projects  independently to the rostromedial medulla and to the spinal cord. Neuroscience 146(3):  1355‐1370.   Ren  K,  Randich  A,  Gebhart  GF  (1990)  Electrical  stimulation  of  cervical  vagal  afferents.  I.  Central  relays  for  modulation  of  spinal  nociceptive  transmission.  J  Neurophysiol  64(4):  1098‐1114.   Rexed B (1952) The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. J Comp Neurol  96(3): 414‐495.   Ries CR, Puil E (1999) Mechanism of anesthesia revealed by shunting actions of isoflurane  on thalamocortical neurons. J Neurophysiol 81(4): 1795‐1801.   Rudomin P (1999) Presynaptic selection of afferent inflow in the spinal cord. J Physiol Paris  93(4): 329‐347.   Rudomin P, Jankowska E (1981) Presynaptic depolarization of terminals of rubrospinal tract  fibers in intermediate nucleus of cat spinal cord. J Neurophysiol 46(3): 517‐531.   Rudomin P, Schmidt RF (1999) Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited.  Exp Brain Res 129(1): 1‐37.   Ruscheweyh R, Sandkuhler J (2002) Lamina‐specific membrane and discharge properties of  rat spinal dorsal horn neurones in vitro. J Physiol 541(Pt 1): 231‐244.   171           References  Rye  DB,  Saper  CB,  Lee  HJ,  Wainer  BH  (1987)  Pedunculopontine  tegmental  nucleus  of  the  rat:  cytoarchitecture,  cytochemistry,  and  some  extrapyramidal  connections  of  the  mesopontine tegmentum. J Comp Neurol 259(4): 483‐528.   Sahai S (1990) Glutamate in the mammalian CNS.  Eur  Arch Psychiatry Clin Neurosci  240(2):  121‐133.   Seutin  V,  Johnson  SW  (1999)  Recent  advances  in  the  pharmacology  of  quaternary  salts  of  bicuculline. Trends Pharmacol Sci 20(7): 268‐270.   Shah  Y,  Dostrovsky  JO  (1980)  Electrophysiological  evidence  for  a  projection  of  the  periaqueductal  gray  matter  to  nucleus  raphe  magnus  in  cat  and  rat.  Brain  Res  193(2):  534‐538.   Soja PJ (2007) Modulation of prethalamic sensory  inflow  during  sleep  versus  wakefulness.  In:  Sleep  and  pain  (Lavigne  G  SB,  Choinière  M,  Soja  PJ,  ed),  pp  45‐76.  Seattle:  IASP  Press.   Soja  PJ,  Sinclair  JG  (1983)  Tonic  descending  influences  on  cat  spinal  cord  dorsal  horn  neurons. Somatosens Res 1(1): 83‐93.   Soja  PJ,  Oka  JI,  Fragoso  M  (1993)  Synaptic  transmission  through  cat  lumbar  ascending  sensory pathways is suppressed during active sleep. J Neurophysiol 70(4): 1708‐1712.   Soja  PJ,  Lopez‐Rodriguez  F,  Morales  FR,  Chase  MH  (1991)  The  postsynaptic  inhibitory  control of lumbar motoneurons during the atonia of active sleep: effect of strychnine on  motoneuron properties. J Neurosci 11(9): 2804‐2811.   Soja PJ, Fragoso MC, Cairns BE, Oka JI (1995) Dorsal spinocerebellar tract neuronal activity  in the intact chronic cat. J Neurosci Methods 60(1‐2): 227‐239.   172           References  Soja  PJ,  Fragoso  MC,  Cairns  BE,  Jia  WG  (1996)  Dorsal  spinocerebellar  tract  neurons  in  the  chronic intact cat during wakefulness and sleep: analysis of spontaneous spike activity.  J Neurosci 16(3): 1260‐1272.   Soja  PJ,  Pang  W,  Taepavarapruk  N,  McErlane  SA  (2001)  Spontaneous  spike  activity  of  spinoreticular tract neurons during sleep and wakefulness. Sleep 24(1): 18‐25.   Soja  PJ,  Taepavarapruk  N,  Pang  W,  Cairns  BE,  McErlane  SA,  Fragoso  MC  (2002)  Transmission through the dorsal spinocerebellar and spinoreticular tracts: wakefulness  versus thiopental anesthesia. Anesthesiology 97(5): 1178‐1188.   Sorkin LS, Steinman JL, Hughes MG, Willis WD, McAdoo DJ (1988) Microdialysis recovery  of serotonin released in spinal cord dorsal horn. J Neurosci Methods 23(2): 131‐138.   Staiman  A,  Seeman  P  (1974)  The  impulse‐blocking  concentrations  of  anesthetics,  alcohols,  anticonvulsants, barbiturates, and narcotics on phrenic and sciatic nerves. Can J Physiol  Pharmacol 52(3): 535‐550.   Stamford JA (1995) Descending control of pain. Br J Anaesth 75(2): 217‐227.   Steriade M, McCarley RW (2005) Brain control of wakefulness and sleep, 2nd Edition. New  York: Springer.   Sukhotinsky  I,  Zalkind  V,  Devor  M  (2003)  Anesthetic  effect  of  barbiturates  microinjected  into  the  brainstem:  neuroanatomy.  In:  Progress  in  pain  research  and  management  ;  (Dostrovsky J, Carr D, Koltzenburg M, eds), pp 305‐313. Seattle: IASP Press.   Sukhotinsky I, Hopkins DA, Lu J, Saper CB, Devor M (2005) Movement suppression during  anesthesia:  neural  projections  from  the  mesopontine  tegmentum  to  areas  involved  in  motor control. J Comp Neurol 489(4): 425‐448.   173           References  Sukhotinsky  I,  Zalkind  V,  Lu  J,  Hopkins  DA,  Saper  CB,  Devor  M  (2007)  Neural  pathways  associated with loss of consciousness caused by intracerebral microinjection of GABA  A‐active anesthetics. Eur J Neurosci 25(5): 1417‐1436.   Sukhotinsky  I,  Reiner  K,  Govrin‐Lippmann  R,  Belenky  M,  Lu  J,  Hopkins  DA,  Saper  CB,  Devor M (2006) Projections from the mesopontine tegmental anesthesia area to regions  involved in pain modulation. J Chem Neuroanat 32(2‐4): 159‐178.   Surmeier  DJ,  Honda  CN,  Willis  WD  (1989)  Patterns  of  spontaneous  discharge  in  primate  spinothalamic neurons. J Neurophysiol 61(1): 106‐115.   Taepavarapruk  N,  McErlane  SA,  Soja  PJ  (2002)  State‐related  inhibition  by  GABA  and  glycine of transmission in Clarkeʹs column. J Neurosci 22(13): 5777‐5788.   Taepavarapruk N, McErlane SA, Chan A, Chow S, Fabian L, Soja PJ (2004) State‐dependent  GABAergic inhibition of sciatic nerve‐evoked responses of dorsal spinocerebellar tract  neurons. J Neurophysiol 92(3): 1479‐1490.   Thompson  SA,  Wafford  K  (2001)  Mechanism  of  action  of  general  anaesthetics‐‐new  information from molecular pharmacology. Curr Opin Pharmacol 1(1): 78‐83.   Tortorici  V,  Vanegas  H  (1994)  Putative  role  of  medullary  off‐  and  on‐cells  in  the  antinociception  produced  by  dipyrone  (metamizol)  administered  systemically  or  microinjected into PAG. Pain 57(2): 197‐205.   Tortorici V, Vanegas H (1995) Anti‐nociception induced by systemic or PAG‐microinjected  lysine‐acetylsalicylate in rats. Effects on tail‐flick related activity of medullary off‐ and  on‐cells. Eur J Neurosci 7(9): 1857‐1865.   174           References  Trapani G, Altomare C, Liso G, Sanna E, Biggio G (2000) Propofol in anesthesia. Mechanism  of action, structure‐activity relationships, and drug delivery. Curr Med Chem 7(2): 249‐ 271.   Urban  BW  (2002)  Current  assessment  of  targets  and  theories  of  anaesthesia.  Br  J  Anaesth  89(1): 167‐183.   Urban MO, Gebhart GF (1997) Characterization of biphasic modulation of spinal nociceptive  transmission  by  neurotensin  in  the  rat  rostral  ventromedial  medulla.  J  Neurophysiol  78(3): 1550‐1562.   Vahle‐Hinz C, Detsch O (2002) What can in vivo electrophysiology in animal models tell us  about mechanisms of anaesthesia? Br J Anaesth 89(1): 123‐142.   Voss  LJ,  Young  BJ,  Barnards  JP,  Sleigh  J  (2005)  Differential  anaesthetic  effects  following  microinjection  of  thiopentone  and  propofol  into  the  pons  of  adult  rats:  a  pilot  study.  Anaesth Intensive Care 33(3): 373‐380.   Wada H, Inagaki N, Yamatodani A, Watanabe T (1991) Is the histaminergic neuron system a  regulatory center for whole‐brain activity? Trends Neurosci 14(9): 415‐418.   Wall PD (1958) Excitability changes in afferent fibre terminations and their relation to slow  potentials. J Physiol 142(1): i3‐21.   Wall PD (1962) The origin of a spinal‐cord slow potential. J Physiol 164(508‐526.   Wall PD (1967) The laminar organization of dorsal horn and effects of descending impulses.  J Physiol 188(3): 403‐423.   175           References  Whalen  FX,  Bacon  DR,  Smith  HM  (2005)  Inhaled  anesthetics:  an  historical  overview.  Best  Pract Res Clin Anaesthesiol 19(3): 323‐330.   Whitehorn D, Burgess PR (1973) Changes in polarization of central branches of myelinated  mechanoreceptor  and  nociceptor  fibers  during  noxious  and  innocuous  stimulation  of  the skin. J Neurophysiol 36(2): 226‐237.   Willcockson WS, Chung JM, Hori Y, Lee KH, Willis WD (1984) Effects of iontophoretically  released amino acids and amines on primate spinothalamic tract cells. J Neurosci 4(3):  732‐740.   Willis  WD  (1985)  Ascending  nociceptive  tracts.  In:  The  pain  system:  the  neural  basis  of  nociceptive  transmission  in  the  mammalian  nervous  system,  pp  145‐212.  Basel;  New  York: Karger.   Willis WD, Westlund KN (1997) Neuroanatomy of the pain system and of the pathways that  modulate pain. J Clin Neurophysiol 14(1): 2‐31.   Willis WD, Coggeshall RE (2004) Sensory pathways in the ventral quadrant. In: Ascending  sensory  tracts  and  their  descending  control,  3rd  Edition  (Willis  WD,  Coggeshall  RE,  eds), pp 705‐788. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers.   Willis  WD,  Nunez  R,  Rudomin  P  (1976)  Excitability  changes  of  terminal  arborizations  of  single  Ia  and  Ib  afferent  fibers  produced  by  muscle  and  cutaneous  conditioning  volleys. J Neurophysiol 39(6): 1150‐1159.   Willis  WD,  Haber  LH,  Martin  RF  (1977)  Inhibition  of  spinothalamic  tract  cells  and  interneurons by brain stem stimulation in the monkey. J Neurophysiol 40(4): 968‐981.   176           References  Willis WD, Jr. (2007) The somatosensory system, with emphasis on structures important for  pain. Brain Res Rev 55(2): 297‐313.   Wilson VJ, Burgess PR (1962) Disinhibition in the cat spinal cord. J Neurophysiol 25(392‐404.   Woodrow KM, Eltherington LG (1988) Feeling no pain: alcohol as an analgesic. Pain 32(2):  159‐163.   Yamamori  Y, Kishikawa K, Collins  JG (1995)  Halothane effects  on  low‐threshold  receptive  field  size  of  rat  spinal  dorsal  horn  neurons  appear  to  be  independent  of  supraspinal  modulatory systems. Brain Res 702(1‐2): 162‐168.   Yezierski  RP  (1990)  Effects  of  midbrain  and  medullary  stimulation  on  spinomesencephalic  tract cells in the cat. J Neurophysiol 63(2): 240‐255.   Yezierski  RP,  Bowker  RM  (1981)  A  retrograde  double  label  tracing  technique  using  horseradish  peroxidase  and  the  fluorescent  dye  4ʹ‐,6‐diamidino‐2‐phenylindole  2HC1  (DAPI). J Neurosci Methods 4(1): 53‐62.   Zhang  DX,  Owens  CM,  Willis  WD  (1991a)  Intracellular  study  of  electrophysiological  features of primate spinothalamic tract neurons and their responses to afferent inputs. J  Neurophysiol 65(6): 1554‐1566.   Zhang  DX,  Owens  CM,  Willis  WD  (1991b)  Two  forms  of  inhibition  of  spinothalamic  tract  neurons produced by stimulation of the periaqueductal gray and the cerebral cortex. J  Neurophysiol 65(6): 1567‐1579.   Zhang  X,  Giesler  GJ,  Jr.  (2005)  Response  characterstics  of  spinothalamic  tract  neurons  that  project to the posterior thalamus in rats. J Neurophysiol 93(5): 2552‐2564.   177           References  Zhou HH, Mehta M, Leis AA (1997) Spinal cord motoneuron excitability during isoflurane  and nitrous oxide anesthesia. Anesthesiology 86(2): 302‐307.   Zhuo M, Gebhart GF (1990) Characterization of descending inhibition and facilitation from  the nuclei reticularis gigantocellularis and gigantocellularis pars alpha in the rat. Pain  42(3): 337‐350.   Zhuo M, Gebhart GF (1991) Spinal serotonin receptors mediate descending facilitation of a  nociceptive  reflex  from  the  nuclei  reticularis  gigantocellularis  and  gigantocellularis  pars alpha in the rat. Brain Res 550(1): 35‐48.   Zhuo  M,  Gebhart  GF  (1992)  Characterization  of  descending  facilitation  and  inhibition  of  spinal  nociceptive  transmission  from  the  nuclei  reticularis  gigantocellularis  and  gigantocellularis pars alpha in the rat. J Neurophysiol 67(6): 1599‐1614.   Zhuo  M,  Gebhart  GF  (1997)  Biphasic  modulation  of  spinal  nociceptive  transmission  from  the medullary raphe nuclei in the rat. J Neurophysiol 78(2): 746‐758.   Zhuo M, Sengupta JN, Gebhart GF (2002) Biphasic modulation of spinal visceral nociceptive  transmission  from  the  rostroventral  medial  medulla  in  the  rat.  J  Neurophysiol  87(5):  2225‐2236.               178           Appendices   APPENDICES  Appendix A     179           Appendices     Appendix B     180           

Cite

Citation Scheme:

        

Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics

Share

Embed

Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                        
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            src="{[{embed.src}]}"
                            data-item="{[{embed.item}]}"
                            data-collection="{[{embed.collection}]}"
                            data-metadata="{[{embed.showMetadata}]}"
                            data-width="{[{embed.width}]}"
                            async >
                            </script>
                            </div>
                        
                    
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:
http://iiif.library.ubc.ca/presentation/dsp.24.1-0066191/manifest

Comment

Related Items